CN105579066B - 使用亲和性树脂合成adc的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及固相合成生物分子‑药物‑缀合物的方法。尤其，本发明涉及合成抗体‑药物‑缀合物(ADC)的固相方法。本发明也涉及产生固定的化学改性的生物分子例如抗体的中间方法。本发明也涉及捕获树脂的各种用途，并且涉及本发明方法的生物分子‑药物‑缀合物、中间体产物和组合物。

Description

使用亲和性树脂合成ADC的方法
本发明涉及合成生物分子-药物-缀合物的固相方法。尤其，本发明涉及合成抗体-药物-缀合物(ADC)的固相方法。本发明也涉及产生固定的、化学改性的生物分子例如抗体的中间方法。
除了上述方法，本发明涉及本发明方法的捕获树脂、生物分子-药物-缀合物、中间体产物和组合物的各种用途。
发明背景
免疫毒素和抗体药物缀合物(ADC)是使靶-特异性结合结构域与可被归类为细胞毒素的足够强有力的毒性的药物分子结合的蛋白质药物。抗体是用于该目的的产生下述靶向系统的理想生物分子，所述靶向系统结合了高特异性与高抗原亲和性，允许将细胞毒素药物运输至期望的施用位点。这些药物构建体是针对发现在肿瘤学中尤其流行的疾病的潜在治疗剂。
抗体药物缀合物(ADC)的主要标准是毒素‘弹头’(药物)在极低水平(picoM)下具有活性。此外，无论周期中的点，而针对肿瘤细胞具有效力是有利的。就该目的而言，已经发现DNA活性试剂利于作为毒素候选物，因为DNA损伤，除非可修复的，将驱动细胞凋亡，而无论周期中的点。
原则上，ADC的适当毒素可以是定义为L01ATC分子的任何部分(‘解剖学治疗学化学分类系统(Anatomical Therapeutic Chemical Classification System)’，其中L01是定义抗肿瘤和免疫调节试剂的亚组，其由WHO药物统计方法合作中心定义。可选地，可归类为用于ADC的适当有效负载的其他部分可简单地定义为当内化时对细胞有毒性的任何部分。落在后者目录中的大多数部分缺少足够的有效效力。因此，工业趋势是鉴定和开发‘超效力’材料。
对于免疫毒素和ADC研究的基本原理、设计和效力的专家综述可见：J.Adair等，Expert Opin.Biol.Ther.，2012，12(9)：P1191-206，G.Casi等，Journal of ControlledRelease，2012，161，2，P422–428和F.Dosio等，Toxins，2011，3，P848-883。
许多溶液相方法可用于制造生物分子-药物-缀合物，例如抗体-药物-缀合物(ADC)。但是，溶液相方法它们本身就产生大量的废物而言是浪费的，并且就合成期间生物分子-药物-缀合物的聚集而言是有问题的。
用于制造生物分子-药物-缀合物的溶液相方法中的第一步骤大体上涉及生物分子的化学改性或活化。例如，在生物分子是抗体的情况下，可通过使抗体还原或部分还原，将抗体‘化学改性’或‘活化’。部分还原抗体的适当方法见“Bioconjugate Techniques”，96/97页，Greg T.Hermanson，Academic Press；第2版，2008，ISBN-13：978-0123705013。还原方法中一般采用还原剂，比如TCEP。
在抗体的化学改性或活化，例如还原之后，下一步骤是去除任何过多的活化/化学改性试剂，例如过多的还原剂。该步骤非常耗费时间，因为其有时必须使样品在分开的分离柱中运行多次。如果生物分子的稳定性有问题，从降解方面而言这也可能是有问题的。如果方法涉及用大量过量的还原剂充分还原ThiomAb，化学改性/活化的生物分子的纯化的问题是尤其有问题的。
在上面的纯化步骤之后，然后化学改性的/活化的例如还原的抗体与药物部分缀合。该步骤的主要问题是生物分子-药物-缀合物高可能性的聚集。当在该过程中采用非常疏水的药物时，这尤其有问题。聚集是主要问题，因为其可导致不稳定的生物分子-药物-缀合物。在最佳情形下，被生物分子-药物-缀合物聚集物污染的生物分子-药物-缀合物必须被进一步纯化，以去除聚集物，其即耗费时间又非常浪费。在纯化期间将失去大部分的药物，因为其形成聚集的生物分子-药物-缀合物的一部分。在最差的情形下，整批生物分子-药物-缀合物被生物分子-药物-缀合物聚集物污染至整体是不稳定的并且必须被处理的这样高的程度。
几乎三十年，肿瘤学家已经致力于利用靶-特异性单克隆抗体将细胞毒素药物递送至肿瘤位点，只要单克隆抗体存在。直到现在，三类毒素占据了该领域。即，刺孢霉素(calicheamicins)、美登素(maytansines)和阿里他汀(auristatins)。这些细胞毒素药物类型本质上都通常是疏水的。当缀合至抗体时，它们的存在明显增加了抗体的总体疏水性，并且在一些情况下，某种程度上，在缀合物之间的疏水相互作用导致缀合物聚集。基于用于麦罗塔(Mylotarg)和CMC-544二者的方法都包含色谱法聚集体去除步骤的认识，该问题的显著性顺序是刺孢霉素>美登素>阿里他汀。约50％的美登素方法包含聚集体去除步骤和非常少的阿里他汀方法包含聚集体去除步骤。
最近，基于多米卡新(duocarmycins)(www.syntarga.com)和吡咯并苯二氮杂(pyrollebenzodiazepene)(PBD)二聚体(www.spirogen.com)的毒素已经缀合至抗体并且进行临床前评估。这些新类型的毒素甚至比它们的前驱物细胞毒素药物类型更疏水并且当缀合至抗体时，更容易聚集。
重大的努力已经聚焦在通过并入亲水性连接体调节药物的疏水性(Zhao等，J.Med.Chem.,2011,54,10,3606–3623)。在聚集体形成不能被控制的情况下，开发人员已经依靠熟知的技术，用于从蛋白质型治疗剂中去除聚集体。这些包括一系列不同的色谱分离，包括离子交换、疏水相互作用、羟基磷灰石和本领域技术人员熟知的其他分离。采用这样的色谱纯化技术具有实现足够产物质量的结果，但是以工艺产率为代价。当与抗体和抗体型治疗剂在制造的背景下一起使用时，通过不明确的伴随副反应或不想要的物理化学相互作用，材料的物理损失具有非常严重的经济影响。
因此，制造生物分子-药物-缀合物的常规的溶液相方法具有许多困难，并且期望提供用于制造生物分子-药物-缀合物的改进方法。
本发明解决了常规的溶液相方法的一个或多个上述问题。
发明内容
合成生物分子-药物-缀合物的方法：
根据本发明，提供了合成生物分子-药物-缀合物的方法，该方法包括：
(i)使生物分子在适于固定生物分子的情况下接触捕获树脂并且因而提供固定的生物分子；其中生物分子是抗体、改性的抗体或抗体片段；和其中捕获树脂包括选自下述的生物分子捕获部分：(1)非肽型的，包括氨基酸型的，蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部分；
(ii)任选地使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂，以提供化学改性的或活化的固定的生物分子；
(iii)使固定的生物分子或化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分，以形成固定的生物分子-药物-缀合物；
(iv)从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物。
本发明上述方法的关键特征是在该方法中采用的捕获树脂能够以连续和可再生方式固定生物分子。生物分子连续固定至捕获树脂应使得通过上述方法产生的所得生物分子-药物-缀合物减少变化。例如，可减少在药物组分连接至固定的生物分子的点的变化，因此产生药物组分和固定的生物分子之间更一致的连接点。这样的区域特异性的改善从改善所得生物分子-药物-缀合物产物的一致性而言应是期望的。
与采用母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕获部分相对，采用非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物或肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物(即上述方法第一步骤中的(1)或(2))作为生物分子捕获部分，可使得相对改善生物分子的固定的一致性，原因是相对于常规的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型系统增加了模拟物的区域特异性。在其中生物分子固定至蛋白质的区域特异性低的情况下，采用母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕获部分将固有地使得生物分子可变地固定至捕获树脂。例如，母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L可经可使总体相互作用复杂的蛋白质上的其他位点展示非特异性结合。如上面阐释，如在本发明中设想的，生物分子与捕获树脂的连续性固定可接着使得减少通过上述方法产生的所得生物分子-药物-缀合物的变化。这将是有利的。本发明的树脂系统的另一优势在于下述事实：相比常规的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型系统的情况，更宽范围的药物可原则上缀合至树脂。例如，在疏水性分子的情况下，可出现在母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型系统中的其他非特异性结合可扰乱或防止这样的药物的有效缀合。
类似的益处存在于采用核苷酸结合位点捕获部分或糖蛋白捕获部分(即上述方法的第一步骤中的(3)或(4))作为生物分子捕获部分。
在一种实施方式中，捕获树脂是非蛋白质捕获树脂。在一种实施方式中，捕获树脂的生物分子捕获部分的分子量为约1000Da或更小，任选地约500Da或更小、约300Da或更小或约200Da或更小。在一种实施方式中，捕获树脂是非蛋白质捕获树脂和捕获树脂的生物分子捕获部分的分子量为约1000Da或更小。
与采用母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕获部分相对，采用非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物或肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕获部分的另一益处是模拟物生物分子捕获部分与宽范围的常用抗体缀合化学物质相容并且可扩大至工业水平。这与蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型生物分子捕获部分相反。
例如，通常期望将赖酰胺侧链官能团靶向在固定的抗体上。在目前临床开发的28种抗体药物缀合物中，几乎一半(下表中灰色阴影的那些)采用赖氨酸引导的缀合化学。蛋白质A、G或L的表面上固定配体的蛋白质本性使得无意中将赖酰胺侧链官能团靶向在蛋白质捕获树脂上。蛋白质A(swiss-prot P02976)具有59个赖氨酸残基，蛋白质G(swiss-protP919909)具有59个赖氨酸残基和蛋白质L(swiss-prot Q51918)具有132个赖氨酸残基。
除了如上所述的配体和抗体赖酰胺残基之间的竞争，蛋白质A、G和L型捕获树脂也存在其他问题。这些包括蛋白质的沥滤和沥滤的加合物的免疫原性。这意味着这些亲和性载体不能用于制造过程的目的(用于纯化或缀合)。由采用蛋白质A，G和L型捕获树脂的这样的过程提供的任何缀合物材料不符合目前抗体纯化和产物质量的规范指南。
合成化学改性的活化、固定的生物分子的方法：
根据本发明，提供了合成化学改性的或活化的固定的生物分子的方法，该方法包括：
(i)使生物分子在适于固定生物分子的情况下与捕获树脂接触，并且因而提供固定的生物分子；其中生物分子是抗体、改性的抗体或抗体片段；和其中捕获树脂包括选自下述的生物分子捕获部分：(1)非肽型的，包括氨基酸型的，蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部分；和
使固定的生物分子与化学改性试剂或活化试剂接触，以提供化学改性的或活化的固定的生物分子。
蛋白质和更具体的抗体的缀合通常用于研究、诊断和治疗。BioconjugateTechniques，第二版(Greg T Hermanson)提供了有关形成标记的或缀合分子的化学、试剂系统和实际应用的非常详细的信息。也详细描述了许多反应，其有关数百种商业上可得的试剂和这些试剂用于改性或交联肽和蛋白质、糖和多糖、核酸和寡核苷酸、脂质和合成聚合物的用途。下面提供了应用于抗体的关键缀合化学物质的简述。
在还原天然链间二硫键之后缀合至游离硫巯基是抗体缀合的常用方法和商业ADC采用的化学反应。方法包括使抗体接触还原剂，比如TCEP、DTT、巯基乙胺(merceptoethylamine)或本领域熟知的其他适当的还原剂；然后，与药物、配体、式D-X的标记物缀合，其中D是药物、配体或标记物和X是活性基团，其选自马来酰亚胺、卤代烷、吡啶基二硫化物和本领域已知的其他硫巯基活性化学物质。
硫巯基缀合抗体的替代方法是改造在抗体中特定位点的活性半胱氨酸残基，以使得药物以限定的化学计量被缀合，而不破坏链间二硫键。改造的半胱氨酸通常作为半胱氨酸或谷胱甘肽的混合二硫化物存在。通过完全还原随后渗滤(diafiltration)而去除加合物。这破坏了链间二硫化物，其必须通过用空气、CuSO4或脱氢抗坏血酸氧化来改造。
用于缀合的另一常见位点是赖氨酸残基的侧链上存在的氨基基团。最简单的方法包括使抗体接触药物、配体、式D-Y的标记物或连接体。D具有如上的相同定义并且Y是活性基团，其选自异氰酸酯、NHS酯、磺酰氯、环氧化物和本领域技术人员已知的其他试剂。
也通常采用间接缀合至赖氨酸。首先用杂双官能连接体活化赖氨酸侧链的氨基基团，然后这与包含良好活性化学性质的药物缀合。这样的偶联体的例子包括用2-亚氨基硫烷改性赖氨酸，以产生新的硫巯基，随后与任何上述的硫巯基活性药物-连接体(D-X)缀合。另一偶联体是用SMCC改性赖氨酸，以产生结合马来酰亚胺的赖氨酸，随后与包含游离硫巯基的药物缀合。对于用于间接赖氨酸缀合的有潜力的偶联体的完整综述见Hermanson和Perbio交联剂目录。
数个小组已经开发了以化学上与蛋白质中20种成蛋白性氨基酸侧链正交的侧链并入非天然氨基酸的方法。
Redwood Bioscience(www.redwoodbioscience.com)已经开发了他们称为醛标记(Aldehyde Tagging)的技术。在该技术中，他们采用称为甲酰甘氨酸酶(FGE)的天然酶，其通常将高度保守的13氨基酸序列中的Cys残基转化成I型硫酸酯酶中的甲酰甘氨酸(醛)(Wu等，PNAS，2009，106，9，3001)。待缀合至这样改性抗体的药物、配体或标记物必须包含醛活性化学物质，比如羟基胺或肼。醛活性功能的全部内容可见Hermanson和Perbio目录。
Ambryx已经开发了他们称为EuCode的技术(Liu等，Anu.Rev.Biochem.，2010，79，413)。EuCode是借助其将细胞改造以通过在表达系统中包括三个非天然组分而并入异源蛋白质中的非天然氨基酸的平台：
1.补充至培养基的非天然氨基酸
2.正交氨酰基-tRNA合酶(aaRS)
3.正交tRNA
已经改造/选择正交aaRS/tRNA对，以促进在琥珀终止密码子通读并且在该位置并入非天然氨基酸。使用该方法，多达70种nnAA已经并入蛋白质。下面的图阐释了正交氨基酸侧链和活性化学物质可能的组合(改编自2012年2月Hanson Wade ADC峰会的Ambryx陈述)。
Sutro已经描述了使用开放的、无细胞合成(OCFS)技术生产抗体和细胞因子。OCFS的特征是用可引导至特定密码子的负载tRNA在蛋白质中并入非天然氨基酸的能力，以将非天然氨基酸递送至蛋白质上的特定位置–使得蛋白质易于特定的改性或赋予新期望的性质(Goerke等，Biotechnol.Bioeng.，2008，99：351-367)。
固定的抗体缀合与所有的非天然氨基酸侧链相容并且以一个前提条件与活性化学物质互补。抗体捕获配体必须不包含作为非天然氨基酸侧链的一部分并入的新的化学物质。
用过碘酸钠氧化糖蛋白中的多糖残基提供了产生用于随后与包含胺或酰肼的分子、药物、配体或标记物缀合的活性醛基的温和及有效的方式。该方法涉及首先使抗体接触过碘酸钠并且然后与选自胺、酰肼、氨氧基或本领域已知的其他醛活性化学物质的活性基团缀合。
步骤(i)：
在一种实施方式中，使生物分子接触捕获树脂的步骤包括用捕获树脂孵育生物分子。
孵育可在约0至约100℃的温度，优选地在约5至约50℃的温度，任选地在约10至约40℃的温度进行。理想地，孵育在约15至约37℃的温度进行，例如孵育在室温下，比如约21℃进行。可选地，孵育在约37℃进行。
孵育可进行约1分钟至约3天的时段，例如约10分钟至约18小时的时段。优选地，孵育进行约20分钟至约1小时的时段。
在一种实施方式中，孵育在水性媒介中进行。在可选的实施方式中，孵育在缓冲液，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与期望的结合pH和化学物质相容的任何缓冲盐中进行，任选地孵育在缓冲液比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。在一种实施方式中，使用包括溶剂比如DMSO或DMF的助溶剂进行孵育。助溶剂可存在的范围是0.5–80％v/v，比如0.5–50％v/v。
在一种实施方式中，孵育在约5至约10，优选地约5至约8，更优选地约6至约8的pH下进行。在优选的实施方式中，孵育在约6至约7.5的pH，理想地在约6.5的pH进行。在另一优选的实施方式中，孵育在约7至约8的pH，理想地在约7.4的pH进行。这产生改善的抗体与衍生载体的结合。
在一种实施方式中，清洗固定的生物分子(即固定在捕获树脂上的生物分子)，以去除还未固定在捕获树脂上的任何生物分子。固定的生物分子的清洗可通过受用新鲜的溶剂冲洗作用。例如，固定的生物分子的清洗可受用缓冲液比如PBS的清洗作用。任选地，固定的生物分子的清洗是在存在螯合剂，比如EDTA的情况下进行。可选地，固定的生物分子的清洗可受用包括磷酸钠缓冲液、NaCl和螯合剂比如EDTA的‘改性的缓冲液’的清洗作用。
步骤(ii)：
在一种实施方式中，使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂，以提供改性的或活化的固定的生物分子的步骤涉及使生物分子还原。在一种实施方式中，生物分子的还原涉及完全还原。在一种实施方式中，生物分子的还原涉及部分还原。在一种实施方式中，生物分子的还原涉及完全还原随后再氧化。
在一种实施方式中，通过使生物分子接触还原剂，比如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺或其他适当的还原剂，使其还原。优选地，还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
在一种实施方式中，通过使还原的生物分子接触氧化剂比如空气、CuSO4或脱氢抗坏血酸(DHAA)，使其再氧化。优选地，氧化剂是脱氢抗坏血酸(DHAA)。
在一种实施方式中，使生物分子还原的过程在缓冲液比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。
在一种实施方式中，使生物分子还原的过程在约5至约10，优选地约7至约8，优选地约7.4的pH下进行。
在一种实施方式中，使生物分子还原的过程在存在螯合剂比如EDTA的情况下进行。
在一种实施方式中，使生物分子还原的过程涉及用还原剂孵育生物分子约20分钟至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
在一种实施方式中，使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂以提供改性的或活化的固定的生物分子的步骤涉及使生物分子与交联剂部分反应。例如，交联剂部分可以是胺-硫氢基交联剂，例如具有NHS-酯和在相对端的马来酰亚胺活性基团的交联剂。使生物分子改性或活化的该方法有效产生生物分子-连接体-药物-缀合物。适当的交联剂一般能够与药物上的伯胺反应(经活性NHS酯端)并且也与生物分子上的半胱氨酸残基反应(经活性马来酰亚胺端)。在该具体的例子中，马来酰亚胺端与固定的生物分子中的半胱氨酸反应。这样的交联剂的例子是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
在一种实施方式中，与交联剂反应的过程在缓冲液，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。可选地，与交联剂反应的过程在包括磷酸钠缓冲液、NaCl和螯合剂比如EDTA的‘改性缓冲液’中进行。
在一种实施方式中，与交联剂反应的过程在约7至约9，优选地约7至约8，优选地约8.0的pH下进行。
在一种实施方式中，与交联剂反应的过程在存在螯合剂比如EDTA的情况下进行。
在一种实施方式中，与交联剂反应的过程涉及用交联剂孵育生物分子约20分钟至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
在一种实施方式中，使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂以提供改性的或活化的固定的生物分子的步骤涉及使生物分子与Traut试剂反应。
在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程在缓冲液，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。
在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程在约7至约9，优选地约7至约8，优选地约8.0的pH下进行。
在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程在存在螯合剂，比如EDTA的情况下进行。
在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程涉及用还原剂孵育生物分子约20分钟至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
在一种实施方式中，清洗活化的固定生物分子以去除任何改性/活化试剂。在一种实施方式中，清洗涉及用缓冲液冲洗，任选地其中缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其他适当的缓冲液包括磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、Bis–Tris丙烷缓冲液、HEPES缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、二甲胂酸缓冲液、乙酸铵缓冲液、咪唑缓冲液、N-二羟乙基甘氨酸缓冲液和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。例如，固定的生物分子可用缓冲液，比如pH为约7至约8，优选地约7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。任选地，活化的固定的生物分子的冲洗在存在螯合剂比如EDTA的情况下进行。冲洗活化的固定的生物分子的另一例子涉及用缓冲液比如PBS，随后用包括柠檬酸钠、NaCl和螯合剂比如EDTA的‘缀合缓冲液’冲洗树脂。
步骤(iii)：
在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固定的生物分子-药物-缀合物的步骤涉及使化学改性的或活化的固定生物分子在如之前结合步骤(ii)描述的缓冲液中接触药物组分。
在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固定的生物分子-药物-缀合物的步骤涉及使化学改性的或活化的固定生物分子在约5至约8，优选地约约7至约8和更优选地约7.4的pH下接触药物组分。
在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固定的生物分子-药物-缀合物的步骤在存在螯合剂比如EDTA的情况下进行。
在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固定的生物分子-药物-缀合物的步骤涉及用药物组分孵育化学改性的或活化的固定生物分子约20分钟至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
在一种实施方式中，在从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物之前清洗固定的生物分子-药物-缀合物。清洗去除任何未反应的药物组分。在一种实施方式中，清洗涉及用缓冲液冲洗，任选地其中缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，和其他溶剂。其他适当的缓冲液包括磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、Bis–Tris丙烷缓冲液、HEPES缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、二甲胂酸缓冲液、乙酸铵缓冲液、咪唑缓冲液、N-二羟乙基甘氨酸缓冲液和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。例如，固定的生物分子-药物-缀合物可用缓冲液，比如pH为约5至约7的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和二甲基乙酰胺(DMA)清洗。任选地，固定的生物分子-药物-缀合物的冲洗在存在螯合剂比如EDTA的情况下进行。
步骤(iv)：
在一种实施方式中，从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物的步骤涉及：
a)将载体-生物分子化合物暴露于释放剂；和/或
b)改变pH，以破坏载体-生物分子结合。
在一种实施方式中，释放剂是氢键破坏剂(disrupter)，比如六氟异丙醇、2,2,2-三氟乙醇或二甲亚砜(DMSO)的助溶剂。
在一种实施方式中，释放剂用载体-生物分子孵育。
孵育可在约0至约100℃的温度，优选地在约5至约50℃的温度和任选地在约10至约40℃的温度进行。理想地，孵育在约15至约37℃的温度进行，例如孵育在室温，比如约21℃进行。可选地，孵育在约37℃进行。
孵育可进行约1分钟至约3天的时段。优选地，孵育进行约30分钟至约2小时的时段。
孵育可在水性媒介中进行。可选地，孵育可在溶剂，比如DMF、DMSO、MeOH或MeCN中进行。可选地，孵育可在具有多达80％的溶剂，优选地0.5至50％和最优选的0.5％至10％v/v的溶剂的水性-溶剂混合物中。在某些情况下，一种或多种上述溶剂——包括水——的混合物，可以是适当的。在必要的情况下，也可包括稳定剂，以确保缀合物保持完整。
在一种实施方式中，从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物的步骤涉及改变pH。可使pH以足够破坏载体-生物分子结合但是不影响生物分子的活性、完整性或3D结构的任何量改变。
例如，可调节pH以使其是酸性的。在一种实施方式中，pH下降约pH2至约pH6。任选地，调节pH至小于约pH 5，例如约pH3至约5，例如小于约pH 4。在一种实施方式中，pH下降至约pH 3。
可选地，可调节pH，以使其是碱性的。在一种实施方式中，pH升高至约pH8至约pH10。任选地，调节pH大于pH 8。例如，pH可升高至约pH9。pH可升高大于pH9。例如，pH可升高至约pH10。pH可升高至大于pH10，但是通常小于pH14。
生物分子-药物-缀合物可用释放剂进行一次或多次处理。有利地，使用新鲜释放剂的第二次或随后处理可使得增加从捕获树脂释放的生物分子-药物-缀合物的量。新鲜释放剂是之前还未用固定的生物分子-药物-缀合物孵育的释放剂。
在一种实施方式中，从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物的步骤涉及使生物分子-药物-缀合物接触盐。例如，生物分子-药物-缀合物可能接触NaCl。盐的浓度的范围可以是约0.1至约10M，优选地约0.1至约1M。
在一种实施方式中，在从捕获树脂释放缀合物的步骤之后中和洗脱的生物分子-药物-缀合物。例如，缀合物可捕获至2％v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)。
清洗步骤：
在一种实施方式中，本发明的方法中清洗中间体的步骤包括去除未与捕获树脂结合的物质，比如污染物。典型的污染物包括用于活化固定的生物分子的过量试剂、还未固定在捕获树脂上的生物分子和未与活化的固定的生物分子反应的药物组分。不影响生物分子的活性、完整性或3D结构或固定的生物分子和捕获树脂之间的结合完整性的任何媒介可用于清洗中间体。
优选地，缓冲液是等渗的并且通过模拟生理学pH和离子强度为生物分子比如抗体产生稳定环境。在一种实施方式中，通过过滤清洗活化的固定生物分子。任选地，所得滤液是缓冲液交换的，例如通过使用膜盒(membrane cartridge)离心。
典型地，将添加剂引入缓冲液媒介。这些添加剂引起控制水平的缓冲液系统和包含在其中的生物分子。例如，添加剂比如Tris或组氨酸被引入至缓冲工艺流，以保持pH并且使容易发生的酸化最小化。典型地，生物分子工艺流的pH应保持在pH5和9.5之间，极端的pH限制避免了延长的时间。可添加无机盐，比如0.1M NaCl(aq)，以保持工艺流的离子强度。可将离子和非离子洗涤剂比如Tween(聚山梨醇酯)添加至缓冲液，以有利提高差可溶性生物分子在缓冲液媒介中的溶解度并且使聚集最小化。
包括捕获树脂和活化试剂的混合物：
根据本发明提供了包括下述的混合物：
(i)捕获树脂，其包括选自下述的抗体、改性的抗体或抗体片段捕获部分：(1)非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部分；和
(ii)化学改性试剂或活化试剂。
在一种实施方式中，捕获树脂包括在其表面上的固定的抗体、改性的抗体或抗体片段。
捕获树脂在合成生物分子-药物-缀合物中的用途：
根据本发明提供了包括选自下述的抗体、改性的抗体或抗体片段捕获部分的捕获树脂在合成生物分子-药物-缀合物中的用途：(1)非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，(3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部分。
捕获树脂：
许多年，研究人员已经尝试开发对许多全长抗体、片段或融合体具有亲和性的配体作为对传统蛋白质A、G或L亲和性纯化载体的替换。成功的配体发现/开发的主要标准已经是：
1.对抗体高选择性，以提供高的初始纯化
2.有用的动态结合能力
3.与保持抗体完整性相容的洗脱条件
4.多个洗脱/净化循环期间载体的稳定性
5.相对于蛋白质A、G或L载体降低成本
在使用用于固相抗体缀合的这些配体的背景下，上面的标准1不是关键的，因为缀合过程开始于纯化的抗体。但是，配体必需完全符合剩下的4个标准。另外，配体必需理想地具有与为缀合提供适当的亲和性结合强度的抗体相互作用的限定的位点。该性质是必要的，从而抗体可结合载体并且随着时间的推移不在缓冲液补充期间不经意地被洗脱。另外，期望限定的相互作用的位点，以推出与周围的溶液相一致的结合抗体复合物的构象呈现，作用是提供用于一致的和可再生的缀合化学性质的方式。抗体是良好表征的生物分子，其具有许多良好限定的为亲和性纯化开发的结合结构域。
第一限定的区域(一个或多个)是蛋白质A和蛋白质G结合袋(binding pocket)，其用于使用蛋白质A/G和蛋白质A/G载体的模拟物的亲和色谱法。蛋白质A与Fc区域中的CH2CH3链间结构域经与下述氨基酸残基的许多非共价相互作用而进行相互作用：Thr 250、Leu251、Met 252、Ile 253、His 310、Gln 311、Leu 314、Asn 315、Lys 338、Glu 345、Ala431、Leu 432、His 433、Asn 434和His 435。蛋白质A模拟物载体已经合理地设计为与该结构域经一个或多个上面限定的氨基酸相互作用。这些模拟物载体为IgG结合和缀合提供适当的亲和性配体。蛋白质A模拟物载体可在亚类中限定为并入非肽型、肽型或氨基酸型配体。类似地，蛋白质G与Fc区域中的CH2CH3链间结构域经与下述氨基酸残基的许多非共价相互作用而进行相互作用：Ile 253、Ser 254、Gln 311、Glu 380、Glu 382、His 433、Asn 434和His 435。蛋白质G模拟物载体已经合理设计为经一个或多个上述氨基酸与该结构域相互作用。这些模拟物载体再次为IgG结合和缀合提供适当的亲和性配体。蛋白质G模拟物载体可在亚类中限定为并入非肽型、肽型或氨基酸型配体。在一种实施方式中，捕获树脂能够结合生物分子上的蛋白质A或蛋白质G结合袋。
第二限定区域是蛋白质L亲和性基质靶向的抗体轻链。蛋白质L特异性结合κI、II和IV轻链，但是不结合κIII也不结合γ轻链。已经描绘了蛋白质L与抗体之间的相互作用，并且注意到氢键和盐桥对于结合是重要的。蛋白质L结构域的总共11种亲水性氨基酸残基——即Ala、Asp、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Phe、Thr、Tyr——对于这些结合的形成是重要的。使用与上面公开的11种氨基酸结构上类似的化合物，通过产生三嗪支架组合文库已经开发了蛋白质L模拟物亲和性载体(WO 2004/035199A)。在WO2004/035199A的公开中，蛋白质L模拟物定义为具有蛋白质L对抗体或片段50％亲和性并且对轻链特异性的配体，如通过Fab片段的结合所证实的。本文公开的或本领域技术人员已知的任何适当的支架可代替三嗪支架，只要保持对轻链的亲和性和特异性特征。这样的树脂用于固定抗体和包含κI、II和IV轻链的片段。蛋白质L模拟物的一种商用实施方式是FabsorbentTM F1P HF(ProMeticBiosciences)。该亲和性载体符合蛋白质L模拟物的标准，但是也结合包含γ轻链的抗体和片段。所以，该亲和性载体普遍应用于抗体亲和性结合和缀合。在一种实施方式中，捕获树脂能够结合抗体轻链，如通过蛋白质L亲和性基质所靶向。
第三限定的区域是跨宽范围的种类的所有抗体同种型的Fab臂中保守的核苷酸结构域。结合位点包括4个氨基酸残基，第一个是Tyr或Phe和剩余的三个是Tyr、Tyr和Trp。尽管结合袋位置和氨基酸侧链定向在晶体结构叠加中是保守的，但是不同抗体之间的总体骨架序列变化和编码方案存在稍微不同。这在下面通过比较商业抗体赫赛汀(Herceptin)和利妥昔单抗(Rituximab)的保守的核苷酸结合位点来表明。已经合理设计为经一个或多个上述氨基酸与该结构域相互作用的核苷酸模拟物(非肽、肽、核苷酸类似物和氨基酸)是用于IgG结合和缀合的合适的亲和性配体。
抗体 氨基酸1 氨基酸2 氨基酸3 氨基酸4
赫赛汀 轻链Tyr 36 轻链Tyr 87 重链Tyr 95 重链Trp 110
利妥昔单抗 轻链Phe 35 轻链Tyr 86 重链Tyr 95 重链Trp 111
在一种实施方式中，捕获树脂能够结合抗体的Fab臂中保守的核苷酸结构域。
第四限定的区域是完整抗体的Fc区域的CH2结构域中Asn 297上存在的聚糖结构。用作亲和性配体的m-氨基苯基硼酸结合糖残基，比如甘露糖、半乳糖或葡萄糖上的顺二醇基团，使得与糖蛋白分子的糖类部分一起存在。可逆的五元环复合物供应自该相互作用。下面显示典型的抗体聚糖结构，以强调抗体聚糖中甘露糖和半乳糖的存在(改编自Arnold等，Advances in Experimental Medicine and Biology，2005，564，27-43)。在一种实施方式中，捕获树脂能够结合完整抗体的Fc区域的CH2结构域中Asn 297上存在的聚糖结构。
图2
聚糖结构和异构体。a)聚糖的一般命名法b)IgG的主要聚糖结构。
G＝半乳糖单元，F＝海藻糖单元。Arnold等之后的改性。
配体可连接至亲和色谱法领域熟知的许多固体载体基质。这些包括例如合成聚合物，比如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或聚苯乙烯，尤其是交联的合成聚合物；无机载体，比如二氧化硅型载体和尤其是多糖载体比如淀粉、纤维素和琼脂糖。
下面描述适于抗体结合的具体配体载体：
‘非肽’蛋白质A、G和L模拟物亲和性载体
结合合成化学文库筛选的蛋白质A、G或L相互作用的分子模拟已经能够半合理设计这些蛋白质的小分子模拟物(Li等，Nature Biotechnology，1998，16，190-195)。这样的树脂的例子包括商业上可得的载体mAbsorbent A1P和FAbsorbent F1P HF(ProMeticBiosciences)。
mAbsorbent A1P和FAbsorbent F1P HF载体在三嗪支架上使用多组分Ugi反应形成(www.prometicbioscience.com)。
US20010045384公开了在亚氨基二醋酸酯(IDA)型支架上组装的蛋白质A模拟物配体-复合物。IDA支架用三唑基(triazyl)配体衍生化，以提供多价三唑基配体-复合物。
WO9808603描述了使用亲和性树脂将免疫球蛋白从细胞培养上清液、血清、血浆或初乳的分离。这些亲和性树脂由合成的单或双环-芳族或杂芳族配体组成，以利于免疫球蛋白纯化。
有希望作为抗体亲和性树脂的另一配体是磺胺甲嘧啶(sulfamethazine)。与磺胺甲嘧啶偶联的葡聚糖微粒特异性结合抗体(Yi等，Prep.Biocheml Biotechnol.，2012，42，6，598-610)。
在上述选择主要候选配体时，基于缺少抗体特异性排除了许多配体。本文公开的是特异性不如对固相抗体缀合树脂的结合效率、能力和稳定性重要并且同样不忽视这些。
‘肽’蛋白质A、G或L模拟物亲和性载体
已经公开了许多蛋白质A模拟肽。Menegatti鉴定了具有序列HWRGWV的六肽，其结合抗体Fc区域(Menegatti等，Journal of Separation Science，2012，35，22，3139–3148)。Fassina等通过合成和筛选由具有四齿状(tetradendate)赖氨酸核心的随机化的合成分子组成的合成多聚体肽文库已经鉴定了蛋白质A模拟肽TG191318(Fassina等，J.Mol.Recognit.，1996，9，564)。EP1997826公开了包括X1-Arg-Thr-Tyr的肽。Lund等公开了适于抗体亲和色谱法的两个肽配体(Lund等，J Chromatogr.A，2012，1225，158-167)。DAAG和D2AAG包含L-精氨酸、L-甘氨酸和合成芳族酸2,6-二叔丁基-4-羟苄基丙烯酸酯(DBHBA)
氨基酸蛋白质A、G或L模拟物亲和性载体
除了上述复合大分子配体，简单的氨基酸已经提出作为以相同方式结合抗体的蛋白质A模拟物(Naik等，J.Chromatogr.A，2011，1218，1756-1766)。这样的例子是AbSep，包含色氨酸的聚甲基丙烯酸酯树脂，其具有对抗体的Fc区域中蛋白质结合位点的高亲和性。包含氨基酸酪氨酸、组氨酸和苯丙氨酸的树脂也适于抗体固定和缀合(Bueno等，J.Chromatogr.B，Biomed.Appl.,1995；667,1,57-67)。
核苷酸结合位点亲和性载体
开发抗体纯化配体的另一策略已经利用较不熟知的抗体Fab可变区中保守的核苷酸结合位点(NBS)(Alves等，Anal.Chem.，2012，84，7721-7728)。核苷酸类似物吲哚丁酸已经偶联至ToyoPearl AF-650-氨基M树脂，以制备符合上面标准1–5的载体。WO/2012/099949中描述了许多用于抗体亲和色谱法的其他核苷酸类似物。
碳水化合物结合树脂
固定在各种载体上的配体m-氨基苯基硼酸已经用于纯化糖蛋白。该配体结合包括抗体的糖蛋白分子的糖类部分中存在的糖残基，比如甘露糖、半乳糖或葡萄糖上的顺式二醇基团，形成可逆的五元环复合物。该复合物可通过降低pH，或通过使用包含Tris或山梨糖醇的洗脱缓冲液解离。
捕获树脂的配体能够通过配体和生物分子例如蛋白质、抗体、改性的抗体或抗体片段之间的特异性、可逆的和非共价结合相互作用而与生物分子相互作用。非共价相互作用可归类为离子的、范德华的、氢键的或疏水的。这些相互作用以3维方式起作用，以有助于靶生物分子对捕获树脂的配体的灵活性和构象。当靠近配体时，生物分子可推出(infer)一种、数种或所有的这些相互作用，以提供配体-生物分子复合物。配体和生物分子之间的距离以及配体的极性和电负性决定这些相互作用的强度。此外，这些相互作用的强度可定义为亲和力。配体和生物分子之间的高亲和力构成了增强稳定性的配体-生物分子复合物(US2009/0240033)。
在一种实施方式中，捕获树脂包括非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物。捕获树脂能够结合抗体、改性的抗体或抗体片段。
非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物已经用于染料配体色谱法，其是使用固定至固体载体比如琼脂糖，以纯化蛋白质的共价结合织物染料的亲和色谱法的模型。这些染料与蛋白质对其具有亲和力的天然底物/蛋白质配体类似。纯化和分离的该模型通常称为伪亲和色谱法(pseudo-affinity chromatography)。染料配体亲和色谱法是非特异性的但是该技术有利于各种蛋白质的宽结合范围。纯化技术的进步采用改性的染料，以用作蛋白质正常底物/配体的竞争抑制剂(P.Dean等，J.Chromatography，1979，165，3，301-319)。通常采用基于三嗪基的配体，比如汽巴蓝3GA(Cibacron Blue 3GA)、普施安红H-3B(Procion Red H-3B)、普施安蓝MX 3G(Procion Blue MX 3G)、普施安黄H-A(ProcionYellow H-A)等，并且解决了关于原始商业染料比如蓝色葡聚糖的纯度、渗漏和毒性的担忧(Lowe等，Trends biotechnology，1992，10，442-448)。三嗪基配体已经成功用于白蛋白、氧化还原酶、脱羧酶、糖解酶、核酸酶、水解酶(hydroloases)、裂解酶、合酶和转移酶的纯化(N.Labrou，Methods Mol.Biol.2002，147，129-139)。生物模拟物染料配体亲和色谱法的局限是不同生物分子的亲和性强度显著不同并且在许多情况下，为一种蛋白质提供强亲和性强度的配体可能不适用于另一蛋白质。因此，通常必须进行大量的和行之有效的筛选过程，以鉴定对感兴趣的生物分子具有期望的亲和性的适当的合成配体。
因此，为了有助于结构化阐释实现亲和性结合生物分子的适当配体，已经将多价支架基序并入配体结构，以提供构建体，该构建体可以向其引入配体的文库并且结合配体的刚性空间分离从载体筛选。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据WO98/08603的公开内容叙述的结构。WO98/08603的捕获树脂包括合成的单或双环-芳族或杂芳族配体，以利于免疫球蛋白纯化。与捕获树脂的结构相关的WO98/08603的内容通过引用并入本文。WO98/08603描述了从细胞培养上清液、血清、血浆或初乳使用亲和性树脂分离免疫球蛋白。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据WO2009/141384的公开内容叙述的结构。WO2009/141384的捕获树脂的通式为：
其中R1、R2和R3表示分子量为15–1000g/mol的有机部分，总重是200–2000g/mol，向其配体经R1、R2和R3之一通过酰胺键固定至固相载体。WO2009/141384与捕获树脂的结构相关的内容通过引用并入本文。WO2009/141384描述了配体结合蛋白质因子VII多肽。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据US20010045384的公开内容叙述的结构。US20010045384的捕获树脂是在亚氨基二醋酸酯(IDA)型支架上组装的蛋白质A模拟物配体-复合物。US20010045384与捕获树脂的结构相关的内容通过引用并入本文。IDA支架用三唑基配体衍生化，以提供多价三唑基配体-复合物。下面显示US20010045384中限定的示意性三唑基配体复合物：
该蛋白质A模拟物已经表明用作免疫球蛋白比如IgG的亲和性纯化媒介。推测配体-复合物中临近三嗪配体的分子几何学是使用IDA支架的优势。
下面显示US20010045384中限定的另一示意性复合物：
该分支多价酞酸-配体支架蛋白质A模拟物配体-复合物表明具有对免疫球蛋白的亲和性。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据WO9710887和US6117996公开内容的结构。WO9710887和US6117996与捕获树脂的结构相关的内容通过引用并入本文。WO9710887和US6117996公开了下述类型的三唑基-配体亲和性构建体：
其中，(A)表示三嗪支架与多糖固体载体的共价附着点，其任选地通过间插在配体和固体载体之间的间隔臂，和R1和Q是具有对蛋白质材料的亲和性的任选取代的配体。有机部分描述为蛋白质A模拟物并且提议和举例为对用于纯化蛋白质材料的蛋白质A的可选的纯化媒介。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据WO2004/035199公开内容叙述的结构。WO2004/035199与捕获树脂的结构相关的内容通过引用并入本文。WO2004/035199公开了由下述通式的分支配体支架组成的蛋白质L模拟物的用途，
其中R1和R2相同或不同并且每个是任选取代的烷基或芳基配体，和R3是任选地通过间隔基序附着的固体载体。三唑基-配体支架已经公开为用于亲和性结合免疫球蛋白或其片段抗体(fAb)的适当的蛋白质L模拟物配体。此外，公开了这些三唑基-配体支架具有对免疫球蛋白κ和λ轻链的优先结合亲和性。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据US20110046353公开内容叙述的结构。US20110046353与捕获树脂的结构相关的内容通过引用并入本文。US20110046353公开了从生产培养基纯化片段抗体(fAb)。片段抗体不能在蛋白质A媒介上纯化。fAb表征为具有能够结合抗原的结合结构域并且在公开的许多实施方式中具有一条重链(Vh)，或其功能片段，和一条轻链(Vl)，或其功能片段，以及至少一条其他链。限定的是对于fAb的亲和性配体，其由下式的分支三唑基支架组成，
其中Q表示与固体载体基质的附着点，任选地具有间隔基序，和基团A和B是用一个或多个能够氢键合——优选地一个或多个–OH、–SH或–CO2H——的取代基取代的苯基或萘基基团。已经报道了使用商业上可获得自Prometic Biosciences商标名为MAbsorbent A1P和MAbsorbent A2P的载体亲和性配体的卓越结果。
在一种实施方式中，捕获树脂的配体具有下述结构：
在一种实施方式中，捕获树脂的配体具有下述结构：
在一种实施方式中，捕获树脂的配体具有下述结构：
在一种实施方式中，捕获树脂为珠的形式。在一种实施方式中，就珠直径而言，珠的尺寸是约10μm至约2000μm，优选地约50μm至约1000μm，和最优选地约75μm至约500μm。
在一种实施方式中，捕获树脂包括由选自下述的材料制备的移动载体：聚苯乙烯、聚苯乙烯(PS-DVB)–与二乙烯基苯稍微交联(0.1-5.0％DVB，称为微孔的)、聚苯乙烯(PS-DVB)–与二乙烯基苯高度交联(5-60％DVB，称为大孔的)、聚乙二醇、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯(PS-PEG共聚物)、聚丙烯酰胺、可控孔径的玻璃(CPG)珠、二氧化硅、硅藻土、聚丙烯、聚(四氟乙烯)、聚乙烯、纤维素、聚甲基丙烯酸酯、官能化的整体材料、官能化的纤维、整体柱(比如Nikzad等，OPRD，2007，11，458-462)、琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性可恢复的聚合物珠。
在优选的实施方式中，捕获树脂是由选自下述的材料制造的移动载体：琼脂糖、琼脂糖凝胶和纤维素。
在一种实施方式中，捕获树脂是商业上可获得的捕获树脂，比如FabsorbantTM F1PHF树脂。在一种实施方式中，捕获树脂是商业上可获得的捕获树脂，比如MabsorbantTM树脂。
生物分子：
在一种实施方式中，生物分子天然存在于活的生物体中。可选地，生物分子可以是天然存在于活的生物体中的化合物的衍生物。例如，生物分子可以是已经以不影响其生物活性的方式被化学上或遗传上改变的生物分子。
在一种实施方式中，生物分子是抗体。
在一种实施方式中，生物分子是改性的抗体，例如包括非天然氨基酸的抗体。
在一种实施方式中，生物分子是抗体片段。
在一种实施方式中，抗体是单克隆抗体。
在一种实施方式中，抗体是曲妥珠单抗。
在一种实施方式中，抗体、改性的抗体或抗体片段是免疫球蛋白(Ig)，例如下述五种人免疫球蛋白类型之一：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。术语抗体包括单克隆抗体。术语抗体包括多克隆抗体。术语抗体包括抗体片段，只要它们展示期望的生物活性。抗体可以是人抗体、动物抗体、鼠抗体、包括人和动物序列的人源化抗体或嵌合抗体。
抗体结构的基本单元是至少20,000道尔顿，例如约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白复合物。抗体长度可能是至少900个氨基酸，例如长度是1400个氨基酸。抗体可包括通过两个非共价结合和通过二硫键连接在一起的两条等同的轻(L)链和两条等同的重(H)链。每条重链和轻链也有规律地间隔开的链内二硫桥键。每条重链是约50,000道尔顿。每条重链长度是至少300个氨基酸，例如约450个氨基酸的长度。抗体可以是仅仅重链抗体。每条轻链是约20,000道尔顿。每条轻链长度是至少100个氨基酸，例如约250个氨基酸的长度。
抗体生物分子可包含两个等同的多肽链对，每对具有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链接着由下述两个区域组成：参与结合靶抗原的可变("V")区，和与免疫系统的其他组分相互作用的恒定("C")区。轻链和重链可变区在3维空间中聚集在一起，以形成结合抗原(例如，细胞表面上的受体)的可变区。
在一种实施方式中，生物分子是抗体片段。抗体片段包括全长抗体的一部分，一般其抗原结合区或其可变区。
抗体片段的例子包括Fab、pFc'、F(ab')2和scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体生物分子和来自抗体片段的多特异性抗体。抗体片段长度可以是至少10个氨基酸，例如抗体片段的长度可以是至少20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300个氨基酸。
在一种实施方式中，生物分子是是改性的抗体或改性的抗体片段。“改性的抗体”或“改性的抗体片段”意思是由于至少一个氨基酸修饰而与亲代抗体(parent antibody)不同的抗体。改性的抗体或改性的抗体片段指与野生型抗体相比其尺寸不同，或其糖基化不同但是与野生型抗体具有对其配体类似亲和性的抗体。
药物：
术语“药物”包括当施用至活的生物体体内时改变正常的身体功能的任何物质。大体上，药物是用于治疗、治愈、预防或诊断疾病或用于以其他方式增强身体或精神状况的物质。在一种实施方式中，药物是细胞毒素药物。
迄今，主要的‘超效力’(药物)候选物定义在两个目录之一中：(i)微管蛋白抑制剂；和(ii)DNA相互作用试剂。微管蛋白抑制剂调节微管蛋白聚合。DNA相互作用试剂靶向细胞DNA
在一种实施方式中，药物是微管蛋白抑制剂。
在一种实施方式中，微管蛋白抑制剂选自：(a)阿里他汀；和(b)美登素衍生物。
在一种实施方式中，药物是阿里他汀。
阿里他汀包括天然存在的化合物多拉司他汀-10的合成衍生物。阿里他汀是抗肿瘤/细胞抑制伪肽家族。多拉司他汀结构上是独特的，原因是并入了4种天然生物合成的产物中鉴定的不常见氨基酸(多拉缬氨酸(Dolavaine)、多拉异亮氨酸(Dolaisoleuine)、多拉脯氨酸(Dolaproine)和多拉苯丙氨酸(Dolaphenine))上。另外，该类型的天然产物具有许多通过Pettit等的总合成研究限定的不对称中心(US4,978,744)。从结构活性关系显而易见，多拉异亮氨酸和多拉脯氨酸残基对于抗肿瘤活性似乎是必要的(US5,635,483和US5,780,588)。
在一种实施方式中，阿里他汀选自：阿里他汀E(AE)、单甲基阿里他汀E(MMAE)、阿里他汀F(MMAF)、vcMMAE和vcMMAF。
在一种实施方式中，药物是美登素或美登素的结构类似物。
在一种实施方式中，药物是美登素。
美登素包括结构上复杂的抗有丝分裂聚酮化合物(polyketide)。美登素是微管组装的有力抑制剂，其导致肿瘤细胞的细胞凋亡。
在一种实施方式中，美登素选自：Mertansine(DM1)；和美登素的结构类似物，比如DM3或DM4。优选地，药物是mertansine(DM1)。
在一种实施方式中，药物是DNA相互作用试剂。DNA相互作用试剂称为‘超有力’(药物)候选物。
在一种实施方式中，DNA相互作用试剂选自：(a)刺孢霉素、(b)多米卡新和(c)吡咯并苯二氮杂(PBD)。
在一种实施方式中，药物是刺孢霉素。
刺孢霉素是有力的细胞毒素试剂，其使得双链DNA断裂，造成细胞死亡。刺孢霉素是天然存在的烯二炔抗生素(A.L.Smith等，J.Med.Chem.，1996，39,11，2103-2117)。刺孢霉素见于土壤微生物刺孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)。
在一种实施方式中，刺孢霉素是刺孢霉素γ1。
在一种实施方式中，药物是多米卡新。
多米卡新是有力的抗肿瘤抗生素，其通过DNA双链的小沟中的选择性结合序列和烷基化腺嘌呤的N3发挥它们的生物作用(D.Boger，Pure&Appl.Chem.，1994，66，4，837-844)。
在一种实施方式中，多米卡新选自：多米卡新A、多米卡新B1、多米卡新B2、多米卡新C1、多米卡新C2、多米卡新D、多米卡新SA、环丙基苯并吲哚(CBI)多米卡新、Centanamycin、拉奇霉素(Rachelmycin)(CC-1065)、阿多来新、比折来新和卡折来新。
在一种实施方式中，药物是吡咯并苯二氮杂。
吡咯并苯二氮杂(PBD)是一类天然存在的抗肿瘤抗生素。吡咯并苯二氮杂见于链霉菌(Streptomyces)。PBD通过特异性共价结合在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤单元的小沟中的DNA发挥它们的抗肿瘤活性。它们经缩醛胺连接插入在鸟嘌呤的N2和，由于它们的形状，它们对DNA螺旋造成最小的破坏。相信DNA-PBD加合物的形成抑制了核酸合成并且造成DNA螺旋中切除-依赖性单链和双链断裂。作为合成衍生物，两个PBD单元经柔性聚亚甲基系链(polymethylene tether)连接在一起使得PBD二聚体交联相对侧的DNA链，产生非常致死的损害。
在一种实施方式中，药物是经柔性聚亚甲基系链连接在一起的两个吡咯并苯二氮杂单元的合成衍生物。
在一种实施方式中，吡咯并苯二氮杂选自：氨茴霉素(Anthramycin)(和其二聚体)；甲基氨茴霉素(Mazethramycin)(和其二聚体)；妥布霉素(和其二聚体)；普拉卡素(Prothracarcin)(和其二聚体)；奇卡霉素(Chicamycin)(和其二聚体)；新茴霉素A(和其二聚体)；新茴霉素B(和其二聚体)；DC-81(和其二聚体)；西伯利亚霉素(Sibiromycin)(和其二聚体)；泊罗霉素(Porothramycin)A(和其二聚体)；泊罗霉素B(和其二聚体)；西巴霉素(Sibanomycin)(和其二聚体)；赤霉素(Abbeymycin)(和其二聚体)；SG2000和SG2285。
在一种实施方式中，药物是通过烷基化靶向DNA链间交联的药物。通过烷基化靶向DNA链间交联的药物选自：DNA靶向芥子(DNA targeted mustard)、鸟嘌呤特异性烷基化试剂；和腺嘌呤特异性烷基化试剂。
在一种实施方式中，药物是DNA靶向芥子。例如，DNA靶向芥子可选自：吡咯低聚物、咪唑低聚物、双(苯并咪唑)载体、聚苯甲酰胺载体；和9-苯胺基吖啶-4-甲酰胺载体。
在一种实施方式中，药物选自:纺锤菌素、偏端霉素、(来红菌素Lexitropsin)、他莫司汀、二溴他莫司汀、PNU 157977和MEN 10710。
在一种实施方式中，药物是是双(苯并咪唑)载体。优选地，药物是Hoechst 33258。
鸟嘌呤特异性烷基化试剂是高度区域特异性烷基化试剂，其在具体的核苷位置反应。
在一种实施方式中，药物是选自下述的鸟嘌呤特异性烷基化试剂：G-N2烷基化剂、A-N3烷基化剂、丝裂霉素、卡美唑类似物；海鞘素类似物。
在一种实施方式中，丝裂霉素选自：丝裂霉素A、丝裂霉素C、甲基丝裂霉素和KW-2149。
在一种实施方式中，卡美唑类似物选自：双(羟甲基)双吡咯烷和NSC 602668。
在一种实施方式中，海鞘素类似物是海鞘素743。
腺嘌呤特异性烷基化试剂是区域特异性的和序列特异性的小沟烷基化剂，其在多聚嘧啶序列中的腺嘌呤的N3处反应。环丙吲哚酮(Cyclopropaindolone)和倍癌霉素(duocamycins)可定义为腺嘌呤特异性烷基化剂。
在一种实施方式中，药物是环丙吲哚酮类似物。优选地，药物选自：阿多来新和卡折来新。
在一种实施方式中，药物是是苯吲哚酮(benz[e]indolone)。优选地，药物选自：CBI-TMI和异CBI。
在一种实施方式中，药物是比折来新。
在一种实施方式中，药物是海洋抗肿瘤药物。海洋抗肿瘤药物已经成为抗肿瘤药物开发平台中的开发领域(I.Bhatnagar等，Mar.Drugs2010，8，P2702-2720和T.L.Simmons等，Mol.Cancer Ther.2005，4(2)，P333-342)。海洋生物体包括海绵、海绵微生物共生体、柳珊瑚、放线菌和海鸡冠已经被广泛开发用于潜在的抗癌剂。
在一种实施方式中，药物选自：阿糖胞苷、Ara-C、曲贝替定(Trabectedin)(ET-743)和甲磺酸艾日布林。
在一种实施方式中，甲磺酸艾日布林选自：(E7389)、索利多汀(TZT 1027)、乳酸角沙胺、西马多汀普利那布林(NPI-2358)、Plitidepsin、衣利地新、Zalypsis、泰丝多汀(Tasidotin)、Synthadotin、(ILX-651)、圆皮海绵内酯、HT1286、LAF389、Kahalalide F、KRN7000、苔藓抑素1、哈米特林(Hemiasterlin)(E7974)、Marizomib、Salinosporamide A、NPI-0052)、LY355703、CRYPTO 52、缩酚肽(NSC630176)、海鞘素743、Synthadotin、Kahalalide F、角沙胺、脱氢膜海鞘素B、膜海鞘素B、西马多汀、索利多汀、E7389、NVP-LAQ824、圆皮海绵内酯、HTI-286、LAF-389、KRN-7000(Agelasphin衍生物)、Curacin A、DMMC、Salinosporamide A、Laulimalide、Vitilevuamide、二氢氧茚吲哚(Diazonamide)、软珊瑚醇(Eleutherobin)、葡枝珊瑚醇(Sarcodictyin)、Peloruside A、SalicylihalimidesA和B；噻可拉林(Thiocoraline)、Ascididemin、Variolins、Lamellarin D、Dictyodendrins、ES-285(Spisulosine)和软海绵素B(Halichondrin B)。
本发明也包括下述下述药物：Amanita属的担子菌产生的鹅膏蕈毒素(α-鹅膏蕈碱)-双环八肽，例如绿色死帽蕈、微管蛋白抑制剂、Tubulysins、dolabellanins、埃博霉素A、B、C、D、E、F。
埃博霉素-构成一类非紫杉烷微管蛋白聚合试剂并且通过粘细菌纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)的天然发酵获得。这些部分具有有力的细胞毒素活性，其与微管的稳定性相关并且在G2/M过渡时产生有丝分裂阻滞。埃博霉素在许多癌症细胞系中已经表明有力的细胞毒性并且通常展示比紫杉醇更大的效力(X.:Pivot等，European Oncology，2008；4(2)，P42-45)。
在一种实施方式中，药物是鹅膏蕈毒素。
在一种实施方式中，药物是微管蛋白抑制剂。
在一种实施方式中，药物是细胞溶素。
在一种实施方式中，药物是dolabellanin。
在一种实施方式中，药物是埃博霉素。
本发明也包括下述药物。在一种实施方式中，药物选自：多柔比星、表柔比星、伊索比星、地拖比星、吗啉代-多柔比星、氨甲喋呤、甲蝶呤、博来霉素、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶-β-D-阿拉伯糖呋喃糖苷、紫杉醇、蛇形菌素(Anguidine)、美法仑、长春花碱、拟茎点霉素A(Phomopsin A)、核糖体-失活蛋白(RIPs)、柔红霉素、长春花生物碱、伊达比星、美法仑、顺铂、蓖麻毒素、皂草素、蒽环霉素、吲哚酮-苯并二氮卓、6-巯基嘌呤、放线菌素、环氧长春碱、异长春碱、洋红霉素、氨蝶呤、他利霉素、足叶草毒素、足叶乙甙、发夹聚酰胺、足叶乙甙磷酸、长春花碱、长春新碱、长春地辛、泰索帝视黄酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱、埃斯培拉霉素和烯二炔。
在一种实施方式中，药物是多柔比星。
在一种实施方式中，药物是表柔比星。
在一种实施方式中，药物是伊索比星。
在一种实施方式中，药物是地拖比星。
在一种实施方式中，药物是吗啉代-多柔比星。
在一种实施方式中，药物是氨甲喋呤。
在一种实施方式中，药物是甲蝶呤。
在一种实施方式中，药物是博来霉素。
在一种实施方式中，药物是二氯甲氨蝶呤。
在一种实施方式中，药物是5-氟尿嘧啶。
在一种实施方式中，药物是胞嘧啶-β-D-阿拉伯糖呋喃糖苷。
在一种实施方式中，药物是紫杉醇。
在一种实施方式中，药物是蛇形菌素。
在一种实施方式中，药物是美法仑。
在一种实施方式中，药物是长春花碱。
在一种实施方式中，药物是拟茎点霉素A。
在一种实施方式中，药物是核糖体-失活蛋白(RIP)。
在一种实施方式中，药物是柔红霉素。
在一种实施方式中，药物是长春花生物碱。
在一种实施方式中，药物是伊达比星。
在一种实施方式中，药物是美法仑。
在一种实施方式中，药物是顺铂。
在一种实施方式中，药物是蓖麻毒素。
在一种实施方式中，药物是皂草素。
在一种实施方式中，药物是蒽环霉素。
在一种实施方式中，药物是吲哚酮-苯并二氮卓。
在一种实施方式中，药物是6-巯基嘌呤。
在一种实施方式中，药物是放线菌素。
在一种实施方式中，药物是环氧长春碱。
在一种实施方式中，药物是异长春碱。
在一种实施方式中，药物是洋红霉素。
在一种实施方式中，药物是氨蝶呤。
在一种实施方式中，药物是他利霉素。
在一种实施方式中，药物是足叶草毒素。
在一种实施方式中，药物是足叶乙甙。
在一种实施方式中，药物是发夹聚酰胺。
在一种实施方式中，药物是足叶乙甙磷酸。
在一种实施方式中，药物是长春花碱。
在一种实施方式中，药物是长春新碱。
在一种实施方式中，药物是长春地辛。
在一种实施方式中，药物是泰索帝视黄酸。
在一种实施方式中，药物是N8-乙酰基亚精胺。
在一种实施方式中，药物是喜树碱。
在一种实施方式中，药物是埃斯培拉霉素。
在一种实施方式中，药物是烯二炔。
生物分子-药物-缀合物：
根据本发明提供了可通过本发明的方法获得的生物分子-药物-缀合物。
附图说明
参考附图下文进一步描述本发明的实施方式，其中：
图1-实施例2产生的固相赫赛汀(Herceptin)vcMMAE缀合物的HIC分析。从底至顶迹线，赫赛汀-vcE1.3、赫赛汀-vcE2.4、赫赛汀-vcE3.4、赫赛汀-vcE4.4。RT 4.3min–未缀合的赫赛汀、RT 5.9min–2的药物抗体比例、RT 7.5min–4的药物抗体比例、RT 8.9min–6的药物抗体比例和RT 9.8min–8的药物抗体比例。
图2-实施例2产生的固相赫赛汀vcMMAE缀合物的SEC分析。从底至顶迹线：赫赛汀、赫赛汀-vcE1.3、赫赛汀-vcE2.4、赫赛汀-vcE3.4、赫赛汀-vcE4.4。
图3-色谱流动固相赫赛汀vcMMAE缀合物的HIC分析。溶液相赫赛汀vcMMAE缀合物的HIC分析(上图)，柱A制造的赫赛汀vcMMAE(中图)，柱B制造的vcMMAE(下图)。
图4-固相赫赛汀vcMMAE缀合物的SEC分析。溶液相赫赛汀vcMMAE缀合物的SEC分析(上图)、柱A制造的赫赛汀vcMMAE(中图)、柱B制造的vcMMAE(下图)。
发明详述
遍及本说明书的描述和权利要求，词语“包括”和“包含”以及它们的变型意思是“包括但不限于”，并且它们不旨在(和不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。遍及本说明书的描述和权利要求，单数包括复数，除非上下文另外需要。尤其，在使用不定冠词的情况下，说明书应理解为考虑复数以及单数，除非上下文另外需要。
结合本发明具体的方面、实施方式或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。本说明书中(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)公开的所有的特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以任何组合结合，不包括其中至少一些这样的特征和/或步骤相互排斥的组合。本发明不限于任何前述实施方式的细节。本发明扩展至本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中公开特征的任何新的一种或任何新的组合，或扩展至如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新的一种或任何新的组合。
读者的注意力转向与本申请的说明书一起或在其之前提交并且说明书的查阅对公众开放的所有文章和文档，并且所有这样的文章和文档的内容通过引用并入本文。
实施例：
下述技术用于实施例。
尺寸排阻色谱法(SEC)
使用TOSOH Bioscience TSK-GW3000SWxl柱进行尺寸排阻色谱法，在0.2M磷酸钾中，pH 6.95，连同0.25mM氯化钾和10％IPA，流速为0.5ml/min。通过在280nm的洗脱峰面积吸光度的积分测定缀合物的聚集状态。
疏水作用色谱法(HIC)
使用TOSOH TSK-丁基NPR柱进行疏水作用色谱法，线性梯度为12分钟内0-100％缓冲液A与B，流速为0.8ml/min。其中缓冲液A是1.5M乙酸铵，pH 6.95，以及25mM磷酸钠，和缓冲液B是25mM磷酸钠，pH 6.95，以及25％的IPA。通过在280nm的洗脱峰面积吸光度的积分测定缀合物的抗体药物比例。
反相色谱法(RP-PLRP)
使用Agilent PLRP-S PL1912-1502柱进行反相(Polymer LabsPLRP)色谱，在31分钟内梯度为25-95％缓冲液A与B，流速为0.25ml/min。其中缓冲液A是水以及0.05％的TFA，和缓冲液B是ACN以及0.04％的TFA。在注射前用包含50mM DTT的20mM pH 8.4的硼酸钠将样品在37℃还原15分钟。通过在280nm的洗脱峰面积吸光度的积分测定缀合物的抗体药物比例。
通过UV分析的药物与抗体比例
为了UV分析，将样品添加至400ul石英试管，路径长度为1cm以及在Thermoscientific multiskan GO分光光度计上测量的在252nm和280nm的吸光度。基于为赫赛汀公开的摩尔消光系数，和在这些波长下的DM1，将252nm和280nm的数据用于计算药物抗体比例。
实施例1-固相抗体药物缀合物筛选
该实施例表明固定的抗体可用不需要方法开发的一般方法缀合至限定的药物负载。该方法适于适应96孔板高通量筛选。
通过轻轻混合树脂淤浆和抗体溶液60分钟，赫赛汀(0.5的1mg/ml PBS，pH 7.4)结合至100μl(固定的树脂体积)在PBS中平衡的FabsorbantTM F1P HF树脂。通过用PBS、2mMEDTA清洗树脂去除未结合的赫赛汀，和最后将树脂再悬浮在0.5ml PBS/EDTA中。
通过将三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris-(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride)添加至2mM的终浓度并且然后在环境温度下孵育18小时使结合的赫赛汀(Her)还原。用PBS/EDTA清洗树脂，以去除未反应的TCEP并且然后再悬浮在475μl PBS/EDTA中。
添加vcMMAE(vcE)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)和二甲基乙酰胺(DMA)，以实现1mM马来酰亚胺(总vcE和NEM)和5％v/v DMA的终浓度。vcE与NEM的比例是改变的，100:0、75:25、50:50、25:75和0:100。通过在环境中孵育树脂悬液60分钟将还原的抗体缀合。用PBS/EDTA/5％v/v DMA和0.1M甘氨酸pH 5.0顺序清洗树脂。
用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱缀合物。将洗脱的缀合物收集至2％v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)，以使它们中和。
然后通过尺寸排阻色谱法和反相色谱法(Polymer Labs，PLRP)色谱分析中和的缀合物，以测定百分数聚集和平均药物负载。
结果总结在下面表1中：
甚至最高药物负载的缀合物的聚集体含量对于在抗原结合和细胞型试验中的进一步评估都是可接受的。用PBS/ETDA/5％v/v DMA并且然后0.1M甘氨酸pH5.0进行顺序清洗确保最终缀合物不含未反应的药物连接体、NEM和溶剂并且不损害生物测定数据的解释。利用FabsorbantTM F1P HF树脂，该方法用于筛选鼠单克隆平板作为用于随后抗体药物缀合开发的克隆选择的一部分，用于直接从包含完整抗体和Fab片段抗体二者的组织培养上清液产生ADC。
实施例2-分批模式的固相部分TCEP还原
该实施例显示固定的抗体可通过部分还原链间二硫键随后与vcMMAE缀合而缀合至限定的药物负载，并且相对于在溶液中制备的相同缀合物提高了产物质量。
通过轻轻混合树脂淤浆和抗体溶液30分钟，将赫赛汀(0.5ml的2mg/ml PBS，pH7.4)结合至100μl(固定的树脂体积)PBS中平衡的FabsorbantTM F1P HF树脂。通过用PBS清洗树脂去除未结合的赫赛汀，2mM EDTA和树脂最终再悬浮在0.5ml PBS/EDTA中。
通过添加三(2-羧乙基)膦盐酸盐至1比4摩尔TCEP每摩尔赫赛汀的比例并且然后将悬液在环境温度下孵育2小时还原未结合的赫赛汀。
添加vcMMAE和二甲基乙酰胺(DMA)，以实现2.5至10摩尔的vcMMAE每摩尔赫赛汀和5％v/v的DMA并且使得缀合在环境中进行30分钟。添加N-乙酰基半胱氨酸(NAC)，以淬火未反应的vcMMAE并且使得反应20分钟，然后用PBS/EDTA/5％v/v DMA和0.1M甘氨酸pH5.0顺序清洗树脂。
用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱缀合物。将洗脱的缀合物收集至2％v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)，以使它们中和。
产生和分析具有vcMMAE和匹配的DAR的赫赛汀相当系列的溶液相缀合物，以提供固相和溶液相缀合物质量的比较。
然后通过疏水作用色谱法(图1)和尺寸排阻色谱法(图2)分析洗脱的缀合物，以测定百分数聚集体和平均药物负载。
结果总结在下面表2中：
数据显示，在固体载体上，TCEP与抗体比例和最终药物负载之间的关系是线性的。另外，当与在溶液中制备的等量缀合物比较时，固相缀合物显示更低的百分数聚集。
实施例3–柱上固相部分TCEP还原
该实施例显示固定的抗体缀合可以卓越的再生性适合色谱流方法。
通过以120cm/hr负载，将赫赛汀(5ml的2mg/ml PBS，pH 7.4)结合至1ml的FabsorbantTM F1P HF树脂柱(之前在PBS中平衡)。通过用PBS、2mM EDTA平衡树脂，制备结合的赫赛汀用于还原。
微型蠕动泵用于产生小体积的PBS/EDTA再循环回路通过添加TCEP的柱(柱外部约200μL)，以产生2TCEP每摩尔赫赛汀的摩尔比。这使得在环境下再循环120分钟，以使赫赛汀还原。
容器和柱的内容物被冲洗以进行破坏(waste)，并且用添加vcMMAE的PBS/EDTA/5％v/v DMA替换，以产生5vcMMAE每摩尔还原的赫赛汀的摩尔比。这使得在环境下再循环60分钟，以缀合还原的赫赛汀。
添加N-乙酰基半胱氨酸(NAC)，以淬火未反应的vcMMAE并且使得反应20分钟，然后用PBS/EDTA/5％v/v DMA和0.1M甘氨酸pH5.0顺序清洗树脂。
用0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱缀合物。将洗脱的缀合物收集至2％v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)中，以使它们中和。
在独立第二实验中使用第二个柱/操作器重复该过程。
然后通过疏水作用色谱法(图3)和尺寸排阻色谱法(图4)分析洗脱的缀合物，以测定百分数聚集物和平均药物负载。
结果总结在下面表3中：
制备方法 DAR ％聚集
赫赛汀 0 0.2
溶液相 2.4 0.6
柱A 2.4 0.3
柱B 2.4 0.3
数据显示当适应色谱流模式时，vcMMAE与赫赛汀的缀合关于平均药物负载和聚集产生是一致的。当TCEP与抗体比例匹配时，在批量模式和色谱模式中实现的DAR是相同的。
实施例4-在批量模式中经赖氨酸侧链的SMCC活化用DM1的固相赫赛汀缀合。
该实施例显示固定的抗体可通过用SMCC修饰随后用DM1缀合而缀合在赖氨酸的侧链上，并且相对于在溶液中制备的相同缀合物提高了产物质量。
通过轻轻混合树脂淤浆和抗体溶液30分钟，将赫赛汀(0.5ml的4mg/ml PBS，pH7.4)结合至100μl(固定树脂体积)在PBS中平衡的FabsorbantTM F1P HF树脂。通过用PBS随后用‘改性缓冲液’(50mM NaPi、150mM NaCl、2mM EDTA pH6.7)清洗树脂去除未结合的赫赛汀，并且最终树脂再悬浮在包含5％v/v DMA的改性缓冲液中。
通过添加4-(N-马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)至5至20摩尔SMCC每摩尔赫赛汀的比例，并且然后在环境温度下孵育悬液4小时，使结合的赫赛汀改性。通过用PBS/5％v/v DMA随后用‘缀合缓冲液’(35mM柠檬酸钠、150mM NaCl、2mM EDTApH5.0)清洗树脂去除未反应的SMCC，并且最终将树脂再悬浮在包含3％v/v DMA的缀合缓冲液中。
添加DM1以实现15摩尔的DM1每摩尔赫赛汀并且使得缀合在环境中进行18小时。然后用PBS/EDTA/5％v/v DMA和0.1M甘氨酸pH5.0顺序清洗树脂。
用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱缀合物。洗脱的缀合物收集至2％v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)中，以使它们中和。
通过使赫赛汀与7.6摩尔的SMCC随后5摩尔的DM1每摩尔赫赛汀反应产生赫赛汀与DM1与匹配DAR的等量溶液相缀合物，并且分析以提供固相和溶液相缀合物质量的比较。改性和缀合反应期间赫赛汀的浓度分别是10和5mg/ml。
然后通过尺寸排阻色谱和UV分析洗脱的缀合物，以测定百分数聚集体和平均药物负载。
结果总结在下面表4中：
数据显示，在固体载体上，赖氨酸侧链缀合是可能的，并且SMCC与抗体比例和最终药物负载之间的关系是线性的。
另外，当比较在溶液中制备的等量缀合物时，固相缀合物显示等量的百分数聚集，但是在缀合反应期间四倍的蛋白质浓度增加。

Claims (59)

1.合成生物分子-药物-缀合物的方法，所述方法包括：
(i)使生物分子在适于固定所述生物分子的情况下与FAbsorbent F1P HF树脂、MAbsorbent A1P树脂或MAbsorbent A2P树脂或非肽型的蛋白质A或L模拟物捕获树脂接触，从而提供固定的生物分子，其中所述捕获树脂包含用于生物分子的捕获部分，其中所述捕获部分为：
下式的分支配体支架：
其中R1和R2相同或不同并且每个是任选取代的烷基或芳基配体，和R3是任选地通过间隔基序附着的固体载体；或
下式的分支三唑基支架：
其中Q表示与固体载体基质的附着点，任选地具有间隔基序，和基团A和B是用一个或多个能够氢键合的取代基取代的苯基或萘基基团；
其中所述生物分子是抗体、改性的抗体或抗体片段；
(ii)任选地使所述固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂，以提供化学改性的或活化的固定的生物分子；
(iii)使所述固定的生物分子或所述化学改性的或活化的固定的生物分子接触药物组分，以形成固定的生物分子-药物-缀合物；
(iv)从所述捕获树脂释放所述生物分子-药物-缀合物。
2.权利要求1所述的方法，其中基团A和B是用一个或多个–OH、–SH或–CO2H取代的苯基或萘基基团。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括用所述捕获树脂孵育所述生物分子。
4.权利要求3所述的方法，其中所述孵育在10℃至40℃的温度进行。
5.权利要求4所述的方法，其中所述孵育在15℃至37℃的温度进行。
6.权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述孵育进行10分钟至18小时的时段。
7.权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述孵育在缓冲液中进行。
8.权利要求7所述的方法，其中所述孵育在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。
9.权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述孵育在5至8的pH进行。
10.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之后，清洗所述固定的生物分子，以去除还未固定在所述捕获树脂上的任何生物分子。
11.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括使所述生物分子还原。
12.权利要求11所述的方法，其中通过使所述生物分子接触还原剂，使所述生物分子还原。
13.权利要求12所述的方法，其中所述还原剂为三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙胺。
14.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括使所述生物分子与交联剂部分反应。
15.权利要求14所述的方法，其中所述交联剂部分是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
16.权利要求11所述的方法，步骤(ii)在缓冲液中进行。
17.权利要求16所述的方法，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
18.权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)在7至8的pH进行。
19.权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)在存在螯合剂的情况下进行。
20.权利要求19所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA。
21.权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)包括用还原剂孵育所述生物分子6小时至18小时的时段。
22.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后，清洗所述活化的固定的生物分子以去除任何改性试剂/活化试剂。
23.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在缓冲液中使所述化学改性的或活化的固定的生物分子与药物组分接触。
24.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在7至8的pH使所述化学改性的或活化的固定的生物分子与药物组分接触。
25.权利要求24所述的方法，其中所述pH为7.4。
26.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(iii)在存在螯合剂的情况下进行。
27.权利要求26所述的方法，其中所述螯合剂为EDTA。
28.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括用药物组分孵育所述化学改性的或活化的固定的生物分子6小时至18小时的时段。
29.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之后，清洗所述固定的生物分子-药物-缀合物以去除任何未反应的药物组分。
30.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(iv)包括改变pH，以破坏载体-生物分子结合。
31.权利要求30所述的方法，其中所述pH下降至小于pH 5。
32.权利要求31所述的方法，其中所述pH下降至pH 3。
33.权利要求30所述的方法，其中在从所述捕获树脂释放所述缀合物的步骤之后使洗脱的生物分子-药物-缀合物中和，任选地所述缀合物被捕获至2％v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)中。
34.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述捕获树脂的生物分子捕获部分具有1000Da或更小的分子量。
35.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物分子是抗体。
36.权利要求35所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
37.权利要求36所述的方法，其中所述单克隆抗体是曲妥珠单抗。
38.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述药物是微管蛋白抑制剂或DNA相互作用试剂。
39.权利要求38所述的方法，其中所述微管蛋白抑制剂选自：(a)阿里他汀；和(b)美登素衍生物。
40.权利要求38所述的方法，其中所述DNA相互作用试剂选自：(a)刺孢霉素、(b)多米卡新和(c)吡咯并苯二氮杂(PBDs)。
41.一种混合物，其包括：
(i)捕获树脂，在其上固定了抗体、改性的抗体或抗体片段，其中所述捕获树脂为FAbsorbent F1P HF树脂、MAbsorbent A1P树脂或MAbsorbent A2P树脂或包含用于生物分子的捕获部分的非肽型的蛋白质A或L模拟物捕获树脂，其中所述捕获部分为：
下述通式的分支配体支架：
其中R1和R2相同或不同并且每个是任选取代的烷基或芳基配体，和R3是任选地通过间隔基序附着的固体载体；或
下式的分支三唑基支架：
其中Q表示与固体载体基质的附着点，任选地具有间隔基序，和基团A和B是用一个或多个能够氢键合的取代基取代的苯基或萘基基团；和
(ii)还原剂或交联剂部分。
42.权利要求41所述的混合物，其中基团A和B是用一个或多个–OH、–SH或–CO2H取代的苯基或萘基基团。
43.权利要求41所述的混合物，其中所述捕获树脂包括在其表面上固定的抗体、改性的抗体或抗体片段。
44.权利要求41-43中任一项所述的混合物，其中所述捕获树脂的生物分子捕获部分具有1000Da或更小的分子量。
45.权利要求41-43中任一项所述的混合物，其中所述生物分子是抗体。
46.权利要求45所述的混合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
47.权利要求46所述的混合物，其中所述单克隆抗体是曲妥珠单抗。
48.权利要求41-43中任一项所述的混合物，其中所述药物是微管蛋白抑制剂或DNA相互作用试剂。
49.权利要求48所述的混合物，其中所述微管蛋白抑制剂选自：(a)阿里他汀；和(b)美登素衍生物。
50.权利要求48所述的混合物，其中所述DNA相互作用试剂选自：(a)刺孢霉素、(b)多米卡新和(c)吡咯并苯二氮杂(PBDs)。
51.捕获树脂在合成生物分子-药物-缀合物中的用途，其中所述捕获树脂为FAbsorbent F1P HF树脂、MAbsorbent A1P树脂或MAbsorbent A2P树脂或包含用于生物分子的捕获部分的非肽型的蛋白质A或L模拟物捕获树脂，其中所述捕获部分为：
下述通式的分支配体支架：
其中R1和R2相同或不同并且每个是任选取代的烷基或芳基配体，和R3是任选地通过间隔基序附着的固体载体；或
下式的分支三唑基支架：
其中Q表示与固体载体基质的附着点，任选地具有间隔基序，和基团A和B是用一个或多个能够氢键合的取代基取代的苯基或萘基基团，
其中所述生物分子为抗体、改性的抗体或抗体片段。
52.权利要求51所述的用途，其中基团A和B是用一个或多个–OH、–SH或–CO2H取代的苯基或萘基基团。
53.权利要求51或52所述的用途，其中所述捕获树脂的生物分子捕获部分具有1000Da或更小的分子量。
54.权利要求51或52所述的用途，其中所述生物分子是抗体。
55.权利要求54所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
56.权利要求55所述的用途，其中所述单克隆抗体是曲妥珠单抗。
57.权利要求51或52所述的用途，其中所述药物是微管蛋白抑制剂或DNA相互作用试剂。
58.权利要求57所述的用途，其中所述微管蛋白抑制剂选自：(a)阿里他汀；和(b)美登素衍生物。
59.权利要求57所述的用途，其中所述DNA相互作用试剂选自：(a)刺孢霉素、(b)多米卡新和(c)吡咯并苯二氮杂(PBDs)。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201419184D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
GB201419185D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resin
HUE054726T2 (hu) 2016-03-02 2021-09-28 Eisai R&D Man Co Ltd Eribulinalapú antitest-gyógyszer konjugátumok és alkalmazási eljárások
AU2018241654A1 (en) * 2017-03-30 2019-11-07 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Method for preparing antibody-drug conjugate

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035199A1 (en) * 2002-10-21 2004-04-29 Cambridge University Technical Services Limited Affinity adsorbents for immunoglobulins
CN1993146A (zh) * 2004-06-01 2007-07-04 健泰科生物技术公司 抗体－药物偶联物和方法
CN102056943A (zh) * 2008-05-16 2011-05-11 Msd生物制剂（英国）有限公司 采用衍生的三嗪作为亲合配体的用于抗体片段的纯化方法
WO2012140433A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Adc Biotechnology Ltd System for purifying, producing and storing biomelecules
WO2012163805A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) -binding proteins
CN102858798A (zh) * 2010-03-02 2013-01-02 西雅图基因公司 筛选抗体的方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
GB9519197D0 (en) * 1995-09-20 1995-11-22 Affinity Chromatography Ltd Novel affinity ligands and their use
US6117996A (en) 1995-09-20 2000-09-12 Novo Nordisk A/S Triazine based ligands and use thereof
DK1386660T3 (da) 1996-08-30 2009-12-21 Upfront Chromatography As Isolering af immunoglobuliner
US6572767B2 (en) 2000-04-28 2003-06-03 Accurate Polymers, Ltd. Simulated activity of Protein A displayed by ligands attached to a cellulose bead surface
US20020197694A1 (en) * 2001-06-20 2002-12-26 Weiping Shao Conjugates of reduced antibodies and biomolecules
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US7786213B2 (en) * 2003-10-15 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Biomacromolecule polymer conjugates
ITMI20071119A1 (it) 2007-06-01 2008-12-02 Tecnogen Spa Nuovi ligandi sintetici per immunoglobuline e composizioni farmaceutiche che li comprendono
US20090240033A1 (en) 2008-03-11 2009-09-24 Rongxiu Li Affinity matrix library and its use
EP2842575B1 (en) * 2008-03-18 2017-09-27 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
US8541178B2 (en) * 2008-05-13 2013-09-24 Genentech, Inc. Analysis of antibody drug conjugates by bead-based affinity capture and mass spectrometry
WO2009141384A2 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Novo Nordisk A/S Process for the purification of factor vii polypeptides using affinity resins comprising specific ligands
WO2012099949A2 (en) 2011-01-18 2012-07-26 University Of Notre Dame Du Lac Antibody purification via affinity chromatography

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035199A1 (en) * 2002-10-21 2004-04-29 Cambridge University Technical Services Limited Affinity adsorbents for immunoglobulins
CN1993146A (zh) * 2004-06-01 2007-07-04 健泰科生物技术公司 抗体－药物偶联物和方法
CN102056943A (zh) * 2008-05-16 2011-05-11 Msd生物制剂（英国）有限公司 采用衍生的三嗪作为亲合配体的用于抗体片段的纯化方法
CN102858798A (zh) * 2010-03-02 2013-01-02 西雅图基因公司 筛选抗体的方法
WO2012140433A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Adc Biotechnology Ltd System for purifying, producing and storing biomelecules
WO2012163805A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Glaxo Group Limited Bcma (cd269/tnfrsf17) -binding proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antibodies and Genetically Engineered Related Molecules: Production and Purification;A. Cecilia A. Roque等;《Biotechnol. Prog.》;20040130;第20卷;第639-654页
Experimental and Theoretical Investigation of Effect of Spacer Arm and Support Matrix of Synthetic Affinity Chromatographic Materials for the Purification of Monoclonal Antibodies;Laura Zamolo等;《J. Phys. Chem. B》;20100630;第114卷;标题，第9367页左栏最后1段至右栏第1段，图1

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