KR20230117186A - 정전기 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

정전기 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230117186A
KR20230117186A KR1020237022270A KR20237022270A KR20230117186A KR 20230117186 A KR20230117186 A KR 20230117186A KR 1020237022270 A KR1020237022270 A KR 1020237022270A KR 20237022270 A KR20237022270 A KR 20237022270A KR 20230117186 A KR20230117186 A KR 20230117186A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protamine
antibody
sirna
smcc
mab
Prior art date
Application number
KR1020237022270A
Other languages
English (en)
Inventor
세바스티안 보이머
니콜 보이머
볼프강 베르델
게오르그 렌츠
리사 비트만
안드레아스 파우스트
Original Assignee
세바스티안 보이머
니콜 보이머
볼프강 베르델
게오르그 렌츠
리사 비트만
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 세바스티안 보이머, 니콜 보이머, 볼프강 베르델, 게오르그 렌츠, 리사 비트만 filed Critical 세바스티안 보이머
Publication of KR20230117186A publication Critical patent/KR20230117186A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/57—Compounds covalently linked to a(n inert) carrier molecule, e.g. conjugates, pro-fragrances

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

본 발명은 (c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자, 뿐만 아니라 (a) 양전하의 폴리펩티드; (b) 양전하의 폴리펩티드에 접합된 항체를 포함하는 제2 접합체(B); (c) 하나 이상의 음전하의 분자를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 나노입자를 포함하는 조성물 및 치료요법에 사용하기 위한 본 발명의 나노입자 또는 조성물에 관한 것이다.

Description

정전기 나노입자 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 2일에 출원된 룩셈부르크 특허 출원 번호 제102272호, 2021년 5월 21일에 출원된 유럽 특허 출원 번호 제21175260.5호 및 2021년 10월 29일에 출원된 유럽 특허 출원 번호 제21205482.9호에 대하여 우선권을 주장하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 나노입자 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 뿐만 아니라 (a) 양전하의 폴리펩티드; (b) 양전하의 폴리펩티드에 접합된 항체를 포함하는 제2 접합체(B); (c) 하나 이상의 음전하의 분자를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 나노입자를 포함하는 조성물 및 치료요법(therapy)에 사용하기 위한 본 발명의 나노입자 또는 조성물에 관한 것이다.
RNA 억제 원리(RNAi)는 의료 응용에 대한 높은 기대를 불러일으켰고 2006년 노벨상을 수상했다. 이 방법은 유전자 특이적 siRNA 올리고뉴클레오티드의 선택 및 합성에 의해 mRNA의 불활성화 및 후속적으로 사실상 모든 유전자의 발현의 침묵화에 의해 고효율을 나타낸다. 이 방법은 분자 생물학에 혁명적이지만, 이 원리를 치료 분야로 번역하는 것은 수많은 특정 문제로 인해 어려운 것으로 판명되었다.
siRNA 올리고는 뉴클레아제의 공격을 받고 높은 면역원성과 신장 클리어런스를 나타내므로 "네이키드 siRNA"의 반감기와 순환 시간이 종종 기대치보다 훨씬 낮다. 결과적으로, siRNA는 나노입자 또는 캡슐과 같은 안정제와 착화되었다. 이러한 안정제를 사용하면 siRNA의 순환 시간과 생체이용률이 증가하지만, a) 특정 표면 분자를 가진 세포를 표적으로 하여 이들 세포에 siRNA를 전달하고 b) 음이온성 세포질 막 위의 음이온성 siRNA의 표적 특이적인 전달을 가능하게 하는, 표적 세포 결정 구조가 여전히 부족하다.
신경 장애, 바이러스 감염 및 암의 치료를 위해 수많은 임상 단계 연구 I 내지 III가 수행되었지만, 지금까지 단 하나의 siRNA만이 FDA의 승인을 받았다. 예를 들어 Patisiran(상표명 Onpattro)은 유전성 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증 환자의 다발신경병증 치료용 약제이다. 유전성 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증은 전 세계적으로 50,000명에게 영향을 미치는 것으로 추정되는 치명적인 희귀 질환이다.
종양 장애의 치료를 위한 모듈식 치료 접근법을 개발하기 위해, siRNA를 암세포 특이적 표면 분자에 대한 항체에 연결하고, siRNA를 의도한 암 세포에 전달하고 수용체와 같은 각각의 표면 분자에 결합하고 수용체 의존 방식으로 내재화되는 특정 양이온성 펩티드인 프로타민에 의해 결합 시 내재화를 일으키는 시스템을 개발했다.
프로타민은 정자 머리에 압축된 완전한 게놈 DNA 세트를 운반하는 양이온성 핵산-결합 펩티드이다. 이는 핵산과 복합체를 형성할 수 있고 세포질 막을 가로질러 핵산의 전이를 촉진할 수 있기 때문에, 형질감염, 표적 전달 및 유전자 치료에 대한 응용을 연구하기 위해 수많은 연구자들을 끌어들였다(Choi et al., 2009; Chono et al., 2008; Hansen et al., 1979; He et al., 2014; Liu, B., 2007). 프로타민은 핵산 전달 비히클로서 테스트되었고 다양한 세포 결정 표적 부분에 연결되었다. 2005년에, Song 등(Song et al., 2005a)은 인간 면역결핍 바이러스 HIV gp 160 외피 단백질 및 단축된 프로타민 펩티드에 대한 Fab 단편(F105)을 연결하는 유전적 융합 단백질을 제시하였다. 융합 단백질은 HIV gag 단백질을 표적으로 하는 siRNA와 복합체를 형성했고, 접합체는 형질감염이 어려운 HIV 감염 T 세포와 HIV 외피 형질감염 흑색종 세포를 표적화할 수 있었다. siRNA-F105 운반체 접합체는 감염된 T 세포에서 HIV 복제를 억제했다. 표적화 원리를 검증하기 위해, 프로타민에 융합된 Erb2 단일 사슬 항체에 의한 표적 ErbB2에 동일한 전략이 적용되었다. 이와 함께, 프로타민과 세포 결정인자 사이의 유전적 융합이 여러 간행물에서 뒤따랐지만 이 개념은 임상으로 성공적으로 번역되지 않았다.
이전 연구에서, 본 출원의 발명자는 항-EGFR 단클론 항체(mAB) 세툭시맙을 문헌[Baumer, N. et al., 2016 Nat. Protoc. 11, 22-36], 문헌[Baumer, N. et al., 2018 PLoS One 13, e0200163]; 및 문헌[Baumer, S. et al., 2015 Clin Cancer Res 21, 1383-94]에 기재된 화학적 접합 방식에 따라 이중특이적 가교제 설포-SMCC에 의해 양이온성 펩티드 프로타민에 접합시켰다. 생성된 IgG-프로타민 접합체 분자는 EGF 수용체를 내재화하고 표적 세포에 siRNA를 전달할 수 있었다.
본 발명의 목적은 표적 세포에 음이온 분자를 전달하기 위한 추가의 바람직하게 개선된 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 (c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 양전하의 폴리펩티드; (b) 양전하의 폴리펩티드에 접합된 항체를 포함하는 제2 접합체(B); (c) 하나 이상의 음전하의 분자를 포함하는 나노입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료요법에 사용하기 위한 본 발명의 나노입자 또는 조성물에 관한 것이다.
도 1: 문헌[Baumer, N. et al., 2016)]에 개시된 접합 절차의 적용에 의한 다양한 항체-SMCC-프로타민 접합체의 형성. 반응 후 과량의 설포-SMCC가 고갈되지 않으면(도 2에서와 같이), 잔여 가교제가 IgG, 프로타민-SMCC 및 반응성 설포-SMCC로부터 다양한 접합체를 형성할 수 있다. SDS-PAGE에 의해 관찰될 수 있는 의도하지 않은 부산물의 예는 다음과 같다: 프로타민에의 동일한 가교결합이 수반된, 과량의 설포-SMCC(A 및 B: 항-EGFR-mAB 세툭시맙)에 의해 내부적으로 가교된 IgG. 또한, 겔 B)에서 보여지는, 프로타민에의 동일한 가교결합이 수반된, 환원불가능한 (A) 고분자량 IgG 다량체가 관찰되었다. 극단적으로, 의도하지 않은 부반응의 복잡성으로 인해, 가능한 모든 접합체 a 내지 d의 혼합물에 의해 형성된, 클라우드(B)가 나타날 수 있다. HC: 중쇄, LC: 경쇄. 미반응 SMCC가 고갈되지 않으면, 원치않는 부산물이 형성되어, 의도한 생성물(c)의 기능을 방해할 수 있다. 예를 들어, 반응성 SMCC는 주어진 IgG 분자(a)에서 경쇄에서 중쇄로의 가교결합 또는 IgG 이량체(d)를 형성하는 두 개의 IgG 분자의 가교결합을 유발할 수 있다.
도 2: 문헌[Baumer, N. et al., 2016]에 개시된 접합 절차의 변형. A: 설포-SMCC를 프로타민과 커플링한 후 과량의 설포-SMCC가 고갈되지 않으면 잔여 가교제가 IgG, 프로타민-SMCC 및 반응성 설포-SMCC로부터 다양한 접합체를 형성할 수 있다. 대신에, 항체-SMCC-프로타민 접합체는 이전 프로토콜에서 커플링 과정 후에 탈염되었다. 새 프로토콜에서는 이 단계가 생략되었다. (C: 항-EGFR-항체 세툭시맙, D: 항-IGF1R-항체 ImcA12). SDS-PAGE에서 관찰할 수 있는 의도하지 않은 부산물의 예는 원으로 강조 표시된다. B: 이제 새로운 접합 프로토콜에는 설포-SMCC와 프로타민의 커플링 후 정제 단계가 포함된다. SMCC-프로타민 접합체는 유리 설포-SMCC를 유지하고 SMCC-프로타민 접합체를 용출하는 Zeba-Spin 겔 정제 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 설포-SMCC로부터 고갈된다. 그 결과, IgG 항체 세툭시맙(Cet; E) 및 ImcA12(A12; F)의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)에 대한 SMCC-프로타민의 정의된 접합 생성물이 이제 형성되어 Coomassie-stained SDS-PAGE에서 관찰될 수 있다. HC: 중쇄, LC: 경쇄, P: 프로타민. 미반응 SMCC가 고갈되지 않으면, 원치않는 부산물이 형성되어 의도한 생성물(c)의 기능을 방해할 수 있다. 예를 들어, 반응성 SMCC는 주어진 IgG 분자(a)에서 경쇄에서 중쇄로의 가교결합 또는 IgG 이량체(d)를 형성하는 두 개의 IgG 분자의 가교결합을 유발할 수 있다.
도 3: NSCLC에서 KRAS를 표적으로 하는 항체-매개 siRNA. A: 항-EGFR-단클론 항체(mAB) 세툭시맙과 프로타민 사이의 표적화 작제물. B: 항-EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민(P/P) 복합체(α-EGFR-mAB)는 항체 1몰 당 최대 8몰의 siRNA와 결합한다. C: 세툭시맙(항-EGFR-mAB-) 프로타민/유리 SMCC-프로타민(P/P)은 Alexa488-태깅된(흰색 점, 왼쪽 상단 패널) siRNA를 엔도솜으로 수송하지만 리소좀으로는 수송하지 않는 데, 이는 Alexa488 양성 소포가 리소좀 마커 Lysotracker(흰색 점, 오른쪽 상단 패널)와 겹치지 않기 때문이다. D: α-EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민/siRNA(α, 항; P/P 함유) 처리된 NSCLC 세포는 KRAS siRNA에 의한 침묵된 KRAS 발현을 나타내었지만, 대조군 siRNA는 그렇지 않았다. E: α-EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민/siRNA(P/P)로 처리된 세포는 wt 및 G12D 돌연변이 대립유전자를 표적으로 하는 KRAS siRNA와의 콜로니 형성이 상당히 감소됨을 나타냈다. F: 대조군 및 KRAS-siRNA와의 복합체로 체계적으로 적용된 α-EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민은 이종이식된 SKLU1 및 A549 세포를 갖는 CD1-누드 마우스에서 내약성이 우수했고, α-EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민/KRAS-siRNA는 SKLU-종양 및 A549-종양에서 종양 성장을 상당히 억제했다. G: A549 종양은 세툭시맙-P/P 운반 대조군(스크램블드) siRNA에 의해 이미 치료학적으로 억제되었지만, KRAS siRNA 처리군의 종양은 어떤 대조군보다 무게가 상당히 가벼웠다. 절제된 종양은 H에 제시되었다: 통계: F를 제외한 모든 실험에서 평균 +/- 표준 편차, 여기서 표준 오차 평균(SEM)이 선택되었다. 유의성: *p < 0.05, 양측 t-테스트.
도 4: 증식 마커 Ki67은 KRAS 녹다운을 갖는 NSCLC 이종이식편에서 덜 풍부하다. 조직학적 이종이식 절편에서 증식 마커 Ki67(A, C, E 및 G, I, K의 회색 점)의 면역형광 결정. PBS 및 대조군 siRNA 운반체 처리군과 비교하여, A549(A - F)와 SK-LU1(G - L)의 KRAS siRNA 처리된 종양 조직 절편에서 Ki67 양성 핵의 수가 크게 감소했다.
도 5: NSCLC 이종이식편은 더 많은 양의 아폽토시스 세포를 나타낸다. TUNEL 분석에 의한 이종이식 종양 절편에서의 아폽토시스의 면역조직학적 할당. A - L: 두 이종이식 세포주에서, 대조군과 비교하여 KRAS siRNA 운반체 처리된 종양에서 증가된 세포사멸률이 관찰되었다. M - N: 절편에서 TUNEL 양성 핵의 통계: TUNEL 양성 핵의 수는 PBS 처리와 비교하여 EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민(mAB-P/P)으로 처리된 A549 종양에서 2배 증가하고, KRAS siRNA 운반체로 처리된 종양에서 3배 증가했다. SK-LU1에서는 EGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민 KRAS siRNA 처리만이 아폽토시스 세포를 4배 증가시켰다. α, anti; cntr, 대조군.
도 6: 횡문근육종(RMS) 세포주가 항체-siRNA 복합체에 의해 표적화될 수 있다. A: 세포 표면 수용체 EGFR 및 IGF1R의 발현은 2개의 RMS 세포주에서 시험되었으며, IGFR1R 및 EGFR은 두 세포주 모두에서 발현된다. B: 세툭시맙-프로타민(유리 SMCC-프로타민(/P/P)을 함유하는 EGFR-mAB-P)은 Alexa488-마킹된 대조군 siRNA를 대부분의 RD 세포로 이동시켰지만(FACS 플롯 C에서 >90%), RH에-30에서는 덜 효과적이었다(FACS 제시되지 않음). 이에 RH-30은 항 IGF1R 지시된 GR11L-프로타민(P/P) 이동된 Alexa488 대조군 siRNA 에 의해 마킹되었다.
도 7: 소프트 한천 분석에서 RH30 감소된 콜로니 성장에서 cmyc/NRAS 및 KRAS 및 PAX3의 세툭시맙-프로타민/유리 SMCC-프로타민(P/P) 매개 siRNA 녹다운을 갖는 RD(배아 RMS, ERMS) 및 RH30(폐포 RMS, ARMS) 세포의 표적화. 세포를 수확하고, 지시된 바와 같이 c-Myc 및 NRAS에 대해 효과적인 2개의 siRNA 또는 대조군(scr)에 결합된 30 nM 세툭시맙-프로타민/P(유리 SMCC-/P를 함유하는 EGFR-mAB-P)로 처리하고, 소프트 한천에서 96개의 플레이트에 접종하고, 2주 동안 배양하고, 염색하고, 카운팅하였다(A). 2개의 효과적인 siRNA의 조합은 콜로니 수를 대조군의 87%에서 PBS 대조군에 대해 정규화된 63%로 감소시켰다(B). C: KRAS 또는 NRAS-특이적 siRNA에 결합된 EGFR-mAB-P/P로 RD 세포를 처리하면 각각의 세포에서 NRAS 발현이 적당히 감소되었다. P<0.001, 양측 T 검정 D: 서열 GGCCTCTCACCTCAGAATTC (siPFl, 서열 번호 49), GCCTCTCACCTCAGAATTCA (siPF2, 서열 번호 50), CCTCTCACCTCAGAATTCAA (siPF3, 서열 번호 51)는 서열 TGGCCTCTCACCTCAGAATTCAATTCGTC (서열 번호 48)로 표시되는 융합 종양유전자 PAX3-Fork head(FKHR)의 중단점 영역을 커버하는 siRNA의 각각의 부분을 나타내며, 밝은 회색은 PAX3 부분이고, 어두운 회색은 FKHR 부분이다. E: RH30 세포에서 PAX3-FKHR의 세툭시맙-프로타민/P 매개 siRNA 녹다운은 소프트 한천 분석에서 콜로니 성장을 감소시켰다. 콜로니 성장은 세툭시맙-매개 중단점-지향 siRNA siPF2(D에서 시각화된 siRNA 워킹)의 적용에 의해 상당히 억제될 수 있다. P<0.05, 양측 T 검정.
도 8: 항체-siRNA-P/P 복합체 형성은 IGF1R 표적화에 적용될 수 있다. A: 여기에 유세포 분석법으로 표시된, A673 유잉 육종 세포는 37℃에서 뮤린 항-IGF1R 항체 GR11L-설포-SMCC-프로타민/P 복합체, 예컨대 결합되지 않은 GR11L 항체를 내재화하며, 이는 내재화되지 않은 4℃ 대조군과 비교하여 히스토그램 신호의 왼쪽으로의 이동에 의해 표시된다. B: Alexa Fluor 488-siRNA로 구성된 A673 세포의 녹색 형광 세포질 소포 구조가 유리 SMCC-P를 함유하는 GR11L-프로타민에 의해 내재화되었지만(화살표, 오른쪽 이미지), 항체 접합체가 결여된 대조군 실험에서는 그렇지 않았다(왼쪽 이미지). 내재화된 Alexa Fluor 488-siRNA는 흰색 소포 침전물(흰색 화살표)로 보여질 수 있다. Hoechst에 의한 세포핵의 대비염색은 신장 모양의 구조로 회색으로 나타낸다. 박스 영역은 표시된 세포의 더 높은 배율을 제시한다. 스케일 바, 20 μm. C: 이어서, GSP 복합체를 발암성 융합 단백질 EWS-FLI1의 mRNA에 대한 siRNA에 결합시키고, A673 세포를 이들 복합체로 처리하였다. 그 결과, EWS-FLI1 발현은 여기서는 FLI1 발현의 웨스턴 블롯에서 검출된 바와 같이 하향조절되었다. EWS-FLI1(E/F)-특이적 siRNA 2는 EWS-FLI1 단백질 발현을 대조군 siRNA 및 PBS 대조군에 비해 80% 감소시켰다. 다른 E/F-특이적 siRNA(siRNA 1 및 FLU-esiRNA)는 훨씬 덜 효과적인 것으로 입증되었다. EWS-FLI1은 ~64 kDa에서, 액틴은 43 kDa에서 이중 밴드로서 이동했다. (Baumer, N. et al., 2016)에 개시되어 있다.
도 9: 유잉 육종 세포의 표적화를 위한 항-IGF1R-mABs All 및 Tepro. A: IGF1R-표적 mABs A12 (식수투무맙) 및 Tepro(테프로투무맙)를 실험실에서 발현 및 정제하고 siRNA 결합 및 수송을 가능하게 하기 위해 프로타민/P에 접합할 수 있다. IgG-프로타민/P 접합체는 적절한 분자량 이동(화살표)을 나타낸다. HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = SMCC-프로타민 B: 항-IGF1R-mABs-프로타민 및 상이한 비율의 siRNA를 사용한 밴드이동 분석. C: 항-IGF1R-mABs-프로타민(유리 SMCC-P 함유)은 Alexa488-마킹된 대조군 siRNA를 SKNM-C 유잉 세포(흰색 점)로 이동시킴.
도 10: 중단점 siRNA는 대조군에 비해 유잉 SKNM-C 세포에서 콜로니 형성을 상당히 감소시켰다. SKNM-C 세포를 프로타민/P-접합된 A12 (A) 또는 Tepro (B) 및 표시된 siRNA로 처리하고 콜로니 형성 분석을 수행했다. E/F-siRNA는 구동 유잉 육종 EWS-Fli1의 mRNA를 간섭하는 siRNA이다. BCL2, BCL2에 대한 siRNA. P<0.05, 양측 T 검정.
도 11: 실험으로부터 추론된 효과적인 항체-SMCC-프로타민/P-siRNA 또는 -SM-1/RF 운반체 복합체에 대한 이러한 조건을 충족하는 나노입자 유사 구조의 예를 통한 단면의 도해. 정전기 결합 브릿지가 mAB 사이에 형성되며, 일부 프로타민은 표적 항체 및, siRNA (A) 뿐만 아니라 SM-1/RF (B) 또는 둘 모두 (C)와 같은 음이온 소분자를 포함하는 각자의 음이온 카고에 결합된다.
도 12: 항체-프로타민/유리 프로타민 접합체는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)에 결합할 수 있다. 밴드이동-검정은 1몰의 EGFR-항체-프로타민-접합체가 8 내지 32몰의 ASO에 결합함을 드러낸다.
도 13: 효과적인 siRNA 바인더의 분자 조성에 대한 설명. 항-CD20 mAB를 지시된 바와 같이 mAB에 대한 몰 과량으로 SMCC-프로타민에 접합시켰다. 생성된 접합체 혼합물을 이의 siRNA와 복합체를 형성하는 능력에 대해 시험하였다. 제공된 프로타민-SMCC의 몰 과량과는 별개로, siRNA와 복합체를 형성하는 능력은 현저하게 다르지 않았고 운반체 바인더 1몰 당 약 16몰 siRNA 범위였다.
도 14: CD20-mAB 리툭시맙-프로타민/P 접합체는 8몰 siRNA에 결합한다. A: 항-CD20-mAB, 30 x SMCC-프로타민 및 분자 마커(M)와 결합된 항-CD20-mAB를 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE; HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = SMCC-프로타민 B: CD20-mAB-프로타민/P 및 다양한 비율의 siRNA를 사용한 밴드이동 분석.
도 15: 항체-P/P-siRNA 복합체를 사용한 DLBCL 세포주의 표적화. 상단 패널: DLBCL 세포주의 선택을 FACS 분석에 의해 CD20 및 CD33에 대한 발현에 대해 시험했다. 중간 패널(흰색 점): Alexa488-태깅된 siRNA는 프로타민-접합된 CD20(리툭시맙) 및 CD33(젬투주맙) 단클론 Ab(둘 모두 유리 SMCC-프로타민 함유)에 결합되었고 각자의 세포주를 조성물로 밤새 처리하였다. siRNA는 각자의 항체 표적화를 통해 내재화되었고 세포질 소포 구조에 농축되었다. 둘 모두의 표적화 mAB(좌측: 항-CD20, 우측: 항-CD33)는 siRNA를 각자의 세포주로 수송하는 것으로 나타났다. 하단 패널: DLBCL 세포주를 메틸셀룰로오스에 시딩하고 지시된 바와 같이 항체-프로타민/P-siRNA 접합체로 처리했다. CD33은 모든 세포주에서 높게 발현되고 리툭시맙은 siRNA를 세포내 소포로 운반하지만, 콜로니 형성 능력에 의해 검출되는 중요한 유전자 녹다운에 대한 반응은 낮으며, 이는 문제가 있는 엔도솜 방출을 가리킨다. 그에 반해, 젬투주맙을 표적으로 하는 더 낮은 발현 CD33은 유전자 녹다운에 대해 훨씬 더 나은 반응을 나타낸다: 유의성 * p < 0.01. 여기서, 특히 HBL-1 세포는 BTK 키나아제, 뿐만 아니라 세포질 키나아제 SYK 및 CARD11b, CD79B 및 MYD88과 같은 B 세포 수용체 신호 경로의 추가 구성성분의 녹다운에 대해 양호한 반응을 나타낸다.
도 16: 단클론 항체에 의한 정전기 수송을 위한 다가음이온성 소분자(SM) 유도체의 합성. SM-1은 다가음이온성 적색 형광 발색단(RF)에 접합되어 저분자량(1.44 kDa) 다가음이온을 형성했다.
도 17: CD20-mAB 리툭시맙-프로타민/P 접합체 및 EGFR-mAB 세툭시맙-프로타민/P 접합체가 SM-1/RF에 결합한다. A: 최대 1:32의 SM-1/RF의 상이한 비율을 사용하는 CD20-mAB-프로타민/P 및 EGFR-mAB-프로타민/P를 사용한 밴드이동 분석. B: 최대 1:200의 SM-1/RF의 상이한 분자 과량을 사용하는 CD20-mAB-프로타민/P 및 EGFR-mAB-프로타민/P를 사용한 밴드이동 분석. 적어도 100 mol SM-1/RF는 또한 유리 SMCC-프로타민을 함유하는 항체-프로타민 접합체에 의해 복합체화될 수 있다.
도 18: CD20-mAB 리툭시맙-프로타민/P 접합체 및 EGFR-mAB 세툭시맙-프로타민/P 접합체는 SM-1/RF를 수송한다. A: CD20-양성 HBL-1 DLBCL 세포는 CD20-mAB-프로타민/P/SM-1/RF(유리 SMCC-P 함유) 복합체를 내재화한다(회색 음영, 왼쪽). B: EGFR-양성 A549 NSCLC 세포는 EGFR-mAB-프로타민/P/SM-1/RF/P 복합체를 내재화한다(흰색 점, 왼쪽).
도 19: EGFR-mAB 세툭시맙-프로타민 접합체는 HPLC에 의한 유리 SMCC-프로타민의 고갈 후에 siRNA에 효율적으로 결합하지 않는다. A: 항-EGFR-mAB, 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-EGFR-mAB 및 결합되지 않은 SMCC-프로타민의 고갈 시 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-EGFR-mAB의 HPLC-분획 25-31을 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE; HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = SMCC-프로타민. B: 밴드이동 분석.
도 20: 유리 프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 siRNA의 상이한 운반체로 처리된 NSCLC 세포의 소프트 한천에서의 콜로니 형성 검정. A: EGFR-mAB-프로타민/P-KRAS-siRNA로 처리한 A549 세포는 EGFR-mAB-프로타민/P-contr(scr)-siRNA로 처리한 세포보다 소프트 한천에서 훨씬 적은 콜로니를 형성한다. B: SK-LU1 세포. A549 (A) 또는 SK-LU1 (B) 세포를 유리 프로타민 없이 EGFR-mAB-프로타민 접합체로 처리한 경우(도 19 A, 분획 29/30 참조) 또는 동일한 양의 SMCC-프로타민만 사용하는 경우 콜로니 형성에서 PBS 처리 세포와 비교하여 어떠한 차이도 관찰될 수 없었다. 여기에 제시된 것은 콜로니 분석의 사진 및 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. 별표는 유의미한 차이를 나타낸다(P<0.05, 양측 T-검정).
도 21: CD33-mAB 젬투주맙-프로타민 접합체는 HPLC에 의한 유리 SMCC-프로타민의 고갈 후에 siRNA에 효율적으로 결합하지 않는다. A: 항-CD33-mAB, 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-CD33-mAB 및 결합되지 않은 SMCC-프로타민의 고갈시 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-CD33-mAB의 HPLC-분획 24-30을 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE; HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = SMCC-프로타민. B: 밴드이동 분석. C: 콜로니 형성 분석. CD33-mAB-프로타민/P-DNMT3A-siRNA(유리 SMCC-P 함유)로 처리한 OCI-AML2 세포는 CD33-mAB-프로타민/P-contr(scr)-siRNA로 처리한 세포보다 소프트 한천에서 훨씬 적은 콜로니를 형성한다. OCI-AML2 세포를 유리 SMCC-프로타민 없이 CD33-mAB-프로타민 접합체로 처리한 경우(A + B, 분획 30 참조) 콜로니 형성에서 PBS 처리 세포와 비교하여 어떠한 차이도 관찰될 수 없었다. 여기에 제시된 것은 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. *P<0.033, 양측 T-검정.
도 22: CD20-mAB 리툭시맙-프로타민 접합체는 HPLC에 의한 유리 SMCC-프로타민의 고갈 후에 SM-1/RF에 효율적으로 결합하지 않는다. A: 항-CD20-mAB, 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-CD20-mAB 및 결합되지 않은 SMCC-프로타민의 고갈시 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-CD20-mAB의 HPLC-분획 19-25/26을 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE; HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = SMCC-프로타민. B: 프로타민 고갈(왼쪽) 및 프로타민 함유 CD20-mAB 제제(오른쪽)를 사용한 밴드이동 분석. SMCC-프로타민 고갈되지 않은 CD20-mAB-제제는 >32 mol의 SM-1/RF에 결합한다.
도 23: 항-IGF1R 단클론 AB IMCA-12 (A12)-프로타민 접합체는 HPLC에 의한 유리 SMCC-프로타민의 고갈 후에 siRNA에 효율적으로 결합하지 않는다. A: 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-IGF1R 및 결합되지 않은 SMCC-프로타민의 고갈시 32 x SMCC-프로타민과 결합된 항-IGF1R-mAB의 HPLC-분획 15-21을 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE; HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = SMCC-프로타민. B: 프로타민 고갈(하부; 분획 20; A 참조) 및 IGF1R-mAB 제제를 함유하는 SMCC-프로타민(상부)을 사용한 밴드이동 분석. SMCC-프로타민이 고갈되지 않은 IGF1R-mAB-제제는 8 mol의 siRNA에 결합한다.
도 24: 유리 프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 A12 운반체로 처리된 SKNM-C 유잉 육종 세포의 소프트 한천에서의 콜로니 형성 검정. 유리 SMCC-P를 함유하는 IGF1R (A12)-mAB-프로타민/P-EWS-FLIl-siRNA로 처리한 SKNM-C 세포는 유리 SMCC-P를 함유하는 IGF1R (A12)-mAB-프로타민/P-contr(scr)-siRNA로 처리한 세포보다 소프트 한천에서 상당히 적은 콜로니를 형성한다. 콜로니 형성의 차이는 SKNM-C 세포가 유리 프로타민 없이 EGFR-mAB-프로타민 접합체로 처리되었을 때 관찰될 수 있다. 여기에 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이 제시된다. 별표는 유의한 차이를 나타낸다(*P< 양측 T-검정).
도 25: 유리 SMCC-프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 siRNA의 상이한 운반체로 처리된 SKNM-C 유잉 육종 세포의 소프트 한천에서의 콜로니 형성 검정. 유리 SMCC-P를 포함하는 IGF1R (A12)-mAB-프로타민/P/EWS-FLI1 (E/F)-siRNA로 처리한 SKNM-C 세포는 유리 SMCC-P를 포함하는 IGF1R (A12)-mAB-프로타민/P/contr(scr)-siRNA로 처리한 세포보다 소프트 한천에서 훨씬 적은 콜로니를 형성한다. 콜로니 형성에서 scr-siRNA(scr, 스크램블드) 처리된 세포와 비교할 때 SKNM-C 세포가 유리 SMCC-프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 EGFR-mAB-프로타민 접합체로 처리된 경우 또는 동일한 양의 SMCC-프로타민만을 사용하는 경우 차이가 관찰될 수 없었다(도 19, 분획 29/30 참조). 여기에 제시된 것은 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. 별표는 유의미한 차이를 나타낸다(P<0.05, 양측 T-검정).
도 26: 추정된 IgG-프로타민-SMCC-프로타민//유리 프로타민/siRNA 복합체에서와 동일한 농도의 비-고갈 A12 항 IGF1R mAB 대 비-항체-결합된 SMCC-프로타민으로 처리된 SKNM-C 유잉 육종, OCI-AML-2 백혈병 및 A549 NSCLC 세포의 소프트 한천에서의 콜로니 형성 분석. A: IGF1R (A12)-mAB-프로타민/EWS-FLIl-siRNA/유리 SMCC-P로 처리한 SKNM-C 세포는 IGF1R(A12)-mAB-프로타민/contr (scr)-siRNA/유리 SMCC-P로 처리한 세포보다 소프트 한천에서 상당히 적은 콜로니를 형성한다. 이에 반해, 효과적인 EWS-FLI1(E/F)-siRNA가 1800 nM 농도에서 SMCC-프로타민에만 복합체화되는 경우 이는 비효율적인 것으로 판명되었다(A, 오른쪽). B: SMCC-프로타민은 표적 항체 없이 효과적인 DNMT3a siRNA와 함께 AML 세포주 OCI-AML2에서도 사용되었으며 콜로니 형성 억제를 나타내지 않았다. C: 마지막으로, 대조군 siRNA과 효과 및 차이가 없는 유리 SMCC-프로타민에 결합된 효과적인 KRAS siRNA를 사용하여 동일한 설정을 A549에서 시험했다. 여기에 제시된 것은 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. 별표는 유의미한 차이를 나타낸다(P<0.05, 양측 T-검정).
도 27: A549 NSCLC 세포에서의 소포 추적. EGFR-mAB-프로타민/유리 SMCC-P-Alexa488 siRNA로 처리한 세포를 리소트래커 레드(Lysotracker red) 염색에 적용했다. Alexa488(흰색 점, 오른쪽 패널)을 포함하는 소포는 리소트래커(회색 점, 중간 패널) 염색과 거의 동일하지 않았다.
도 28: 상이한 복합체로 처리한 EGFR-양성 NSCLC 세포 SK-LU1에서 상이한 항-EGFR-mAB(세툭시맙) 제제의 내재화.
유리 SMCC-프로타민을 포함하는(상단 패널의 흰색 점) 및 유리 SMCC-프로타민을 포함하지 않는(하단 패널) EGFR-mAB-프로타민/P/Alexa488-대조군-siRNA로 처리한 SK-LU1 세포.
도 29: 상이한 복합체 및 유리 SMCC-프로타민으로 처리한 EGFR-양성 NSCLC 세포 A549에서 상이한 항-EGFR-mAB(세툭시맙) 제제의 내재화. 유리 SMCC-프로타민을 포함하는(A에서 핵 염색 및 D에서 흰색 점으로 siRNA) 및 유리 SMCC-프로타민을 포함하지 않는(B 및 E) EGFR-mAB-프로타민/P/Alexa488-대조군-siRNA 및 유리 SMCC-프로타민(C 및 F)으로 처리한 A549 세포. A-C: Hoechst를 사용한 핵 염색, D-F: Alexa488-siRNA 내재화 소포에 대한 A-C에서와 동일한 세포를 묘사하는 녹색 채널(흰색 점).
도 30: 상이한 복합체로 처리한 CD33-양성 AML 세포 OCI-AML2에서 상이한 항-CD33-mAB(젬투주맙) 제제의 내재화. 유리 SMCC-프로타민을 포함하는(A 및 D) 및 유리 SMCC-프로타민을 포함하지 않는(B 및 E) 항-CD33-mAB-프로타민/P/Alexa488-대조군-siRNA 및 유리 SMCC-프로타민(C 및 F)으로 처리한 OCI-AML2 세포. A-C: Hoechst를 사용한 핵 염색(회색 점), D-F: Alexa488-siRNA 내재화 소포에 대한 A-C에서와 동일한 세포를 묘사하는 녹색 채널(D의 흰색 점).
도 31: 상이한 복합체로 처리한 IGF1R-양성 유잉 육종 세포 SKNM-C에서 상이한 항-IGF1R-mAB (ImcA12) 제제의 내재화. 유리 SMCC-프로타민이 있는(A 및 D) 및 유리 SMCC-프로타민이 없는(B 및 E) 항-IGFlR-mAB-protamine/P/Alexa488-control-siRNA 및 유리 SMCC-프로타민(C 및 F)으로 처리한 SKNM-C 세포. A-C: Hoechst를 사용한 핵 염색, D-F: Alexa488-siRNA 내재화 소포에 대한 A-C에서와 동일한 세포를 묘사하는 녹색 채널(D의 흰색 점).
도 32: EGFR-음성 SKNM-C-세포 배양물에서 상이한 항-EGFR-mAB(세툭시맙) 제제의 존재. 하단 패널은 흰색 프레임으로 표시된 바와 같이 상단 패널 삽입의 더 높은 배율을 나타낸다. A: 결합되지 않은 세툭시맙은 Alexa488 대조군 siRNA를 SKNMC 세포로 수송하지 않는다. B: 프로타민-결합된 세툭시맙은 Alexa488-대조군 siRNA를 SKNMC-세포로 수송하지 않으며, Alexa488-양성 소포 구조는 세포 옆(흰색 점, 상단 패널의 화살표)과 배양물의 세포가 없는 영역(하단 패널의 화살표)에서만 발생한다. C: 유리 SMCC-프로타민을 포함하지 않는(HPLC에 의해 제거됨) 프로타민-결합된 세툭시맙은 더 이상 Alexa488-양성 소포 구조를 형성하지 않는다.
도 33: DLS 측정에서의 EGFR-mAB 세툭시맙-프로타민 접합체. 상부 패널: 하부 패널 측정을 위해 분리되거나 사용된 상이한 복합체를 묘사하는 쿠마시 염색된 PAGE 겔. 하부 패널: 유리 SMCC-프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 EGFR-mAB-P 및 SMCC-프로타민 단독을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 제타카운터(MALVERN)에서 동적 광 산란(DLS)을 통해 측정했다. 서로 다른 피크는 nm 단위로 서로 다른 크기의 입자를 나타낸다. 유리 SMCC-프로타민/siRNA를 포함하는 EGFR-mAB-P의 최고 피크는 약 427 nm에서 발생하지만, 유리 SMCC-프로타민을 포함하지 않는 것은 약 3.2 nm에서만 피크를 생성하고 유리 SMCC-프로타민/siRNA는 5.7 nm에서 피크를 생성한다.
도 34: 실온에서 0 내지 24시간 인큐베이션 동안 DLS 측정에서 EGFR-mAB 세툭시맙-프로타민/P 접합체. siRNA 단량체(약 1.92 nm)는 혼합 후 세툭시맙-프로타민/결합되지 않은 프로타민 운반체 시스템에 의해 더 큰 구조로 조립되며, 이는 훨씬 더 큰 매크로구조(~500 nm)로 안정화되고 추가로 조립된다. PBS의 보호되지 않은 환경에서 24시간 후, 매크로구조는 다시 부분적으로 분해되기 시작한다. 아래 숫자는 측정된 입자 크기(nm)를 나타낸다.
도 35: 항체-프로타민/유리 SMCC-P(P/P) 접합체와 형광 Alexa488-siRNA(흰색 점)를 챔버 슬라이드 상에서 밤새 무세포 인큐베이션하였다. A: EGFR-mAB-P/P, B: CD20-mAB-P/P, C: CD33-mAB-P/P, D: IGF1R-mAB-P/P, 40 x 배율, 막대 = 10 μm. E-H: A-D의 고배율, 막대는 여전히 10 μm.
도 36: 챔버 슬라이드 상에서 밤새 무세포 인큐베이션에서 형광 Alexa488-siRNA(백색 점)을 갖는 유리 SMCC-프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 항체-프로타민 접합체 및 SMCC-프로타민 단독. 유리 SMCC-프로타민을 포함하는 항체 복합체: A-D. A. EGFR-mAB-P, B. CD20-mAB-P, C. CD33-mAB-P, D. IGF1R-mAB-P. E. 유리 SMCC-프로타민. 유리 SMCC-프로타민을 포함하지 않는 항체 복합체: F-I. F. EGFR-mAB-P, G. CD20-mAB-P, H. CD33-mAB-P, I. IGF1R-mAB-P. 모두 40 x 배율.
도 37: 항체 복합체의 하나의 공초점 광학 섹션(C 및 D)에 대한 형광 광학 현미경(A 및 B) 및 레이저 스캔 현미경(LSM) 사진. 챔버 슬라이드 상에서 밤새 무세포 인큐베이션에서 형광 Alexa488-siRNA(흰색 점)를 사용한 세툭시맙 항-EGFR-mAB-프로타민/유리 SMCC_P 접합체(A 및 C) 및 항-CD20-mAB-프로타민/유리 SMCC-P(B 및 D)의 형성.
도 38: 지시된 바와 같이 상이한 온도에서 챔버 슬라이드 상에서 밤새 무세포 인큐베이션에서 형광 Alexa488-siRNA(흰색 점)를 갖는 유리 SMCC-프로타민을 포함하는 항-EGFR-항체-프로타민 접합체.
도 39: 상이한 비율의 항체 대 SMCC-프로타민을 갖는 세툭시맙의 접합. A: 각 접합 프로세스의 상세한 표시. B: A에 제시된 커플링된 접합 생성물과 비교하여 커플링되지 않은 항-EGFR-항체 세툭시맙을 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE.
도 40: 상이한 비율의 항체 대 SMCC-프로타민을 갖는 세툭시맙의 접합 생성물의 기능적 분석. A-F: 도면에 소개된 다양한 접합 생성물을 사용하는 밴드이동 분석. G-L: 다양한 접합 생성물이 Alexa488-siRNA와 함께 인큐베이션되었을 때 슬라이드 상에 세포가 없는 소포의 형성(특히 J에서 흰색 점). M-R: 다양한 세툭시맙-SMCC-프로타민/P/Alexa488-siRNA 복합체의 EGFR-양성 A549 세포로의 내재화(흰색 점, 화살표). S-X: 대조군 ("scr") siRNA 또는 항-KRAS siRNA("KRAS")와의 복합체에서 유리 프로타민을 함유하는 상이한 세툭시맙-SMCC-프로타민/P 접합체로 처리한 A549 세포의 콜로니 형성. 50x 이상의 SMCC-프로타민이 사용되는 경우, 접합체는 비특이적으로 독성이 있다. 여기에 제시된 것은 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. 별표는 유의미한 차이를 나타낸다(P<0.009, 양측 T-검정).
도 41: 상이한 비율의 보충된 SMCC-프로타민 또는 프로타민 단독을 갖는 유리 SMCC-프로타민이 고갈된 항-EGFR-mAB-프로타민의 소포 형성의 기능적 분석. Alexa488-siRNA와 함께 인큐베이션시 슬라이드 상에서 세포가 없는 소포의 형성. 유리 SMCC-프로타민이 없는 항-EGFR-mAB-프로타민은 도면에 표시된 것처럼 소포(흰색 점)를 형성하지 않는다. 유리 SMCC-프로타민을 단계적으로 첨가한 경우, 소포 형성은 1x SMCC-프로타민 (A)에서 발생하지 않으며, 10x SMCC-프로타민 (B)에서는 낮은 정도로, 32x SMCC-프로타민 (C)에서는 높은 정도로 발생한다. 설포-SMCC에 커플링되지 않은 유리 프로타민을 단계적으로 첨가한 경우, 소포 형성은 1x SMCC-프로타민 (D)에서 발생하지 않았고, 10x SMCC-프로타민 (E)에서는 낮은 정도로, 32x SMCC-프로타민 (F의 흰색 점)에서는 높은 정도로 발생한다.
도 42: 챔버 슬라이드 상의 o/n 무세포 인큐베이션에서 형광 Alexa488-siRNA 및/또는 SM-1/RF와의 항-CD20-mAB-프로타민/유리 SMCC-P 접합체의 형성. A.-C. 녹새 형광 채널(흰색 점), D.-F. 적색 형광 채널(녹색 점). A. 및 D. Alexa488-siRNA를 갖는 항-CD20-mAB-P/P, B. 및 E. 적색 형광 SM-l/RF를 갖는 항-CD20-mAB-P/P, C. 및 F. Alexa488-siRNA 및 적색 형광 SM-l/RF를 갖는 항-CD20-mAB-P/P, 40 x 배율, 막대 = 10 μm.
도 43: 챔버 슬라이드 상의 o/n 무세포 인큐베이션에서 형광 Alexa488-siRNA 및/또는 SM-1/RF와의 항-EGFR-mAB-프로타민/유리 SMCC-P 접합체의 형성. A-D: 녹색 형광 채널(흰색 점), E-H: 적색 형광 채널(녹색 점). A. 및 E. Alexa488-siRNA를 갖는 EGFR-mAB-P/P, B. 및 F. 적색 형광 SM-l/RF를 갖는 EGFR-mAB-P/P, C. 및 G. 비형광 대조군-siRNA 및 적색 형광 SM-1/RF를 갖는 EGFR-mAB-P/P, D. 및 H. 녹색 형광 Alexa488-siRNA 및 적색 형광 SM-1/RF를 갖는 EGFR-mAB-P/P, 40 x 배율, 막대 = 10 μm.
도 44: 챔버 슬라이드 상의 o/n 무세포 인큐베이션에서 SM-1/RF와 조합된 형광 Alexa488-siRNA를 갖는 리툭시맙 항-CD20-mAB-프로타민/유리 SMCC-P 접합체의 형성. A-C: 40x 배율 녹색(흰색 점) 및 적색 형광(녹색 점) 채널, D-L: A-C에서 세부 사항의 동일한 배율, 막대 = 10 μm. D, G 및 L에서: 회색 고리는 Alexa488-siRNA 형광(화살표)를 나타낸다. E, H 및 K에서: 회색 고리는 SM-l/RF의 적색-형광(화살표)를 나타낸다. F, I, 및 L에서: 녹색-형광(회색) 테두리 (Alexa488-siRNA, 화살표) 및 적색 내부 형광 (SM-l/RF)이 구별될 수 있다.
도 45: 챔버 슬라이드 상의 o/n 무세포 인큐베이션에서 적색 형광 SM-1/RF와 조합된 녹색 형광 Alexa488-siRNA를 갖는 세툭시맙 항-EGFR-mAB-프로타민/유리 SMCC-P 접합체의 형성. A-C: 40x 배율 녹색 (A 및 C의 흰색 및 고리) 및 적색 형광 채널(B 및 C에서 회색 원). D: A-C의 세부 사항의 확대, 막대 = 10 μm.
도 46: 항-CD20-mAB/P/유리 SMCC-/P(A의 회색 고리), SM-1/RF(B의 회색 원) 및 Alexa488-siRNA에 의해 형성된 큰 미셀 구조는 위상차로 광학 현미경에서 보여질 수 있다(B 및 C). 막대 = 5 μm.
도 47: 항체 복합체의 하나의 공초점 광학 섹션 및 Z-스택 상의 LSM 사진. A: 챔버 슬라이드 상의 o/n 무세포 인큐베이션에서 SM-1/RF와 결합된 형광 Alexa488-siRNA(흰색 점)를 갖는 항-EGFR-mAB (세툭시맙)-프로타민/유리 SMCC-P 접합체의 형성, a: 소포 전체에 1 준위, b 및 c: 두 축으로 소포의 3D 구조를 재구성하는 Z 스택. B: 챔버 슬라이드 상의 o/n 무세포 인큐베이션에서 SM-1/RF(회색 그림자)와 결합된 형광 Alexa488-siRNA(흰색 고리 및 점)를 갖는 항-CD20-mAB (리툭시맙)-프로타민/P 접합체의 형성, d: 소포 전체에 1 준위, e 및 f: 두 축으로 소포의 3D 구조를 재구성하는 Z 스택.
도 48: 단클론 항체에 의한 정전기 수송을 위한 다가음이온성 이브루티닙 유도체의 합성. 이브루티닙은 Cy3.5 발색단에 접합되어 저분자량(1.44 kDa) 다가 음이온을 형성했다. 정전기적 상호작용 시 양이온성 프로타민-연결된 mAB 안정한 소포로 형성되는 음이온성 이브루티닙-Cy3.5(Cy3.5-RMA561)의 화학 구조.
도 49: Cy3.5-RMA561의 고해상도 질량 분석법. 샘플을 질량 분석기에서 전자빔에 의해 이온화 및 단편화하였으며, 생성된 단편을 특정 편향에 따른 질량 대 전하(m/z) 비율로 분석하였다. HRMS (ESI, CH3CN/H2O):
C64H62N9O15S4 3- [M-H] (z=3)에 대한 m/z 산출치: 441.44216; 실측치: 441.44160;
C64H62N9O15S4H2- [M-H] (z=2)에 대한 m/z 산출치: 662.66687; 실측치: 662.66630;
(C64H62N9O15S4H)2 4- [M-H] (z=4)에 대한 m/z 산출치: 662.66687; 실측치: 662.66630.
도 50: αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC 접합체 및 αEGFR-mAB 세툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC 접합체가 이브루티닙-Cy3.5에 결합한다. A. 최대 1:32의 상이한 비율의 이브루티닙-Cy3.5를 사용하여 αCD20-mAB-프로타민/P 및 αEGFR-mAB-프로타민/P를 사용하는 밴드이동 분석. B. 최대 1:200의 상이한 분자 과량의 이브루티닙-Cy3.5를 사용하여 αCD20-mAB-프로타민/유리 프로ㅍ타민-SMCC 및 αEGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민-SMCC를 사용하는 밴드이동 분석. 적어도 100 mol의 이브루티닙-Cy3.5는 항체-프로타민 접합체에 의해 복합체와될 수 있다. α, anti.
도 51: αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5 접합체 및 αEGFR-mAB 세툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC 접합체는 이브루티닙-Cy3.5를 내재화한다. A. CD20-양성 HBL-1 DLBCL 세포는 αCD20-mAB-프로타민//유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5 복합체를 내재화한다. 좌측: 핵 염색, 우측: 회색 점 = Cy3.5. B. EGFR-양성 A549 NSCLC 세포는 αEGFR-mAB-프로타민//유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5 복합체를 내재화한다. 좌측: 핵 염색, 우측: 회색 점 = Cy3.5. α, anti.
도 52: 운반체 분자로서 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC에 의해 수송된 이브루티닙-Cy3.5 접합체에 의한 시험관내 BTK 키나아제의 공유 표지화(αCD20-mAB-P/이브루티닙-Cy3.5). 105 세포를 지시된 농도의 화합물로 밤새 처리하고, 로딩 염료에 용해시키고 겔에 걸었다. 겔을 INTAS 겔 이미저에서 Cy3.5 방출을 위해 SYBR Gold 필터(왼쪽) 상에서 UV 광에 노출시키고, 이후 식별을 위해 항-BTK-mAB와 함께 블롯팅 및 인큐베이션하였다(오른쪽). RTX, 리툭시맙. 세포내 BTK는 유리 이브루티닙-Cy3.5 뿐만 아니라 항체-프로타민-복합체화된 이브루티닙-Cy3.5와 결합했다.
도 53: αCD20-mAB(리툭시맙)-프로타민/유리 프로타민 접합체 및 αEGFR-mAB 세툭시맙-프로타민/유리 프로타민 접합체는 이브루티닙-Cy3.5를 수송하고 이브루티닙-Cy3.5 또는 항체 단독보다 더욱 효과적으로 클로니 형성을 억제한다. A. 및 B. 콜로니 형성 검정. (A) αCD20-mAB (리툭시맙)-프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5 로 처리한 HBL-1 세포, 및 (B) αEGFR mAB-(세툭시맙) 프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5로 처리한 A549 세포는, PBS, 비복합 이브루티닙-Cy3.5로 처리되거나 αCD20 mAB-(리툭시맙) 프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5으로 처리된 세포보다 메틸셀룰로오스에서 훨씬 더 적은 콜로니를 형성한다. 여기에 제시된 것은 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. 별표는 유의미한 차이를 나타낸다(P<0.05, 양측 T-검정). α, anti.
도 54: αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민 접합체는 HPLC에 의한 유리 프로타민-SMCC의 고갈 후 이브루티닙-Cy3.5에 효율적으로 결합하지 않는다. A. αCD20-mAB, 32 x 프로타민-SMCC와 커플링된 αCD20-mAB 및 결합되지 않은 프로타민-SMCC의 고갈 시 32 x 프로타민-SMCC와 커플링된 αCD20-mAB의 HPLC-분획 19-25/26을 나타내는 쿠마시-염색 SDS-PAGE; HC = 중쇄, LC = 경쇄, -P = 프로타민-SMCC. B: 밴드이동 분석. 프로타민 고갈(왼쪽) 및 프로타민 함유 αCD20-mAB 제제(오른쪽)를 사용한 밴드이동 분석. 프로타민-SMCC 고갈되지 않은 αCD20-mAB-제제는 >32 mol의 이브루티닙-Cy3.5에 결합한다. C. 콜로니 형성 분석. αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5로 처리된 HBL-1 세포는 커플링되지 않은 이브루티닙-Cy3.5 또는 커플링되지 않은 αCD20-mAB 단독으로 처리된 세포보다 소프트 한천에서 상당히 적은 콜로니를 형성한다. HLB-1 세포를 유리 프로타민-SMCC 없이 αCD20-mAB-프로타민 접합체로 처리한 경우 콜로니 형성에서 PBS 처리된 세포와 비교하여 어떠한 차이도 관찰될 수 없다(A + B, 분획 25 참조). 여기에 제시된 것은 3가지 독립적인 실험 +/- SD의 평균이다. 별표는 유의미한 차이를 나타낸다(P<0.0003, 양측 T-검정). α, anti.
도 55: αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC 접합체는 이브루티닙-Cy3.5를 생체내 종양 부위로 효율적으로 배위 및 수송하고 종양 성장을 상당히 감소시킨다. A. NSG-HBL1 이종이식 모델의 종양 성장 및 치료 요법. 이식 후, 종양을 200 mm3까지 성장시킨 후, 주 2회 복강내(i.p.) 치료를 시작하였다. B. 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 1:20 복합체(4 mg/kg 마우스 체중, 또는 단일 용량당 0.625 nmol 리툭시맙-프로타민 및/또는 12.5 nmol 이브루티닙 유도체)로의 치료(사진에서 = 리툭시맙-이브루티닙-Cy3.5 (C) 또는 리툭시맙-P/P/이브루티닙-Cy3.5 (B))는 종양 부피 및 성장을 상당히 감소시켰다. 매 치료일에, 일주일에 두 번, 캘리퍼스 측정으로 종양 부피를 평가했다. 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 1:20 복합체 치료군에서 종양 부피는 1,000 mm3보다 훨씬 아래로 제한되었고 3회 치료 후 600 mm3로 줄어들기 시작한 반면, 다른 모든 그룹은 빠른 종양 성장을 보였고 미리 정의된 법적 규정에 의해 조기에 희생되어야 했다. C. 치료군 대 대조군의 생존 곡선. 각 10마리 마우스 그룹을 PBS, 리툭시맙, 이브루티닙 표준물, 이브루티닙-Cy3.5 및 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 1:20 복합체로 처리하였다. 이브루티닙-Cy3.5는 치료 시작 8일 후 종양 성장을 감소시키지 않았고, 사전 정의된 기준 때문에 모든 마우스를 희생시켜야 했지만, PBS 및 리툭시맙 처리된 마우스는 최대 16일까지 미미하게 더 오래 살았다. 마지막 10마리의 이브루티닙 처리된 마우스는 20일째에 희생되어야 했지만, 반면 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 1:20 복합체 처리된 마우스 10마리 중 5마리는 처리 시작 후 16일까지 및 4마리는 20일까지 생존했다. 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 처리군과 대조군 간의 차이는 p≤0.03(ANOVA)으로 평가되었다. α, anti, RTX, 리툭시맙.
도 56: NSG 마우스에 이종이식된 HBL-1 세포의 종양은 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5 처리된 마우스에서 Cy3.5 형광 신호의 현저한 강화를 나타낸다. 도 55에 도시된 실험으로부터의 이종이식 마우스는 530 nm 여기 및 600 nm 방출에서 Cy3.5 신호에 대한 생체외 형광 검출에 대해 준비되고 노출된 종양뿐만 아니라 견딜 수 없는 종양 크기, 기관에 도달한 후에 희생되었다. 리툭시맙-P/유리 P/이브루티닙(사진에서 = Rtx/이브루티닙-Cy3.5) 처리된 그룹(하단 행)의 종양은 종양 조직의 모든 부분에 대해 비표적화된 이브루티닙-Cy3.5 및 표준 이브루티닙과 비교하여 Cy3.5 의존성 형광 신호의 현저한 강화를 나타냈지만, 대조군 기관에서는 자가 형광을 나타내는 괴사 병소만 검출될 수 있었다. 제시된 종양 표본의 직경은 모든 경우에 유사했지만 형광 면적이 다르다. 눈금은 임의의 단위의 형광을 나타낸다. 점선은 각 종양의 외부 한계를 나타낸다. 숫자는 개별 마우스 식별자를 지칭한다.
도 57: HBL1 마우스로 이종이식된 NSG 마우스로부터 Cy3.5 형광에 대해 분석된 상이한 마우스 기관에 대한 개요. 도 55 및 56에 도시된 실험으로부터의 이종이식 마우스는 530 nm 여기 및 600 nm 방출에서 Cy3.5 신호에 대한 생체외 형광 검출에 대해 준비되고 노출된 종양뿐만 아니라 견딜 수 없는 종양 크기, 기관에 도달한 후 희생되었다. 리툭시맙-P/유리 P/이브루티닙(사진에서 = Rtx/이브루티닙-Cy3.5) 처리된 그룹(하단 행)으로부터의 종양은 표적화되지 않은 이브루티닙-Cy3.5와 비교하여 Cy3.5 의존성 형광 신호의 현저한 강화를 보여주었다. 눈금은 임의의 단위의 형광을 나타낸다. 기관은 명시야(상단 패널) 및 적색(Cy3.5) 형광(하단 패널)에서 항상 동일한 방향(오른쪽 구성표에 묘사됨)으로 배열된다.
도 58: 챔버 슬라이드 상의 밤새(o/n) 무세포 인큐베이션에서 녹색 형광 Alexa488-siRNA 및/또는 적색 형광 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 리툭시맙 αCD20-mAB-프로타민/유리 SMCC-프로타민 나노-소포의 형성. A.-C. 녹색 형광 채널, D.-F. 적색 형광 채널, A. 및 D. 녹색 Alexa488-siRNA를 갖는 αCD20-mAB-P/유리 P, B. 및 E. 적색 형광 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 αCD20-mAB-P/유리 P, C. 및 F. 녹색 Alexa488-siRNA 및 적색 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 αCD20-mAB-P/유리 P, 40 x 배율, 막대 = 10 μm. 모든 리툭시맙-프로타민 제제는 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 포함한다. α, anti.
도 59: 챔버 슬라이드 상의 밤새(o/n) 무세포 인큐베이션에서 녹색 형광 Alexa488-siRNA 및/또는 적색 형광 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 세툭시맙 αEGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민-SMCC 접합체의 형성. A.-D. 녹색 형광 채널, E-H. 적색 형광 채널, A. 및 E. 녹색 형광 Alexa488-siRNA를 갖는 세툭시맙 αEGFR-mAB-P/유리 프로타민-SMCC, C. 및 G. 비형광 대조군 siRNA(scr, 스크램블드) 및 적색 형광 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 αEGFR-mAB-P, D. 및 H. 비형광 Alexa488-siRNA 및 적색 형광 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 αEGFR-mAB-P, 40 x 배율, 막대 = 10 μm. 모든 세툭시맙 프로타민 제제에는 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유한다. α, anti.
도 60: 챔버 슬라이드 상의 밤새(o/n) 무세포 인큐베이션에서 적색 형광 이브루티닙과 조합된 녹색 형광 Alexa488-siRNA를 갖는 세툭시맙 αEGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민-SMCC (A-B) 및 리툭시맙 항-CD20-mAB-프로타민/유리 프로타민-SMCC (C-D) 접합체의 형성. 녹색- 및 적색-형광 채널의 40x 배율, A 및 C에서, 녹색-형광 테두리 (Alexa488-siRNA)가 보여지는 한편, B 및 D에서, 적색 내부 형광 (이브루티닙-Cy3.5)이 보여질 수 있다. 모든 항체-프로타민 제제는 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유한다.
도 61: siRNA 및 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC의 상이한 복합체 형성에서 입자 크기의 결정. A. B-E에 도시된 평균 직경(nm)의 그래픽 그림. 표시된 복합체의 Zetaview 측정은 인큐베이션 시작 후 1시간 및 2시간에 수행되었다. 여기에 표시된 것은 B-E의 히스토그램에 묘사된 각 입자의 평균 직경에 의해 결정되는 평균 소포 크기(nm)이다. 모든 리툭시맙-프로타민 제제는 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유한다. α, anti.
도 62: A: αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC(αCD20-mAB-P/P) 접합체는 이브루티닙-Alexa488에 결합한다. 최대 1:2의 다양한 비율의 이브루티닙-Alexa488을 사용하는 αCD20-mAB-프로타민/P를 사용하는 밴드이동 분석. α, anti. B: -2의 Alexa488 분자의 제한된 음이온 전하로 인해(화살표), 다가양이온성 프로타민 융합체와 Alexa488 사이의 상호작용은 -4의 순 전하를 갖는 Cy3.5보다 덜 강한 것으로 밝혀졌다. Alexa488-접합된 이브루티닙 및 프로타민 접합체를 사용하여, 단지 2:1의 커플링 비율이 실현되었다. 그러나 αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC(αCD20-mAB-P/P)와 이브루티닙-Alexa488의 복합체화는 여전히 성공적이었다. C-H: 1:20 비율로 αCD20-mAB-프로타민, 유리 프로타민 및 이브루티닙-Cy3.5의 1시간 자동 조립 및 이후 PBS(C, D)에서, 및 세포 배양 배지 RPMI/10% FCS (E, F) 및 PBS/50% FCS (G, H)와 같은 까다로운 조건에서 24시간 동안 후속 배양한 후의 안정성. C, E, G: Cy3.5 형광, D, F, H: 위상차, α, anti.
도 63: 하전된 이브루티닙-Cy3.5, 하전되지 않은 이브루티닙(상표명: 임브루비카)은 상이한 프로타민-접합된 mAb와 안정한 나노입자를 형성한다. SMCC를 통해 프로타민에 접합되고 유리 SMCC-프로타민을 함유하는 각각의 항체 운반체는 하전되지 않은 이브루티닙과 비교하여 하전된 이브루티닙-Cy3.5로 로딩되었다. Cy3.5와 접합된 이브루티닙 샘플만이 나노입자의 조밀한 형성을 나타내었지만 하전되지 않은 이브루티닙은 그렇지 않았다. Cy3.5 의존형 형광 현미경 사진(위) 및 위상차(아래)에서 항-EGFR 항체 (A-D), 항-CD33 항체 (E-H) 및 항-IGF1R 항체 (I-L)를 시험했다. α, anti.
도 64: 실험으로부터 추론된 효과적인 항체-프로타민-프로타민-siRNA 또는 -이브루티닙-Cy3.5 운반체 복합체에 대한 조건을 충족시키는 나노입자-유사 구조의 이상적인 예를 통한 단면의 도해. 비례하지 않는 도해. mAB 사이에 정전기적 결합 브릿지가 형성되고, 일부 프로타민은 표적 항체, 및 siRNA (A) 및 이브루티닙-Cy3.5 (B) 또는 둘 모두 (C)를 포함하는, 각각의 음이온 카고에 커플링된다.
도 65: αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민-이브루티닙-Cy3.5에 의한 정전기적 나노입자 형성. 운반체 항체-프로타민 접합체를 1:20 비율로 음이온성 이브루티닙-Cy3.5로 로딩하고, 형광 현미경(A, B)을 위한 세포 배양 처리된 유리 슬라이드, 또는 포스포-울프람 음성 염색 전자 현미경(C)을 위한 구리 그리드에 적용했다. 여기에서 정전기 로딩은 수많은 응집체의 형성을 유발하며, 여기서 더 큰 응집체는 강한 Cy3.5 형광(A)을 나타내고 엠보스 동적 필터를 사용하는 광학 현미경에서 보여질 수 있어 콘트라스트 향상을 통해 3D 구조를 설명할 수 있다(B). 투과 전자 현미경(C)에서 음성 염색은 대략 동일한 범위의 입자 크기로 이어졌지만 광학 현미경에서 감지할 수 없는 과다한 더 작은 소포(C)의 존재를 드러냈다. α, anti.
도 66: αCD20-mAB-P/P-복합체화된 이브루티닙-Cy3.5에 의한 브루톤 키나아제 BTK의 세포 표적화. A-F: Cy3.5-신호의 현저한 세포내 농축을 보여주는 표적 접합체 및 대조군으로 처리된 HBL1 DLBCL 세포의 형광 현미경 검사. G: 표적 접합체 및 대조군으로 72시간 동안 처리된 세포로부터의 용해물을 SDS PAGE에 적용하고 Cy3.5 신호에 대해 조명하였다. 여기서, 병렬 면역블롯에 의해 BTK로 확인된 70 kDa의 명확한 밴드는, 이브루티닙-Cy3.5에 의해 공유결합으로 마킹되었으며, 이는 이브루티닙-Cy3.5 유도체의 결합 및 따라서 기능성을 시사한다. H-P: 이브루티닙-보디피(녹색, N 및 P)로 전처리된 HBL1 DLBCL 세포의 형광 현미경 검사는 αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5 처리 후 Cy3.5 신호의 세포내 농축을 나타내지 않는다(M, L과 비교). α, anti.
도 67: DLBCL 세포주에서 αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민-이브루티닙-Cy3.5 처리에 의한 BTK-불활성화의 생리학적 및 기능적 결과. A: HBL1 세포를 제시된 각각의 접합체에 의해 72시간 동안 처리하고, 용해시키고, 로딩 대조군으로서 포스포-BTK(pBTK), 총 BTK(tBTK), 포스포-ERK(p-ERK), 총-ERK(t-ERK) 및 액틴에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. 여기서, 표적화되지 않은 이브루티닙-Cy3.5는 αCD20-mAB-프로타민-이브루티닙-Cy3.5보다 약간 적은 BTK의 인산화를 억제했으며, ERK와 같은 예상되는 다운스트림 인산화 표적의 차이는 더 두드러졌다: 여기서, αCD20-mAB-P/P 매개 이브루티닙-Cy3.5 처리만이 ERK 인산화를 감소시킬 수 있었다. B: 콜로니 형성 분석에서, 표적화되지 않은 이브루티닙-Cy3.5는 HBL1 세포의 콜로니 성장을 완만하게 감소시킨 반면, αCD20-mAB-P/P에 의한 이브루티닙-Cy3.5의 특이적 표적화는 콜로니 성장 감소를 30% 미만으로 부스팅했다. 접합체 작제물에서 유리 프로타민의 중요성을 입증하기 위해, 접합체 혼합물로부터 이를 고갈시켰으며, 이 조합의 적용은 이브루티닙-Cy3.5의 단일 적용보다 콜로니 형성 감소를 더 이상 나타내지 않았으므로, 항체 접합체는 표적화 능력을 상실하였다(B, 맨 오른쪽 막대), α, anti.
도 68: DLBCL 세포주 HBL1에서 αCD20-mAB-P/P 복합체화된 이브루티닙-Cy3.5 처리에 의한 BTK 표적화의 세포자멸 유도. HBL1 세포를 72시간 동안 제시된 각각의 접합체에 의해 처리하고 Annexin V-염색에 적용하였다. 세포자멸 세포는 유세포측정에 의한 AnnexinV-발현(상부 패널, X축)에 의해 검출된 반면, 증가된 내재화된 이브루티닙-Cy3.5 형광은 특히 αCD20-mAB-P/P 복합체화된 이브루티닙-Cy3.5 처리된 세포에서 Y축의 형광(상부 패널)에 의해 나타난다. 오른쪽 상단 및 오른쪽 하단 게이트의 값이 계산되었다. 하단 패널: 3개의 독립적인 실험에서 Annexin V-양성 세포가 요약되었다. P<0.05, 양측 T-검정. α, anti.
도 69: 유잉 육종 이종이식편 종양 성장은 αIGF1R-mAB-프로타민/유리 프로타민-siRNA-프로타민 나노운반체를 사용한 전신 요법을 통한 발암성 EWS-FLI1 전좌 산물의 녹다운 시 억제된다. A. 생체내 실험의 치료 계획. 표시된 바와 같이 나노입자를 복강내 제공하였다. B-C. SK-N-MC 이종이식 종양에 대한 표적화된 나노운반체의 전신 생체내 적용 결과. B. αIGF1R-mAB 테프로투무맙("Tepro")-프로타민/PsiRNA 나노입자로 처리된 종양 성장 곡선 SK-N-MC (평균 +/- SEM; 양측 t-검정, * p < 0.05). C. 실험 종료 시 절제된 종양의 무게 통계 (평균 + SD. 양측 t-검정, * p < 0.05). α, anti.
도 70: 운반체 항체-프로타민/유리 프로타민 및 siRNA에 의해 형성된 나노입자는 거의 중성의 표면 전하를 노출시킨다. 나노입자는 다른 곳에서 기술된 바와 같이 2시간 동안 형성되었고 동적 광 산란(DLS) 분석(Malvern Zeta-sizer)을 받았다. 입자 크기는 다양한 항체 접합 제제에 따라 지시된 편차를 갖는 350 내지 750 nm 범위였다. 더 중요한 것은 입자 표면의 제타 전위가 중성에서 단지 약간 음수라는 것이다.
도 71: 항-EGFR-mAB-SMCC-프로타민 접합체, 유리 SMCC-프로타민 및 siRNA 사이의 효과적인 나노입자 형성을 위한 전제 조건 판독. A-G. 항체 농도와 비교하여 Alexa488-대조군-siRNA의 몰비 상승(1:0.6 - 1:40) 및 32x SMCC-프로타민의 존재 하에 60 nM αEGFR-mAB-P에 의해 소포 형성. 소포 형성은 siRNA의 5 내지 10x 몰 과량에서 관찰될 수 있다 (D-E). 상부 패널: Alexa488-siRNA 양성 소포의 형광 현미경. 하단 패널: 상단 패널과 동일한 제제의 위상차, α, anti.
도 72: αEGFR-프로타민/유리 프로타민-Alexa488-siRNA에 의해 형성된 나노입자는 혈청 함유 조건에서 안정하다. A-B. αEGFR-mAB-프로타민, 유리 프로타민 및 Alexa488-siRNA를 1:10 비율로 2시간 자동 조립 및 PBS (A)에서 및 PBS/50% FCS (B)에서 24시간 동안 후속 인큐베이션 후의 안정성, 24시간 동안. α, anti.
도 73: αCD20-mAB-프로타민/유리 P-이브루티닙-Cy3.5 나노운반체의 혈청 안정성. A-F. αCD20-mAB-프로타민, 유리 프로타민 및 이브루티닙-Cy3.5를 1:20 비율로 2시간 자동 조립 및 PBS (A, D)에서 및 세포 배양 배지 R. PM 1/10% FCS (B, E) 및 PBS/50% FCS (C, F)에서와 같은 도전적인 조건에서 24시간 (A-C) 또는 72시간 (D-F) 동안 후속 인큐베이션 후의 안정성, α, anti.
도 74: 3개의 상이한 표적화 항체로 구성된 siRNA 나노운반체의 pH 안정성. αEGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민(상부 패널), αIGFlR-mAB-프로타민/유리 프로타민(중간 패널) 및 αCD33-mAB-프로타민/유리 프로타민(하단 패널)으로 형성된 나노운반체, 각각의 10배 몰 과량의 siRNA를 RT에서 2시간 동안 표준 조건 하에서 형성한 다음 챔버 슬라이드에서 24시간 동안 각 pH 안정성 테스트를 위해 30배 부피의 각각의 완충제에 희석함. 다음으로, 슬라이드를 세정하고 장착하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 나노운반체는 5.2와 8.0 사이의 pH 값에서 안정하고 더 낮은 pH에서 응집되는 경향이 있는 것으로 나타났다. α, anti.
도 75: αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민 및 이브루티닙-Cy3.5로 구성된 나노운반체의 pH 안정성. 20배 몰 과량의 이브루티닙-Cy3.5와 함께 αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민으로 형성된 나노운반체를 RT에서 2시간 동안 표준 조건에서 형성한 다음 챔버 슬라이드에서 24시간 동안 각 pH 안정성 테스트를 위해 30배 부피의 각각의 완충제에 희석하였다. 다음으로, 슬라이드를 세정하고 장착하고 형광 현미경으로 관찰하였다. 나노운반체는 5.8과 8.0 사이의 pH 값에서 안정하고 더 낮은 pH에서 분해되는 경향이 있는 것으로 나타났다. α, anti.
도 76: αEGFR-mAB-P/유리 프로타민-siRNA 나노운반체에서의 표적화 IgG 항체의 면역표지. 나노운반체를 2시간 동안 자동 조립에 의해 형성하였고(αEGFR-P/유리 프로타민 플러스 Alexa488-siRNA(A 및 D에서 녹색)), 처리된 유리 표면(A, E) 상에 o/n 고정시키고, αhIgG-Alexa647(A-C)로 염색하고, PBS로 헹구고, DAKO fluo 장착 매질에 장착하고, 형광 현미경 검사를 실시했다. 나노운반체 구조는 표면 영역에서만 표적화 αEGFR-항체의 Alexa647의 두드러진 염색을 나타낸다 (B-C). F. 염색 과정에 대한 도식적 개요, α, anti.
도 77: αIGFXR-mAB-P/유리 프로타민 siRNA 나노운반체에서의 표적화 IgG 항체의 면역표지. 나노운반체를 2시간 동안 자동 조립에 의해 형성하였고(테프로투무맙-프로타민 + Alexa488-siRNA (녹색)), 처리된 유리 표면(A, D) 상에 o/n 고정시키고, αhIgG-Alexa647(A-C)로 염색하고, PBS로 헹구고, DAKO fluo 장착 매질에 장착하고, 형광 현미경 검사를 실시했다. 나노운반체 구조는 표면 영역에서만 표적화 테프로투무맙 항체의 Alexa647의 두드러진 염색을 나타낸다 (B-C). F. 염색 과정에 대한 도식적 개요, α, anti.
도 78: 나노운반체 복합체에서의 유리 프로타민의 가시화. 여기에서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 유리 프로타민이 고갈되고 유리 프로타민으로 이 제제를 재구성한 αEGFR-mAB-프로타민 제제를 사용하였고, Cy3 발색단으로 태그하였다. A: 제조사의 권고에 따라 프로타민을 Cy3-NHS 에스테르와 접합하고 스핀 컬럼으로 정제했다. 생성된 프로타민-Cy3는 강한 Cy3-의존성 형광을 나타내었고 접합되지 않은 물질과 비슷한 방식으로 농축되었으므로, 일반적인 32배 몰 과량으로 항체-프로타민에 대해 재구성되었다 (B). 태그되지 않은 siRNA로 재구성된 이러한 물질에 의해 형성된 siRNA 나노운반체는 나노구조의 내강에서 프로타민의 강한 Cy3 의존 형광 신호를 나타내었다 (C). 이에 반해, αhIgG-Alexa 647 항체로 인간 IgG 신호에 대해 염색된 동일한 나노구조는 항체 위치에 대해 양성으로 염색된 테두리 구조를 노출했다 (D). E: C와 D에서 강조 표시된 부분을 병합하고 더 높은 배율로 표시한다. F: E의 강조 표시된 부분의 더 높은 배율. α, anti.
도 79: 시아닌-염료 접합된 억제제 제피티닙, 겜시타빈 및 베네토클락스의 합성.
도 80: 더 쉽고 더 저렴한 다가음이온성 분자 모이어티로의 개념 확장.
본 출원의 발명자들은 놀랍게도 문헌[Baumer, N. et al., 2016 Nat. Protoc. 11, 22-36]에 기재된 바와 같은 항체-프로타민 접합체에 대한 접합 프로토콜의 변형이 항체-프로타민 접합체 및 음전하의 카고 분자를 포함하는 나노입자를 형성하여 표적으로 전달된다는 것을 발견하였다.
프로타민, 유리 프로타민 및 siRNA와 같은 음전하 카고 분자에 화학적으로 접합된 표적화 모이어티를 포함하는 복합 나노입자의 형성은 발암 경로를 선택적으로 차단할 수 있는 siRNA 및 다른 이펙터 약물의 세포 유형 특이적 치료제 전달에 사용될 수 있다.
본 발명의 접합 프로토콜에서, 두 단계가 변형되었다.
먼저, 항체-프로타민 생성을 위한 접합 단계는 항체 및 본질적으로 유리 설포-SMCC가 없는 SMCC-프로타민 접합체로 수행하였다. 문헌[Baumer, N. et al., 2016 Nat. Protoc. 11, 22-36]에 기재된 바와 같은 프로토콜에서, 유리 설포-SMCC는 이 접합 단계에서 존재했고 접합 단계 후에만 제거되었다. 둘째, 항체-프로타민 접합체에 siRNA를 로딩하는 단계를 위해, 항체-SMCC 접합체와 siRNA를 일정량의 유리 프로타민 존재 하에 서로 접촉시킨다. 놀랍게도, 항체-프로타민 접합체, 유리 프로타민 및 siRNA를 포함하는 거대입자가 이 변형된 프로토콜로 형성된다.
본 출원의 발명자들은 더욱 놀랍게도 이러한 나노입자가 기술된 바와 같은 이전 프로토콜을 사용하여 생성된 접합체와 비교하여 siRNA의 보다 효율적인 결합 및 수송을 제공한다는 것을 발견하였다(Baumer, N. et al., 2016 Nat.Protoc.11, 22-36).
본 발명의 방법에 의해 생성된 나노구조는 선형 단일 항체-프로타민-siRNA 복합체보다 훨씬 크고 광학 현미경에 의해 소포 구조로 검출될 수 있다. 본 출원의 발명자들은 이러한 나노입자를 형성하고 각각의 세포를 효율적으로 표적화하기 위해 일정량의 결합되지 않은 프로타민이 필요함을 발견하였다. 그 다음, 의도한 표적(onco-) 유전자의 녹다운이 구체적으로 수행된다. 양전하의 나노구조(마이셀)는 또한 실시예 6, 15 및 18 내지 21에 나타낸 바와 같이 음전하의 다른 소분자를 위한 운반체 역할을 할 수 있으며, 여기에서 소분자는 표적화된 효율적인 방식으로 각각의 세포로 수송되었다. 이 접근법을 통해 siRNA와 같은 치료적 분자는 정전기 나노구조를 형성하도록 작용할 뿐만 아니라 나노구조 내부에 캡슐화된다.
진행 및 전이 단계에 있는 대부분의 암 유형은 본 발명이 만들어 질때 효과적으로 치유될 수 없기 때문에 새롭고 더 효과적이고 더 잘 견딜 수 있는 치료 옵션에 대한 강한 요구가 있다. SMCC-프로타민과 유리 프로타민이 화학적으로 결합된 암 세포 특이적 항체와 같은 표적화 모이어티로 구성된 나노입자는 siRNA와 같은 음전하의 분자 및 진핵 세포에 의해 흡수되지 않는 다른 작은 분자들을 수송할 수 있다. 특히 siRNA는 모든 유전자에 대해 정의할 수 있기 때문에 이 시스템은 잠재적으로 암, 신경변성 및 바이러스 감염을 비롯한 많은 질환에 적용할 수 있다.
본 출원은 따라서 (c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자 제조 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 "제1 접합체"는 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진 접합체를 의미한다.
본 발명의 방법에서, (c)는 항체와 제1 접합체를 접합시키는 접합 단계이다. 이전에 문헌[Baumer, N. et al., 2016 Nat. Protoc. 11, 22-36]에 기재된 방법과 달리, 이 단계에서 사용되는 제1 접합체를 포함하는 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없다. 이에 따라, 단계 (c)의 접합은 바람직하게는 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 조성물에서 수행된다.
상기 (c) 단계에서 제1 접합체는 항체보다 몰 과량인 것이 바람직하며, 이는 바람직하게는 항체 분자보다 제1 접합체 분자가 더 많다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서 제1 접합체와 항체 사이의 몰비는 약 10:1 이상, 바람직하게는 약 15:1 이상, 바람직하게는 약 20:1 이상이다. 일부 구현예에서, 제1 접합체와 항체 사이의 몰비는 약 50:1 이하, 바람직하게는 약 45:1 이하, 바람직하게는 약 40:1 이하이다. 일부 구현예에서, 단계 (c)에서 제1 접합체와 항체 사이의 몰비는 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 15:1 내지 약 45:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 40:1 범위이다. 바람직한 구현예에서, 제1 접합체와 항체 사이의 몰비는 약 20:1, 약 21:1, 약 22:1, 약 23:1, 약 24:1, 약 25:1, 약 26:1, 약 27:1, 약 28:1, 약 29:1, 약 30:1, 약 31:1, 약 32:1, 약 33:1, 약 34:1, 약 35:1, 약 36:1, 약 37:1, 약 38:1, 약 39:1, 약 40:1이다.
본 발명의 방법에 있어서, 단계 (d)에서, 제2 접합체, 양전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 서로 접촉시킨다. 이론에 얽매이지 않고, 앞서 언급한 세 가지 성분들이 자기 조립하여 나노입자를 형성하는 것으로 여겨진다. 여기서, 상기 제2 접합체는 (c) 단계에서 형성된 제2 접합체이다.
단계 (d)와 관련하여 양전하의 폴리펩티드를 언급할 때, 표현은 유리된 양전하의 폴리펩티드 및 양전하의 폴리펩티드의 접합체, 예컨대 링커와 접합된 양전하의 폴리펩티드를 모두 포함한다. 단계 (d)의 양전하의 폴리펩티드는 단계 (c)에서와 같이 첫 번째 접합된 것일 수 있거나, 단계 (c)의 제1 접합체와 다른 분자일 수도 있다. 예를 들어, 단계 (d)와 관련하여 용어 양전하의 폴리펩티드는 (유리) 프로타민 및 SMCC-프로타민을 모두 포함할 수 있다. 단계 (d)와 관련하여, 상기 용어는 또한 양전하의 폴리펩티드의 혼합물 및 양전하의 폴리펩티드 접합체의 혼합물을 비롯하여, 상이한 양전하의 폴리펩티드들의 혼합물을 포괄한다.
일부 구현예에서, 단계 (d)의 양전하의 폴리펩티드는 단계 (c)의 제1 접합체이다. 예시적인 예로서, 단계 (d)의 양전하의 폴리펩티드는 SMCC-프로타민이고 단계 (c)의 제1 접합체도 SMCC-프로타민이다. 단계 (d)의 양전하의 폴리펩티드가 단계 (c)의 제1 접합체인 경우, 단계 (c)에서 형성된 조성물은, 단계 (c)에서 형성된 제2 접합체를 "잔여" 양전하의 폴리펩티드(본 문맥에서 "잔여" 제1 접합체 포함)로부터 분리하는 단계 없이 단계 (d)에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (d)의 양전하의 폴리펩티드는 단계 (c)의 제1 접합체와 상이하다. 예시적인 예로서, 단계 (d)의 양전하의 폴리펩티드는 (유리) 프로타민인 반면, 단계 (c)의 제1 접합체는 SMCC-프로타민이다. 이러한 경우, 방법은 단계 (c) 이후 및/또는 단계 (d) 이전에 제1 접합체로부터 제2 접합체를 분리하는 단계를 단계 (c) 이후에 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 단계 (d)에서 및/또는 단계 (d) 이전에 양전하의 폴리펩티드를 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
단계 (d)와 관련하여 바람직한 양전하의 폴리펩티드는 프로타민, SMCC-프로타민, 히스톤 서브유닛, SMCC에 접합된 히스톤 서브유닛, 또는 이의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 프로타민, SMCC-프로타민 또는 이의 혼합물이 바람직하고, 프로타민 또는 SMCC-프로타민이 더욱 바람직하다.
단계 (d)에서, 양전하의 폴리펩티드는 바람직하게는 제2 접합체에 비해 몰 과량이며, 이는 바람직하게는 제2 접합체 분자보다 양전하의 폴리펩티드 분자가 더 많다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체 사이의 몰비는 적어도 약 10:1, 바람직하게는 적어도 약 15:1, 바람직하게는 적어도 약 20:1이다. 일부 구현예에서, 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체 사이의 몰비는 약 50:1 이하, 바람직하게는 약 45:1 이하, 바람직하게는 약 40:1 이하이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체 사이의 몰비는 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 15:1 내지 약 45:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 40:1 범위이다. 바람직한 구현예에서, 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체 사이의 몰비는 약 약 20:1, 약 21:1, 약 22:1, 약 23:1, 약 24:1, 약 25:1, 약 26:1, 약 27:1, 약 28:1, 약 29:1, 약 30:1, 약 31:1, 약 32:1, 약 33:1, 약 34:1, 약 35:1, 약 36:1, 약 37:1, 약 38:1, 약 39:1, 약 40:1이다.
단계 (d)에서, 음전하의 분자는 바람직하게는 제2 접합체에 비해 몰 과량이며, 이는 바람직하게는 제2 접합체 분자보다 음전하의 분자가 더 많다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 단계 (d)에서 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체 사이의 몰비는 적어도 약 10:1, 적어도 약 15:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 25:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 70:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 150:1, 적어도 약 200:1, 적어도 약 250:1, 적어도 약 300:1, 적어도 약 400:1 또는 적어도 약 500:1이다.
단계 (d)에서, 음전하의 분자는 바람직하게는 양전하의 폴리펩티드와 비교하여 등몰 또는 몰 초과이며, 이는 바람직하게는 양전하의 폴리펩티드 분자보다 음전하의 분자가 거의 동일하거나 더 많다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서 단계 (d)에서 음전하의 분자와 양전하의 폴리펩티드 사이의 몰비는 적어도 약 1:1, 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 60:1, 적어도 약 70:1, 적어도 약 80:1, 적어도 약 90:1, 또는 적어도 약 100:1이다.
본 발명의 방법은 넓은 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 본 출원의 실시예는 나노입자가 약 4℃, 실온 뿐만 아니라 37℃에서 형성될 수 있음을 보여준다. 따라서, 예를 들어, 단계 (c) 및/또는 단계 (d)는 약 1℃ 내지 약 60℃, 바람직하게는 약 2℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 3℃ 내지 약 40℃, 더욱 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 따라서, 단계 (d)는 약 1℃ 내지 약 60℃, 바람직하게는 약 2℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 3℃ 내지 약 40℃, 더욱 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 37℃이다.
단계 (d)는 바람직하게는 나노입자의 형성을 허용하는 인큐베이션 단계를 포함하는 것으로 생각된다. 인큐베이션 단계는 바람직하게는 적어도 약 1시간, 바람직하게는 적어도 약 1.5시간, 바람직하게는 적어도 약 2시간 동안 수행된다. 인큐베이션 단계는 바람직하게는 약 48시간 이하, 바람직하게는 약 24시간 이하, 바람직하게는 약 18시간 이하, 바람직하게는 약 12시간 이하, 바람직하게는 약 10시간 이하, 바람직하게는 약 9시간 이하, 바람직하게는 약 8시간 이하, 바람직하게는 약 7시간 이하, 바람직하게는 약 6시간 이하 동안 수행될 수 있다. 인큐베이션 단계는 바람직하게는 약 1시간 내지 약 48시간 동안, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 24시간 동안, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 18시간 동안, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 12시간 동안, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 10시간 동안, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 9시간 동안, 바람직하게는 약 1.5시간 내지 약 8시간 동안, 바람직하게는 약 1.5시간 내지 약 7시간 동안, 바람직하게는 약 2시간 내지 약 6시간 동안 수행된다. 이론에 얽매이지 않고, 최적의 결과는 약 2시간 내지 약 6시간 동안 인큐베이션 내에서 달성될 수 있다고 믿어진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 단계는 약 2시간 내지 약 6시간, 예를 들어 약 2시간, 약 2.1시간, 약 2.2시간, 약 2.3시간, 약 2.4시간, 약 2.5시간, 약 2.6시간, 약 2.7시간, 약 2.8시간, 약 2.9시간, 약 3시간, 약 3.1시간, 약 3.2시간, 약 3.3시간, 약 3.4시간, 약 3.5시간, 약 3.6시간, 약 3.7시간, 약 3.8시간, 약 3.9시간, 약 4시간, 약 4.1시간, 약 4.2시간, 약 4.3시간, 약 4.4시간, 약 4.5시간, 약 4.6시간, 약 4.7시간, 약 4.8시간, 약 4.9시간, 약 5시간, 약 5.1시간, 약 5.2시간, 약 5.3시간, 약 5.4시간, 약 5.5시간, 약 5.6시간, 약 5.7시간, 약 5.8시간, 약 5.9시간 및 약 6시간의 인큐베이션 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 (c) 단계 이전에 (a) 양전하의 폴리펩티드를 이작용성 링커와 접합시키는 단계 및 (b) 접합되지 않은 링커의 제거 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "접합되지 않은 링커의 제거"는 접합되지 않은 링커로부터 양전하의 폴리펩티드와 이작용성 링커의 접합체(즉, 제1 접합체)를 분리하는 데 적합한 임의의 단계를 의미한다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 여과, 투석, 겔 여과, 크로마토그래피 또는 전기영동을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "접합" 또는 "접합체"는 화학적 접합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수단에 의한 모든 형태의 공유 결합을 통해 2개 이상의 분자를 함께 연결하는 것을 의미한다. 따라서 접합은 링커의 적어도 한 부분을 폴리펩티드에 접합시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 연결은 상이한 반응기 또는 동일한 반응기를 통해 달성될 수 있다.
가교를 위한 표적화될 수 있는 폴리펩티드 상의 작용기는 바람직하게는 아민 및/또는 설프히드릴 및/또는 카르복실을 통한 1차 차민, 설프히드릴, 카르보닐, 히드록실, 탄수화물, 카르복실산 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드에 대한 링커의 접합은 상기 폴리펩티드의 NH2-기를 통해 달성된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드에 대한 링커의 접합은 상기 폴리펩티드의 티올기를 통해 달성된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드에 대한 링커의 접합은 상기 폴리펩티드의 카르복실기를 통해 달성된다. 링커(또는 가교제)를 폴리펩티드에 화학적으로 접합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법은 단계 (c) 이전에 항체 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 정제 단계는 탈염 단계일 수 있다. 이러한 탈염 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 겔 여과 또는 투석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 생산 환경의 구성성분으로부터 단계 (c)에서 수득된 나노입자를 분리 및/또는 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분리 및/또는 회수 후, 나노입자는 그의 생산 환경으로부터의 모든 다른 구성성분과 회합이 없거나 실질적으로 없다. 생산 환경의 오염 구성성분은 일반적으로 나노입자의 용도, 특히 치료 용도를 방해하는 물질이며 유리 제2 접합체(즉, 나노입자에 포함되지 않은 제2 접합체), 유리된 양전하의 폴리펩티드(즉, 나노입자에 포함되지 않음), 또는 유리된 음전하의 분자(즉, 나노입자에 포함되지 않음)를 포함할 수 있다. 나노입자는 주어진 샘플에서 총 단백질 중 중량 기준으로 예를 들어 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%를 구성할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 나노입자는 주어진 샘플에서 총 단백질 중 중량 기준으로 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%를 구성한다. 바람직한 구현예에서, 나노입자는 주어진 샘플에서 총 단백질 중 중량 기준으로 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%상, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 구성한다. 단리된 나노입자는 상황에 따라 총 단백질 함량의 약 5 중량% 내지 약 99.9 중량% 또는 약 100중량%를 구성할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
선택적으로: (a) 양전하의 폴리펩티드를 이작용성 링커와 접합시키는 단계;
선택적으로: (b) 접합되지 않은 이작용성 링커를 제거하는 단계;
선택적으로: 항체의 정제;
(c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계;
선택적으로: 단백질 함량의 결정;
선택적으로; 바람직하게는 유세포분석을 통한 항체 기능성의 평가;
(d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계; 및/또는
선택적으로: 나노입자의 회수 및/또는 분리.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 단일 사슬로 이루어진 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드"와 동의어일 수 있거나, 추가로 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 폴리펩티드는 적어도 약 10개, 적어도 약 20개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개, 적어도 약 100개, 적어도 약 150개, 적어도 약 200개, 적어도 약 250개, 적어도 약 300개, 적어도 약 350개, 적어도 약 400개, 적어도 약 450개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 발생 및/또는 단백질 생성 아미노산으로 이루어진다. 그러나, 아미노산(들) 및/또는 펩티드 결합(들)이 기능적 유사체로 대체된 펩티드 모방체도 본 발명에 포함된다. 폴리펩티드라는 용어는 또한 폴리펩티드의 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 지칭하지만 배제하지 않는다. 이러한 변형은 기본 교재 및 더 자세하게는 연구 문헌에 잘 기술되어 있다.
용어 "양전하의 폴리펩티드"는 생리학적 pH 또는 그 근처에서(예를 들어, pH가 4 내지 10, 5 내지 9, 또는 6 내지 8인 용액에서) 순 양전하를 갖는 폴리펩티드를 의미하며, 바람직하게는 정전기적 상호작용을 통해 핵산 또는 음전하의 소분자를 결합시킬 수 있다. 이 부류의 운반체로는 프로타민, 히스톤 또는 히스톤 서브유닛이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 이러한 양전하의 폴리펩티드는 적어도 2+, 바람직하게는 적어도 3+, 바람직하게는 적어도 4+, 바람직하게는 적어도 5+, 바람직하게는 적어도 6+, 바람직하게는 적어도 7+, 바람직하게는 적어도 8+, 바람직하게는 적어도 9+, 바람직하게는 적어도 10+, 바람직하게는 적어도 11+, 바람직하게는 적어도 12+, 바람직하게는 적어도 13+, 바람직하게는 적어도 14+, 바람직하게는 적어도 15+, 바람직하게는 적어도 16+, 바람직하게는 적어도 17+, 바람직하게는 적어도 18+, 바람직하게는 적어도 19+, 바람직하게는 적어도 20+의 순 전하를 갖는다. 용어 "양전하의 폴리펩티드"는 유리(즉, 비접합) 폴리펩티드 뿐만 아니라 링커에 접합된 폴리펩티드와 같은 접합된 폴리펩티드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 양전하의 폴리펩티드는 프로타민을 포함한다. 프로타민은 작고 강염기성인 단백질을 말하며, 이의 양전하의 아미노산 기(특히 아르기닌)는 일반적으로 그룹으로 배열되어 있으며 다중 양이온 특성으로 인해 핵산의 음전하를 중화시킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로타민"은 그의 단편 및 상기 아미노산 서열 또는 그의 단편의 다량체 형태를 포함하는 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 수득되거나 유도된 임의의 프로타민 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 프로타민은 천연 기원이거나 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합 방법을 사용하면 프로타민의 다중 복제본이 생성되거나 프로타민의 분자 크기 및 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 상응하는 화합물이 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 인공 프로타민이 합성되는 경우, 사용되는 절차에는 예를 들어 수송 기능(예: DNA의 축합)에 바람직하지 않은 천연 프로타민의 기능을 갖는 아미노산 잔기를 다른 적합한 아미노산으로 대체하는 것이 포함될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 프로타민은 임의의 종이거나 임의의 종으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 프로타민은 포유동물, 조류, 양서류, 파충류 또는 어류로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 프로타민은 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 말, 소, 돼지, 염소, 닭, 양, 당나귀, 토끼, 알파카, 라마, 거위, 황소, 칠면조, 연어 등, 바람직하게는 인간 또는 연어로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 종일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 프로타민은 또한 상이한 프로타민들의 혼합물일 수 있다. 바람직한 프로타민은 연어 프로타민을 포함한다. 바람직한 프로타민은 인간 프로타민을 포함한다. 바람직한 프로타민은 서열 번호 53에 나타낸 연어 프로타민과 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 바람직한 프로타민은 서열 번호 53에 나타낸 연어 프로타민을 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진다. 바람직한 프로타민은 서열 번호 55에 나타낸 인간 프로타민 1과 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 바람직한 프로타민은 서열 번호 55에 나타낸 인간 프로타민 1을 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진다.
전술한 바와 같이, 프로타민은 또한 siRNA와 같은 음전하의 핵산과 즉시 상호작용하는 강한 양전하의 단백질이다. 이론에 얽매이지 않고 세포 내로의 복합체의 흡수는 수용체-매개 세포내섭취(endocytosis)를 통해 매개되는 것으로 여겨진다. 또한 항체가 수용체에 결합하고 나노입자가 클라트린으로 코팅된 피트에서 세포내섭취를 통해 내재화되는 것으로 여겨진다. 또한 소포는 세포 내로 수송되는 것으로 여겨지며 여기서 siRNA가 나노입자로부터 방출되고 RNAi 경로에 들어갈 수 있다.
본 발명에 따른 추가의 바람직한 양전하의 폴리펩티드는 히스톤 또는 히스톤 서브유닛을 포함한다. 히스톤은 양전하의 아미노산(리신 및 아르기닌)의 비율이 높은 염색질에 존재하는 작은 DNA 결합 단백질을 말하며, 이로 인해 뉴클레오티드 서열과 독립적으로 DNA에 결합하여 뉴클레오솜으로 접힐 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "히스톤"은 히스톤 서브유닛, 이의 단편 및 상기 아미노산 서열 또는 이의 단편의 다량체 형태를 포함하는 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 얻거나 유래된 임의의 히스톤 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 히스톤 H2, H3 및 H4가 특히 적합하다. 일반적으로, 본 발명에 따른 히스톤은 임의의 종이거나 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 히스톤은 포유동물, 조류, 양서류, 파충류 또는 어류로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 히스톤은 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 말, 소, 돼지, 염소, 닭, 양, 당나귀, 토끼, 알파카, 라마, 거위, 황소, 칠면조, 연어 등, 바람직하게는 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 종일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 히스톤은 또한 상이한 히스톤 또는 히스톤 서브유닛의 혼합물일 수 있다. 바람직한 히스톤은 인간 히스톤을 포함한다. 바람직한 히스톤은 서열 번호 56에 나타낸 인간 히스톤 H2와 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%, 바람직하게는 적어도 약 95%, 바람직하게는 적어도 약 98%, 바람직하게는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 바람직한 히스톤은 서열 번호 56에 나타낸 인간 히스톤 H2를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진다. 바람직한 히스톤은 서열 번호 57에 나타낸 인간 히스톤 H2와 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 바람직한 히스톤은 서열 번호 57에 나타낸 인간 히스톤 H2를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진다. 바람직한 히스톤은 서열 번호 58에 나타낸 인간 히스톤 H2와 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 바람직한 히스톤은 서열 번호 58에 나타낸 인간 히스톤 H2를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 "링커"는 유리(즉, 비접합) 형태로 적어도 2개의 작용기를 함유하는 가교제 또는 가교결합제를 의미할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 카르보디이미드, 카르보닐, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 말레이미드, N-히드록시석신이미드 (NHS)-에스테르, 설포-NHS-에스테르, PFP-에스테르, 히드록시메틸 포스핀, 아릴아지드, 피리딜 디설파이트, 비닐 설폰을 포함하지만 이에 제한되지 않는 작용기를 갖는 동종- 또는 이종 이작용성인 가교결합제를 포함한다. 이들이 생성하는 결합에는 아미드, 이황화물, 하이드라진, 티오에테르 및 에스테르 결합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 가교를 위한 링커 또는 가교결합제에 의해 표적화될 수 있는 작용기는 1차 아민, 설프히드릴, 카르보닐, 히드록실, 탄수화물, 카르복실 등, 바람직하게는 아민 및 설프히드릴, 가장 바람직하게는 설프히드릴을 포함한다. 바람직하게는 링커는 절단가능한 이황화 결합(S-S)을 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 링커는 pH-의존 절단가능한 측을 포함한다. 링커는 수용성, 세포막 투과성, 다양한 스페이서 아암 길이로 될 수 있거나, 자발적 반응성일 수 있거나 광반응성 기를 포함할 수 있다. 또한, 링커는 표지되거나 태그될 수 있다.
일 구현예에서, 링커는 항체 및 양전하의 폴리펩티드와 직접 접합될 수 있으며, 이에 대한 예는 설포-SMCC 링커이다. 가교결합제의 예는 N-히드록시설포석신이미드(설포-NHS), 설포석신이미딜(퍼플루오로-아지도벤즈아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-SFAD), 석신이미딜 4-포르밀벤조에이트(SFB), 석신이미딜 4-히드라지노니코티네이트 아세톤 히드라존(SANH), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 2-이미노티올란(트라우트 시약), N-석신이미딜(아세틸티오)아세테이트(SATA) 및 3[2-피리딜디티오]프로피오닐 히드라지드(PDPH) 또는 공개적으로 이용가능하고 당업자에게 공지된 임의의 다른 링커를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"이종작용성" 링커는 표적화된 작용기가 서로 상이한 링커를 의미한다. 일 구현예에서, 링커는 가교를 위한 표적화되는 작용기로서 아민 및 설프히드릴, 또는 아민 및 히드록실, 바람직하게는 아민 및 설프히드릴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 가교를 위한 표적화된 작용기로서 아민 및 설프히드릴을 포함하는 링커를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 절단 부위, 예를 들어 절단가능한 이황화 결합(S-S)을 갖지 않는 이종이작용성 링커를 포함한다. 바람직한 이종작용기 링커는 예를 들어 α-말레이미도아세톡시-석신이미드 에스테르 (AMAS), N(4-[p-아지도살리실아미도]부틸)-3'-(2'-피리딜디티오) 프로피온아미드 (APDP*), (β-말레이미도프로피온산)히드라지드·TFA (BMPH), (β-말레이미도프로필옥시)석신이미드 에스테르 (BMPS), ε-말레이미도카프로산 (EMCA), (ε-말레이미도카프로일옥시)석신이미드 에스테르 (EMCS), (γ-말레이미도부티릴옥시)석신이미드 에스테르 (GMBS), κ-말레이미도운데칸산 (KMUA), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), 석신이미딜-6-(3'-[2-피리딜-디티오]프로피온아미도)헥사노에이트 (LC-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르 (MBS), 석신이미딜-3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP), 석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), 석신이미딜 요오도아세테이트 (SIA), 석신이미딜 4-(ρ-말레이미도-페닐)부티레이트 (SMPB), NHS-PEG24-말레이미드 SM (PEG24), NHS-PEG12-말레이미드 (SM[PEG]12), NHS-PEG8-말레이미드 (SM[PEG]8), NHS-PEG6-말레이미드 (SM(PEG)6), NHS-PEG4-말레이미드 (SM[PEG]4), NHS-PEG2-말레이미드 (SM[PEG]2), 석신이미딜 4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산-카르복실레이트 (SMCC), 석신이미딜 요오도아세테이트 (SIA), 석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), (ε-말레이미도카프로일옥시)설포석신이미드 에스테르 (설포-EMCS),-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트 (SMPH), N-(γ-말레이미도부틸옥시)설포석신이미드 에스테르 (설포-GMBS),-(κ-말레이미도운데카노일옥시)설포석신이미드 에스테르 (설포-KMUS), 술포석신이미딜 6-(α-메틸-α-[2-피리딜디티오]-톨루아미도)헥사노에이트 (설포-LC-SMPT), 설포석신이미딜 6-(3'-[2-피리딜-디티오]프로피온아미도)헥사노에이트 (설포-LC-SPDP), 말레이미도벤조일-히드록시설포석신이미드 에스테르 (설포-MBS), 설포석신이미딜(4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트 (설포-SIAB), 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도 메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (설포-SMCC), 설포석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (설포-SMPB) N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC), 설포-NHS-(2-6-[비오틴아미도]-2-(p-아지도베자아미도) (설포-SBED)이다. 이종이작용성 링커가 본 발명의 방법에서 바람직하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 설포-SMCC인 이종이작용성 링커를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "접합되지 않은 이작용성 링커"는 2개의 작용기가 모두 접합되지 않은 이작용성 링커를 의미한다. 일부 구현예에서, 접합되지 않은 이작용성 링커는 양전하의 폴리펩티드에 접합되지 않는다. 일부 구현예에서, 접합되지 않은 이작용성 링커는 항체에 접합되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는"은 접합되지 않은 이작용성 링커가 조성물에 존재하지 않는 것이 바람직하지만, 본 발명에 따른 조성물에 매우 소량의 접합되지 않은 이작용성 링커는 바람직하게는 이러한 양이 이러한 조성물의 유리한 이용에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한 존재할 수 있음을 의미한다. 일부 구현예에서, 접합되지 않은 링커가 본질적으로 없는 제1 접합체를 포함하는 조성물은 접합되지 않은 링커 분자보다 적어도 약 10배 더 많은 제1 접합체 분자를 포함한다. 따라서, 접합되지 않은 링커가 본질적으로 없는 제1 접합체는 바람직하게는 제1 접합체 대 접합되지 않은 링커의 몰비가 약 10:1 이상, 바람직하게는 약 20:1 이상, 바람직하게는 약 50:1 이상, 바람직하게는 약 100:1 이상, 바람직하게는 약 200:1 이상, 바람직하게는 약 500:1 이상, 바람직하게는 약 1000:1 이상, 바람직하게는 약 2000:1 이상, 바람직하게는 약 5000:1 이상, 바람직하게는 약 10000:1 이상이다. 일부 구현예에서, 제1 접합체 및 접합되지 않은 이작용성 링커를 원래 포함하고, 탈염 단계와 같이 접합되지 않은 이작용성 링커를 완전히 또는 부분적으로 제거할 수 있는 정제 단계를 거친 조성물은, 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 조성물인 것으로 간주된다.
용어 "항체"의 정의는 단클론, 키메라, 단일 사슬, 인간화 및 인간 항체와 같은 구현예를 포함한다. 전장 항체에 더하여, 정의는 항체 유도체 및 항체 단편, 특히 Fab 단편도 포함한다. 항체 단편 또는 유도체는 F(ab')2, Fv, scFv 단편, 또는 도메인 항체 또는 나노바디와 같은 단일 도메인 항체, 단일 가변 도메인 항체, 또는 VHH, VH 또는 VL일 수 있는 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 추가로 포함하며, 이는 다른 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 용어는 또한 디아바디 또는 DART(Dual-Affinity Re-Targeting) 항체를 포함한다. 추가로 (이중특이성) 단일 사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(Tandab), 다음과 같은 구조로 예시되는 "미니바디": (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 또는 (scFv-CH3-scFv)2, "Fc DART" 및 "IgG DART", 트리아바디와 같은 멀티바디가 구상된다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단리된 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드뿐만 아니라 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 더 큰 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 기재된 항체와 동일한 특이성을 나타내는 본 명세서에 기재된 항체의 유도체 또는 변이체에 관한 것이다. "항체 변이체"의 예는 비인간 항체의 인간화 변이체, "친화도 성숙" 항체 및 변경된 이펙터 기능(들)을 갖는 항체 돌연변이체를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,648,260호 참조).
용어 "항체"는 또한 상이한 부류(즉, IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE) 및 하위 부류(예를 들어, IgG1, IgG2 등)의 면역글로불린(Ig)을 포함한다. 본 발명의 의미에서 용어 항체의 정의에도 속하는 항체의 유도체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 이황화 결합 형성, 파네실화, 히드록실화, 메틸화 또는 에스테르화와 같은 분자의 변형을 포함한다.
항체의 기능적 단편은 F(ab')2 단편의 도메인, Fab 단편, scFv 또는 단일 면역글로불린 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체 폴리펩티드, 예를 들어 단일 중쇄 가변 도메인 또는 단일 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 상기 본 명세서에 기재된 다른 항체 단편을 포함하는 작제물을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1와 CL 도메인 사이에서 발생하는 분자간 이황화 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "인간" 항체는 항체 또는 그의 기능적 단편이 인간 생식세포계열 항체 레퍼토리에 포함된 아미노산 서열(들)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 본 명세서에서 정의의 목적상, 항체 또는 이의 단편은, 그러한 (a) 인간 생식세포계열 아미노산 서열(들)로 구성되는 경우, 즉 해당 항체 또는 그의 기능적 단편의 아미노산 서열(들)이 발현된 인간 생식세포계열 아미노산 서열(들)과 동일한 경우, 인간으로 간주될 수 있다. 항체 또는 이의 기능적 단편은 (a) 가장 가까운 인간 생식세포계열 서열(들)에서부터 체세포 과돌연변이의 각인으로 인해 예상되는 것보다 더 많이 벗어나지 않는 서열(들)로 구성된 경우 인간으로 간주될 수 있다. 또한, 많은 비인간 포유동물, 예를 들어 마우스 및 래트와 같은 설치류의 항체는 발현된 인간 항체 레퍼토리에도 존재할 것으로 예상되는 VH CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 발현된 인간 레퍼토리에 존재할 것으로 예상될 수 있는 인간 또는 비인간 기원의 임의의 이러한 서열(들)은 또한 본 발명의 목적을 위해 "인간"으로 간주될 것이다. 따라서 용어 "인간 항체"는 예를 들어 Kabat 등(문헌[Kabat et al., (1991) 'Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.', National Institutes of Health])에 의해 기재된 바와 같은 것을 포함하여 당업계에 공지된 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열과 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명의 인간 항체는 예를 들어 CDR에서, 특히, CDR3에서 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기로 대체된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 위치를 가질 수 있다.
비인간 및 인간 항체 또는 이의 기능적 단편은 바람직하게는 단클론성이다. 단클론성 인간 항체를 제조하는 것은 특히 어렵다. 불멸화 세포주와 뮤린 B 세포의 융합과 대조적으로, 불멸화 세포주와 인간 B 세포의 융합은 실행가능하지 않다. 따라서 인간 단클론 항체는 항체 기술 분야에서 일반적으로 인정되는 상당한 기술적 난관을 극복한 결과이다. 항체의 단클론 성질은 특히 치료제로 사용하기에 매우 적합한 데, 이러한 항체는 특성이 잘 규명되고 재현 가능하게 만들어지고 정제될 수 있는 단일 균질 분자 종으로 존재할 것이기 때문이다. 이러한 요인으로 인해 높은 수준의 정확도로 생물학적 활성을 예측할 수 있는 생성물이 얻어지며, 이러한 분자가 인간의 치료 투여에 대한 규제 승인을 얻으려면 매우 중요하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성체화, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지향된다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인(다중클론) 항체 제제와 달리, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 단클론 항체는 특이성 외에도 다른 면역글로불린에 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 장점이 있다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조). "단클론 항체"는 또한 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
단클론 항체 또는 상응하는 기능적 단편이 인간 항체 또는 상응하는 기능적 단편인 것이 특히 바람직하다. 인간에 대한 치료적 투여를 위한 항체 제제를 고려함에 있어서, 항체가 인간 기원인 것이 매우 유리하다. 인간 환자에게 투여한 후, 인간 항체 또는 이의 기능적 단편은 아마도 환자의 면역 체계에 의해 강한 면역원성 반응을 유도하지 않을 것이며, 즉, 비인간 단백질인 이물질인 것으로 인식되지 않을 것이다. 이는 치료용 항체에 대해 숙주, 즉 환자, 항체가 생성되지 않음을 의미하며, 그렇지 않으면 치료용 항체의 활성을 차단하고/하거나 환자의 신체에서 치료용 항체의 제거를 가속화하여 원하는 치료 효과를 발휘하지 못하게 하는 것이다.
본 발명의 추가 구현예에 따르면, 항체는 면역글로불린일 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에 따르면, 항체는 IgG 항체일 수 있다. IgG 아이소타입은 고도로 구별되는 항원 인식 및 결합을 담당하는 중쇄 및 경쇄의 가변 항체 영역뿐만 아니라 "천연적으로" 생산된 항체에 일반적으로 존재하는 중쇄 및 경쇄 항체 폴리펩티드 사슬의 불변 영역을 포함하며, 경우에 따라 탄수화물이 있는 하나 이상의 부위의 변형을 포함한다. 이러한 글리코실화는 일반적으로 IgG 형식의 특징이며 생체내에서 다양한 이펙터 기능을 유도하는 것으로 알려진 전체 항체의 소위 Fc 영역을 포함하는 불변 영역에 위치한다. 또한, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 IgG의 결합을 매개할 뿐만 아니라 Fc 수용체 존재가 증가된 위치(예를 들어, 염증 조직)로의 IgG의 귀환을 촉진한다. 유리하게는, IgG 항체는 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이며, 이들의 생체내 작용 메카니즘이 특히 잘 이해되고 특성화되기 때문에 선호되는 형식이다. 이것은 특히 IgG1 항체의 경우이다.
본 발명의 추가 구현예에 따르면, 항체의 기능적 단편은 바람직하게는 scFv, 단일 도메인 항체, Fv, VHH 항체, 디아바디, 탠덤 디아바디, Fab, Fab' 또는 F(ab)2일 수 있다. 이러한 형식은 일반적으로 2개의 하위 부류, 즉 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 하위 부류와 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 하위 부류로 나눌 수 있다. 전자의 하위 부류의 구성원은 scFv(폴리펩티드 링커를 통해 단일 폴리펩티드 사슬로 결합되는 하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 포함); VHH 항체(단일 VH 영역 포함)와 같은 단일 도메인 항체(단일 항체 가변 영역 포함)를 포함한다. 후자의 하위 부류의 구성원은 Fv(서로 비공유 결합된 별개의 폴리펩티드 사슬로서 하나의 VH 영역 및 하나의 VL 영역을 포함); 디아바디(2개의 비공유적 결합된 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각은 2개의 항체 가변 영역 - 일반적으로 폴리펩티드 사슬당 하나의 VH와 하나의 VL - 을 포함하고, 2개의 폴리펩티드 사슬은 2가 항체 분자가 생성되도록 헤드-투-테일 형태로 배열됨); 탠덤 디아바디(2개의 상이한 특이성의 4개의 공유 결합된 면역글로불린 가변 - VH 및 VL - 영역을 포함하는 이중특이성 단일 사슬 Fv 항체, 상기 기재된 디아바디보다 2배 더 큰 동종이량체를 형성함); Fab (그 자체가 VL 영역 및 전체 경쇄 불변 영역을 포함하는, 전체 항체 경쇄를 하나의 폴리펩티드 사슬로서 포함하고, 또 다른 폴리펩티드 사슬로서 완전한 VH 영역을 포함하는 항체 중쇄의 일부 및 중쇄 불변 영역의 일부를 포함하고, 상기 2개의 폴리펩티드 사슬은 사슬간 이황화 결합을 통해 분자간 연결됨); Fab’(항체 중쇄에 포함된 추가의 감소된 이황화 결합을 제외하고 상기 Fab로서); 및 F(ab)2 (2개의 Fab' 분자를 포함하며, 각각의 Fab' 분자는 사슬간 이황화 결합을 통해 각각의 다른 Fab' 분자에 연결됨)을 포함한다. 일반적으로, 상기 기재된 유형의 기능적 항체 단편은 예를 들어 당면한 특정 긴급 상황에 대한 치료 투여에 바람직한 항체의 약동학적 특성을 맞춤화하는 데 큰 유연성을 허용한다. 예를 들어, 혈관화가 잘 되지 않는 것으로 알려진 조직(예를 들어, 관절)을 치료할 때 조직 침투 정도를 높이기 위해 투여되는 항체의 크기를 줄이는 것이 바람직할 수 있다. 어떤 상황에서는, 치료용 항체가 신체에서 제거되는 속도를 증가시키는 것이 또한 바람직할 수 있으며, 상기 속도는 일반적으로 투여되는 항체의 크기를 줄임으로써 가속화될 수 있다. 항체 단편은 단편이 예를 들어 모 항체의 에피토프/표적에 대한 특이적 결합 특성을 유지하는 한, 예를 들어, CD33, EGFR, IGF1R 또는 CD20, 또는 항체 결합 시 내재화하는 능력을 가진 다른 세포 표면 구조 a를 표적으로 하는 항체에 특이적으로 결합하는 한, 본 발명의 맥락에서 기능성 항체 단편으로 정의된다.
본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체는 CL 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체는 CHI 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체는 CH2 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체는 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체는 전체 경쇄를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체는 전체 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 1가 단일특이성; 다가 단일특이성, 특히 2가 단일특이성; 또는 다가 다중특이성, 특히 2가 이중특이성 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 상기 기재된 바와 같은 완전 인간 IgG와 같은 다가 단일특이성, 특히 2가 단일특이성 항체는 이러한 항체에 의해 수행되는 중화가 결합활성 효과에 의해, 즉 동일한 항체, 여기서는 예를 들어 CD33, EGFR, IGF1R 또는 CD20에 의해 동일한 항원의 분자의 다수의 분자에 대한 결합에 의해 강화된다는 치료적 이점을 가져올 수 있다. 항체 단편의 여러 1가 단일특이성 형태가 상기에 기재되어 있다(예를 들어, scFv, Fv, VHH 또는 단일 도메인 항체).
항체 또는 이의 기능적 단편은 예를 들어 유기 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 및/또는 폴리비닐 피롤리돈("PVP")의 하나 이상의 분자로 유도체화될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이러한 유도체화는 항체 또는 이의 기능적 단편의 약동학적 특성을 조절하는데 유리할 수 있다. 특히 바람직한 것은 PEG-말레이미드로 유도체화된 PEG 분자이며, 이는 시스테인 아미노산의 설프히드릴 기를 통해 부위 특이적 방식으로 항체 또는 이의 기능적 단편과 접합할 수 있게 한다. 이들 중에서 특히 바람직한 것은 분지쇄 또는 직쇄 형태의 20kD 및/또는 40kD PEG-말레이미드이다. 후자를 하나 이상의 PEG 분자, 특히 PEG-말레이미드에 커플링함으로써 더 작은 인간 항체 단편, 예컨대 scFv 단편의 유효 분자량을 증가시키는 것이 특히 유리할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서, 나머지 사슬(들)은 다른 종에서 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인, "키메라" 항체(면역글로불린), 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을, 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 포함한다(미국 특허 번호 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984)]). 본 명세서의 관심 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등) 및 인간 불변 영역 서열로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열을 포함하는 "원시적(primitized)" 항체를 포함한다.
비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소한의 서열을 포함하는 대부분의 인간 서열의 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역(또한 CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 가진 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "인간화 항체"는 또한 수용자 항체나 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 인간화 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 자세한 내용은 문헌[Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
바람직한 항체는 바람직하게는 수용체-의존적 방식으로 내재화되는 세포 표면 분자, 바람직하게는 세포 표면 도메인에 결합하는 항체, 예를 들어 항-CD33 항체, 항-EGFR 항체, 항-IGF1R 항체 또는 항-CD20 항체이다. 바람직한 항체는 세툭시맙, 젬투주맙, 식수투무맙, 테프로투무맙, GR11L 및 리툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 세포 표면 도메인에 결합하고 수용체-의존적 방식으로 내재화되는 추가의 항체는 LU 92353 A에 개시되어 있으며, 이는 참조로 포함된다.
바람직한 항체는 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 VH 도메인 및 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: 서열 GFSLTNYG (서열 번호 1)을 갖는 CDR-H1, 서열 IWSGGNT (서열 번호 2)을 갖는 CDR-H2, 서열 ARALTYYDYEFAY (서열 번호 3)을 갖는 CDR-H3, 서열 QSIGTN (서열 번호 4)을 갖는 CDR-L1, 서열 YAS를 갖는 CDR-L2, 및 서열 QQNNNWPTT (서열 번호 5)을 갖는 CDR-L3. 바람직한 항체는 서열 번호 6에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 7에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 바람직한 항체는 서열 번호 8에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 9에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
바람직한 항체는 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 VH 도메인 및 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: 서열 GYTITDSN (서열 번호 10)을 갖는 CDR-H1, 서열 IYPYNGGT (서열 번호 11)을 갖는 CDR-H2, 서열 VNGNPWLAY (서열 번호 12)을 갖는 CDR-H3, 서열 ESLDNYGIRF (서열 번호 13)을 갖는 CDR-L1, 서열 AAS를 갖는 CDR-L2, 및 서열 QQTKEVPWS (서열 번호 14)을 갖는 CDR-L3. 바람직한 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 바람직한 항체는 서열 번호 17에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 바람직한 항체는 서열 번호 65에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 18에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
바람직한 항체는 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 VH 도메인 및 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: 서열 GGTFSSYAIS (서열 번호 19)을 갖는 CDR-H1, 서열 GIIPIFGTANYAQKFQ (서열 번호 20)을 갖는 CDR-H2, 서열 APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV (서열 번호 21)을 갖는 CDR-H3, 서열 QGDSLRSYYAT (서열 번호 22)을 갖는 CDR-L1, 서열 GENKRPS (서열 번호 23)을 갖는 CDR-L2, 및 서열 KSRDGSGQHLV (서열 번호 24)을 갖는 CDR-L3. 바람직한 항체는 서열 번호 25에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 26에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 바람직한 항체는 서열 번호 27에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 28에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
바람직한 항체는 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 VH 도메인 및 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: 서열 GFTFSSYG (서열 번호 29)을 포함하는 CDR-H1, 서열 IWFDGSST (서열 번호 30)을 포함하는 CDR-H2, 서열 ARELGRRYFDL (서열 번호 31)을 포함하는 CDR-H3, 서열 QSVSSY (서열 번호 32)을 포함하는 CDR-L1, 서열 IWFDGSST (서열 번호 33)을 포함하는 CDR-L2 및 서열 QQRSKWPPWT (서열 번호 34)을 포함하는 CDR-L3. 바람직한 항체는 서열 번호 35에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 36에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 바람직한 항체는 서열 번호 37에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 38에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
바람직한 항체는 하기 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 VH 도메인 및 하기 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다: 서열 GYTFTSYN (서열 번호 39)을 갖는 CDR-H1, 서열 IYPGNGDT (서열 번호 40)을 갖는 CDR-H2, 서열 CARSTYYGGDWYFNV (서열 번호 41)을 갖는 CDR-H3, 서열 SSVSYI (서열 번호 42)을 갖는 CDR-L1, 서열 ATS을 갖는 CDR-L2, 및 서열 QQWTSNPPT (서열 번호 43)을 갖는 CDR-L3. 바람직한 항체는 서열 번호 44에 제시된 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 45에 제시된 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 바람직한 항체는 서열 번호 46에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 47에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "세포 표면 도메인"은 세포 표면 상의 임의의 단백질을 의미한다. 세포 표면 도메인은 또한 세포 표면 항원을 포함한다. 이는 세포의 세포 표면에서 인식될 수 있는 임의의 에피토프를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 에피토프 또는 단백질은 특정 세포 유형에만 존재하므로 세포 유형 특이적이다. 일 구현예에서, 세포 표면 도메인은 암 세포 상에 존재한다. 잠재적인 세포 표면 표적에는 CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD56, CD64, CD70, CD74, CD79, CD105, CD138, CD 174, CD205, CD227, CD326, CD340, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, ED-B, TMEFF2, EphB2, EphA2, FAP Av, 인테그린, Mesothelin, EGFR, TAG-72, GD2, CAIX 및/또는 5T4를 포함한다. 다른 잠재적인 세포 표면 도메인은 CD52, CD3, CD117, CD99, CD34, CD44, CD117, CA15-3, CA-125, CA27-29, EpCAM, 암배아 항원, T 세포 1(MARTI)에 의해 인식되는 흑색종 항원, 영양막 당단백질(TPBG)을 포함한다. 본 발명에 따른 세포 표면 분자는 바람직하게는 음전하의 분자에 의한 치료적 처리에 민감한 세포에서 발현되는 것이다.
바람직하게는 이러한 세포 표면 도메인은 CD33, EGFR, IGF1R, CD20이다. 세포 표면 도메인은 또한 본 발명에 따른 항체가 결합할 수 있는 에피토프를 제공할 수 있다.
상기와 일치하여, 용어 "에피토프"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체에 의해 특이적으로 결합/확인되는 항원 결정자를 정의한다. 항체는 표적 구조에 고유한 구조적 또는 연속적 에피토프에 특이적으로 결합/상호작용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 암 관련 항원에 대해 특이적이다. 본 명세서에서 사용되는 "암 관련 항원" 또는 "종양 관련 항원"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 암 또는 종양 세포와 관련된, 즉 정상 세포와 비교하여 동일하거나 더 큰 정도로 발생하는 임의의 항원을 지칭한다.이러한 항원은 상대적으로 종양 특이적일 수 있으며 악성 세포 표면에서의 발현은 제한적이지만 비악성 세포에서도 발견될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 암 관련 항원에 결합한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내재화"는 단백질과 같은 분자가 세포막에 의해 사로잡혀 세포 내로 끌어당겨지는 세포내섭취를 의미한다. 특히, 결합 도메인이 결합하는 세포 표면 도메인이 내재화된다. 이 내재화를 측정할 수 있는 방법은 본 출원의 실시예에 개시되어 있다. 그렇지 않으면, 예를 들어 이러한 과정은 관심 수용체와 세포막이 이중으로 염색되는 시간 경과 현미경으로 관찰할 수 있다. 바람직하게는, 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 나노입자는 세포 표면 분자에 결합시 내재화된다.
본 명세서에 사용된 "제2 접합체(B)"는 본 명세서에 개시된 항체, 본 명세서에 개시된 양전하의 폴리펩티드 및 바람직하게는 본 명세서에 개시된 이작용성 링커를 포함하거나 바람직하게는 이로 이루어진 접합체를 지칭한다. 여기서, 양전하의 폴리펩티드와 항체는 바람직하게는 이작용성 링커를 통해 상호 연결된다.
용어 "음전하의 분자"는 생리학적 pH 또는 그 근처에서(예를 들어, 4 내지 10, 5 내지 9, 또는 6 내지 8의 pH를 갖는 용액에서) 순 양전하를 갖는 분자를 지칭하며, 이는 바람직하게는 정전기적 상호작용을 통해 프로타민 또는 히스톤과 같은 양전하의 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직한 음전하의 분자는 핵산 및 음전하의 소분자이다. 바람직하게는, 이러한 음전하의 분자는 적어도 2-, 바람직하게는 적어도 3-, 바람직하게는 적어도 4-, 바람직하게는 적어도 5-, 바람직하게는 적어도 6-, 바람직하게는 적어도 7-, 바람직하게는 적어도 8-, 바람직하게는 적어도 9-, 또는 바람직하게는 적어도 10- 의 순 전하를 갖는다.
본 명세서에서 "뉴클레오티드 서열(들)", "폴리뉴클레오티드(들)", "핵산(들)", "핵산 분자"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 모든 길이의 중합체성 비분지 형태의 둘의 조합을 지칭한다. 핵산 서열은 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, 예를 들어 mRNA, siRNA, 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함하는 합성 형태 및 혼합 중합체, 또는 비-천연 또는 유도체 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다. 추가로, 이러한 핵산의 비제한적 예는 mRNA의 분해 또는 번역 정지, tRNA 및 rRNA 기능의 억제 또는 후생적 효과에 의한 메시지(mRNA)의 유전자 녹다운을 포함하는, 유전자 중단 및/또는 유전자 녹다운을 수행하는, 단일 가닥이든 이중 가닥이든 상관없이, 임의의 유형의 RNA 간섭(RNAi); 짧은(또는 작은) 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 엔도리보뉴클레아제-준비 siRNA (esiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA 및 비암호화 RNA 등, DNA에 대한 짧은 RNA 활성, 및 다이서-기질 siRNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 핵산은 siRNA, esiRNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 miRNA이며, siRNA가 가장 바람직하다. 일부 구현예에서, 바람직하게는 핵산이 이중 가닥인 경우, 핵산은 약 18 내지 약 25 bp를 갖는다. 일부 구현예에서, 바람직하게는 핵산이 단일 가닥인 경우, 핵산은 약 18 내지 약 25 nt를 갖는다.
본 발명에 의해 이용되는 핵산은 표적 세포에 영향을 미친다. 예를 들어 핵산 분자의 제공을 통해 특정 분자 또는 단백질의 발현이 표적 세포에서 감소되거나 증가된다. 바람직하게는, 특정 분자 단백질의 발현은 핵산 분자의 이용에 의해 감소된다.
본 발명에 따른 핵산은 암과 관련되거나 암의 발달 및/또는 진행에 관여하는 유전자 또는 단백질의 발현을 표적화하고 억제하거나 차단하도록 설계된 siRNA 분자를 포함한다.
바람직한 핵산 분자는 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 또는 FLT3에 특이적인 siRNA, esiRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 miRNA로부터 선택된다. 더욱 더 바람직한 것은 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 또는 FLT3에 특이적인 siRNA이다. 이러한 siRNA는 당업자에게 공지되어 있고 이러한 siRNA에 대한 예시적인 예는 하기 표에 제시되어 있다.
본 발명의 바람직한 핵산은 또한 하나 이상의 표적, 바람직하게는 하나의 표적에 대해 지향되는 상이한 siRNA의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 및 FLT3로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 대해 특이적인 siRNA의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 음전하의 분자는 또한 핵산이 아닌 분자일 수 있다. 그러한 분자는 소분자, 또는 바람직하게는 유기 소분자일 수 있다. 음전하의 분자는 약 20 kDa 이하, 바람직하게는 약 15 kDa 이하, 또는 약 10 kDa 이하의 분자량을 가질 수 있다. 음전하의 분자는 또한 약 9 kDa 이하, 약 8 kDa 이하, 약 7 kDa 이하, 약 6 kDa 이하, 약 5 kDa 이하, 약 4 kDa 이하, 약 3 kDa 이하, 또는 약 2kDa 이하의 분자량을 가질 수 있다. 예시적인 예로서, 음전하의 분자는 약물 및/또는 전구약물일 수 있다. 약물 및/또는 전구약물은 음전하의 모이어티와 접합될 수 있다. 예를 들어, 약물은 음전하의 모이어티, 예를 들어 Cy 3.5 또는 Alexa488에 접합된 이브루티닙일 수 있다. 그러나 약물은 음전하의 다른 모이어티와 접합될 수도 있다. 접합에 적합한 음전하의 모이어티는 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 음전하의 모이어티의 예시적인 예는 (폴리)설폰화 아릴(예를 들어 전이 금속에 대한 공동-리간드로서), (폴리)설폰화 염료(예를 들어 개 염료), 모노/디/트리포스페이트, 단당류 또는 분지형 올리고당류의 (폴리)설페이트, 글루탐산 또는 아스파르트산의 올리고펩티드를 포함한다. 약물 및/또는 전구약물은 임의의 추가 부분에 접합되지 않고 음의 순 전하를 가질 수 있다. 예시적인 예로서, 음의 순 전하를 갖는 약물은 렘데시비르 트리포스페이트이다. 당업자는 전술한 예가 단지 예시를 위한 것이며 많은 다른 음전하의 분자가 본 발명의 맥락 내에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "이브루티닙"(TUPAC 명칭: 1-[(3R)-3-[4-아미노-3-(4-페녹시페닐)피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일]피페리딘- 1-일]프로프-2-엔-1-온, CAS 번호: 936563-96-1)은 (유리 형태로) 다음 구조를 갖는 분자에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "렘데시비르 트리포스페이트"(IUPAC 명칭 [[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-7-일)-5-시아노-3,4-디히드록시옥솔란-2-일]메톡시-히드록시포스포릴]포스포노 수소 인산염, CAS 번호: 1355149-45-9)는 다음 구조를 갖는 분자에 관한 것이다.
본 출원은 또한 나노입자에 관한 것이다. 이러한 나노입자는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 나노입자는 (a) 바람직하게는 본 명세서에 개시된 바와 같은 양전하의 폴리펩티드; (b) 바람직하게는 이작용성 링커를 통해 양전하의 폴리펩티드에 접합된 항체를 포함하는 제2 접합체(B); 및 (c) 바람직하게는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 음전하의 분자를 포함할 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 양전하의 폴리펩티드, 제2 접합체 및 하나 이상의 음전하의 분자(들)는 입자 내에 균질하게 분포되지 않는 것으로 여겨진다. 대신, 일부 구현예에서, 제2 접합체는 나노입자의 외부 부분에 풍부하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 음전하의 분자(들)는 나노입자의 내부 부분에 풍부하다. 일부 구현예에서, 양전하의 폴리펩티드는 나노입자의 외부 부분에 풍부하다. 일부 구현예에서, 양전하의 폴리펩티드는 나노입자의 내부 부분에 풍부하다. 따라서, 본 발명의 나노입자는 소포형 구조를 형성할 수 있으며, 여기서 제2 접합체는 외부 부분에 주로 존재하는 반면 음전하의 분자는 나노입자의 내부 부분에 풍부하거나 캡슐화된다. 이론에 얽매이지 않고, 그러한 구조는 음전하의 분자를 보호하여 안정성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 또한 적어도 일부 또는 심지어 전체 나노입자가 제2 접합체를 통해 세포에 결합시 내재화될 수 있는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 적어도 약 0.05 μm인 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 적어도 약 0.1 μm인 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 나노입자의 평균 직경은 적어도 약 0.2 μm이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 약 0.05 μm 내지 약 10 μm, 바람직하게는 약 0.1 μm 내지 약 10 μm, 바람직하게는 약 0.2 μm 내지 약 5 μm 범위의 평균 직경을 갖는다. 본 발명의 나노입자의 평균 직경은 또한 약 0.3 μm 내지 약 4 μm, 약 0.4 μm 내지 약 3 μm, 또는 약 0.5 μm 내지 약 2 μm의 범위일 수 있다. 나노입자의 평균 직경은 동적 광 산란 및 현미경 분석을 포함하여 입자 크기 결정에 적합한 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 입자 크기를 결정하는 바람직한 방법은 현미경 분석, 바람직하게는 투과광 현미경에 의한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 본 발명의 조성물에서, 조성물에 포함된 제2 접합체의 약 10% 이상이 나노입자에 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물에 포함된 제2 접합체의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상이 나노입자에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 나노입자에 포함되지 않은 제2 접합체가 본질적으로 없다.
본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 본 발명의 조성물에서, 조성물에 포함된 양전하의 폴리펩티드의 적어도 약 10%가 나노입자에 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물에 포함된 양전하의 폴리펩티드의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99%가 나노입자에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 나노입자에 포함되지 않은 양전하의 폴리펩티드가 본질적으로 없다.
본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 본 발명의 조성물에서, 조성물에 포함된 음전하의 분자의 적어도 약 10%가 나노입자에 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조성물에 포함된 음전하의 분자의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99%가 나노입자에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 나노입자에 포함되지 않은 음전하의 분자가 본질적으로 없다.
용어 "약학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 약학적 조성물 또는 제형은 일반적으로 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이고 따라서 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료적 사용을 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 통상, 약학적 조성물은 운반체, 안정화제 및/또는 부형제의 적합한(즉, 약학적으로 허용되는) 제형을 포함한다. 적합한 약학적 담체의 예는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 운반체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 전술한 분자의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구, 경피, 내강내, 동맥내, 척수강내 및/또는 비강내 투여를 위한 또는 조직으로의 직접 주사를 위한 조성물이다. 특히 상기 조성물은 주입 또는 주사를 통해 환자에게 투여되는 것으로 구상된다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피부내 투여에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 완충 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, 리포좀 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 기존 방법에 의해 제형화될 수 있다.
본 구현예에 따르면, 용어 "치료적 유효량"은 암과 관련된 질환의 치료에 효과적인 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자를 지칭한다. 바람직한 투여량 및 바람직한 투여 방법은 투여 후 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자가 유효 투여량으로 혈액에 존재하도록 하는 것이다. 투여 일정은 질병 상태를 관찰하고 실험실 테스트에서 표적 분자의 발현을 감소시키는 분자의 혈청 수준을 분석한 후, 투여 간격을 연장함으로써, 예를 들어 1주에 2회 또는 1주에 1회에서 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회 등으로 연장시키거나 또는 그에 상응하게 투여 간격을 줄여 조정할 수 있다. 암의 경우, 본 명세서에 개시된 분자 또는 조성물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 줄이고/줄이거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 느리게 및/또는 중단)하고/하거나; 종양 전이를 억제(즉, 느리게 및/또는 중단)하고/하거나; 종양 성장을 억제하고/하거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 경감시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 추가 약물과 함께, 즉 병용요법의 일부로서 투여되기에 적합하다. 상기 병용 요법에서, 활성제는 임의로 본 발명의 분자와 동일한 약학적 조성물에 포함될 수 있거나 별도의 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 후자의 경우, 상기 별도의 약학적 조성물은 본 발명의 분자를 포함하는 상기 약학적 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여하기에 적합하다. 추가 약물 또는 약학적 조성물은 비단백질성 화합물 또는 단백질성 화합물일 수 있다. 추가 약물이 단백질성 화합물인 경우, 단백질성 화합물이 면역 이펙터 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 것이 유리하다. 바람직하게는, 상기 단백질성 화합물 또는 비단백질성 화합물은 상기 정의된 본 발명의 분자(또는 제제), 상기 정의된 벡터, 또는 상기 정의된 숙주와 동시에 또는 비동시적으로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 적절한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 요법은 주치의와 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 어느 한 명의 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시에 투여되는 기타 약물을 포함하는 많은 요인에 따라 달라진다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 수성 운반체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액(식염수 및 완충 매체 포함)을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거액 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유액 및 영양소 보충제, 전해질 보충제(예를 들어 링거 덱스트로스에 기재한 것) 등을 포함한다. 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 방부제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린과 같은 단백질성 운반체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도된 용도에 따라 상기 기재된 분자에 더하여 추가의 생물학적 활성제를 포함할 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 작용제는 위장계에 작용하는 약물, 세포증식억제제로 작용하는 약물, 고요산혈증을 예방하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물(예: 코르티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물 및/또는 당업계에 공지된 사이토카인과 같은 작용제일 수 있다.
예를 들어 암 요법에서 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자의 효과를 분석하기 위해, 결과 측정은 예를 들어 약동학, 면역원성, 및 예를 들어 MRI 영상에 의해 암의 크기를 감소시킬 가능성 뿐만 아니라 환자가 보고한 결과로부터 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물과 같은 약물의 개발에서 또 다른 주요 과제는 약동학적 특성의 예측 가능한 조절이다. 이를 위해, 약물 후보의 약동학 프로파일, 즉 주어진 상태를 치료하는 특정 약물의 능력에 영향을 미치는 약동학 매개변수의 프로파일이 확립된다. 특정 질병 개체를 치료하기 위한 약물의 능력에 영향을 미치는 약물의 약동학 매개변수에는 반감기, 분포 용적, 간 초회 통과 대사 및 혈청 결합 정도가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 주어진 약제의 효능은 상기에서 언급한 각 매개변수에 의해 영향을 받을 수 있다. "반감기"는 투여된 약물의 50%가 생물학적 과정, 예를 들어 신진대사, 배설 등을 통해 제거되는 시간을 의미한다. "간 초회 통과 대사"는 약물이 간과 처음 접촉할 때, 즉 간을 처음 통과하는 동안 대사되는 경향을 의미한다. "분포 용적"은 신체의 다양한 구획, 예를 들어 세포내 및 세포외 공간, 조직 및 기관을 통한 약물의 보유 정도 등 및 이러한 구획 내의 약물 분포를 의미한다.
"혈청 결합 정도"는 약물의 생물학적 활성의 감소 또는 손실을 초래하는 알부민과 같은 혈청 단백질과 상호작용하고 결합하는 약물의 성향을 의미한다.
약동학적 파라미터는 또한 투여된 약물의 주어진 양에 대한 생체이용률, 지연 시간(Tlag), Tmax, 흡수율 및/또는 Cmax를 포함한다. "생체이용률"은 혈액 구획 내 약물의 양을 의미한다. "지연 시간"은 약물 투여와 혈액 또는 혈장에서의 검출 및 측정 사이의 시간 지연을 의미한다. "Tmax"는 약물의 최대 혈중 농도에 도달한 후의 시간이고, 흡수는 약물이 투여 부위에서 전신 순환계로 이동하는 것으로 정의되며, "Cmax"는 주어진 약물에서 최대로 얻어지는 혈중 농이다. 생물학적 효과에 필요한 약물의 혈액 또는 조직 농도에 도달하는 시간은 모든 매개변수의 영향을 받는다.
본 명세서에 사용된 "독성"이라는 용어는 부작용 또는 심각한 부작용으로 나타나는 약물의 독성 효과를 지칭한다. 이러한 부작용은 일반적으로 약물의 내약성 부족 및/또는 투여 후 국소 내약성 부족을 의미할 수 있다. 독성에는 약물로 인한 기형 유발 또는 발암 영향도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성"이라는 용어는 약물 투여 직후 및 장기간 약물 적용 동안 심각한 부작용을 유발하지 않고 약물을 투여하는 것을 정의한다. "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성"은 예를 들어 치료 및 추적 기간 동안 일정한 간격으로 평가된다. 측정에는 임상 평가, 예를 들어 장기 징후 및 실험실 이상 선별이 포함된다. 임상 평가가 수행될 수 있으며 NCI-CTC 및/또는 MedDRA 표준에 따라 기록/코딩된 정상 소견과 다를 수 있다. 장기 발현은 예를 들어 부작용에 대한 공통 용어 기준 v3.0(CTCAE)에 제시된 바와 같은 알레르기/면역학, 혈액/골수, 심장 부정맥, 응고 등과 같은 기준을 포함할 수 있다. 시험될 수 있는 실험실 매개변수는 예를 들어 혈액학, 임상 화학, 응고 프로파일 및 소변 분석 및 혈청, 혈장, 림프액 또는 척수액, 액체 등과 같은 다른 체액의 검사를 포함한다. 따라서 신체 검사, 영상 기술(예를 들어, 초음파, X-선, CT 스캔, 자기 공명 영상(MRI), 기술 장치(예를 들어, 심전도)를 사용한 기타 측정, 활력 징후, 실험실 매개변수 측정 및 부작용 기록에 의해 안전성을 평가할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "유효 및 무독성 투여량"은 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체의 허용 가능한 투여량을 말하며, 이는 주요 독성 효과 없이 또는 본질적으로 없이 관심 질병을 치료하거나 안정화하는 데 충분히 높은 양이다. 이러한 유효하고 무독성인 용량은 예를 들어 당업계에 기재된 용량 증량 연구에 의해 결정될 수 있으며, 심각한 유해 부작용(용량 제한 독성, DLT)을 유발하는 용량 미만이어야 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상이한 제형을 가질 수 있다. 제형(때때로 본 명세서에서 "물질의 조성물", "조성물" 또는 "용액"이라고도 함)은 바람직하게는 액체, 동결, 동결건조, 냉동건조, 분무건조 및 재구성된 제형과 같은 다양한 물리적 상태일 수 있으며, 액체 및 동결이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 "액체 제형"은 구성 분자가 그들 사이에서 자유롭게 이동하지만 실온에서 분리되는 경향이 없는 것을 특징으로 하는 액체로 발견되는 물질의 조성물을 지칭한다. 액체 제형은 수성 및 비수성 액체를 포함하며, 수성 제형이 바람직하다. 수성 제형은 용매 또는 주요 용매가 물, 바람직하게는 주사용수(WFI)인 제형이다. 제형에서 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자의 용해는 균질하거나 이질적일 수 있으며, 상기 기재된 바와 같이 균질한 것이 바람직하다.
본 발명의 제형에 안정성을 제공한다면 임의의 적합한 비수성 액체가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비수성 액체는 친수성 액체이다. 적합한 비수성 액체의 예시적인 예는 다음을 포함한다: 글리세롤; 디메틸 설폭사이드(DMSO); 폴리디메틸실록산(PMS); 에틸렌 글리콜류, 예컨대 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 200, PEG 300 및 PEG 400; 및 프로필렌 글리콜류, 예컨대 디프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜("PPG") 425 및 PPG 725.
본 명세서에서 사용된 "혼합 수성/비수성 액체 제형"은 물, 바람직하게는 WFI 및 추가 액체 조성물의 혼합물을 함유하는 액체 제형을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 경우 "제형" 또는 "조성물"은 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자(즉, 활성 약물/물질) 및 바람직하게는 액체 상태인 의약품에 필요한 추가 화학 물질 및/또는 첨가제의 혼합물이다. 본 발명의 제형은 약학적 제형을 포함한다.
제형의 제조는 활성 약물을 비롯한 상이한 화학 물질을 조합하여 약학적 조성물과 같은 최종 의약품을 생산하는 과정을 포함한다. 본 발명의 제형의 활성 약물은 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자는 본질적으로 순수하고/하거나 본질적으로 균질하게(즉, 오염 물질, 예를 들어, 제품 관련 및/또는 공정 관련 불순물일 수 있는, 단백질 등이 실질적으로 없음) 제형화될 수 있다. 용어 "본질적으로 순수한"은 적어도 약 80중량%, 바람직하게는 약 90중량%의 화합물, 바람직하게는 적어도 약 95중량%의 화합물, 보다 바람직하게는 적어도 약 97중량%의 화합물, 또는 가장 바람직하게는 약 98중량%의 화합물을 포함하는 조성물을 의미한다. 용어 "본질적으로 균질한"은 다양한 안정화제의 질량 및 용액 중의 물을 제외하고, 약 99중량% 이상의 화합물, 바람직하게는 단량체 상태의 화합물을 포함하는 조성물을 의미한다.
"안정한" 제형은 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자가 본질적으로 저장 시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지하고/하거나 바람직하게는 색상 및/또는 투명도의 육안 검사 시 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정할 때, 대조군 샘플과 비교하여 응집, 침전, 단편화, 분해 및/또는 변성의 실질적인 징후를 나타내지 않는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 추가 분석 기술이 당업계에서 이용 가능하며 예를 들어 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 문헌[Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 검토된다.
본 명세서에서 사용된 "저장 중"은 일단 제조되면 즉시 사용되지 않는 제형을 의미하고; 오히려 준비 후에 액체 형태, 동결 상태 또는 나중에 액체 형태 또는 기타 형태로 재구성하기 위한 건조 형태로 저장을 위해 포장되는 제형을 의미한다.
본 발명에 따른 "대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체이다.
"척추동물"은 척추동물 어류, 조류, 양서류, 파충류 및 포유동물을 포함한다.
"포유동물"은 개, 고양이, 말, 래트, 마우스, 유인원, 토끼, 소, 돼지, 양 및 바람직하게는 인간을 포함한다. 인간에게라는 용어는 환자라는 용어로도 지칭될 수 있다.
본 발명은 또한 치료요법에 사용하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다. 치료요법에서의 사용은 바람직하게는 대상체에서 암을 치료하는 방법에서의 사용이다.
본 발명에 의해 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 병태를 의미한다.
암은 종양 세포가 닮고 따라서 종양의 기원으로 추정되는 세포 유형에 따라 분류된다. 이러한 유형에는 암종, 육종, 혈액암, 생식 세포 종양 및 아세포종이 포함된다.
본 명세서에서 언급되는 "암종"은 상피 세포로부터 유래된 암을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 "육종"은 중간엽(결합 조직) 기원의 세포로부터 발생하는 암을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 "혈액암"은 골수를 떠나 각각 림프절 및 혈액에서 성숙되는 경향이 있는 조혈(혈액 형성) 세포로부터 발생하는 암 부류를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 백혈병을 언급할 때, 혈류에서 정상적으로 성숙하는 골수-유래 세포가 포함될 수 있다. 본 명세서에서 림프종을 언급할 때, 림프계에서 정상적으로 성숙하는 골수-유래 세포가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 "생식 세포 종양"은, 대부분은 고환 또는 난소에 존재하는, 다능성 세포로부터 유래된 암을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "아세포종"은 미성숙 "전구체" 세포 또는 배아 조직으로부터 유래된 암을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자 또는 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자는 암 치료 방법에 사용될 수 있으며, 여기서 암은 비소세포폐암과 같은 폐암, 횡문근육종 또는 유잉 육종과 같은 육종, 결장직장암, 혈액암, 예컨대 백혈병 또는 림프종, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBLC)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 암과 같은 질환 또는 장애의 진행을 완화, 감소, 안정화 또는 억제하는 것을 의미한다.
본 발명은 대상체에서 종양 성장을 억제 및/또는 조절하는 방법에 사용되는, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 나노입자 또는 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
"종양" 또는 "신생물"은 세포의 비정상적인 성장 또는 분열의 결과로서 조직의 비정상적인 덩어리이다. 신생물 세포의 성장은 그 주변의 정상 조직의 성장을 초과하고 조화를 이루지 못한다. 그러나, 본 발명의 의미에서의 종양은 또한 백혈병 및 상피내 암종을 포함한다. 종양은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있다. 바람직한 구현예에서 종양은 전악성 또는 악성이다. 가장 바람직하게는 종양은 악성이다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 종양 부위에 전달하기 위한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 (약학적) 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 사용을 위한 본 발명의 약학적 조성물은 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 및 FLT3 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 siRNA를 포함한다. 본 발명의 siRNA는 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 또는 FLT3을 표적화할 수 있다. 바람직하게는 siRNA는 세포의 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 또는 FLT3의 발현을 감소시킨다. 바람직하게는 이러한 표적의 발현이 감소될 수 있다.
"siRNA 표적화"는 특정 siRNA에 의해 인식되는 표적을 의미한다. siRNA는 다양한 방식으로 구성될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 mRNA를 표적으로 할 수 있다.
일반적으로, siRNA의 설계는 숙련된 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Reynolds et al., (Reynolds et al., (2004) “Rational siRNA design for RNA interference” Nature Biotechnology 22, 326 -330)] 또는 문헌[Judge et al., (Judge et al., 2006) “Design of Noninflammatory Synthetic siRNA Mediating Potent Gene Silencing in Vivo" Molecular Therapy (2006) 13, 494-505)] 또는 문헌[Sioud and Leirdal (Sioud and Leirdal (2004) “Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs” Methods Mol Biol. 2004;252:457-69)]을 참조한다.
용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특정 유전자 또는 특정 유전자 또는 특정 유전자 작제물의 전사를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특히 구조적 RNA(rRNA, tRNA) 또는 mRNA로의 유전자 또는 유전자들 또는 유전적 작제물의 전사를 의미하며, 이들은 단백질로 후속 번역되거나 되지 않는 것이다. 이 과정에는 DNA의 전사 및 생성된 mRNA 생성물의 처리가 포함된다. 그 다음 mRNA는 펩티드/폴리펩티드 사슬로 번역되고 궁극적으로 최종 펩티드/폴리펩티드/단백질로 접힌다. 단백질 발현은 일반적으로 특정 세포 또는 조직에서 하나 이상의 단백질의 존재 및 풍부도를 측정하기 위해 단백질체학 연구자에 의해 사용된다. 세포 단백질의 발현은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯 분석을 사용한다. 여기서, 얻어진 결과는 건강한 세포 또는 대조군 표준과 비교하여 평가되어야 한다. 더 낮은 발현 세포는 예를 들어 대조군 세포와 비교할 때 강도가 감소되는 염색을 나타낸다. 더 높은 발현 세포는 예를 들어 동일한 설정에서 대조 세포와 비교할 때 강도가 증가되는 염색을 나타낸다. 또한, mRNA의 발현은 예를 들어 RT-PCR로 측정될 수 있다. 여기서, 더 낮은 발현 세포는 예를 들어 동일한 설정에서 대조 세포와 비교할 때 검출 가능한 신호를 명백히 하기 위해 더 많은 수의 증폭 주기를 나타낸다. 당업자는 세포의 단백질, mRNA의 발현을 결정하는 방법과 같은 상이한 기술을 알고 있다.
예를 들어, 세포는 대상체의 혈액, 간, 위, 입, 피부, 폐, 림프계, 비장, 방광, 췌장, 골수, 뇌, 신장, 창자, 담낭, 뇌, 후두 또는 인두에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따라 사용되며, 여기서 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 하나 이상의 커플링 완충제/시약 및 프로토콜을 포함하는 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 키트는 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 하나 이상의 커플링 완충제/시약 및 프로토콜을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 완충제/시약 및 프로토콜 및 선택적으로 예를 들어 본 발명의 분자 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 분자 및/또는 상기 분자를 세척하는 수단 및/또는 상기 분자를 저장하는 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 따라서 상기 분자 및 추가 수단은 바람직하게는 하나의 밀봉 패키지 또는 키트에 함께 포장된다.
본 발명은 또한 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 나노입자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 및/또는 선택적으로 상기 분자를 정제 또는 풍부화하기 위한 수단 및/또는 상기 분자를 세척하기 위한 수단 및/또는 상기 분자를 저장하는 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 따라서 상기 분자 및 추가 수단은 바람직하게는 하나의 밀봉 패키지 또는 키트에 함께 포장된다.
본 발명의 키트의 부품(또는 "부품의 키트")은 바이알 또는 병에 개별적으로 또는 용기 또는 다중 용기 유닛에 조합하여 포장될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게는 당업자에게 공지된 표준 절차를 따른다.
본 발명의 키트는 선택적으로 라벨이 있는 하나 이상의 용기(들)를 포함할 수 있다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있으며 바람직하게는 멸균된다. 용기는 활성 성분을 갖거나 본 발명의 방법에 효과적인 완충제를 포함하는 조성물을 보유한다. 추가 용기는 특정 반응이 일어나도록 하는 적절한 완충제(예: 반응 완충제)를 보유할 수 있다. 또한 다양한 완충제, 예를 들어 반응 완충제 및/또는 본 발명의 분자 및/또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자 등의 정제를 위한 완충제를 보유하는 용기가 포함되는 것으로 생각된다. 조성물 내의 활성제는 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분자 또는 본 발명의 분자 또는 본 발명의 약학적 조성물이다.
키트는 또한 본 발명의 방법 및 용도에 따라 본 발명의 방법을 수행하기 위한 서면 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트는 내용물이 본 발명에 따른 나노입자의 증가를 위해 및/또는 본 발명의 상기 나노입자를 위해 사용될 수 있음을 나타내는 라벨 또는 임프린트를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 예를 들어 완충제, 바이알, 대조군(들), 안정제(들), 당업자가 본 발명의 나노입자의 제조 또는 사용을 돕는 서면 설명서를 추가로 포함하는 것으로 생각된다.
또한, 본 발명은 대상체에서의 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 약학적 조성물의 치료요법에서, 바람직하게는 암 치료에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
용어 "투여"는 본 발명의 전술한 나노입자의 치료적 또는 진단적 유효 용량을 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 다양한 투여 경로가 가능하며 상기에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 약제, 예를 들어, 암 치료에 효과적인 약제의 제조를 위한, 본 발명의 나노입자 또는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 나노입자 또는 본 발명의 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 상세한 설명 및 청구범위를 포함하여 본 문서에서 사용된 다음 용어는 아래에 주어진 정의를 갖는다.
당업자는 단지 반복 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되도록 의도된다.
본 명세서에서 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형을 포함함을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약들 중 하나 이상을 포함하고 "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재된 방법에 대해 수정되거나 대체될 수 있는 당업자에게 공지된 등가의 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 오는 "적어도"라는 용어는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 전부 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 그러나 여기에는 구체적인 숫자도 포함되며, 예를 들어 약 20은 20을 포함한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", 및 "포함하는" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹이지만 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹은 제외되지 않는다. 본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어는 "함유하는" 또는 "포함하는"이라는 용어로 대체될 수 있으며, 때때로 "갖는"이라는 용어로 본 명세서에서 사용되는 경우도 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "이루어지는"은 청구 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용될 때 "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서의 각 경우에서 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"이라는 용어는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 임의의 이러한 대체는 본 개시에 의해 고려된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 제한되지 않으며 그 자체가 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 권리범위를 한정하려는 의도가 아니다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 인용된 모든 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등 포함)는 이로써 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 범위 내에서 명세서는 그러한 자료를 대체한다.
본 발명은 하기 항목에 의해 추가로 예시된다:
항목 1. 나노입자의 제조 방법으로서, c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계; 및 d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 2. 항목 1에 있어서, 방법은 단계 c) 이전에, a) 양전하를 띤 폴리펩티드를 이작용성 링커와 접합시키는 단계; b) 접합되지 않은 이작용성 링커를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 항체는 단계 c) 이전에 정제되는, 방법.
항목 4. 선행 항목들 중 어느 하나에 있어서, 방법은 나노입자의 회수를 추가로 포함하는, 방법.
항목 5. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서 제1 접합체가 항체에 비해 몰 과량인, 방법.
항목 6. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 양전하의 폴리펩티드는 제2 접합체(B)에 비해 몰 과량인, 방법.
항목 7. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 음전하의 분자는 제2 접합체(B)에 비해 몰 과량인, 방법.
항목 8. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 음전하의 분자는 양전하의 폴리펩티드에 비해 몰 과량인, 방법.
항목 9. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서 제1 접합체(A)와 항체 사이의 몰비는 적어도 약 10:1인, 방법.
항목 10. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서 제1 접합체(A)와 항체 사이의 몰비는 약 10:1 내지 약 50:1인, 방법.
항목 11. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체(B) 사이의 몰비는 적어도 약 10:1인, 방법.
항목 12. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체(B) 사이의 몰비는 약 10:1 내지 약 50:1인, 방법.
항목 13. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 음전하의 분자와 제2 접합체 사이의 몰비는 적어도 약 1:1인, 방법.
항목 14. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 나노입자는 단계 d)에서 자기 조립에 의해 형성되는, 방법.
항목 15. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)는 약 4℃ 내지 37℃에서 인큐베이션하는 것을 포함하는, 방법.
항목 16. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)는 적어도 약 1시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 방법.
항목 17. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 양전하의 폴리펩티드와 항체는 제2 접합체에서 이작용성 링커를 통해 상호연결되는, 방법.
항목 18. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 방법.
항목 19. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 세포 표면 분자에 특이적인, 방법.
항목 20. 항목 19에 있어서, 세포 표면 분자는 항체의 결합 시 내재화될 수 있는, 방법.
항목 21. 항목 19 또는 항목 20에 있어서, 세포 표면 분자는 음전하의 분자에 의한 치료적 처리에 민감한 세포 상에서 발현되는, 방법.
항목 22. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 암 관련 항원에 특이적인, 방법.
항목 23. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 CD33, EGFR, IGF1R 또는 CD20에 특이적인, 방법.
항목 24. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 젬투주맙, 세툭시맙, 식수투무맙, 테프로투무맙, GR11L, 리툭시맙인, 방법.
항목 25. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 갖는, 방법: a. CDR-H1 : GFSLTNYG (서열 번호 1), CDR-H2: IWSGGNT (서열 번호 2), CDR-H3: ARALTYYDYEFAY (서열 번호 3), CDR-L1 : QSIGTN (서열 번호 4), CDR-L2: YAS, 및 CDR-L3: QQNNNWPTT (서열 번호 5); b. CDR-H1 : GYTITDSN (서열 번호 10), CDR-H2: IYPYNGGT (서열 번호 11), CDR-H3: VNGNPWLAY (서열 번호 12), CDR-L1 : ESLDNYGIRF (서열 번호 13), CDR-L2: AAS, 및 CDR-L3: QQTKEVPWS (서열 번호 14); c. CDR-H1 : GGTFSSYAIS (서열 번호 19), CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQ (서열 번호 20), CDR-H3: APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV (서열 번호 21), CDR-LI : QGDSLRSYYAT (서열 번호 22), CDR-L2: GENKRPS (서열 번호 23), 및 CDR-L3: KSRDGSGQHLV (서열 번호 24); d. CDR-H1 : GFTFSSYG (서열 번호 29), CDR-H2: IWFDGSST (서열 번호 30), CDR-H3: ARELGRRYFDL (서열 번호 31), CDR-L1 : QSVSSY (서열 번호 32), CDR-L2: IWFDGSST (서열 번호 33), 및 CDR-L3: QQRSKWPPWT (서열 번호 34); 및 e. CDR-H1 : GYTFTSYN (서열 번호 39), CDR-H2: IYPGNGDT (서열 번호 40), CDR-H3: CARSTYYGGDWYFNV (서열 번호 41), CDR-L1 : SSVSYI (서열 번호 42), CDR-L2: ATS, 및 CDR-L3: QQWTSNPPT (서열 번호 43).
항목 26. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열을 갖는 방법: a. 서열 번호 6 및 7; b. 서열 번호 15 및 16; c. 서열 번호 25 및 26; d. 서열 번호 35 및 36; 및 e. 서열 번호 44 및 45.
항목 27. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 방법: a. 서열 번호 8 및 9; b. 서열 번호 17 및 18; c. 서열 번호 27 및 28; d. 서열 번호 37 및 38; e. 서열 번호 46 및 47; 및 f. 서열 번호 65 및 18.
항목 28. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 핵산인, 방법.
항목 29. 항목 28에 있어서, 핵산은 이중 가닥 핵산인, 방법.
항목 30. 항목 28에 있어서, 핵산은 단일 가닥 핵산인, 방법.
항목 31. 항목 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 약 18 내지 약 25 bp를 갖는, 방법.
항목 32. 항목 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 약 18 내지 약 25 nt를 갖는, 방법.
항목 33. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 DNA 또는 RNA인, 방법.
항목 34. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 siRNA, esiRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 miRNA인, 방법.
항목 35. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 또는 FLT3에 특이적인 siRNA인, 방법.
항목 36. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 바람직하게는 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 및 FLT3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적에 특이적인 siRNA의 혼합물인, 방법.
항목 37. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 약 20 kDa 이하의 분자량을 갖는, 방법.
항목 38. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 적어도 2-의 전하를 갖는, 방법.
항목 39. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 양전하의 폴리펩티드는 프로타민 또는 히스톤인, 방법.
항목 40. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 이작용성 링커는 이종이작용성 링커인, 방법.
항목 41. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 이작용성 링커는 설포-SMCC인, 방법.
항목 42. 선행 항목 중 어느 하나의 방법에 의해 수득가능한 나노입자.
항목 43. a) 양전하의 폴리펩티드; b) 양전하의 폴리펩티드에 접합된 항체를 포함하는 제2 접합체(B); 및 c) 하나 이상의 음전하의 분자(들)을 포함하는 나노입자.
항목 44. 항목 42 또는 43에 있어서, 양전하의 폴리펩티드는 나노입자의 외부 및/또는 내부 부분에 풍부한, 나노입자.
항목 45. 항목 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 제2 접합체는 나노입자의 외부 부분에 풍부한, 나노입자.
항목 46. 항목 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 음전하의 분자는 나노입자의 내부 부분에 풍부한, 나노입자.
항목 47. 항목 42 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 평균 직경이 약 0.05 μm 내지 약 10 μm인, 나노입자.
항목 48. 항목 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 양전하의 폴리펩티드와 항체는 제2 접합체에서 이작용성 링커를 통해 상호연결된, 나노입자.
항목 49. 항목 42 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 나노입자.
항목 50. 항목 42 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 항체는 세포 표면 분자에 특이적인, 나노입자.
항목 51. 항목 50에 있어서, 세포 표면 분자는 항체의 결합 시 내재화될 수 있는, 방법.
항목 52. 항목 50 또는 51에 있어서, 세포 표면 분자는 음전하의 분자에 의한 치료적 처리에 민감한 세포 상에서 발현되는, 나노입자.
항목 53. 항목 42 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 항체는 암 관련 항원에 특이적인, 나노입자.
항목 54. 항목 42 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 항체는 CD33, EGFR, IGF1R 또는 CD20에 특이적인, 나노입자.
항목 55. 항목 42 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 항체는 젬투주맙, 세툭시맙, 식수투무맙, 테프로투무맙, GR11L, 리툭시맙인, 나노입자.
항목 56. 항목 42 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 갖는, 나노입자: a. CDR-H1 : GFSLTNYG (서열 번호 1), CDR-H2: IWSGGNT (서열 번호 2), CDR-H3: ARALTYYDYEFAY (서열 번호 3), CDR-L1 : QSIGTN (서열 번호 4), CDR-L2: YAS, 및 CDR-L3: QQNNNWPTT (서열 번호 5); b. CDR-H1: GYTITDSN (서열 번호 10), CDR-H2: IYPYNGGT (서열 번호 11), CDR-H3: VNGNPWLAY (서열 번호 12), CDR-L1 : ESLDNYGIRF (서열 번호 13), CDR-L2: AAS, 및 CDR-L3: QQTKEVPWS (서열 번호 14); c. CDR-H1: GGTFSSYAIS (서열 번호 19), CDR-H2: GIIPIFGTANYAQKFQ (서열 번호 20), CDR-H3: APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV (서열 번호 21), CDR-L1 : QGDSLRSYYAT (서열 번호 22), CDR-L2: GENKRPS (서열 번호 23), 및 CDR-L3: KSRDGSGQHLV (서열 번호 24); d. CDR-H1: GFTFSSYG (서열 번호 29), CDR-H2: IWFDGSST (서열 번호 30), CDR-H3: ARELGRRYFDL (서열 번호 31), CDR-L1 : QSVSSY (서열 번호 32), CDR-L2: IWFDGSST (서열 번호 33), 및 CDR-L3: QQRSKWPPWT (서열 번호 34); 및 e. CDR-H1 : GYTFTSYN (서열 번호 39), CDR-H2: IYPGNGDT (서열 번호 40), CDR-H3: CARSTYYGGDWYFNV (서열 번호 41), CDR-L1 : SSVSYI (서열 번호 42), CDR-L2: ATS, 및 CDR-L3: QQWTSNPPT (서열 번호 43).
항목 57. 항목 42 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및 VL 서열을 갖는, 나노입자: a. 서열 번호 6 및 7; b. 서열 번호 15 및 16; c. 서열 번호 25 및 26; d. 서열 번호 35 및 36; 및 e. 서열 번호 44 및 45.
항목 58. 항목 42 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는, 나노입자: a. 서열 번호 8 및 9; b. 서열 번호 17 및 18; c. 서열 번호 27 및 28; d. 서열 번호 37 및 38; e. 서열 번호 46 및 47; 및 f. 서열 번호 65 및 18.
항목 59. 항목 42 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 핵산인, 나노입자.
항목 60. 항목 42 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 이중 가닥 핵산인, 나노입자.
항목 61. 항목 42 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 단일 가닥 핵산인, 나노입자.
항목 62. 항목 42 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 약 18 내지 약 25 bp를 갖는, 나노입자.
항목 63. 항목 42 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 핵산은 약 18 내지 약 25 nt를 갖는, 나노입자.
항목 64. 항목 42 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 DNA 또는 RNA인, 나노입자.
항목 65. 항목 42 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 siRNA, esiRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 miRNA인, 나노입자.
항목 66. 항목 42 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 또는 FLT3에 특이적인 siRNA인, 나노입자.
항목 67. 항목 42 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 바람직하게는 KRAS, BRAF, PIK3CA, PAX3-FKHR, EWS-FLI1, c-MYC, TP53, DNMT3A, IDH1, NPM1, 및 FLT3로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적에 대해 특이적인 siRNA의 혼합물인, 나노입자.
항목 68. 항목 42 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 약 20 kDa 이하의 분자량을 갖는, 나노입자.
항목 69. 항목 42 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 음전하의 분자는 적어도 2-의 전하를 갖는, 나노입자.
항목 70. 항목 42 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 양전하의 폴리펩티드는 프로타민 또는 히스톤인, 나노입자.
항목 71. 항목 42 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 이작용성 링커는 이종이작용성 링커인, 나노입자.
항목 72. 항목 42 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 이작용성 링커는 설포-SMCC인, 나노입자.
항목 73. 항목 42 내지 72 중 어느 하나의 나노입자를 포함하는 조성물.
항목 74. 항목 73에 있어서, 약제학적 조성물인 조성물.
항목 75. 치료요법에 사용하기 위한, 항목 42 내지 72 중 어느 하나의 나노입자 또는 항목 73 또는 74의 조성물.
항목 76. 항목 75에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한 나노입자 또는 조성물.
항목 77. 항목 75에 있어서, 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 나노입자 또는 조성물.
항목 78. 항목 75에 있어서, 폐암, 육종, 결장직장암, 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한 나노입자 또는 조성물.
항목 79. 항목 42 내지 72 중 어느 하나의 나노입자 또는 항목 73 또는 74의 조성물을 포함하는 키트.
항목 80. 항목 1 내지 41 중 어느 하나의 방법 또는 항목 42 내지 72 중 어느 하나의 나노입자로서, 음전하의 분자는 약물 및/또는 전구약물, 예컨대 렘데시비르 트리포스페이트인, 방법 또는 나노입자.
항목 81. 항목 1 내지 41 중 어느 하나의 방법 또는 항목 42 내지 72 중 어느 하나의 나노입자로서, 음전하의 분자는 Cy 3.5 또는 Alexa488과 같은 음의 순 전하를 갖는 모이어티에 접합된, 이브루티닙과 같은 약물 및/또는 전구약물인, 방법 또는 나노입자.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예는 예시의 목적으로 포함되며 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예 1: 접합 프로토콜의 변형
Baumer, N. et al., 2016; Baumer, N. et al., 2018; Baumer, S. et al., 2015 에 공개된 바와 같이 선택된 운반체 항체, 설포-SMCC 및 프로타민 간의 화학적 접합을 수행하는 동안, SDS-PAGE 전기영동에서 의도하지 않은 특성을 가진 생성된 접합체 생성에 당황했다: 예를 들어, DTT, DTE, 베타-머캅토-에탄올 또는 TCEP와 같은 환원제에 의해 더 이상 환원될 수 없는 것으로 입증된 IgG 접합체 현상을 자주 관찰했다(도 1, A 및 B, 설명을 위해 겔 a 참조). 다음으로, 의도한 것보다 훨씬 더 높은 분자량을 나타내는 접합체를 관찰했으며, 이는 서로 가교결합된 IgG의 이량체 또는 다량체를 나타내고, 일부는 추가 프로타민이 있고 일부는 없었다(도 1, C, 설명을 위해 겔 B 참조). 극단적인 경우, 이러한 모든 부반응의 복잡성으로 인해 생성된 접합체의 구름 같은 모양이 나타나며, 이는 아마도 도 1B에서 이러한 모든 접합체 a-d의 혼합물에 의해 야기됐을 것이다.
역으로, 의도된 접합체는 도 1에서 C로 표시된 제형이었고, 이 분자는 추가적인 내부 가교 조작은 없지만, 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 에 가교된 프로타민의 매니폴드를 갖는, 천연 이황화 결합 내부- 및 외부 펩티드 HC 및 LC를 유지한다.
그 결과, 설포-SMCC에 의한 프로타민 펩티드의 아미노-말단 활성화 후에 추가적인 정제 단계를 도입함으로써 접합 프로토콜을 변형하였다. 생성된 생성물을 겔 크로마토그래피로 정제하여, 여전히 활성인 과잉 유리체 설포-SMCC로부터 활성화된 SMCC-프로타민을 분리하였다. 이 단계부터, 항체 접합은 잔여 가교제의 오염 없이 순수 SMCC-프로타민의 균질 용액에 의해 수행되었다(도 2).
그 결과, 다음 실시예에 나타낸 모든 실험은 "새로운" SMCC 고갈 프로토콜에 따라 수행되었다. 생성된 복합체는 전기 영동 균질성과 관련하여 엄청나게 개선되어 성능 및 기능적 유효성을 목표로 한다.
따라서, 여기에 제시된 모든 발견은 Baumer, N. et al., 2016; Baumer, N. et al., 2018; Baumer, S. et al., 2015 에 공개된 제형이 아닌 새로운 제조 공정에 의해 합성된 치료제를 이용해 수행되었다.
실시예 2: 미공개 변형된 접합 프로토콜을 사용한 비소세포폐암에서의 종양유전자 불활성화
다음으로, 세툭시맙-프로타민으로 EGFR-발현 비소세포폐암 세포주(NSCLC)를 표적화했다. 여기서, 세툭시맙-프로타민은 세툭시맙-프로타민 1 몰당 8 몰의 siRNA에 결합할 수 있었고(도 3 A, B) 초기 엔도좀에 수용체 의존적 방식으로 siRNA를 전달했다(도 3 C). KRAS는 KRAS에 대한 siRNA와 복합체를 형성한 항-EGFR-mAB-프로타민으로 처리한 후 생체내-처리된 NSCLC 세포주에서 효과적으로 침묵되었다(도 3 D). 세툭시맙-민감성 A549 세포에서 대조군 siRNA가 로딩된 접합된 세툭시맙은 CD1 누드 마우스에서 세포 성장, 콜로니 형성, 종양 성장 및 종양 무게에 작은 영향을 미쳤으며, 이는 NSCLC 환자에서 세툭시맙을 사용한 무작위 임상 시험과 일치한다. 그러나 이 효과는 KRAS siRNA의 사용에 의해 크게 증폭되었다(도 3 E 및 F(오른쪽 패널) 참조). 세툭시맙-내성 SK-LU1 세포는 세툭시맙-대조군 siRNA에 훨씬 더 잘 견뎠지만 여기서도 KRAS siRNA에 의해 콜로니 및 종양 성장이 크게 억제되었다(도 3 E 및 F, 왼쪽 패널).
다음으로, 냉동 절편(A549 종양) 및 파라핀 절편(SK-LU-1 종양)에 대한 면역형광에서 증식 마커 Ki67 발현에 대한 NSCLC 이종이식 종양의 전신 항-EGFR-mAB-siRNA 처리의 효과를 조사했다. PBS 또는 항-EGFR-mAB-대조군-siRNA 처리된 A549(도 4 A-D) 및 SK-LU-1 종양(도 4 G-J)에서, Ki67 염색은 각각의 종양 세포의 Hoechst-염색된 핵 사이에 널리 퍼졌다. 반대로, 항-EGFR-mAB-KRAS-siRNA로 처리된 종양은 Ki67 염색을 나타내는 훨씬 적은 증식성 세포를 나타냈다(도 4 E-F 및 2 K-L).
전신 항-EGFR-mAB-siRNA 적용에 의한 종양 성장 지연은 종양 조직의 감소된 증식뿐만 아니라 증가된 세포자멸에 의해 유도될 수 있다. 더욱이, 세포자멸의 유도는 물론 종양 크기를 능동적으로 감소시킬 수 있는 잠재적인 암 치료제의 바람직한 효과이다. 본 발명자는 세포자멸의 징후로 핵에서 DNA 단편화를 드러내는 생체 외 각 종양 조직의 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 염색에 의해 세포자멸 세포의 풍부함을 조사하는 것을 목표로 했다. 과산화효소-염색 전개 후, 대조군 처리된 종양 섹션은 PBS 처리(도 5 A-B)와 비교하여 항-EGFR-mAB-대조군 siRNA로 처리된 A549 종양(도 5 C-D)에서 TUNEL-양성 핵의 더블링을 나타내었고, 운반체에 KRAS siRNA가 포함된 경우 추가 더블링을 나타냈다(설명을 위해 도 5 E-F 및 통계를 위해 도 5 M). 세포자멸 신호에 의해, PBS(도 5 G-H) 및 항-EGFR-mAB-대조군 siRNA(도 5 I-J)로 처리된 SK-LU1 종양은 구별할 수 없었지만, KRAS-siRNA가 항체 운반체에 접합되고 이종이식 종양에 적용된 경우(도 5 K-L 및 도 5 N) TUNEL 양성 핵의 수가 4배 증가하였다.
종합하면, 항-EGFR-mAB-KRAS siRNA를 사용한 치료에 의한 종양 크기의 현저하고 상당한 감소는 각각의 종양에서 감소된 증식 및 증가된 세포자멸사의 조합에 의해 설명될 수 있다.
또한, EGFR이 육종에서도 표면 발현된다는 사실을 이용한다((Herrmann et al., 2010) 및 다음 장 참조). 세툭시맙이 육종에서의 첫 번째 임상 시험에서 단일 제제로서 효과가 없었다는 관찰(Ha et al., 2013)은 본 발명의 시스템이 활성 항암제로서가 아니라 종양유전자-특이적 이펙터 siRNA를 운반하는 셔틀 시스템의 구성성분으로서 항체에 의존하기 때문에 우리의 목적과 관련이 없다.
실시예 3: 횡문근육종에서 종양유전자 표적화
횡문근육종(RMS)은 미성숙 근육모세포에서 기원하고 주로 어린이와 젊은 성인에서 발생하는 공격적인 연조직 육종이다. 소아 RMS는 조직학적 모양에 따라 두 가지 주요 범주로 나뉜다: 약 2/3는 예후가 더 좋은 배아 RMS(ERMS)를 나타내고, 1/3은 보다 공격적인 폐포 RMS(ARMS)를 나타낸다(Stevens, 2005). 지금까지 ERMS에서 11p15의 이형접합성 손실 축적을 제외한 진단적 가치가 있는 일반적인 유전적 병변은 발견되지 않았다(Chen et al., 2013). ARMS의 중요한 동인을 표적으로 삼는 것이 치료 효과를 가질 가능성이 더 크다. 폐포 횡문근육종(ARMS)을 특징짓는 유전적 병변은 t(1;13) 또는 t(2;13)의 염색체 전좌에 의한 PAX3-FKHR 또는 PAX7-FKHR 융합이다. 따라서 PAX-FKHR 융합 유전자 및 그 전사체의 표적화는 악성 성장을 억제하고 ARMS 세포의 세포자멸을 유도하는 구체적이고 효과적인 수단이 될 수 있다. 발암성 융합 단백질 또는 돌연변이 단백질의 억제는 어려운 것으로 밝혀졌다. 단백질이 "약물 투여 불가(undruggable)"로 명시되었거나 약물 치료로 인해 단백질의 내성 버전이 선택되었고 보다 공격적인 재발이 발생했다(Verdine and Walensky, 2007).
RNAi에 의한 융합 단백질의 하향조절은 발현이 mRNA 수준에서 억제되기 때문에 이러한 문제를 극복하도록 의도된다. 구체적으로, RMS 세포에서 RNAi에 의한 PAX3-FKHR 융합 단백질 발현의 하향조절은 악성 표현형에 직접적인 영향을 미쳤다. PAX3 또는 PAX3-FKHR에 대한 siRNA에 의해 PAX3-FKHR 융합을 침묵시키면 RMS 세포주의 증식, 이동성 및 콜로니 형성이 감소한다(Kikuchi et al., 2008; Liu, L. et al., 2012). 따라서, 생체내에서 확립된 항체-프로타민 운반체 시스템에 의해 안정적이고 특이적인 방법으로 종양 세포로 운반되는 RNAi에 의한 ARMS 특이적 융합 단백질의 효과적인 하향조절이 치료 효과로 이어지기를 희망했다.
RMS에서, IGF1R 및 상피 성장 인자 수용체(EGFR)는 본 발명의 모듈 운반체에 대한 후보 표적이다. 우리의 기술은 두 가지 독립적인 특성에 의해 종양 세포를 다른 세포와 구별할 수 있게 하여 특이성의 이중 계층을 제공한다: a) 세포 표면 수용체 장식 및 b) 세포 발암 장비. 우리와 다른 사람들(Herrmann et al., 2010)은 다른 폐포(및 배아) RMS 세포주에서 EGFR 및 IGF1R 고밀도 표면 발현을 확인했다. 두 세포 표면 수용체 모두 본 발명의 시스템의 표적 성분으로 작용할 수 있다.
RMS 세포주에서 본 발명의 항체 작제물의 표적화 효율을 확인하기 위해, 항-EGFR 항체(세툭시맙)-siRNA 복합체로 ERMS EGFR+ 세포주 RD를 처리하였고 항-IGF1R-siRNA로 ARMS IGF1R+ 세포주 RH-30을 처리했다(도 6). 두 세포주 모두 IGF1R 및 EGFR을 다양한 수준으로 발현하며(도 6 A), 가장 높은 발현에 따르면, RD 세포는 항-EGFR-Alexa488-siRNA를 우선적으로 내재화하는 반면(도 6 B 및 C, 상단 패널), RH-30 세포는 우선적으로 항-IGF1R-Alexa488 siRNA 복합체를 내재화한다(도 6 B, 하단 패널). Alexa488-siRNA는 세툭시맙-프로타민에 의해 모든 EGFR+ RD 세포의 최대 90%까지 내재화될 수 있었던 반면(도 6 C, 중간 패널), 항-IGF1R 항체는 IGF1R+ RH-30 세포에서 덜 효과적으로 수행했다(도 6 B, 하단 패널).
RMS-전형적인 PAX3 -Forkhead 융합 종양유전자의 특이적 표적화에 대한 원리 증명 실험을 수행하기 위해, PAX3-FKHR의 중단점 영역(도 7 D)에 걸친 다양한 siRNA를 설계하고 ARMS RH-30 세포를 콜로니 형성 분석에서 세툭시맙-프로타민에 결합된 중단점 스패닝 siRNA로 처리했다. 중단점 siRNA는 대조군과 비교하여 RH-30에서 콜로니 형성을 유의하게 감소시킨 반면(도 7 E), ERMS 유형 세포 RD 콜로니 형성은 cMyc siRNA와 결합된 NRAS의 수송에 의해 손상되었으며(도 7 A 및 B), 두 표적 유전자는 잘 알려진 ERMS의 종양유전자를 대표한다. 결과적으로, NRAS의 종양유전자 발현은 RD 세포에서 항-EGFR/NRAS siRNA로 처리한 후 웨스턴 블롯에서 감소하였다(가운데 줄 도 7 C).
이들 결과는 종양유전자 불활성화를 유도하기 위해 선택한 핵산을 특이적으로 수송하는 RMS 종양의 수용체 장식에 따라, 적어도 2개의 상이한 단클론 항체를 갖는 본 발명의 모듈식 항체-siRNA 시스템을 사용하여 RMS 세포주를 표적화할 수 있음을 예시한다.
실시예 4: 유잉 육종에서 종양유전자 표적화
유잉 육종은 어린이 및 젊은 성인의 뼈 종양이다. 전이 단계에서 장기간 완전 관해율이 35% 미만이므로 더 나은 치료 옵션에 대한 높은 요구가 존재한다(Paulussen et al., 1998; Paulussen et al., 2008). 중심 유전적 사건은 이들 종양 세포에서 융합 단백질 EWS-FLI1의 형성을 초래하는 염색체 전좌 t(11;22)의 발생이다(Arvand and Denny, 2001). 유잉 육종 세포는 표면에 많은 양의 IGF1R을 발현한다. 따라서 본 발명자는 클론 ImcA12(식수투무맙) 또는 테프로투무맙과 같은 항-IGF1R-항체를 EWS-FLI1 중단점-특이적 siRNA를 수송하기 위한 SMCC-프로타민 접합체로서 사용하는 본 발명의 모듈식 요법을 적용하려고 했다. 원리 증명으로, 상업용 항-IGF1R 쥐 항체 GR11L(Merck)을 사용하여 유잉 세포의 표적화를 나타냈다. 이 결과는 (Baumer, N. et al., 2016)에 공개되었으며 도 8에 나와 있다.
이 치료 옵션을 사용할 수 있도록, CHO-S 세포에서 두 가지 다른 IGF1R-항체를 클로닝 및 발현하였으며 HPLC를 사용하여 정제했다. 이들은 클론 식수투무맙(여기서는 "A12"라고 함) 및 테프로투무맙(여기서는 "Tepro"라고 함)이었다. 둘 모두 충분한 양으로 생산되었고 SMCC-프로타민에 결합되었고(도 9 A), 둘 모두 siRNA를 결합하여(도 9 B) siRNA를 IGF1R-양성 세포 SKNM-C로 수송한다(도 9 C).
세포를 EWS-FLI1에 대한 siRNA와 복합체로 된 이들 IGF1R-mAB-프로타민 접합체와 함께 인큐베이션하고 반고체 소프트-한천에 시딩한 경우, 콜로니 형성이 상당히 감소되었다(도 10 A 및 B).
따라서 본 발명자들은 본 발명의 모듈 시스템이 특히 EWS-FLI1-siRNA와 같은 융합 단백질 특이적 siRNA의 녹다운을 위해 항-IGF1R 항체 및 육종 세포의 사용에 적용될 수 있다고 결론지었다.
실시예 5: 림프종 모델에서 종양유전자 표적화
미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)은 빈번한 림프종 아형을 나타낸다. DLBCL 세포는 표면에 CD20을 발현한다. 영향을 받은 환자에 대한 표준 1차 요법은 화학요법과 항-CD20 항체 리툭시맙의 조합이다. 리툭시맙은 CD20 분자를 결합 및 차단하여 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 유발한다. 이 방법으로 약 65%의 환자를 치료할 수 있다. 1차 치료에 반응하지 않거나 초기 반응 후 재발한 환자는 생존율이 극도로 낮은 특징이 있어 새로운 치료 방법이 시급히 필요함을 나타낸다. 따라서, 본 발명자는 유전적으로 꽤 다양한 림프종 세포에서 확인된 다양한 종양유전자에 대한 siRNA를 갖는 세포 표적 항체로서 1차 약물 리툭시맙을 결합하는 것을 목표로 했다(도 15).
먼저 CD20-항체 리툭시맙을 다양한 비율의 SMCC-프로타민과 화학적으로 커플링하여 siRNA에 결합하는 각 복합체의 유효성을 비교했다(도 13). 흥미롭게도, 80 또는 120 mol의 결합되지 않은 SMCC-프로타민의 높은 과량에도 불구하고, siRNA의 결합은 1 mol 항체를 40 mol SMCC-프로타민과 커플링하는 것과 거의 동일했다(도 13). 따라서 본 발명자는 최소량의 SMCC-프로타민이 충분하다고 결론을 내렸고 항체:SMCC-프로타민의 일상적인 비율인 1:32로 되돌아갔다(도 14). 본 발명자는 이전에 수행한 것처럼 먼저 siRNA로 리툭시맙프로타민의 결합 능력을 확인했고, 다른 운반체 항체에서 발견되는 것과 같이 siRNA와 운반체 시스템의 유사한 배위(약 8 mol/mol)를 관찰했다(도 14 B).
이어서, 상이한 DLBCL 세포주들을 CD20 및 CD33의 표면 발현에 대해 양성으로 시험하였다(도 15, 상부 패널). 결과적으로, 내재화 연구는 항-CD20 mAB 리툭시맙 및 항-CD33-mAB 젬투주맙에 의해 수행되었다.
DLBCL 세포주는 항체-매개 siRNA 녹다운에 의해 B-세포 수용체-축 분자 스크린에 적용되어 BTK 외에 추가 표적 분자를 발생시켰는 데(도 15), 이는 특히 항-CD33-항체-siRNA 표적화를 사용하는 HBL1 세포에서 현저한 콜로니 성장 억제를 초래하는 것이다(도 15, 하부 패널).
실시예 6: siRNA와 다른 화학 구조를 갖는 운반체 항체-프로타민과 저분자량 다가음이온성 약물에 의해 형성된 복합체
또 다른 프로젝트에서, 본 발명자는 리툭시맙 또는 젬투주맙과 같은 치료용 단클론 항체가 저분자량(lmw) 약물을 위한 운반체 분자로 활용될 수 있다는 가설을 세웠다. 키나아제 억제제 그룹과 같은 여러 lmw 약물의 약동학 및 안전성이 비표적 형태보다 표적 운반체에 의해 개선될 수 있기 때문에 이 전략은 임상에서 중요할 것이다. 따라서, 본 발명자는 이러한 항체-억제제 접합체를 사용하는 경우 i) 항체가 의도한 표적 세포에서 억제제를 풍부하게 하는 데 도움을 주기 때문에 더 낮은 용량으로 적용될 수 있고 ii) 항체가 의도하지 않은 독성 반응을 유발할 수 있는 의도하지 않은 세포에 의해 억제제가 흡수되는 것을 억제한다는 가설을 세웠다.
첫 번째 실험 세트에서, 본 발명자는 여기서 Small Molecule 1(SM-1)로 지칭되는 공지된 증식 억제제의 유도체인 4- 의 전하를 갖는 음전하의 소분자를 합성하였다. 따라서, 본 발명자는 음전하를 첨가하고 적색 형광(여기서는 "SM-1/RF"라고 함)을 방출함으로써 하전되지 않은 소분자 억제제를 강한 음이온성 화합물로 전환시켰으며, 이는 정전기력에 의해 본 발명의 프로타민 기반 운반체 시스템에 결합하여 항체-억제제-접합체를 형성할 수 있도록 하였다.
적색 형광 염료의 강한 다가음이온 전하 외에, 접합체는 적색 형광의 형태로 시험관내 및 생체내에서 쉽게 추적할 수 있다는 이점을 가졌다.
이어서, SM-1/RF와 리툭시맙(CD20)-프로타민 및 신뢰할 수 있는 세툭시맙(EGFR)-프로타민의 두 운반체 시스템 사이의 결합에 대해 동일한 실험을 수행하였다. 두 운반체 모두 SM-1/RF의 강력한 공동 조립을 보였고, siRNA(대략 13 kDa)에 비해 낮은 분자량으로 인해, 운반체 mAB 1몰당 100 mol SM-1/RF를 초과하는, 극도로 높은 mol/mol 비율의 정전기 포화를 보였다(도 17).
아임계 20배 과량의 SM-1/RF가 로딩된 상응하는 접합체 리툭시맙- 및 세툭시맙-프로타민을 CD20 및 EGFR-발현 세포주와 함께 인큐베이션하고 SM-1/RF의 세포내 농축에 대해 분석하였다. 두 경우 모두 전형적인 적색 형광 여기/방출 파장 조합에서 형광 신호의 세포내 농축이 문서화될 수 있다(도 18). 따라서 변형된 SM-1/RF 화합물은 세포에 의해 내재화되고 결과적으로 작용할 수 있다.
실시예 7: 효과적인 항체-프로타민-siRNA 제형의 놀라운 특징
사용된 모든 항체의 정확한 접합 절차는 두 단계로 나눌 수 있다: 먼저, 설포-SMCC에 대한 프로타민의 아미노-말단 접합, 이어서 과량의 접합 가교제를 제거하기 위한 크기 배제 공정, 및 둘째, 활성화된 프로타민-SMCC의 IgG 골격에 대한 시스테인-지향 접합. 생성된 생체접합체는 SDS-PAGE 전기영동에서 볼 수 있듯이 IgG의 중쇄 및 경쇄 모두에서 상당한 분자량 이동을 나타낸다. IgG의 약 60 내지 80%가 프로타민-태그를 포함하도록 전환되었으며, 과량의 프로타민의 잔류량이 항상 눈에 띄었다.
EGFR-mAB 세툭시맙-프로타민 접합체에 대해 도 19a에 나타낸 바와 같이, 단백질 G 상호작용 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로부터 결합되지 않은 프로타민을 고갈시켰다. 프로타민-접합 항체는 단백질 G 매트릭스에 결합되었고, 결합되지 않은 프로타민은 일찍 용출되었고 이후 프로타민이 없는 정제된 IgG-프로타민 복합체가 뒤따랐다(분획 29 내지 31 참조). 놀랍게도, 이 물질은 프로타민-접합되었지만 고전적인 밴드-이동 분석에서는 siRNA에 결합할 수 없었고(도 19 B의 오른쪽 절반 참조), 반면 정제되지 않은 mAB-프로타민 복합체는 일반적인 1:16 몰비로 siRNA에 결합했다.
프로타민-함유 및 프로타민-고갈된 제제의 유효성을 추가로 조사하기 위해, EGFR-발현 및 KRAS-의존성 A549 및 SK-LU1 NSCLC 세포주를 KRAS-siRNA 및 대조군-siRNA를 수송하는 두 제제로 처리하였다. 유리 프로타민을 함유하는 제제만이(도 19 A 및 B,“32배 SMCC-프로타민과 커플링된 항-EGFR-mAB”참조) KRAS-siRNA를 갖는 세포주의 콜로니 성장을 효과적으로 감소시켰는데, 이는 종양유전자 중독에 대해 예상되었던 바와 같았다(도 20 A 및 B).
본 발명자는 AML의 실험적 치료에 사용한 항-CD33 mAB 젬투주맙에 대해 정확히 동일한 정제 절차를 수행했으며 동일한 효과를 관찰했다: HPLC에 의해 고갈된 결합되지 않은 프로타민을 갖는 접합체 제제는 원하는 양으로 siRNA에 결합하지 않은 반면(도 21 B, 하부 패널), 정제되지 않은 것은 정확히 결합하였다(도 21 B, 상부 패널).
또한, 정제되지 않은 물질과 대조적으로, 결합되지 않은 SMCC-프로타민이 없는 운반체는 콜로니 형성 검정에서 OCI-AML2 세포에 대한 항-DNMT3A-siRNA의 남아있는 억제 효능이 없었다(도 21 C). 이러한 관찰은 운반체 시스템의 이전 분자 조립 가설(도 3A)과 양립되지 않았으며 일반적으로 우리의 이전 가설에 대항적이었다.
이러한 어리둥절하고 예상치 못한 관찰에 대한 설명을 찾기 위해 여러 실험을 수행했다.
도 19의 결과를 고려하여, 본 발명자는 CD20-mAB-프로타민-SM-1/RF-프로타민 부가물에서 결합되지 않은 SMCC-프로타민의 존재가 siRNA 부가물에서만큼 중요할 수 있다는 가설을 세워서, 이전과 같이 친화성 크로마토그래피에 의해 리툭시맙-CD20 mAB 제제로부터 프로타민을 고갈시켰다. 가정된 바와 같이, 고갈된 제제(도 22 A, 분획 25)는 SMCC-프로타민 함유 제제(도 22 B, 오른쪽)와 동일한 정도로 다가음이온성 SM-1/RF에 결합 및 조정될 수 없었다(도 22 B, 왼쪽).
항-IGF1R 단클론 AB IMCA-12 접합체를 사용하여 동일한 결과를 얻었다(도 23). SMCC-프로타민 고갈된 항체-프로타민 접합체는 siRNA에 정전기적으로 결합할 수 없었다.
도 24에서, 본 발명자는 SKNM-C 유잉 육종 세포에서 종양유전자-불활성화 siRNA를 효과적으로 전달하는 SMCC-프로타민 고갈된 A12 운반체 항체(도 23)의 능력을 시험하였다. 효과적인 siRNA가 로딩된 고갈되지 않은 A12-SMCC-프로타민은 콜로니 성장을 감소시켰지만, 고갈된 제제(도 23, 분획 19-21 참조)는 콜로니 성장을 감소시키지 않았다.
실시예 8: 항체-SMCC-프로타민/유리 SMCC-프로타민 복합체 내 유리 SMCC-프로타민의 역할 해석
전자의 결과에 따르면, 유리 SMCC-프로타민이 없으면 표적화가 작동하지 않는다는 것을 알게 되었다. 따라서 본 발명자는 유리 SMCC-프로타민이 복합체 내에서 어떤 역할을 하는지 알아보고 싶었다. 물론 본 발명자는 주요 기능이 유리 SMCC-프로타민에 의해 수행된다는 것을 배제해야 했다. 따라서 본 발명자는 유리 SMCC-프로타민 및 기타 음성 대조군을 사용하여 일련의 실험을 수행했다.
먼저, EWS-FLI1-전좌 산물에 의존하는 IGF1R-양성이지만 EGFR-음성인 유잉 육종 세포주 SKNM-C로 콜로니 형성 검정을 수행하였다(도 25). 양성 대조군으로서 세포를 항-EWS-FLIl(E/F)-siRNA에 접합된 항-IGF1R-mAB-프로타민 복합체로 처리하여 EWS-FLI1-전좌 산물을 억제했으며, 이는 SKNM-C 세포의 콜로니 성장을 현저하게 감소시킨다(도 25). 반대로, 유리 SMCC-프로타민을 포함하거나 포함하지 않는 운반체로서 항-EGFR-mAB-프로타민을 사용하는 항-EWS-FLI1-siRNA의 수송은 대조군 siRNA와 비교하여 감소된 콜로니 형성을 초래하지 않았는데(도 25), 이는 IGF1R-매개 표적화가 특이적이고 유리 SMCC-프로타민 때문이 아님을 나타낸다. 더욱이, 항-EGFR-항체(60 nM)와 동일한 농도의 SMCC-프로타민 단독으로도 콜로니 형성 억제를 유도할 수 없었다(도 25).
다음으로, SMCC-프로타민에 접합된 항-IGF1R 항체, 항-IGF1R-mAB-프로타민 복합체에 존재하는 것과 동일한 양의 유리 SMCC-프로타민(30배 과량의 SMCC-프로타민과 접합된 60 nM의 운반체는 ≤1800 nM의 잠재적으로 유리 SMCC-프로타민과 같음) 및 효과적인 항-EWS-FLI1-siRNA을 포함하는 규칙적인 표적화 혼합물을 SKNM-C 유잉 육종 세포에 대면시켰다(도 26 A). 표적화 항-IGF1R-mAB A12를 생략하고 완전 혼합물 및 효과적인 siRNA와 동일한 농도의 유리 SMCC-프로타민으로만 SKNM-C 세포를 처리한 경우, 대조군 scr-siRNA와 비교하여 콜로니 성장의 감소가 관찰될 수 없었다(도 26 A). 또한 AML 세포주 OCI-AML-2(도 26 B) 및 A549 NSCLC 세포(도 26 C)에서 이 전략을 시험했으며, 항상 표적화 mAB(여기서는 각각 항-CD33 또는 항-EGFR)를 생략했지만 일반적으로 효과적인 siRNA를 제공하였다. SKNM-C에서와 같이, 효과적인 siRNA가 로딩된 유리 SMCC-프로타민은 대조군 siRNA로서 어떠한 영향도 없이 남아있었다.
이는 의도한 표적 세포 표면 분자의 검출을 위해 정확한 항체가 필요하지만, 치료 효능을 위해 siRNA를 효과적으로 결합하여 복합체를 형성하고 이를 발암성 분자에 표적화하기 위해서는 두 가지 추가 전제 조건이 충족되어야 한다는 추정에 이르게 한다: a) 표적화 항체에 접합된 프로타민 및 b) 혼합물에 존재하는 충분한 잔여량의 결합되지 않은 SMCC-프로타민. 항체 결합 운반체가 없는 유리 SMCC-프로타민은 이러한 요구 사항을 충족할 수 없었다.
대답해야 할 다음 질문은 연구에서 관찰된 모든 시험관내 및 생체내 효능 결과를 모순 없이 설명할 수 있는 본 발명의 운반체 시스템의 변형된 어셈블리 구조가 무엇인지라는 것이다.
실시예 9: 안정한 나노입자를 형성하는 예상치 못한 정전 매크로구조의 검출 및 가시화
세포내 항체-프로타민-siRNA 복합체는 도 27에 도시된 바와 같이 상응하는 세포 표면 수용체 또는 분자가 발현되는 경우, 처리된 세포 배양 샘플에서 쉽게 확인된다: 여기서, 결합된 siRNA가 있는 세툭시맙(항-EGFR)-SMCC-프로타민은 EGFR 발현 NSCLC 세포내로 내재화되고 내부적으로 초기 엔도좀(흰색 점, 왼쪽 패널)으로 진행되지만, 리소좀(회색 점, 중간 패널)으로 진행되지 않는다.
실시예 10: 표적 세포에서 유리 SMCC-프로타민 없는 항체-프로타민-siRNA 복합체 또는 유리 SMCC-프로타민-siRNA 단독의 내재화 없음
흥미롭게도, 접합 프로토콜로부터의 잔여 SMCC-프로타민이 혼합물에 남아 있는 경우(도 28, 오른쪽), 전형적인 내재화된 소포 구조가관찰되었지만, 프로타민-SMCC가 친화성 크로마토그래피에 의해 고갈된 경우에는 관찰되지 않았다(도 28, 왼쪽, 크로마토그래피 결과는 도 19 참조). 따라서 시각적으로도 결합되지 않은 프로타민-SMCC의 존재는 접합체의 효율성에 있어 중요하다.
HPLC를 통해 유리 SMCC-프로타민이 고갈된 대응물과 비교하여 다른 항체-SMCC-프로타민 복합체로 그리고 유리 SMCC-프로타민으로도 이것을 수행하였다: 유리 SMCC-프로타민이 없는 항체-프로타민-siRNA 복합체나 유리 SMCC-프로타민 단독이나 어떠한 세포주에서도 내재화가 관찰될 수 없었다(도 29, 도 30 및 도 31).
실시예 11: 항체-프로타민-siRNA 복합체에 의한 시험관내 소포 구조의 형성
음성 대조군 실험을 수행할 때마다, 즉 EGF 수용체를 발현하지 않는 세포를 EGF 수용체를 표적화하는 효과적인 접합체로 처리할 때마다, 결과적으로 매우 낮은 세포 표적화 효율이 관찰되었지만(도 32 B), 세포 외부의 형광 미셀 구조의 축적에 흥미를 느꼈다. 아마도 처리된 디쉬 표면의 매트릭스와 같은 구조에 부착되었을 이러한 축적물은, 접합체를 결합하고 내부화하기 위한 세포 상에서 발견된 표적이 없는 경우에만 보였다. 또한 이러한 축적물은 모두 비슷한 크기였고 1개의 IgG와 여러 개의 프로타민과 8개의 부착된 siRNA의 단량체를 설명할 수 있는 대략 10 내지 20 nm보다 훨씬 컸어야 했는데, 왜냐하면 이 크기는 대략 방출 파장의 절반 정도의 해상도를 갖는 형광 현미경에서 입자로 감지할 수 없기 때문에 200 nm보다 큰 입자 크기를 불러일으키기 때문이다.
따라서, 3개의 성분인 1. 세툭시맙-SMCC-프로타민, 2. siRNA 및 3. 결합되지 않은 SMCC-프로타민이 활성에 필요한 일종의 안정한 매크로구조를 형성한다고 가정하였다. IgG-프로타민-siRNA의 효율을 담당하는 이러한 매크로구조의 존재를 확인하기 위해, 용액 내 입자에 의해 야기된 광 확산을 연관시키는 제타 카운터(MALVERN)에 동적 광산란(DLS)을 통한 입자 크기 검출을 적용하였다. 그 결과는 매우 흥미로웠다. 동적 과정으로, 완전히 그럴듯한 크기(IgG-프로타민-프로타민-siRNA 단량체의 경우 22 nm)를 갖는 성분은 몇 시간 후에 크기가 400 nm보다 큰 나노구조로 자발적으로 조립되고, 한편 이 과정은 프로타민이 고갈된 제제에서는 검출되지 않는다(도 33).
이 과정은 시간 의존적이고, 더 큰 구조는 특정 시간의 인큐베이션 후에만 형성된다(도 34). 2시간에서 6시간 사이의 시간 범위는 매크로구조를 형성하기에 충분하며, 이는 다시 실온에서 보호되지 않은 PBS 환경에서 24시간 후에 다시 부분적으로 분해되기 시작한다.
이러한 측정에 근거하여, 항체-프로타민/유리 SMCC-프로타민/siRNA 복합체가 세포 외부에서 형성되고 세포 환경과는 독립적이라는 가설을 세웠다. 이러한 복합체를 시각화하기 위해, 코팅된 챔버 슬라이드에서 Alexa488-siRNA를 사용하여 세포 없이 다양한 복합체 조성물을 인큐베이션하고 다음날 발생된 구조를 고정시켰다. 형광 현미경 검사에 의해 소포 구조가 3개의 성분이 서로를 찾을 때만 형성됨이 드러났다: 1. 항체-SMCC-프로타민, 2. 유리 SMCC-프로타민, 3. siRNA(도 35 참조).
유리 SMCC-프로타민이 있는 모든 항체-프로타민 복합체는 소포성 나노구조를 형성하는 반면, 유리 SMCC-프로타민이 없거나 SMCC-프로타민 단독으로는 어떠한 나노구조도 형성하지 않았다(도 36).
상세히, 나노구조는 mAB-SMCC-프로타민, 접합되지 않은 SMCC-프로타민 및 Alexa488-표지된 siRNA의 3개의 성분에 의해 형성된 마이크로미터 크기의 구형체 형상과 닮았다(도 37). 구조는 형광 현미경 및 레이저 스캔 공초점 현미경에 의해 확인된다. 회전 타원체 구조가 siRNA 화합물로부터의 Alexa488 신호로 완전히 채워져 있다는 것이 분명해졌다.
결과는 하기 표에 요약되어 있다.
실시예 12: 시험관내 소포 구조는 상이한 온도에서 발생함
또한 소포 구조의 형성이 특정 온도에 의존하는지 시험했다. 실제로 4℃, 실온(~22℃) 및 37℃에서 형성된다(도 38).
실시예 13: 항체-프로타민-siRNA 복합체에 의한 시험관내 기능성 소포 구조의 형성은 유리 SMCC-프로타민의 양에 의존함
항체에 커플링되고 복합체 내의 유리 분자로서의 SMCC-프로타민의 기능을 추가로 설명하기 위해, 항체 - 여기서는 항-EGFR-항체 세툭시맙 - 에 첨가된 SMCC-프로타민의 양을 적정하였다. 일정량의 세툭시맙을 사용하고 1:1 내지 1:100의 SMCC-프로타민의 몰비를 첨가하였다(자세한 내용은 (도 39 A) 참조). 그 다음 쿠마시-염색 SDS-PAGE에서 접합 효율을 확인하고, 항체의 경쇄(LC)와 중쇄(HC)의 커플링은 1:1 내지 1:10의 항체:SMCC-프로타민 비율을 인큐베이션할 때 차선적인 것으로 나타났음을 확인였다(도 39 B). 접합 과정은 1:32의 몰비의 항체:SMCC-프로타민에서 포화된 것으로 나타났고 1:50 및 1:100에서는 더 이상 향상되지 않았다(도 39 B).
일상적인 밴드이동 분석에 의해 이들 상이한 접합의 siRNA 결합 능력을 분석하였다(도 40 A-F). siRNA의 결합은 1:32 내지 1:100의 접합 비율에서 검출가능했고(도 40 D-F), 더 낮은 비율에서는 효율적인 siRNA 결합이 검출가능하지 않았다(도 40 A-C).
본 발명자는 이들 접합 생성물이 Alexa488-대조군-siRNA(도 40 G-L) 및 EGFR-양성 A459 세포와 함께 인큐베이션되었을 때 세포 없이 소포-구조를 형성하는 이들의 능력에 따라 상이한 접합 생성물의 특성을 추가로 분석하였다(도 40 M-R). 세툭시맙이 1:1 내지 1:10의 비율로 SMCC-프로타민과 접합되었을 때, 효율적인 무세포 소포 형성이 관찰되지 않은 반면(도 40 G-I), 1:32의 비율에서는 소포 형성이 매우 풍부했고(도 40 J), 1:50 및 1:100의 비율에서는 감소하였다(도 40 K-L). 이들 복합체의 내재화 능력은 접합 1:32에서 가장 높았고(도 40 P), 접합 1:10에서 감소하였다(도 40 O). 1:1(도 40 M), 1:3.2(도 40 N) 또는 1:50 대 1:100(도 40 Q-R)의 비율에서는 내재화가 관찰되지 않았다. 이는 1:32의 세툭시맙과 SMCC-프로타민의 최적 복합체 형성을 시사하는데, 그 이유는 이것이 가장 효율적인 접합, 세포 없는 소포 형성 및 세포로의 내재화를 유도하기 때문이다.
기능적 검정으로서, 종양유전자 KRAS의 녹다운 시 A549 세포의 콜로니 형성을 억제하기 위한 상이한 접합 생성물의 효율을 비교하였다. 또한 결합되지 않은 SMCC-프로타민 단독의 영향을 설명하기 위해, 접합된 세툭시맙이 없는 동일한 양의 유리 SMCC-프로타민과 이를 비교했다(도 40 S-X). 놀랍게도, KRAS-siRNA에 복합체화된 세툭시맙:SMCC-프로타민 1:32 접합 만이 스크램블된 대조군-siRNA와 비교하여 콜로니 형성의 현저한 감소를 야기한다(도 40 V). SMCC-프로타민 단독은 임의의 농도에서 KRAS 녹다운을 통한 콜로니 형성의 억제를 유도할 수 없다(도 40 S-X). 가장 높은 농도에서 scr-siRNA 및 KRAS-siRNA와의 복합체에서 SMCC-프로타민의 놀라운 독성만을 관찰했다(도 40 W-X).
실시예 14: 유리 SMCC-프로타민은 SMCC-프로타민-고갈된 항체-프로타민 접합체에 재첨가되어 시험관내 소포 구조를 형성할 수 있고 유리 SMCC-프로타민은 유리 프로타민으로 대체될 수 있음.
항체에 커플링된 SMCC-프로타민의 기능 및 복합체 내의 유리 분자로서의 기능을 추가로 설명하기 위해, HPLC에 의해 유리 SMCC-프로타민이 고갈된 항체-프로타민-접합체에 첨가된 SMCC-프로타민의 양을 적정하였다. 이들 항체-프로타민 접합체는 도 36 F에 도시된 바와 같이 형광 siRNA를 갖는 소포 구조를 형성할 수 없다. 따라서 유리 SMCC-프로타민을 다시 첨가하여 이 기능을 수행할 수 있는지, SMCC-프로타민을 설포-SMCC 없이 프로타민으로 대체할 수 있는지 궁금했다. 상이한 양의 유리 SMCC-프로타민 및 프로타민 단독을 항-EGFR-mAB-P에 첨가하였다(도 41). 항체와 관련하여 1x SMCC-프로타민 또는 10x SMCC-프로타민의 첨가는 소포 구조를 형성하는 데 효과적이지 않은 반면(도 41 A 및 B), 32x SMCC-프로타민의 첨가는 매우 효과적인 소포 형성을 유도한다(도 41 C). 이 검정에 따르면, 유리 SMCC-프로타민은 화학적으로 커플링된 설포-SMCC 없이 프로타민으로 대체될 수 있다(도 41 F).
실시예 15: 항체-프로타민-siRNA 및/또는 SM-1/RF 복합체에 의한 시험관내 소포 구조의 형성
이 새롭고 예상치 못한 나노구조 모델을 시험하기 위해, 구조적으로 완전히 다르지만 정전기적으로는 동일하게 하전된 분자 SM-1/RF(실시예 8 참조)를 사용하고 이를 항체-프로타민 접합체에 복합체화했다(도 42 내지 도 45).
추가 siRNA를 포함하거나 포함하지 않는 mAB-프로타민-SM-1/RF-접합체의 무세포 어셈블리 결과를 검사하는 동안, 각 나노구조의 양과 크기에서 현저한 차이를 관찰했다: siRNA 및 mAB-프로타민과 유리 SMCC-프로타민에 의해 복합체화된 SM-1/RF에 의해 조립된 것은 siRNA가 없는 것보다 상당히 더 크고 더 빈번했다(도 42 C 및 F 및 도 43 D 및 H). 안정한 나노구조를 형성하는 4개의 성분 모두로 구성된 혼합 입자의 가설로 이 현상이 설명된다. 상세한 형광 현미경 사진에서, 가장 큰 입자의 나노구조는 회전 타원체 미셀의 경계를 형성하는 siRNA로 밝혀질 수 있는 반면, SM-1/RF는 이 구의 내강을 채우고 있다(도 44 및 도 45, 배율 참조).
혼합된 항체-프로타민 입자가 mAB-프로타민에 복합체화된 SM-1/RF만을 갖는 것보다 더 빈번하고 훨씬 더 크다는 이러한 현상은 운반체 항체로서 항-CD20-mAB 리툭시맙(도 44) 및 항-EGFR-mAB 세툭시맙(도 45) 둘 모두에서 볼 수 있다.
이것은 음전하의 SM-1/RF가 항체-프로타민 복합체와 함께 작은 소포를 형성할 수 있지만(도 42 E 및 도 43 F), 선형이고 고도로 음전하의 분자인 siRNA는 항체-프로타민/유리 SMCC-프로타민 복합체 사이에서 일종의 정전기 "접착제"로서 기능할 수 있음을 의미한다. 이것은 적색 형광 SM-1/RF로 채워진 것처럼 보이는 매우 큰 소포에서 원형의 빛나는 것으로 관찰될 수 있다(도 44 및 도 45).
도 44 및 37에서 볼 수 있는 큰 미셀 구조는 위상차 조건 하에서 일반 광학 현미경 분석에서도 볼 수 있다(도 46 참조).
레이저 스캔 현미경(LSM, 도 47)에 의해 이러한 관찰을 추가로 확인하였다. 여기서, 세포 없이 형성된 소포의 공초점 분석은 녹색 형광 siRNA가 고리를 형성하고(도 47 A a-c 및 도 47 B d-f) 항-CD20-mAB-P로 형성된 것과 같은 매우 큰 소포의 경우, 이 소포는 루멘이 적색 형광 SM-1/RF로 채워진 것을 볼 수 있다(도 47 B d 및 f).
실시예 16: 제안된 모델
종합하면, 운반체-항체-프로타민과 결합되지 않은 프로타민에 의해 음이온 카고 분자를 결합시키는 원리는 siRNA-핵산 이외의 카고에도 적용될 수 있다. 여기서 카고 분자를 변형하여 다가음이온 특성을 부여하고 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 제제에 남겨 두어 반응물의 강력한 정전기 조정 및 자기 조립을 가능하게 하는 것이 중요하다.
이러한 관찰은 새롭고 예상치 못한 매크로분자 나노구조가 본 발명의 운반체 시스템의 시험관내 및 생체내 약역학적 효능에 잠재적으로 필요하고 충분한 것임을 강력하게 지지한다.
따라서, 본 발명자는 성분 1. 항체-프로타민, 2. siRNA/음이온 소분자 억제제 및 3. 결합되지 않은 (SMCC-)프로타민의 조합이 나노입자-유사 매크로구조를 형성한다고 가정하였으며, 이는 siRNA의 안정성을 담당하고 siRNA 및/또는 음이온 소분자 억제제를 의도한 세포에 효과적으로 전달할 수 있는데, 완전히 예상치 못한 관찰이다. 이 나노구조 어셈블리의 예시적이고 이상적인 모델이 도 11에 나와 있다.
결론적으로, 다가-음이온성이고 다른 구조적 유사성이 없다는 최소 공통 분모 요건을 갖는 다양한 화학적으로 상이한 이펙터 페이로드를 사용하는 실험은, 본 발명의 항체-SMCC 링커-프로타민 siRNA 운반체 및 본 발명의 항체-SM-1/RF 시스템의 시험관내 및 생체내 약동학적 특성의 기초가 되는 새롭고 예상치 못한 나노구조 모델에 대한 실험적 증거를 제공한다.
1. siRNA/음이온 소분자 수송 및 표적 세포로의 특이적 전달 및 2. 특이적 세포내 종양유전자 불활성화에 대한 이중 특이성을 갖는 이 모듈식 나노구조 시스템은 암을 비롯한 다양한 질병 그룹에 사용될 수 있다.
실시예 17: 안티센스 올리고뉴클레오티드를 항체-프로타민 접합체에 커플링
항체-프로타민 나노입자가 현재 유전자 발현을 녹다운하기 위한 대체 도구로 사용되는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 수송하는 데에도 사용될 수 있는지 확인하기 위해. 이러한 합성 안티센스 단일 가닥 올리고뉴클레오티드("ASO")는 siRNA만큼 짧으며, siRNA와 유사한 αEGFR-mAB-프로타민 접합체에 결합하는 것으로 가정된다. 따라서 본 발명자는 대조군 ASO를 사용하여 밴드 이동 분석을 수행했고 1 mol αEGFR-mAB-프로타민 접합체가 실온에서 1시간 동안 또는 37℃에서 5분 동안 인큐베이션되었을 때 적어도 8 내지 32 mol의 ASO에 결합할 수 있음을 확인했다(도 12).
실시예 18: 저분자량 다가음이온성 약물 이브루티닙-Cy3.5("RMA561")의 합성
이브루티닙은 브루톤 키나아제의 공유 결합제이다. 이브루티닙은 일부 림프종 아형에 사용되며 가용성 브루톤 키나아제의 ATP 결합 주머니에 있는 시스테인에 대한 공유 첨가에 의해 B 세포 수용체의 하류에서 신호 전달을 차단한다. 이브루티닙은 림프종 세포뿐만 아니라 정상 세포의 BTK도 표적으로 삼기 때문에 감염, 폐렴 또는 부정맥과 같은 심각한 부작용이 있을 수 있다(Wilson et al. 2015). 후자는 더 높은 용량, 관련 없는 세포에 의한 차단 및 부작용에 더해 부분적으로 BTK 이외의 표적에 대한 방관자 효과로 인한 것일 수 있다(Byrd et al. 2013). 다음으로 장기간의 이브루티닙 투여는 내성 발달로 이어질 수 있다(Lenz 2017). 여기서 본 발명자는 먼저 진보된 링커 화학을 통해 CD20을 표적으로 하고 DLBCL의 표준 요법의 일부인, 적합한 운반체 항체, 리툭시맙에 이브루티닙을 접합하려고 시도했다. 접합은 성공적이었지만, 접합체의 용해도를 변경하여 더 이상 이용할 수 없는 것으로 판명되었다.
따라서, 본 발명자는 하전되지 않은 이브루티닙을 강한 음이온성 화합물 Cy3.5-RMA561(여기서는 이브루티닙-Cy3.5로 지칭됨)로 전환시켰으며, 이는 항체-억제제-복합체를 형성하기 위해 정전기력에 의해 이를 본 발명의 프로타민 기반 운반체 시스템에 결합할 수 있게 했다. 시아닌 염료 Cy3.5는 잠재적 결합제로서 4개의 설폰산 기를 노출시킴으로써 강한 음이온 특성을 나타낸다(도 48). 본 발명의 관점에서는, 나노-운반체를 형성하기 위해 분자의 한 부위에 음이온 전하가 집중되어 있고 전체가 선형인 것이 바람직하다. 또한 시아닌 염료를 사용하면 모든 평가 단계에서 형광 판독값을 사용할 수 있다. 공개된 데이터(Kim et al. 2015; Turetsky et al. 2014)에 따르면, 상업적으로 이용가능한 피라졸로피리미딘 1을 시작으로 아미노관능화된 이브루티닙 유도체 5를 합성했으며, 피라졸로피리미딘은 이후에 요오드화되고 스즈키-커플링을 통해 이브루티닙 코어 구조의 주요 부분 2를 형성하도록 4-페닐옥시벤젠 보론산으로 대체되었다. 높은 결합 친화도에 중요한 (S)-N-Boc-3-하이드록시피페리딘은 입체제어된 MITSUNOBU 반응 형성 화합물 3을 통해 설치되었다. 피페리딘 모이어티의 탈보호 후, 표적에 대한 비가역적 결합을 위해 α,β-불포화 링커 4(MICHAEL 수용체)를 도입하였다. 생성된 Boc-보호된 아민 5는 염기성 조건 하에서 상응하는 아미드 이브루티닙-Cy3.5(Cy3.5-RMA561)를 생성하는 시아닌 염료 Cy3.5(Lumiprobe)와 같은 상이한 음이온 모이어티로 표지하기 위한 리드 구조를 나타낸다. 최종 생성물을 C18-SPE 카트리지(순도 >98%(HPLC))로 정제하고 고분해능 질량 분석법으로 확인했다.
Boc-보호된 유도체 5(8.2 mg, 0.014 mmol, 1.05 당량)를 0.5 mL 건조 디클로로메탄(분자체 4A에서 건조)에 용해시키고, 디옥산 중 염화수소 4M 용액(41 μL, 0.166 mmol, 12 당량)을 첨가하고, 5가 유리 아민으로 완전히 전환될 때까지 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다(TLC에 의한 추적: 실리카, 용매: 10% MeOH/EtOAc, 검출: UV254 및 닌히드린 염색). 반응 혼합물을 35℃로 가열하면서 진공에서 증발시켰다. 잔여 백색 고체를 0.5 mL 무수 디메틸포름아미드에 용해시키고 그 용액에 0.5 mL 무수 디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민(72 μL, 0.414 mmol, 30 당량)에 용해된 Cy3.5의 NHS 에스테르(Lumiprobe의 "설포-Cy3.5 NHS ester"; 15 mg, 0.014 mmol, 1.0 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 TLC 분석(RP C-18, 용매: MeOH/H2O/AcOH 10/0.5/0.2 v/v/v, 검출: UV-VIS 및 닌히드린 염색)에 의해 제어되는 반응 완료까지 실온에서 광 보호하에 교반되었다. 반응 혼합물을 35℃로 가열하면서 진공에서 증발시키고 잔류물을 펜탄, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트로 분쇄하고 진공에서 실온에서 건조시켜 21 mg의 미정제 생성물(Cy3.5-RMA561)을 보라색 고체 형태로 수득하였다.
12g C18 SPE 카트리지에서 미정제 생성물의 크로마토그래피 정제에 의해 분석적으로 순수한 샘플을 제조하였다. 카트리지는 물(10 mL)로 세척하여 전처리했다. 미정제 생성물을 두 부분으로 나누었으며, 각각 0.5 mL 물에 용해하고 카트리지에 로딩한 다음 물(10 mL)로 세척하고 추가로 아세토니트릴(10 mL)로 세척하여 불순물 및 반응 부산물을 제거했다. 그 후, 순수한 Cy3.5-RMA561만을 함유하는 몇 개의 분획에서 혼합물 ACN/H2O 1:1(v/v)로 생성물을 용출했다. 동결건조 후 2x 8 mg의 순수한 생성물 Cy3.5-RMA561을 보라색 고체로 얻었다.
Cy3.5 염료의 강한 다가음이온 특성 외에도, 접합체는 적색 형광의 형태로 시험관내 및 생체내에서 쉽게 추적할 수 있다는 이점을 가졌다.
실시예 19: 시험관내 이브루티닙-Cy3.5를 사용한 항체-프로타민/프로타민 복합체 형성 분석
먼저, 이브루티닙-Cy3.5와 2개의 운반체 시스템, 프로타민에 이작용성 가교제 설포-SMCC에 의해 화학적으로 접합된 두 항체(리툭시맙 및 세툭시맙), 즉 밴드이동 분석에서 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유하는 리툭시맙(항-CD20-mAB)-프로타민, 및 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유하는 세툭시맙(항-EGFR-mAB)-프로타민 사이의 결합을 특성화하기 위한 실험을 수행했다.
결합되지 않은 프로타민-SMCC를 포함하는 두 운반체-접합체는 모두 이브루티닙-Cy3.5 유도체의 강력한 공동 조립을 보여주었고, siRNA(대략 13 kDa)에 비해 분자량이 낮기 때문에 운반체 mAB 1몰당 100몰 이브루티닙-Cy3.5를 초과하는 매우 높은 mol/mol 비의 정전기 포화를 보여주었다(도 50). 모든 추가 실험에서, 화학적으로 접합된 항체-대-프로타민의 조성은 변하지 않으며, 이는 얻어진 생성물이 여전히 항체-프로타민 접합체 외에 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유하고 있음을 의미한다.
아임계 20x 과량의 이브루티닙-Cy3.5가 로딩된 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 함유하는 상응하는 접합체 리툭시맙- 및 세툭시맙-프로타민을, CD20 및 EGFR-발현 세포주와 함께 인큐베이션하고 이브루티닙-Cy3.5의 세포내 농축에 대해 분석하였다. 두 경우 모두, 전형적인 Cy3.5 여기/방출 파장 조합에서 형광 신호의 세포내 농축이 문서화될 수 있었다(도 51). 따라서 변형된 이브루티닙-Cy3.5 화합물은 여전히 세포에 의해 내재화되고 있으며 결과적으로 표적 BTK에 여전히 결합한다면 작용할 수 있다.
다음으로, 리툭시맙 운반체 항체에 커플링된 이브루티닙-Cy3.5 유도체로 DLBCL 세포주를 대면시키고, 세포를 용해시키고 용해물을 SDS PAGE 분석에 적용하였다. 그 다음 겔을 UV 조명하고 Cy3.5 발색단의 방출을 스캔했으며, 실제로 Cy3.5 형광을 방출하는 70 kDa에서 단일 단백질 밴드가 있었으며, 이는 추후 웨스턴 봇 분석에 의해 브루톤 키나아제 BTK로 확인되었다(도 52).
결론적으로, 다가음이온성 유도체로의 이브루티닙 코어 구조의 화학적 변형은 브루톤 키나아제 BTK에 결합하는 접합체의 효율을 변경하지 않는다.
다음으로, 항체-억제제-복합체의 유효성을 확인하기 위한 기능적 검정을 계획했다. DLBCL 종양 세포를 메틸셀룰로오즈에 시딩하여 종양형성에 대한 대체 마커로서 부착-부재 콜로니 성장을 형성했다. 항체-억제제 복합체의 조합으로 검정을 처리하고 적절한 대조군과 비교하였다. CD20-발현이 높은 HBL-1 세포는 운반체 mAB가 없는 대조군과 비교하여 이브루티닙-Cy3.5를 갖는 리툭시맙-프로타민/프로타민으로 처리했을 때 콜로니의 30%만 형성했다는 것이 명백해졌다. 반면, 접합되지 않은 리툭시맙은 콜로니 성장에 약간의 영향만 미쳤다. 추가로, EGFR-발현은 높지만 CD20-발현은 낮은, A549 NSCLC 세포에서(도 53 B), 세툭시맙 운반체는 리툭시맙 운반체보다 훨씬 더 잘 수행하여, 의도한 바와 같은 수용체-특이적 흡수 메커니즘을 드러냈다.
항체-프로타민/유리 프로타민-SMCC/siRNA 접합 실험의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, αCD20-mAB-프로타민-이브루티닙-Cy3.5-프로타민 부가물에서 결합되지 않은/유리 프로타민-SMCC의 존재가 siRNA 부가물에서만큼 중요할 수 있다는 가설을 세웠고, 그래서 이전과 같이 친화성 크로마토그래피에 의해 리툭시맙-αCD20 mAB 제제로부터 유리 프로타민-SMCC를 고갈시켰다. 예상한 바와 같이, 고갈된 제제(도 54 A, 분획 25)는 프로타민-SMCC 함유 제제(도 54 B, 오른쪽)와 동일한 정도로(도 54 B, 왼쪽) 다가음이온성 이브루티닙-Cy3.5에 결합하고 배위할 수 없었다. 유리 프로타민-SMCC의 고갈 후 αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민-SMCC 복합체와 비교할 때, 유리 프로타민-SMCC가 없는 CD20-mAB-P는 이브루티닙-Cy3.5와 복합체화될 때 콜로니 형성의 억제를 부여하지 않는다(도 54 C).
실시예 20: 생체내 이브루티닙-Cy3.5를 사용한 항체-프로타민/유리 프로타민-SMCC 복합체 형성의 분석
모든 필요 성분 대조군과 비교하여 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 운반체의 치료학적 생체내 효능을 추가로 특성화하기 위해, 나타낸 바와 같이 생체내 치료 실험을 수행하였다(도 55 A 참조). 이를 위해, 107개의 HBL-1 DLBCL-세포를 면역결핍 NSG 마우스에 피하 이식하고, 평균 크기 200 mm3까지 종양 성장을 관찰하고, 마우스를 각각 10마리씩 그룹으로 분류하고, 단일 용량 당 0.625 nmol 리툭시맙 접합체에 상응하는 리툭시맙, 단일 용량 당 0.625 mmol 리툭시맙 접합체에 상응하는 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5(1:20) 및 18 μg 또는 12.5 mmol의 이브루티닙-Cy3.5, 및 배위되지 않은 이브루티닙(12.5 mmol) 및 이브루티닙-Cy3.5(12.5 nmol)의 등가물(PBS에 의해 추가로 조정됨)에 대해 계산된 4 mg/kg 체중의 표준 농도로 치료를 시작하였다. 이브루티닙-Cy3.5를 사용한 요법은 종양 성장에 대한 치료 효과를 나타내지 않은 반면, 리툭시맙-프로타민 운반체에 결합된 등가량의 이브루티닙-Cy3.5의 적용은 다른 모든 그룹에 비해 종양의 성장이 상당히 더 느렸다(도 55 C). 이것은 또한 동물의 생존 분석으로 해석되었다(도 55 B).
따라서, 생체내 모델에서 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5 1:20 복합체는 모든 적절한 성분 대조군과 비교하여 상당히 우수한 표적화 및 치료 프로파일을 나타냈다. 또한, 적용된 이브루티닙의 단일 용량은 20배 더 낮은 범위에 있었다(12.5 nmol의 이브루티닙은 0.720 mg/kg 마우스에 해당하며, 표준 용량은 Nod-SCID 마우스에서 12 mg/kg임(Chen et al. 2016; Zhang et al. 2017)).
이 가설을 입증하기 위해, 희생된 마우스로부터 장기를 준비하고 이를 통합된 이브루티닙-Cy3.5의 생체외 형광 검출에 적용했다(도 56). 그 결과, 리툭시맙-프로타민/이브루티닙-Cy3.5 처리된 마우스로부터의 종양은 처리 주기에 따라 증가하는 Cy3.5-유래 형광 신호의 현저한 축적을 나타내었다. 이 발견과 대조적으로, 리툭시맙이 배위되지 않은 이브루티닙-Cy3.5로 처리된 마우스로부터의 종양에서 검출가능한 신호는 거의 없었으나(도 56), 이 그룹에서는 대부분의 장기에서 볼 수 있는 확산 배경 신호 경향이 있었다(도 57).
또한, 분석된 장기에서 특정 형광이 검출되지 않았다(도 57). 본 발명자들은 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC/이브루티닙-Cy3.5 접합체가 CD20-양성 종양에서 특이적으로 풍부하다는 결론을 내렸다.
실시예 21: 항체-프로타민/유리 프로타민-siRNA 및/또는 이브루티닙-Cy3.5 복합체에 의한 시험관내 소포 구조의 형성
새로운 나노구조를 추가로 특성화하기 위해, 정전하를 띤 녹색 형광 siRNA 및 적색 형광 이브루티닙-Cy3.5를 사용하고 이를 항체-프로타민/유리 프로타민-SMCC 접합체에 복합체화했다(도 58 내지 도 60).
추가 siRNA를 포함하거나 포함하지 않는 mAB-프로타민/유리 프로타민/이브루티닙-Cy3.5-접합체의 무세포 어셈블리 결과를 검사하는 동안, 각 나노구조의 양과 크기에서 현저한 차이를 관찰했다: siRNA 및 mAB-프로타민과 유리 프로타민-SMCC에 의해 복합체화된 이브루티닙-Cy3.5에 의해 조립된 것들은 siRNA가 없는 것보다 상당히 더 크고 더 빈번했다(도 58 C 및 F 및 도 59 D 및 H). 안정한 나노 구조를 형성하는 4개의 성분 모두로 구성된 혼합 입자의 가설로 이 현상이 설명된다. 상세한 형광 현미경 사진에서, 가장 큰 입자의 나노구조는 타원체 미셀의 외부 테두리(도 60, A 및 C)를 형성하는 siRNA로서 드러날 수 있는 반면, 이브루티닙-Cy3.5는 이 나노구조의 내강을 더 많이 채두고 있다(도 60 B 및 D).
혼합된 항체-프로타민 입자가 mAB-프로타민/프로타민 운반체에 복합체화된 이브루티닙-Cy3.5만을 갖는 것보다 더 빈번하고 훨씬 더 큰 이러한 현상은 운반체 항체로서 항-CD20-mAB 리툭시맙(도 60 C-D) 및 항-EGFR-mAB 세툭시맙(도 60 A 및 B) 둘 모두에서 볼 수 있다.
이것은 음전하의 이브루티닙-Cy3.5가 항체-프로타민 복합체와 함께 작은 작은 소포를 형성할 수 있지만(도 58 E 및 도 59 F), 선형이고 고도로 음전하의 분자인 siRNA는 항체-프로타민/유리 프로타민-SMCC 복합체 사이의 일종의 정전기 "접착제"로서 작용할 수 있다. 이는 적색 형광성 이브루티닙-Cy3.5로 채워져 있는 것으로 보이는 매우 큰 소포에서 원형의 빛나는 것으로 관찰될 수 있다(도 60).
이 구조를 추가로 특성화하기 위해, Zeta View® 나노입자 추적 비디오 현미경을 사용하여 입자 크기 측정을 수행했다. 여기서 1 내지 1000 nm 사이의 입자를 감지하고 크기와 개수를 분석했다(도 61). 대조군 (scr)-siRNA, 이브루티닙-Cy3.5 또는 이들 모두를 각각 첨가하여 복합체 형성 시작 1시간 후에 안정하고 가장 큰 입자를 검출하였다(도 61 A, B, C, D). 동일한 양의 항체-무함유 프로타민-SMCC(= 1800 nM = 60 nm 항-CD20-mAB의 커플링에 사용된 것과 같은 30배 몰비)의 사용은 지속적으로 더 작은 입자를 형성했다(도 61 A, 하부 패널 및 도 61 E). 흥미롭게도, 도 60에서 볼 수 있는 바와 같이 매우 큰 혼합 입자의 형성은 기술적인 한계 때문에 Zetaview 데이터에서는 관찰되지 않았다.
실시예 22: 운반체-항체-프로타민 융합체 또는 항체-프로타민 접합체에 의한 음이온성 소분자 약물의 복합화
음이온성 소분자의 복합체화와 관련하여, αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC(αCD20-mAB-P/P) 접합체가 이브루티닙-Alexa488의 비율을 최대 1:2까지 다양한 비율로 사용하여 αCD20-mAB-프로타민을 사용하는 밴드이동 분석에서 이브루티닙-Alexa488에 결합한다는 것을 발견하였다. α, anti. (도 62, A): -2의 Alexa488 분자의 제한된 음이온 전하로 인해(도 62, B), 다가양이온성 프로타민 융합체와 Alexa488 사이의 상호작용은 -4의 순 전하를 갖는 Cy3.5(다음 예)보다 덜 강한 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, Alexa488-접합된 이브루티닙 및 프로타민 접합체에서는 고작 2:1의 커플링 비율이 실현되었다. 그러나, αCD20-mAB 리툭시맙-프로타민/유리 프로타민-SMCC(αCD20-mAB-P/P)에 의한 이브루티닙-Alexa488의 복합체화는 여전히 성공적이었다.
안정한 나노입자 형태의 항체-억제제-복합체의 구축이 형광 현미경(도 62 C-H)에서 검출될 수 있었으며, 이는 다른 나노입자에 대하여 공개된 조건 하에 혈청에서 안정하다(도 62 E, G, F, H). 중요한 것은 이브루티닙-Cy3.5가 형광에 의해 검출가능하기 때문에 모든 다운스트림 응용 분야에 탁월한 추적 능력을 제공한다는 것이다.
시험관내에서 인큐베이션되었을 때, 이브루티닙-Cy3.5가 로딩된 αCD20-mAB-P/P는 적색 Cy3.5 형광을 노출하는 정전기적으로 안정화된 나노입자의 조립을 유도하였다(도 65). 형광 현미경 검사에서, 첫 번째 규칙적인 모양의 소포 구조(도 62 C, D), 이후 2 μm보다 큰 불규칙한 모양의 응집체 및 더 작은 입자가 검출되었으며, 변형되지 않은 αCD20-mAB가 이브루티닙-Cy 3.5를 복합체화하는 데 사용된 경우 또는 변형된 αCD20-mAB-P/유리 프로타민이 소수성 이브루티닙(상표명: Imbruvica)을 복합체화하는 데 사용된 경우, 이 과정은 보이지 않았다(도시하지 않음). 광학 현미경(도 65 A 및 B)에서 보여진 정전기 입자는 또한 전자 현미경(도 65 C)에서도 검증되었으며, 여기서 <100 내지 200 nm 범위의 다수의 더 작은 입자가 검출되어(도 65 C), "나노" 운반체라는 용어를 선택하게 되었다.
프로타민 접합체와의 복합체화 측면에서 음이온성 하전된 소분자 대 하전되지 않은 소분자의 비교에 관하여, 하전된 이브루티닙-Cy3.5는 프로타민-접합된 mAb와 안정한 나노입자를 형성하지만 하전되지 않은 이브루티닙(상품명: imbruvica)은 그렇지 않음을 확인하였다. 프로타민에 접합된 각각의 항체 운반체에 하전된 이브루티닙-Cy3.5 대 하전되지 않은 이브루티닙이 로딩되었다. 주목할 것은, Cy3.5와 접합된 이브루티닙 샘플만이 나노입자의 조밀한 형성을 나타냈지만, 하전되지 않은 이브루티닙은 그렇지 않다는 것이며(도 63), 이는 다가음이온 순 전하 뿐만 아니라 다가음이온의 특정 구조가 프로타민에 대한 적절한 정전기적 상호작용에 중요함을 나타낸다.
실시예 23: 제안된 모델
종합하면, 항체-프로타민 및 결합되지 않은 프로타민으로 구성된 운반체에 의해 음이온 카고 분자를 결합시키는 원리는 siRNA-핵산 이외의 카고, 예를 들어 소분자, 예를 들어 키나아제 억제제 이브루티닙에도 적용될 수 있다. 여기서, 카고 분자를 수정하여 다가음이온 특성을 부여하고 나노구조로 구성성분의 강력한 정전기 자기 조립을 가능하게 하기 위해 제제에 결합되지 않은 프로타민-SMCC를 남겨 두는 것이 중요하다.
이러한 관찰은 새롭고 예상치 못한 거대분자 나노구조가 본 발명의 운반체 시스템의 시험관내 및 생체내 약동학적 효능을 담당함을 강력하게 지지한다.
따라서, siRNA의 안정성을 담당하는 나노입자 유사 매크로구조를 형성하기 위한 성분 1. 항체-프로타민, 2. siRNA/음이온성 소분자 및 3. 결합되지 않은 프로타민(-SMCC)의 조합을 기대하며, 이는 siRNA의 안정성을 담당하고 siRNA 및/또는 음이온 소분자 억제제를 의도한 세포에 효과적으로 전달할 수 있는데, 완전히 예상치 못한 관찰이다. 이 나노구조 어셈블리의 이상적인 모델이 도 64에 나와 있다.
결론적으로, 다가-음이온성이고 다른 구조적 유사성이 없다는 최소 공통 분모 요건을 갖는 다양한 화학적으로 상이한 이펙터 페이로드를 사용하는 실험은 본 발명의 나노운반체-siRNA 운반체 및 본 발명의 나노운반체-이브루티닙-Cy3.5 시스템의 시험관내 및 생체내 약동학적 특성의 기초가 되는 새롭고 예상치 못한 나노구조 모델에 대한 실험적 증거를 제공한다.
1. siRNA/음이온 소분자 수송 및 표적 세포로의 특이적 전달 및 2. 특이적 세포내 종양유전자 불활성화 또는 약리학적 활성에 대한, 이중 특이성을 갖는 이러한 모듈식 나노구조 시스템은 암을 비롯한 다양한 질병 그룹에 사용될 수 있다.
실시예 24: 시험관내 αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5 나노운반체의 기능 분석
다음으로, 상이한 세포 모델 시스템에서의 이러한 αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5 나노운반체의 효능을 조사하였다.
먼저, Cy3.5 형광을 통한 CD20-양성 DLBCL 세포로의 내재화를 조사하였다. 커플링되지 않은 이브루티닙-Cy3.5로 밤새 처리된 HBL1 및 TMD-8 림프종 세포는 세포의 적절한 적색 형광 마킹(도 66E 에서 백색)을 나타내며, 이는 이브루티닙-Cy3.5가 αCD20-mAB-P/P와 복합체화되고 수송되었을 때 강화되었다(도 66 F). 이는 운반체 항체 구현 없이 이브루티닙-Cy3.5 음이온에 대한 비표적화된 흡수 메커니즘에 비해 CD20 수용체에 의한 유익한 내재화 과정을 시사하였다(도 66 E). 다음으로, 접합체를 사용한 세포의 72시간 처리는 SDS PAGE 전기영동에서 70 kDa 단백질의 공유결합 Cy3.5 마킹의 단일 밴드를 나타내며, 이는 변형된 이브루티닙-Cy3.5 화합물의 결합 및 기능성을 시사한다(도 66 G). BTK의 형광 검출을 위해, 레인의 동일한 부하 및 BTK의 식별을 나타내기 위해 겔이 상당히 과부하되어야 했기 때문에, 다음으로 형광 검출 후 BTK의 면역검출을 위한 겔을 블롯팅하였다. 실제로, BTK를 나타내는 밴드는 Cy3.5 형광에서 보여지는 것과 동일한 위치에 나타났으며, 이는 예상한 바와 같이 이브루티닙-Cy3.5가 BTK에만 독점적으로 공유 결합되었음을 시사한다(도 66 G).
또한, HBL1 세포를 이브루티닙-보디피와 함께 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5로 처리하였다. 세포는 이브루티닙-보디피를 포함하지만(도 66 N 및 P), Cy3.5 형광은 전처리되지 않은 세포에서만 나타나고(도 66 L) 이브루티닙-보디피로 전처리된 세포에서는 나타나지 않는다(도 66 P). 일부 세포하 적색 소포는 이브루티닙-Cy3.5의 CD20-매개 내재화를 나타내지만(도 66 P), BTK 결합을 암시하는 패턴(이브루티닙-Cy3.5에 대한 도 66 L 및 이브루티닙-보디피에 대한 도 66 N 및 P 참조)은 발생하지 않는다. 이는 또한 αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5 처리 24시간 후와 비형광성 이브루티닙의 사전 배양 및 세척 후에도 그러하다.
이브루티닙에 의한 BTK의 공유결합적 표적화의 기능적 효과는 BTK 자가인산화 능력의 억제이다. 따라서, αCD20-mAB/P/P 나노운반체에서 복합체 형성 유무에 따른 이브루티닙-Cy3.5 처리 후 DLBCL 세포에서 BTK의 인산화 상태를 분석하였다(도 67 A). 세포를 PBS, 비복합체화된 이브루티닙-Cy3.5 및 αCD20-mAB-P/P/이브루티닙-Cy3.5 복합체로 72시간 동안 처리하고, 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 특정 포스포-BTK-항체에 의해 검출된 티로신 223에서 BTK의 인산화가 이브루티닙-Cy3.5 처리시 HBL1(도 67 A, 왼쪽 패널) 및 TMD8 세포(데이터는 도시되지 않음)에서 그것이 복합체화되었든 그렇지 않든 상관없이 유의하게 감소됨을 발견하였다. 이는 도 66 G에 도시된 바와 같이 BTK에 대한 결합에 따른 것이었다. 총 BTK의 발현은 약간 영향을 받았다(도 67 A). 합성된 이브루티닙-Cy3.5 접합체가 BTK 자가인산화의 불활성화뿐만 아니라 표적 분자 BTK에 결합하는 측면에서 완전한 기능을 유지한다고 결론지었다.
흥미롭게도, 모든 시험된 림프종 세포주에서 림프종-특이적 αCD20-mAB-P/P/ibru-Cy3.5 나노운반체 시스템은 소프트 한천 배양물에서 콜로니 성장을 상당히 억제했다. 이는 단일 제제로서의 이브루티닙 또는 이브루티닙-Cy3.5에 대해 훨씬 더 적은 정도로 관찰되었으며, 변형되지 않은 리툭시맙(αCD20-mAB)이 사용된 경우에는 관찰되지 않았다(HBL1: 도 67 B). 이 콜로니 분석법은 앵커리지 독립적인 클론 세포 성장의 정량화에 사용되며 생체내 종양형성에 대한 표준 시험관내 대용물이다. 따라서 음이온성 화합물이 양이온성 αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민 운반체 복합체와 음이온성 카고 이펙터로 구성된 안정한 정전기 나노입자로 조립될 때에만 이브루티닙-Cy3.5의 강력한 치료 효과가 나타난다고 주장할 수 있다.
다음으로, DLBCL 세포주에서 αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5에 의한 BTK 불활성화의 기능적 결과를 세포자멸 유도 측면에서 탐구하였다. 여기서, HBL1(도 68) 및 TMD8 세포(데이터는 도시되지 않음)에서, αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5 치료는 세포자멸 신호의 우수한 유도를 제공한 반면(도 68, 가장 오른쪽 막대), 복합체화되지 않은 이브루티닙-Cy3.5 치료는 표적 치료 및 유리 이브루티닙 치료와 비교하여 경미한 영향만을 나타냈다. 따라서 αCD20-mAB-P/P-이브루티닙-Cy3.5의 표적 치료는 세포에서 활성 이브루티닙-Cy3.5의 축적으로 이어지고, 따라서 복합체화되지 않은 이브루티닙-Cy3.5보다 더 심각한 세포자멸 유도로 이어진다고 추정한다. 또한 음이온 분자 이브루티닙-Cy3.5는 복합체가 없는 경우 소수성 유리 이브루티닙보다 세포에 덜 접근할 수 있거나 적어도 덜 효과적인 것으로 보이며, 이는 유리 이브루티닙과 비교하여 더 낮은 세포자멸의 유도에 의해 판단된다.
실시예 25: 유잉 육종 이종이식편 종양 성장은 αIGF1R-mAB-프로타민-siRNA-프로타민 나노운반체를 사용한 전신 요법을 통한 발암성 EWS-FLI1 전좌 산물의 녹다운시 억제됨.
테프로투무맙-프로타민 나노운반체의 생체내 효능을 시험하기 위해, 107개의 인간 SK-N-MC 세포를 CD1-누드 마우스의 옆구리에 피하(s.c.) 이종 이식하고, 적어도 7마리의 마우스 코호트를 PBS로, 또는 스크램블된 제어군-siRNA와 복합체를 이루는 또는 위에서 언급한 EWS-FLI1-siRNA와 복합체를 이루는 αIGF1R-mAB-P/P로 처리하였다(도 69 A-C). 종양의 평균 크기가 100 내지 150 mm3에 도달했을 때 처리를 시작했다. Tepro-mAB-P/EWS-FLI1-siRNA/P 나노입자를 수득한 처리 그룹의 종양은 두 대조군 그룹과 비교했을 때 유의미하고 거의 완전한 성장 억제를 보여주었다(도 69 B 및 C). 이것은 Tepro-mAB-P/siRNA/P 나노입자를 통한 EWS-FLI1의 녹다운이 전신 생체내 적용 후에 성공적이었음을 제안했다.
실시예 26: 운반체 항체-프로타민/유리 프로타민 및 siRNA에 의해 형성된 나노입자는 거의 중성의 표면 전하를 노출시킴.
항체-프로타민/유리 프로타민 및 siRNA로부터의 나노입자의 형성은 신속하고 재현성 있는 것으로 밝혀졌으나 이는 항체 제제에 따라 다르다. 예를 들어, 상이한 α-IGFR-프로타민 제제는 αEGFR-프로타민 제제 또는 αCD33 제제에 의해 형성된 것보다 더 큰 입자를 향하는 경향이 있었으며, 이는 DLS 분석(도 70) 및 현미경 분석에 의해 보여진다. 다음으로, 표면 전하는 약한 음이온 범위에서 약간만 변화하여 거의 중성으로 하전된 입자를 노출한다. 항체 자체의 특성뿐만 아니라 음이온 및 양이온 성분의 정전기적 균형이 크기 및 표면 전하에서 나노입자의 속성을 정의한다고 결론지었다.
실시예 27: 항-EGFR-mAB-SMCC-프로타민 접합체, 유리 SMCC-프로타민 및 siRNA 사이의 효과적인 나노입자 형성을 위한 전제 조건 해독.
또한, 소포 형성에 siRNA가 필요한지 여부를 평가하였다. 일정한 32x 유리 SMCC-프로타민과 함께 일정한 양의 αEGFR-mAB-P를 다양한 양의 Alexa488-대조군-siRNA와 함께 인큐베이션했다(도 71 A-G, 상단 패널의 녹색 형광, 하단 패널의 위상차). 놀랍게도, 나노입자는 항체에 비해 5 내지 10배의 siRNA의 최적 몰 과량으로 효율적으로 형성된다(도 71 D-E).
실시예 28: αEGFR-프로타민/유리 프로타민-유리 프로타민-Alexa488-siRNA에 의해 형성된 나노입자는 혈청 함유 조건에서 안정함.
표적화된 나노입자의 전신 치료 적용을 위해, 다양한 까다로운 조건에서의 안정성이 가장 중요하며, 그렇지 않으면 활성 물질이 분해에 의해 나노운반체로부터 분리될 것이다. 여기서, αEGFR-mAB-프로타민, 유리 프로타민 및 Alexa488-siRNA는 고농도의 소 혈청 알부민에서 안정성에 대해 테스트되었고 나노운반체는 24시간 후에도 안정적인 것으로 입증되었다(도 72 B).
실시예 29: αCD20-mAB-프로타민/유리 P-이브루티닙-Cy3.5 나노운반체의 혈청 안정성.
안정한 나노입자 형태의 αCD20-mAB-프로타민/유리 P-이브루티닙-Cy3.5 항체억제제-복합체의 구축은 형광 현미경(도 73 A-F)으로 검출될 수 있었으며, 24시간 동안(도 73 B-C) 및 심지어 72시간 동안(도 73 E-F) 혈청에서 안정적이다.
실시예 30: 3개의 상이한 표적화 항체로 구성된 siRNA 나노운반체의 pH 안정성.
나노운반체의 전신 적용을 위해, 배위된 siRNA 이펙터 분자의 조기 분해 및 손실을 방지하기 위해 어떤 pH 조건 하에서 구조가 안정한지가 중요하다. 여기서, 표준 조건 하에 3개의 상이한 표적화 항체 및 siRNA로 siRNA 나노운반체를 형성하고 pH 4.8과 8.0 사이의, 즉 나노운반체가 치료 적용 중에 도전받을 수 있는 모든 pH 조건을 포괄하는, pH 조건 하에서 무결성을 시험하였다(도 74). 복합체화된 siRNA의 Alexa488 형광에 의해 판단된 나노운반체는 5.2 내지 8.0의 pH 조건에서 안정하였으며, 더 낮은 pH에서 더 큰 상부구조를 형성하도록 구조화되는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 31: αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민 및 이브루티닙-Cy3.5로 구성된 나노운반체의 pH 안정성.
여기서, 표준 조건 하에 αCD20-mAB-프로타민/유리 프로타민으로 이브루티닙-Cy3.5 나노운반체를 형성하고, pH 4.8과 8.0 사이의, 즉 나노운반체가 치료 적용 중에 도전받을 수 있는 모든 pH 조건을 포괄하는, pH 조건 하에서 무결성을 시험하였다(도 75). 복합체화된 이브루티닙-Cy3.5의 Cy3.5 형광에 의해 판단된 나노운반체는 5.8 내지 8.0의 pH 조건에서 안정하였으며, 더 낮은 pH에서 붕괴하도록 구조화되는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 32: αEGFR-mAB-P/유리 프로타민-siRNA 나노운반체 및 αIGF1R-mAB-P/유리 프로타민 siRNA 나노운반체에서 표적화 IgG 항체의 면역표지.
양이온성 항체-프로타민/유리 프로타민 제제 및 siRNA의 자가 조립 과정은 정의된 구조를 갖는 나노입자 구조를 유도한다: 여기서, αEGFR-mAB-프로타민/유리 프로타민-siRNA 나노입자(도 76) 및 αIGF1R(테프로투무맙)mAB-프로타민/유리 프로타민/siRNA 나노입자(도 77)는 인간 IgG 신호의 면역 검출에 적용되었다. α-인간 IgG-Alexa647을 사용하여 나노운반체에서 인간 IgG 위치 및 배향을 시각화했는데, 나노입자 미셀 구조의 외부 테두리에서만 신호를 노출하였고(도 76 B 및 77 B) 내강에서는 신호를 노출하지 않았다(도 76 A 및 77 A). 따라서, 부피가 큰 IgG 분자는 나노입자 미셀의 바깥쪽을 향하고 있으므로 단백질 표적, 세포 표면 분자의 세포외 도메인 및 수용체 티로신 키나아제에 확실히 접근할 수 있어야 한다는 결론을 내렸다.
실시예 33: 나노운반체 복합체에서 유리 프로타민의 가시화.
나노운반체에서 중요한 유리 프로타민의 위치는 지금까지 불분명한 상태로 남아 있었고, 그래서 본 발명자는 이점에 방향을 돌려 주어진 αEGFR-프로타민 제제의 유리 프로타민을 Cy3-NHS 에스테르에 접합된 프로타민으로 대체했고(도 78 A) 비-형광 siRNA와 조합하여 나노운반체 구조를 형성하였다(도 78 B). 그 다음 나노운반체를 형광 현미경으로 관찰하고 염색 패턴을 밝혔는데, 여기서 프로타민-Cy3은 나노운반체의 내강에 위치하는 반면(도 78 C-E), 항-인간 IgG-Alexa647로 염색된 IgG 부분은 나노운반체의 테두리 섹션에 위치하였다(도 78 E-F).
실시예 34: 시아닌-염료 접합 억제제 제피티닙, 젬시타빈 및 베네토클락스의 합성.
이를 위해, 각각 2개의 상이한 시아닌 염료, 설포-Cy3.5™(여기 591 nm/방출 604 nm) 및 설포-Cy5.5™(여기 684 nm, 방출 710 nm)에 연결된, 3개의 새로운 화합물의 합성이 수행될 것이다. 두 시아닌 염료 모두 프로타민 양이온성 펩티드 조정에 필요한 4개의 강한 음이온성 설포닐 기를 나타내는 동일한 코어 형광단 구조를 공유하지만, 공액 이중 결합의 수만 다르므로, 식별가능한 형광단 특성을 유발한다. 이브루티닙과 유사하게, 3개의 상이한 약물-염료-접합체를 비교가능한 전체 분자 모양으로 합성해야 한다. 가능한 후보로 제피티닙(EGFR 억제제), 젬시타빈(세포 증식 억제 약물) 및 베네토클락스(BLCL-2 억제제)가 선택되었는데, 그 이유는 모든 경우에 이들은 염료에 접합된 후에도 표적 분자에 대한 결합력을 유지하고 형광 이미징 응용 프로그램을 허용하기 때문이다(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2018; Gonzales et al. 2018). 이들은 PEG4-스페이서를 설치하고 상업적으로 이용가능한 반응성 NHS-에스테르 또는 아지도 기능화 염료를 사용하여 시아닌 염료에 접합된다(도 79 참조).
먼저, 제피티닙 유사체는, 상업적으로 입수가능한 제피티닙 1로 시작하여 합성될 것인데, 이는 탈메틸화될 것이고 생성된 페놀은 아지도-PEG4-메실레이트의 친핵성 공격에 의해 전환될 것이다. 생성된 아지드는 아민 2로 환원되고 설포-Cy3.5 또는 설포-Cy5.5로 표지되어 나노운반체로의 추가 복합체화를 위한 제피티닙-접합체를 생성한다.
젬시타빈 3의 경우, 하이드록실 기가 보호될 것이고, 이탈기는 시토신에 설치되어 프로파길 아민의 친핵성 공격 후 알킨 4를 얻을 것이다(Solanki et al. 2020). 클릭 반응에 의해 해당 아지도 작용화된 시아닌 염료로 표지한 후, 필요한 접합체가 얻어질 것이다.
세 번째 예인 베네토클락스의 경우, 알려진 베테토클락스 코어 구조 5의 합성으로 시작될 것이다(Giedt et al. 2014). 설폰아미드 6은 이미 언급한 메실-PEG4-아지드를 사용하여 3단계에서 도달될 것이며, 5에 연결된 후, 아지드의 환원 및 후속 시아닌 염료로의 표지(NHS-에스테르)에 의해 추가 평가를 위한 해당 베네토클락스 접합체를 수득할 것이다.
실시예 35: 보다 쉽고 저렴한 다가음이온성 분자 모이어티 및 또한 PDT 및 방사선 요법과 같은 다른 치료 개입으로의 개념 확장.
상이한 결합 모티프 및 표적을 갖는 다른 항암 약물에 대한 정전기적 결합 원리의 전환 및 평가 후에, 여기서 사용된 시아닌 염료(초기 광학 특성화 및 형광 이미징에 중요함)로부터 필요한 음이온 특성을 (1) 더 쉽고 저렴한 합성 측면에서 더 쉽게 접근할 수 있는 정전기 커넥터로 변경하여 임상 평가로의 번역을 용이하게 하기 위한 것이다. 이에 대한 후보물질은 대규모 합성을 위한 길을 열 수 있는 다중 황산화 단당류, 이당류 및 분지형 올리고당 또는 모노-, 디 또는 트리포스페이트이다(도 80).
본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제약 없이 적합하게 실시될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되었으며, 이러한 용어 및 표현을 사용함에 있어 제시되고 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가능함이 인정된다. 즉, 본 발명이 예시적인 구현예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 본 발명의 수정 및 변경은 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 이러한 수정 및 변경은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명은 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 총칭에 속하는 각각의 보다 좁은 종 및 아속 그룹도 본 발명의 일부를 형성한다. 이에는 절제된 자료가 본 명세서에 구체적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 단서 또는 부정적인 제한에 의해 속으로부터 임의의 대상을 제거하는 발명의 일반적인 설명이 포함된다.
다른 구현예들은 하기 청구범위 내에 있다.
비특허문헌
Arvand, A., and Denny, C.T. (2001). Biology of EWS/ETS fusions in 유잉's family tumors. Oncogene 20, 5747-5754.
Baumer, N., Appel, N., Terheyden, L., Buchholz, F., Rossig, C., Muller-Tidow, C., Berdel, W.E., and Baumer, S. (2016). Antibody-coupled siRNA as an efficient method for in vivo mRNA knockdown. Nat. Protoc. 11, 22-36.
Baumer, N., Berdel, W.E., and Baumer, S. (2017). Immunoprotein-Mediated siRNA Delivery. Mol. Pharm. 14, 1339-1351.
Baumer, N., Rehkamper, J., Appel, N., Terheyden, L., Hartmann, W., Wardelmann, E., Buchholz, F., Muller-Tidow, C., Berdel, W.E., and Baumer, S. (2018). Downregulation of PIK3CA via antibody-esiRNA-complexes suppresses human xenograft tumor growth. PLoS One 13, e0200163.
Baumer, S., Baumer, N., Appel, N., Terheyden, L., Fremerey, J., Schelhaas, S., Wardelmann, E., Buchholz, F., Berdel, W.E., and Muller-Tidow, C. (2015). Antibody-Mediated Delivery of Anti-KRAS-siRNA In Vivo Overcomes Therapy Resistance in Colon Cancer. Clin Cancer Res 21, 1383-94.
Bose, P., and Grant, S. (2013). Mcl-1 as a Therapeutic Target in Acute Myelogenous Leukemia (AML). Leuk Res. Rep. 2, 12-14.
Byrd, J. C.; Furman, R. R.; Coutre, S. E.; Flinn, I. W.; Burger, J. A.; Blum, K. A. et al. (2013): Targeting BTK with ibrutinib in relapsed chronic lymphocytic leukemia. In: N. Engl. J. Med. 369 (1), S. 32-42. DOI: 10.1056/NEJMoal215637.
Chen, J.; Kinoshita, T.; Sukbuntherng, J.; Chang, B. Y.; Elias, L. (2016): Ibrutinib Inhibits ERBB Receptor Tyrosine Kinases and HER2-Amplified Breast Cancer Cell Growth. In: Mol. Cancer. Ther. 15 (12), S. 2835-2844.
Chen, X., Stewart, E., Shelat, A.A., Qu, C., Bahrami, A., Hatley, M., Wu, G., Bradley, C., McEvoy, J., Pappo, A., et al. (2013). Targeting oxidative stress in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer. Cell. 24, 710-724.
Choi, Y.S., Lee, J.Y., Suh, J.S., Kwon, Y.M., Lee, S.J., Chung, J.K., Lee, D.S., Yang, V.C., Chung, C.P., and Park, Y.J. (2009). The systemic delivery of siRNAs by a cell penetrating peptide, low molecular weight protamine. Biomaterials 31, 1429-43.
Chono, S., Li, S.D., Conwell, C.C., and Huang, L. (2008). An efficient and low immunostimulatory nanoparticle formulation for systemic siRNA delivery to the tumor. J. Control. Release 131, 64-69.
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-11.
Giedt, R. J., Sprachman, M. M., Yang, K. S. & Weissleder, R. Imaging cellular distribution of Bel inhibitors using small molecule drug conjugates. Bioconjug. Chem. 25, 2081-2085; 10.1021/bc500433k (2014).
Gonzales, J. et al. Nanoemulsion-Based Delivery of Fluorescent PARP Inhibitors in Mouse Models of Small Cell Lung Cancer. Bioconjug. Chem. 29, 3776-3782; 10.1021/acs.bioconj chem.8b00640 (2018).
Ha, H.T., Griffith, K.A., Zalupski, M.M., Schuetze, S.M., Thomas, D.G., Lucas, D.R., Baker, L.H., and Chugh, R. (2013). Phase II trial of cetuximab in patients with metastatic or locally advanced soft tissue or bone sarcoma. Am. J. Clin. Oncol. 36, 77-82.
Hansen, B., Linde, S., Kolendorf, K., and Jensen, F. (1979). Absorption of protamine-insulin in diabetic patients. I. Preparation and characterization of protamine- 1251-insulin. Horm. Metab. Res. 11, 85-90.
Hauser, P.V., Pippin, J.W., Kaiser, C., Krofft, R.D., Brinkkoetter, P.T., Hudkins, K.L., Kerjaschki, D., Reiser, J., Alpers, C.E., and Shankland, S.J. (2010). Novel siRNA delivery system to target podocytes in vivo. PLoS One 5, e9463.
He, H., Ye, J., Liu, E., Liang, Q., Liu, Q., and Yang, V.C. (2014). Low molecular weight protamine (LMWP): a nontoxic protamine substitute and an effective cell-penetrating peptide. J. Control. Release 193, 63-73.
Herrmann, D., Seitz, G., Warmann, S.W., Bonin, M., Fuchs, J., and Armeanu-Ebinger, S. (2010). Cetuximab promotes immunotoxicity against rhabdomyosarcoma in vitro. J. Immunother. 33, 279-286.
Kikuchi, K., Tsuchiya, K., Otabe, O., Gotoh, T., Tamura, S., Katsumi, Y., Yagyu, S., Tsubai- Shimizu, S., Miyachi, M., lehara, T., and Hosoi, H. (2008). Effects of PAX3-FKHR on malignant phenotypes in alveolar rhabdomyosarcoma. Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 568-574.
Kim, E.; Yang, K. S.; Kohler, R. H.; Dubach, J. M.; Mikula, H.; Weissleder, R. (2015): Optimized Near-IR Fluorescent Agents for in Vivo Imaging of Btk Expression. In: Bioconjug. Chem. 26 (8), S. 1513-1518. DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00152.
Lenz, G. (2017): Deciphering Ibrutinib Resistance in Chronic Lymphocytic Leukemia. In: J. Clin. Oncol. 35 (13), S. 1451-1452. DOI: 10.1200/JC0.2016.72.0102.
Liu, B. (2007). Exploring cell type-specific internalizing antibodies for targeted delivery of siRNA. Brief Funct. Genomic Proteomic 6, 112-119.
Liu, L., Wang, Y.D., Wu, J., Cui, J., and Chen, T. (2012). Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer 12, 154-2407-12-154.
Paulussen, M., Ahrens, S., Craft, A.W., Dunst, J., Frohlich, B., Jabar, S., Rube, C., Winkelmann, W., Wissing, S., Zoubek, A., and Jurgens, H. (1998). 유잉's tumors with primary lung metastases: survival analysis of 114 (European Intergroup) Cooperative 유잉's Sarcoma Studies patients. J. Clin. Oncol. 16, 3044-3052.
Paulussen, M., Bielack, S., Jurgens, H., Jost, L., and ESMO Guidelines Working Group. (2008). 유잉's sarcoma of the bone: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann. Oncol. 19 Suppl 2, ii97-8.
Smith, C.G., Fisher, D., Claes, B., Maughan, T.S., Idziaszczyk, S., Peuteman, G., Harris, R., James, M.D., Meade, A., Jasani, B., et al. (2013). Somatic profiling of the epidermal growth factor receptor pathway in tumors from patients with advanced colorectal cancer treated with chemotherapy +/- cetuximab. Clin. Cancer Res. 19, 4104-4113.
Solanki, A., King, D., Thibault, G., Wang, L. & Gibbs, S. L. Quantification of fluorophore distribution and therapeutic response in matched in vivo and ex vivo pancreatic cancer model systems. PLoS One 15, e0229407; 10.1371/journal. pone.0229407 (2020).
Song, E., Zhu, P., Lee, S.K., Chowdhury, D., Kussman, S., Dykxhoorn, D.M., Feng, Y., Palliser, D., Weiner, D.B., Shankar, P., Marasco, W.A., and Lieberman, J. (2005a). Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat Biotechnol 23, 709-17.
Song, E., Zhu, P., Lee, S.K., Chowdhury, D., Kussman, S., Dykxhoorn, D.M., Feng, Y., Palliser, D., Weiner, D.B., Shankar, P., Marasco, W.A., and Lieberman, J. (2005b). Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat Biotechnol 23, 709-17.
Stevens, M.C. (2005). Treatment for childhood rhabdomyosarcoma: the cost of cure. Lancet Oncol. 6, 77-84.
Turetsky, A.; Kim, E.; Kohler, R. EL; Miller, M. A.; Weissleder, R. (2014): Single cell imaging of Bruton's tyrosine kinase using an irreversible inhibitor. In: Sci. Rep. 4, S. 4782. DOI: 10.1038/srep04782.
Verdine, G.L., and Walensky, L.D. (2007). The challenge of drugging undruggable targets in cancer: lessons learned from targeting BCL-2 family members. Clin. Cancer Res. 13, 7264-7270.
Wilson, W. EL; Young, R. M.; Schmitz, R.; Yang, Y.; Pittaluga, S.; Wright, G. et al. (2015): Targeting B cell receptor signaling with ibrutinib in diffuse large B cell lymphoma. In: Nat. Med. 21 (8), S. 922-926. DOI: 10.1038/nm.3884.
Wu, Q. et al. Development of small molecule inhibitor-based fluorescent probes for highly specific super-resolution imaging. Nanoscale 12, 21591-21598; 10.1039/d0nr05188h (2020).
Zhang, Hui; Patel, Atish; Wang, Yi-Jun; Zhang, Yun-Kai; Kathawala, Rishil J.; Qiu, Long-Hui et al. (2017): The BTK Inhibitor Ibrutinib (PCI-32765) Overcomes Paclitaxel Resistance in ABCB1- and ABCCIO-Overexpressing Cells and Tumors. In: Mol. Cancer. Ther. 16 (6), S. 1021-1030. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-16-0511.
Zhu, D. et al. Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling and Dual Imaging of Apoptosis Markers with Probes Derived from Venetoclax and Idasanutlin. Angewandte Chemie (International ed. in English) 57, 9284-9289; 10.1002/anie.201802003 (2018).
SEQUENCE LISTING <110> BAEUMER, Sebastian BAEUMER, Nicole BERDEL, Wolfgang LENZ, Georg WITTMANN, Lisa <120> ELECTROSTATIC NANOPARTICLES AND USE THEREOF <130> IPA-0285-EP/UKM17204PCT <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab CDR-H1 <400> 1 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab CDR-H2 <400> 2 Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab CDR-H3 <400> 3 Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab CDR-L1 <400> 4 Gln Ser Ile Gly Thr Asn 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab CDR-L3 <400> 5 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab VH <400> 6 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab VL <400> 7 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 8 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab heavy chain <400> 8 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cetuximab light chain <400> 9 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab CDR-H1 <400> 10 Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser Asn 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab CDR-H2 <400> 11 Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab CDR-H3 <400> 12 Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab CDR-L1 <400> 13 Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab CDR-L3 <400> 14 Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser 1 5 <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab VH <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab VL <400> 16 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab Heavy chain <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 18 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab Light chain <400> 18 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab CDR-H1 <400> 19 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab CDR-H2 <400> 20 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab CDR-H3 <400> 21 Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Tyr Met Asp Val 20 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab CDR-L1 <400> 22 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab CDR-L2 <400> 23 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab CDR-L3 <400> 24 Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His Leu Val 1 5 10 <210> 25 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab VH <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab VL <400> 26 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 27 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab heavy chain <400> 27 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln 115 120 125 Asp His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr 130 135 140 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 145 150 155 160 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 165 170 175 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 180 185 190 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 195 200 205 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 210 215 220 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 225 230 235 240 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 260 265 270 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 275 280 285 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 290 295 300 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 325 330 335 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 340 345 350 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 355 360 365 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 420 425 430 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 450 455 460 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 28 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cixutumumab light chain <400> 28 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser 100 105 110 Gly Gln His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 115 120 125 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 140 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 165 170 175 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 195 200 205 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 210 215 220 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab CDR-H1 <400> 29 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab CDR-H2 <400> 30 Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab CDR-H3 <400> 31 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab CDR-L1 <400> 32 Gln Ser Val Ser Ser Tyr 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab CDR-L2 <400> 33 Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr 1 5 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab CDR-L3 <400> 34 Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab VH <400> 35 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab VL <400> 36 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 37 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab heavy chain <400> 37 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 38 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teprotumumab light chain <400> 38 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab CDR-H1 <400> 39 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab CDR-H2 <400> 40 Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab CDR-H3 <400> 41 Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 15 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab CDR-L1 <400> 42 Ser Ser Val Ser Tyr Ile 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab CDR-L3 <400> 43 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 44 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab VH <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 45 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab VL <400> 45 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab heavy chain <400> 46 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 47 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rituximab light chain <400> 47 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion oncogene PAX3-Fork head <400> 48 tggcctctca cctcagaatt caattcgtc 29 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 49 ggcctctcac ctcagaattc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 50 gcctctcacc tcagaattca 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 51 cctctcacct cagaattcaa 20 <210> 52 <211> 102 <212> DNA <213> chum salmon <400> 52 atgcccagaa gacgcagatc ctccagccga cctgtccgca ggcgccgccg ccctagggtg 60 tcccgacgtc gtcgcaggag aggaggccgc aggaggcgtt ag 102 <210> 53 <211> 33 <212> PRT <213> chum salmon <400> 53 Met Pro Arg Arg Arg Arg Ser Ser Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg <210> 54 <211> 153 <212> DNA <213> human <400> 54 atggccaggt acagatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg ccagagacaa 60 agaagtcgca gacgaaggag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat gaggtgctgc 120 cgccccaggt acagaccgag atgtagaaga cac 153 <210> 55 <211> 51 <212> PRT <213> human <400> 55 Met Ala Arg Tyr Arg Cys Cys Arg Ser Gln Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr 1 5 10 15 Arg Gln Arg Gln Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Cys Gln Thr 20 25 30 Arg Arg Arg Ala Met Arg Cys Cys Arg Pro Arg Tyr Arg Pro Arg Cys 35 40 45 Arg Arg His 50 <210> 56 <211> 130 <212> PRT <213> human <400> 56 Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val Arg 20 25 30 Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu 50 55 60 Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile 65 70 75 80 Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 85 90 95 Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile 100 105 110 Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Lys 130 <210> 57 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human histone H2 derived peptide <400> 57 Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu 20 25 30 Leu Arg Lys Gly 35 <210> 58 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human histone H2 derived peptide <400> 58 Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu 20 25 30 Leu Arg Lys Trp 35 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 59 uucugcuugu gacauuaaaa a 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 60 aaacuuggcu gaaguuuaaa a 21 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 61 ugaauucuga ggugagaggc tt 22 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 62 ggcagcagaa cccuucuuau u 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 63 acacaaacuu gaacagcuat t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 64 gaaauguucu ugcaguuaat t 21 <210> 65 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gemtuzumab heavy chain 2 <400> 65 Met Gly Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile 35 40 45 Thr Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225 230 235 240 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465

Claims (15)

  1. c) 이작용성 링커에 접합된 양전하의 폴리펩티드를 포함하는 제1 접합체(A)를 포함하는 조성물과 항체를 접촉시켜, 양전하의 폴리펩티드, 이작용성 링커 및 항체를 포함하는 제2 접합체(B)를 얻는 단계로서, 상기 조성물은 접합되지 않은 이작용성 링커가 본질적으로 없는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    d) 상기 제2 접합체(B), 음전하의 폴리펩티드 및 음전하의 분자를 접촉시켜 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 나노입자 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c) 이전에 하기를 포함하는 방법:
    a) 양전하의 폴리펩티드를 이작용성 링커와 접합시키는 단계;
    b) 접합되지 않은 이작용성 링커를 제거하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 c)에서 제1 접합체(A)와 항체의 몰비가 약 10:1 이상인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 양전하의 폴리펩티드와 제2 접합체(B) 사이의 몰비는 약 10:1 이상인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 세포 표면 분자에 특이적인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 음전하의 분자는 핵산인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 양전하의 폴리펩티드는 프로타민 또는 히스톤인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 나노입자.
  9. (a) 양전하의 폴리펩티드;
    (b) 양전하의 폴리펩티드에 접합된 항체를 포함하는 제2 접합체(B); 및
    (c) 하나 이상의 음전하의 분자(들)을 포함하는 나노입자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 제2 접합체는 나노입자의 외부에 풍부한 것인, 나노입자.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 음전하의 분자는 나노입자의 내부에 풍부한 것인, 나노입자.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자는 약 0.05 μm 내지 약 10 μm의 평균 직경을 갖는, 나노입자.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는 조성물.
  14. 치료요법에 사용하기 위한 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 나노입자 또는 제13항의 조성물.
  15. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항의 나노입자 또는 제13항의 조성물을 포함하는 키트.
KR1020237022270A 2020-12-02 2021-12-02 정전기 나노입자 및 이의 용도 KR20230117186A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LULU102272 2020-12-02
LU102272 2020-12-02
EP21175260.5 2021-05-21
EP21175260 2021-05-21
EP21205482 2021-10-29
EP21205482.9 2021-10-29
PCT/EP2021/083975 WO2022117731A1 (en) 2020-12-02 2021-12-02 Electrostatic nanoparticles and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230117186A true KR20230117186A (ko) 2023-08-07

Family

ID=79021835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237022270A KR20230117186A (ko) 2020-12-02 2021-12-02 정전기 나노입자 및 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240024500A1 (ko)
EP (1) EP4255496A1 (ko)
JP (1) JP2023553038A (ko)
KR (1) KR20230117186A (ko)
AU (1) AU2021392981A1 (ko)
CA (1) CA3198298A1 (ko)
MX (1) MX2023006487A (ko)
WO (1) WO2022117731A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
LU92353A1 (en) 2014-01-14 2015-07-15 Univ Muenster Wilhelms Antibody-mediated delivery of RNAI

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023006487A (es) 2023-07-20
CA3198298A1 (en) 2022-06-09
WO2022117731A1 (en) 2022-06-09
AU2021392981A9 (en) 2024-06-27
US20240024500A1 (en) 2024-01-25
AU2021392981A1 (en) 2023-06-22
JP2023553038A (ja) 2023-12-20
WO2022117731A9 (en) 2024-05-16
EP4255496A1 (en) 2023-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2952017T3 (es) Conjugado de anticuerpo-oligonucleótido mejorado
CN110913903B (zh) 聚糖相互作用化合物和使用方法
JP2021102648A (ja) 抗ｆｏｌｒ１免疫複合体投与計画
CA2979895A1 (en) Conjugates for the treatment of cancer targeted at intracellular tumor-associated antigens
JP7177131B2 (ja) アポトーシスを誘導するための組成物及び方法
Parker et al. Pretargeted delivery of PEG-coated drug carriers to breast tumors using multivalent, bispecific antibody against polyethylene glycol and HER2
JP2022547434A (ja) 標的化デンドリマー複合体
Lucas et al. Importance and considerations of antibody engineering in antibody-drug conjugates development from a clinical pharmacologist’s perspective
Weber et al. A Humanized Anti‐CD22‐Onconase Antibody‐Drug Conjugate Mediates Highly Potent Destruction of Targeted Tumor Cells
KR20210099660A (ko) 절단가능 링커를 포함하는 화합물 및 이의 용도
EP3471740A1 (en) Compositions and methods for using albumin-based nanomedicines
Choi et al. Complexation of drug and hapten-conjugated aptamer with universal hapten antibody for pancreatic cancer treatment
CN112105643A (zh) 治疗性抗体及其应用
US20240024500A1 (en) Electrostatic nanoparticles and use thereof
US20230233699A1 (en) Oligonucleotide conjugates and preparation and applications thereof
EP4340889A1 (en) Antibody-protamine fusions as targeting compounds of a protamine-based nanoparticle
WO2022178751A1 (en) Targeting conjugates comprising effector molecules and uses thereof
CN116801909A (zh) 静电纳米颗粒及其用途
LU92353A1 (en) Antibody-mediated delivery of RNAI
WO2022205316A1 (en) Targeting conjugates comprising effector molecules and uses thereof
KR20220148235A (ko) 최적화된 약물 접합을 위한 변형된 결합 폴리펩티드
CA3209753A1 (en) Targeting conjugates comprising effector molecules and uses thereof
Glatt Monoclonal antibody-mediated tumor targeting and drug delivery to solid tumors
WO2023121447A1 (en) Conjugate of a single domain antibody, a saponin and an effector molecule, pharmaceutical composition comprising the same, therapeutic use of said pharmaceutical composition
Shin A Proof-of-Concept Investigation of CPP-Modified ATTEMPTS for Enhanced Toxin-Based Colorectal Cancer Therapy.