ES2658420T3 - Método de síntesis de ADC utilizando resinas de afinidad - Google Patents

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Abstract

Un método para sintetizar un conjugado de biomolécula-fármaco, comprendiendo el método: (i) poner en contacto una biomolécula con resina F1P HF FAbsorbent, resina A1P MAbsorbent o resina A2P MAbsorbent o una resina de captura que comprende una fracción de captura para la biomolécula, en el que la fracción de captura es: un andamio de ligando ramificado de fórmula: **(Ver fórmula)** en el que R1 y R2 son iguales o diferentes y son cada uno de los ligandos alquilo o arilo opcionalmente sustituidos, y R3 es un soporte sólido opcionalmente unido por un motivo separador; o un andamio de triacilo ramificado de fórmula: **(Ver fórmula)** en el que Q representa el punto de unión a una matriz de soporte sólido, opcionalmente con un motivo separador y los Grupos A y B son grupos fenilo o naftilo sustituidos con uno o más sustituyentes capaces de formar puentes de hidrógeno, preferiblemente uno o más de -OH, -SH o- CO2H; en condiciones adecuadas para inmovilizar la biomolécula y, por lo tanto, proporcionar una biomolécula inmovilizada; en donde la biomolécula es un anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo; (ii) opcionalmente poner en contacto la biomolécula inmovilizada con un agente de modificación química o un agente activador para proporcionar una biomolécula inmovilizada modificada o activada químicamente; (iii) poner en contacto la biomolécula inmovilizada o la biomolécula inmovilizada modificada o activada químicamente con un componente de fármaco para formar un conjugado de biomolécula-fármaco inmovilizado; (iv) liberar el conjugado biomolécula-fármaco de la resina de captura.

Description

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imagen2
imagen3
residuos de lisina, la proteína G (swiss-prot P919909) tiene 59 residuos de lisina y la proteína L (swiss-prot Q51918) tiene 132 residuos de lisina.
Nombre
Objetivo Fármaco+Ligador Desarrollador Fase Indicación
ADCetris
CD30 vcE Seattle Genetics MA 2011 HL y ALCL
CR011-vcE
GPNMB vcE Celldex Ph II Mama, Melanoma
PSMA ADC
PSMA vcE Progenics Ph II Próstata
RG7593
CD22 vcE GNE/Roche Ph II Hematológico
RG7596
CD79b vcE GNE/Roche Ph II Hematológico
SGN-75
CD70 mcMMAF Seattle genetics Ph 1b NHL, RCC
AGS-5ME
SLC44A4 vcE Agensys Ph I Próstata, Pancreático
AGS-22ME
Nectin 4 vcE Agensys Ph I Tumores Sólidos
AGS-16M8F
ENPP3 mcMMAF Agnsys Ph I Carcinoma de Célula renal
BAY 79-4620
MN/CA-9 vcE Bayer Ph I Tumores Sólidos
MLN064
GCC vcE Takeda/Millenium Ph I Gastrointestinal
RG7450
STEAP 1 vcE GNE/Roche Ph I Próstata
RG7458
MUC16 vcE GNE/Roche Ph I Ovario
RG7598
? Auristatina GNE/Roche Ph I Mieloma Múltiple
RG7599
? Auristatina GNE/Roche Ph I NSCLC, Ovario
RG7600
? Auristatina GNE/Roche Ph I Pancreático, Ovario
RG7636
? Auristatina GNE/Roche Ph I Melanoma
Kadcyla
Her2 SMCC DM1 GNE/Roche MA 2013 Cáncer de mama
Lorvotuzumab
CD56 SPP-DM1 Immunogen Ph II MM, Célula de Merkel
SAR3419
CD19 SPDB-DM4 Sanofi Aventis Ph II NHL, B-ALL
SAR566658
CA6 SPDB-DM4 Sanofi Aventis Ph I Mama, Ovario
BT-062
CD138 SPDB-DM4 Biotest Ph I Mieloma Múltiple
IMGN-529
CD37 SPDB-DM4 Immunogen Ph I NHL
IMG-853
FoIR1 SPDB-DM4 Immunogen Ph I Ovario NSCLC
BAY-94-9343
Mesotelina SPDB-DM4 Bayer Ph I Meso tumores
AMG-595
EGFRvIII DM1 Amgen Ph I Glioma Recurrente
AMG-172
? DM1 Amgen Ph I Cáncer Renal
CMC-544
CD22 Caliqueamicina Pfizer Ph III Células B ALL
5 Además de la competición entre los residuos de lisilo de ligando y anticuerpo como se describió anteriormente, también existen otros problemas con las resinas de captura basadas en Proteína A, G y L. Estos incluyen la lixiviación de la proteína y la inmunogenicidad de los aductos lixiviados. Esto significa que estos soportes de afinidad no pueden emplearse (para purificación o conjugación) hacia el final de un proceso de fabricación. Cualquier material conjugado suministrado a partir de un proceso de este tipo que emplee resinas de captura basadas en Proteína A, G y L no cumplirá con las directrices
10 reguladoras actuales para la purificación de anticuerpos y la calidad del producto.
Método para sintetizar una biomolécula inmovilizada, activada y modificada químicamente.
De acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un método para sintetizar una biomolécula inmovilizada 15 químicamente modificada o activada, el método comprende:
(i)
poner en contacto una biomolécula con una resina de captura en condiciones adecuadas para inmovilizar la biomolécula y, por lo tanto, proporcionar una biomolécula inmovilizada; en donde la biomolécula es un anticuerpo, anticuerpo modificado
o fragmento de anticuerpo; y en el que la resina de captura comprende una fracción de captura de biomoléculas
20 seleccionado del grupo que consiste en: (1) una base no peptídica, que incluye aminoácidos, Proteína A, Proteína G o proteína L miméticas, (2) un péptido basado en Proteína A, proteína G o proteína L miméticas, (3) una fracción de captura del sitio de unión a nucleótidos y (4) una fracción de captura de glicoproteína; y
(ii) poner en contacto la biomolécula inmovilizada con un agente de modificación química o un agente activador para 25 proporcionar una biomolécula inmovilizada modificada o activada químicamente.
La conjugación de proteínas y más específicamente anticuerpos se usa a menudo en investigación, diagnóstico y terapéutica. Bioconjugate Techniques, segunda edición (Greg T Hermanson) proporciona información muy detallada sobre la química, los sistemas de reactivos y las aplicaciones prácticas para crear moléculas etiquetadas o conjugadas. También 30 describe docenas de reacciones con detalles sobre cientos de reactivos disponibles comercialmente y el uso de estos reactivos para modificar o reticular péptidos y proteínas, azúcares y polisacáridos, ácidos nucleicos y oligonucleótidos,
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que incluye un disolvente tal como DMSO o DMF. El codisolvente puede estar presente dentro de un rango de 0.5-80% v/v, tal como 0.5-50% v/v.
En una realización, la incubación se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, más preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En una realización preferida, la incubación se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.5, idealmente a un pH de aproximadamente 6.5. En otra realización preferida, la incubación se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, idealmente a un pH de aproximadamente 7.4. Esto da como resultado una unión mejorada del anticuerpo al soporte derivado.
En una realización, la biomolécula inmovilizada (es decir, la biomolécula que se inmoviliza en la resina de captura) se lava para eliminar cualquier biomolécula que no se haya inmovilizado en la resina de captura. El lavado de la biomolécula inmovilizada puede verse afectado por el enjuague con disolvente fresco. Por ejemplo, el lavado de la biomolécula inmovilizada puede verse afectado por el enjuague con una solución tampón tal como PBS. Opcionalmente, el enjuague de la biomolécula inmovilizada se lleva a cabo en presencia de un agente quelante, tal como EDTA. Alternativamente, el lavado de la biomolécula inmovilizada puede verse afectado por un enjuague con un “tampón de modificación” que incluye un tampón de fosfato de sodio, NaCl y un agente quelante, tal como EDTA.
Etapa (ii):
En una realización, la etapa de poner en contacto la biomolécula inmovilizada con un agente de modificación química o un agente activador para proporcionar una biomolécula inmovilizada modificada o activada implica reducir la biomolécula. En una realización, la reducción de la biomolécula implica una reducción completa. En una realización, la reducción de la biomolécula implica una reducción parcial. En una realización, la reducción de la biomolécula implica una reducción completa seguida de una reoxidación.
En una realización, la biomolécula se reduce al ponerla en contacto con un agente reductor tal como tris (2carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), merceptoetilamina u otro reductor adecuado. Preferiblemente, el agente reductor es tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).
En una realización, la biomolécula reducida se reoxida poniéndola en contacto con un agente oxidante tal como aire, CuSO4
o ácido dehidroascórbico (DHAA). Preferiblemente, el agente oxidante es ácido deshidroascórbico (DHAA).
En una realización, el proceso de reducción de la biomolécula se lleva a cabo en una solución tampón tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS).
En una realización, el proceso de reducción de la biomolécula se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, preferiblemente aproximadamente 7.4.
En una realización, el proceso de reducción de la biomolécula se lleva a cabo en presencia de un agente quelante, tal como EDTA.
En una realización, el proceso de reducción de la biomolécula implica incubar la biomolécula con el agente reductor durante un período de tiempo de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 3 días, opcionalmente, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 días y además opcionalmente de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 18 horas.
En una realización, la etapa de poner en contacto la biomolécula inmovilizada con un agente de modificación química o un agente activador para proporcionar una biomolécula inmovilizada modificada o activada implica hacer reaccionar la biomolécula con una fracción de entrecruzador. Por ejemplo, la fracción de entrecruzamiento podría ser un entrecruzador de amina a sulfhidrilo, por ejemplo, un entrecruzador que tiene un éster de NHS y un grupo reactivo de maleimida en los extremos opuestos. Este procedimiento de modificación o activación de la biomolécula da como resultado un conjugado biomolécula-enlazador-fármaco. Los entrecruzadores adecuados generalmente son capaces de reaccionar con un grupo amino primario en el fármaco (a través del extremo del éster NHS reactivo) y también reaccionan con un residuo de cisteína en la biomolécula (a través del extremo reactivo de maleimida). En este ejemplo particular, el extremo de maleimida reaccionará con una cisteína en la biomolécula inmovilizada. Un ejemplo de tal entrecruzador es succinimidil 4-(Nmaleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC).
En una realización, el proceso de reacción con un entrecruzador se lleva a cabo en una solución tampón tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Alternativamente, el proceso de reacción con un entrecruzador se lleva a cabo en un “tampón de modificación” que incluye un tampón de fosfato de sodio, NaCl y un agente quelante, tal como EDTA.
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NEM y solvente y no comprometen la interpretación de los datos del bioensayo. Con la resina F1P HF FAbsorbent™, este enfoque es útil para seleccionar paneles de monoclonales murinos como parte de la selección de clones para el posterior desarrollo de conjugación de fármacos con anticuerpos, para producir ADC directamente a partir de sobrenadantes de cultivos tisulares que contienen fragmentos intactos y fragmentos Fab.
5 Ejemplo 2 -Reducción de TCEP parcial en fase sólida en modo de lotes
Este ejemplo muestra que los anticuerpos inmovilizados pueden conjugarse con una carga de fármaco definida por reducción parcial de los enlaces disulfuro intercatenarios seguido de la conjugación con vcMMAE y que la calidad del
10 producto aumenta con respecto a los mismos conjugados preparados en solución.
Herceptina (0.5 ml de 2 mg/ml de PBS, pH 7.4) se unió a 100 µΙ (volumen de resina sedimentada) de resina F1 P HF FAbsorbent ™ equilibrada en PBS mezclando la suspensión de resina y la solución de anticuerpo suavemente durante 30 minutos. La Herceptina no unida se eliminó lavando la resina con PBS, EDTA 2 mM y la resina finalmente se resuspendió en
15 0.5 ml de PBS/EDTA.
La Herceptina unida se redujo mediante la adición de hidrocloruro de tris-(2-carboxietil)fosfina a una relación de 1 a 4 moles de TCEP por mol de Herceptina y luego incubando la suspensión a temperatura ambiente durante 2 horas.
20 Se añadieron vcMMAE y dimetilacetamida (DMA) para conseguir 2.5 a 10 moles de vcMMAE por mol de Herceptina y 5% v/v de DMA y la conjugación se dejó avanzar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió N-acetil cisteína (NAC) para inactivar vcMMAE sin reaccionar y se dejó reaccionar durante 20 minutos antes de lavar la resina secuencialmente con PBS/EDTA/DMA al 5% v/v y glicina 0.1 M pH 5.0.
25 Los conjugados se eluyeron con glicina 0.1 M pH 3.0. Los conjugados eluidos se recogieron en 2% v/v de tris (hidroximetil) aminoetano (TRIS) 1 M para neutralizarlos.
Se produjo y analizó una serie equivalente de conjugados en fase de solución de Herceptina con vcMMAE con DAR apareado para proporcionar una comparación de la calidad del conjugado en fase sólida y en fase de solución.
30 Los conjugados eluidos fueron luego analizados por Cromatografía de interacción hidrófoba (Figura 1) y Cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2) para determinar el porcentaje de agregado y la carga promedio de fármaco.
Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación: 35
DAR
% de Agregado de Solución % de Agregado de Sólido
0 (Herceptina)
0.2
1.3
0.4 0.3
2.4
0.7 0.3
3.4
1.1 0.3
4.4
1.5 0.3
Los datos muestran que en los soportes sólidos la relación entre TCEP a la proporción de anticuerpos y la carga final del fármaco es lineal. Además, cuando se compara con un conjugado equivalente hecho en solución, los conjugados en fase sólida muestran una menor agregación porcentual.
40 Ejemplo 3 -Reducción de TCEP parcial en fase sólida en columna
Este ejemplo muestra que la conjugación de anticuerpos inmovilizados se puede adaptar a un proceso de flujo cromatográfico con excelente reproducibilidad.
45 Herceptina (5 ml de 2 mg/ml de PBS, pH 7.4) se unió a una columna de 1 ml de Resina F1P HF FAbsorbent™ (previamente equilibrada en PBS) cargando a 120 cm/h. La Herceptina unida se preparó para la reducción equilibrando la resina con PBS, EDTA 2 mM.
50 Se usó una bomba microperistáltica para crear un circuito de recirculación de PBS/EDTA de pequeño volumen a través de la columna (aproximadamente 200 µL externa a la columna) a la que se añadió TCEP para dar una relación molar de 2 TCEP por mol de Herceptina. Esto permitió recircular durante 120 minutos a temperatura ambiente para reducir la Herceptina.
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