KR20150124954A - Dlk 안정성을 조절하는 방법 - Google Patents

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KR20150124954A
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데이지 부스토스
사라 헌트워크-로드리게즈
도날드 커크패트릭
조셉 웨슬리 류콕
아룬드하티 센굽타 고쉬
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 감소시키거나 억제하고 DLK의 안정성을 감소시키는 작용제를 뉴런 또는 그의 부분에 투여하는 것을 포함하는, 뉴런에서 DLK 안정성을 감소시키거나 또는 DLK의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 감소시키거나 억제하는 방법, 뿐만 아니라 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 억제하는 작용제를 환자에게 투여함으로써 환자에서 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는 방법을 제공한다.

Description

DLK 안정성을 조절하는 방법 {METHODS OF MODULATING DLK STABILITY}
관련 출원
본원은 2013년 2월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/770,959를 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK) 인산화의 억제를 통해 DLK의 안정성을 감소시킴으로써 뉴런 변성을 방지하는 방법에 관한 것이다.
축삭 변성 및 뉴런 세포 사멸은 뉴런 연결을 정밀화하기 위한 발생 동안 (Oppenheim, R.W. Annual review of neuroscience 14, 453-501 (1991); Luo, L. & O'Leary, D.D. Annual review of neuroscience 28, 127-156 (2005)), 훼손된 세포를 제거하기 위한 손상 후에 (Quigley, H.A. et al. Investigative ophthalmology & visual science 36, 774-786 (1995)), 및 신경변성 질환, 예컨대 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 알츠하이머병에서 (Vila, M. & Przedborski, S. Nature reviews. Neuroscience 4, 365-375 (2003)) 일어난다. 이러한 상황에서 신경변성을 일으키는 인자는 폭넓게 다양하지만, 많은 신경변성 맥락에 공통인 것처럼 보이는 보존된 신호전달 사건이 축삭 변성 및 뉴런 아폽토시스를 개시하는 것으로 확인되었다. 이것의 한 예는 둘 다의 발생에서 (Ham, J. et al. Neuron 14, 927-939 (1995); Kuan, C.Y. et al. Neuron 22, 667-676 (1999); Southwell, D.G. et al. Nature 491, 109-113 (2012); White, F.A., Keller-Peck, C.R., Knudson, C.M., Korsmeyer, S.J. & Snider, W.D. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 18, 1428-1439 (1998)) 및 신경변성 질환 병리상태의 일부로서 (Hunot, S. et al. PNAS 101, 665-670 (2004); Martin, L.J. Journal of neuropathology and experimental neurology 58, 459-471 (1999); Vila, M. et al. PNAS 98, 2837-2842 (2001); Yao, M., Nguyen, T.V. & Pike, C.J. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 25, 1149-1158 (2005)) 축삭 변성 및 뉴런 아폽토시스를 활성화하는데 있어서 Bax 및 c-Jun의 상류에서 작용하는 Jun N-말단 키나제 (JNK)이다. 각각의 이러한 상황에서, Bax-의존성 카스파제 활성화는 JNK 활성화의 하류에서 프로그램화된 세포 사멸 및 축삭 변성을 수행하는 것이 필요한 것처럼 보인다 (Simon, D.J. et al. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 32, 17540-17553 (2012); Pettmann, B. & Henderson, C.E. Neuron 20, 633-647 (1998); Gagliardini, V. et al. Science 263, 826-828 (1994); Yuan, J. & Yankner, B.A. Nature 407, 802-809 (2000)).
이중 류신 지퍼 보유 키나제 (DLK)는 스트레스-유도 뉴런 JNK 활성화에 요구되는 혼합 계통 키나제 (MLK) 패밀리의 진화적으로 보존된 고도 뉴런-특이적 구성원이다 (Hirai, S. et al. Gene expression patterns : GEP 5, 517-523 (2005); Ghosh, A.S. et al. The Journal of cell biology 194, 751-764 (2011); Watkins, T.A. et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. In Press (2013); Chen, X. et al. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 28, 672-680 (2008)). 포유동물에서의 DLK의 손실은 발생에서 및 축삭 손상 후에 아폽토시스 및 축삭 변성을 약화시키기에 충분하다 (Ghosh, A.S. et al. (2011); Watkins, T.A. et al. In Press (2013); Chen, X. et al. (2008); Miller, B.R. et al. Nature neuroscience 12, 387-389 (2009)). 무척추동물에서, DLK에 대한 뚜렷한 기능은 E3 유비퀴틴 리가제의 PHR 패밀리 (PAM/highwire/RPM-1)가 DLK 수준을 음성 조절하여 시냅스 발생을 제어한다는 것을 입증한 연속 유전적 스크린을 통해 확인되었다 (Collins, C.A., Wairkar, Y.P., Johnson, S.L. & DiAntonio, A. Neuron 51, 57-69 (2006); Nakata, K. et al. Cell 120, 407-420 (2005)). 탈유비퀴틴화 효소 (DUB) fat facets (faf)의 과다발현은 highwire 돌연변이체에 유사한 시냅스 표현형을 생성하며, 이는 Faf가 PHR 리가제와 반대로 작용하여 DLK 수준을 양성 조절할 수 있다는 것을 시사한다 (Collins, C.A., Wairkar, Y.P., Johnson, S.L. & DiAntonio, A. (2006)). 유사한 메카니즘이 드로소필라(Drosophila)에서의 신경 손상 후에 DLK를 조절하는 것처럼 보이며, 여기서 DLK 수준은 PHR-의존성 방식으로 신속히 상향조절된다 (Xiong, X. et al. The Journal of cell biology 191, 211-223 (2010)). 씨. 엘레간스(C. elegans)에서, 손상 후의 DLK 활성은 또한 뉴런의 훼손된 영역에 대한 DLK 활성화를 제한하는 보다 짧은 DLK 이소형과의 이종이량체화를 통해 조절된다 (Yan, D. & Jin, Y. Neuron 76, 534-548 (2012)).
무척추동물 시스템에서의 연구를 통해 얻은 기계론적 지식에도 불구하고, DLK가 포유동물 뉴런에서 유사하게 조절될지 여부에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 마우스 PHR 유비퀴틴 리가제인 Phr1의 발현이 결핍된 마우스는 전체 뇌에서 DLK 존재비의 총 변화를 보이지 않고, DLK의 손실은 Phr1 돌연변이체에서 관찰된 축삭 경로설정 결함을 억제하지 못한다 (Bloom, A.J., Miller, B.R., Sanes, J.R. & DiAntonio, A. Genes & development 21, 2593-2606 (2007)). 그러나, 포유동물 뉴런 손상 패러다임에서의 유비퀴틴-프로테아솜 시스템에 의한 DLK 수준의 조절은 엄밀히 조사되지 않았다.
DLK는 뉴런 손상을 감지하고 변성 및 재생 신호전달 둘 다를 일으키는 MAP3K이다 (Ghosh, A.S. et al. (2011); Watkins, T.A. et al. In Press (2013); Miller, B.R. et al. (2009); Shin, J.E. et al. Neuron 74, 1015-1022 (2012)). DLK의 손실은 매우 폭넓게 다양한 뉴런 스트레스 패러다임에서 JNK 활성화 및 하류 반응을 완전히 억제하기에 충분하나 (Watkins, T.A. et al. In Press (2013)), 어떻게 DLK가 포유동물 뉴런에서 뉴런 스트레스에 의해 그 자체로 조절되는지에 관해서는 분명하지 않았다. 본원에 기재된 실시예는 포유동물 뉴런에서 다음을 입증한다: (1) DLK 양은 뉴런 스트레스에 대한 반응에서 조기에 급속히 증가함, (2) DLK 수준은 JNK 활성이 단백질 안정성을 조절하는 DLK 내의 수많은 부위의 인산화를 조절하는 양성 피드백 루프에 의해 제어됨, (3) DLK 수준은 Phr1 및 USP9X에 의해 조절됨, (4) DLK 단백질 안정성의 변경은 DLK 신호전달의 스트레스-유도 활성화에 관계없이 발생할 수 있음, 및 (5) DLK 단백질 양은 하류 신호전달의 양을 직접적으로 제어함.
본 발명은 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화의 억제를 통해 DLK 안정성을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 DLK의 인산화를 억제하고, 특히 DLK의 특정한 아미노산 잔기의 인산화를 억제하는 작용제의 투여를 통해 환자에서 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 DLK 수준이 다양한 유형의 뉴런 스트레스 후에 재현가능하게 증가한다는 관찰을 기초로 한다. 이론에 얽매이지 않으면서, Phr1 및 데유비퀴티나제 (DUB) USP9X는 DLK 활성을 조절하지 않을지라도 뉴런에서 DLK 단백질의 존재비를 면밀히 조절하는 기능을 한다. 뉴런-손상-의존성 활성화 후에, DLK는 과인산화되며, 이로 인해 DLK 키나제 활성을 조절하는 것과는 구별되는, 키나제 도메인 밖의 특정한 JNK 의존성 인산화 사건을 통해 단백질 안정성이 증가된다. 따라서, DLK 경로 활성화는 DLK 단백질의 수준을 증가시키고, 차례로 하류 표적의 인산화를 증진시키며, 뉴런이 손상에 적절히 반응하도록 하는 보다 완전한 반응으로 등급별 또는 국부 DLK 신호전달을 전환시키는 피드백 메카니즘을 생성한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 감소시키거나 억제하고 DLK의 안정성을 감소시키는 작용제를 뉴런 또는 그의 부분에 투여하는 것을 포함하는, 뉴런에서 DLK 안정성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 특정한 DLK 아미노산 잔기 또는 잔기들의 인산화를 억제하거나 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 억제하거나 감소시키는 작용제를 뉴런 또는 그의 부분에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인산화의 억제 또는 감소는 DLK 단백질 안정성을 감소시키는 것인, DLK의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 억제하거나 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 억제하거나 감소시키는 작용제를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인산화의 억제 또는 감소는 DLK의 안정성을 감소시키는 것인, 환자에서 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 특정한 DLK 아미노산 잔기 또는 잔기들의 인산화를 억제하거나 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 인산화 형태의 DLK를 특이적으로 인식하는 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키고; (b) 생물학적 샘플 내에서의 인산화 형태의 DLK에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 항체에 의한 결합은 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 나타내는 것인, 뉴런에서 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 인산화 형태의 DLK에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 대조군 대비 생물학적 샘플에서의 항체의 결합의 증가는 뉴런에서 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 뉴런, 뉴런 세포 용해물 및 뉴런으로부터 정제된 DLK로부터 선택된 생물학적 물질을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 특정한 DLK 아미노산 잔기, 예컨대 서열 1 (인간 DLK)의 위치 43의 트레오닌 (T43); 서열 2 (뮤린 DLK)의 위치 43의 트레오닌; 서열 1 (인간 DLK)의 위치 500의 세린 (S500); 서열 2 (뮤린 DLK)의 위치 533의 세린 (S533) 또는 그의 임의의 조합의 인산화를 억제하거나 감소시킨다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 서열 1 (인간 DLK)의 위치 43의 트레오닌 (T43); 서열 2 (뮤린 DLK)의 위치 43의 트레오닌; 서열 1 (인간 DLK)의 위치 500의 세린 (S500); 서열 2 (뮤린 DLK)의 위치 533의 세린 (S533)과 등가의 잔기인, 다른 종으로부터의 DLK 또는 이소형에서의 특정한 아미노산 잔기 및 그의 임의의 조합의 인산화를 억제한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 항체, 소분자, 폴리펩티드 및 짧은 간섭 RNA (siRNA)로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 구체적 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 뉴런 또는 그의 부분에 투여된다. 특정 실시양태에서, 뉴런 또는 그의 부분은 인간 대상체에 존재하거나, 신경 이식편 또는 신경 이식물에 존재하거나, 또는 생체외 또는 시험관내에 존재한다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 JNK 억제제이고/거나, 방법은 JNK 억제제인 추가의 작용제의 투여를 추가로 포함한다. 구체적 실시양태에서, JNK 억제제는 JNK1, JNK2, JNK3 또는 JNK1, JNK2 및 JNK3의 임의의 조합을 억제한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 JNK 억제제는 JNK1, JNK2 및 JNK3을 억제하거나; 또는 JNK1 및 JNK2를 억제하거나; 또는 JNK1 및 JNK3을 억제하거나; 또는 JNK2 및 JNK3을 억제한다. 구체적 실시양태에서, JNK 억제제는 JNK 억제제 V, JNK 억제제 VII (TAT-TI-JIP153 -163), JNK 억제제 VIII 및 JNK 폴리펩티드의 발현을 억제하는 siRNA로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, 치료할 환자는 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨-플러스병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 설인 신경통, 벨 마비, 중증 근무력증, 근육 이영양증, 진행성 근육 위축, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 가성 연수 마비, 진행성 연수 마비, 척수성 근육 위축, 유전성 근육 위축, 추간판 증후군, 경부 척추증, 신경총 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 헌팅톤병, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 루이 소체 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 프리온 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌병증, 픽병, 간질, 및 AIDS 치매 복합증, 만성 통증, 섬유근육통, 척추 통증, 손목 터널 증후군, 암으로 인한 통증, 관절염, 좌골신경통, 두통, 수술로 인한 통증, 근육 연축, 요통, 내장통, 손상으로 인한 통증, 치통, 신경통, 예컨대 신경성 또는 신경병증성 통증, 신경 염증 또는 손상, 대상포진, 추간판 탈출, 찢어진 인대, 및 당뇨병; 당뇨병, 암, AIDS, 간염, 신장 기능장애, 콜로라도 진드기열, 디프테리아, HIV 감염, 나병, 라임병, 결절성 다발동맥염, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 전신 홍반성 루푸스 또는 아밀로이드증에 의해 야기되는 말초 신경병증 또는 신경통; 독성 화합물, 중금속, 산업용 용매, 약물, 화학요법제, 답손, HIV 의약, 콜레스테롤 강하 약물, 심장 또는 혈압 의약, 또는 메트로니다졸에 대한 노출에 의해 야기되는 신경 손상; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상에 의해 야기되는 신경계에 대한 손상; 정신분열증, 망상 장애, 분열정동 장애, 정신분열형, 공유 정신병적 장애, 정신병, 편집성 인격 장애, 분열성 인격 장애, 경계성 인격 장애, 반사회적 인격 장애, 자기애성 인격 장애, 강박 장애, 섬망, 치매, 기분 장애, 양극성 장애, 우울증, 스트레스 장애, 공황 장애, 광장공포증, 사회 공포증, 외상후 스트레스 장애, 불안 장애, 및 충동 조절 장애; 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성 또는 건성 AMD와 연관된 광수용체 변성, 다른 망막 변성, 시신경 드루젠, 시신경병증, 및 시신경염으로부터 선택된 질환 또는 상태를 앓고 있다.
도 1 DLK 단백질 수준 및 분자량은 시험관내 및 생체내 스트레스 패러다임 둘 다에서 뉴런 스트레스에 반응하여 증가한다. (a) 배아 후근 신경절 (DRG) 뉴런을 신경 성장 인자 (NGF)의 존재 하에 5일 동안 배양하였고, 이어서 4개의 별개 시험에서 3시간 동안 NGF를 고갈시켰다. 반응에서, DLK 양이 증가하고, 이러한 증가는 DLK의 상향 이동성 변화를 동반한다. cJun 인산화 (p-cJun)는 DLK 활성화의 하류 결과로서 일어난다. (b) 시신경이 파쇄된 망막 및 그의 파쇄되지 않은 반대쪽 대조군을 수술 후 제3일에 수집하였다. 파쇄된 망막에서의 DLK 수준 및 분자량은 망막 신경 파쇄 후 3일까지 증가한다. (c) 망막, 파쇄 부위, 근위 신경 및 원위 신경의 위치를 보여주는 망막 신경 파쇄 모델의 다이어그램. (d) 파쇄된 신경 내에서, 단지 근위 신경에서의 DLK만이 신경 파쇄 후에 전체 망막에서 관찰된 분자량 및 양의 스트레스-의존성 증가를 겪는다. 신경 파쇄를 주어진 유전자형의 마우스에서 수행하였고, 신경을 24시간 후에 수집하였다. WT: C57BL/6. Cre-: DLKlox/DLKlox; Cre-. Cre+: DLKlox/DLKlox; Cre+. 이동성의 변화는 근위 신경에서 파쇄 (적색 화살표) 후에 관찰될 수 있다. *: DLK에 대해 블롯팅한 신경 용해물에서 관찰된 배경 밴드. (e) (a)에서 제시된 -NGF vs. +NGF 샘플 및 (b)에서 제시된 파쇄 vs. 비파쇄 샘플에서의 DLK 단백질 양의 평균 비. 각각의 스트레스 패러다임에서, DLK의 양을 이미지랩(ImageLab)에서 측정하고, 액틴 로딩 대조군에 대해 정규화하였다. NGF 회수 샘플에서, -NGF 및 +NGF에서의 DLK의 비를 각각의 인접한 세트의 조건에 대해 취하였다. 망막 신경 파쇄에서, 파쇄 및 비파쇄 눈에서의 DLK 양의 비를 4마리 마우스 각각에 대해 취하였다. TF 회수: 평균 = 2.12 ± 0.127. 신경 파쇄: 평균 = 1.497 ± 0.157. 평균을 1에 비교하는 만-휘트니 U 검정에 의한 *P = 0.02. (f) +NGF 및 -NGF 샘플에서의 DLK의 평균 분자량 (MW). 분자량은 DLK의 분자량을 공지된 세트의 분자량 표준의 경우와 비교하는 분자량 분석 도구를 사용하여 이미지랩에서 계산하였다. +NGF: 평균 = 115.1 ± .7723. -NGF: 평균 = 120.0 ± .8050. 만-휘트니 U 검정에 의한 *P = 0.03. (g) DRG 용해물의 람다 단백질 포스파타제 (λpp) 처리는 -NGF 및 +NGF 조건에서 DLK 분자량을 동등하게 한다. 모든 오차 막대는 평균의 표준 오차이다.
도 2 DLK 단백질은 배아 감각 뉴런의 영양 인자 회수에 반응하여 안정화된다. (a) -NGF vs. +NGF 배양 조건 (청색 막대) 또는 3마리의 복제 마우스로부터의 파쇄 vs. 비파쇄 망막 (흑색 막대)에서 qRT-PCR에 의한 DLK 전사체의 상대량의 측정. 오차 막대는 3개의 기술적 복제물을 기준으로 한 표준 편차이다. -NGF vs +NGF: 1.036 ± 0.0234. 마우스 1: 0.995 ± .0315. 마우스 2: 0.970 ± .0462. 마우스 3: 0989 ± 0.040. (b) 5 μM 시클로헥시미드의 존재 하에 영양 인자 회수 및 +NGF 대조군의 8-시간 타임코스. (c) (b)에서 수행된 실험의 3회 반복 시험의 정량화. 각 시점에서의 밴드를 액틴 로딩 대조군 대비 정량화하였고, 각 시점에서의 평균 밴드 강도를 t=0에서의 강도에 의해 계산하고 나누었다. 시간 0에서의 양과 비교하여 주어진 시간에 남아있는 DLK의 상대량을 플롯팅하였다. 오차 막대는 표준 편차이다. 각 타임코스를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어에서의 선에 적합시켰다. 두 선의 기울기를 ANCOVA와 비교하는 경우에 *P = 0.0109. (d) DRG를 3시간 동안 주어진 조건으로 처리하고 용해시켰다. OA: 200 nM 오카다산. MG132를 30 μM로 사용하였다.
도 3 유비퀴틴-프로테아솜 시스템은 DLK 수준을 스트레스-의존성 방식으로 조절한다. (a) DLK 유비퀴틴화는 영양 인자 회수에 의해 감소된다. NGF-고갈 및 대조군 DRG를 처리 3시간 후에 수집하고 용해시켰다. 유비퀴틴화된 단백질을 용해물로부터 면역침전시키고, 면역침전물을 DLK 및 유비퀴틴에 대해 블롯팅하였다. 마우스 IgG 대조군을 항체 특이성을 입증하기 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. (b) USP9X loxp/loxp Cre- 및 Cre+ 배아 DRG에서 NGF 회수 후에 DLK, USP9X, p-cJun 및 튜불린에 대한 웨스턴 블롯. (c) (b)에서 제시된 DLK 및 USP9X에 대한 블롯의 정량화. USP9X의 ~95%의 손실 (좌측 패널)은 DLK 수준의 전체적인 감소를 가져오지만, + 및 -NGF 조건에서 DLK의 상대 수준을 변경하지는 않는다 (우측 패널 - Cre+에서의 배수 변화를 Cre-에서의 경우와 비교). (d) +NGF 조건에서의 DLK 단백질 수준은 Phr1WT와 비교하여 Phr1mag 기능 상실 돌연변이체에서 상승한다. 이러한 증가에도 불구하고, p-cJun의 하류 활성화는 Phr1mag 돌연변이체에서 영향을 받지 않는다. (e) Tuj 로딩 대조군에 대해 정규화된 (d)에 제시된 DLK 블롯의 정량화. (f) 유비퀴틴화된 단백질의 면역침전은 DLK가 PhrWT / mag 이형접합체 대조군에서보다 Phr1mag/mag 동형접합체에서 덜 유비퀴틴화된다는 것을 제시한다. 좌측 패널: 항-유비퀴틴 ("Ub")에 의한 면역침전, 이어서 DLK에 대한 블롯팅. 마우스 IgG를 사용한 면역침전은 항체 특이성에 대한 대조군으로서 사용하였다. 괄호: Phr1mag 이형접합체와 동형접합체 사이에 보이는 주요 차이를 강조한다: 녹아웃에서의 폴리유비퀴틴화된 DLK의 결핍. 우측 패널: DLK 및 튜불린에 대한 투입 용해물의 블롯. 보다 많은 DLK가 투입물에 존재한다는 사실에도 불구하고, 보다 적은 DLK가 항-유비퀴틴 항체에 의해 풀 다운되었다.
도 4 DLK 안정화는 DLK 활성 및 DLK의 하류 표적에 의존한다. (a) HEK 293T 세포의 일시적 형질감염은 DLK의 키나제 데드 버전 (S302A)이 야생형 DLK보다 더 낮은 수준으로 발현됨을 나타낸다. USP9X와의 공동-형질감염은 이 효과를 구제한다. (b) myc 에피토프로 N-말단 태그부착된 우성 음성 DLK 류신 지퍼 도메인 구축물 (myc-DLK-LZ)과의 DLK의 공동-형질감염은 GFP 발현 구축물과의 공동-형질감염과 비교하여 DLK 발현을 감소시킨다. (c) dox-유도성 DLK 발현 구축물을 갖는 안정한 세포에서 2개의 상이한 JNK 억제제 (JNK8 및 JNK7, 둘 다 10 μM)에 의한 JNK 활성의 억제는 DLK 발현을 감소시킨다. (d) JNK2 KO 배경에서의 JNK3의 녹다운은 배아 DRG에서 NGF 회수로 관찰된 DLK 양의 증가를 차단한다. (e) 신경 파쇄 후 18시간에서, JNK2/3 이중 녹아웃 망막은 한배새끼 대조군으로부터의 파쇄된 망막에서 보이는, 보다 높은 분자 형태 (화살표)에 의해 검정된 바와 같은 활성화된 DLK를 갖지 않는다.
도 5 인산화 상태가 DLK 또는 JNK 활성에 의해 조절되는 뮤린 DLK 내 인산화 부위의 확인. (a) 질량 분광측정법에 사용된 무거운 및 가벼운 SILAC 조건 하에 293T 세포에서 DLK의 발현. 발현 후에, Flag-태그부착된 DLK를 면역침전 (IP)시키고, 주어진 조건의 IP를 DLK 내 인산화 부위의 비율측정 분석을 위해 합하였다. WT DLK: 야생형 DLK. DLKS302A: 키나제 데드 점 돌연변이체. CA-JNK: 구성적 활성 JNK 구축물 (방법 참조). JNKi: JNK 억제제 8, 10 μM. OA: 오카다산, 200 nM. (b) DLK 도메인 및 주목되는 인산화 부위 위치의 개략도. 넘버링은 뮤린 DLK를 기준으로 한다. N-말단: DLK의 N-말단 도메인. 키나제 도메인: 촉매 DLK 도메인. LZ: 류신 지퍼 모티프. C-말단: C-말단 도메인. 도메인은 참고문헌 [Holzman, L.B., Merritt, S.E. & Fan, G. The Journal of biological chemistry 269, 30808-30817 (1994)]에 따라 배열된다. (c) 확인된 인산화 부위 변화의 개요. 열거된 부위는 조건에 걸쳐 가장 큰 효과 및 일관성을 나타내었거나, 또는 S295-T306의 경우에, 키나제 활성화 루프 내 공지된 부위이다. ∞: 이 부위의 인산화는 조건 A에서 관찰되었지만 조건 B에서는 관찰되지 않았다. N/A: 이 부위의 인산화는 어느 조건에서도 관찰되지 않았다. 주어진 수는 조건 A vs. 조건 B에서 부위의 인산화의 배수 변화이고, 상향 또는 하향 화살표는 변화의 방향을 나타낸다 (예를 들어 최상단-우측 상자의 경우에, 오카다산 부재 하의 DLK 발현 세포에서보다 오카다산 처리된 DLK 발현 세포에서 T43의 7.78배 더 많은 인산화가 존재한다). *: 이 부위는 트레오닌 (T) 또는 세린 (S)에 이어서 프롤린을 함유한다. 플랭킹 프롤린은 대다수의 MAPK 인산화 부위에서 발견된다. "JNK 가설에 적합한가?"라는 표제의 열은, 4개의 조건에 걸친 인산화의 패턴이 이 부위의 인산화가 JNK에 의해 일어나고 DLK의 안정화에 대한 원인이라는 가설에 적합한지 여부를 요약한다. 체크 마크: 인산화의 패턴은 이 가설과 일치한다. ~: 인산화의 패턴은 이 가설과 부분적으로 일치한다. X: 인산화의 패턴은 이 가설과 일치하지 않는다. S643의 경우에, 10.3의 A점수는 선행 세린을 ~90% 신뢰도로 뒷받침한다. 13 미만의 A점수를 갖는 인산화 부위는 일반적으로 모호하게 국재화된 것으로 간주되지만, S643이 4개의 연속 세린의 마지막이고 프롤린에 바로 인접하여 위치하기 때문에, 본 발명자들은 인산화가 S642가 아니라 이 부위에서 일어난다고 결론내린다. 마지막 행 (S295-T306)의 경우에, 두 인산화 잔기는 이 펩티드에서 검출되었지만, 부위 결정 이온의 결핍 때문에 단일의 이중-변형된 서열이 분명하게 배정될 수는 없다. 가능한 순열의 수가 주어지면, 여러 다중-포스포펩티드 서열이 일어나는 것이 가능하다. 이러한 이유로, 이러한 이중 변형된 서열에 대한 데이터는 특히 부위에 의해서 보다는 오히려 응집체에서 제시된다.
도 6 확인된 부위는 뉴런 스트레스 후에 인산화된다 (a) 야생형 DLK (DLKWT) 및 주어진 인산화부적격 점 돌연변이체가 일시적으로 발현되는 HEK 293T 세포로부터의 용해물에 대한 웨스턴 블롯. p-T43, p-S272, p-S533: 이러한 부위 각각에 대한 포스포-특이적 항체를 사용한 블롯. (b) DLKT43 및 DLKS533은 JNK에 의해 직접적으로 인산화될 수 있다. 정제된 DLKS302A를 정제된 JNK3과 함께 (우측 레인) 또는 정제된 JNK3 없이 (좌측 레인) 인큐베이션하고, 제시된 포스포-특이적 항체를 사용하여 블롯팅하였다. (c) 영양 인자 고갈된 감각 뉴런으로부터의 용해물에 대한 웨스턴 블롯은 -NGF 조건에서 나타나는 항-포스포T43 면역반응성을 제시하였다. 람다 단백질 포스파타제를 사용한 처리는 인산화 단백질에 대한 항체의 특이성을 입증한다. (d) DLK loxp/loxp Cre- 및 Cre+ 배아로부터의 영양 인자 고갈된 DRG의 블롯팅은 항-p-T43 항체가 DLK에 특이적이라는 것을 제시한다. (e) 파쇄된 망막 용해물 및 파쇄되지 않은 대조군으로부터의 DLK의 면역침전, 이어서 포스포-T43 및 포스포-S533-특이적 항체를 사용한 블롯팅은 이들 부위가 시신경 파쇄 후에 인산화된다는 것을 제시한다. 좌측 패널: 시신경 파쇄 하에 DLK 수준 및 인산화의 증가 (겉보기 분자량 변화)를 보여주는 면역침전물에 대한 투입. 우측 패널: 파쇄된 용해물 또는 파쇄되지 않은 대조군으로부터 항-DLK 또는 대조군 토끼 IgG를 사용한 면역침전, 이어서 주어진 항체를 사용한 블롯팅.
도 7 DLK는 용량-의존성 방식으로 하류 아폽토시스촉진 신호전달을 조절한다. (a) DLK +/+ (WT) 및 DLK +/- (het) DRG에서의 영양 인자 회수의 타임코스는 이형접합 뉴런에서의 DLK 단백질 수준의 감소가 JNK 및 cJun의 감소된 하류 활성화를 유발하는지를 밝힌다. (b, d) DLK +/+ 및 DLK +/- 마우스에서 신경-파쇄된 망막의 염색, 및 (c, e, f) 제시된 염색의 정량화. (b, c) 파쇄 후 6시간의 p-cJun. 제시된 정량화는 망막당 p-cJun 양성 세포의 평균 개수이다. 스튜던츠 t 검정에 의한 *P = 0.0014. WT의 평균 = 2291 ± 299. het의 평균 = 689 ± 97.6. n = 7 WT 및 5 het 동물. (d) 파쇄 후 3일의 카스파제-3 및 Brn3 염색. (e) 망막당 카스파제-3-양성 세포의 평균 개수의 정량화. 스튜던츠 t 검정에 의한 *P = 0.0001. WT의 평균 = 823 ± 36. het의 평균 = 79 ± 20. n = 4 WT 및 3 het 동물. (f) 파쇄 vs. 비파쇄 망막에서의 망막당 Brn3-양성 세포의 비의 정량화. 스튜던츠 t 검정에 의한 *P = .0253. WT의 평균 = 0.27 ± 0.086. het의 평균 = 0.56 ± 0.017. 오차 막대는 평균의 표준 오차이다. n = 5 WT 및 4 het 동물. 스케일 막대 = 100 μm.
도 8 뉴런 스트레스 하의 DLK 겔 이동성 변화의 관찰. (a) AAV-Cre 바이러스를 주사한 야생형 (WT) 및 DLKloxp / loxp (loxp) 마우스로부터의 제3일 파쇄 망막 용해물의 블롯. DLK 겔 이동성 변화는 야생형 망막에서 이중선의 형태 (적색 화살표)로 관찰되지만, 이것은 loxp 마우스에서는 관찰되지 않는다. loxp 마우스는 망막 신경절 세포에 단지 재조합된 Dlk를 가지기 때문에, 이것은 망막 신경 파쇄에서 나타나는 상부 밴드 (적색 화살표)가 특히 망막 신경절 세포에서 DLK의 인산화로 인한 것임을 제시한다. (b) 2개의 상이한 러닝 완충제를 사용한 SDS-PAGE에서의 DLK의 이동성의 차이. MOPS 완충제: 완충제로서 MOPS를 함유하는 SDS-PAGE 러닝 용액. MES 완충제: 완충제로서 MES를 함유하는 SDS-PAGE 러닝 용액.
도 9 USP9X 활성은 영양 인자 회수로 변화하지 않는다. + 및 -NGF-처리된 DRG를 HA-태그부착된 유비퀴틴 비닐 술폰 (이는 탈유비퀴틴화 효소 (DUB)의 활성 부위에 공유적으로 결합함)과 함께 인큐베이션한 것은 영양 인자 회수에 의한 USP9X 활성의 변화 없음을 제시한다. DUB를 억제하는 N-에틸말레이미드 (NEM)는 음성 대조군으로서 사용된다.
도 10 Phr1 KO 뉴런에서의 NGF 회수 후에 감각 뉴런 축삭 변성의 타임코스상 차이 없음. 배아 DRG를 야생형 또는 Phr1 녹아웃 한배새끼 배로부터 배양하고, 시험관내에서 3일 후에 NGF를 고갈시켰다. 18시간 후에, 두 배양물은 튜불린 염색에 의해 시각화된 바와 같이 동등하게 변성되었다.
도 11 시신경 파쇄 후에 망막에서의 세포 생존율, 무손상 축삭 구조 및 뉴런 스트레스 신호전달의 활성화에 대한 특성화. (a) 비파쇄 야생형 대조군과 비교한, 파쇄 후 2주에서의 Brn3, γ-시누클레인 및 신경필라멘트-M (NF-M)에 대한 염색. (b) 수술 후 24시간의 야생형 및 DLK 이형접합 망막에서의 p-cJun 염색. p-cJun 염색에 있어서 야생형과 이형접합 망막 사이의 어떠한 유의차도 이 시점에서 관찰되지 않는다.
도 12 망막 용해물 샘플에서 전체 JNK, JNK2 및 JNK3에 대한 블롯. 면역반응성의 손실이 JNK2/3 이중 녹아웃에서 관찰된다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "이중 류신 지퍼 키나제" 또는 "DLK"는, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 DLK를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 프로세싱되지 않은 DLK, 뿐만 아니라 DLK 프리-mRNA에 의해 코딩되는 다양한 폴리펩티드 이소형, DLK의 자연 발생 변이체 (예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체), 및 관련 기술분야에 공지되어 있는 번역후 변형된 프로세싱된 형태의 DLK를 비롯한, 세포에서 프로세싱되어 생성된 임의의 형태의 DLK를 포괄한다. 그러한 DLK 변이체의 한 예는 이소형 2 (유니프롯케이비(UniProtKB)/스위스-프롯(Swiss-Prot) 등록 번호 Q12852-2)를 포함한다. DLK는 또한 명칭 "미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제 12", "MAP3K12", "이중 류신 지퍼 보유 키나제", "류신 지퍼 단백질 키나제" (ZPK) 및 "MAPK-상류 키나제" (MUK)로 공지되어 있다. 인간 DLK는 유니프롯케이비/스위스-프롯 등록 번호 Q12852에 기재된 바와 같은 859개 아미노산의 길이이고, 본원에 참조로 포함된다. 인간 DLK에 대한 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
(서열 1).
뮤린 DLK는 유니프롯케이비/스위스-프롯 등록 번호 Q60700에 기재된 바와 같은 888개 아미노산 길이이고, 본원에 참조로 포함된다. 뮤린 DLK에 대한 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00002
(서열 2).
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
"개체" 또는 "환자" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 환자 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업용 패키지 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하도록 사용된다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 지연시키는데 사용된다.
용어 "짧은 간섭 RNA (siRNA)"는 유전자 발현을 간섭하는 소형 이중-가닥 RNA를 지칭한다. siRNA는 이중 가닥 RNA가 상동성 유전자를 침묵시키는 과정인 RNA 간섭의 매개자이다. 전형적으로 siRNA는 단일-가닥 오버행(들)을 포함할 수 있는 듀플렉스를 형성하는, 뉴클레오티드 약 15-25개 길이의 2개의 단일-가닥 RNA로 구성된다. 이중 가닥 RNA가 효소 복합체, 예를 들어 폴리머라제로 프로세싱되면, 이중 가닥 RNA가 절단되어 siRNA가 생성된다. siRNA의 안티센스 가닥이 RNA 간섭 (RNAi) 침묵 복합체에 의해 사용되어 mRNA 절단으로 안내함으로써, mRNA 분해를 촉진한다. 예를 들어 포유동물 세포에서, siRNA를 사용하여 특정 유전자를 침묵시키기 위해, 관련되지 않은 mRNA에 대한 우연한 상보성을 피하도록 염기 쌍형성 영역이 선택된다. 예를 들어, 문헌 [Fire et al., Nature 391:806-81 (1998) 및 McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10):737-747 (2002)]에 의해, RNAi 침묵 복합체가 관련 기술분야에 확인되어 있다.
용어 "간섭 RNA (RNAi)"는 특정 mRNA의 촉매적 분해를 초래하고, 따라서 특정한 유전자의 발현 억제/저하를 위해 사용될 수 있는 이중 가닥 RNA를 지칭하도록 본원에 사용된다.
본원에 사용된 어구 "축삭 변성 방지", "뉴런 변성 방지", "뉴런의 변성 방지", "뉴런의 변성 억제", "축삭 변성 억제" 또는 "뉴런 변성 억제"는 (i) 신경변성 질환 또는 장애에 걸린 것으로 새롭게 진단되었거나 새로운 신경변성 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 환자에서 축삭 또는 뉴런 변성을 억제 또는 방지하는 능력, 및 (ii) 신경변성 질환 또는 장애를 이미 앓고 있거나 그의 증상이 있는 환자에서 추가의 축삭 또는 뉴런 변성을 억제 또는 방지하는 능력을 포함한다. 축삭 또는 뉴런 변성 방지는 축삭 또는 뉴런 변성을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하고, 이는 뉴런 또는 축삭 변성의 완전한 또는 부분적인 억제를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 신경학적 기능의 분석에 의해, 이를 평가할 수 있다. 상기 열거된 용어들은 시험관내 및 생체외 방법을 또한 포함한다. 추가로, 어구 "뉴런 변성 방지" 및 "뉴런 변성 억제"는 전체 뉴런 또는 그의 부분, 예컨대 뉴런 세포체, 축삭 및 수상돌기에 관한 억제를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 작용제의 투여는 본원에 기재된 하나 이상의 작용제를 투여받지 않은 대조군 대상체 또는 집단과 비교하여 대상체 또는 집단에서 신경계의 장애; 신경계 외부에 일차 효과를 갖는 질환, 상태 또는 요법에 대해 이차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 안구-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신 장애의 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9가지)의 증상 (예를 들어, 진전, 동작 둔화, 운동실조, 균형 상실, 우울증, 인지 기능 감소, 단기 기억 상실, 장기 기억 상실, 혼란, 인격 변화, 언어 곤란, 감각 인지 상실, 접촉 민감성, 사지 무감각, 근육 약화, 근육 마비, 근육 경련, 근육 연축, 상당한 식습관 변화, 과도한 공포 또는 걱정, 불면증, 망상, 환각, 피로, 요통, 흉통, 소화 문제, 두통, 빠른 심박수, 어지럼증, 흐린 시각, 시각의 그림자 또는 누락 영역, 변시증, 색각 장애, 밝은 빛에의 노출 후 시각 기능의 회복 감소, 및 시각적 대비 감도 상실)의 적어도 10% 감소 (예를 들어, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 심지어 100% 감소)를 가져올 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 작용제의 투여는 본원에 기재된 하나 이상의 작용제가 투여되지 않은 뉴런 집단 또는 대상체에서 변성되는 뉴런 (또는 그의 뉴런 세포체, 축삭 또는 수상돌기)의 개수와 비교하여 뉴런 집단 또는 대상체에서 변성되는 뉴런 (또는 그의 뉴런 세포체, 축삭 또는 수상돌기)의 개수의 적어도 10% 감소 (예를 들어, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 감소)를 가져올 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 작용제의 투여는 본원에 기재된 하나 이상의 작용제로 처리되지 않은 대조군 대상체 또는 집단과 비교하여 대상체 또는 대상체 집단에서 신경계의 장애; 신경계 외부에 일차 효과를 갖는 질환, 상태 또는 요법에 대해 이차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 안구-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신 장애가 발생할 가능성의 적어도 10% 감소 (예를 들어, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 감소)를 가져올 수 있다.
본원에 사용된 용어 "투여"는 뉴런 또는 그의 부분을 본원에 기재된 바와 같은 작용제와 접촉시키는 것을 지칭한다. 이는 뉴런 또는 그의 부분이 내부에 존재하는 대상체에게 작용제를 투여하는 것, 뿐만 아니라 뉴런 또는 그의 부분이 배양되는 배지 내로 작용제를 도입하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뉴런"은 중심 세포체 또는 소마, 및 2가지 유형의 신장물 또는 돌출물 (일반적으로 대부분의 뉴런 신호를 세포체로 전달하는 수상돌기, 및 일반적으로 대부분의 뉴런 신호를 세포체로부터 이펙터 세포, 예컨대 표적 뉴런 또는 근육으로 전달하는 축삭)을 포함하는 신경계 세포를 의미한다. 뉴런은 조직 및 기관로으부터의 정보를 중추 신경계 내로 전달할 수 있고 (구심성 또는 감각 뉴런), 신호를 중추 신경계로부터 이펙터 세포로 전송할 수 있다 (원심성 또는 운동 뉴런). 개재뉴런으로 명시되는 다른 뉴런은 중추 신경계 (뇌 및 척주) 내의 뉴런들을 연결한다. 본 발명에 따른 치료에 적용될 수 있는 뉴런 유형의 특정 구체적 예는 소뇌 과립 뉴런, 후근 신경절 뉴런 망막 신경절 세포, 망막 시신경 및 피질 뉴런을 포함한다.
하나 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뉴런 스트레스"는 뉴런에 대한 스트레스의 적용, 예컨대 비제한적으로 질환, 손상, 허혈, 흥분독성, 축삭 횡절단, UV 조사, 시토카인에 의한 자극, 세라미드 노출 또는 신경 성장 인자의 부재를 의미한다. 뉴런 스트레스는 뉴런에서 아폽토시스 신호전달 캐스케이드의 활성화에 의한 것을 비롯한, 뉴런 변성 및 세포 사멸을 가져올 수 있다.
본원에 사용된 용어 "스트레스 의존성 DLK 활성"은 뉴런 스트레스에 반응한 DLK의 활성화를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "아폽토시스촉진 DLK 활성"은 뉴런에서 아폽토시스 신호전달 캐스케이드를 지지하거나 유도하는 DLK의 활성화를 의미한다.
II. 방법
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로는, DLK가 뉴런에서 스트레스 또는 손상에 반응하여 인산화된다는 발견을 기초로 한다. DLK 인산화의 증가는 손상된 또는 스트레스 받은 뉴런에서 DLK의 안정화 및 DLK 단백질 수준의 증가를 유발한다. DLK의 특정 아미노산 잔기는 뉴런 스트레스 또는 손상에 반응하여 인산화되고, 증가된 DLK 안정성 및 궁극적으로 축삭 변성 및 뉴런 아폽토시스에 필요한 DLK의 스트레스-의존성 또는 아폽토시스촉진 활성에 중요하다.
따라서, 본 발명은 DLK의 인산화를 억제 또는 감소시켜 DLK 안정성을 감소시키는 작용제를 사용하여 뉴런 변성을 방지하거나 억제하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명은 DLK의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 억제하거나 감소시켜 DLK의 안정성을 감소시키는 방법을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 DLK의 인산화를 억제하거나 감소시키는 작용제 및 특정 경우에서는 DLK의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 억제하는 작용제를 뉴런 또는 그의 부분에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인산화의 감소는 DLK 안정성을 감소시키는 것인, 뉴런에서 DLK 안정성을 감소시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 인산화 형태의 DLK를 특이적으로 인식하는 항체를 생물학적 샘플과 접촉시키고, 인산화 형태의 DLK에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 인산화 형태의 DLK에 대한 항체의 결합은 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 가리키거나 나타내는 것인, 뉴런에서 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 활성을 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 뉴런 또는 그의 부분은 소뇌 과립 뉴런, 후근 신경절 뉴런, 피질 뉴런, 교감 뉴런, 망막 신경절 세포, 망막 시신경 및 해마 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴런을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 작용제는 DLK 인산화의 억제제를 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는, 예를 들어 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 폴리뉴클레오티드, 압타머, 소분자 및 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항체의 경우에, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편)으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 작용제는 DLK, 예컨대 JNK를 인산화하는 단백질의 억제제를 포함한다. 비제한적 예는 JNK1, JNK2 및/또는 JNK3의 억제제를 포함한다. 추가의 예는 JNK1 및 JNK2; JNK1 및 JNK3; JNK1 및 JNK3; JNK2 및 JNK3; 및 JNK1, JNK2 및 JNK3의 억제제를 포함한다. 이러한 JNK 억제제는 JNK 억제제 V, JNK 억제제 VII (TAT-TI-JIP153 -163), JNK 억제제 VIII, SC-202673, SY-CC-401, SP600125, AS601245 및 XG-102, 뿐만 아니라 EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences)로부터의 카탈로그 번호 420119, 420130, 420131, 420123, 420116, 420118, 420136, 420129, 420135, 420134, 420133, 420140 및 420128, 및 JNK1, JNK2, JNK3 또는 그의 임의의 조합의 발현을 억제하는 siRNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 다양한 JNK를 표적으로 하는 siRNA 서열은 TTGGATGAAGCCATTAGACTA (서열 3)의 JNK1 서열, ACCTTTAATGGACAA CATTAA (서열 4) 또는 AAGGATTAGCTTTGTATCATA (서열 5)의 JNK2 서열, 및 CCCGCATGTGTCT GTATTCAA (서열 6)의 JNK3 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서의 뉴런 또는 그의 부분은 대상체, 예컨대 인간 대상체에 존재한다. 대상체는, 예를 들어 (i) 신경계의 장애, (ii) 신경계 외부에 일차 효과를 갖는 질환, 상태 또는 요법에 대해 이차적인 신경계의 상태, (iii) 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상, (iv) 통증, (v) 안구-관련 신경변성, (vi) 기억 상실, 및 (vii) 정신 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 상태가 발생했거나 또는 그의 발생 위험이 있을 수 있다.
신경계의 장애의 예는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 설인 신경통, 벨 마비, 중증 근무력증, 근육 이영양증, 진행성 근육 위축, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 가성 연수 마비, 진행성 연수 마비, 척수성 근육 위축, 유전성 근육 위축, 추간판 증후군, 경부 척추증, 신경총 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 파킨슨병, 파킨슨-플러스병, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 루이 소체 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 프리온 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌병증, 픽병, 간질, 및 AIDS 치매 복합증을 포함한다.
통증의 예는 만성 통증, 섬유근육통, 척추 통증, 손목 터널 증후군, 암으로 인한 통증, 관절염, 좌골신경통, 두통, 수술로 인한 통증, 근육 연축, 요통, 내장통, 손상으로 인한 통증, 치통, 신경통, 예컨대 신경성 또는 신경병증성 통증, 신경 염증 또는 손상, 대상포진, 추간판 탈출, 찢어진 인대, 및 당뇨병을 포함한다.
신경계 외부에 일차 효과를 갖는 질환, 상태 또는 요법에 대해 이차적인 신경계의 상태의 예는 당뇨병, 암, AIDS, 간염, 신장 기능장애, 콜로라도 진드기열, 디프테리아, HIV 감염, 나병, 라임병, 결절성 다발동맥염, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 전신 홍반성 루푸스, 및 아밀로이드증에 의해 야기되는 말초 신경병증 또는 신경통을 포함한다.
물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상의 예는 독성 화합물, 중금속, 산업용 용매, 약물, 화학요법제, 답손, HIV 의약, 콜레스테롤 강하 약물, 심장 또는 혈압 의약, 및 메트로니다졸에 대한 노출에 의해 야기되는 신경 손상을 포함한다. 추가의 예는 화상, 상처, 수술, 사고, 허혈, 저온에의 장기 노출, 졸중, 두개내 출혈, 및 뇌 출혈을 포함한다.
정신 장애의 예는 정신분열증, 망상 장애, 분열정동 장애, 정신분열형, 공유 정신병적 장애, 정신병, 편집성 인격 장애, 분열성 인격 장애, 경계성 인격 장애, 반사회적 인격 장애, 자기애성 인격 장애, 강박 장애, 섬망, 치매, 기분 장애, 양극성 장애, 우울증, 스트레스 장애, 공황 장애, 광장공포증, 사회 공포증, 외상후 스트레스 장애, 불안 장애, 및 충동 조절 장애를 포함한다.
안구-관련 신경변성의 예는 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성 또는 건성 AMD와 연관된 광수용체 변성, 다른 망막 변성, 시신경 드루젠, 시신경병증, 및 시신경염을 포함한다. 녹내장의 예는 원발성 녹내장, 저안압 녹내장, 원발성 폐쇄각 녹내장, 급성 폐쇄각 녹내장, 만성 폐쇄각 녹내장, 간헐성 폐쇄각 녹내장, 만성 개방각 폐쇄 녹내장, 색소성 녹내장, 낙설 녹내장, 발육이상 녹내장, 속발성 녹내장, 수정체성 녹내장, 안내 출혈에 대해 속발성인 녹내장, 외상성 녹내장, 신생혈관 녹내장, 약물-유도 녹내장, 독성 녹내장, 및 안내 종양, 망막 박리, 눈의 중증 화학적 화상 및 홍채 위축과 연관된 녹내장을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴런 또는 그의 부분을 본 발명의 방법에 따른 작용제와 접촉시키는 것은, 대상체에게 작용제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 투여는, 예를 들어 정맥내 주입; 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사; 또는 국소 또는 안구 적용에 의해 수행된다. 추가로, 본 발명의 방법은 대상체에게 하나 이상 추가의 제약 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 뉴런 또는 그의 부분 (예를 들어, 신경 이식편 또는 신경 이식물)은 생체외 또는 시험관내에 존재한다.
본 발명은 또한 뉴런 또는 그의 부분의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 작용제를 확인하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 뉴런 또는 그의 부분을 후보 작용제와 축삭 또는 뉴런 변성의 검정 (예를 들어, 항-신경 성장 인자 (NGF) 항체, 혈청 고갈/KCl 감소, 망막 시신경 파쇄 및/또는 로테논 처리)에서 접촉시키는 것을 포함한다. 대조군 대비, 후보 작용제의 존재 하에 뉴런 또는 그의 부분의 변성 감소의 검출은 뉴런 또는 그의 부분의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 작용제의 확인을 나타낸다. 후보 작용제는, 예를 들어 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 폴리뉴클레오티드, 압타머, 소분자 및 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
A. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제를 확인 및 특성화하기 위한 스크리닝 검정
본 발명은 부분적으로는, DLK의 스트레스-유도 또는 뉴런 손상 유도 인산화가 DLK 안정성 및 궁극적으로 아폽토시스촉진 DLK 활성을 가져온다는 발견을 기초로 한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 DLK 인산화를 억제하거나 감소시키는 작용제를 사용하여 뉴런 또는 축삭 변성을 억제 및/또는 방지하는 방법을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 방법은 생체내에서, 예컨대 신경계 장애 또는 신경계에 대한 손상의 치료에서 수행된다. 방법은 시험관내 또는 생체외에서, 예컨대 뉴런 기능의 실험실 연구 및 신경 이식편 또는 이식물의 치료에서 수행된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제가 본원에 기재된다. 본 발명에 사용하기 위한 추가의 작용제는 하기 요약된 표준 스크리닝 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
본원에 기재된 작용제 이외에도, DLK의 인산화를 억제하거나 감소시키고 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 작용제가 하기 검정 또는 검정의 조합을 사용하여 스크리닝될 수 있다. DLK의 인산화 또는 뉴런 또는 축삭 변성의 억제를 판독하기 위한 하기 기재된 검정 이외에도, 본 발명은 또한 특정 포스포-형태의 DLK에 간단하게 결합하거나 또는 그를 검출하는 검출제를 겨냥하는 검정을 이용한다. 따라서, 본 발명은 특정한 포스포-형태의 DLK에 결합하거나 또는 그와 복합체를 형성하는 화합물을 확인하는 스크리닝 검정의 사용을 포함한다.
결합 검정에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 단리될 수 있거나 또는 반응 혼합물 내에서 검출될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적 폴리펩티드 또는 작용제 후보물이 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고체 상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비-공유 부착은 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 일반적으로 달성된다. 대안적으로, 고정될 표적 폴리펩티드에 대해 특이적인 고정된 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 앵커링시킬 수 있다. 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 검정이 수행된다. 반응이 완료되면, 미반응 성분을, 예를 들어 세척에 의해 제거하고, 고체 표면 상에 앵커링된 복합체를 검출한다. 원래의 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 보유하는 경우, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 원래의 고정되지 않은 성분이 표지를 보유하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써 복합체 형성을 검출할 수 있다.
추가로, 단백질 키나제의 활성에 대한 후보 작용제의 영향을 측정하기 위한 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 직접적인 인산화 검정 (전형적으로, 방사성-표지 포스페이트, 기질에 대한 인산화-특이적 항체를 통해 해석됨), 및 키나제 활성의 하류 결과, 예를 들어 리포터 유전자의 활성화를 측정하는 세포-기반 검정을 포함한다. 이들 주요 전략 둘 다는, 형광 편광을 기반으로 하는 대안적인 검정에 더하여, 억제제를 확인, 검증 또는 특성화하기 위해 소규모 또는 고처리량 포맷으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Favata et al., J. Biol. Chem. 273:18623-18632, 1998; Parker et al., J. Biomol. Screening 5:77-99, 2000; Singh et al., Comb. Chem. High Throughput Screen 8:319-325, 2005; Garton et al., Meth. Enz. 439:491-500, 2008; 및 Kupchko et al., Anal. Biochem. 317:210-217, 2003] 참조).
본원에서 구체적으로 논의되는 스크리닝 검정은 단지 예시를 위한 것이다. 특정한 표적 및 작용제 유형 (예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 비-펩티드 소형 유기 분자, 핵산 분자 등)에 따라 선택될 수 있는 다양한 다른 검정이 통상의 기술자에게 주지되어 있고, 본 발명에 또한 사용될 수 있다.
본원에 기재된 검정은 랜덤 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 소형 유기 분자로 구성된 화학적 라이브러리, 천연 생성물 라이브러리 (예를 들어, 미생물, 동물, 식물 등의 수집물) 및 조합 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 화합물들의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에서의 검정은 천연 인간, 재조합, 합성 및 반합성 항체 라이브러리를 비제한적으로 포함하는 항체 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다. 항체 라이브러리는, 예를 들어 파지 입자당 평균적으로 1개의 단일-쇄 항체 또는 항체 단편을 디스플레이하는 1가 라이브러리, 및 바이러스 입자당 평균적으로 2개 이상의 항체 또는 항체 단편을 디스플레이하는 다가 라이브러리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 스크리닝될 항체 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리에 제한되지 않는다. 다른 디스플레이 기술은, 예를 들어 리보솜 또는 mRNA 디스플레이 (Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9022-9026, 1994; Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942, 1997), 미생물 세포 디스플레이, 예컨대 박테리아 디스플레이 (Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34, 1997), 또는 효모 세포 디스플레이 (Kieke et al., Protein Eng. 10:1303-1310, 1997), 포유동물 세포 상의 디스플레이, 포자 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 예컨대 레트로바이러스 디스플레이 (Urban et al., Nucleic Acids Res. 33:e35, 2005), 단백질-DNA 연결을 기초로 하는 디스플레이 (Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. U.S.A. 101:2806-2810, 2004; Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33:e10, 2005), 및 마이크로비드 디스플레이 (Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458, 2002)를 포함한다.
상기 기재된 검정에서 수득된 결과가 뉴런 및/또는 축삭 변성의 시험관내 및/또는 생체내 검정에서 확인될 수 있다. 대안적으로, 뉴런 및/또는 축삭 변성의 시험관내 및/또는 생체내 검정이 본원에 기재된 바와 같이 억제제 및 길항제를 확인하기 위한 일차 검정으로서 사용될 수 있다.
i) 뉴런 또는 축삭 변성의 세포-기반 및 시험관내 검정
작용제가 DLK 인산화를 감소시키거나 억제하는 것으로 확인된 후에, 억제제는 본원에 기재된 바와 같은 뉴런 또는 축삭 변성의 모델에서 뿐만 아니라 적절한 동물 모델 시스템에서 시험될 수 있다.
DLK 인산화를 억제하거나 감소시켜 뉴런 또는 축삭 변성을 억제하며 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 추가의 작용제를 확인하고 특성화하기 위한 예시적인 검정이 하기와 같이 간략하게 기재된다.
DLK의 인산화를 감소시키거나 억제하는 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성을 또한 억제한다는 것을 확인하는 것 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 사용하기 위한 추가의 작용제를 확인하기 위한 검정이 하기 실시예에서 상세하게 기재되고, 하기와 같이 간략하게 요약된다. 이러한 검정은 (i) 항-신경 성장 인자 (항-NGF) 항체 검정, (ii) 혈청 고갈/염화칼륨 (KCl) 감소 검정, (iii) 로테논 변성 검정, (iv) 망막 시신경 파쇄 및 (iv) 빈크리스틴 변성 검정을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 뉴런 또는 축삭 변성을 평가하기 위한 추가의 검정이 본 발명에 또한 사용될 수 있다.
NGF는 표적 뉴런의 분화 및 생존에 관여하는 소형 분비 단백질이다. 배양된 뉴런을 NGF로 처리하는 것은 축삭의 증식을 가져오는 한편, 이러한 뉴런을 항-NGF 항체로 처리하는 것은 축삭 변성을 가져온다. 뉴런을 항-NGF 항체로 처리하는 것은 또한 현미경검사에 의해 검출가능한 여러 상이한 형태학적 변화를 유도하며, 이를 모니터링하여 후보 억제제의 효과를 관찰할 수 있다. 이러한 변화는 정맥류 형성, 신장된 미토콘드리아의 손실, 정맥류에서의 미토콘드리아의 축적, 세포골격 해체 및 축삭 단편화를 포함한다. 항-NGF 항체에 의해 유도되는 임의의 형태학적 변화에 대항하는 것으로 밝혀진 작용제는 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가의 시스템, 예컨대 본원에 기재된 시스템에서 시험할 수 있다. 추가로, 실시예 1에 기재되고 예를 들어 도 1-3에 예시된 바와 같이, NGF 회수는 DLK 단백질의 증가를 유도한다. 따라서, DLK 단백질의 증가를 방지하는 것으로 밝혀진 작용제는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 후보 작용제로 간주될 수 있다.
혈청 고갈/KCl 감소 검정은 마우스 (예를 들어, P7 마우스) 뇌로부터 단리된 소뇌 과립 뉴런 (CGN)의 배양물의 사용을 기반으로 한다. 이러한 검정에서, 뉴런은 KCl을 포함하는 배지에서 배양된 후, KCl을 덜 함유하는 배지 (5 mM KCl을 포함하는 이글 기초 배지)로 교체되고, 이는 뉴런 변성을 유도한다. 예를 들어 뉴런 마커 (예를 들어, 항-클래스 III 베타-튜불린)로 염색된 고정된 뉴런의 영상의 분석에 의해 검출될 수 있는, KCl 회수시 뉴런 변성을 차단하거나 감소시키는 것으로 밝혀진 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가의 시스템, 예컨대 본원에 기재된 시스템에서 시험할 수 있다.
뉴런 또는 축삭 변성의 또 다른 모델은 배양된 뉴런을, 여러 식물의 뿌리 및 줄기에서 자연적으로 발생하는 살충제 및 살곤충제로서 미토콘드리아 전자 수송을 방해하며 래트에게 주사되는 경우에 파킨슨병-유사 증상을 야기하는 로테논 ((2R,6aS,12aS)-1,2,6,6a,12,12a-헥사히드로-2-이소프로페닐-8,9-디메톡시크로메노[3,4-b]푸로(2,3-h)크로멘-6-온)과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 예컨대 뉴런 특이적 베타 III 튜불린에 대한 항체로 염색된 고정된 뉴런의 영상의 분석에 의해 검출될 수 있는, 로테논의 존재 하에 배양된 뉴런의 변성을 차단하거나 감소시키는 것으로 밝혀진 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가의 시스템, 예컨대 본원에 기재된 시스템에서 시험할 수 있다.
뉴런 또는 축삭 변성의 추가의 모델은 배양된 뉴런을, 튜불린 이량체에 결합하고 미세관 구조의 조립을 방지하는 알칼로이드인 빈크리스틴과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 예컨대 뉴런 특이적 베타 III 튜불린에 대한 항체로 염색된 고정된 뉴런의 영상의 분석에 의해 검출될 수 있는, 빈크리스틴의 존재 하에 배양된 뉴런의 변성을 차단하거나 감소시키는 것으로 밝혀진 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원하는 경우에 이를 추가의 시스템, 예컨대 본원에 기재된 시스템에서 시험할 수 있다.
뉴런 또는 축삭 변성의 망막 시신경 파쇄 모델은 실시예에서 추가로 기재되지만, 또한 문헌 [Quigley, H.A. et al. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Investigative ophthalmology & visual science 36, 774-786 (1995) 및 Ghosh, A.S. et al. DLK induces developmental neuronal degeneration via selective regulation of proapoptotic JNK activity. The Journal of cell biology 194, 751-764 (2011)]에도 기재되어 있으며, 상기 문헌 둘 다는 본원에 참조로 포함된다.
ii) 뉴런 또는 축삭 변성의 동물 모델
본 발명에 사용하기 위한 생체내 검정은 다양한 신경변성 질환의 동물 모델, 예컨대 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증의 동물 모델 (예를 들어, 마우스에서의 실험적 자가면역 뇌염 (EAE))을 포함한다. 또한, 척수 및 외상성 뇌 손상 모델이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 작용제를 특성화하는데 사용될 수 있는 생체내 검정의 비제한적 예는 하기와 같이 기재된다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)의 경우에, 돌연변이체 형태의 슈퍼옥시드 디스뮤타제 1 (SOD1)을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 ALS의 표현형 및 병리상태를 재현한다 (Rosen et al., Nature 362(6415):59-62, 1993). SOD1 마우스 이외에도, 근위축성 측삭 경화증 (ALS)의 여러 마우스 모델이 개발되었고, 본 발명에 사용될 수 있다. 이는 운동 뉴런 변성 (Mnd), 진행성 운동 신경병증 (pmn), 워블러 (Bird et al., Acta Neuropathologica 19(1):39-50, 1971), 및 TDP-43 돌연변이체 트랜스제닉 마우스 (Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2009년 10월 15일 전자 공개))를 포함한다. 추가로, 개 모델이 개발되었고, 본 발명에 사용될 수 있다 (유전성 개 척수성 근육 위축 (HCSMA)).
본 발명의 방법에 사용하기 위한 억제제를 특성화하는데 사용될 수 있는, 파킨슨병의 병원성, 조직학적, 생화학적 및 임상 특징을 모의하는 동물 모델은 레세르핀 (토끼; Carlsson et al., Nature 180:1200, 1957); 메탐페타민 (설치류 및 비-인간 영장류; Seiden et al., Drug Alcohol Depend 1:215-219, 1975); 6-OHDA (래트; Perese et al., Brain Res. 494:285-293, 1989); MPTP (마우스 및 비-인간 영장류; Langston et al., Ann. Neurol. 46:598-605, 1999); 파라콰트/마네브 (마우스; Brooks et al., Brain Res. 823:1-10, 1999 및 Takahashi et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 66:167-170, 1989); 로테논 (래트; Betarbet et al., Nat. Neurosci. 3:1301-1306, 2000); 3-니트로티로신 (마우스; Mihm et al., J. Neurosci. 21:RC149, 2001); 및 돌연변이된 α-시누클레인 (마우스 및 드로소필라; Polymeropoulos et al., Science 276:2045-2047, 1997) 모델을 포함한다.
마우스, 파리, 어류 및 충체를 비롯한 유전자-변형 동물이 알츠하이머병의 이면의 병원성 메카니즘을 연구하는데 사용되었다. 예를 들어, β-아밀로이드에 대한 트랜스제닉 마우스는 알츠하이머병과 일치하는 기억 장애를 발달시킨다 (Gotz et al., Mol. Psychiatry. 9:664-683, 2004). 이들과 같은 모델은 본 발명에 사용하기 위한 작용제를 특성화하는데 사용하기 위한 작용제를 특성화하는데 사용될 수 있다.
마우스, 래트, 저빌, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지 및 원숭이를 비롯한 여러 동물 모델이 졸중을 연구하기 위해 관련 기술분야에서 사용된다. 대부분의 초점성 뇌 허혈 모델은 중대뇌 동맥과 같은 1개의 주요 뇌 혈관의 폐쇄를 수반한다 (예를 들어, 문헌 [Garcia, Stroke 15:5-14, 1984 및 Bose et al., Brain Res. 311:385-391, 1984] 참조). 이러한 모델 중 임의의 모델이 본 발명에 또한 사용될 수 있다.
B. 항체 작용제 제조
DLK의 인산화를 방지하거나 감소시키는 항체; 특정 포스포-형태의 DLK에 결합하는 항체; 및 본 발명의 결합 및 활성 검정에 의해 확인된 항체는 재조합 DNA 기술의 기법을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.
1. 항원 제조
임의로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 예시적인 서열은 실시예에서 기재되고, 본 발명에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 항원의 제조에 사용될 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태가 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
2. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 전형적으로 생성된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1NCNR (식 중, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화할 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어 단백질 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅시킬 수 있다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제가 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.
3. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495, 1975]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 마카크 원숭이를 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 도출한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유할 수 있는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
예시적인 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정한 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 사용이 고려될 수 있는 특정한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다 (Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포가 이러한 DNA의 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체의 재조합 생산 및 라이브러리로부터의 항체의 단리는 하기에서 보다 상세하게 기재된다.
4. 항체 단편 모노클로날 항체
특정 실시양태에서, 본원 방법에 사용하기 위한 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
5. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원 방법에 사용하기 위한 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
6. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원 방법에 사용하기 위한 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야의 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재된다.
7. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하며, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
8. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원 방법에 사용하기 위한 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 DLK, 인산화 DLK 또는 특정한 포스포-형태의 DLK에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 DLK의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위해 정전기 조종 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하는 것 (예를 들어 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하는 것에 의해 다중특이적 항체가 또한 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 비롯한, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원 방법에 사용하기 위한 항체 또는 단편은 또한 DLK, 인산화 DLK 또는 특정한 포스포-형태의 DLK 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
9. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 항체를 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴으로 생산하게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술 기재)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의하여 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7); 인간 태아 신장 계통 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장세포 (MDCK); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A); 인간 폐세포 (W138); 인간 간세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 작용제는 생물학적 샘플에서의 인산화 DLK 또는 특정한 포스포-형태의 DLK의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 뉴런 또는 그의 부분을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 작용제가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서의 인산화 DLK 및/또는 특정한 인산화 형태의 DLK (예를 들어, 인간 또는 뮤린 DLK 서열 (각각 서열 1 및 2)의 위치 43의 트레오닌; 인간 DLK 서열 (서열 1)의 위치 500의 세린 및 뮤린 DLK 서열 (서열 2)의 위치 533의 세린; 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 인산화된 DLK)의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 인산화 형태의 DLK를 특이적으로 인식하는 항체가 인산화 형태의 DLK에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 상기 항체와 접촉시키는 것, 및 상기 항체화 인산화 형태의 DLK 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 항체는 스트레스 의존성 및/또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 가지고 있는 뉴런을 선택하고/거나, 스트레스-의존성 및/또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 검출하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 표지된 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
D. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 작용제는 치료 방법에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 신경변성 질환, 상태 또는 장애를 가진 개체에게 유효량의 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 작용제를 제공한다. 이러한 한 실시양태에서, 방법은 상기 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는데 사용하기 위한 작용제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 DLK의 인산화를 억제하거나 감소시키기 위한 유효량의 작용제를 투여하여 DLK 단백질 안정성을 감소시키는 것을 포함하는, 개체에서 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한 작용제를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 작용제는 양질의 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
작용제 표적이 뇌에 위치한 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 작용제를 제공한다. 특정 신경변성 질환은 혈액-뇌 장벽의 투과성 증가와 연관되어, 작용제 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)이 뇌에 용이하게 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 무손상으로 유지되는 경우, 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하기 위한 여려 관련 기술분야-공지 접근법이 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편과 같은 작용제를 수송하는 물리적 방법은 완전히 혈액-뇌 장벽을 우회하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 우회 방법은 뇌 내로의 직접적인 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9:398-406, 2002] 참조), 간질성 주입/대류-증강 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2076-2080, 1994] 참조), 및 뇌에의 전달 장치 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9:589-595, 2003]; 및 글리아델 웨이퍼스(Gliadel Wafers)™, 길드포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical) 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 장벽 내에 구멍을 생성시키는 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Volumes 1 and 2, Plenum Press, N.Y., 1989)), 예를 들어 브라디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 혈액-뇌 장벽에 걸쳐진 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0083299 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 지질-기반 방법은 항체 또는 항원-결합 단편을 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포솜에 캡슐화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0025313 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0131692 참조)에 코팅하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 글루코코르티코이드 차단제를 사용하여 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널을 활성화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0089473 참조), ABC 약물 수송체를 억제하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0073713 참조); 항체를 트랜스페린으로 코팅하고 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성을 조절하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0129186 참조), 및 항체를 양이온화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg 내지 10mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여 요법은 투여를 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
E. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
물질 및 방법
다음의 물질 및 방법을 하기 기재된 바와 같은 실시예에서 사용하였다.
마우스 모델 - DLK 이형접합 및 녹아웃 마우스, DLK 조건부 녹아웃 마우스, Phr1mag 마우스 및 JNK2 녹아웃 마우스를 문헌 [Ghosh, A.S. et al. (2011), Watkins, T.A. et al. (2013), Lewcock, J.W. et al. Neuron 56, 604-620 (2007), 및 Sabapathy, K. et al. Current biology : CB 9, 116-125 (1999)]에 기재된 바와 같이 생성하였다. JNK3 녹아웃 마우스를 제노웨이(genOway) (프랑스 리옹, www.genoway.com)에 의해 C57Bl/6 ES 세포에서 표적화 벡터로의 상동 재조합에 의해 생성하였다. 표적화 벡터는 3.8 kb 및 6.5 kb의 상동성 아암을 함유하였고, 대부분의 엑손 11을 네오마이신 내성 카세트로 대체하였다. 삭제된 영역은 JNK 활성에 요구되는 T-P-Y 트리펩티드 이중 인산화 모티프를 포함한다. neo 카세트 삽입은 엑손 10 및 12를 함께 스플라이싱하는 경우에 프레임시프트를 일으켜 엑손 14에 이른 정지 코돈을 생성한다. 네오마이신-내성 ES 세포 클론을 PCR 및 서던 블롯에 의해 스크리닝하여 카세트의 상동 재조합을 확인하였다. JNK3 유전자형의 결정은 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수행하였다:
프라이머 1: 5'-CCAGTAACATTGTAGTCAAGTCT-3' (서열 7)
프라이머 2: 5'-TGGTCTTCCGCTTGGTAT-3' (서열 8)
프라이머 3: 5'-CGCCTTCTATCGCCTTCT-3' (서열 9)
프라이머 1 및 2는 WT 대립유전자에서의 249-bp 단편을 생성하고, KO 대립유전자에서는 어떠한 생성물도 생성하지 않는다. 프라이머 1 및 3은 KO 대립유전자에서의 435-bp 단편을 생성하고, WT 대립유전자에서는 어떠한 생성물도 생성하지 않는다. JNK2/3 이중 녹아웃 및 한배새끼 대조군으로부터의 망막 샘플에서의 JNK2 및 JNK3에 대한 블롯팅은 녹아웃 마우스에서 JNK2 및 JNK3 단백질의 손실을 제시한다 (도 12).
USP9X 조건부 녹아웃 마우스를 렉시컨 파마슈티칼스(Lexicon Pharmaceuticals)에 의해 C57BL/6 ES 세포로부터 생성하였다. 이는 촉매적 Cys 1560을 코딩하는 엑손 31에 플랭킹하는 loxp 부위를 갖는 USP9X 대립유전자를 함유한다. 엑손 31의 4.7 kb 5' 및 4.0 kb 3'의 상동성 아암을 갖는 FRT-플랭킹된 네오마이신 카세트를 사용하여 ES 세포에서 상동 재조합에 의해 loxp 부위를 삽입하였다. 네오마이신-내성 ES 세포 클론을 카세트의 상동 재조합에 대한 서던 블롯에 의해 스크리닝하였다. 플록싱된 대립유전자를 함유하는 마우스를 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 Flp 결실자 계통과 교배시켰다. 플록싱된 USP9X 대립유전자의 유도성 재조합을 달성하기 위해, USP9X 조건부 녹아웃 마우스를, rosa 유전자좌 내에 Cre-에스트로겐 수용체 융합 단백질을 코딩하는 구축물의 삽입을 함유하는 Rosa-Cre-ERT2 계통과 교배시켰다 (Seibler, J. et al. Nucleic acids research 31, e12 (2003)). DRG 실험을 위해, USP9Xloxp / loxp; Cre- 및 USP9Xloxp / loxp; Cre+ 마우스를 시간설정된 임신을 위해 교배하였고, 배아를 Cre의 존재 또는 부재에 대해 유전자형 결정하였다. 배양된 DRG에서의 재조합은 48시간 동안 10 μM 4-히드록시타목시펜 (4-OHT, 시그마(Sigma) 카탈로그 # H7904)을 세포에 첨가함으로써 유도하였다. 4-OHT를 또한 Cre- 대조군 세포에 첨가하였다.
일차 뉴런 배양 - 후근 신경절을 E12.5부터 E13.5 마우스 배아까지 절개하고, 트립신처리하고 (체외이식편의 경우를 제외함), 폴리-d-리신 및 라미닌으로 코팅된 챔버 슬라이드 (바이오코트(BioCoat), BD) 상에서 N3 보충물, 40 mM 글루코스 및 25 ng/mL NGF를 함유하는 F12 배지에서 배양하였다. 플레이팅 다음 날에, 3 μM 아라비노푸라노시드 (AraC, 시그마)를 배지에 첨가하고, 2일 후에 제거하고, 배지를 AraC 없이 N3/F12/NGF로 대체하였다. NGF 회수 실험을 위해, 시험관내에서 4 내지 5일 후에, 배지를 1 내지 3시간 동안 NGF 무함유 및 25 μg/mL 항-NGF 항체 (제넨테크(Genentech)) 함유 배지로 대체하였다.
siRNA 실험을 위해, 분리된 DRG를 아막사(Amaxa) 뉴클레오펙션 시스템 (론자(Lonza))을 사용하여 형질감염시켰다. JNK3 siRNA (센스 5'- ACA TCG TAG TCA AGT CTG ATT T-3' (서열 10), 안티센스 5'- ATC AGA CTT GAC TAC GAT GTT T (서열 11))를 제넨테크에서 합성하였다 (Kim, M.J. et al. Neuron 56, 488-502 (2007)). 대조군 siRNA는 다마콘(Dharmacon)으로부터의 온-타켓플러스(ON-TARGETplus) 비-표적화 siRNA #1이었다.
웨스턴 블롯팅 - DRG 배양물을 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 완충제에서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여 용해시켰다. HEK 293T 세포를 방사성면역침전 검정 (RIPA) 완충제에서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여 용해시켰다. 망막 및 신경 조직 샘플을 3mm 탄화텅스텐 비드 (퀴아젠(Qiagen))를 갖는 티슈라이저(TissueLyser) (퀴아젠)를 사용하여 RIPA 완충제에서 6분 동안 용해시켰다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 용해 용액은 완전 프로테아제 억제제 칵테일 및 PhosSTOP 포스파타제 억제제 칵테일 (로슈(Roche))을 함유하였다. 293T 및 망막 용해물의 단백질 농도를 BCA 검정 (피어스(Pierce))에 의해 결정하였다. 샘플을 NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 (인비트로젠(Invitrogen)) 상에 로딩하였고, 표준 이뮤노블롯팅 절차에 적용하였다. 표시된 경우를 제외하고, DLK에 대해 블롯팅된 겔을 MOPS 완충제 (인비트로젠)에서 러닝시켰다. Phr1의 큰 크기로 인해, Phr1에 대해 블롯팅된 샘플을 3-8% 트리스-아세테이트 겔 (인비트로젠) 상에서 러닝시켰다. 블롯을 화학발광 및 필름에의 노출로 시각화하였다. 상대적 단백질 발현 및 분자량 정량화를 위해, 블롯을 또한 케미독(Chemidoc) (바이오-라드(Bio-Rad)) 상에서 시각화하였다. 정량화를 이미지랩 (바이오-라드)에서 수행하였다. 단백질 발현을 로딩 대조군 (액틴 또는 튜불린)에 대해 표준화하였다. 분자량을 프리시젼 플러스 프로테인 웨스턴씨 스탠다즈(Precision Plus Protein WesternC Standards) (바이오-라드)에 대해 표준화하였다.
항체 및 억제제 - 하기 항체를 염색 및 웨스턴 블롯팅에 사용하였다: 항-DLK (1:1000, 참고문헌 [Hirai, S. et al. Development 129, 4483-4495 (2002)]에 따라 제넨테크에서 생산함); 항-p-JNK (1:250, 셀 시그널링(Cell Signaling) # 9251); 항-p-cJun (웨스턴에 대해 1:250 및 염색에 대해 1:500, 셀 시그널링 #9261); 항-전체 JNK (1:500, 셀 시그널링 # 9252); 항-JNK2 (1:500, 셀 시그널링 #4672); 항-JNK3 (1:500, 셀 시그널링 #2305); 항-β-튜불린 ("Tuj", 1:1000, 코반스(Covance) #MMS-435P-250); 항-액틴 (1:5000, BD # 612656); 항-절단-카스파제-3 (1:500, 셀 시그널링 # 9664); Brn3 (1:100, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) # sc-6026); γ-시누클레인 (1:200, 압캠(Abcam) # ab55424); NF-M (1:200, 코반스 MMS-583S). 항-USP9X (래트 모노클로날 4B3)는 제넨테크에서 생산하였고, 인간 USP9X의 198개 C-말단 아미노산에 대해 생성하였다. Phr1에 대한 항체는 바큘로바이러스에서 발현된 DOC 도메인으로 이루어진, 아미노산 D3812-Q3961을 포함하는 Phr1의 단편으로 토끼를 면역화시켜 생성하였다. 이어서, 혈청을 사용 전에 동일한 펩티드로 로딩한 칼럼을 사용하여 친화도 정제하였다. 이러한 단백질의 부분은 Phr1mag 돌연변이체에서 부재한다. DLK 상의 T43, S272 및 S533 인산화 부위에 대한 항체는 하기 펩티드: PEKDL- pT -PTHVLQLHC (서열 12), HRDLK- pS -PNMLITYDC, RNVPQKL- pS -PHSKRPC (서열 13)를 사용한 토끼의 면역화를 통해 생성하고, 사용 전에 친화도 정제하였다.
하기 억제제를 주어진 농도로 사용하였다: 시클로헥시미드 (5 μM, 칼바이오켐(Calbiochem) # 239764); 오카다산 ("OA", 200 nM, 시그마 # O8010), MG132 (30 μM, 피셔(Fisher) # NC9937881); JNK 억제제 V ("JNKV", 10 μM, EMD # 420129); JNK 억제제 VII ("JNKVII", 10 μM, EMD # 420134); JNK 억제제 VIII ("JNKVIII", 10 μM, EMD # 420135).
HA-Ub-비닐 술폰을 사용한 USP9X 활성 검정 - HA-태그부착된 유비퀴틴 비닐 술폰을 엔조 라이프 사이언시스(Enzo Life Sciences)로부터 얻었다. 검정을 문헌 [Borodovsky, A. et al. Chemistry & biology 9, 1149-1159 (2002)]에서와 같이 수행하였다. 간략하게, 배양된 DRG를 항-NGF로 또는 대조군으로서의 NGF로 처리하였다. 이어서, DRG를 용해 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5, 5 mM MgCl2, 250 mM 수크로스, 1 mM DTT, 2mM ATP 및 100 μM PMSF)에 재현탁시키고, 용해를 위해 다운싱하였다. 이어서, 용해물을 6.6 μg/mL HA-유비퀴틴 비닐 술폰과 함께 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. N-에틸-말레이미드를 음성 대조군으로서 5 μM로 첨가하였다. 반응을 샘플 완충제에서 비등시켜 중지시켰다.
실시간 정량적 역전사 PCR (실시간 qRT-PCR) - 분리된 DRG 및 망막으로부터의 RNA 샘플을 RNeasy 플러스 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 수집하였다. 미리-디자인된 택맨(Taqman) 프라이머 세트를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 주문하였다. 프라이머 세트에 대한 카탈로그 번호는 다음과 같았다: DLK - Mm00437378_m1 (FAM 표지됨), GAPDH - 4352339E (VIC 표지됨). 비교 Ct (ΔΔCt) 검정을 7500 실시간 PCR 시스템 상에서 택맨 RNA-투-Ct 원-스텝 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 # 4392938)를 사용하여 수행하고, 7500 소프트웨어에서 분석하였다. GAPDH 내인성 대조군 및 DLK 프라이머를 멀티플렉스화하였다. 모든 검정은 5회의 기술적 반복을 포함하였다. 오차 막대는 이러한 5회의 기술적 반복으로부터 계산된 상대량의 표준 편차를 나타낸다.
람다 단백질 포스파타제 검정 - 람다 단백질 포스파타제, PMP에 대한 10X NEBuffer 및 10 mM MnCl2를 모두 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 얻었다. DRG에 대해, 용해물을 포스파타제 억제제 또는 EDTA 없이, 그러나 다르게는 이 원고에서의 다른 DRG 용해물과 동일한 조건 하에서 수집하였다. 용해물을 1X PMP 완충제 및 1 mM MnCl2와 함께, 모의 대조군으로서 800 유닛 람다 단백질 포스파타제 또는 동등 부피의 50% 글리세롤과 함께 30℃에서 30분 동안 배양하였다. 반응을 샘플 완충제와 함께 가열하고 겔 상에 로딩함으로써 중지시켰다.
DLK 안정성을 결정하기 위한 시클로헥시미드 타임코스 - 시간 0에서, DRG 배양 배지를 상기 방법 하위표제에서 상술된 바와 같은 NGF 무함유, 항-NGF 및 시클로헥시미드 함유 배지로 대체하였다. 용해물을 주어진 시점에서 수집하고, DLK에 대해 블롯팅하였다. 실험을 3회 수행하고, DLK를 로딩 대조군 대비 정량화하였다. 시간 0에서의 양 대비 DLK의 평균 양을 각 시점에 대해 계산하였다. 2개 선의 기울기를 비교하기 위한 선형 회귀 및 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 수행하였다.
면역침전 - 항-유비퀴틴 면역침전 (IP)을 위해, E12.5 CD-1 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories))로부터 절개된 DRG를 상기 기재된 바와 같이 용해 완충제 중 30 μM MG132 및 5 μM N-에틸말레이미드를 첨가하여 용해시켰다. 용해물을 프로테인 G 접합된 디나비즈 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 사용하여 30분 동안 예비-청정화시켰다. 6 μg 항-유비퀴틴 항체 (클론 FK2, 밀리포어(Millipore)) 또는 등가물.
시험관내 JNK 키나제 검정 - Flag-태그부착된 DLKS302A를 항-Flag-접합된 자기 비드 (시그마)를 사용하여 293T 세포 용해물로부터 면역침전시켰다. 세척 후에, DLK-결합된 Flag 비드를 2,000 유닛의 람다 단백질 포스파타제, 1X PMP 완충제 및 1X MnCl2와 함꼐 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 정제된 DLK로부터 모든 포스페이트 기를 제거하였다. 이어서, 비드를 포스파타제 억제제를 함유하는 완충제로 세척하고, 키나제 반응 완충제 (50 mM HEPES pH 7.2, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.01% 트리톤-X-100, 2 mM DTT, 30 μM ATP)를 갖는 2개의 튜브로 분할하였다. 126 ng의 GST-태그부착된 인간 재조합 JNK3 (밀리포어)을 2개의 튜브 중 하나에 첨가하고, 30℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. DLK를 샘플 완충제에서 가열하여 Flag 비드로부터 용리시키고, 샘플을 블롯팅을 위해 겔 상에 로딩하였다.
실시예 1 - 뉴런 스트레스 반응은 다양한 포유동물 스트레스 패러다임에서 DLK 수준의 증가를 가져온다
전체 DLK 단백질 수준을 조사하여, 전체 DLK 수준이 무척추동물 (Xiong, X. et al. (2010)) 및 세포 배양 기반 모델 (Xu, Z. et al. (2001))에서 관찰된 바와 같이 뉴런 스트레스에 대한 일반적 반응으로서 증가하는지 여부를 결정하였다. DLK 의존성인 신뢰할 만하고 재현가능한 신경변성을 제공하는 2가지 뉴런 스트레스 모델을 선택하였다: 배양된 배아 감각 뉴런의 신경 성장 인자 (NGF) 회수 검정, 발생 뉴런 세포 사멸의 모델, 및 망막 시신경 파쇄 검정, 신경 손상 및 녹내장에 대한 모델3 , 18. 배양된 배아 후근 신경절 세포 (DRG)에서, DLK 단백질 수준은 NGF 회수에 대한 반응으로, NGF의 존재 하에 배양된 비스트레스 뉴런과 비교하여 대략 2배만큼 증가하였다 (도 1a, e). 유사하게, 전체 망막에서의 DLK 수준은 시신경 파쇄 3일 내에 거의 1.5배만큼 증가하였다 (도 1b,e). 시신경으로부터 단리된 샘플에서, DLK 수준의 증가는 근위 측면에서만 일어나고, 원위 축삭에서는 일어나지 않았다 (도 1c,d). 각각의 경우에, DLK 수준은 NGF 회수에서 16시간 후에 및 망막 신경 파쇄에서 3-7일 후에 시작되는 뉴런 변성의 개시보다 훨씬 더 이른 시점에서 증가하였다.
DLK 단백질 양의 증가는 ~5kDa의 DLK의 겉보기 분자량 (도 1a,b,d)의 증가를 동반했다 (도 1f). DRG 용해물을 람다 단백질 포스파타제로 처리하여 포스페이트 기를 절단하는 것은 +NGF 및 -NGF 조건에서 DLK의 분자량을 같게 하였으며 (도 1g), 이는 이동성 변화가 인산화의 결과였음을 입증한다. 망막 신경 파쇄에서, DLK는 RGC에서만 인산화되고, 다른 망막 세포 유형에서는 인산화되지 않는다 (도 8a).
DLK 이동성 변화는 일부 경우에서 관찰되었으나 (Xu, Z., Maroney, A.C., Dobrzanski, P., Kukekov, N.V. & Greene, L.A. Molecular and cellular biology 21, 4713-4724 (2001); Mata, M. et al. The Journal of biological chemistry 271, 16888-16896 (1996)), 다른 경우에서는 관찰되지 않았고, 관찰된 경우에 이러한 현상의 기초는 잘 이해되지 않았다. 이러한 충돌 결과는 적어도 부분적으로는 연구 군에 걸쳐 사용된 SDS-PAGE 완충제 조건의 차이로 인한 것일 수 있다 (도 8b).
실시예 2 - DLK 단백질은 영양 인자 회수에 반응하여 안정화된다
스트레스-유도 DLK 수준 상승을 설명하기 위한 가능한 메카니즘은 (1) Dlk의 증가된 전사, (2) 증가된 단백질 번역, 또는 (3) 증가된 DLK 안정성을 포함한다. 가능성 1을 다루기 위해, 실시간 qRT-PCR을 수행하여, 영양 인자 회수를 겪은 DRG에서 및 신경 파쇄된 망막에서 DLK 전사체의 양을 정량화하였다. 어떠한 조건도 비스트레스 대조군과 비교하여 DLK 전사체 수준의 검출가능한 변화를 제시하지 않았는데 (도 2a), 이는 DLK 단백질 수준의 상승이 전사후 메카니즘으로 인한 것임을 입증한다. DLK 안정성이 뉴런 스트레스에 의해 영향을 받는지를 결정하기 위해, DRG를 8시간의 기간에 걸쳐 NGF의 존재 또는 부재 하에 단백질 번역을 억제하는 시클로헥시미드로 처리하고, 이 시간 기간에 걸쳐 남아있는 DLK의 양을 결정하였다. DLK 안정성의 ~2.5배 증가를 NGF 고갈에서 관찰하였는데 (도 2b-c), 이는 DLK 단백질 수준의 상승이 뉴런 스트레스에 대한 반응으로 증진된 단백질 안정성의 결과임을 나타낸다.
DLK의 스트레스-의존성 조절에 있어서 인산화의 역할을 추가로 연구하기 위해, NGF의 존재 하에 배양된 비스트레스 DRG를 광범위한 포스파타제 억제제인 오카다산으로 처리하여 DLK의 인산화를 증진시켰다. 이러한 처리는 겉보기 분자량과 전체 DLK 수준 둘 다를 증가시키기에 충분하였으며, 이는 DLK의 인산화가 단백질 안정성을 조절함을 시사한다 (도 2d). MG132를 사용한 처리는 DLK 인산화의 증가 없이 DLK 수준의 증가를 나타냈으며, 이는 비-인산화 DLK가 프로테아솜에 의해 정상적으로 분해됨을 시사한다 (도 2d).
실시예 3 - 뉴런 스트레스는 Phr1의 조절을 통해 DLK 유비퀴틴화를 조절한다
뉴런 스트레스가 DLK 유비퀴틴화를 감소시켜 DLK 안정성을 증진시키는지 여부를 결정하기 위해, 유비퀴틴화 단백질을 +NGF 및 -NGF DRG로부터 면역침전시켰으며, DLK 유비퀴틴화는 -NGF 조건에서 현저하게 감소되는 것으로 밝혀졌다 (도 3a). 무척추동물 시스템에서, E3 유비퀴틴 리가제의 PHR 패밀리 (PAM/highwire/RPM-1)는 DLK 단백질 수준을 조절하고, 탈유비퀴틴화 효소 (DUB)를 코딩하는 fat facets 유전자와 dlk 상동체 사이의 유전적 상호작용이 입증되었다 (Collins, C.A., Wairkar, Y.P., Johnson, S.L. & DiAntonio, A. (2006); Nakata, K. et al. (2005); Xiong, X. et al. (2010)). 그러나, Phr1 KO 마우스 배아로부터의 전체 뇌 용해물은 DLK 단백질 양에 있어서 변화를 나타내지 않기 때문에 (Bloom, A.J., Miller, B.R., Sanes, J.R. & DiAntonio, A. (2007)), DLK를 조절하는 유사한 경로가 척추동물에 존재하는지 여부는 명백하지 않았다. 포유동물 뉴런에서 DLK 수준을 조절하는데 있어서 유비퀴틴 프로테아솜 시스템의 역할을 직접적으로 연구하기 위해, 기능 상실 대립유전자를 갖는 DRG를 이러한 두 유전자의 마우스 상동체에서 배양하였다.
fat facets에 가장 가까운 마우스 상동체인 USP9X에서의 조건부 마우스 녹아웃으로부터의 제1 DRG를 배양하였다. DLK의 전환을 제어하는 DUB의 녹아웃에 대해 예상된 바와 같이, DLK 수준의 ~35% 감소를 USP9X 결핍 DRG (Cre+) 대 Cre- DRG에서 관찰하였다 (도 3b,c). 그러나, USP9X의 녹아웃이 DLK의 기저 수준에 효과를 나타낸 반면, Cre- 뉴런에서 DLK 단백질 양의 -NGF:+NGF 비는 Cre+ 뉴런에서의 경우와 거의 동일하였다 (도 3c). 이러한 관찰과 일치하게, 유비퀴틴 비닐 술폰과의 가교는 USP9X 활성이 NGF 회수에 의해 변경되지 않는다는 것을 밝혔다 (도 9). 따라서, 본 발명자들은 USP9X가 DLK를 탈유비퀴틴화하지만, DLK 수준의 스트레스 의존성 변화에 요구되지는 않는다고 결론내린다.
대조적으로, 기능 상실 Phr1mag 대립유전자에 대해 동형접합인 DRG (Lewcock, J.W. et al. (2007))는 야생형 대조군과 비교하여 NGF의 존재 하에 DLK 수준의 증가를 나타냈지만, NGF 고갈 후에는 DLK 수준에 영향을 미치지 않았으며, 스트레스 및 비-스트레스 조건에서 대략 동등한 DLK 수준을 나타냈다 (도 3d,e). 추가로, Phr1mag 동형접합 뉴런은 보다 적은 양의 유비퀴틴화 DLK를 가진다 (도 3f). 이러한 관찰은, 뉴런 스트레스 하에 관찰된 DLK 유비퀴틴화의 감소 (도 3a)와 함께, DLK의 유비퀴틴화의 변화가 적어도 부분적으로는 Phr1 활성의 조절 또는 그의 DLK와의 상호작용으로 인한 것임을 시사한다. 그러나, Phr1mag 뉴런에서의 DLK의 양의 증가는 하류 신호전달 및 c-Jun과 같은 하류 표적의 인산화를 구동하기에 충분하지 않았다. 따라서, 상승된 DLK 단독으로는 하류 신호전달 사건을 유도하기에 충분하지 않고, 추가의 투입물이 DLK 활성화에 요구된다.
실시예 4 - DLK 활성 및 JNK 활성이 DLK의 안정화에 요구된다
뉴런 스트레스는 감소된 유비퀴틴화를 통해 DLK 인산화 및 안정화를 유도하고, 오카다산 처리가 또한 DLK 인산화 및 안정화를 유발한다. 이것은 DLK 인산화와 DLK 안정화 사이의 가능한 연관성을 시사한다. 어떻게 인산화가 DLK 단백질 안정성을 조절할 수 있는지를 결정하기 위해, 일시적 형질감염에 의한 HEK 293T 세포에서의 Flag-태그부착된 뮤린 DLK의 발현을 조사하였다. 293T 세포에서 발현된 야생형 DLK는 이량체화되고 자가-인산화되기 때문에 구성적으로 활성이다 (Mata, M. et al. (1996)). 뉴런에서의 비스트레스 vs. 스트레스 조건을 어느 정도 모방하기 위해, 본 발명자들은 MLK3과의 상동성에 의해 확인한 추정 활성화 루프에서 인산화 부위를 돌연변이시킴으로써 DLK의 키나제 데드 버전을 만들었다 (Leung, I.W. & Lassam, N. The Journal of biological chemistry 276, 1961-1967 (2001)). 하나의 그러한 점 돌연변이체인 DLKS302A는 발현되는 경우 c-Jun의 인산화를 유발할 수 없으며, 이는 키나제 활성이 결핍되어 있음을 확인해준다. 흥미롭게도, DLKS302A는 HEK293T 세포에서 야생형 DLK보다 더 낮은 수준으로 발현되었다. USP9X와의 공-발현은 DLKS302A의 발현을 야생형 수준으로 증가시켰으며, 이는 관찰된 더 낮은 단백질 수준이 불활성 DLK의 증가된 유비퀴틴화로 인한 것임을 시사한다 (도 4a). 이러한 데이터는 뉴런에서의 관찰과 일치한다. DLKS302A로 관찰된 단백질 발현의 감소가 이러한 특정 돌연변이의 효과라기보다는 오히려 키나제 활성의 손실의 결과였다는 것을 확인하기 위해, 전장 DLK 이량체화를 방지함으로써 우성 음성의 역할을 하는, 단지 DLK 류신 지퍼만을 함유하는 말단절단된 구축물을 갖는 야생형 DLK (Nihalani, D., Merritt, S. & Holzman, L.B. The Journal of biological chemistry 275, 7273-7279 (2000))를 공동-형질감염시켰다. DLKS302A로 관찰된 것과 유사하게, DLK 활성의 감소는 GFP와 공-발현된 DLK와 비교하였을 때 저하된 DLK 발현을 초래하였다 (도 4b).
DLK 경로 활성이 단백질 안정화를 위해 필요한 것처럼 보이지만, 하류 신호전달이 DLK 안정성에서 일정 역할을 하는지 여부를 조사하였다. 독시시클린-유도성 방식으로 DLK를 발현한 안정한 세포주를 사용하였고, 세포를 2개의 구조적으로 구별되는 JNK 억제제로 처리하였다 (도 4c). 두 JNK 억제제는 DLK 단백질의 수준을 감소시킬 수 있었다.
뉴런 시스템에서 이러한 발견의 관련성을 결정하기 위해, siRNA를 사용하여 JNK2 녹아웃 DRG에서 JNK3 발현을 녹다운시키고, 대부분의 스트레스 유도 뉴런 변성을 조절하는 2개의 JNK 패밀리 구성원을 제거하였다 (Coffey, E.T. et al. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 22, 4335-4345 (2002); Chang, L., Jones, Y., Ellisman, M.H., Goldstein, L.S. & Karin, M. Developmental cell 4, 521-533 (2003)). 대조군 siRNA와 비교하여, JNK3 녹다운은, DLK 겉보기 분자량의 일부 변화가 여전히 관찰되긴 하였지만, DLK의 증가를 약화시켰다 (도 4d). JNK 활성은, 다른 JNK 독립적 인산화 사건도 일어나긴 하지만, DLK 안정화에 요구되는 DLK 상의 특정 부위의 인산화를 일으키는 피드백 메카니즘을 생성하는 것으로 가정되었다. 망막 신경 파쇄 모델에서, JNK2/3 이중 녹아웃은 파쇄후 18시간에서 한배새끼 대조군과 비교하여 DLK 수준 또는 분자량의 증가를 나타내지 않았으며 (도 4e, 화살표), 이는 DLK의 JNK-의존성 인산화가 성체 생체내 손상 패러다임에서 또한 일어남을 입증한다.
실시예 5 - DLK 안정화에 요구되는 인산화 부위의 확인
DLK 상의 기능적으로 관련된 인산화 부위를 확인하기 위해, 세포 배양 중 아미노산에 의한 안정한 동위원소 표지 (SILAC)와 함께 질량 분광측정법을 사용하였다. 이러한 연구를 위해, FLAG-태그부착된 DLK를 발현하는 293T 세포를 동위원소 농축 (무거움) 버전의 리신 (13C6 15N2) 및 아르기닌 (13C6 15N4) 또는 그의 비표지 대응물 (가벼움)을 함유하는 SILAC 배지에서 배양하였다. 4개의 쌍형성 조건 (가벼움 vs. 무거움)을 다음과 같이 설정하여 DLK의 전체 존재비 및 DLK 인산화의 정도에 대한 JNK 및 DLK 활성의 효과를 분석하였다: 1) 야생형 (WT) DLK vs. DLKS302A, 2) DLKS302A vs. 구성적으로 활성인 JNK 구축물과 함께 공-발현된 DLKS302A (Lei, K. et al. Molecular and cellular biology 22, 4929-4942 (2002)), 3) WT DLK vs. WT DLK와 JNK 억제제, 및 4) WT DLK vs. WT DLK와 오카다산 (도 5a).
시험한 조건에 반응하여 존재비가 변화한, DLK 상의 일련의 포스포펩티드를 확인하였다. 조건간 DLK의 전체 존재비의 차이에 대한 교정 후에 (물질 및 방법 참조), DLK 및 JNK-의존성 인산화와 일치하는 방식으로 인산화 상태가 변화한 부위를 확인하였다 (도 5b,c). 변화의 크기의 면에서 상위 3개의 부위는 N-말단 도메인에서의 T43, 키나제 도메인에서의 S272 및 류신 지퍼 도메인에 대해 바로 C-말단인 S533이었다. 또한, JNK 및 DLK의 예상된 활성화와 일치하게, 다중 인산화 부위를 함유하는 펩티드에 대한 변화를 관찰하였다. 키나제 활성화 루프 내의 공지된 인산화 부위 (S295-T306)는 DLK의 키나제 활성에 의존성이지만 JNK와는 독립적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은, JNK가 DLK의 활성을 직접적으로 조절하지 않고 오히려 DLK 안정성에 영향을 미치는 인자를 제어하는 모델에 적합하다. 흥미롭게도, DLK의 서열 내에서, 상위 확인된 부위는 MAPK 기질 모티프와 일치하는 플랭킹 프롤린을 함유하였다 (Songyang, Z. et al. Molecular and cellular biology 16, 6486-6493 (1996)).
실시예 6 - 확인된 부위는 안정화된 DLK에서 인산화된다
DLK의 안정성에 대한 각각의 상위 3개의 확인된 부위의 인산화의 효과를 결정하기 위해, 각각의 알라닌 점 돌연변이체를 293T 세포에서 발현시켰다. S272는 c-Jun 인산화에 의해 측정된 바와 같이 DLK 활성에 요구되었다. S272 돌연변이체로부터 유발되는 DLK 안정성의 변화를 키나제 활성의 손실로 인해 일어난 변화와 구별하는 것은 가능하지 않았으므로, 이러한 점 돌연변이는 더 조사되지 않았다. 흥미롭게도, T43 및 S533은 DLK 활성에 요구되지 않았지만, DLKT43A 및 DLKS533A 돌연변이체는 야생형 DLK보다 더 낮은 수준으로 발현되었고 (도 6a), 이는 단백질 안정성의 감소와 일치한다. T43, S272 및 S533에 대해 생성된 포스포-특이적 항체는, 점 돌연변이체에서 뿐만 아니라 키나제 데드 DLKS302A에서 이들 부위의 인산화의 손실이 존재함을 입증하였고, 이는 질량 분광측정법 결과와 일치한다 (도 6a).
T43 및 S533의 인산화가 뉴런에서 스트레스-의존성 방식으로 일어나는지 여부를 조사하였다. 이러한 질문에 답하기 위해, 야생형 DRG를 영양 인자 고갈시켰고, 용해물을 각각의 2개의 인산화 부위에 특이적인 항체로 블롯팅하였다 (도 6b). 포스포-T43 표적화 항체는 람다 포스파타제 처리에 의해 제거된 -NGF 조건에서 면역반응성을 제시하였으며, 이는 인산화 표적 항원에 대한 이 항체의 특이성을 입증한다. 영양 인자 고갈된 DLK loxp/loxp Cre- 및 Cre+ 용해물을 블롯팅하여 DLK에 대한 이 항체의 특이성을 입증하였다 (도 6c). 추가로, T43 및 S533 둘 다의 인산화는 파쇄된 망막으로부터 면역침전된 DLK에서 검출될 수 있었다 (도 6d). 따라서, T43 및 S533은 생체내 뉴런 스트레스 후에 인산화되며, 이는 이들 부위의 인산화가 뉴런에서의 DLK 안정성에 기여한다는 가설과 일치한다. 정제된 JNK 및 DLK를 사용하는 시험관내 키나제 검정은 T43 및 S533 둘 다가 JNK에 의해 직접적으로 인산화될 수 있음을 제시하였다 (도 6e). 따라서, JNK는 생체내에서 DLK를 직접적으로 인산화할 수 있다.
실시예 7 - DLK는 용량-의존성 방식으로 하류 아폽토시스촉진 신호전달을 조절한다
DLK 단백질 양이 영양 인자 회수 및 시신경 파쇄에 반응하여 증가한다는 관찰은, DLK 단백질 수준이 뉴런 스트레스 후에 DLK에 의해 유발된 하류 신호전달의 정도에 직접적으로 영향을 미치는지 여부에 관한 시험을 촉진시켰다. 이를 위해, 본 발명자들은 WT 한배새끼에 존재하는 DLK의 양의 대략 50%를 발현하는 DLK 녹아웃 이형접합체를 사용하였다. NGF 회수의 3시간 타임 코스 (도 7a)에서, DLK KO 대립유전자에 대한 이형접합 뉴런은 WT 대조군과 비교하여 보다 낮은 수준의 p-cJun 및 p-JNK를 제시하였다. 따라서, DRG에서 DLK의 양은 아폽토시스촉진 신호전달의 양을 직접적으로 제어한다.
망막 신경 파쇄에서, DLK 야생형 마우스와 비교하여 DLK 이형접합 마우스에서 아폽토시스촉진 신호전달의 유사한 감소가 존재하였다. 시신경 파쇄 6시간 후에, 이형접합 파쇄 망막에서의 p-cJun-양성 핵의 개수는 WT 망막에서 발견된 개수와 비교하여 대략 70%만큼 감소하였다 (도 7b,c). 마찬가지로, 시신경 파쇄 3일 후에, 카스파제-3-양성 세포의 양은 DLK 이형접합체에서 > 85%만큼 감소한 반면에 (도 7d,e), Brn3-양성 핵의 전체 개수는 > 2배만큼 증가하였다 (도 7d,f). 이러한 마커의 변화는 스트레스 반응이 없어졌다는 것을 나타낸다 (Watkins, T.A. et al. In Press (2013)). 보다 나중의 시점에, 이러한 마커는 WT 망막에서 관찰된 것과 구별이 불가능해질 수 있으며, 이는 이형접합체에서의 감소된 아폽토시스 신호전달이 절대적 감소보다 더 지연된 것임을 입증한다 (도 11). 이것은 신경 파쇄 후에 아폽토시스촉진 신호전달이 차단되는 DLK 녹아웃과는 다르다 (Watkins, T.A. et al. In Press (2013)). 따라서, DLK 수준의 조절은 뉴런 스트레스 후에 생체내 및 시험관내 둘 다에서 하류 아폽토시스 신호전달의 양 및 진행을 조정한다.
DLK 수준은 정상 조건 하에서 Phr1 및 USP9X를 통해 면밀하게 조절되는 것으로 제안되어 있다. 특히 Phr1 돌연변이체에서, DLK 수준은 스트레스의 부재 하에 증가하지만, 이는 하류 신호전달을 유발하지 않으므로; 따라서, 추가의 인자가 DLK 활성화에 요구된다. 뉴런 스트레스 (예를 들어 NGF 고갈 및 손상)는 DLK 키나제 활성의 활성화 및 하류 표적 MKK4/7 및 JNK의 인산화를 유도한다. 이어서, JNK-의존성 피드백 메카니즘은 DLK의 인산화 및 안정화를 유발한다. 안정화는, NGF 회수에서 관찰된 바와 같이, 유비퀴틴화의 변화를 통해 일어난다. 이러한 유비퀴틴화의 변화는, 추가의 E3 유비퀴틴 리가제가 또한 DLK의 유비퀴틴화에 참여하는 것이 가능할지라도, 아마도 Phr1의 활성 또는 Phr1에 대한 DLK의 기질 이용가능성의 변화를 통해 일어나는 것 같다. 어느 경우에도, JNK로부터의 양성 피드백으로 인한 유비퀴틴화의 감소는 DLK 수준의 신속한 스위치-유사 상향조절 및 아폽토시스와 축삭 변성의 활성화를 유발한다.
DLK 키나제 활성은 동종이량체화 및 자가인산화를 요구하고 (Nihalani, D., Merritt, S. & Holzman, L.B. (2000)), 활성화 루프 상의 자가인산화는 관련된 키나제 MLK3의 키나제 활성에 요구된다 (Leung, I.W. & Lassam, N. (2001)). 따라서, NGF 회수 및 신경 파쇄에서 관찰된 DLK의 인산화가 DLK 활성화 루프 상의 자가인산화 또는 상류 활성화 키나제에 의한 DLK 활성화 루프의 인산화의 결과라고 가정하는 것은 합리적일 것이다. 이것은 사실상 JNK 억제가 뉴런 스트레스 후에 DLK 내의 모든 부위의 인산화를 완전히 억제하지는 않는다는 관찰을 설명하는 것 같다 (도 4). 키나제 조절의 기계론적 이해는 수많은 키나제의 활성화 루프의 인산화에 대부분 초점을 맞추었다. 상기 실험은 활성화 루프 밖의 특정 잔기 상의 DLK 인산화가 하류 키나제를 요구하는 특징적 메카니즘의 증거를 제공한다. 이러한 잔기의 인산화는 DLK 활성에 영향을 미치지 않으면서 DLK의 안정성에 영향을 미친다.
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
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Glu Val Asp Ser Glu Val Glu Leu Pro Pro Ser 755 760 765 Gln Arg Trp Pro Gln Gly Pro Asn Met Arg Gln Ser Leu Ser Thr Phe 770 775 780 Ser Ser Glu Asn Pro Ser Asp Val Glu Glu Gly Thr Ala Ser Glu Pro 785 790 795 800 Ser Pro Ser Gly Thr Pro Glu Val Gly Ser Thr Asn Thr Asp Glu Arg 805 810 815 Pro Asp Glu Arg Ser Asp Asp Met Cys Ser Gln Gly Ser Glu Ile Pro 820 825 830 Leu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Val Val Pro Glu Arg Glu Ala Ser Ser 835 840 845 Leu Pro Met Gln His Gln Asp Gly Gln Gly Pro Asn Pro Glu Asp Ser 850 855 860 Asp Cys Asp Ser Thr Glu Leu Asp Asn Ser Asn Ser Ile Asp Ala Leu 865 870 875 880 Arg Pro Pro Ala Ser Leu Pro Pro 885 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ttggatgaag ccattagact a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 acctttaatg gacaacatta a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Claims (21)

  1. 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 감소시키거나 억제하고 DLK의 안정성을 감소시키는 작용제를 뉴런 또는 그의 부분에 투여하는 것을 포함하는, 뉴런에서 DLK 안정성을 감소시키는 방법.
  2. 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 감소시키거나 억제하는 작용제를 뉴런 또는 그의 부분에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인산화의 감소 또는 억제는 DLK 단백질 안정성을 감소시키는 것인, DLK의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 감소시키거나 억제하는 방법.
  3. 이중 류신 지퍼 키나제 (DLK)의 인산화를 감소시키거나 억제하는 작용제를 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 인산화의 감소 또는 억제는 DLK의 안정성을 감소시키는 것인, 환자에서 뉴런 변성을 억제하거나 방지하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 특정한 DLK 아미노산 잔기의 인산화를 감소시키거나 억제하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 특정한 DLK 아미노산 잔기가 서열 1 (인간)의 위치 43의 트레오닌 (T43); 서열 2 (마우스)의 위치 43의 트레오닌; 서열 1 (인간)의 위치 500의 세린 (S500); 서열 2 (마우스)의 위치 533의 세린 (S533); 및 다른 종으로부터의 DLK 또는 이소형에서의 등가의 잔기로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DLK의 인산화를 감소시키거나 억제하는 작용제가 항체, 소분자, 폴리펩티드 및 짧은 간섭 RNA (siRNA)로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 항체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 또는 그의 부분이 인간 대상체에 존재하거나, 신경 이식편 또는 신경 이식물에 존재하거나, 또는 생체외 또는 시험관내에 존재하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런이 소뇌 과립 뉴런, 후근 신경절 뉴런, 망막 신경절 세포 뉴런 및 피질 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, DLK 인산화의 감소 또는 억제가 DLK 키나제 활성에 영향을 미치지 않는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 JNK의 억제제인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, JNK의 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, JNK의 억제제가 JNK1; JNK2; JNK3; 및 JNK1, JNK2 및 JNK3의 임의의 조합으로부터 선택된 JNK를 억제하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, JNK의 억제제가 JNK 억제제 V, JNK 억제제 VII (TAT-TI-JIP153-163), JNK 억제제 VIII 및 siRNA로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨-플러스병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 설인 신경통, 벨 마비, 중증 근무력증, 근육 이영양증, 진행성 근육 위축, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 가성 연수 마비, 진행성 연수 마비, 척수성 근육 위축, 유전성 근육 위축, 추간판 증후군, 경부 척추증, 신경총 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 헌팅톤병, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 루이 소체 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환, 길랑-바레 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 프리온 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌병증, 픽병, 간질, 및 AIDS 치매 복합증, 만성 통증, 섬유근육통, 척추 통증, 손목 터널 증후군, 암으로 인한 통증, 관절염, 좌골신경통, 두통, 수술로 인한 통증, 근육 연축, 요통, 내장통, 손상으로 인한 통증, 치통, 신경통, 예컨대 신경성 또는 신경병증성 통증, 신경 염증 또는 손상, 대상포진, 추간판 탈출, 찢어진 인대, 및 당뇨병; 당뇨병, 암, AIDS, 간염, 신장 기능장애, 콜로라도 진드기열, 디프테리아, HIV 감염, 나병, 라임병, 결절성 다발동맥염, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 전신 홍반성 루푸스 또는 아밀로이드증에 의해 야기되는 말초 신경병증 또는 신경통; 독성 화합물, 중금속, 산업용 용매, 약물, 화학요법제, 답손, HIV 의약, 콜레스테롤 강하 약물, 심장 또는 혈압 의약, 또는 메트로니다졸에 대한 노출에 의해 야기되는 신경 손상; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상에 의해 야기되는 신경계에 대한 손상; 정신분열증, 망상 장애, 분열정동 장애, 정신분열형, 공유 정신병적 장애, 정신병, 편집성 인격 장애, 분열성 인격 장애, 경계성 인격 장애, 반사회적 인격 장애, 자기애성 인격 장애, 강박 장애, 섬망, 치매, 기분 장애, 양극성 장애, 우울증, 스트레스 장애, 공황 장애, 광장공포증, 사회 공포증, 외상후 스트레스 장애, 불안 장애, 및 충동 조절 장애; 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 습성 또는 건성 AMD와 연관된 광수용체 변성, 다른 망막 변성, 시신경 드루젠, 시신경병증, 및 시신경염으로부터 선택된 질환 또는 상태를 앓고 있는 것인 방법.
  17. (a) 인산화 형태의 DLK를 특이적으로 인식하는 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키고, (b) 생물학적 샘플 내에서의 인산화 형태의 DLK에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 항체에 의한 결합은 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 나타내는 것인, 뉴런에서 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 검출하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 인산화 형태의 DLK에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 대조군 대비 생물학적 샘플에서의 항체의 결합의 증가는 스트레스 의존성 또는 아폽토시스촉진 DLK 활성을 나타내는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 생물학적 샘플이 뉴런, 뉴런 세포 용해물 및 뉴런으로부터 정제된 DLK로부터 선택된 생물학적 물질을 포함하는 것인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 1 (인간)의 위치 43의 트레오닌 (T43); 서열 2 (마우스)의 위치 43의 트레오닌; 서열 1 (인간)의 위치 500의 세린 (S500); 서열 2 (마우스)의 위치 533의 세린 (S533); 및 다른 종으로부터의 DLK 또는 이소형에서의 등가의 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기에서 인산화된 DLK에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, DLK의 인산화가 뉴런 스트레스 또는 손상에 대해 반응하여 일어나는 것인 방법.
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