CN112105643A - 治疗性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对CD44基因(CD44v6或CD44v9)的变体外显子v6或v9中的表位具有特异性的抗体或其抗原结合片段，其抗体药物偶联物(ADC)，以及包含抗体或其抗原结合片段的其他衍生物。本发明还提供了编码该保护客体(抗体或其抗原结合片段，其抗体药物偶联物(ADC)，以及包含抗体或其抗原结合片段的其他衍生物)的核酸分子及其制备方法。本发明进一步提供了包含该保护客体的药物组合物，以及其在治疗疾病或在制备用于治疗疾病(如癌症)的药物中的应用。

Description

治疗性抗体及其应用
背景技术
CD44是涉及同型细胞、细胞-基质和细胞-细胞骨架相互作用的跨膜糖蛋白家族。CD44的细胞外结构域结合了许多基质取代基：透明质酸、埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)、膜突蛋白(moesin)和分生蛋白(merlin)、肝素亲和生长因子、血管内皮生长因子、p185HER2、表皮生长因子和肝细胞生长因子。其胞内结构域与细胞骨架取代基锚蛋白结合，从而决定细胞和组织的结构形式(Bourguignon et al.,1998,Front.Biosci.3:D637-649；Welch et al.,1995,J.Cell.Physiol.164:605-612)。
CD44基因定位于11号染色体，包含20个外显子，跨度为60kb，可细分为5个结构域。20个外显子中的10个，外显子1-5和16-20，构成了CD44(CD44s或CD44std)的标准形式。尽管这种最小的CD44亚型(CD44s)在包括上皮细胞的不同组织中普遍表达，但某些CD44剪接变体(CD44v，CD44var)仅在上皮细胞的一个子集中表达。
CD44变体是在信使核糖核酸(mRNA)水平上通过选择性剪接产生的，其方式是蛋白质的细胞外部分的十个外显子(v1-v10)的序列在CD44s中被完全切除，但可以在不同组合的较大变体中出现(Screaton et al.,1992；
Figure BDA0002677076120000011
et al.,1993；Hofmann et al.,1991)。所述变体的不同之处在于不同的氨基酸序列被插入到蛋白质的细胞外部分的某个特定位点。理论上，CD44变体(CD44v)亚型有超过1000种潜在的肽域组合。所有变体的外显子的内含物将产生分子量为230kD的蛋白质，但是大部分变体的亚型小于120kD。变体亚型(CD44v1-10)包括一个或多个拼接的外显子6-15，虽然在人体中，但是外显子6(v1)并未表达。
一些剪接变体由正常上皮细胞以组织特异性方式表达。例如，CD44v10由正常淋巴细胞表达(Okamoto et al.,1998,J.Natl.Cancer Inst.90:307-315)。
然而，最近已经表明，某些CD44变体的表达对于引起非转移性大鼠胰腺腺癌细胞系和非转移性大鼠纤维肉瘤细胞系的所谓自发转移行为是必要的和充分的(Günthert etal.,1991)。所述变体可以在多种人类肿瘤细胞以及人类肿瘤组织中检测到。
例如，Okamoto等人(Okamoto et al.,2002,Am.J.Pathol.160:441-447；Okamotoet al.,2001,J.Cell.Biol.155:755-762；Murakami et al.,2003,Oncogene 22:1511-1516)已经表明，在几种人类肿瘤(不包括前列腺癌)中，25-30kD的裂解产物可通过使用抗CD44细胞质部分的抗体的免疫印迹(Western blot)检测到。CD44的可溶部分在血清中被检测为100-160-kD片段，所述检测方法为使用抗CD44v单克隆抗体对分子的细胞外部分进行检测(Gansauge et al.,1997,Cancer 80:1733-1739)。流入循环的CD44亚型的免疫印迹检测可作为恶性肿瘤的诊断检测或预后检测(Taylor et al.,1996,J.Soc.Gynecol.Invest.3:289-294)。然后可以开发一种酶联血清免疫测定法(ELISA)，用于灵敏、简便的进行蛋白质检测。CD44v6的扩增与胰腺癌的转移表型(Rall and Rustgi,1995,Cancer Res.55:1831-1835)和乳腺癌增加的等级有关(Woodman et al.,1996,Am.J.Pathol.149:1519-1530；Bourguignon et al.,1999,Cell Motil.Cytoskeleton 43:269-287)。在许多良性肿瘤和癌症组织中的单个或连续变体外显子的内含物通过RT-PCR和测序技术进行描述(Okamoto et al.,1998,J.Natl.Cancer Inst.90:307-315；Okamoto etal.,2002,Am.J.Pathol.160:441-447；Rall and Rustgi,1995,Cancer Res.55:1831-1835；Woodman,et al.,1996,Am.J.Pathol.149:1519-1530；Bourguignon et al.,1999,Cell Motil.Cytoskeleton 43:269-287；Roca et al.,1998,Am.J.Pathol.153:183-190；Franzmann et al.,2001,Otolaryngol.Head Neck Surg.124:426-432；Terpe et al.,1996,Am.J.Pathol.148:453-463；Christ et al.,2001,J.Leukoc.Biol.69:343-352；Mortegani et al.,1999,Am.J.Pathol.154:291-300；Miyake et al.,1998,Int.J.Cancer.18:560-564；Yamaguchi et al.,1996,J.Clin.Oncol.14:1122-1127)。
在转移过程中，肿瘤细胞脱离原发部位，迁移到细胞外基质中，并侵入血管和淋巴管。转移部位的肿瘤生长需要通过黏附蛋白(如CD44)附着到新的细胞外基质上。这与许多癌症已经解除了对CD44基因剪接的管制，导致可能在转移中起一定作用的新CD44变体亚型的表达这一事实相一致。
事实上，最近已经研究了结直肠癌发生期间CD44变体的表达(Heider et al.,1993a)。CD44变体的在正常人结肠上皮中不表达，并且在隐窝的增殖细胞中仅检测到了弱表达。在肿瘤发展的后期，例如在腺癌中，所有的恶性肿瘤都表达CD44的变体。CD44变体的高水平组织表达也显示在侵袭性非霍奇金淋巴瘤中(Koopman et al.,1993)。
外显子v6似乎起着特殊的作用，尤其是在转移扩散的过程中(Rudy et al.,1993)。在动物模型中，针对v6特异性表位的抗体可以阻止转移细胞的沉降和转移的生长(Seiter et al.,1993)。在结肠癌中，v6表达与肿瘤进展相关(Wielenga et al.,1993)。在胃癌中，v6表达是区分肠型肿瘤和弥漫型肿瘤的重要诊断标志(Heider et al.,1993b)。在后两个出版物中，使用针对v6特异性表位的抗体测定了v6的表达。
因为CD44v6已被证明是在人体肿瘤和正常组织中具有良好表达模式的肿瘤相关抗原(Heider et al.,1995；Heider et al.,1996)，因此其已经应用于基于抗体的诊断性和治疗性方法中(Heider et al.,1996；WO 95/33771；WO 97/21104)。
另一方面，CD44v9的异常表达已被证明与胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌和头颈部鳞状细胞癌有关(US20170137810A1)。CD44v6和CD44v9在先均被证明在结肠癌中有过表达的情况(Wielenga et al.,Am.J.Pathol.,1999,154:515-523)。还发现CD44v9在胃癌中也有过表达的情况(Ue et al.,Co-expression of osteopontin and CD44v9 in gastriccancer.Int J Cancer 1998；79:127-132)。
CD44v9阳性细胞显示出增强的抑制活性氧(ROS)生成的能力，导致随后的治疗抗性、肿瘤复发和转移(Ishimoto et al,2011；Tsugawaet al,2012；Yae et al,2012)。还有报道称，CD44v9是多种肿瘤类型中的肿瘤干细胞标志物(Aso et al.,2015)。
将非人抗体用于人类时出现的一个严重问题是，其会迅速引起人对非人抗体的反应，从而降低抗体在患者中的功效并损害持续给药。为了解决这个问题，本领域已经发展出了“人源化(humanising)”非人抗体的概念。在第一种方法中，已经尝试通过构建非人/人嵌合抗体来实现非人抗体的人源化，其中非人可变区与人恒定区连接到一起(BoulianneG.L.,Hozumi N.and Shulman,M.J.(1984)Production of functional chimeric mouse/human antibody Nature 312:643)。由此产生的嵌合抗体保留了原始非人抗体的结合特异性和亲和力。
然而，虽然嵌合抗体明显优于小鼠抗体，但其仍能在人体内引起抗嵌合反应(LoBuglio A.F.,Wheeler R.H.,Trang J.,Haynes A.,Rogers K.,Harvey E.B.,Sun L.,Ghrayeb J.and Khazaeli M.B.(1989)Mouse/human chimeric monoclonal antibody inman:Kinetics and immune response.Proc.Natl.Acad.Sci.86:4220)。这种方法随后得到了改进，通过将非人类可变区的互补决定区(CDRs)移植到人类可变区，然后将这些“重塑的人类”可变区连接到人类恒定区，进一步减少了非人类序列的数量(Riechmann L.,ClarkM.,Waldmann H.and Winter G.(1988)Reshaping human antibodies fortherapy.Nature 332:323)。CDR移植或重塑的人抗体含有很少或不含可被鉴定为来自小鼠抗体的蛋白质序列。尽管通过CDR移植的人源化抗体可能仍然能够引发一些免疫反应，例如抗同种异型或抗独特型反应，正如天然的人抗体那样，但是CDR移植的抗体的免疫原性将明显低于小鼠抗体，因此使得对患者的治疗时间更长。
然而，很快就发现，单独的CDR移植并不总是能产生具有足够结合亲和力的抗体。与其亲本非人抗体相比，CDR移植抗体有时具有相对较差的结合特性，这是因为，例如，与CDR内的氨基酸相比，更多的氨基酸可能参与抗原的结合。因此，结合亲和力差的CDR移植抗体在治疗中被认为是无用的。因此，人们做了诸多尝试去创造结合CDR接枝抗体的低免疫原性和非人亲本抗体的良好结合特性的抗体。除了CDR-移植，还提出了如下概念：人源化框架区域中的一个到几个氨基酸必须作为啮齿动物供体来源的残基(用于保持亲和力)得以保留(Queen et al,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86:10029-10033)。
由于所述抗体在诊断和治疗中具有很高的潜在效用，因此需要适用于治疗人类疾病(比如各种癌症)的高性能抗体。
本发明的一个潜在问题是提供可替代CD44v6或CD44v9的特异性抗体，优选比已知的CD44v6或CD44v9特异性抗体具有更好性质的抗体。
发明内容
本发明的一个方面提供了具有分离的CD44v6表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位包括SEQ ID NO:19/实质上由SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQ ID NO:19组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v6表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v6表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
在某些实施方式中，所述单克隆抗体包括：(1)重链可变区(HCVR)，其包括SEQ IDNO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVR CDR2序列和SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:10的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:11的LCVR CDR2序列和SEQ ID NO:12的LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，CD44v6表位是SEQ ID NO:19。
在某些实施方式中，CD44v6表位实质上由SEQ ID NO:19组成(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。
在某些实施方式中，CD44v6表位是SEQ ID NO:24(HEGYRQTPKEDS)。
在某些实施方式中，(i)所述HCVR进一步包含SEQ ID NOs:7-9中的一个或多个；和/或(ii)所述LCVR进一步包括SEQ ID NOs:13-18中的一个或多个。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v6表位或具有所述CD44v6表位的细胞结合，其KD为约10nM、约5nM或约2nM或更小。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。
在某些实施方式中，其抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在相关方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合到与参考单克隆抗体结合的CD44v6的相同表位上，或与所述参考单克隆抗体竞争结合到CD44v6的相同表位上，其中所述参考单克隆抗体包含:(1)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVRCDR2序列和/或SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:10的LCVRCDR1序列、SEQ ID NO:11的LCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:12的LCVR CDR3序列。
本发明的另一个方面提供了具有对分离的CD44v9表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位包括SEQ ID NO:43/实质上由SEQ ID NO:43(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ IDNO:43的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQ ID NO:43组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v9表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v9表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
在某些实施方式中，所述单克隆抗体包括：(1)重链可变区(HCVR)，其包括SEQ IDNO:25的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:26的HCVR CDR2序列和SEQ ID NO:27的HCVR CDR3序列；(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:34的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:35的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:36的LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，CD44v9表位是SEQ ID NO:43。
在某些实施方式中，CD44v9表位实质上由SEQ ID NO:43组成(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。
在某些实施方式中，CD44v9表位是SEQ ID NO:44(SHEGLEEDKDH)。
在某些实施方式中，(i)所述HCVR进一步包含SEQ ID NOs:28-33中的一个或多个；和/或(ii)所述LCVR进一步包括SEQ ID NOs:37-42中的一个或多个。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v9表位或具有所述CD44v9表位的细胞结合，其KD为约10nM、约5nM、约2nM、约1nM或更小。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。
在某些实施方式中，其抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在相关方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合到与参考单克隆抗体结合的CD44v9的相同表位上，或与所述参考单克隆抗体竞争结合到CD44v9的相同表位上，其中所述参考单克隆抗体包含:(1)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:25的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:26的HCVRCDR2序列和/或SEQ ID NO:27的HCVR CDR3序列；(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:34的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:35的LCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:36的LCVR CDR3序列。
本发明的另一方面提供了一种多肽，其包含任意的主题抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段的HCVR和/或LCVR。
在某些实施方式中，所述多肽是融合蛋白(如嵌合抗原T细胞受体)。
本发明的另一方面提供了编码任一主题多肽的多核苷酸。
本发明的另一方面提供了包含任一主题多核苷酸的载体。
在某些实施方式中，所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
本发明的另一方面提供了一种细胞，其包含任意的主题抗CD44v6或抗CD44v9的抗体或其抗原结合片段、任意的主题多肽、任意的主题多核苷酸或任意的主题载体。
在某些实施方式中，所述细胞表达任意的主题抗体或其抗原结合片段，或任意的主题多肽。
在某些实施方式中，所述细胞是BHK细胞、CHO细胞或COS细胞。
在某些实施方式中，所述细胞在细胞表面包含任意的主题抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或任意的主题多肽。
在某些实施方式中，所述细胞是携带嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T cell)，所述嵌合抗原受体包含任意的主题抗体或其抗原结合片段，或任意的主题多肽。
本发明的另一个方面提供了一种分离的CD44v6表位，其包括SEQ ID NO:19/实质上由SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或由SEQ ID NO:19组成。
本发明的另一方面提供了融合蛋白或化学偶联物，其包含权利要求28中的分离的CD44v6表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
本发明的另一方面提供了一种分离的CD44v9表位，其包括SEQ ID NO:43/实质上由SEQ ID NO:43(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ IDNO:43加上SEQ ID NO:43的C端上的1或2个残基，或SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或由SEQ ID NO:43组成。
本发明的另一方面提供了融合蛋白或化学偶联物，其包含权利要求28a中的分离的CD44v9表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
本发明的另一方面提供了一种产生任意的主题抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段或任意的主题多肽的方法，包括：(a)培养任意受试细胞；和(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
在某些实施方式中，所述细胞是真核细胞。
本发明的另一个方面提供了具有下述分子式的免疫偶联物(或抗体-药物偶联物或ADC):Ab-[-L-D]n，其中：Ab是任意的主题抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其任意的主题多肽，其共价连接到一个或多个接头-药物部分-[-L-D]单元，其中L是接头，而D是细胞毒性药物；并且，n是从1到20的整数(例如，从1到12)；并且其中每个接头-药物部分可以具有相同或不同的接头L或细胞毒性药物D。
在某些实施方式中，每个接头-药物部分-[-L-D]通过赖氨酸(Lys)的侧链氨基与Ab共价连接。
在某些实施方式中，每个接头-药物部分-[-L-D]通过半胱氨酸(Cys)的侧链巯基与Ab共价连接。
在某些实施方式中，每个接头-药物部分-[-L-D]通过位点特异性掺入的非天然氨基酸与Ab共价连接。
在某些实施方式中，每个接头L包含一个肽单元。
在某些实施方式中，所述肽单元包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、2-10或2-5个氨基酸残基。
在某些实施方式中，接头L不可被蛋白酶(例如组织蛋白酶)裂解。
在某些实施方式中，接头L是可被蛋白酶(例如，组织蛋白酶)、酸性环境或氧化还原状态变化裂解的可裂解接头。
在某些实施方式中，所述细胞毒性药物是DNA嵌入剂、微管结合剂、拓扑异构酶I抑制剂或DNA小沟结合剂。
在某些实施方式中，所述细胞毒性药物是澳瑞他汀类(auristatin class)如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，美登素类(maytansine class)如DM-1、DM-3、DM-4，刺孢霉素(calicheamicin)如奥加米星(ozogamicin)、SN-38或PBD(吡咯并苯二氮卓)。
本发明的另一个方面提供了一种药物组合物，其包含任意的主题抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的另一方面提供了一种抑制表达CD44v6的细胞生长的方法，包括将该细胞与任意的主题抗CD44v6抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物进行接触。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自肺癌(如NSCLC(非小细胞肺癌))。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自结肠直肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
本发明的另一方面提供了一种抑制表达CD44v9的细胞生长的方法，包括将该细胞与任意的主题抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物进行接触。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6，所述方法包括给受试者施用有效治疗剂量的CD44v6拮抗剂，所述拮抗剂包含CD44v6抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面提供了一种用于治疗受试者中的细胞增值紊乱的方法，其中所述细胞增殖紊乱的细胞表达CD44v6，所述方法包括给受试者施用有效治疗剂量的CD44v6拮抗剂，所述CD44v6拮抗剂包含CD44v 6抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，CD44v6的拮抗剂包含任意的主题抗CD44v6抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，所述癌症包括如下来源：乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺或肾；是骨和软组织肉瘤，比如骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、平滑肌肉瘤；是造血系统恶性肿瘤，比如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病；是神经外胚层肿瘤，比如周围神经肿瘤、星形细胞瘤或黑色素瘤；或者是间皮瘤。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v9，所述方法包括给所述受试者施用有效治疗剂量的CD44v9拮抗剂，所述拮抗剂包含CD44v9抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面提供了一种用于治疗受试者的细胞增值紊乱的方法，其中所述细胞增殖紊乱的细胞表达CD44v9，所述方法包括给所述受试者施用有效治疗剂量的CD44v9拮抗剂，所述CD44v9拮抗剂包含CD44v 9抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，CD44v9的拮抗剂包含任意的主题抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，所述癌症包括如下来源：乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺或肾；是骨和软组织肉瘤，比如骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤；是造血系统恶性肿瘤，比如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病；是神经外胚层肿瘤，比如周围神经肿瘤、星形细胞瘤或黑色素瘤；或者是间皮瘤。
本发明的另一方面提供了一种确定来自受试者的样品中CD44v6的存在和/或丰度的方法，所述方法包括将样品与任意的主题抗CD44v6抗体或其抗原结合片段接触。
本发明的另一方面提供了一种确定来自受试者的样品中CD44v9的存在和/或丰度的方法，所述方法包括将样品与任意的主题抗CD44v9抗体或其抗原结合片段接触。
本发明的另一方面提供了一种诊断和治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6，所述方法包括：(1)使用所述主题方法来确定来自所述受试者的癌症样品中CD44v6的存在和/或丰度，以鉴定所述癌症样品中表达CD44v6的主体；(2)给所述受试者施用有效治疗剂量的任意的主题抗CD44v6抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物，从而诊断和治疗患有癌症的受试者。
本发明的另一方面提供了一种诊断和治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v9，所述方法包括：(1)使用所述主题方法来确定来自所述受试者的癌症样品中CD44v9的存在和/或丰度，以鉴定所述癌症样品中表达CD44v9的主体；(2)给所述受试者施用有效治疗剂量的任意的主题抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物，从而诊断和治疗患有癌症的受试者。
应当理解的是，本文中描述的任何实施方式，包括仅在实施例中描述的那些和仅在本发明的一个方面下描述的那些，可以与一个或多个其他实施方式组合，除非明确否认不能组合或不适宜组合。
附图说明
图1A是用于分离CD44v6或CD44v9单克隆抗体mAb119或mAb116的活细胞超大规模单抗芯片(MabArray)的示意图。具体的，使用Arrayjet打印机将约6×104种不同的单克隆抗体(mAbs)打印至玻璃醛芯片上(75×25mm)以生成MabArray。随后在实验开始前，用10％牛血清白蛋白(BSA)将MabArray芯片封闭过夜。采用绿色荧光核酸染色剂SYTO14(ThermoFisher Science)对肺癌细胞系PC9活细胞进行标记，并以1×107细胞/ml的密度与芯片在PBS中孵育1h。随后，采用PBS温和洗涤MabArray芯片并用Genepix扫描仪进行扫描。
图1B示出了4个独立的PC9活细胞MabArray实验组中的mAb119和对照组mAb的图像。活的PC9细胞被MabArray芯片上的mAb119捕获。
图2示出了PC9细胞上mAb119的FACs分析结果。mAb119的PC9 FACs滴定是通过将PC9细胞与mAb119的连续稀释液(30000pM-0.1pM，3倍连续稀释液)在冰上孵育30min来进行的，然后采用Alexa-488偶联的抗小鼠IgG(Jackson lab)对细胞染色30min。采用BD C6对MFI进行分析。亲和力KD被测定为约2nM。
图3示出了PC9细胞内化结合的mAb119。在盖玻片上培养PC9活细胞，并与10μg/ml的mAb119在冰上孵育1h，然后用PBS洗涤细胞3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定，然后通过FACs用二级抗体偶联的FITC进行检测。然后用mAb119(用绿色荧光染料Alexa488标记)和抗LAMP1(用红色荧光染料Alexa595标记)对PC9细胞进行共染色。具体而言，PC9细胞采用0.1％TritonX渗透，并与mAb119和兔抗LAMP1抗体(1:200，Abcam)以及mAb119一起孵育1h。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体和Alexa595偶联的抗兔抗体分别标记抗体。溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)是一种主要通过溶酶体膜表达的糖蛋白。mAb119和抗LAMP1信号的共定位产生黄色信号，表明PC9细胞将mAb119内化至溶酶体区室。在0h时，在细胞表面首次观察到mAb119，其并未与LAMP1共定位。在2h和4h时，观察到mAb119和LAMP1的共定位。
基于表面荧光的流式细胞分析(FACs)显示mAb119在PC9细胞上内化(数据未显示)。具体来说，将PC9活细胞与10μg/ml的mAb119在冰上孵育0.5h，用PBS洗涤3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体对细胞进行染色，并通过计算表面MFI用流式细胞仪进行分析。表面MFI表征了mAb119的表面共定位情况，在37℃孵育2h和4h后，表面MFI分别降低了70％和80％。显示的是FACs数据的量化，表示为PC9细胞内化的平均百分比±SEM(n＝3)。纵轴表示相对表面荧光度(％)。数据表明，mAb119可以结合膜抗原，并在PC9细胞内化。
图4示出了mAb119的间接细胞毒性是抗原表达依赖性的。PC9或TE1细胞在96孔板中以2000细胞/孔的密度融合培养过夜，细胞用mAb119和2μg/mlMMAE偶联的山羊抗小鼠抗体连续稀释液处理72h，然后通过CCK8(dojindo)计算细胞数。在TE1和PC9细胞中观察到不同的细胞毒性。抗体混合物抑制PC9生长，所述混合物中IC50的浓度为18pM，而同样的抗体混合物并未抑制TE1细胞生长。显示的是来自TE1和PC9细胞的代表性数据，表示为平均生长抑制百分比±SEM(n＝3)。
mAb119抗原在两种细胞系中的表达也通过流式细胞仪测定。侧面的嵌入图显示了由mAb119标记的TE1(顶部图)和PC9(底部图)的FACs分析结果。结果表明表达mAb119抗原的是PC9细胞而非TE1细胞。因此间接细胞毒性与抗原表达呈正相关。
图5A和5B示出了mAb119靶向的人的CD44v6外显子。PC9被靶向人CD v6表位或对照siRNA的4种不同siRNA的混合物转染48h。然后转染细胞用mAb119染色或者用流式细胞仪(FACs)分析，或者提取总蛋白并用蛋白质印迹法评估mAb119抗原的丰度。CD44v6的敲除降低了FACs中mAb119的表面染色强度(图5A，FACs数据显示CD44v 6siRNA(V6.si)抑制了mAb119的表面信号(代表n＝3))。CD44v6的敲除也降低了mAb119抗原的蛋白表达水平(图5B，蛋白质印迹数据显示CD44v6 siRNA(V6.si)抑制了mAb119抗原的蛋白表达(代表n＝3))。数据表明，mAb119靶向CD44v6。
图6A是mAb119-ADC(AMT119)的结构示意图。mAb119与MC-vc-PAB-MMAE偶联。
图6B是AMT119的高效液相色谱-疏水性相互作用色谱图。平均药物抗体比(DAR)约为6。
图7示出了AMT119在PC9和TE1细胞中的细胞毒性。图中是从PC9和TE1细胞获得的代表性数据，显示了AMT119的平均生长抑制百分比±SEM(n＝3)。PC9和TE1细胞的IC50值分别为2,600pM和39,000pM。这种差异与CD44v6在两种细胞系中的不同表达水平一致(见图4)。
图8A和8B示出了CD44v6在人非小细胞肺癌(NSCLC，图8A的右图)和正常肺组织(图8A的左图)中的表达情况。使用mAb119抗体从一系列正常和癌症组织中显示出了CD44v6蛋白的IHC(免疫组织化学)检测，其中显示了CD44v6以肿瘤特异性方式上调。显微照片图像描绘了代表0、1+、2+和3+染色强度的肿瘤组织(图8A的右图)。图8B显示CD44v6在非小细胞肺癌不同亚型中的患病率。其中，SCC，鳞状细胞癌；LCC，大细胞癌。
图9示出了PC9细胞上mAb116的FACs分析结果。mAb116的PC9 FACs滴定是通过将PC9细胞与mAb116的连续稀释液(30000pM-0.1pM，3倍连续稀释液)在冰上孵育30min来进行的，然后采用Alexa488偶联的抗小鼠IgG(Jackson lab)对细胞染色30min。使用BD C6对MFI进行分析。亲和力KD被测定为约980pM(或0.98nM)。
图10示出了PC9细胞内化结合的mAb116。在盖玻片上培养PC活细胞，并与10μg/ml的mAb116在冰上孵育1h，然后用PBS洗涤细胞3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定，然后通过FACs用二级抗体偶联的FITC进行检测。然后用mAb116(用绿色荧光染料Alexa488标记)和抗LAMP1(用红色荧光染料Alexa595标记)对PC9细胞进行共染色。具体而言，PC9细胞采用0.1％Triton X渗透，并与mAb116和兔抗LAMP1抗体(1:200，Abcam)以及mAb116一起孵育1h。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体和Alexa595偶联的抗兔抗体分别标记抗体。mAb116和抗LAMP1信号的共定位产生黄色信号，表明PC9细胞将mAb116内化至溶酶体区室。在0h时，在细胞表面首次观察到mAb116，其并未与LAMP1共定位。在2h和4h时，观察到mAb119和LAMP1的共定位。
基于表面荧光的流式细胞分析(FACs)显示mAb116在PC9细胞上内化(数据未显示)。具体来说，将PC9活细胞与10μg/ml的mAb116在冰上孵育0.5h，用PBS洗涤3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体对细胞进行染色，并通过计算表面MFI用流式细胞仪进行分析。表面MFI表征了mAb116的表面共定位情况，在37℃孵育4h后，表面MFI降低了约90％。显示的是FACs数据的量化，表示为PC9细胞内化的平均百分比±SEM(n＝3)。纵轴表示相对表面荧光度(MFI，％)。数据表明，mAb116可以结合膜抗原，并在PC9细胞内化。
图11示出了mAb116和对照IgG的间接细胞毒性。PC9细胞在96孔板中以2000细胞/孔的密度融合培养过夜，然后用mAb116或IgG的连续稀释液与2μg/ml MMAE偶联的山羊抗小鼠IgG抗体一起处理细胞72h，然后通过CCK8(dojindo)计算细胞数。mAb116抗体混合物抑制了PC9的生长，所述混合物中IC50的浓度为30pM，但IgG混合物并未产生任何影响。显示的是来自于PC9细胞的代表性数据，表示为平均生长抑制百分比±SEM(n＝3)。
图12A和12B示出了mAb116靶向的人的CD44 v9外显子。PC9被靶向人CD44 v9表位或对照siRNA的siRNA转染48h。然后转染细胞用mAb116染色或者用流式细胞仪(FACs)分析，或者提取总蛋白并用蛋白质印迹法评估mAb116抗原的丰度。CD44v9的敲除降低了FACs中mAb116的表面染色强度(图12A，FACs数据显示CD44v9 siRNA(V9.si)抑制了mAb116的表面信号(代表n＝3)。CD44v9的敲除也降低了mAb116抗原的蛋白表达水平(图12B)。数据表明，mAb116靶向CD44v9。
图13A是mAb116-ADC(AMT116)的结构示意图。mAb116与MC-vc-PAB-MMAE偶联。
图13B是AMT116的高效液相色谱-疏水性相互作用色谱图。平均药物抗体比(DAR)约为4.23。
图14示出了AMT116在PC9和KYSE-150(食管癌细胞系)细胞中的细胞毒性。图中是从PC9和KYSE-150细胞获得的代表性数据，其中显示了AMT116和IgG对照(n＝3)的平均生长抑制百分比±SEM。AMT116在PC9和KYSE-150细胞中的IC50值分别为134pM和670.2pM。
图15示出了AMT116的体内功效。将约5×106个KYSE-150细胞悬浮于1:1基质胶中，然后将其注射至雌性Balb/c裸鼠(8-10周，20-22g)的右侧腋下。肿瘤体积(以0.5×长度×宽度2的方式测定)和体重每周至少测定两次。小鼠基于给药前的初始肿瘤大小(平均肿瘤体积为约250-500mm3)进行随机分组(n＝5/组)。通过静脉输注(3mg/kg，q3d×3)施用载体(PBS)、AMT116或对照抗体药物偶联物(ADC)。绘制整个研究期间的组平均肿瘤体积图。
图16A和16B示出了CD44v9在人非小细胞肺癌(图16A的右图)和正常肺组织(图16A的左图)中的表达。使用mAb116抗体从一系列正常和癌症组织中显示了CD44v9蛋白的IHC检测，其中显示了CD44v9以肿瘤特异性方式上调。显微照片图像描绘了代表0、1+、2+和3+染色强度的肿瘤组织(图16A的右图)。图16B显示CD44v9在非小细胞肺癌不同亚型中的患病率。其中，SCC，鳞状细胞癌；LCC，大细胞癌。
图17示出了CD44v9在多种肿瘤细胞类型中的过表达情况。使用mAb116抗体从一系列正常和癌症组织中显示了CD44v9蛋白的IHC检测，其中显示了CD44v9以肿瘤特异性方式上调。
具体实施方式
1.概述
本文所述的发明部分基于如下发现：某些抗CD44v6或抗CD44v9抗体，比如本文所述的抗体，可有效治疗疾病(如癌症)。
因此，本发明的一个方面提供了对分离的CD44v6表位具有特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位:(1)包含/实质上包含SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端的1或2个残基，或者SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)，或者(2)由SEQ ID NO:19组成。
例如，根据本领域已知的方法(见下文)，本发明的抗体或抗原结合片段可针对分离的CD44v6表位，或针对包含所述分离的CD44v6表位和载体蛋白的融合蛋白或其化学偶联物。
在某些实施方式中，抗CD44v6单克隆抗体包含:(1)重链可变区(HCVR)，其包含SEQID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；和/或(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:10的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:11的LCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:12的LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，CD44v6表位是SEQ ID NO:19。
在某些实施方式中，CD44v6表位实质上包含SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。SEQID NO:19的N端和/或C端添加的/额外的残基可以是天然存在于野生型CD44v6中的，也可以是人工的。
在某些实施方式中，CD44v6表位是SEQ ID NO:24(HEGYRQTPKEDS)。
在某些实施方式中，(i)所述重链可变区进一步包含SEQ ID NOs:7-9中的一个或多个；和/或(ii)所述轻链可变区进一步包含SEQ ID NOs:13-18中的一个或多个。
在某些实施方式中，分离的抗CD44v6单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v6表位或具有所述CD44v6表位的细胞结合，所述分离的抗CD44v6单克隆抗体或其抗原结合片段具有约10nM、约5nM或约2nM或更小的KD。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。
在某些实施方式中，其抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在相关方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合到与参考单克隆抗体结合的CD44v6的相同表位上，或与所述参考单克隆抗体竞争结合到CD44v6的相同表位上，其中所述参考单克隆抗体包含:(1)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVRCDR2序列和/或SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:10的LCVRCDR1序列、SEQ ID NO:11的LCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:12的LCVR CDR3序列。
本发明的另一个方面提供了对分离的CD44v9表位具有特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位:(1)包括/基本上由SEQ ID NO:43(例如，由SEQID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:43的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者(2)由SEQ ID NO:43组成。
在某些实施方式中，抗CD44v9抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v9表位，或针对包含所述分离的CD44v9表位和载体蛋白(如白蛋白，优选牛血清白蛋白或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))的融合蛋白或其化学偶联物。
在某些实施方式中，单克隆抗体包含:(1)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:25的HCVRCDR1序列、SEQ ID NO:26的HCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:27的HCVR CDR3序列；和/或(2)轻链可变区(LCVR)，包含SEQ ID NO:34的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:35的LCVRCDR2序列和/或SEQ ID NO:36的LCVR CDR3序列。
在某些实施方式中，CD44v9表位是SEQ ID NO:43。
在某些实施方式中，CD44v9表位实质上由SEQ ID NO:43组成(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的C端上的1或2个残基，或SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。SEQ ID NO:43的N端和/或C端添加的/额外的残基可以是天然存在于野生型CD44v9中的，也可以是人工的。
在某些实施方式中，CD44v9表位是SEQ ID NO:44(SHEGLEEDKDH)。
在某些实施方式中，(i)所述重链可变区进一步包含SEQ ID NOs:28-33中的一个或多个；和/或(ii)所述轻链可变区进一步包括SEQ ID NOs:37-42中的一个或多个。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v9表位或具有所述CD44v9表位的细胞结合，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段具有约10nM、约5nM、约2nM、约1nM或更小的KD。
在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。
在某些实施方式中，其抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在相关方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合到与参考单克隆抗体结合的CD44v9的相同表位上，或与所述参考单克隆抗体竞争结合到CD44v9的相同表位上，其中所述参考单克隆抗体包含:(1)重链可变区(HCVR)，其包含SEQ ID NO:25的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:26的HCVRCDR2序列和/或SEQ ID NO:27的HCVR CDR3序列；(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:34的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:35的LCVR CDR2序列和/或SEQ ID NO:36的LCVR CDR3序列。
本发明的另一方面提供了一种多肽，其包含任意主题抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段的HCVR和/或LCVR。
在某些实施方式中，所述多肽是融合蛋白(如嵌合抗原T细胞受体)。
嵌合抗原T细胞受体(CAR-T)也称为嵌合抗原受体(CAR)、嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体。其是一种将任意特异性移植到免疫效应T细胞上的工程受体。通常，这些受体被用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上，通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。所述受体被称为嵌合体，因为它们由不同来源的部分组成。CAR-T可通过过继细胞转移用于治疗癌症，其中从患者体内取出T细胞，并对其进行修饰，使其表达针对患者特定癌症的受体，如在癌细胞上表达的CD44v6或CD44v9。T细胞被重新引入病人体内然后可以识别并杀死癌细胞。来源于病人以外的供体的T细胞的修饰也可以以类似的方式使用。
在某些实施方式中，本发明的CAR-T是来源于任意受试单克隆抗CD44v6或抗CD44v9抗体的受试单链可变片段(scFv，即单链抗体)的融合体，其融合到跨膜结构域(例如CD3-ζ跨膜域)和内域(例如CD3-ζ内域)。
在某些实施方式中，scFv由信号肽引导，以将新生蛋白质导向内质网和随后的表面表达。可以使用任何真核生物信号肽序列。在某些实施方式中，使用天然连接到氨基末端的信号肽(例如，在具有轻链-接头-重链的定向单链抗体(scFv)中，使用了轻链的天然信号)。
在某些实施方式中，添加柔性间隔物以允许单链抗体在不同方向定向，从而实现最佳的抗原结合。所述间隔物优选足够柔韧，以允许抗原结合结构域定向于不同方向，从而促进抗原的识别。在某些实施方式中，来自IgG1的铰链区域被用作间隔物。在某些实施方式中，免疫球蛋白的CH2CH3区域和CD3部分被用作间隔物。对于大多数基于单链抗体的构建体，IgG1铰链用作间隔物通常就足够了。
在某些实施方式中，所述构建体包含跨膜区，该跨膜区是典型的疏水性α螺旋，其来源于突入细胞并传输所需信号的信号内域的原始分子。在某些实施方式中，采用了来自内域的最接近膜的近端组分的跨膜域，例如CD3-ζ跨膜域。
在某些实施方式中，内域是含有3个ITAMs的CD3-ζ内域，其在抗原被本发明的抗原结合片段结合后向T细胞传递激活信号。
在某些实施方式中，内域进一步包含来自共刺激蛋白受体(例如CD28，41BB，ICOS)的细胞内信号结构域，所述共刺激蛋白受体融合到构建体的细胞质尾部(CD3-ζ结构域的N-端或C-端)，以向T细胞提供附加信号。
在某些实施方式中，内域与多个信号结构域进行结合，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以增强效力，或传递增殖/存活信号。
在某些实施方式中，本发明的嵌合抗原受体进一步包含Strep-tag II序列(显示出对链霉亲和素的内在亲和力的八残基最小肽序列(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys))，以提供具有用于快速纯化的鉴定标记的工程T细胞。
本发明的另一方面提供了编码任何主题多肽的多核苷酸。
本发明的另一方面提供了包含任何主题多核苷酸的载体。
在某些实施方式中，所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
本发明的另一方面提供了一种细胞，其包含任意受试抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段、任意受试多肽、任意受试多核苷酸或任意受试载体。
在某些实施方式中，细胞表达任意受试抗体或其抗原结合片段，或任意受试多肽。
在某些实施方式中，细胞是BHK细胞、CHO细胞或COS细胞。
在某些实施方式中，细胞在细胞表面包含任意受试抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或任意受试多肽。
在某些实施方式中，所述细胞是携带嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T cell)，所述嵌合抗原受体包含任意受试抗体或其抗原结合片段，或任意受试多肽。
在某些实施方式中，病毒载体如逆转录病毒、慢病毒或转座子可用于将携带受试CAR-T构建体的转基因整合至宿主细胞基因组中。
在某些实施方式中，非整合载体或游离基因的DNA/RNA构建体，如质粒或mRNA，可以被替换使用。
在某些实施方式中，稳定保持在T细胞中而不被整合到基因组中的载体用于实现长期转基因表达，而没有插入突变或遗传毒性的风险。
本发明的另一方面提供了一种分离的CD44v6表位，其包括/实质上由SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQID NO:19的C端上的1或2个残基，或SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或由SEQ ID NO:19组成。
本发明的另一方面提供了一种融合蛋白或化学偶联物，其包含分离的CD44v6表位(权利要求28中)和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
本发明的另一方面提供了一种分离的CD44v9表位，其包括/实质上由SEQ ID NO:43(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:43加上SEQID NO:43的C端上的1或2个残基，或SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或由SEQ ID NO:43组成。
本发明的另一方面提供了一种融合蛋白或化学偶联物，其包含分离的CD44v9表位(权利要求28a中)和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
本领域公知的，载体蛋白是用于与肽或其他半抗原偶联的任何蛋白，所述肽或半抗原本身较小或较简单，而不足以诱导免疫响应或产生抗体。所述载体蛋白，由于其大而复杂的特性，赋予了偶联的半抗原以免疫原性，使得半抗原和载体上的表位产生抗体。
许多蛋白质可以用作载体，并基于免疫原性、溶解性和有益官能团的可用性进行选择，通过这些官能团可以实现与半抗原的结合。在某些实施方式中，本发明中使用的载体蛋白是匙孔血蓝蛋白(KLH)或白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白。
可用于本发明的多种所述载体蛋白是市售的，例如Thermo Scientific ImjectMariculture Keyhole Limpet Hemocyanin(mcKLH)；Blue Carrier*Protein(一种纯化的海螺血蓝蛋白(CCH)制剂，具有与KLH大部分相同的免疫原性)；Thermo Scientific ImjectBSA(一种高度纯化的(即第五组分)牛血清白蛋白)；阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)(通过用过量的乙二胺修饰天然牛血清白蛋白制备，基本上用带正电荷的伯胺封端所有带负电荷的羧基，产生高正电荷的蛋白质(pI>11)，与天然牛血清白蛋白相比，其免疫原性显著增加)；和卵清蛋白。
本发明的CD44v6和CD44v9表位可以与载体蛋白融合，或者通过例如载体蛋白表面的一个或多个伯胺基团与载体蛋白化学偶联。
根据半抗原/表位上可用的官能团、所需半抗原/表位的方向和与载体的距离以及偶联(conjugation)对生物学和抗原性能的可能影响，有不同的方法将半抗原/肽表位与载体蛋白偶联。例如，具有伯胺(赖氨酸残基的N端和侧链)、羧基(天冬氨酸和谷氨酸的C端或侧链)和巯基(半胱氨酸残基的侧链)的表位可以成为用所述基团进行结合的目标。通常，载体蛋白中的许多伯胺常被用于通过交联剂对半抗原进行偶联。
在某些实施方式中，使用碳二亚胺交联剂EDC(即，通过羧基和胺交联的EDC偶联物)进行蛋白-质载体和肽-载体的偶联。
在某些实施方式中，蛋白质-载体和肽-载体的偶联使用马来酰亚胺偶联剂(巯基交联)进行。
在某些实施方式中，使用戊二醛偶联剂(胺-胺交联)进行蛋白质-载体和肽-载体的偶联。
本发明的另一方面提供了一种产生任意受试抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段或任意受试多肽的方法，包括：(a)培养任意受试细胞；和(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
在某些实施方式中，所述细胞是真核细胞。
本发明的另一个方面提供了具有下述分子式的免疫偶联物(或抗体-药物偶联物或ADC):Ab-[-L-D]n，其中：Ab是任意受试抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其任意受试多肽，其共价连接到一个或多个接头-药物部分-[-L-D]单元，其中L是接头，而D是细胞毒性药物；并且，n是从1到20的整数(例如，从1到12)；并且其中每个接头-药物部分可以具有相同或不同的接头L或细胞毒性药物D。
在某些实施方式中，每个接头-药物部分-[-L-D]通过赖氨酸(Lys)的侧链氨基与Ab共价连接。
在某些实施方式中，每个接头-药物部分-[-L-D]通过半胱氨酸(Cys)的侧链巯基与Ab共价连接。
在某些实施方式中，每个接头-药物部分-[-L-D]通过位点特异性掺入的非天然氨基酸与Ab共价连接。
在某些实施方式中，每个接头L包含一个肽单元。
在某些实施方式中，所述肽单元包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、2-10或2-5个氨基酸残基。
在某些实施方式中，接头L不可被蛋白酶(例如组织蛋白酶)裂解。
在某些实施方式中，接头L是可被蛋白酶(例如，组织蛋白酶)、酸性环境或氧化还原状态变化裂解的可裂解接头。
在某些实施方式中，所述细胞毒性药物是DNA嵌入剂、微管结合剂、拓扑异构酶I抑制剂或DNA小沟结合剂。
在某些实施方式中，所述细胞毒性药物是澳瑞他汀类(auristatin class)如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，美登素类(maytansine class)如DM-1、DM-3、DM-4，刺孢霉素(calicheamicin)如奥加米星(ozogamicin)、SN-38或PBD(吡咯并苯二氮卓)。
在一个相关的方面，所述D部分(细胞毒性药物D)本身不是药物分子，而是衔接分子(如FITC)，其可以被具有衔接分子特异性的通用型CAR-T紧密结合。根据本发明的这一方面，当与双特异性SMDC(小分子药物偶联物)衔接分子共同给药时，单个通用CAR-T型细胞可被用于治疗多种癌症，其中所述CAR-T细胞以极高亲和力与衔接分子(如FITC)进行结合。这些独特的双特异性衔接子由一个衔接分子(如FITC分子)和一个肿瘤归巢分子(如受试抗CD44v6或抗CD44v9抗体的抗原结合片段)构建而成，以精确地将通用型CAR-T细胞与癌细胞连接起来，从而引起局部的T细胞活化。抗肿瘤活性只有在通用型CAR-T细胞和正确的抗原特异性衔接分子同时存在时才能被诱导。抗肿瘤活性和毒性可以通过调节衔接分子的施用剂量来进一步控制。抗原异质性肿瘤的治疗可以通过施用所需抗原特异性衔接子的混合物来实现。
本发明的另一个方面提供了一种药物组合物，其包含任意受试抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的另一方面提供了一种抑制表达CD44v6的细胞生长的方法，包括将该细胞与任意受试抗CD44v6抗体或其抗原结合片段，或其受试多肽，或其受试免疫偶联物，或其受试药物组合物进行接触。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自肺癌(如NSCLC(非小细胞肺癌))。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自结肠直肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
本发明的另一方面提供了一种抑制表达CD44v9的细胞生长的方法，包括将该细胞与任意受试抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物进行接触。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方式中，所述肿瘤细胞来自肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC))。
在某些实施方式中，肿瘤细胞来自结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6，所述方法包括给受试者施用有效治疗剂量的CD44v6拮抗剂，所述拮抗剂包含CD44v6抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面提供了一种用于治疗受试者中的细胞增值紊乱的方法，其中所述细胞增殖紊乱的细胞表达CD44v6，所述方法包括给受试者施用有效治疗剂量的CD44v6拮抗剂，所述CD44v6拮抗剂包含CD44v 6抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，CD44v6的拮抗剂包含任意受试抗CD44v6抗体或其抗原结合片段，或其受试多肽，或其受试免疫偶联物，或其受试药物组合物。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，所述癌症包括如下来源：乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺或肾；是骨和软组织肉瘤，比如骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、平滑肌肉瘤；是造血系统恶性肿瘤，比如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病；是神经外胚层肿瘤，比如周围神经肿瘤、星形细胞瘤或黑色素瘤；或者是间皮瘤。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v9，所述方法包括给所述受试者施用有效治疗剂量的CD44v9拮抗剂，所述拮抗剂包含CD44v9抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面提供了一种用于治疗受试者的细胞增值紊乱的方法，其中所述细胞增殖紊乱的细胞表达CD44v9，所述方法包括给所述受试者施用有效治疗剂量的CD44v9拮抗剂，所述CD44v9拮抗剂包含CD44v 9抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，CD44v9的拮抗剂包含任意受试抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，所述癌症包括如下来源：乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺或肾；是骨和软组织肉瘤，比如骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤；是造血系统恶性肿瘤，比如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病；是神经外胚层肿瘤，比如周围神经肿瘤、星形细胞瘤或黑色素瘤；或者是间皮瘤。
本发明的另一方面提供了一种确定来自受试者的样品中CD44v6的存在和/或丰度的方法，所述方法包括将样品与任意受试抗CD44v6抗体或其抗原结合片段接触。
本发明的另一方面提供了一种确定来自受试者的样品中CD44v9的存在和/或丰度的方法，所述方法包括将样品与任意受试抗CD44v9抗体或其抗原结合片段接触。
本发明的另一方面提供了一种诊断和治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6，所述方法包括：(1)使用所述主题方法来确定来自所述受试者的癌症样品中CD44v6的存在和/或丰度，以鉴定所述癌症样品中表达CD44v6的主体；(2)给所述受试者施用有效治疗剂量的任意受试抗CD44v6抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物，从而诊断和治疗患有癌症的受试者。
本发明的另一方面提供了一种诊断和治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v9，所述方法包括：(1)使用所述主题方法来确定来自所述受试者的癌症样品中CD44v9的存在和/或丰度，以鉴定所述癌症样品中表达CD44v9的主体；(2)给所述受试者施用有效治疗剂量的任意受试抗CD44v9抗体或其抗原结合片段，或其多肽，或其免疫偶联物，或其药物组合物，从而诊断和治疗患有癌症的受试者。
在本发明上述已经简单进行描述的情况下，本发明的某些特定方面或者实施方式将在以下部分中进一步描述。
2.定义
术语“抗体”、“抗体分子”和“抗体蛋白”在本文中可互换使用并应被认为是等同的。它们包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子通过免疫球蛋白分子的轻链和/或重链可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶分子，所述靶分子例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合。如本文所用，术语“抗体”包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体，并且可以作为缩写包括抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体如双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出所需的生物活性即可。抗体可以是五大类免疫球蛋白中的任何一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种类型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于它们的重链恒定区(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的同一性。不同种类的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的，也可以与毒素、放射性同位素等其他分子结合。
在一些实施方式中，抗体是非天然存在的、重组产生的抗体。在一些实施方式中，抗体是从天然成分中纯化的。在一些实施方式中，抗体是重组产生的。在一些实施方式中，抗体由杂交瘤产生，或在抗体库中产生。
“单克隆抗体的互补决定区(CDRs)”应理解为根据Kabat(Kabat E.A.,Wu T.T.,Perry H.M.,GottesmanK.S.and Foeller C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest(5th Ed.).NIH Publication No.91-3242.U.S.Department ofHealth and Human Services,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,在此引入作为参考)结合Chothia和Lesk(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,在此引入作为参考)，参与特异性抗原结合的那些氨基酸序列。
如本文所用，术语“框架修饰”是指单个互补决定区周围可变区中单个或多个氨基酸的交换、缺失或添加。框架修饰可能对抗体蛋白的免疫原性、可生产性或结合特异性有影响。
本文所用的“抗原结合片段”、“抗原结合部分”或简称“片段”是指抗体分子的较短版本，即任何多肽子集，其特征在于其由比全长序列更短的核酸分子编码，但仍保留其抗体结合活性(例如，基本上相同的结合特异性，尽管用KD测量其结合亲和力可能稍差)。
这些术语指完整抗体的一部分，并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语抗体的“抗原结合片段”包括抗体的一个或多个片段，其保持着特异性结合抗原的能力。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的某些片段来实现。包含在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的例子包括(但不限于)：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段(例如，被木瓜蛋白酶分解的抗体产生三个片段：两个抗原结合Fab片段，和一个不结合抗原的Fc片段)；(ii)一个F(ab')2片段，一个包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接(例如，被胃蛋白酶分解的抗体产生两个片段：一个二价抗原结合的F(ab')2片段，和一个不结合抗原的pFc'片段)及其相关的F(ab')单价单位；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段(即包含在Fab中的重链部分)；(iv)由单臂抗体的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段，以及相关的二硫键连接的Fv；(v)dAb(结构域抗体)或sdAb(单结构域抗体)片段(Ward etal.,Nature 341:544-546,1989)，由一个VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。
生产抗体片段的各种技术是已知的。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化得到的(例如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117,1993；Brennan et al.,Science 229:81,1985)。在某些实施方式中，抗体片段是重组产生的。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达和分泌，从而允许这些片段大量生产。所述抗体片段也可以从抗体噬菌体文库中分离出来。抗体片段也可以是如美国专利5,641,870中所述的线性抗体，并且可以是单特异性或双特异性的。生产抗体片段的其他技术对于本领域技术人员来说是显而易见的。
“单克隆抗体”是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质抗体群体。其与多克隆抗体相反，多克隆抗体通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”包括完整的和全长的单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何方式制备的抗体，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体选择法、重组表达法和转基因动物法。
单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如Kohler andMilstein(1975)Nature256:495中描述的方法。使用杂交瘤方法，对小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞产生特异性结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，淋巴细胞被分离并与合适的骨髓瘤细胞系融合(使用例如聚乙二醇)，以形成杂交瘤细胞，然后可以将其从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选择出来。通过免疫沉淀，免疫印迹或通过体外结合测定法(例如，放射免疫测定法(RIA)；酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定产生特异性针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤。所述杂交瘤可以使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)在体外培养繁殖或在动物体内培养为腹水肿瘤。然后可以如关于多克隆抗体所述，从培养基或腹水中纯化单克隆抗体。
或者，也可以使用美国专利4,816,567中描述的重组DNA方法制备单克隆抗体。编码单克隆抗体的多核苷酸是从成熟的B细胞或杂交瘤细胞中分离出来的，例如通过使用寡核苷酸引物的RT-PCR技术，所述寡核苷酸引物对编码抗体重链和轻链的基因进行特异性扩增，并且使用常规方法确定其序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，当将其转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞等不产生免疫球蛋白的蛋白质中时，宿主细胞产生单克隆抗体。同样的，所需物种的重组单克隆抗体或其片段可以从表达所需物种的CDRs的噬菌体展示文库中分离出来(McCafferty et al.,Nature 348:552-554,1990；Clackson et al.,Nature,352:624-628,1991；and Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597,1991)。
编码单克隆抗体的多核苷酸可以通过使用重组DNA技术以多种不同方式进一步修饰，以产生替代抗体。在一些实施方式中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被1)例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或者2)非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施方式中，恒定区被截短或去除以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可变区的定向位点或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
术语“人源化抗体”是指非人(如鼠)抗体的形式，它们是特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最少非人(如鼠)序列的片段。典型的，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的互补决定区的残基取代，所述非人物种具有所需的特异性、亲和力和性能(Jones et al.,Nature 321:522-525,1986；Riechmann et al.,Nature 332:323-327,1988；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536,1988)。
工程化、人源化或重现非人或人抗体的方法也可被使用并且是本领域的公知技术。人源化、重现或类似工程化的抗体可以具有一个或多个来自非人来源的氨基酸残基，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物。这些非人氨基酸残基被通常被称为“导入(import)”的残基所取代，这些残基通常取自已知人类序列的“导入”可变区、恒定区或其他区域。
所述导入序列可用于降低免疫原性，或降低、增强或修饰结合性、亲和力、开启率、关闭率、亲和力、特异性、半衰期或本领域已知的任何其他合适的特性。通常，CDR残基直接且最实质性地参与影响CD44v6或CD44v9的结合。因此，部分或全部非人或人CDR序列得以保留，而可变区和恒定区的非人序列可被人或其他物种的氨基酸替代。
任选的，抗体也可以是人源化的、重现的、工程化的人抗体，其保留了对抗原CD44v6或CD44v9的高亲和力以及其他有利的生物学特性。为了实现这一目标，人源化的(或人的)或工程化的抗CD44v6或抗CD44v9抗体和重现抗体可以任选的通过分析亲代序列和各种概念性的人源化和工程化产品的过程来制备，所述分析使用亲代、工程化和人源化序列的三维模型进行。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可获得的，其说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原如CD44v6或CD44v9的能力的残基。通过这种方式，可以从共有序列和导入序列中选择并结合框架(FR)残基，从而获得所需的抗体特征，如对靶抗原亲和力的增加。
本发明抗体的人源化、重现或工程化可以使用任何已知的方法进行，例如但不限于：Jones et al.,Nature 321:522,1986；Riechmann et al.,Nature 332:323,1988；Verhoeyen et al.,Science 239:1534,1988,Sims et al.,J.Immunol.151:2296,1993；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901,1987,Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285,1992；Presta et al.,J.Immunol.151:2623,1993；Raguska et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(3):969-973,1994；U.S.Pat.Nos.5,639,641,5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567；PCT/:US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；EP 229246；7,557,189；7,538,195；and 7,342,110，其中的每一个都通过引用的方式全部并入本文，包括其中引用的参考文献。
在某些可选的实施方式中，CD44v6或CD44v9的抗体是人抗体。所述人抗体可使用本领域已知的多种技术直接制备。可以产生永生化的人B淋巴细胞，其可进行体外免疫或从免疫个体中分离出能够产生针对靶抗原的抗体(参见，比如Cole et al.,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer et al.,1991,J.Immunol,147(l):86-95；andU.S.Patent 5,750,373)。此外，人抗体可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体，例如，如下所述：Vaughan et al.,Nat.Biotech.14:309-314,1996,Sheets et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.95:6157-6162,1998,Hoogenboomand Winter,J.Mol.Biol.227:381,1991,and Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581,1991。抗体噬菌体文库的产生和使用技术也在下述美国专利中有所描述：5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963以及Rothe et al.,J.Mol.Bio.doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018,2007(其中的每一个都通过引用的方式全部并入本文)。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783,1992,通过全部引用的方式包括于此)在本领域中是已知技术的，并且可以用来产生高亲和力的人抗体。
人源化抗体也可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备，所述人免疫球蛋白基因座在免疫后能够在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全部的人抗体。这种方法在下述美国专利中有所描述：5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016。
在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种的抗体中的相应残基所取代。人源化抗体可以通过在Fv框架区和/或被取代的非人残基中进行额外残基的取代来进一步修饰，以改进和优化抗体的特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有中的至少一个、典型的两个或三个可变结构域，所述可变结构域包含所有或基本上所有的对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，然而所有或基本上所有的FR区是人类免疫球蛋白的共有序列。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白。用于产生人源化抗体的方法的示例在下述美国专利和文献中进行了描述：5,225,539和5,639,641，Roguska et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(3):969-973,1994；andRoguska et al.,Protein Eng.9(10):895-904,1996(通过引用的方式包含于本发明中)。在一些实施方式中，“人源化抗体”是表面重建抗体。在一些实施方式中，“人源化抗体”是CDR移植抗体。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，其可以是单独的或组合的。重链和轻链的可变区各由四个框架区(FR)组成，所述框架区由三个互补决定区(CDRs，也称为高变区)组成。每条链中的CDRs通过FRs紧密结合在一起，与来自另一条链的CDRs一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。目前至少有两种技术用于确定CDRs：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat et al.Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.)；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究方法(Al-lazikani et al.,J.Molec.Biol.273:927-948,1997)。此外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDRs。
当涉及可变结构域中的残基(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest,5thEd.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在Kabat系统中的氨基酸位置编号是指用于Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)(通过引用的方式包含于此)的抗体汇编中重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含更少或额外的氨基酸，所述氨基酸对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变区可以包括在H2残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat系统编号的残基52a)和重链FR残基82之后的插入的残基(例如，根据Kabat系统编号的残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列进行对齐，可以确定给定抗体的Kabat残基编号。Chothia而是指结构环的位置(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917,1987)。当使用Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32和H34之间变化。这是因为Kabat编号方案将插入位点置于H35A和H35B-如果35A和35B都不存在，则环在32结束；如果只存在35A，则环在33结束；如果35A和35B同时存在，则环在34结束。AbM高变区代表了Kabat编号中的CDRs和Chothia结构环之间的折衷，并被用于OxfordMolecular’s AbM抗体建模软件中。
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Figure BDA0002677076120000321
术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有对应于采用本领域已知技术人造的抗体氨基酸序列的抗体。在某些实施方式中，人抗体不具有非人序列。人抗体的定义包括完整抗体或全长抗体，或其抗原结合片段。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来自两种或多种物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区对应于来自一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)具有所需的特异性、亲和力和能力的抗体可变区，然而恒定区与来自另一个物种(通常是人)的抗体中的序列同源，以避免或减少在该物种(例如人)中引发免疫反应的机会。在某些实施方式中，嵌合抗体可以包括包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体或其抗原结合片段，例如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
根据本发明的目的，应当理解的是，修饰的抗体可以包含任何类型的可变区，所述可变区提供了抗体与人CD44v6或CD44v9的多肽之间的关联。在这方面，所述可变区可以包含或来自于任何类型的哺乳动物，其可以被诱导产生体液响应并生成针对所需肿瘤相关抗原的免疫球蛋白。因此，修饰抗体的可变区可以是例如人、鼠、非人灵长类动物(例如食蟹猴、猕猴等)或羽扇豆源(lupine origin)。在一些实施方式中，修饰的免疫球蛋白的可变区和恒定区都是人的。在其他实施方式中，可以对相容抗体(通常来源于非人类来源)的可变区进行工程改造或专门定制，以改善结合特性或降低分子的免疫原性。在这方面，本发明的有益可变区可以通过导入的氨基酸序列的夹杂物而被人源化或改变。
在某些实施方式中，重链和轻链中的可变结构域通过一个或多个CDRs的至少部分替换而改变，并且如果需要，通过部分框架区域替换和序列改变而改变。尽管CDRs可以衍生自与衍生框架区的抗体相同种类或甚至亚类的抗体，但是可以设想的是CDRs将衍生自不同种类的抗体并且在某些实施方式中衍生自不同物种的抗体。可能没有必要将所有的CDRs用来自供体可变区的CDRs进行替换，以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可变结构域中。相反，可能只需要转移那些维持抗原结合位点活性所必需的残基。鉴于美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762给出的解释，通过进行常规实验或反复试验来获得免疫原性降低的功能性抗体完全在本领域技术人员的能力范围内。
尽管可变区发生了改变，但本领域技术人员将会理解，当与包含天然或未改变的恒定区的大约相同免疫原性的抗体相比时，本发明的修饰抗体将包含抗体(例如全长抗体或其免疫反应性片段)，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被删除或以其他方式改变，以便提供所需要的生物化学特性，例如增加的肿瘤定位或缩短的血清半衰期。在一些实施方式中，修饰抗体的恒定区将包含人恒定区。与本发明相容的恒定区的修饰包括一个或多个结构域中一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。也就是说，本文公开的修饰抗体可以包括对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定区(CL)中的一个或多个的改变或修饰。在一些实施方式中，考虑了一个或多个结构域被部分或全部删除的修饰的恒定区。在一些实施方式中，修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域已被去除(ACH2构建体)。在一些实施方式中，省略的恒定区结构域将被短氨基酸间隔基(例如，10个残基)取代，所述氨基酸间隔区提供了通常由缺失的恒定区赋予的一些分子灵活性。
应当注意的是，在某些实施方式中，修饰的抗体可以被工程化以将CH3结构域直接融合到各自修饰的抗体的铰链区。在其他构建体中，可能需要提供在铰链区和修饰的CH2和/或CH3结构域之间的间隔肽。例如，可以表达相容的构建体，其中CH2结构域已被删除，剩余的CH3结构域(修饰的或未修饰的)用5-20个氨基酸间隔基连接到铰链区。例如，可以添加所述间隔物以确保恒定区的调控序列保持自由和可进入，或者铰链区保持柔韧性。然而，应该注意的是，在某些情况下，氨基酸间隔基可以被证明是免疫原性的，并引发针对构建体的不需要的免疫反应。因此，在某些实施方式中，任何添加到构建体中的间隔物将是相对无免疫原性的，或者甚至完全被省略，以便保持修饰抗体所需的生物化学质量。
除了整个恒定区结构域的缺失之外，应当理解的是，本发明的抗体可以通过几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来提供。例如，CH2结构域的选定区域中单个氨基酸的突变可能足以显著降低Fc结合，从而增加肿瘤定位。类似地，可能希望简单地删除一个或多个恒定区结构域中控制待调节效应子功能(例如，补体C1Q结合)的部分。恒定区的这种部分缺失可以改善抗体的选定特征(血清半衰期)，同时保持与受试者恒定区结构域相关的其他所需功能不变。此外，如上所述，所公开的抗体的恒定区可以被修饰，例如通过一个或多个氨基酸的突变或取代，其可以增强所得构建体的轮廓。在这方面，其可以破坏保守结合位点提供的活性(例如，Fc结合)，同时基本上保持修饰抗体的构型和免疫原性概况。某些实施方式可以包括向恒定区添加一个或多个氨基酸，以增强期望的特性，例如降低或增加效应子功能或提供更多的细胞毒素或碳水化合物附着。在这样的实施方式中，可能希望插入或复制源自选定恒定区结构域的特定序列。
本发明进一步包括与本文所述的嵌合、人源化和人抗体或其抗体片段基本同源的变体和等同物。这些可以包含，例如，保守取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如，保守取代是指在相同的一般类别中用另一个氨基酸取代一个氨基酸，例如，一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代，或者一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的目的在本领域是公知的，例如上文所定义的那些。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，指能够被特定抗体识别和特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，通过蛋白质的三级折叠，表位可以由蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸和非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丢失。在特殊的空间构象中，表位通常包括至少3个，和更通常至少5个或8-10个氨基酸。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的强度总和。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用离解常数(Kd)或半最大有效浓度(EC50)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常结合抗原较慢，易于解离，而高亲和力抗体通常结合抗原较快，易于保持较长时间的结合。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其中任何一种都可以用于本发明的目的。本文描述了具体的说明性实施方式。
这里使用的短语“基本相似”或“基本相同”表示两个数值(通常一个与本发明的抗体相关，另一个与参考/比较抗体相关)之间具有足够高的相似度，使得本领域技术人员将认为这两个值之间的差异在由所述数值(例如Kd值)测量的生物学特征的范围内具有很小或没有生物学和/或统计学意义。作为参考/比较抗体的数值函数，所述两个值之间的差值小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，或小于约10％。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是指自然界中没有的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已经纯化到一定程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物，它们不再是自然界中发现的形式。在一些实施方式中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物基本上是纯的。
本领域已知的用于纯化抗体和其他蛋白质的方法还包括，例如，美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的方法，在此通过引用的方式将其全部并入本文。
如本文所用，“基本上纯的”是指纯度至少为50％(即不含污染物)、纯度至少为90％、纯度至少为95％、纯度至少为98％或纯度至少为99％的材料。
本发明中的抗体分子的“功能变体”是具有与本发明的抗体分子基本相似的生物活性(功能性或结构性)的抗体分子，即基本相似的底物特异性或底物切割能力。
术语“功能变体”还包括“片段”、“等位基因变体”、“功能变体”、“基于退行性核酸编码的变体”或“化学衍生物”。所述“功能变体”可以携带一个或几个点突变，编码序列中的一个或几个核酸交换，缺失或插入，或一个或几个氨基酸的交换、缺失或插入。所述功能性变体仍保持其生物活性，例如抗体结合活性，至少部分保持或甚至伴随着所述生物活性的改善。
本发明的抗体分子的“功能变体”也可以包括具有与本发明的抗体分子基本相似的生物活性(功能性或结构性)的抗体分子，即基本相似的靶分子结合活性的抗体分子。
“等位基因变体”是由于等位基因变异而产生的变异体，例如人体中两个等位基因的差异。所述变体仍保持其生物活性，例如抗体靶结合活性，至少部保持或甚至伴随着所述生物活性的改善。
“基于遗传密码的退行性变体”是一种由于某个氨基酸可能由几个不同的核苷酸三联体编码的变体。所述变体仍保持其生物活性，例如抗体结合活性，至少部分保持或甚至伴随着所述生物活性的改善。
“融合分子”可以是本发明的抗体分子融合到例如报告分子(reporter)比如放射性标记，融合到化学分子比如毒素或荧光标记或融合到本领域公知的其他分子。
如本文所用，本发明的“化学衍生物”是本发明的抗体分子，其被化学修饰或包含通常不是分子一部分的附加化学部分。所述部分可以提高分子的活性，例如靶破坏(例如杀死肿瘤细胞)，或者可以提高其溶解性、吸收性、生物半衰期等。
一个分子与另一个分子“基本相似”指的是两个分子具有基本相似的结构或生物活性。因此，只要两个分子具有相似的活性，则将其视为此处所使用术语的变体，即使其中一个分子的结构在另一个分子中没有被发现，或者氨基酸残基的序列不完全相同。
在特定实施方式中，本发明的“样品”或“生物样品”是生物来源的，例如来自真核生物。在一些实施方式中，样本是人类样本，但是也可以使用动物样本。用于本发明的样品的非限制性来源包括例如固体组织、活检抽吸物、腹水、流体提取物、血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、肿瘤、器官、细胞培养物和/或细胞培养成分。“癌/肿瘤样品”是包含癌细胞的样品。该方法可用于检测CD44v6或CD44v9表达的一个方面或样品的状态，包括但不限于，比较不同类型的细胞或组织，比较不同的发育阶段，以及检测或测定疾病或异常行为的存在和/或类型。
对于本发明的抗体的许多用途，其被希望具有最小可能的抗原结合单位，即CD44v6-或CD44v 9-结合单位。因此，在另一个优选实施方式中，本发明的抗体蛋白是Fab片段(Fragment antigen-binding＝Fab)。本发明中的CD44v6特异性抗体蛋白由两条链的可变区组成，这两条链由相邻的恒定区结合在一起。所述蛋白可以通过蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)分解从常规抗体形成，但是类似的Fab片段也可以同时通过基因工程产生。在另一个优选的实施方式中，本发明的抗体蛋白是F(ab')2片段，其可以通过用胃蛋白酶进行蛋白水解裂解来制备。
利用基因工程方法有可能产生仅由重链(VH)和轻链(VL)可变区组成的缩短的抗体片段。所述抗体片段被称为Fv片段(可变片段＝具有可变部分的片段)。在另一个优选实施方式中，本发明的CD44v6-或CD44v 9-特异性抗体分子即是这样的Fv片段。由于这些Fv片段缺乏恒定链的半胱氨酸对两条链的共价键合，因此Fv片段通常是稳定的。通过短肽片段，例如10-30个氨基酸，优选15个氨基酸，连接重链和轻链的可变区是有利的。通过这种方式，获得了由VH和VL组成的通过肽接头连接的单个肽链。这种抗体蛋白被称为单链抗体(scFv)。现有技术中关于单链抗体蛋白的例子记载于Huston et al.(1988,PNAS 16:5879-5883)。因此，在另一个优选实施方式中，本发明的CD44v6-或CD44v 9-特异性抗体蛋白是单链Fv蛋白(scFv)。
近年来，已经开发了多种策略来制备作为多聚体衍生物的单链抗体。这尤其是为了产生具有改良的药代动力学和生物分布特性以及增加的结合亲和力的重组抗体。为了实现单链抗体的多聚化，单链抗体被制备成具有多聚化结构域的融合蛋白。多聚化结构域可以是例如IgG的CH3区或卷曲螺旋结构(螺旋结构)，如亮氨酸拉链结构域。然而，也有利用单链抗体的VH/VL区之间的相互作用进行多聚体化的策略(例如二体、三体和五体)。因此，在另一个实施方式中，本发明的抗体蛋白是CD44v6-或CD44v 9-特异性双抗体片段。本领域技术人员所说的双抗体是指二价同二聚体单链抗体衍生物(Hu et al.,1996,PNAS 16:5879-5883)。将单链抗体分子中的接头缩短至5-10个氨基酸，致使同源二聚体的形成，其中发生了链间VH/NL重叠。此外，还可以通过引入二硫键来稳定双抗体。现有技术中双抗体蛋白的例子可以在Perisic et al.(1994,Structure 2:1217-1226)中找到。
本领域技术人员所说的微小抗体是指二价、同型二聚体单链抗体衍生物。其由融合蛋白组成，所述融合蛋白含有免疫球蛋白的CH3区，优选IgG，最优选IgG1作为二聚区，该二聚区通过铰链区(例如也来自IgG1)和接头区与单链抗体相连。铰链区的二硫键主要在高等细胞中形成，而不是在原核生物中。在另一个优选实施方式中，本发明的抗体蛋白是CD44v6特异性微小抗体片段。现有技术中微小抗体蛋白的例子可以在Hu et al.(1996,CancerRes.56:3055-61)中找到。
本领域技术人员所说的三体是指三价同三聚体单链抗体衍生物(Kortt etal.1997 Protein Engineering 10:423-433)。ScFv衍生物导致三聚体的形成，其中VH-VL在没有接头序列的情况下直接融合。
本领域技术人员也熟悉所谓的微型抗体，其具有二价、三价或四价结构，并且来源于单链抗体。多聚化是通过二、三或四聚体卷曲螺旋线圈结构(Pack et al.,1993Biotechnology II:,1271-1277；Lovejoy et al.1993Science 259:1288-1293；Pack etal.,1995 J.Mol.Biol.246:28-34)进行的。
因此，在一个实施方式中，本发明的抗体蛋白是基于上述抗体片段的CD44v6-或CD44v 9-特异性多聚体分子，并且可以是例如三体、四价微型抗体或五体。
人源化CD44v6-或CD44v 9-特异性抗体蛋白可以通过本领域已知的分子生物学方法生成。
本发明抗体蛋白的可变区通常连接到免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。人恒定区的DNA序列可根据公知的方法从多种人细胞中分离得到，但优选永生化的B细胞(参见Kabat et al.,supra,and WO 87/02671)。因此，本发明的抗体蛋白可以包含全部或仅一部分恒定区，只要它们表现出与CD44v6或CD44v9抗原的特异性结合。恒定区的类型和范围的选择取决于效应子的功能(诸如补体固定或抗体依赖性细胞毒性)是否需要，以及抗体蛋白所需的药理学性质。本发明的抗体蛋白通常是由两个轻链/重链对组成的四聚体，但也可以是二聚体，即由一个轻链/重链对组成，例如Fab或Fv片段。
因此，在本发明进一步的实施方式中，涉及本发明的抗体蛋白，其特征在于它们具有可变轻链区和可变重链区，每个都连接到人恒定区。特别是，轻链的可变区与人kappa恒定区相连，重链的可变区与人γ-1恒定区相连。其他用于嵌合轻链和重链的人类恒定区也是可用的。
鼠抗体可变区的人源化可以采用本领域已知的方法实现。欧洲专利EP 0239400公开了将鼠可变区的CDRs移植到人可变区的框架中。WO 90/07861公开了通过引入额外的骨架修饰来重塑CDR移植的可变区的方法。WO 92/11018公开了生产人源化免疫球蛋白(Ig)的方法，该方法将供体CDRs与受体框架结合，所述受体框架与供体框架具有高度同源性。WO92/05274公开了由鼠抗体开始制备框架突变抗体的方法。更多的与鼠单克隆抗体人源化相关的现有技术参考文献还有：EP 0368684，EP0438310，WO 92/07075或WO 92/22653。所有文献都在此引入作为参考。
在另一个实施方式中，本发明涉及本发明的抗体分子，其特征在于轻链的所述可变区和重链的所述可变区中的每一个分别连接到人恒定区。
在另一个实施方式中，本发明涉及本发明的抗体分子，其中所述轻链的人恒定区是人kappa恒定区。
在另一个实施方式中，本发明涉及本发明的抗体蛋白，其中所述重链的人恒定区是人IgG1恒定区。
本发明的抗体蛋白提供了用于将治疗剂靶向CD44v6或CD44v9抗原的高度特异性工具。因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体蛋白，其中所述抗体蛋白在抗体-药物-偶联物中任选地通过接头与治疗剂偶联。在本领域已知的诸多治疗剂中，优选选自放射性同位素、毒素、类毒素、发炎剂、酶、反义分子、肽、细胞因子和化疗药物。在放射性同位素中，发射γ、β和α的放射性同位素可用作治疗剂。优选发射β的放射性同位素作为治疗性放射性同位素。186铼、188铼、131碘和90钇已被证明是特别有用的β发射同位素，用于实现恶性肿瘤细胞的局部照射和破坏。因此，特别优选来自186铼、188铼、131碘和90钇的放射性同位素作为与本发明抗体蛋白偶联的治疗剂。例如，对于本发明抗体的放射性碘化，可以采用WO 93/05804中公开的方法。
本文使用的术语“免疫偶联物”、“偶联物”或“抗体药物偶联物(ADC)”是指与细胞结合剂(即抗CD44v6或抗CD44v9抗体或其片段)连接的化合物或其衍生物，并由如下通式定义：A-L-C，其中C＝细胞毒素，L＝接头，A＝细胞结合剂(CBA)，例如抗CD44v6或抗CD44v9抗体或抗体片段。免疫偶联物也可以按照相反的顺序由通式定义。
“接头”是能够以稳定、共价的方式将化合物(通常为药物，如本文所述的细胞毒性剂)与细胞结合剂(如抗CD44v6或-CD44v9抗体或其片段)连接的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头可以对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键的切割敏感或基本上具有抵抗力。合适的接头是本领域公知的，包括例如二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。接头还包括如本文所述和本领域已知的带电接头及其亲水形式。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法上的等同物指的是来自肿瘤或癌前病变的细胞的总群体，包括非致瘤细胞(其构成肿瘤细胞群体的大多数)和致瘤干细胞(癌症干细胞)。如本文所用，术语“肿瘤细胞”将被术语“非致瘤的”修饰，仅指那些缺乏更新和分化能力以将那些肿瘤细胞与癌症干细胞区分开来的肿瘤细胞。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指人类受试者。
施用“结合(in combination with)”一种或多种进一步的治疗剂包括以任何顺序同时(同时)和连续给药。
术语“药物制剂”是指这样一种制剂，即，其形式允许活性组分的生物活性有效，并且不包含对施用该制剂的受试者不可接受的毒性附加成分。所述制剂可以是无菌的。
本文公开的抗体或免疫偶联物的“有效量”是足以实现特定目的的量。“有效量”可根据经验并以常规方式确定，与所述目的相关。
术语“有效治疗剂量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或紊乱的抗体或其他药物的量。当是癌症的情况下，药物的有效治疗剂量可以减少癌细胞的数量；缩小肿瘤的大小；抑制(即，在一定程度上减慢，并且在特定实施方式中，停止)癌细胞向外周器官的渗透；抑制(即，在一定程度上减慢，并且在特定实施方式中，停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤的生长；在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状；和/或引起有利的反应，例如无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)、或总生存期(OS)、完全反应(CR)、部分反应(PR)、或在某些情况下，稳定疾病(SD)、进行性疾病减少(PD)、进展时间缩短(TTP)或其任意组合。参见本文中“治疗”的定义。在某种程度上，该药物可以阻止现有癌细胞的生长和/或杀死现有癌细胞，所述药物可以抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。
“预防有效量”是指在必要的剂量和时间内达到预期预防效果的有效量。典型的但不是必须的，由于在疾病的前期或早期对受试者使用预防性剂量，所以预防性有效量将小于治疗性有效量。
“化疗药物”是一种用于治疗癌症的化合物，不管其作用机制如何。术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“减轻(alleviating)”或“减轻(to alleviate)”是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理状况或病症的症状和/或中止其进展的治疗措施。因此，那些需要治疗的人包括那些已经被诊断患有该疾病的人，并且还可能包括那些具有最小残留疾病、或抗性疾病、或复发疾病的人。在某些实施方式中，如果患者表现出以下一种或多种情况，则认为本发明的方法成功的“治疗”了受试者的癌症：癌细胞数量减少或完全缺失；肿瘤体积的减小；抑制或不存在癌细胞向外周器官的渗透，包括例如癌症向软组织和骨的扩散；抑制或不存在肿瘤转移；肿瘤生长的抑制或不存在肿瘤生长；缓解与特定癌症相关的一种或多种症状；发病率和死亡率的降低；生活质量的提高；肿瘤的致瘤性、致瘤频率或致瘤能力降低；肿瘤中肿瘤干细胞数量或频率的减少；致瘤细胞向非致瘤状态的分化；无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或总生存期(OS)、完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定疾病(SD)、进展性疾病减少(PD)、进展时间缩短(TTP)或其任意组合。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在修饰，则可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记成分偶联的方式。其他类型的修饰包括，例如，“封端(caps)”，一个或多个天然存在的核苷酸的类似物的取代，核苷酸间修饰，例如那些带有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，含有侧链部分的，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、赖氨酸等)，带有嵌入剂的(例如吖啶、补骨脂素等)，含有螯合剂的(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)，含有烷基化剂的，具有修饰键的(例如，α异头核酸等)，以及多核苷酸的未修饰形式。进一步的，糖中通常存在的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，被标准保护基团保护，或者被活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可以与固体载体(solid supports)偶联。5’和3’末端羟基可以被磷酸化或被胺类或来自1-20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域中公知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-0-甲基-、2’-0-烯丙基、2’-氟代-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖(xyloses)或溶糖(lyxoses)、吡喃糖、呋喃糖、七庚糖(sedoheptuloses)、无环类似物和碱基核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被可选的连接基团取代。所述可选的连接基团包括但不限于下述实施方式，其中磷酸盐被P(O)S(“硫代酸盐(thioate)”)，P(S)S(“二硫代酸盐(dithioate)”)，(O)NR2(“酰胺酸盐(amidate)”)，P(O)R，P(O)OR*，CO or CH2(“甲醛(formacetal)”)替换，其中每个R或R独立的是氢或取代的或未取代的烷基(1-20个C)，任选的包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连接都必须是相同的。前述描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括DNA和RNA。
术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送和表达一个或多个目的基因或序列的构建体。载体的例子包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的偶联。在定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽。应当理解的是，因为本发明的多肽基于抗体，所以在某些实施方式中，多肽可以单链或相关链的形式存在。在一些实施方式中，多肽、肽或蛋白质是非天然存在的。在一些实施方式中，多肽、肽或蛋白质是从其他天然存在的组分中纯化得到的。在一些实施方式中，多肽、肽或蛋白质是重组产生的。
在两种或多种核酸或多肽的情况下，当为了最大程度的一致性而进行比较和比对(如果需要，引入间隙)时，术语“相同”或百分比“同一性”是指两种或多种序列或亚序列是相同的或者具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守的氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。本领域中已知多种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。序列比对算法的一个非限制性例子是在Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.87:2264-2268,1990中描述的算法，Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:5873-5877,1993中做出的修改，以及被合并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul et al.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1991)。在某些实施方式中，Gapped BLAST可以按照Altschul et al.,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997所述的进行使用；BLAST-2，WU-BLAST-2(Altschul et al.,Methods in Enzymology 266:460-480,1996)，ALIGN，ALIGN-2(Genentech,South SanFrancisco,California)或者Megalign(DNASTAR)是可用于排列序列的额外的公开软件程序。在某些实施方式中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件中的GAP程序来确定的(例如，使用NWSgapdna。CMP矩阵和间隙权重为40、50、60、70或90，长度权重为1、2、3、4、5或6)。在某些可替换的实施方式中，GCG软件包中的GAP程序结合了Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453,1970)的算法，可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。可选的，在某些实施方式中，核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比通过使用Myers和Miller(CABIOS,4:11-17,1989)的算法进行确定。例如，同一性百分比可以使用ALIGN程序(2.0版)和使用PAM120残基表，间隙长度罚分12和间隙罚分4进行确定。本领域技术人员可以通过特定对准软件对最大对准的合适参数进行确定。在某些实施方式中，使用对准软件的默认参数。在某些实施方式中，第一氨基酸序列对第二序列氨基酸的百分比同一性“X”计算为100×(Y/Z)，其中Y是在第一和第二序列的比对中(通过视觉检查或特定的序列比对程序进行比对)被评分为相同匹配的氨基酸残基的数量，Z是第二序列中残基的总数。如果第一序列的长度比第二序列长，则第一序列对第二序列的同一性百分比将比第二序列对第一序列的同一性百分比长。
作为非限制性的实例，在某些实施方式中，可以使用Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)确定是否任何特定的多核苷酸与参考序列具有一定百分比的序列同一性(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同，并且在某些实施方式中，至少95％、96％、97％、98％或99％相同)。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2:482-489,1981)来寻找两个序列之间的最佳同源性片段。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否例如与本发明中的参考序列95％相同时，设置参数以使得在参考核苷酸序列的全长范围内计算同一性百分比，并且允许同源性差距不超过参考序列中核苷酸总数的5％。
在一些实施方式中，本发明的两种核酸或多肽基本上是相同的，这意味着当使用序列比较算法或通过目测进行比较和比对以获得最大一致性时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方式中具有至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在某些实施方式中，同一性存在于长度为至少约10个、约20个、约40-60个残基或其中间的任何整数值的序列区域上，或者存在于比60-80个残基、至少约90-100个残基更长的区域上，或者序列在被比较序列的全长范围内基本上相同，例如核苷酸序列的编码区域。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如络氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸替代酪氨酸是一种保守的取代。在某些实施方式中，本发明的多肽和抗体的序列中的保守取代不会消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原的结合，所述抗原即多肽或抗体结合的CD123/IL-3Rα。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域是公知的技术(参见例如,Brummell et al.,Biochem.32:1180-1187,1993；Kobayashi et al.,Protein Eng.12(10):879-884,1999；and Burks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417,1997)。
本发明的另一方面提供了本发明中与治疗剂相连的抗体蛋白，其中所述治疗剂是选自放射性同位素、毒素、类毒素、前药和化疗药物的治疗剂。
在某些实施方式中，治疗剂通过选自MAG-3(U.S.Pat.No.5,082,930A,EP 0247866B1(第2页55-56行-第3页1-23行))的接头连接到抗体蛋白上；MAG-2GABA(U.S.Pat.No.5,681,927 A,EP 0284071 B1(第6页9-29行))；和N2S2((＝苯硫醚phenthioate)U.S.Pat.Nos.4,897,255 A,5,242,679 A,EP 0188256 B1(第2页38行-第3页18行)),(Ac)Phe-Lys(Alloc)-PABC-PNP,6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，6-喹喔啉羧酸，2,3-双(溴甲基)-Fmoc-Val-Cit-PAB，Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP，Mc-Val-Cit-PABC-PNP，Val-cit-PAB-OH，全部通过引用的方式包含于此。
在某些实施方式中，放射性同位素选自186铼、188铼、131碘和90钇。
在某些实施方式中，本发明的抗体蛋白被标记。所述CD44v6-或cd44v 9-特异性标记抗体允许在体外和/或体内的定位和/或检测CD44v6/CD44v9抗原。
标记被定义为可直接检测或间接检测的标记。间接标记被定义为自身不能被检测但需要对间接标记有特异性的进一步直接可检测的标记。用于实施本发明的优选标记是可检测的标记。从诸多可检测标记中，可检测标记可以选自酶、染料、放射性同位素、洋地黄毒苷(digoxygenin)和生物素。
在某些实施方式中，标记是可检测的标记，例如选自酶、染料、放射性同位素、洋地黄毒苷(digoxygenin)和生物素的标记。
在某些实施方式中，本发明的抗体蛋白与可成像剂偶联。各种各样的可成像试剂可以从现有技术中获得，尤其是放射性同位素。在某些实施方式中，可成像剂是γ-发射同位素，例如125碘。在某些实施方式中，抗体蛋白具有约0.5-约15mCi/mg，或约0.5-约14mCi/mg，或约1-约10mCi/mg，或约1-约5mCi/mg，和约2-6mCi/mg或1-3mCi/mg的比活性。
3.组合物和药物组合物
本发明包括一种组合物(例如药物组合物)，其包含本文所述的受试抗体或其抗原结合片段或其免疫偶联物，以及载体(例如药学上可接受的载体)。本发明还包括一种组合物(例如药物组合物)，其包含受试抗体或其抗原结合片段或其偶联物，以及载体(药学上可接受的载体)，并且进一步包含一种第二治疗剂。本发明的组合物可用于抑制哺乳动物(例如人)的异常细胞生长或治疗增生性疾病，包括血液系统癌症、白血病或淋巴瘤。
特别的，本发明提供了包含一种或多种本文所述的CD44v6或CD44v9结合剂或其免疫偶联物的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。所述药物组合物可用于抑制肿瘤生长和治疗人类患者的癌症，包括血液系统癌症、白血病或淋巴瘤。
在某些实施方式中，通过将本发明的纯化抗体或其免疫偶联物与药学上可接受的载体(例如载体、赋形剂)结合，制备用于储存和使用的制剂(Remington,The Science andPractice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing,2000)。合适的药学上可接受的载体包括但不限于无毒缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐类，如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如乙二胺四乙酸；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属配合物(如锌-蛋白质配合物)；和非离子表面活性剂如吐温或聚乙二醇(PEG)。
药学上可接受的载体可以包含生理学上可接受的化合物，例如,其用于稳定或增加AMPA谷氨酸受体激动剂、拮抗剂或调节剂的吸收。所述生理上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990),18th ed.Mack Publ.,Easton)。本领域技术人员将会知道，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如组合物的给药途径。
合适的药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂通常是公知的，并且可以由本领域普通技术人员根据临床情况确定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括：(1)杜氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水，pH约为7.4，含有或不含有约1mg/ml-25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％生理盐水(0.9％w/v氯化钠)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且还可以包含抗氧化剂如色胺和稳定剂如吐温20。
本文所述的药物组合物可以以任何方式给药，用于局部或全身治疗。给药可以是局部给药(如粘膜给药，包括阴道和直肠给药)，如透皮贴剂、软膏、洗液、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末；肺部给药(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)；口服给药；或肠胃外给药，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内给药(如鞘内或脑室内)。在一些特定实施方式中，给药是静脉内给药。本文所述的药物组合物也可用于体外或离体。
在动物或人体中，根据所治疗的疾病或问题(例如肿瘤)的类型和来源，通过静脉注射或其他途径，例如全身、局部或局部(topically)的将上述药物组合物施用到目的组织或器官中，可以被证明是有利的。例如，当不同的器官或器官系统需要治疗时，例如全身性自身免疫性疾病、过敏、移植的外来器官或组织、或弥散性或难以定位的肿瘤，则需要全身性的作用模式。当仅预期肿瘤的局部临床表现或免疫作用时，例如局部肿瘤，将考虑局部作用模式。
包含本发明抗体蛋白的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的不同施用途径施用，特别是静脉注射或直接注射到靶组织中。对于全身施用来说，优选静脉内、血管内、肌内、动脉内、腹膜内、口服或鞘内途径。可以在待治疗的组织(结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织)内或附近进行皮下、皮内、心内、球内、髓内、肺内或直接的局部施用。根据所需的治疗持续时间和效果，药物抗体组合物可以给药一次或几次，也可以间歇给药，例如以一天为周期给药几天、给药几周或给药几个月，并以不同的剂量给药。
为了制备用于上述应用的包含抗体制剂的合适的药物组合物，可以使用已知的可注射的、生理上可接受的无菌溶液。为了制备用于胃肠外注射或输注的即用溶液，可以使用等渗水溶液，例如生理盐水或对应的血浆蛋白溶液。所述药物组合物可以冻干物或干制剂的形式存在，其可以在无菌条件下使用前直接用已知的可注射溶液重构，例如作为成套部件。制备用于注射、输注或灌注的本发明抗体组合物的最终制剂是通过将本发明的纯化抗体与无菌生理可接受的溶液混合得到的，所述溶液可以补充已知的载体物质或/和添加剂(例如血清白蛋白、葡萄糖、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸)。
抗体的使用量取决于疾病的性质。在癌症患者中，包含在本发明的药物组合物中的“裸”抗体的施用剂量可以是0.1-100mg/m2，每次施用5mg/m2-50 mg/m2，10mg/m2-约40mg/m2，10mg/m2-约30mg/m2，也可以是20mg/m2-约30mg/m2，以及约25mg/m2体表面积。也可以使用约50mg/m2体表面积的抗体蛋白剂量。
对患者每次给药的放射剂量必须足够高才能有效，但必须低于剂量限制毒性(DLT)。对于包含放射性标记抗体(如186铼)的药物组合物来说，必须确定最大耐受剂量(MTD)，在治疗设定中不得超过该剂量。放射性标记抗体在癌症患者中的应用可以通过重复(每月或每周)静脉输注低于最大耐受剂量的剂量来实现(参见例如Welt et al.(1994)J.Clin.Oncol.12:1193-1203)。优选多次给药，通常每周一次；然而，放射性标记的材料应该以更长的时间间隔给药，即间隔4-24周，优选间隔12-20周。然而，技术人员可以选择将给药分成两次或更多次施用，可以在短时间内紧接着施用，或者以某个其他预定的间隔范围施用，例如从1天至1周。
此外，所施加的放射性剂量将符合以下概述的指导原则。一般来说，每次给药的放射性剂量在30-75mCi/m2体表面积(BSA)之间。因此，在本发明的药物组合物中，放射性标记抗体的量采用186铼、188铼、99m锝、133碘或90钇(优选用186铼标记)进行标记，用于患者中的放射性标记抗体的施用量为10、20、30、40、50或60mCi/m2，优选50mCi/m2。在一个实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其中本发明的所述放射性标记抗体的剂量是最大耐受剂量(MTD)，为50mCi/m2。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物进一步包含一种或多种辐射防护剂，所述辐射防护剂选自抗坏血酸、龙胆酸、还原酸、异抗坏血酸、对氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、烟酸、烟酰胺、2-5-二羟基-1,4-苯二磺酸、聚维酮、肌醇和/或柠檬酸盐。在某些实施方式中，辐射防护剂是抗坏血酸。
本发明的抗体或免疫偶联物可与第二化合物组合成药物组合制剂，或作为组合疗法的给药方案，所述第二化合物可以是例如已知可有效治疗目的疾病或障碍的化合物。在一些实施方式中，所述第二化合物是抗癌剂。在一些实施方式中，所述方法包括施用本发明的第二化合物和免疫偶联物，与单独施用免疫偶联物相比，其产生更好的功效。第二化合物可以通过多种方式给药，包括例如局部给药、肺部给药、口服给药、肠胃外给药或颅内给药。在一些实施方式中，给药是口服的。在一些实施方式中，给药是静脉内的。在一些实施方式中，给药是口服和静脉内给药。
抗体或免疫偶联物也可与镇痛药或其他药物组合成药物组合制剂，或作为组合疗法的给药方案。
抗体或免疫偶联物可与具有抗癌特性的第二化合物组合成药物组合制剂，或作为组合疗法的给药方案。药物组合制剂或给药方案的第二化合物可以具有与组合的抗体偶联药物(ADC)互补的活性，使得它们不会相互产生不利影响。还提供了包含CD44v6-或CD44v9-结合剂和第二抗癌剂的药物组合物。
在某些实施方式中，单独或与第二治疗剂组合的有效治疗剂量的受试抗体或其抗原结合片段，或本文所述的免疫偶联物，或其组合物，优先抑制白血病干细胞(LSCs)、白血病祖细胞(LPs)和/或白血病母细胞的增殖，超过正常造血干细胞(HSCs)。在某些实施方式中，抑制白血病干细胞(LSCs)、白血病祖细胞(LPs)和/或白血病母细胞增殖的上述主体药剂的IC50值或半最大浓度比正常造血干细胞(HSCs)低至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、300倍、500倍或更多倍。
4.治疗方法
本发明包括抑制哺乳动物(例如人)中异常细胞生长或治疗增殖性疾病的方法，该方法包括单独或与第二治疗剂联合给所述哺乳动物施用有效治疗剂量的所述受试抗体或其抗原结合片段，或本文所述的免疫偶联物，或其组合物。
本发明的另一个方面是本发明的抗体蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本发明的另一方面涉及本发明的抗体蛋白与如上所述的治疗剂结合用于治疗癌症的用途。所述癌症包括任何与恶性生长相关的疾病，如实体瘤、肉瘤和白血病。这类疾病的一个必要前提是CD44v6或CD44v9的表达。
本发明还提供了在选定细胞群中诱导细胞死亡的方法，包括将靶细胞或含有靶细胞的组织与有效量的本发明的受试抗体或其抗原结合片段或免疫偶联物接触。靶细胞是偶联物的细胞结合剂可与之结合的细胞。
本发明用于在选定的细胞群中诱导细胞死亡、抑制细胞生长和/或治疗癌症的方法可以在体外、体内或离体实施。对于临床体内应用，本发明的细胞毒性化合物或偶联物将以溶液或冻干粉的形式提供，并对其进行无菌性和内毒素水平测试。
在某些实施方式中，哺乳动物中的异常细胞生长或增殖性疾病是与CD44v6或CD44v9的表达相关或以其为特征的疾病或病症，例如癌症。
例如，癌症可以选自：上皮癌，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、头颈癌、食道癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、皮肤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、食道癌、前列腺癌和肾癌；骨和软组织肉瘤，包括骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)和平滑肌肉瘤；造血系统恶性肿瘤，包括淋巴瘤和白血病；神经外胚层肿瘤，包括周围神经肿瘤、星形细胞瘤和黑色素瘤以及间皮瘤。
本发明的癌症还可包括但不限于：1)上皮癌的治疗，包括乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺和肾来源；2)骨和软组织肉瘤：骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤；3)造血系统恶性肿瘤：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、白血病；4)神经外胚层肿瘤：周围神经肿瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤；5)间皮瘤。
与实体瘤相关的癌性疾病状态的例子包括但不限于：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌和脑转移癌。
在某些实施方式中，癌症具有至少一个负面预后因素。
本发明的另一个方面涉及如上定义的本发明的抗体蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中每次施用的抗体蛋白量为0.1-100mg/m2、5-50mg/m2、10mg/m2-约40mg/m2、10mg/m2-约30mg/m2、或20mg/m2-约30mg/m2、或约25mg/m2体表面积、或约50mg/m2体表面积。
在某些实施方式中，如上定义的与本发明的放射性同位素偶联的抗体蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的应用，其中每次给药的放射性剂量在30-75mCi/m2体表面积(BSA)之间。在某些实施方式中，本发明的抗体蛋白用186铼、188铼、99m锝、131碘或90钇(如186铼)进行放射性标记。在又一个实施方式中，本发明涉及如上定义的与本发明的放射性同位素偶联的抗体蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中抗体剂量为10、20、30、40、50或60mCi/m2，或50mCi/m2。
在某些实施方式中，如上定义的与本发明的放射性同位素偶联的抗体蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的应用，其中抗体蛋白具有约0.5-约15mCi/mg，或约0.5-约14mCi/mg，优选约1-约10mCi/mg，优选约1-约5mCi/mg，最优选2-6mCi/mg或1-3mCi/mg的比活性。
还优选的是如上定义与本发明放射性同位素偶联的抗体蛋白在制造用于治疗癌症的药物中的应用，其中所述抗体或抗体衍生物在pH约7-约8的水溶液中，且浓度为约0.5-约2.0mg/ml。
本发明进一步涉及一种癌症的治疗方法，其中本发明的抗体蛋白给药一次至数次至有此需要的个体，所述抗体蛋白选择性结合CD44v6或CD44v9，通过与抗体蛋白连接的治疗剂破坏肿瘤细胞，并监测治疗成功。所述抗体蛋白可以以裸/未修饰的抗体蛋白、修饰的抗体蛋白(例如融合蛋白)或与治疗剂结合的抗体蛋白的形式存在，其包括将肿瘤与有效量的所述抗体接触。如上所述的治疗肿瘤的方法可以在体外或体内生效。癌症是如上所述的任何癌症。
癌症疗法及其剂量、给药途径和推荐用法在本领域中是已知的，并且已经在诸如医师案头参考(Physician's Desk Reference-PDR)的文献中进行了描述。PDR公开了用于治疗各种癌症的药剂的剂量。有效治疗的上述化疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病的程度和本领域技术人员熟悉的其他因素，并且可由医生确定。PDR的内容通过全部引用的方式被明确的包含于此。本领域的技术人员可以使用一个或多个以下参数来审查PDR，以确定按照本发明的教导使用的化疗药物和偶联物的给药方案和剂量。所述参数包括：综合指数；制造商；产品(按公司或商标药品名称)；类别索引；通用/化学索引(非商标通用药物名称)；药物的彩色图像；产品信息，与FDA标签一致；化学信息；功能/作用；适应症和禁忌症；试验研究，副作用，警告信息。
抗体的使用量取决于疾病的性质。在癌症患者中，“裸”抗体的施用剂量可以是0.1-100mg/m2，每次施用5-50mg/m2，10mg/m2-约40mg/m2，10mg/m2-约30mg/m2，也可以是20mg/m2-约30mg/m2，以及约25mg/m2体表面积，或约50mg/m2体表面积。
对患者每次给药的放射剂量必须足够高才能有效，但必须低于剂量限制毒性(DLT)。对于包含放射性标记抗体(如186铼)的药物组合物来说，必须确定最大耐受剂量(MTD)，在治疗设定中不得超过该剂量。放射性标记抗体在癌症患者中的应用可以通过重复(每月或每周)静脉输注低于最大耐受剂量的剂量来实现(参见，例如Welt et al.(1994)J.Clin.Oncol.12:1193-1203)。优选多次给药，通常每周一次；然而，放射性标记的材料应该以更长的时间间隔给药，即间隔4-24周，优选间隔12-20周。然而，技术人员可以选择将给药分成两次或更多次施用，可以在短时间内紧接着施用，或者以某个其他预定的间隔范围施用，例如从1天至1周。
还提供了一种本发明中癌症的治疗方法(见上文)，其中如上定义的与本发明的放射性同位素偶联的抗体蛋白具有约0.5-约15mCi/mg，或约0.5-约14mCi/mg，优选约1-约10mCi/mg，优选约1-约5mCi/mg，最优选2-6mCi/mg或1-3mCi/mg的比活性。
还提供了本发明中癌症的治疗方法(见上文)，其中如上定义的与本发明的放射性同位素偶联的抗体蛋白在pH约7-约8的水溶液中，且浓度为约0.5-约2.0mg/ml。
在某些实施方式中，癌症是结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
本发明的方法还提供了杀死细胞如癌细胞的体外方法。体外应用的例子包括：在将自体骨髓移植到同一患者体内之前对其进行治疗以杀死患病细胞或恶性细胞：在移植之前对骨髓进行治疗以杀死有能力的T细胞并预防移植物抗宿主病(GVHD)；处理细胞培养物，以杀死除了不表达靶抗原的所需变异体以外的所有细胞；或者杀死表达不需要的抗原的变体。
本领域普通技术人员容易确定非临床体外使用的条件。
临床离体应用的例子是在癌症治疗或自身免疫性疾病治疗中自体移植前从骨髓中去除肿瘤细胞或淋巴细胞，或在移植前从自体或同种异体骨髓或组织中去除T细胞和其他淋巴细胞，以预防GVHD。治疗可以按照如下方式进行：从患者或其他个体采集骨髓，然后在含有血清的培养基中孵育，向该培养基中加入本发明的细胞毒性剂，浓度范围为约10μM-1pM，在约37℃下孵育约30min至约48h。浓度和孵育时间的确切条件(即剂量)，容易由本领域普通技术人员确定。孵育后，用含有血清的培养基洗涤骨髓细胞，并按照已知的方法以静脉内给药的方式返回患者。在患者接受其他治疗的情况下，例如在采集骨髓和重新注入治疗细胞之间进行消融化疗或全身照射的过程，使用标准医疗设备将处理过的骨髓细胞冷冻储存在液氮中。
5.核酸
本发明的另一个方面是核酸，其特征在于其编码本发明的抗体或蛋白质。所述核酸可以是RNA，或者优选是DNA。所述DNA分子可以是化学合成的。首先，合适的寡核苷酸可以用本领域已知的方法合成(例如Gait,M.J.,1984,Oligonucleotide Synthesis.APractical Approach.IRL Press,Oxford,UK)，可以用来生产合成基因。本领域已知生成合成基因的方法(例如，Stemmer et al.1995,Single-step assembly of a gene andentire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides,Gene 164(1):49-53；Ye etal.1992,Gene synthesis and expression in E.coli for pump,a humanmatrix metalloproteinase,Biochem Biophys Res Commun 186(1):143-9；Hayden etMandecki 1988,Gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides,DNA 7(8):571-7)。这些方法可用于合成本申请中公开的任何DNA分子。
本发明的核酸可以包含5’或3’或5’和3’非编码区。本发明的核酸可以包含上游和/或下游的其他非编码区。非编码区可以包含调节元件，例如转录起始单元(启动子)或增强子。所述启动子例如可以是组成型、诱导型或发育控制型启动子。在某些实施方式中，也不排除其他已知的启动子，比如人巨细胞病毒(CMV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)的组成型启动子，以及猿猴病毒40(SV40)和单纯疱疹病毒启动子。本发明的诱导型启动子包括抗生素抗性启动子、热休克启动子、激素诱导型“乳腺肿瘤病毒启动子”和金属硫蛋白启动子。本发明的核酸可以编码本发明的抗体蛋白的片段。这是指本发明的多肽的一部分。
6.载体
本发明的另一个重要方面是重组DNA载体，其特征在于其含有本发明的核酸。示例是病毒载体，例如痘苗病毒、塞姆利基森林病毒和腺病毒；用于COS-细胞的载体具有SV40复制起点，并使获得质粒的高拷贝数成为可能；用于昆虫细胞的载体是例如大肠杆菌转移载体，并含有例如编码多角体蛋白的DNA作为启动子。
本发明的另一个方面是本发明的重组DNA载体，其特征在于其是一种表达载体。
本发明的另一个方面是本发明的重组DNA载体，其特征在于其是载体pAD-CMV或其功能衍生物。所述衍生物是例如pAD-CMV1、pAD-CMV19或pAD-CMV25。
所述载体可以是公开于美国专利5,648,267A或5,733,779A包含本发明的核苷酸序列的载体。本发明的另一个方面是本发明的重组DNA载体，其特征在于其是载体N5KG1Val或其衍生物。
7.细胞或宿主细胞
本发明的另一方面是宿主，其特征在于其包含本发明的载体。
本发明的另一方面是本发明的宿主，其特征在于其是真核宿主细胞。本发明的真核宿主细胞包括真菌，例如毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、昆虫细胞(例如来自具有杆状病毒表达系统的草地夜蛾Sf-9)、植物细胞，例如烟草、哺乳动物细胞，例如COS细胞，BHK细胞，CHO细胞或骨髓瘤细胞。
在人体内也形成抗体蛋白的免疫系统细胞的后代中，本发明的抗体蛋白具有特别好的折叠和糖基化性能。哺乳动物宿主细胞，优选CHO或COS细胞，例如CHO DG44(Urlauband Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77(7):4216-20(1980))或CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞。因此，本发明的另一方面是本发明的宿主，其特征在于其是BHK、CHO或COS细胞，最优选CHO DG44或CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞。
在某些实施方式中，所述宿主是噬菌体。
在某些实施方式中，所述宿主是原核宿主细胞。原核宿主细胞的例子是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或奇异变形杆菌。
本发明进一步涉及制备本发明的抗体蛋白的方法，其特征在于其包括以下步骤：在所述宿主细胞表达所述抗体蛋白并分离所述抗体蛋白的条件下培养本发明的宿主。本发明的抗体按照如下方法生成：编码轻链和重链的核酸分子可以通过标准方法以化学的和酶促的方式合成。首先，可用本领域已知的方法合成合适的寡核苷酸(详见上文)；从寡核苷酸产生合成基因的方法在本领域中是已知的(上文详述)；所述编码抗体重链和轻链的核酸分子可以被克隆到表达载体中(两条链在一个载体分子中，或者每条链分别进入一个单独的载体分子)，然后将其导入宿主细胞。宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞(上文详述)，例如COS、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)或BHK细胞；然后在产生抗体的条件下，在合适的培养基中培养宿主细胞，然后根据标准程序从培养物中分离抗体。在宿主细胞和各自的表达载体中从重组DNA生产抗体的方法在本领域中是公知的(例如参见WO 94/11523、WO 97/9351、EP0481790)。
本发明还涉及一种方法，其中宿主是哺乳动物细胞，优选CHO或COS细胞。
在某些实施方式中，宿主细胞与携带轻链或重链表达单元的两个质粒共转染。
实施例
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应该被解释对本发明公开范围的限制。
实施例1抗CD44v6单克隆抗体119和抗CD44v9单克隆抗体116的活细胞单克隆抗体阵列分离(MabArray Isolation)
如图1A所示，使用Arrayjet打印机将约6×104种不同的单克隆抗体(mAbs)打印至玻璃醛芯片上(75×25mm)以生成MabArray。随后在实验开始前，用10％牛血清白蛋白(BSA)将MabArray芯片封闭过夜。采用绿色荧光核酸染色剂SYTO14(ThermoFisher Science)对肺癌细胞系PC9活细胞进行标记，并以1×107细胞/ml的密度与芯片在PBS中孵育1h。随后，采用PBS温和洗涤MabArray芯片并用Genepix扫描仪进行扫描。
图1B示出了4个独立的PC9活细胞MabArray实验组中的mAb119和对照组mAb的图像。活的PC9细胞被MabArray芯片上的mAb119捕获。
实施例2 mAb119抗原在PC9细胞表面进行表达，并被PC9细胞内化
图2示出了PC9细胞上mAb119的FACs分析结果。mAb119的PC9 FACs滴定是通过将PC9细胞与mAb119的连续稀释液(30000pM-0.1pM，3倍连续稀释液)在冰上孵育30min来进行的，然后采用Alexa-488偶联的抗小鼠IgG(Jackson lab)对细胞染色30min。采用BD C6对MFI进行分析。亲和力KD被测定为约2nM。
图3示出了PC9细胞内化结合的mAb119。在盖玻片上培养PC9活细胞，并与10μg/ml的mAb119在冰上孵育1h，然后用PBS洗涤细胞3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定，然后通过FACs用二级抗体偶联的FITC进行检测。然后用mAb119(用绿色荧光染料Alexa488标记)和抗LAMP1(用红色荧光染料Alexa595标记)对PC9细胞进行共染色。具体而言，PC9细胞采用0.1％TritonX渗透，并与mAb119和兔抗LAMP1抗体(1:200，Abcam)和mAb119一起孵育1h。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体和Alexa595偶联的抗兔抗体分别标记抗体。溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)是一种主要通过溶酶体膜表达的糖蛋白。mAb119和抗LAMP1信号的共定位产生黄色信号，表明PC9细胞将mAb119内化至溶酶体区室。在0h时，在细胞表面首次观察到mAb119，其并未与LAMP1共定位。在2h和4h时，观察到mAb119和LAMP1的共定位。
基于表面荧光的流式细胞分析(FACs)显示mAb119在PC9细胞上内化(数据未显示)。具体来说，将PC9活细胞与10μg/ml的mAb119在冰上孵育0.5h，用PBS洗涤3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体对细胞进行染色，并通过计算表面MFI用流式细胞仪进行分析。表面MFI表征了mAb119的表面共定位情况，在37℃孵育2h和4h后，表面MFI分别降低了70％和80％。显示的是FACs数据的量化，表示为PC9细胞内化的平均百分比±SEM(n＝3)。纵轴表示相对表面荧光度(％)。数据表明，mAb119可以结合膜抗原，并在PC9细胞内化。
实施例3 mAb119的直接细胞毒性是抗原表达依赖性的
图4示出了mAb119的间接细胞毒性是抗原表达依赖性的。PC9或TE1细胞在96孔板中以2000细胞/孔的密度融合培养过夜，细胞用mAb119和2μg/mlMMAE偶联的山羊抗小鼠抗体连续稀释液处理72h，然后通过CCK8(dojindo)计算细胞数。在TE1和PC9细胞中观察到不同的细胞毒性。抗体混合物抑制PC9生长，所述混合物中IC50的浓度为18pM，而同样的抗体混合物并未抑制TE1细胞生长。显示的是来自TE1和PC9细胞的代表性数据，表示为平均生长抑制百分比±SEM(n＝3)。
mAb119抗原在两种细胞系中的表达也通过流式细胞仪测定。侧面的嵌入图显示了由mAb119标记的TE1(顶部图)和PC9(底部图)的FACs分析结果。结果表明表达mAb119抗原的是PC9细胞而非TE1细胞。因此间接细胞毒性与抗原表达呈正相关。
实施例4 mAb119靶向人CD44 v6外显子
图5A和5B示出了mAb119靶向的人的CD44v6外显子。PC9被靶向人CD v6表位或对照siRNA的4种不同siRNA的混合物转染48h。然后转染细胞用mAb119染色或者用流式细胞仪(FACs)分析，或者提取总蛋白并用蛋白质印迹法评估mAb119抗原的丰度。CD44v6的敲除降低了FACs中mAb119的表面染色强度(图5A，FACs数据显示CD44v 6siRNA(V6.si)抑制了mAb119的表面信号(代表n＝3))。CD44v6的敲除也降低了mAb119抗原的蛋白表达水平(图5B，蛋白质印迹数据显示CD44v6 siRNA(V6.si)抑制了mAb119抗原的蛋白表达(代表n＝3))。数据表明，mAb119靶向CD44v6。
使用mAb119作为抗原结合部分制备抗体药物偶联物。图6A是mAb119-ADC(AMT119)的结构示意图，其中mAb119与MC-vc-PAB-MMAE偶联。图6B是AMT119的高效液相色谱-疏水性相互作用色谱图。平均药物抗体比(DAR)约为6。
图7示出了AMT119在PC9和TE1细胞中的细胞毒性。图中是从PC9和TE1细胞获得的代表性数据，显示了AMT119的平均生长抑制百分比±SEM(n＝3)。PC9和TE1细胞的IC50值分别为2,600pM和39,000pM。这种差异与CD44v6在两种细胞系中的不同表达水平一致(见图4)。
实施例5 CD44v 6在人非小细胞肺癌中的表达
图8A和8B示出了CD44v6在人非小细胞肺癌(NSCLC，图8A的右图)和正常肺组织(图8A的左图)中的表达情况。使用mAb119抗体从一系列正常和癌症组织中显示出了CD44v6蛋白的IHC(免疫组织化学)检测，其中显示了CD44v6以肿瘤特异性方式上调。显微照片图像描绘了代表0、1+、2+和3+染色强度的肿瘤组织(图8A的右图)。图8B显示CD44v6在非小细胞肺癌不同亚型中的患病率。其中，SCC，鳞状细胞癌；LCC，大细胞癌。
实施例6 mAb116抗原在PC9细胞表面进行表达，并被PC9细胞内化
图9示出了PC9细胞上mAb116的FACs分析结果。mAb116的PC9 FACs滴定是通过将PC9细胞与mAb116的连续稀释液(30000pM-0.1pM，3倍连续稀释液)在冰上孵育30min来进行的，然后采用Alexa488偶联的抗小鼠IgG(Jackson lab)对细胞染色30min。使用BD C6对MFI进行分析。亲和力KD被测定为约980pM(或0.98nM)。
图10示出了PC9细胞内化结合的mAb116。在盖玻片上培养PC活细胞，并与10μg/ml的mAb116在冰上孵育1h，然后用PBS洗涤细胞3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定，然后通过FACs用二级抗体偶联的FITC进行检测。然后用mAb116(用绿色荧光染料Alexa488标记)和抗LAMP1(用红色荧光染料Alexa595标记)对PC9细胞进行共染色。具体而言，PC9细胞采用0.1％Triton X渗透，并与mAb116和兔抗LAMP1抗体(1:200，Abcam)以及mAb116一起孵育1h。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体和Alexa595偶联的抗兔抗体分别标记抗体。mAb116和抗LAMP1信号的共定位产生黄色信号，表明PC9细胞将mAb116内化至溶酶体区室。在0h时，在细胞表面首次观察到mAb116，其并未与LAMP1共定位。在2h和4h时，观察到mAb119和LAMP1的共定位。
基于表面荧光的流式细胞分析(FACs)显示mAb116在PC9细胞上内化(数据未显示)。具体来说，将PC9活细胞与10μg/ml的mAb116在冰上孵育0.5h，用PBS洗涤3次。然后将细胞在37℃培养0h、2h或4h，然后用4％的多聚甲醛溶液(PFA)固定。然后用Alexa488偶联的抗小鼠抗体对细胞进行染色，并通过计算表面MFI用流式细胞仪进行分析。表面MFI表征了mAb116的表面共定位情况，在37℃孵育4h后，表面MFI降低了约90％。显示的是FACs数据的量化，表示为PC9细胞内化的平均百分比±SEM(n＝3)。纵轴表示相对表面荧光度(MFI，％)。数据表明，mAb116可以结合膜抗原，并在PC9细胞内化。
实施例7单克隆抗体116的间接细胞毒性依赖于抗原表达
图11示出了mAb116和对照IgG的间接细胞毒性。PC9细胞在96孔板中以2000细胞/孔的密度融合培养过夜，然后用mAb116或IgG的连续稀释液与2μg/ml MMAE偶联的山羊抗小鼠IgG抗体一起处理细胞72h，然后通过CCK8(dojindo)计算细胞数。mAb116抗体混合物抑制了PC9的生长，所述混合物中IC50的浓度为30pM，但IgG混合物并未产生任何影响。显示的是来自于PC9细胞的代表性数据，表示为平均生长抑制百分比±SEM(n＝3)。
实施例8 mAb116靶向人CD44 v9外显子
图12A和12B示出了mAb116靶向的人的CD44 v9外显子。PC9被靶向人CD44 v9表位或对照siRNA的siRNA转染48h。然后转染细胞用mAb116染色或者用流式细胞仪(FACs)分析，或者提取总蛋白并用蛋白质印迹法评估mAb116抗原的丰度。CD44v9的敲除降低了FACs中mAb116的表面染色强度(图12A，FACs数据显示CD44v9 siRNA(V9.si)抑制了mAb116的表面信号(代表n＝3)。CD44v9的敲除也降低了mAb116抗原的蛋白表达水平(图12B)。数据表明，mAb116靶向CD44v9。
使用mAb116作为抗原结合部分制备抗体药物偶联物。图13A是mAb116-ADC(AMT116)的结构示意图，其中mAb116与MC-vc-PAB-MMAE偶联。图13B是AMT116的高效液相色谱-疏水性相互作用色谱图。平均药物抗体比(DAR)约为4.23。
图14示出了AMT116在PC9和KYSE-150(食管癌细胞系)细胞中的细胞毒性。图中是从PC9和KYSE-150细胞获得的代表性数据，其中显示了AMT116和IgG对照(n＝3)的平均生长抑制百分比±SEM。AMT116在PC9和KYSE-150细胞中的IC50值分别为134pM和670.2pM。
图15示出了AMT116的体内功效。将约5×106个KYSE-150细胞悬浮于1:1基质胶中，然后将其注射至雌性Balb/c裸鼠(8-10周，20-22g)的右侧腋下。肿瘤体积(以0.5×长度×宽度2的方式测定)和体重每周至少测定两次。小鼠基于给药前的初始肿瘤大小(平均肿瘤体积为约250-500mm3)进行随机分组(n＝5/组)。通过静脉输注(3mg/kg，q3d×3)施用载体(PBS)、AMT116或对照ADC。绘制整个研究期间的组平均肿瘤体积图。
实施例9 CD44v 9在人非小细胞肺癌和其他癌症中的表达
图16A和16B示出了CD44v9在人非小细胞肺癌(图16A的右图)和正常肺组织(图16A的左图)中的表达。使用mAb116抗体从一系列正常和癌症组织中显示了CD44v9蛋白的IHC检测，其中显示了CD44v9以肿瘤特异性方式上调。显微照片图像描绘了代表0、1+、2+和3+染色强度的肿瘤组织(图16A的右图)。图16B显示CD44v9在非小细胞肺癌不同亚型中的患病率。其中，SCC，鳞状细胞癌；LCC，大细胞癌。
图17示出了CD44v9在多种肿瘤细胞类型中的过表达情况。使用mAb116抗体从一系列正常和癌症组织中显示了CD44v9蛋白的IHC检测，其中显示了CD44v9以肿瘤特异性方式上调。
实施例10抗体序列
mAb119和mAb116的不同区域/结构域的序列如下所列。
表1 mAb119的不同区域的序列
Figure BDA0002677076120000601
Figure BDA0002677076120000602
HEGYRQTPKE(SEQ ID NO:19)-用于提高主题的抗CD44v6抗体的CD44v6表位序列
HEGYRQTPKEDS(SEQ ID NO:24)
表2 mAb116的不同区域的序列
Figure BDA0002677076120000611
SHEGLEEDKD(SEQ ID NO:43)-用于提高主题的抗CD44v9抗体的CD44v9表位序列
SHEGLEEDKDH(SEQ ID NO:44)

Claims (84)

1.一种具有分离的CD44v6表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位包括/实质上由SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ IDNO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQ ID NO:19组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v6表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v6表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：
(1)重链可变区(HCVR)，其包括SEQ ID NO:1的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:2的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:3的HCVR CDR3序列；
(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:10的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:11的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:12的LCVR CDR3序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位是SEQ ID NO:19。
4.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位实质上由SEQ ID NO:19组成(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:19加上SEQID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。
5.根据权利要求4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位是SEQ ID NO:24(HEGYRQTPKEDS)。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述HCVR进一步包含SEQ ID NOs:7-9中的一个或多个；和/或
(ii)所述LCVR进一步包括SEQ ID NOs:13-18中的一个或多个。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v6表位或具有所述CD44v6表位的细胞结合，其KD为约10nM、约5nM或约2nM或更小。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
10.一种具有对分离的CD44v9表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位包含/实质上由SEQ ID NO:43(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:43的C端上的1或2个残基，或者SEQID NO43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQ IDNO:43组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v9表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v9表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。
11.根据权利要求10所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：
(1)重链可变区(HCVR)，其包括SEQ ID NO:25的HCVR CDR1序列、SEQ ID NO:26的HCVRCDR2序列和SEQ ID NO:27的HCVR CDR3序列；
(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQ ID NO:34的LCVR CDR1序列、SEQ ID NO:35的LCVRCDR2序列和SEQ ID NO:36的LCVR CDR3序列。
12.根据权利要求10或11所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位是SEQ ID NO:43。
13.根据权利要求10或11所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位实质上由SEQ ID NO:43组成(例如，由SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N 端上的1或2个残基，SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ ID NO:43加上SEQ ID NO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。
14.根据权利要求13所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位是SEQ ID NO:44(SHEGLEEDKDH)。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述HCVR进一步包含SEQ ID NOs:28-33中的一个或多个；和/或
(ii)所述LCVR进一步包括SEQ ID NOs:37-42中的一个或多个。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v9表位或具有所述CD44v9表位的细胞结合，其KD为约10nM、约5nM、约2nM、约1nM或更小。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
19.一种多肽，其包含权利要求1-9中任一项所述的HCVR和/或LCVR。
20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白(如嵌合抗原T细胞受体)。
21.一种多肽，其包含权利要求10-18中任一项所述的HCVR和/或LCVR。
22.根据权利要求21所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白(如嵌合抗原T细胞受体)。
23.一种编码权利要求19或20中多肽的多核苷酸。
24.一种编码权利要求21或22中多肽的多核苷酸。
25.一种包含权利要求23中多核苷酸的载体。
26.根据权利要求25所述的载体，其中所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
27.一种包含权利要求24中多核苷酸的载体。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。
29.一种细胞，其包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含权利要求19或20中的多肽，包含权利要求23中的多核苷酸，或权利要求25或26中的载体。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞对权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽进行表达。
31.根据权利要求29或30所述的细胞，其中所述细胞是BHK细胞、CHO细胞或COS细胞。
32.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽。
33.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是携带嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)，所述嵌合抗原受体包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽。
34.一种细胞，其包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含权利要求21或22中的多肽，包含权利要求24中的多核苷酸，或权利要求27或28中的载体。
35.根据权利要求34所述的细胞，其中所述细胞对权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽进行表达。
36.根据权利要求34或35所述的细胞，其中所述细胞是BHK细胞、CHO细胞或COS细胞。
37.根据权利要求34所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述细胞是携带嵌合抗原受体(CAR-T细胞)的T细胞，所述嵌合抗原受体包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽。
39.一种生产权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中多肽的方法，包括：
(a)培养权利要求29、30或31中的细胞；和；
(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
41.一种生产权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中多肽的方法，包括：
(a)培养权利要求34、35或36中的细胞；和；
(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
43.一种具有下述分子式的免疫偶联物(或抗体-药物偶联物或ADC):
Ab-[-L-D]n，
其中：
Ab是权利要求1-9任一项中的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽，其共价连接到一个或多个接头-药物部分-[-L-D]单元，其中L是接头，而D是细胞毒性药物；并且，
n是从1到20的整数(例如，从1到12)；并且
其中每个接头-药物部分可以具有相同或不同的接头L或细胞毒性药物D。
44.根据权利要求43所述的免疫偶联物，其中每个接头-药物部分-[-L-D]通过Lys的侧链氨基与Ab共价连接。
45.根据权利要求43所述的免疫偶联物，其中每个接头-药物部分-[-L-D]通过Cys的侧链巯基与Ab共价连接。
46.根据权利要求43所述的免疫偶联物，其中每个接头-药物部分-[-L-D]通过位点特异性掺入的非天然氨基酸与Ab共价连接。
47.根据权利要求43-46任一项所述的免疫偶联物，其中每个接头L包含一个肽单元。
48.根据权利要求47所述的免疫偶联物，其中所述肽单元包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、2-10或2-5个氨基酸残基。
49.根据权利要求43-48任一项所述的免疫偶联物，其中接头L不可被蛋白酶(例如组织蛋白酶)裂解。
50.根据权利要求43-48任一项所述的免疫偶联物，其中接头L是可被蛋白酶(例如，组织蛋白酶)、酸性环境或氧化还原状态变化裂解的可裂解接头。
51.根据权利要求43-50任一项所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性药物是DNA嵌入剂、微管结合剂、拓扑异构酶I抑制剂或DNA小沟结合剂。
52.根据权利要求51所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性药物是澳瑞他汀类如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，美登素类如DM-1、DM-3、DM-4，刺孢霉素(calicheamicin)如奥加米星、SN-38或PBD(吡咯并苯二氮卓)。
53.一种具有下述分子式的免疫偶联物(或抗体-药物偶联物或ADC):
Ab-[-L-D]n，
其中：
Ab是权利要求10-18任一项中的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽，其共价连接到一个或多个接头-药物部分-[-L-D]单元，其中L是接头，而D是细胞毒性药物；并且，
n是从1到20的整数(例如，从1到12)；并且
其中每个接头-药物部分可以具有相同或不同的接头L或细胞毒性药物D。
54.根据权利要求53所述的免疫偶联物，其中每个接头-药物部分-[-L-D]通过Lys的侧链氨基与Ab共价连接。
55.根据权利要求53所述的免疫偶联物，其中每个接头-药物部分-[-L-D]通过Cys的侧链巯基与Ab共价连接。
56.根据权利要求53所述的免疫偶联物，其中每个接头-药物部分-[-L-D]通过位点特异性掺入的非天然氨基酸与Ab共价连接。
57.根据权利要求53-56任一项所述的免疫偶联物，其中每个接头L包含一个肽单元。
58.根据权利要求57所述的免疫偶联物，其中所述肽单元包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、2-10或2-5个氨基酸残基。
59.根据权利要求53-58任一项所述的免疫偶联物，其中接头L不可被蛋白酶(例如组织蛋白酶)裂解。
60.根据权利要求53-58任一项所述的免疫偶联物，其中接头L是可被蛋白酶(例如，组织蛋白酶)、酸性环境或氧化还原状态变化裂解的可裂解接头。
61.根据权利要求53-60任一项所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性药物是DNA嵌入剂、微管结合剂、拓扑异构酶I抑制剂或DNA小沟结合剂。
62.根据权利要求61所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性药物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，DM-1、DM-3、DM-4，或PBD(吡咯并苯二氮卓)。
63.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽，或权利要求43-52中任一项的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
64.一种药物组合物，其包含权利要求10-18中任一项的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽，或权利要求53-62中任一项的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
65.一种抑制表达CD44v6的细胞生长的方法，包括将该细胞与权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽，或权利要求43-52中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求63中的药物组合物进行接触。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述肿瘤细胞来自肺癌(如NSCLC(非小细胞肺癌))。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述肿瘤细胞来自结肠直肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
69.一种抑制表达CD44v9的细胞生长的方法，包括将该细胞与权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽，或权利要求53-62中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求64中的药物组合物进行接触。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤细胞来自肺癌(如NSCLC(非小细胞肺癌))。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤细胞来自结肠直肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或脑转移癌。
73.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6，所述方法包括给受试者施用有效治疗剂量的CD44v6拮抗剂，所述拮抗剂包含CD44v6抗体或其抗原结合片段。
74.一种用于治疗受试者中的细胞增殖紊乱的方法，其中所述细胞增殖紊乱的细胞表达CD44v6，所述方法包括给受试者施用有效治疗剂量的CD44v6拮抗剂，所述CD44v6拮抗剂包含CD44v 6抗体或其抗原结合片段。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述CD44v6的拮抗剂包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽，或权利要求43-52中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求63中的药物组合物。
76.根据权利要求73或75所述的方法，其中所述癌症是上皮癌，所述癌症包括如下来源：乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺或肾；是骨和软组织肉瘤，比如骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、平滑肌肉瘤；是造血系统恶性肿瘤，比如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病；是神经外胚层肿瘤，比如周围神经肿瘤、星形细胞瘤或黑色素瘤；或者是间皮瘤。
77.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v9，所述方法包括给所述受试者施用有效治疗剂量的CD44v9拮抗剂，所述拮抗剂包含CD44v9抗体或其抗原结合片段。
78.一种用于治疗受试者的细胞增值紊乱的方法，其中所述细胞增殖紊乱的细胞表达CD44v9，所述方法包括给所述受试者施用有效治疗剂量的CD44v9拮抗剂，所述CD44v9拮抗剂包含CD44v 9抗体或其抗原结合片段。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述CD44v9的拮抗剂包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽，或权利要求53-62中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求64中的药物组合物。
80.根据权利要求77或79所述的方法，其中所述癌症包括如下来源：乳腺、肺、肝、结肠直肠、头颈部、食管、胰腺、卵巢、膀胱、胃、皮肤、子宫内膜、卵巢、睾丸、食管、前列腺或肾；是骨和软组织肉瘤，比如骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤；是造血系统恶性肿瘤，比如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病；是神经外胚层肿瘤，比如周围神经肿瘤、星形细胞瘤或黑色素瘤；或者是间皮瘤。
81.一种测定来自受试者的样品中CD44v6的存在和/或丰度的方法，所述方法包括将样品与权利要求1-9任一项中的抗体或其抗原结合片段接触。
82.一种测定来自受试者的样品中CD44v9的存在和/或丰度的方法，所述方法包括将样品与权利要求10-18任一项中的抗体或其抗原结合片段接触。
83.一种诊断和治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6，所述方法包括：
(1)使用权利要求81中的方法来测定来自所述受试者的癌症样品中CD44v6的存在和/或丰度，以鉴定所述癌症样品中表达CD44v6的主体；
(2)给所述受试者施用有效治疗剂量的权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽，或权利要求43-52中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求63中的药物组合物。
84.一种诊断和治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达CD44v9，所述方法包括：
(1)使用权利要求82中的方法来测定来自所述受试者的癌症样品中CD44v9的存在和/或丰度，以鉴定所述癌症样品中表达CD44v9的主体；
(2)给所述受试者施用有效治疗剂量的权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽，或权利要求53-62中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求64中的药物组合物；
从而诊断和治疗患有癌症的受试者。
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