JP2016518310A - Ｄｌｋの安定性をモデュレートする方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ニューロンにおけるデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の安定性を減少させる方法、又はＤＬＫの特定のアミノ酸残基のリン酸化を減少させ若しくは阻害する方法であって、ＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害してＤＬＫの安定性を減少させる薬剤をニューロン又はその一部に投与することを含む方法、並びにデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）のリン酸化を阻害する薬剤を患者に投与することによって、患者における神経変性を阻害又は予防するための方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１３年２月２８日に出願された米国仮出願第６１／７７０９５９号（これは、出典明示によりその全体が本明細書に援用される）の利益を主張する。
本発明は、ＤＬＫのリン酸化の阻害を介してデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の安定性を減少させることによって、神経変性を予防する方法に関する。
神経接続を高めるための発達中に（Oppenheim, R.W. Annual review of neuroscience 14, 453-501 (1991); Luo, L. & O’Leary, D.D. Annual review of neuroscience 28, 127-156 (2005)）、明らかに損傷を受けた細胞に対する損傷後に（Quigley, H.A.ら Investigative ophthalmology & visual science 36, 774-786 (1995)）、並びに神経変性疾患、例えばパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びアルツハイマー病において（Vila, M. & Przedborski, S. Nature reviews. Neuroscience 4, 365-375 (2003)）、軸索変性及び神経細胞死が起こる。これらの場面で神経変性を誘発する要因は大きく異なるが、多くの神経変性の状況に共通すると思われる保存されたシグナル伝達事象は、軸索変性及び神経細胞アポトーシスを開始することが確認されている。この一例は、発生において（Ham, J.ら Neuron 14, 927-939 (1995); Kuan, C.Y.ら Neuron 22, 667-676 (1999); Southwell, D.G.ら Nature 491, 109-113 (2012); White, F.A., Keller-Peck, C.R., Knudson, C.M., Korsmeyer, S.J. & Snider, W.D. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 18, 1428-1439 (1998)）、及び神経変性疾患病状の一環として（Hunot, S.ら PNAS 101, 665-670 (2004); Martin, L.J. Journal of neuropathology and experimental neurology 58, 459-471 (1999); Vila, M.ら PNAS 98, 2837-2842 (2001); Yao, M., Nguyen, T.V. & Pike, C.J. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 25, 1149-1158 (2005)）、軸索変性及び神経細胞アポトーシスの活性化の際に、Ｂａｘ及びｃ−Ｊｕｎの上流で作用するＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）である。これらの各場面では、Ｂａｘ依存性カスパーゼの活性化は、ＪＮＫ活性化の下流におけるプログラム細胞死及び軸索変性を行うのに必要であると思われる（Simon, D.J.ら The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 32, 17540-17553 (2012); Pettmann, B. & Henderson, C.E. Neuron 20, 633-647 (1998); Gagliardini, V.ら Science 263, 826-828 (1994); Yuan, J. & Yankner, B.A. Nature 407, 802-809 (2000)）。
デュアルロイシンジッパーを有するキナーゼ（ＤＬＫ）は、混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）ファミリーの進化的に保存された高度にニューロン特異的なメンバーであり、ストレス誘導性ニューロンＪＮＫ活性化に必要である（Hirai, S.ら Gene expression patterns : GEP 5, 517-523 (2005); Ghosh, A.S.ら The Journal of cell biology 194, 751-764 (2011); Watkins, T.A.ら DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. In Press (2013); Chen, X.ら The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 28, 672-680 (2008)。哺乳動物におけるＤＬＫの消失は、発生中及び軸索損傷後のアポトーシス及び軸索変性を減衰するのに十分である（Ghosh, A.S.ら (2011); Watkins, T.A.ら In Press (2013); Chen, X.ら (2008); Miller, B.R.ら Nature neuroscience 12, 387-389 (2009)）。無脊椎動物では、Ｅ３ユビキチンリガーゼのＰＨＲファミリー（ＰＡＭ／ｈｉｇｈｗｉｒｅ／ＲＰＭ−１）はＤＬＫレベルを負にレギュレートしてシナプス発生を制御することを実証した一連の遺伝子スクリーニングによって、ＤＬＫの明確な機能が同定された（Collins, C.A., Wairkar, Y.P., Johnson, S.L. & DiAntonio, A. Neuron 51, 57-69 (2006); Nakata, K.ら Cell 120, 407-420 (2005)）。脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）ｆａｔ ｆａｃｅｔｓ（ｆａｆ）の過剰発現は、ｈｉｇｈｗｉｒｅ突然変異体に似たシナプス表現型をもたらすが、これは、ＦａｆがＰＨＲリガーゼに反作用して、ＤＬＫレベルを正にレギュレートし得ることを示唆している（Collins, C.A., Wairkar, Y.P., Johnson, S.L. & DiAntonio, A. (2006)）。ＤＬＫレベルがＰＨＲ依存的に迅速にアップレギュレートされるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、神経損傷後において、同様の機構がＤＬＫをレギュレートすると思われる（Xiong, X.ら The Journal of cell biology 191, 211-223 (2010)）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは、損傷後のＤＬＫ活性はまた、ＤＬＫの活性化をニューロンの損傷領域に限定するより短いＤＬＫアイソフォームとのヘテロ二量化を介してレギュレートされる（Yan, D. & Jin, Y. Neuron 76, 534-548 (2012)）。
無脊椎動物系における研究を通して得られた機構的知識にもかかわらず、哺乳動物ニューロンにおいてＤＬＫが同様にレギュレートされるかについてはあまり知られていない。Ｐｈｒ１（マウスＰＨＲユビキチンリガーゼ）の発現を欠くマウスは、脳全体におけるＤＬＫ存在量の肉眼的変化を示さず、ＤＬＫの消失は、Ｐｈｒ１突然変異体で観察される軸索経路探索障害を抑制することができない（Bloom, A.J., Miller, B.R., Sanes, J.R. & DiAntonio, A. Genes & development 21, 2593-2606 (2007)）。しかしながら、哺乳動物ニューロン損傷パラダイムにおけるユビキチン−プロテアソーム系によるＤＬＫレベルのレギュレーションは厳密に検討されていない。
ＤＬＫは、ニューロン損傷を感知し、変性及び再生の両方のシグナル伝達を誘発するＭＡＰ３Ｋである（Ghosh, A.S.ら (2011); Watkins, T.A.ら In Press (2013); Miller, B.R.ら (2009); Shin, J.E.ら Neuron 74, 1015-1022 (2012)）。極めて多種多様なニューロンストレスパラダイムにおいて、ＤＬＫの消失は、ＪＮＫ活性化及び下流応答を完全に抑制するのに十分であるが（Watkins, T.A.ら In Press (2013)、哺乳動物ニューロンにおいて、ニューロンストレスによってＤＬＫそれ自体がどのようにレギュレートされるかについては不明である。本明細書に記載される実施例では、哺乳動物ニューロンにおいて、（１）ＤＬＫ量は、ニューロンストレス応答の初期に急速に増加し、（２）ＤＬＫレベルは、タンパク質安定性をモデュレートするＤＬＫ内の多数の部位のリン酸化をＪＮＫ活性がレギュレートする正のフィードバックループによって制御され、（３）ＤＬＫレベルは、Ｐｈｒ１及びＵＳＰ９Ｘによってレギュレートされ、（４）ＤＬＫタンパク質の安定性の変化は、ＤＬＫシグナル伝達のストレス誘導性活性化とは無関係に起こり得、（５）ＤＬＫタンパク質量は、下流シグナル伝達の量を直接制御することを実証する。
本発明は、デュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）のリン酸化の阻害を介して、ＤＬＫの安定性をモデュレートする方法を提供する。本発明はまた、ＤＬＫのリン酸化を阻害する（特に、ＤＬＫの特定のアミノ酸残基のリン酸化を阻害する）薬剤の投与を介して、患者における神経変性を阻害又は予防する方法を提供する。
本発明は、様々な種類のニューロンストレス後において、ＤＬＫレベルが再現可能に増加するという観察結果に基づくものである。理論に縛られるものではないが、Ｐｈｒ１及びデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）ＵＳＰ９Ｘは、ニューロン中の多量のＤＬＫタンパク質を厳密にレギュレートするように機能するが、何れもＤＬＫ活性をレギュレートしない。ニューロン損傷依存性活性化後に、ＤＬＫが過リン酸化されて、ＤＬＫのキナーゼ活性をレギュレートするものとは異なるキナーゼドメインの外側の特異的なＪＮＫ依存性リン酸化事象を介してタンパク質安定性が増加する。したがって、ＤＬＫ経路の活性化は、ＤＬＫタンパク質のレベルを増加させるフィードバック機構を発生させ、今度はこれが、下流標的のリン酸化を増強し、段階的又は局所的なＤＬＫシグナル伝達をより完全な応答に変換して、ニューロンが損傷に適切に反応することが可能になる。
一実施態様では、本発明は、ニューロンにおけるデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の安定性を減少させるための方法であって、ＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害してＤＬＫの安定性を減少させる薬剤をニューロン又はその一部に投与することを含む方法を提供する。特定の実施態様では、薬剤は、特定のＤＬＫアミノ酸残基（一又は複数）のリン酸化を阻害し又は減少させる。
他の実施態様では、本発明は、デュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の特定のアミノ酸残基のリン酸化を阻害し又は減少させるための方法であって、ＤＬＫの特定のアミノ酸残基のリン酸化を阻害し又は減少させる薬剤をニューロン又はその一部に投与することを含み、前記リン酸化の阻害又は減少が、ＤＬＫタンパク質の安定性の減少をもたらす方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、患者における神経変性を阻害又は予防するための方法であって、デュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）のリン酸化を阻害し又は減少させる薬剤を患者に投与することを含み、前記リン酸化の阻害又は減少が、ＤＬＫの安定性を減少させる方法を提供する。特定の実施態様では、薬剤は、特定のＤＬＫアミノ酸残基（一又は複数）のリン酸化を阻害し又は減少させる。
他の実施態様では、本発明は、ニューロンにおけるストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を検出するための方法であって、（ａ）生物学的サンプルと、リン酸化型ＤＬＫを特異的に認識する抗体とを接触させること；及び（ｂ）前記生物学的サンプル中の前記リン酸化型ＤＬＫに対する前記抗体の結合を検出することを含み、前記抗体による結合がストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を示す方法を提供する。特定の実施態様では、前記方法は、前記リン酸化型ＤＬＫに対する前記抗体の結合を測定することをさらに含み、ここで、前記生物学的サンプル中の前記抗体の結合がコントロールと比べて増加していることが、ニューロンにおけるストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性の指標である。他の実施態様では、生物学的サンプルは、ニューロン、神経細胞溶解物、及びニューロンから精製されたＤＬＫから選択される生物学的材料を含む。
特定の実施態様では、本発明の方法に使用するための薬剤は、特定のＤＬＫアミノ酸残基、例えば配列番号１（ヒトＤＬＫ）の４３位のトレオニン（Ｔ４３）；配列番号２（マウスＤＬＫ）の４３位のトレオニン；配列番号１（ヒトＤＬＫ）の５００位のセリン（Ｓ５００）；配列番号２（マウスＤＬＫ）の５３３位のセリン（Ｓ５３３）又はそれらの任意の組み合わせのリン酸化を阻害し又は減少させる。さらなる実施態様では、本発明の方法に使用するための薬剤は、他の種由来のＤＬＫ又はアイソフォームにおける配列番号１（ヒトＤＬＫ）の４３位のトレオニン（Ｔ４３）；配列番号２（マウスＤＬＫ）の４３位のトレオニン；配列番号１（ヒトＤＬＫ）の５００位のセリン（Ｓ５００）；配列番号２（マウスＤＬＫ）の５３３位のセリン（Ｓ５３３）と同等の残基及びそれらの任意の組み合わせである特定のアミノ酸残基のリン酸化を阻害する。
他の実施態様では、本発明の方法に使用するための薬剤は、抗体、小分子、ポリペプチド及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）から選択される。特定の実施態様では、薬剤は抗体である。特定の実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ’）２断片から選択される。
さらなる実施態様では、本発明の方法に使用するための薬剤は、ニューロン又はその一部に投与される。特定の実施態様では、ニューロン又はその一部は、ヒト被験体、神経移植片若しくは神経移植物、又はエクスビボ若しくはインビトロに存在する。
さらなる実施態様では、本発明の方法に使用するための薬剤はＪＮＫ阻害剤であり、及び／又は前記方法は、ＪＮＫ阻害剤であるさらなる薬剤を投与することをさらに含む。特定の実施態様では、ＪＮＫ阻害剤は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３又はＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３の任意の組み合わせを阻害する。特定の実施態様では、本発明の方法に使用するためのＪＮＫ阻害剤は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３；又はＪＮＫ１及びＪＮＫ２；又はＪＮＫ１及びＪＮＫ３；又はＪＮＫ２及びＪＮＫ３を阻害する。特定の実施態様では、ＪＮＫ阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤Ｖ、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩ（ＴＡＴ−ＴＩ−ＪＩＰ１５３−１６３）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ、及びＪＮＫポリペプチドの発現を阻害するｓｉＲＮＡから選択される。
さらなる実施態様では、治療される患者は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、ポルフィリン症、ハンチントン病、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、レビー小体認知症、前頭側頭認知症、脱髄疾患、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・ツース病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、牛海綿状脳症、ピック病、癲癇、ＡＩＤＳ認知症複合、慢性疼痛、線維筋痛、脊椎痛、手根管症候群、癌からの疼痛、関節炎、坐骨神経痛、頭痛、手術からの疼痛、筋痙攣、背痛、内臓痛、損傷からの疼痛、歯痛、神経痛、例えば、神経原性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は損傷、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病、糖尿病、癌、ＡＩＤＳ、肝炎、腎機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、ＨＩＶ感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス又はアミロイドーシスによって引き起こされる末梢神経障害及び神経痛、毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬物、化学療法剤、ダプソン、ＨＩＶ薬、コレステロール低下薬、心圧若しくは血圧の薬又はメトロニダゾールへの曝露によって引き起こされる神経損傷、物理的、機械的又は化学的外傷によって引き起こされる神経系への損傷、統合失調症、妄想性障害、分裂情動障害、統合失調症様障害、共有精神病性障害、精神病、妄想性人格障害、統合失調質人格障害、境界性人格障害、反社会的人格障害、自己愛性人格障害、強迫性障害、譫妄、認知症、気分障害、双極性障害、鬱病、ストレス障害、パニック障害、広場恐怖症、社会恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害、緑内障、格子状ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型又は乾燥型ＡＭＤに伴う光受容体の変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視神経症並びに視神経炎から選択される疾患又は症状を患っている。
インビトロ及びインビボの両方のストレスパラダイムにおける、ニューロンストレスに応じたＤＬＫタンパク質レベル及び分子量の増加。（ａ）神経増殖因子（ＮＧＦ）の存在下で胚性後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを５日間培養し、次いで、４回の別個の試験でＮＧＦを３時間欠乏させた。それに応じて、ＤＬＫ量が増加し、この増加はＤＬＫの上方への移動度シフトを伴う。ｃＪｕｎリン酸化（ｐ−ｃＪｕｎ）は、ＤＬＫの活性化の下流の結果として起こる。（ｂ）視神経を挫滅した網膜、及びその非挫滅対側コントロールを手術の３日後に採取した。挫滅網膜におけるＤＬＫレベル及び分子量は、網膜神経挫滅の３日後まで増加している。（ｃ）網膜、挫滅部位、近位神経及び遠位神経の位置を示す網膜神経挫滅モデルのダイアグラム。（ｄ）挫滅神経内では、近位神経のＤＬＫのみが、神経挫滅後の網膜全体で観察された分子量及び量のストレス依存性増加を受けている。所定の遺伝子型のマウスに対して神経挫滅を実施し、２４時間後に神経を採取した。ＷＴ：Ｃ５７ＢＬ／６．Ｃｒｅ−：ＤＬＫｌｏｘ／ＤＬＫｌｏｘ；Ｃｒｅ−．Ｃｒｅ＋：ＤＬＫｌｏｘ／ＤＬＫｌｏｘ；Ｃｒｅ＋。近位神経では、挫滅（赤色矢印）後に移動度シフトを観察することができる。＊：ＤＬＫについてブロッティングした神経溶解物で観察されたバックグラウンドバンド。（ｅ）（ａ）に示されている−ＮＧＦサンプル対＋ＮＧＦサンプル及び（ｂ）に示されている挫滅サンプル対非挫滅サンプルにおけるＤＬＫタンパク質量の平均比。各ストレスパラダイムでは、ＩｍａｇｅＬａｂでＤＬＫの量を測定し、アクチンローディングコントロールに対して正規化した。ＮＧＦ離脱サンプルでは、−ＮＧＦ及び＋ＮＧＦにおけるＤＬＫの比を各隣接条件セットに用いた。網膜神経挫滅では、挫滅眼及び非挫滅眼におけるＤＬＫ量の比を４匹の各マウスに用いた。ＴＦ離脱：平均＝２．１２±０．１２７。神経挫滅：平均＝１．４９７±０．１５７。＊Ｐ＝０．０２（マンホイットニーＵ検定によって平均を１と比較）。（ｆ）＋ＮＧＦサンプル及び−ＮＧＦサンプルにおけるＤＬＫの平均分子量（ＭＷ）。ＤＬＫの分子量を既知の分子量標準セットのものと比較する分子量分析ツールを使用してＩｍａｇｅ Ｌａｂで、分子量を計算した。＋ＮＧＦ：平均＝１１５．１±．７７２３．−ＮＧＦ：平均＝１２０．０±．８０５０。＊Ｐ＝０．０３（マンホイットニーＵ検定による）。（ｇ）−ＮＧＦ条件及び＋ＮＧＦ条件では、ＤＲＧ溶解物のラムダプロテインホスファターゼ（λｐｐ）処理は、ＤＬＫの分子量を均一にする。すべてのエラーバーは、平均の標準誤差である。 胚の感覚ニューロンでは、ＤＬＫタンパク質は、栄養因子離脱に応じて安定化される。（ａ）−ＮＧＦ培養条件対＋ＮＧＦ培養条件（青色のバー）又は３組のマウス由来の挫滅網膜対非挫滅網膜（黒色のバー）におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるＤＬＫ転写産物の相対量の測定。エラーバーは、３回の技術的反復に基づく標準偏差である。−ＮＧＦ対＋ＮＧＦ：１．０３６±０．０２３４。マウス１：０．９９５±．０３１５。マウス２：０．９７０±．０４６２。マウス３：０９８９±０．０４０。（ｂ）５μＭシクロヘキシミドの存在下における、栄養因子離脱及び＋ＮＧＦコントロールの８時間の経時変化。（ｃ）（ｂ）で実施した実験の３回反復試験の定量。各時点におけるバンドをアクチンローディングコントロールに対して定量し、各時点における平均バンド強度を計算し、ｔ＝０における強度で割った。時間０における量と比較した、所定時点で残っているＤＬＫの相対量がプロットされている。エラーバーは、標準偏差である。GraphPad Prismソフトウェアにおいて、各経時変化を直線に対してフィッティングした。ＡＮＣＯＶＡによって２本の直線の傾きを比較した場合、＊Ｐ＝０．０１０９。（ｄ）所定条件によってＤＲＧを３時間処理し、溶解した。ＯＡ：２００ｎＭオカダ酸。ＭＧ１３２を３０μＭで使用した。 ユビキチン−プロテアソーム系は、ＤＬＫレベルをストレス依存的にレギュレートする。（ａ）ＤＬＫのユビキチン化は、栄養因子離脱によって低減される。ＮＧＦ欠乏及びコントロールＤＲＧを採取し、処理の３時間後に溶解した。溶解物からユビキチン化タンパク質を免疫沈降し、免疫沈降物をＤＬＫ及びユビキチンについてブロッティングした。マウスＩｇＧコントロールをネガティブコントロールとして使用して、抗体特異性を実証した。（ｂ）ＵＳＰ９Ｘ ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ Ｃｒｅ−及びＣｒｅ＋胚ＤＲＧにおけるＮＧＦ離脱後の、ＤＬＫ、ＵＳＰ９Ｘ、ｐ−ｃＪｕｎ、及びチューブリンのウエスタンブロット。（ｃ）（ｂ）に示されているＤＬＫ及びＵＳＰ９Ｘのブロットの定量。＋ＮＧＦ条件及び−ＮＧＦ条件では、ＵＳＰ９Ｘの〜９５％の消失（左パネル）は、ＤＬＫレベルの全体的な減少をもたらすが、ＤＬＫの相対レベルを変化させない（右パネル−Ｃｒｅ＋の変化倍率をＣｒｅ−のものと比較）。（ｄ）Ｐｈｒ１ｍａｇ機能喪失型突然変異体では、Ｐｈｒ１ＷＴと比較して、＋ＮＧＦ条件におけるＤＬＫタンパク質レベルが上昇している。この増加にもかかわらず、Ｐｈｒ１ｍａｇ突然変異体では、ｐ−ｃＪｕｎの下流活性化が影響を受けていない。（ｅ）（ｄ）に示されているＤＬＫブロットをＴｕｊローディングコントロールに対して正規化した定量。（ｆ）ユビキチン化タンパク質の免疫沈降は、Ｐｈｒ１ｍａｇ／ｍａｇホモ接合体では、ユビキチン化されているＤＬＫが、ＰｈｒＷＴ／ｍａｇヘテロ接合体コントロールよりも少ないことを示している。左パネル：抗ユビキチン（「Ｕｂ」）による免疫沈降と、それに続くＤＬＫのブロッティング。マウスＩｇＧによる免疫沈降を抗体特異性のコントロールとして使用した。括弧：Ｐｈｒ１ｍａｇヘテロ接合体及びホモ接合体間で見られる主な差異を強調している：ノックアウトにおけるポリユビキチン化ＤＬＫの欠如。右パネル：ＤＬＫ及びチューブリンのインプット溶解物のブロット。より多くのＤＬＫがインプット中に存在していたという事実にもかかわらず、抗ユビキチン抗体によってプルダウンされたＤＬＫは少なかった。 ＤＬＫの安定化は、ＤＬＫ活性及びＤＬＫの下流標的に依存する。（ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションは、キナーゼ失活型ＤＬＫ（Ｓ３０２Ａ）が野生型ＤＬＫよりも低いレベルで発現していることを示す。ＵＳＰ９Ｘによるコトランスフェクションは、この効果をレスキューする。（ｂ）ｍｙｃエピトープをＮ末端にタグ付したドミナントネガティブＤＬＫロイシンジッパードメイン構築物（ｍｙｃ−ＤＬＫ−ＬＺ）でＤＬＫをコトランスフェクションすると、ＧＦＰ発現構築物によるコトランスフェクションと比較して、ＤＬＫ発現が減少する。（ｃ）ｄｏｘ誘導性ＤＬＫ発現構築物を含む安定細胞において、２つの異なるＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫ８及びＪＮＫ７。両方とも１０μＭ）でＪＮＫ活性を阻害すると、ＤＬＫ発現が減少する。（ｄ）ＪＮＫ２ ＫＯバックグラウンドにおけるＪＮＫ３のノックダウンは、胚ＤＲＧにおけるＮＧＦ離脱で観察されたＤＬＫ量の増加を阻止する。（ｅ）同腹子コントロール由来の挫滅網膜で見られる高分子型（矢印）によってアッセイしたところ、神経挫滅の１８時間後において、ＪＮＫ２／３ダブルノックアウト網膜は、活性化ＤＬＫを有していない。 そのリン酸化状態がＤＬＫ又はＪＮＫ活性によってモデュレートされるマウスＤＬＫにおけるリン酸化部位の同定。（ａ）質量分析に使用した重ＳＩＬＡＣ条件及び軽ＳＩＬＡＣ条件における２９３Ｔ細胞中のＤＬＫの発現。発現後、Ｆｌａｇタグ付ＤＬＫを免疫沈降（ＩＰ）し、ＤＬＫにおけるリン酸化部位のレシオメトリック分析のために、所定条件のＩＰを組み合わせた。ＷＴ ＤＬＫ：野生型ＤＬＫ。ＤＬＫＳ３０２Ａ：キナーゼ死点突然変異体。ＣＡ−ＪＮＫ：構成的に活性なＪＮＫ構築物（方法を参照のこと）。ＪＮＫｉ：ＪＮＫ阻害剤８、１０μＭ。ＯＡ：オカダ酸、２００ｎＭ。（ｂ）ＤＬＫドメイン及び認められたリン酸化部位の位置の概略図。番号付けは、マウスＤＬＫに基づいている：Ｎ末端：ＤＬＫのＮ末端ドメイン。キナーゼドメイン：触媒ＤＬＫドメイン。ＬＺ：ロイシンジッパーモチーフ。Ｃ末端：Ｃ末端ドメイン。参考文献Holzman, L.B., Merritt, S.E. & Fan, G. The Journal of biological chemistry 269, 30808-30817 (1994)にしたがって、ドメインをアレンジしている。（ｃ）同定されたリン酸化部位の変化の概要。条件全体にわたって、又はＳ２９５−Ｔ３０６の場合に最大の効果及び一貫性を示したと記載されている部位は、キナーゼの活性化ループ内の公知の部位である。∞：条件Ａではこの部位のリン酸化が観察されたが、条件Ｂでは観察されなかった。Ｎ／Ａ：何れの条件においても、この部位のリン酸化は観察されなかった。示されている数字は、条件Ａ対条件Ｂのこの部位のリン酸化の変化倍率であり、上矢印又は下矢印は、変化の方向を表す（例えば、最上段右側の枠について、ＤＬＫを発現するオカダ酸処理細胞では、ＤＬＫを発現する非オカダ酸処理細胞よりも、Ｔ４３のリン酸化が７．７８倍超ある）。＊：この部位は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）とそれに続いてプロリンを含有する。ＭＡＰＫリン酸化部位の大部分において、隣接プロリンが見られる。「ＪＮＫ仮説に一致？」という表題のカラムは、ＪＮＫによるこの部位のリン酸化が起こってＤＬＫの安定化に関与するという仮説と、４つの条件全体のリン酸化のパターンが一致するかをまとめたものである。チェックマーク：リン酸化のパターンは、この仮説と一致する。〜：リン酸化のパターンは、この仮説と部分的に一致する。Ｘ：リン酸化のパターンは、この仮説と一致しない。Ｓ６４３の場合、１０．３のＡｓｃｏｒｅは、先行するセリンを支持する（〜９０％の信頼度）。Ａｓｃｏｒｅｓが１３未満のリン酸化部位は、一般的に、位置決定が曖昧であると考えられるが、Ｓ６４３は、４つの連続するセリンの最後であり、プロリンの直ぐ隣に位置するため、本発明者らは、Ｓ６４２ではなくこの部位でリン酸化が起こると結論している。最後の行（Ｓ２９５−Ｔ３０６）について、２つのリン酸化残基がこのペプチド上で検出されたが、部位を決定するイオンが不十分であるため、単一の二重改変配列を明確に割り当てることができない。可能な順列の数を考慮すると、いくつかの多リン酸化ペプチド配列が存在する可能性がある。この理由のために、この二重改変配列のデータを、部位ごとに具体的に示すのではなく集合で示す。 同定部位は、ニューロンストレス後にリン酸化される。（ａ）野生型ＤＬＫ（ＤＬＫＷＴ）及び所定のリン酸化不完全点突然変異体を一過性に発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の溶解物のウエスタンブロット。ｐ−Ｔ４３、ｐ−Ｓ２７２、ｐ−Ｓ５３３：これらの各部位に対するリン酸化特異的抗体によるブロット。（ｂ）ＤＬＫＴ４３及びＤＬＫＳ５３３は、ＪＮＫにより直接リン酸化され得る。精製ＪＮＫ３の有（右レーン）無（左レーン）の下で精製ＤＬＫＳ３０２Ａをインキュベートし、示されているリン酸化特異的抗体でブロッティングした。（ｃ）栄養因子欠乏感覚ニューロン由来の溶解物のウエスタンブロットにより、−ＮＧＦ条件で現れる抗リン酸化Ｔ４３免疫応答性が示された。ラムダプロテインホスファターゼによる処理は、リン酸化タンパク質に対する抗体の特異性を実証する。（ｄ）ＤＬＫ ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ Ｃｒｅ−及びＣｒｅ＋胚由来の栄養因子欠乏ＤＲＧのブロッティングは、抗ｐ−Ｔ４３抗体がＤＬＫ特異的であることを示す。（ｅ）挫滅網膜溶解物及び非挫滅コントロール由来のＤＬＫの免疫沈降と、それに続くリン酸化Ｔ４３及びリン酸化Ｓ５３３特異的抗体によるブロッティングは、これらの部位が視神経挫滅後にリン酸化されることを示す。左パネル：視神経挫滅によるＤＬＫレベル及びリン酸化（見掛けの分子量シフト）の増加を示す免疫沈降に対するインプット。右パネル：抗ＤＬＫ又はコントロールウサギＩｇＧによる挫滅溶解物又は非挫滅コントロールの免疫沈降と、それに続く所定の抗体によるブロッティング。 ＤＬＫは、下流のアポトーシス促進性シグナル伝達を用量依存的にモデュレートする。（ａ）ＤＬＫ＋／＋（ＷＴ）及びＤＬＫ＋／−（ｈｅｔ）ＤＲＧにおける栄養因子離脱の経時変化は、ヘテロ接合性ニューロンにおけるＤＬＫタンパク質レベルの減少が、ＪＮＫ及びｃＪｕｎの下流活性化の減少をもたらすことを明らかにする。（ｂ、ｄ）ＤＬＫ＋／＋及びＤＬＫ＋／−マウスにおける神経挫滅網膜の染色、及び（ｃ、ｅ、ｆ）示されている染色の定量。（ｂ、ｃ）挫滅６時間後のｐ−ｃＪｕｎ。示されている定量は、網膜当たりのｐ−ｃＪｕｎ陽性細胞の平均数である。＊Ｐ＝０．００１４（スチューデントのｔ検定による）。ＷＴの平均＝２２９１±２９９。ｈｅｔの平均＝６８９±９７．６。ｎ＝７（ＷＴ動物）及び５（ｈｅｔ動物）。（ｄ）挫滅３日後のカスパーゼ−３及びＢｒｎ３染色。（ｅ）網膜当たりのカスパーゼ−３陽性細胞の平均数の定量。＊Ｐ＝０．０００１（スチューデントのｔ検定による）。ＷＴの平均＝８２３±３６。ｈｅｔの平均＝７９±２０。ｎ＝４（ＷＴ動物）及び３（ｈｅｔ動物）。（ｆ）挫滅網膜対非挫滅網膜における網膜当たりのＢｒｎ３陽性細胞の比の定量。＊Ｐ＝．０２５３（スチューデントのｔ検定による）。ＷＴの平均＝０．２７±０．０８６。ｈｅｔの平均＝０．５６±０．０１７。エラーバーは、平均の標準誤差である。ｎ＝５（ＷＴ動物）及び４（ｈｅｔ動物）。スケールバー＝１００μｍ。 ニューロンストレスによるＤＬＫゲル移動度シフトの観察。（ａ）ＡＡＶ−Ｃｒｅウイルスを注射した野生型（ＷＴ）及びＤＬＫｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ（ｌｏｘｐ）マウス由来の３日間挫滅した網膜の溶解物のブロット。野生型網膜では、ダブレット型でＤＬＫゲル移動度シフトが見られるが（赤色矢印）、ｌｏｘｐマウスではこれは観察されない。ｌｏｘｐマウスは、網膜神経節細胞に組換えＤｌｋのみを有するので、これは、網膜神経挫滅で現れる上のバンド（赤色矢印）が、特異的に網膜神経節細胞におけるＤＬＫのリン酸化によるものであることを示す。（ｂ）２つの異なるランニング緩衝液によるＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＤＬＫ移動度の差異。ＭＯＰＳ緩衝液：緩衝液としてＭＯＰＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥランニング溶液。ＭＥＳ緩衝液：緩衝液としてＭＥＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥランニング溶液。 ＵＳＰ９Ｘ活性は、栄養因子離脱により変化しない。＋ＮＧＦ処理ＤＲＧ及び−ＮＧＦ処理ＤＲＧとＨＡタグ付ユビキチンビニルスルホン（これは、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の活性部位に共有結合する）とのインキュベーションは、栄養因子離脱によるＵＳＰ９Ｘ活性の変化を示さない。ＤＵＢを阻害するＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）をネガティブコントロールとして使用する。 Ｐｈｒ１ ＫＯニューロンにおけるＮＧＦ離脱後の感覚ニューロン軸索の変性の経時変化には差異がない。野生型又はＰｈｒ１ノックアウト同腹胚由来の胚ＤＲＧを培養し、インビトロで３日後にＮＧＦを欠乏させた。１８時間後、チューブリン染色により可視化されるように、両方の培養物は等しく変性した。 視神経挫滅後の網膜における細胞生存率、インタクトな軸索構造及びニューロンストレスシグナル伝達の活性化のマーカーの特性決定。（ａ）非挫滅野生型コントロールと比較した、挫滅の２週間後におけるＢｒｎ３、γ−シヌクレイン、及びニューロフィラメント−Ｍ（ＮＦ−Ｍ）の染色。（ｂ）手術の２４時間後における野生型及びＤＬＫヘテロ接合性網膜におけるｐ−ｃＪｕｎ染色。この時点では、野生型とヘテロ接合性網膜との間でｐ−ｃＪｕｎ染色の有意差は観察されない。 網膜溶解物サンプルの全ＪＮＫ、ＪＮＫ２、及びＪＮＫ３のブロット。ＪＮＫ２／３ダブルノックアウトでは、免疫応答性の消失が見られる。
Ｉ．定義
特に断らない限り、本明細書で使用される「デュアルロイシンジッパーキナーゼ」又は「ＤＬＫ」という用語は、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＤＬＫを指す。この用語は、プロセシングされていない「全長」ＤＬＫだけではなく、細胞内プロセシングから生じる任意の形態のＤＬＫ（ＤＬＫプレｍＲＮＡによってコードされる様々なポリペプチドのアイソフォーム、天然に存在するＤＬＫ変異体（例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体）及び当技術分野で公知の翻訳後修飾プロセシング型ＤＬＫを含む）も包含する。このようなＤＬＫ変異体の一例には、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１２８５２−２）が含まれる。ＤＬＫは、「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ１２」、「ＭＡＰ３Ｋ１２」、「デュアルロイシンジッパーを有するキナーゼ」、「ロイシンジッパータンパク質キナーゼ」（ＺＰＫ）、及び「ＭＡＰＫ上流キナーゼ」（ＭＵＫ）という名称によっても公知である。ヒトＤＬＫは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１２８５２に記載されているように８５９アミノ酸長であり、出典明示により本明細書に援用される。ヒトＤＬＫの例示的なアミノ酸配列は、以下の通りである：
MACLHETRTPSPSFGGFVSTLSEASMRKLDPDTSDCTPEKDLTPTHVLQL HEQDAGGPGGAAGSPESRASRVRADEVRLQCQSGSGFLEGLFGCLRPVWT MIGKAYSTEHKQQQEDLWEVPFEEILDLQWVGSGAQGAVFLGRFHGEEVAVKKVRDLKETDIKHLRKLKHPNIITFKGVCTQAPCYCILMEFCAQGQLYE VLRAGRPVTPSLLVDWSMGIAGGMNYLHLHKIIHRDLKSP NMLITYDDVV KISDFGTSKELSDKSTKMSFAGTVAWMAPEVIRNEPVSEKVDIWSFGVVLWELLTGEIPYKDVDSSAIIWGVGSNSLHLPVPSSCPDGFKILLRQCWNSK PRNRPSFRQILLHLDIASADVLSTPQETYFKSQAEWREEVKLHFEKIKSEGTCLHRLEEELVMRRREELRHALDIREHYERKLERANNLYMELNALMLQLELKERELLRREQALERRCPGLLKPHPSRGLLHGNTMEKLIKKRNVPQKLS PHSKRPDILKTESLLPKLDAALSGVGLPGCPKGPPSPGRSRRGKTRHRKASAKGSCGDLPGLRTAVPPHEPGGPGSPGGLGGGPSAWEACPPALRGLHHDLLLRKMSSSSPDLLSAALGSRGRGATGGAGDPGSPPPARGDTPPSEGSAPGSTSPDSPGGAKGEPPPPVGPGEGVGLLGTGREGTSGRGGSRAGSQHLTPAALLYRAAVTRSQKRGISSEEEEGEVDSEVELTSSQRWPQSLNMRQSLSTFSSENPSDGEEGTASEPSPSGTPEVGSTNTDERPDERSDDMCSQGSEIPLDPPPSEVIPGPEPSSLPIPHQELLRERGPPNSEDSDCDSTELDNSNSVDALRPPASLPP（配列番号１）。
マウスＤＬＫは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ６０７００に記載されているように８８８アミノ酸長であり、出典明示により本明細書に援用される。マウスＤＬＫの例示的なアミノ酸配列は、以下の通りである：
MACLHETRTPSPSFGGFVSTLSEASMRKLDPDTSDCTPEKDLTPTQCVLRDVVPLGGQGGGGPSPSPGGEPPPEPFANSVLQLHEQDTGGPGGATGSPESRASRVRADEVRLQCQSGSGFLEGLFGCLRPVWTMIGKAYSTEHKQQQEDLWEVPFEEILDLQWVGSGAQGAVFLGRFHGEEVAVKKVRDLKETDIKHLRKLKHPNIITFKGVCTQAPCYCILMEFCAQGQLYEVLRAGRPVTPSLLVDWSMGIAGGMNYLHLHKIIHRDLKSPNMLITYDDVVKISDFGTSKELSDKSTKMSFAGTVAWMAPEVIRNEPVSEKVDIWSFGVVLWELLTGEIPYKDVDSSAIIWGVGSNSLHLPVPSSCPDGFKILLRQCWNSKPRNRPSFRQILLHLDIASADVLSTPQETYFKSQAEWREEVKLHFEKIKSEGTCLHRLEEELVMRRREELRHALDIREHYERKLERANNLYMELNALMLQLELKERELLRREQALERRCPGLLKSHPSRGLLHGNTMEKLIKKRNVPQKLSPHSKRPDILKTESLLPKLDAALSGVGLPGCPKGPPSPGRSRRGKTRHRKASAKGSCGDLPGLRAALPPHEPGGLGSPGGLGVGPSAWDACPPALRGLHHDLLLRKMSSSSPDLLSAALGARGRGATG GARDPGSPPPPQGDTPPSEGSAPGSTSPDSPGGAKGEPPPPVGPGEGVGLLGTGREGTAGRGGNRAGSQHLTPAALLYRAAVTRSQKRGISSEEEEGEVDSEVELPPSQRWPQGPNMRQSLSTFSSENPSDVEEGTASEPSPSGTPEVGSTNTDERPDERSDDMCSQGSEIPLDLPTSEVVPEREASSLPMQHQDGQGPNPEDSDCDSTELDNSNSIDALRPPASLPP（配列番号２）。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻止する抗体を指し、反対に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、前記抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻止する。例示的な競合アッセイは、本明細書に提供される。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
薬剤（例えば、医薬製剤）の「有効量」は、必要な投与量及び時間で、所望の治療的又は予防的結果を達成するために有効な量を指す。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部又は実質的に全部が非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全部又は実質的に全部がヒト抗体のものに対応する少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「個体」又は「患者」又は「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は患者又は被験体はヒトである。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様では、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定した場合に、抗体は、９５％超又は９９％の純度まで精製される。抗体純度の評価方法の総説については、例えば、Flatmanら, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得る変異体抗体を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。例えば、天然に存在する突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物を作製する間に発生するこのような変異体は通常、少量で存在する。様々な決定基（エピトープ）を対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、何れかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用するためのモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書において説明される。
「添付文書」という用語は、治療的製品の市販用包装商品に習慣的に含まれる、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、及び／又はそのような治療的製品の使用に関する警告についての情報を含む取り扱い説明書を指すのに使用される。
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態で存在し、その製剤が投与されると思われる被験体に対して許容されないほど毒性である追加成分を含まない、調製物を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、被験体にとって非毒性である、医薬製剤中の有効成分以外の成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存剤が含まれる。
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的変形、例えば「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床的病状の過程の何れかに実施され得る。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的転帰の低減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、又は疾患の進行を遅くするために使用される。
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、遺伝子発現を干渉する小さい二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子をサイレンシングさせる工程であるＲＮＡ干渉のメディエーターである。ｓｉＲＮＡは典型的に、二本鎖を形成するおよそ１５−２５長のヌクレオチドの２つの一本鎖ＲＮＡを含み、一本鎖オーバーハング（一又は複数）を含み得る。酵素複合体、例えばポリメラーゼによる二本鎖ＲＮＡのプロセシングにより、二本鎖ＲＮＡの切断が生じ、ｓｉＲＮＡが生成される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）サイレンシング複合体に用いられ、ｍＲＮＡ切断が導かれ、これによってｍＲＮＡ分解が促される。例えば哺乳動物細胞において特定の遺伝子をｓｉＲＮＡを使用してサイレンシングさせるために、塩基対領域を、無関係なｍＲＮＡに偶然に相補性を持たないように選択する。例えばFireら, Nature 391:806-81 (1998)及びMcManusら, Nat. Rev. Genet. 3(10):737-747 (2002)にあるように、ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、当技術分野において同定されている。
「干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）」という用語は、本明細書では、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらすので、特定の遺伝子の発現を阻害／低減するのに使用され得る二本鎖ＲＮＡを指すのに使用される。
本明細書で使用される「軸索変性を予防する」、「ニューロン変性を予防する」、「神経変性を予防する」、「神経変性を阻害する」、「軸索変性を阻害する」又は「ニューロン変性を阻害する」という語句には、（ｉ）新規に神経変性疾患若しくは障害を有すると診断された患者又は新たに神経変性疾患若しくは障害を発症するリスクにある患者の軸索又はニューロンの変性を阻害する又は予防する能力、及び（ｉｉ）神経変性疾患若しくは障害を既に患っている患者又は神経変性疾患若しくは障害の症状を有する患者のさらなる軸索又はニューロンの変性を阻害する又は予防する能力が含まれる。軸索又はニューロンの変性の予防には軸索又はニューロンの変性の低減又は阻害が含まれ、これはニューロン又は軸索変性の完全又は一部の予防によって特性決定され得る。これは、例えば神経機能の分析によって評価することができる。また、上に列挙した用語はインビトロ及びエクスビボの方法も含む。さらに、「ニューロン変性を予防する」及び「ニューロン変性を阻害する」という語句には、ニューロン全体、又はニューロン細胞質体、軸索及び樹状突起といった一部に関する阻害が含まれる。本明細書に記載される１つ以上の薬剤の投与により、本明細書に記載される１つ以上の薬剤を摂取していないコントロール被験体又は集団と比較して、被験体又は集団において、神経系の障害；神経系以外に主な効果を有する治療、症状又は疾患に続発する神経系の症状；物理的、機械的又は化学的外傷によって引き起こされる神経系に対する損傷、疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は精神的障害（例えば振戦、運動の遅鈍、運動失調、バランスの喪失、抑鬱、認識機能の低減、短期記憶喪失、長期持続記憶喪失、錯乱、性格の変化、言語障害、感覚の知覚の喪失、触覚に対する感度、四肢の麻痺、筋肉虚弱、筋肉麻痺、筋痙攣、筋れん縮、食習慣の著しい変化、過剰な恐れ又は心配、不眠症、妄想、幻覚、疲労、背痛、胸の疼痛、消化障害、頭痛、迅速な心拍数、めまい、霧視、視力の不安又は領域喪失、変視症、色覚障害、明るい光への曝露後の視覚の機能回復の低減、及び視覚のコントラスト感度の喪失）の１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９）の症状の、少なくとも１０％の減少（例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらに１００％の減少）が生じ得る。本明細書に記載される１つ以上の薬剤の投与により、本明細書に記載される１つ以上の薬剤を投与していない被験体又はニューロン集団において変性するニューロン（又は、ニューロン体、軸索又はその樹状突起）の数と比較して、被験体又はニューロン集団において変性するニューロン（又は、ニューロン体、軸索又はその樹状突起）の数の少なくとも１０％の減少（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の減少）が生じ得る。本明細書に記載される１つ以上の薬剤の投与により、本明細書に記載される１つ以上の薬剤にて治療していないコントロール被験体又は集団と比較して、被験体又は被験体集団において、神経系の障害；神経系以外に主な効果を有する治療、症状又は疾患に続発する神経系の症状；物理的、機械的又は化学的外傷によって引き起こされる神経系に対する損傷、疼痛；眼関連神経変性；記憶喪失；又は精神的障害を発症する可能性の、少なくとも１０％の減少（例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はさらに１００％の減少）が生じ得る。
本明細書で使用される「投与する」という用語は、本明細書に記載される薬剤とニューロン又はその一部とを接触させることを指す。これには、ニューロン又はその一部が存在する被験体への薬剤の投与、並びにニューロン又はその一部が培養されている培地への薬剤の導入が含まれる。
本明細書で使用される「ニューロン」という用語は、中央の細胞質体又は細胞体を含む神経系細胞、及び２種類の伸長又は突起、つまり、大多数の神経系シグナルを通常細胞体に運搬する樹状突起、及び、大多数の神経系シグナルを通常細胞体から標的ニューロン又は筋といったエフェクター細胞に運搬する軸索を意味する。ニューロンは、組織及び臓器から中枢神経系（求心性又は感覚ニューロン）へ情報を伝達し、中枢神経系からエフェクター細胞（遠心性又は運動ニューロン）へシグナルを伝えることができる。介在ニューロンと称する他のニューロンは、中枢神経系（脳及び脊柱）内でニューロンを連結する。本発明による治療に供され得るニューロンの種類の特定の具体例には、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、網膜神経節細胞、網膜視神経及び皮質ニューロンが含まれる。
１つ以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与には、同時（並列）及び何れかの順序での逐次投与が含まれる。
本明細書で使用される「ニューロンストレス」という用語は、限定されないが、疾患、傷害、虚血、興奮毒性、軸索離断、ＵＶ照射、サイトカイン刺激、セラミド曝露、又は神経増殖因子の欠如などの、ニューロンに対するストレスの適用を意味する。ニューロンストレスは、ニューロンにおけるアポトーシスシグナル伝達カスケードの活性化によるものを含む、神経変性及び細胞死をもたらし得る。
本明細書で使用される「ストレス依存性ＤＬＫ活性」という用語は、ニューロンストレスに応じたＤＬＫの活性化を意味する。
本明細書で使用される「アポトーシス促進性ＤＬＫ活性」という用語は、ニューロンにおけるアポトーシスシグナル伝達カスケードを支持又は誘導するＤＬＫの活性化を意味する。
ＩＩ．方法
一態様では、本発明は、ＤＬＫが、ニューロンにおけるストレス又は損傷に応じてリン酸化されるという発見に一部基づいている。損傷ニューロン又はストレスを受けたニューロンでは、ＤＬＫのリン酸化の増加は、ＤＬＫの安定化及びＤＬＫタンパク質レベルの増加をもたらす。ＤＬＫの特定のアミノ酸残基は、ニューロンストレス又は損傷に応じてリン酸化され、これが、ＤＬＫの安定性の増加に、並びに最終的には、軸索変性及びニューロンアポトーシスに必要なＤＬＫのストレス依存性又はアポトーシス促進性活性に重要である。
したがって、本発明は、ＤＬＫのリン酸化を阻害し又は減少させる薬剤を使用してＤＬＫの安定性を減少させることによって、神経変性を予防又は阻害する方法を含む。さらに、本発明は、ＤＬＫの特定のアミノ酸残基のリン酸化を阻害し又は減少させて、ＤＬＫの安定性を減少させる方法を含む。他の態様では、本発明は、ニューロンにおけるＤＬＫの安定性を減少させるための方法であって、ＤＬＫのリン酸化を阻害し又は減少させる薬剤（特定の場合には、ＤＬＫの特定のアミノ酸残基のリン酸化を阻害する薬剤）をニューロン又はその一部に投与することを含み、前記リン酸化の減少が、ＤＬＫの安定性の減少をもたらす方法を含む。
本発明はまた、ニューロンにおけるストレス依存性又はアポトーシス促進性活性を検出するための方法であって、生物学的サンプルと、リン酸化型ＤＬＫを特異的に認識する抗体とを接触させること、及び前記リン酸化型ＤＬＫに対する前記抗体の結合を検出することを含み、前記リン酸化型ＤＬＫに対する前記抗体の結合がストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を示すか又はその指標である方法を含む。
本発明の方法に使用されるニューロン又はその一部には、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、皮質ニューロン、交感神経ニューロン、網膜神経節細胞、網膜視神経及び海馬ニューロンからなる群より選択されるニューロンが含まれる。
本発明の方法に使用される薬剤には、ＤＬＫのリン酸化阻害剤が含まれる。さらに、本発明の方法に使用するための薬剤は、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ポリヌクレオチド、アプタマー、小分子及び多糖からなる群より選択される。抗体の場合、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は抗体断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２断片）から選択される。
本発明の方法に使用するためのさらなる薬剤には、ＤＬＫをリン酸化するタンパク質、例えばＪＮＫの阻害剤が含まれる。非限定的な例には、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及び／又はＪＮＫ３の阻害剤が含まれる。さらなる例には、ＪＮＫ１及びＪＮＫ２；ＪＮＫ１及びＪＮＫ３；ＪＮＫ１及びＪＮＫ３；ＪＮＫ２及びＪＮＫ３；及びＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３の阻害剤が含まれる。このようなＪＮＫ阻害剤には、限定されないが、ＪＮＫ阻害剤Ｖ、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩ（ＴＡＴ−ＴＩ−ＪＩＰ１５３−１６３）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ、ＳＣ−２０２６７３、ＳＹ−ＣＣ−４０１、ＳＰ６００１２５、ＡＳ６０１２４５及びＸＧ−１０２、並びにＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのカタログ番号４２０１１９、４２０１３０、４２０１３１、４２０１２３、４２０１１６、４２０１１８、４２０１３６、４２０１２９、４２０１３５、４２０１３４、４２０１３３、４２０１４０及び４２０１２８、並びにＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３又はそれらの任意の組み合わせの発現を阻害するｓｉＲＮＡが含まれる。例えば、様々なＪＮＫをターゲティングするｓｉＲＮＡ配列は、ＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＡＣＴＡ（配列番号３））のＪＮＫ１配列、ＡＣＣＴＴＴＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡＡ（配列番号４）又はＡＡＧＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＡ（配列番号５））のＪＮＫ２配列、及びＣＣＣＧＣＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＴＴＣＡＡ（配列番号６））のＪＮＫ３配列を含む。
特定の実施態様では、本発明の方法におけるニューロン又はその一部は、ヒト被験体などの被験体に存在する。被験体は、例えば、（ｉ）神経系の障害、（ｉｉ）神経系以外に主な効果を有する疾患、症状又は治療に続発する神経系の症状、（ｉｉｉ）物理的、機械的又は化学的外傷に起因する神経系の損傷、（ｉｖ）疼痛、（ｖ）眼関連神経変性、（ｖｉ）記憶喪失、及び（ｖｉｉ）精神障害からなる群より選択される疾患若しくは症状を発症しているか、又は前記疾患若しくは症状を発症するリスクを有する。
神経系の障害の例には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、大脳皮膚基底核変性症、レビー小体認知症、前頭側頭認知症、脱髄疾患、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・ツース病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、牛海綿状脳症、ピック病、癲癇及びＡＩＤＳ認知症複合が含まれる。
疼痛の例には、慢性疼痛、線維筋症、脊椎痛、毛根管症候群、癌からの疼痛、関節炎、坐骨神経痛、頭痛、手術からの疼痛、筋痙攣、背痛、内臓痛、損傷からの疼痛、歯痛、神経痛、例えば神経原性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は障害、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病が含まれる。
疾患、症状、又は神経系以外に主な効果を有する治療に続発する神経系の症状の例には、糖尿病、癌、ＡＩＤＳ、肝炎、腎機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、ＨＩＶ感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス及びアミロイドーシスによって引き起こされる末梢神経障害又は神経痛が含まれる。
物理的、機械的又は化学的外傷によって引き起こされる神経系の損傷の例には、毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬物、化学療法剤、ダプソン、ＨＩＶ薬、コレステロール低下薬、心圧又は血圧の薬及びメトロニダゾールへの曝露によって引き起こされる神経損傷が含まれる。さらなる例には、熱傷、傷、手術、事故、虚血、冷温への長期曝露、脳卒中、頭蓋内出血、及び脳溢血が含まれる。
精神障害の例には、統合失調症、妄想性障害、分裂情動障害、統合失調症様障害、共有精神病性障害、精神病、妄想性人格障害、統合失調質人格障害、境界性人格障害、反社会性人格障害、自己愛性人格障害、強迫性障害、譫妄、認知症、気分障害、双極性障害、鬱病、ストレス障害、パニック障害、広場恐怖症、社会恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害が含まれる。
眼関連神経変性の例には、緑内障、格子状ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型又は乾燥型ＡＭＤに伴う光受容体の変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視神経症及び視神経炎が含まれる。緑内障の例には、原発性緑内障、低眼圧緑内障、原発性閉寒隅角緑内障、急性閉寒隅角緑内障、慢性閉寒隅角緑内障、間欠性閉寒隅角緑内障、慢性開放隅角閉鎖緑内障、色素性緑内障、剥離緑内障、発育緑内障、二次的緑内障、水晶体性緑内障、眼内出血に続発する緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、薬物誘発性緑内障、中毒性緑内障、及び眼内腫瘍、網膜剥離、眼の重症化学的熱傷及び虹彩萎縮と関係する緑内障が含まれる。
特定の実施態様では、本発明の方法による、ニューロン又はその一部の薬剤との接触は、薬剤を含む薬学的組成物を被験体に投与することを含む。投与は、例えば、静脈内注入；静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、若しくは病巣内の経路による注入；又は、局所的又は眼の適用により行われる。さらに、本発明の方法は、１つ以上の他の薬学的薬剤を被験体に投与することを含む。
他の例では、本発明の方法によって治療されるニューロン又はその一部は、エクスビボ又はインビトロにある（例えば神経移植片又は神経移植物）。
本発明はまた、ニューロン又はその一部の変性を阻害するのに使用するための薬剤を同定する方法を含む。これらの方法は、軸索又はニューロンの変性のアッセイにおいて候補薬剤（例えば抗神経増殖因子（ＮＧＦ）抗体、血清欠乏／ＫＣｌ減少、網膜視神経挫滅及び／又はロテノン治療）とニューロン又はその一部を接触させることを伴う。候補薬剤の存在下におけるニューロン又はその一部の変性がコントロールと比べて低減していることは、ニューロン又はその一部の変性を阻害するのに使用するための薬剤の同定を示す。候補薬剤は、例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチボディ、核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ポリヌクレオチド、アプタマー、小分子及び多糖からなる群より選択される。
Ａ．本発明の方法に使用するための薬剤を同定及び特性決定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、ＤＬＫのストレス誘導性又はニューロン損傷誘導性リン酸化が、ＤＬＫの安定性及び最終的にはアポトーシス促進性ＤＬＫ活性をもたらすという発見に一部基づいている。
本発明は、本明細書に記載されるように、ＤＬＫのリン酸化を阻害し又は減少させる薬剤を使用することによって、ニューロン又は軸索変性を阻害及び／又は予防する方法を含む。本明細書に記載されるように、前記方法は、例えば、神経障害又は神経系損傷の治療ではインビボで行われる。前記方法は、例えば、ニューロン機能の実験室研究及び神経移植片又は移植物の治療では、インビトロ又はエクスビボで行われる。
本発明の方法に使用するための薬剤は、本明細書に記載されている。本発明に使用するためのさらなる薬剤は、下記標準的なスクリーニング方法を使用して同定され得る。
本明細書に記載される薬剤に加えて、本発明の方法に使用するためのさらなる薬剤であって、ＤＬＫのリン酸化を阻害し又は減少させて神経変性を阻害又は予防する薬剤は、以下のアッセイ又はアッセイの組み合わせを使用してスクリーニングされ得る。リードアウトがＤＬＫのリン酸化又はニューロン若しくは軸索の変性の阻害である下記アッセイに加えて、本発明はまた、特定のリン酸化型ＤＬＫに単に結合するか、又はこれを検出する検出剤を対象とするアッセイを用いる。したがって、本発明は、特定のリン酸化型ＤＬＫと結合するか、又はこれと複合体形成する化合物を同定するスクリーニングアッセイの使用を含む。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離され得るか、又は反応混合物中で検出され得る。特定の実施態様では、標的ポリペプチド又は薬剤候補の何れかが、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に、固体表面をポリペプチドの溶液でコーティングし乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべき標的ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、検出可能な標識によって標識され得る非固定化成分を、固定化成分、例えば、固着成分を含むコーティング表面などに添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有する場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
さらに、候補薬剤のタンパク質キナーゼの活性への影響を測定するためのアッセイは当技術分野で公知であり、一般的に放射性標識されたリン酸塩により読み取られる直接リン酸化アッセイ、基質に対するリン酸化特異的抗体、及びキナーゼ活性、例えばリポーター遺伝子の活性化の下流の結果を測定する細胞ベースのアッセイが含まれる。蛍光偏光法に基づく代替アッセイに加えて、これらの主要な方策は何れも、小規模又はハイスループットの形式で用い、阻害剤を同定、確認又は特性決定してよい（例としてFavataら, J. Biol. Chem. 273:18623-18632, 1998; Parkerら, J. Biomol. Screening 5:77-99, 2000; Singhら, Comb. Chem. High Throughput Screen 8:319-325, 2005; Gartonら, Meth. Enz. 439:491-500, 2008;及びKupchkoら, Anal. Biochem. 317:210-217, 2003を参照のこと）。
本明細書において具体的に述べるスクリーニングアッセイは例示目的に過ぎない。薬剤（例えば、抗体、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド小有機分子、核酸分子など）の種類及び特定の標的に応じて選択され得る様々な他のアッセイが当業者に周知であり、本発明に用いられ得る。
また、本明細書に記載されるアッセイを使用して、限定されないが、化学ライブラリー、天然の生成物ライブラリー（例えば、微生物、動物、植物などの集積）、及びランダムペプチド、オリゴヌクレオチド又は小有機分子を含む組み合わせライブラリーなどの化合物のライブラリーをスクリーニングしてもよい。特定の実施態様では、本明細書中のアッセイを使用して、限定されないが、ナイーブヒト抗体、組換え抗体、合成抗体及び半合成抗体のライブラリーをスクリーニングする。抗体ライブラリーは、例えば、ファージ粒子当たり平均１の単鎖抗体又は抗体断片をディスプレイする一価ライブラリー、及びウイルス粒子当たり平均２以上の抗体又は抗体断片をディスプレイする多価ライブラリーを含むファージディスプレイライブラリーであり得る。しかしながら、本発明によってスクリーニングされる抗体ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーに限らない。他のディスプレイ技術には、例えば、リボソーム又はｍＲＮＡディスプレイ（Mattheakisら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9022-9026, 1994; Hanesら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942, 1997）、微生物細胞ディスプレイ（例えば細菌ディスプレイ（Georgiouら, Nature Biotech. 15:29-34, 1997）又は酵母細胞ディスプレイ（Kiekeら, Protein Eng. 10:1303-1310, 1997）、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ（Urbanら, Nucleic Acids Res. 33:e35, 2005）、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ（Odegripら, Proc. Acad. Natl. Sci. U.S.A. 101:2806-2810, 2004; Reiersenら, Nucleic Acids Res. 33:e10, 2005）、及びミクロビーズディスプレイ（Seppら, FEBS Lett. 532:455-458, 2002）が含まれる。
上記アッセイにおいて得られた結果は、ニューロン及び／又は軸索変性のインビトロ及び／又はインビボのアッセイにおいて確認され得る。あるいは、ニューロン及び／又は軸索変性のインビトロ及び／又はインビボのアッセイを、本明細書に記載される阻害剤及びアンタゴニストを同定するために一次アッセイとして使用してもよい。
ｉ）ニューロン又は軸索変性の細胞ベースのインビトロアッセイ
薬剤がＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害すると確認された後、本明細書に記載されるニューロン又は軸索変性モデルにおいて、及び適切な動物モデル系において、阻害剤を試験し得る。
ＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害して、ニューロン又は軸索変性を阻害するさらなる薬剤であって、本発明の方法に使用され得る薬剤を同定及び特性決定するための例示的なアッセイを以下のように簡単に説明する。
ＤＬＫのリン酸化を低減又は阻害する薬剤がニューロン又は軸索変性も阻害することを確認するため、並びに本発明の方法に使用するための他の薬剤を同定するためのアッセイは、以降の実施例に詳述しており、以下の通りに簡単に要約する。これらのアッセイには、（ｉ）抗神経増殖因子（抗ＮＧＦ）抗体アッセイ、（ｉｉ）血清欠乏／塩化カリウム（ＫＣｌ）減少アッセイ、（ｉｉｉ）ロテノン変性アッセイ、（ｉｖ）網膜視神経挫滅及び（ｉｖ）ビンクリスチン変性アッセイが含まれる。また、当技術分野で公知であるニューロン又は軸索変性を評価するためのさらなるアッセイが本発明で使用されてよい。
ＮＧＦは、標的ニューロンの分化及び生存に関与する小さい、分泌タンパク質である。ＮＧＦにて培養したニューロンを処理すると軸索が増殖するのに対して、抗ＮＧＦ抗体にて該ニューロンを処理すると軸索変性が生じる。また、抗ＮＧＦ抗体にてニューロンを処理すると、電子顕微鏡によって検出可能であるいくつかの異なる形態学的変化が生じ、これはモニタリングして候補阻害剤の効果を観察することができる。これらの変化には、静脈瘤形成、伸長したミトコンドリアの喪失、静脈瘤におけるミトコンドリアの蓄積、細胞骨格分解、及び軸索断片化が含まれる。抗ＮＧＦ抗体によって誘導される何れかの形態学的変化を無効にすることが見出されている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補阻害剤とみなすことができ、これは所望により、本明細書に記載されるもののようなさらなる系において試験してもよい。さらに、実施例１に記載されているように、例えば図１−３に示されているように、ＮＧＦ離脱は、ＤＬＫタンパク質の増加をもたらす。したがって、ＤＬＫタンパク質の増加を防止することが見出されている薬剤は、本発明の方法に使用するための候補薬剤と考えられ得る。
血清欠乏／ＫＣｌ低減アッセイは、マウス（例えばＰ７マウス）脳から単離した小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の培養物の使用に基づく。このアッセイにおいて、ニューロンは、ＫＣｌを含む培地中で培養され、より少ないＫＣｌを含む培地（５ｍＭ ＫＣｌを含む基礎培地イーグル）に交換し、ニューロン変性を誘導する。例えばニューロンマーカー（例えば抗クラスＩＩＩβ−チューブリン）にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出され得る、ＫＣｌ離脱によるニューロン変性を阻止又は低減することが見出されている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補阻害剤とみなすことができ、これは所望により本明細書に記載されるもののようなさらなる系において試験されてよい。
ニューロン又は軸索変性の他のモデルは、ロテノン(２Ｒ,６ａＳ,１２ａＳ)-１,２,６,６ａ,１２,１２ａ-ヘキサヒドロ-２-イソプロペニル-８,９-ジメトキシクロメノ[３,４-ｂ]フロ(２,３-ｈ)クロメン-６-オン)と培養したニューロンとの接触を含む。この物質はいくつかの植物の根及び幹に天然に生じる農薬及び殺虫剤であり、ミトコンドリアの電子伝達に干渉し、ラットに投与した場合にパーキンソン病様の症状を引き起こす。例えばニューロン特異的βＩＩＩチューブリンに対する抗体にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出され得る、ロテノンの存在下で培養したニューロンの変性を阻止又は低減することが見出されている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補阻害剤とみなすことができ、これは所望により本明細書に記載されるもののようなさらなる系において試験されてよい。
ニューロン又は軸索変性のさらなるモデルは、ビンクリスチンと培養したニューロンとの接触を含む。ビンクリスチンは、チューブリン二量体に結合して、微小管構造の集積を妨げるアルカロイドである。例えばニューロン特異的βＩＩＩチューブリンに対する抗体にて染色した固定ニューロンの画像を分析することによって検出され得る、ビンクリスチンの存在下で培養したニューロンの変性を阻止又は低減することが見出されている薬剤を、ニューロン又は軸索変性の候補阻害剤とみなすことができ、これは所望により本明細書に記載されるもののようなさらなる系において試験されてよい。
ニューロン又は軸索変性の網膜視神経挫滅モデルは実施例にさらに記載されるが、Quigley, H.A.ら Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Investigative ophthalmology & visual science 36, 774-786 (1995)及びGhosh, A.S.ら DLK induces developmental neuronal degeneration via selective regulation of proapoptotic JNK activity. The Journal of cell biology 194, 751-764 (2011)（これらは両方とも、出典明示により本明細書に援用される）にも記載されている。
ｉｉ）ニューロン又は軸索変性の動物モデル
本発明に使用するためのインビボアッセイには、様々な神経変性疾患の動物モデル、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病及び多発性硬化症（例えばマウスの実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ））の動物モデルが含まれる。さらに、脊髄及び外傷脳損傷モデルが用いられてもよい。本発明に使用するための薬剤を特性決定するのに使用され得るインビボアッセイの非限定的な例を、以下の通りに記述する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合、突然変異型スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を発現するトランスジェニックマウスがＡＬＳの表現型及び病理学を反復する（Rosenら, Nature 362(6415):59-62, 1993）。ＳＯＤ１マウスに加え、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のいくつかのマウスモデルが開発され、本発明で用いられ得る。これらは、運動ニューロン変性（Ｍｎｄ）、進行性運動神経障害（ｐｍｎ）、ゆらぎ（Birdら, Acta Neuropathologica 19(1):39-50, 1971）、及び、ＴＤＰ−４３突然変異体トランスジェニックマウス（Wegorzewskaら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., e-published on Oct. 15, 2009）を含む。さらに、イヌモデルが開発され、本発明に用いられ得る（遺伝性イヌ脊髄性筋萎縮症（ＨＣＳＭＡ））。
本発明の方法に使用するための阻害剤を特性決定するのに使用され得る、パーキンソン病の病因、組織学、生化学及び臨床的特徴を擬態する動物モデルには、レセルピン（ウサギ；Carlssonら, Nature 180:1200, 1957）；メタンフェタミン（齧歯目及び非ヒト霊長類；Seidenら, Drug Alcohol Depend 1:215-219, 1975）；６−ＯＨＤＡ（ラット；Pereseら, Brain Res. 494:285-293, 1989）；ＭＰＴＰ（マウス及び非ヒト霊長類；Langstonら, Ann. Neurol. 46:598-605, 1999）；パラコート／マネブ（マウス；Brooksら, Brain Res. 823:1-10, 1999及びTakahashiら, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 66:167-170, 1989）；ロテノン（ラット；Betarbetら, Nat. Neurosci. 3:1301-1306, 2000）；３−ニトロチロシン（マウス；Mihmら, J. Neurosci. 21:RC149, 2001）；及び、突然変異α−シヌクレイン（マウス及びショウジョウバエ；Polymeropoulosら, Science 276:2045-2047, 1997）モデルが含まれる。
マウス、ハエ、魚及び虫を含む遺伝的に変更された動物は、アルツハイマー病に隠れる病原機構を調べるために用いられている。例えば、β−アミロイドについてのトランスジェニックマウスはアルツハイマー病と一致した記憶障害を発達させる（Gotzら, Mol. Psychiatry. 9:664-683, 2004）。これらのようなモデルが、本発明に使用するための薬剤を特性決定するのに使用するための薬剤を特性決定するのに使用され得る。
当技術分野では、マウス、ラット、スナネズミ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ及びサルを含むいくつかの動物モデルが、脳卒中を調べるために用いられる。局所性の脳虚血モデルのほとんどは、中大脳動脈のようなある主要な脳血管の閉塞を伴う（例としてGarcia, Stroke 15:5-14, 1984及びBoseら, Brain Res. 311:385-391, 1984を参照のこと）。これらの何れのモデルも本発明に使用されてよい。
Ｂ．抗体薬剤の作製
ＤＬＫのリン酸化を防止し又は減少させる抗体；特定のリン酸化型ＤＬＫに結合する抗体；並びに本発明の結合及び活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えＤＮＡ技術の技術を含む公知の方法によって製造され得る。
１．抗原調製
他の分子に任意選択的にコンジュゲートした可溶性抗原又はその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。例示的な配列は実施例に記載されており、本発明で使用するための抗体の作製のための抗原の調製に使用することができる。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当技術分野の技術者に明らかであろう。
２．ポリクローナル抗体
典型的には、ポリクローナル抗体は、関連する抗原及びアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）注射又は腹腔内（ｉｐ）注射することによって、動物において産生させる。二官能性物質又は誘導体化物質、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１ＮＣＮＲ（Ｒ及びＲ１が異なるアルキル基である）を用いて、免疫化しようとする種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又はダイズトリプシン阻害剤に、関連する抗原を結合させることが有用である場合がある。
例えば、１００μｇ又は５μｇのタンパク質又は結合体（それぞれ、ウサギ又はマウスに対する）を３倍体積量の完全フロイントアジュバントと混合し、その溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性結合体、又は免疫原性誘導体に対する免疫性を動物に与える。１カ月後、完全フロイントアジュバントに溶かした最初の量の１／５−１／１０のペプチド又は結合体を複数の部位に皮下注射することによって、動物に追加免疫する。７−１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価を検査する。力価が頭うちになるまで、動物に追加免疫する。同じ抗原の、ただし異なるタンパク質に結合されているか、及び／又は異なる架橋試薬によって結合されている結合体を用いて、動物に追加免疫し得る。また、結合体は、組換え細胞培養によってタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強する。
３．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature 256:495, 1975によって最初に説明されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）によって作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えば、ハムスター若しくはマカクサルを本明細書において前述したようにして免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、インビトロでリンパ球を免疫化してもよい。次いで、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986）。
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有し得る適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
例示的な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性であるものである。これらのうちで、使用について検討され得る特定の骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、並びにAmerican Type Culture Collection, Manassas, Va., USAから入手可能なＳＰ−２細胞又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製のために記載されている（Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の作製に関して分析する。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又はインビトロ結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈処置によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986）によって増殖させてよい。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させてよい。
従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を培地、腹水、又は血清から適切に分離する。
従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。単離した後、ＤＮＡを発現ベクター（その後、宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は免疫グロブリンタンパク質をさもなければ産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる）中に配置して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を実現することができる。抗体の組換え作製及びライブラリーからの抗体の単離は、下記により詳細に説明する。
４．抗体断片モノクローナル抗体
特定の実施態様では、本明細書の方法に使用するための抗体は、抗体断片である。抗体断片には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに後述する他の断片が含まれる。いくつかの抗体断片の総説については、Hudsonら Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと。また、国際公開第９３／１６１８５号並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長くなっているＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディとは、二価又は二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudsonら, Nat. Med. 9:129-134 (2003);及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまた、Hudsonら, Nat. Med. 9:129-134 (2003)にも記載されている。
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部分又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部分を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照のこと）。
抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解消化並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による作製を非限定的に含む様々な技術によって作製することができる。
５．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施態様では、本明細書の方法に使用するための抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。１つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
特定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させる。通常、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部分も任意選択的に含む。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復させるか、又は向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来元である抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において概説されており、例えば、Riechmannら, Nature 332:323-329 (1988); Queenら, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Kashmiriら, Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを説明）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を説明）；Dall’Acquaら, Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャッフリング」を説明）；並びにOsbournら, Methods 36:61-68 (2005)及びKlimkaら, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを説明）にさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法（例えば、Simsら J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照のこと）を用いて選択されたフレームワーク領域；特定のサブグループの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carterら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPrestaら J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞性突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）並びにＦＲライブラリーをスクリーニングして得られたフレームワーク領域（例えば、Bacaら, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosokら, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照のこと）が含まれる。
６．ヒト抗体
特定の実施態様では、本明細書の方法に使用するための抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に一般的に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、調製することができる。典型的には、このような動物は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部分を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいて、通常、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を説明する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を説明する米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明する米国特許第７０４１８７０号、並びにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明する米国特許出願第２００７／００６１９００号も参照のこと。このような動物によって産生されるインタクト抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と結合させることによって、さらに改変することができる。
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株は記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoernerら, J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照のこと）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製したヒト抗体が、Liら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の作製を説明）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを説明）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと結合させてよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を後述する。
７．ライブラリー由来の抗体
本発明の方法に使用するための抗体は、所望の活性（一又は複数）を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Hoogenboomら in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brienら, 編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)において概説されており、例えば、McCaffertyら, Nature 348:552-554; Clacksonら, Nature 352: 624-628 (1991); Marksら, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, 編, Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhuら, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Leeら, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLeeら, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)にさらに記載されている。
いくつかのファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子のレパートリー及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいて無作為に組換え、次いで、Winterら, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているようにして、抗原結合ファージについてそれらをスクリーニングすることができる。典型的には、ファージは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffithsら, EMBO J, 12: 725-734 (1993)によって記載されているように、未処置のレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、まったく免疫化せずに、広範な非自己抗原及びまた自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することもできる。最後に、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報には、例えば、米国特許第５７５０３７３号、並びに米国特許公報第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
８．多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書の方法に使用するための抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性のうちの１つは、ＤＬＫ、リン酸化ＤＬＫ又は特定のリン酸化型ＤＬＫに対するものであり、他は、他の任意の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＤＬＫの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTrauneckerら, EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照のこと）及び「ノブインホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照のこと）が含まれる。また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電気的操縦（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びBrennanら, Science, 229: 81 (1985)を参照のこと）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを用いること（例えば、Kostelnyら, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること（例えば、Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照のこと）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いること（例えば、Gruberら, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと）；並びに例えばTuttら J. Immunol. 147: 60 (1991)で記載されているようにして、三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願第２００６／００２５５７６号を参照のこと）。
また、本明細書の方法に使用するための抗体又は断片には、ＤＬＫ、リン酸化ＤＬＫ又は特定のリン酸化型ＤＬＫ並びに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」が含まれる（例えば、米国特許出願第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
９．組換え方法及び組成物
例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して、抗体を生産し得る。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされないときには、抗体を細菌において産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照のこと（大腸菌における抗体断片の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254も参照のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分にある細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。
原核生物に加えて糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターに適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体が産生される菌類及び酵母株を含む（Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)及びLiら, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照のこと）。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞はまた多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に使用することができる、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞をトランスフェクトするために使用することができる、非常に多くのバキュロウイルス株が特定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について説明している）を参照のこと。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（２９３又は、例えば、Grahamら, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載されている２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにミエローマ細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０が含まれる。抗体産生に適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照のこと。
Ｃ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書で提供される薬剤の何れかは、生物学的サンプル中のリン酸化ＤＬＫ又は特定のリン酸化型ＤＬＫの存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的サンプルは、細胞又は組織、例えばニューロン又はその一部を含む。
一実施態様では、診断又は検出の方法に使用するための薬剤が提供される。さらなる態様では、生物学的サンプル中のリン酸化ＤＬＫ及び／又は特定のリン酸化型ＤＬＫ（例えば、ヒト又はマウスＤＬＫ配列（それぞれ配列番号１及び２）の４３位のトレオニン；ヒトＤＬＫ配列（配列番号１）の５００位のセリン及びマウスＤＬＫ配列（配列番号２）の５３３位のセリン；及びそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸残基においてリン酸化されたＤＬＫ）の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、前記方法は、生物学的サンプルと、本明細書に記載されるリン酸化型ＤＬＫを特異的に認識する抗体とを、前記抗体が前記リン酸化型ＤＬＫに結合するのを許容する条件下で接触させること；及び前記抗体と前記リン酸化型ＤＬＫとの間で複合体が形成されるかを検出することを含む。このような方法は、インビトロ又はインビボ方法であり得る。抗体は、ストレス依存性及び／若しくはアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を有するニューロンを選択するために、並びに／又はストレス依存性及び／若しくはアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を検出するために使用される。
特定の実施態様では、本発明の方法に使用するための標識抗体が提供される。標識には、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光性標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）、並びに例えば酵素反応又は分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、蛍光体、例えば、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、（過酸化水素を使用して色素前駆体を酸化する酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼと併用される）糖酸化酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環系酸化酵素（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、並びに安定なフリーラジカルなどが含まれる。
Ｄ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される薬剤の何れかは、治療方法に使用され得る。
特定の実施態様では、本発明は、神経変性疾患、症状又は障害を有する個体を治療する方法であって、有効量の薬剤を前記個体に投与することを含む方法に使用するための薬剤を提供する。このような一実施態様では、前記方法は、例えば、下記のように、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、神経変性の阻害又は予防に使用するための薬剤を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体における神経変性を阻害又は予防する方法であって、有効量の薬剤を前記個体に投与して、ＤＬＫのリン酸化を阻害し又は減少させて、それにより、ＤＬＫタンパク質の安定性を減少させることを含む方法に使用するための薬剤を提供する。上記実施態様の何れかの「個体」は、好ましくはヒトである。
本発明の方法に使用するための薬剤（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、並びに局所的治療のために望ましいならば、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投与は、投与が短時間であるか又は長期的であるかにある程度応じて、任意の適切な経路によって、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によって行うことができる。限定されないが、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、本明細書において企図される。
本発明の方法に使用するための薬剤は、優良医療規範と一致する様式で製剤化、投薬及び投与される。この状況で考慮すべき要因には、治療される個々の障害、治療される個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医療担当者に公知である他の要因が含まれる。抗体は、そうする必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するのに現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記の他の要因に依存する。通常、これらは、本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、若しくは本明細書に記載される投与量の約１−９９％で、又は適切であると実験的に／臨床的に判定される任意の投与量及び任意の経路で、使用される。
薬剤標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施態様は、血液脳関門を横断する薬剤を提供する。特定の神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増大に関連しており、これにより薬剤（例えば抗体又は抗原結合断片）を脳に容易に導入できる。血液脳関門が完全に保持されているとき、そこに分子を輸送するためのいくつかの従来技術に公知の手法が存在し、それらには、限定されないが、物理的方法、脂質に基づく方法、及び受容体とチャネルに基づく方法が含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片などの薬剤を輸送する物理的方法には、限定されないが、血液脳関門を完全に回避すること、又は血液脳関門に開口部を形成することが含まれる。回避方法には、限定されないが、脳への直接注入（例えば、Papanastassiouら, Gene Therapy 9:398-406, 2002）、間質性注入／対流強化送達（例えば、Boboら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2076-2080, 1994を参照のこと）、及び脳への送達装置の移植（例えば、Gillら, Nature Med. 9:589-595, 2003;及びGliadel Wafers.TM., Guildford Pharmaceuticalを参照のこと）が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定されないが、超音波（例えば、米国特許出願第２００２／００３８０８６号を参照のこと）、浸透圧（例えば、高浸透圧性マンニトールの投与による（Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Volumes 1 and 2, Plenum Press, N.Y., 1989））、例えば、ブラジキニン又はパーミアライザーＡ−７による透過性化（例えば、米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号を参照のこと）、及び抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入（例えば、米国特許出願第２００３／００８３２９９号）が含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片などの薬剤を輸送する脂質に基づく方法には、限定されないが、血液脳関門の血液内皮上の受容体に結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体又は抗原結合断片を封入すること（例えば、米国特許出願第２００２／００２５３１３号を参照のこと）、及び低密度リポプロテイン粒子（例えば、米国特許出願第２００４／０２０４３５４号を参照のこと）、又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願第２００４／０１３１６９２号を参照のこと）中の抗体又は抗原結合断片をコーティングすることが含まれる。
血液脳関門に抗体又は抗原結合断片を輸送する受容体及びチャネルに基づく方法には、限定されないが、グリココルチコイド遮断薬を使用して血液脳関門の透過性を増大させること（例えば、米国特許出願第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号を参照のこと）、カリウムチャネルを活性化させること（例えば、米国特許出願第２００５／００８９４７３号を参照のこと）、ＡＢＣ薬の輸送を抑制すること（例えば、米国特許出願第２００３／００７３７１３号を参照のこと）、抗体をトランスフェリンでコーティングし、１つ以上のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願第２００３／０１２９１８６号を参照のこと）、及び抗体のカチオン化（例えば、米国特許第５００４６９７号を参照のこと）が含まれる。
疾患を予防又は治療する際、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、又は１つ以上の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療しようとする疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、その抗体が予防目的で投与されるのか又は治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床歴、及び抗体に対する応答、並びに主治医の判断に依存する。抗体は、１回で、又は一連の治療の間、患者に適宜投与される。疾患の種類及び重症度によって、約１μｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための最初の候補投与量であることができ、例えば、１回以上の個別投与によるか持続輸注によるかを問わない。１つの典型的な１日投与量は、前述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ以上に及び得る。数日間又はそれより長い期間にわたる反復投与の場合、症状に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、通常、治療は継続される。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ−約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）という１つ以上の用量が、患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間ごとに（例えば、患者に抗体が約２−約２０回、又は例えば約６回与えられるように）投与されてよい。最初に多めの負荷用量、続いて、１回又は複数回の少なめの用量を投与してよい。例示的な投与計画は、投与を含む。しかしながら、他の投与計画が有用である場合がある。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイを用いて容易にモニタリングされる。
Ｅ．製品
本発明の別の態様では、前述の障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器、及び容器の上又は容器に伴うラベル又は添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなど様々な材料から形成されてよい。容器は、単独であるか、又は症状を治療、予防、及び／若しくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を含み、無菌取出口を有してよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静注液バッグ又はバイアルでよい）。組成物中の少なくとも１種の活性物質は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、その組成物が、選ばれた症状を治療するのに使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物がその中に含まれる第１の容器；及び（ｂ）別の細胞傷害性物質又はそうでなければ治療剤を含む組成物がその中に含まれる第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施態様の製品は、それらの組成物を用いて特定の症状を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。あるいは又はさらに、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容され得る緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含んでよい。
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施態様を実施し得ると理解される。
材料及び方法
下記のように、実施例では、以下の材料及び方法を使用した。
マウスモデル−Ghosh, A.S.ら (2011), Watkins, T.A.ら (2013), Lewcock, J.W.ら Neuron 56, 604-620 (2007), and Sabapathy, K.ら Current biology : CB 9, 116-125 (1999)に記載されているように、ＤＬＫヘテロ接合性ノックアウトマウス、ＤＬＫコンディショナルノックアウトマウス、Ｐｈｒ１ｍａｇマウス、及びＪＮＫ２ノックアウトマウスを作製した。ターゲティングベクターを用いた相同組換えによるgenOway (Lyon, France www.genoway.com)によって、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＥＳ細胞においてＪＮＫ３ノックアウトマウスを作製した。ターゲティングベクターは、３．８ｋｂ及び６．５ｋｂの相同性アームを含有し、エクソン１１の大部分がネオマイシン耐性カセットで置換されている。欠失領域は、ＪＮＫ活性に必要なＴ−Ｐ−Ｙトリペプチド二重リン酸化モチーフを含む。ｎｅｏカセットを挿入すると、エクソン１０及び１２が一緒にスプライシングされるフレームシフトが起こって、エクソン１４に早期終止コドンが生成される。ＰＣＲ及びサザンブロットによってネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローンをスクリーニングして、カセットの相同組換えを検証した。以下のプライマーを用いてＰＣＲによって、ＪＮＫ３遺伝子型の決定を行った：
プライマー１：５’−ＣＣＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＴＡＧＴＣＡＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７）
プライマー２：５’−ＴＧＧＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＡＴ−３’（配列番号８）
プライマー３：５’−ＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号９）
プライマー１及び２は、ＷＴ対立遺伝子内の２４９ｂｐの断片を生成し、ＫＯ対立遺伝子内の産物を生成しない。プライマー１及び３は、ＫＯ対立遺伝子内の４３５ｂｐの断片を生成し、ＷＴ対立遺伝子内の産物を生成しない。ＪＮＫ２／３ダブルノックアウト及び同腹子コントロール由来の網膜サンプル中のＪＮＫ２及びＪＮＫ３のブロッティングは、ノックアウトマウスにおけるＪＮＫ２及びＪＮＫ３タンパク質の消失を示す（図１２）。
ＵＳＰ９Ｘコンディショナルノックアウトマウスは、Lexicon PharmaceuticalsがＣ５７ＢＬ／６ ＥＳ細胞から作製した。それらは、触媒Ｃｙｓ１５６０をコードするエクソン３１に隣接するｌｏｘｐ部位を有するＵＳＰ９Ｘ対立遺伝子を含有する。エクソン３１の５’側４．７ｋｂ及び３’側４．０ｋｂの相同性アームを有するＦＲＴ隣接ネオマイシンカセットを使用して、ＥＳ細胞における相同組換えによって、ｌｏｘｐ部位を挿入した。このカセットの相同組換えについてのサザンブロットによって、ネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローンをスクリーニングした。ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）対立遺伝子を含むマウスをＦｌｐ欠失系統と交配して、ネオマイシンカセットを除去した。ｌｏｘＰに挟まれたＵＳＰ９Ｘ対立遺伝子の誘導組換えを達成するために、ＵＳＰ９ＸコンディショナルノックアウトマウスをＲｏｓａ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２系統（これは、Ｃｒｅ−エストロゲン受容体融合タンパク質をコードする構築物のｒｏｓａ遺伝子座への挿入を含有する（Seibler, J.ら Nucleic acids research 31, e12 (2003)）と交配した。ＤＲＧ実験では、ＵＳＰ９Ｘｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ；Ｃｒｅ−及びＵＳＰ９Ｘｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ；Ｃｒｅ＋マウスを時限妊娠のために交配し、Ｃｒｅの有無について胚を遺伝子型決定した。１０μＭ ４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ、Sigma catalog # H7904）を細胞に４８時間追加することによって、培養ＤＲＧにおける組換えを誘導した。また、４−ＯＨＴをＣｒｅ−コントロール細胞に追加した。
一次ニューロン培養物−Ｅ１２．５−Ｅ１３．５マウス胚から後根神経節を切除し、トリプシン処理し（外植片の場合を除く）、ポリ−ｄ−リジン及びラミニン（BioCoat, BD）でコーティングしたチャンバースライド上の、Ｎ３サプリメント、４０ｍＭグルコース及び２５ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含有するＦ１２培地中で培養した。プレートした翌日に、３μＭアラビノフラノシド（ＡｒａＣ、Ｓｉｇｍａ）を培地に追加し、２日後に除去し、ＡｒａＣを含まないＮ３／Ｆ１２／ＮＧＦと培地を交換した。ＮＧＦ離脱実験の場合、インビトロで４−５日経過した後、１−３時間で、ＮＧＦを含有せず２５μｇ／ｍＬ抗ＮＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含有する培地と培地を交換した。
ｓｉＲＮＡ実験の場合、Amaxa nucleofection system (Lonza)を使用して、分離したＤＲＧをトランスフェクトした。Genentech (Kim, M.J.ら Neuron 56, 488-502 (2007))において、ＪＮＫ３ ｓｉＲＮＡ（センス５’−ＡＣＡ ＴＣＧ ＴＡＧ ＴＣＡ ＡＧＴ ＣＴＧ ＡＴＴ Ｔ−３’（配列番号１０）、アンチセンス５’−ＡＴＣ ＡＧＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＡＴ ＧＴＴ Ｔ（配列番号１１））を合成した。コントロールｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ製のON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1であった。
ウエスタンブロッティング−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する緩衝液中、氷上で３０分間インキュベートすることにより、ＤＲＧ培養物を溶解した。放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液中、氷上で３０分間インキュベートすることにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を溶解した。ＲＩＰＡ緩衝液中、３ｍｍタングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を含むＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、網膜及び神経組織サンプルを６分間溶解した。特に断りのない限り、すべての溶解溶液は、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル及びＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有していた。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、２９３Ｔ及び網膜溶解物のタンパク質濃度を決定した。サンプルをNuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)上にロードし、標準的なイムノブロッティング手順に供した。言及されている場合を除いて、ＤＬＫについてブロッティングしたゲルは、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でランした。Ｐｈｒ１のサイズが大きいため、Ｐｈｒ１についてブロッティングしたサンプルは、３−８％トリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でランした。化学発光及びフィルムへの曝露により、ブロットを可視化した。相対的なタンパク質発現及び分子量の定量のために、またChemidoc (Bio-Rad)でブロットを可視化した。ImageLab (Bio-Rad)で定量を実施した。タンパク質発現をローディングコントロール（アクチン又はチューブリン）に対して正規化した。分子量をPrecision Plus Protein WesternC Standards (Bio-Rad)に対して正規化した。
抗体及び阻害剤−以下の抗体を染色及びウエスタンブロッティングに使用した：抗ＤＬＫ（１：１０００、参考文献Hirai, S.ら Development 129, 4483-4495 (2002)にしたがってＧｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて生産）；抗ｐ−ＪＮＫ（１：２５０、Cell Signaling # 9251）；抗ｐ−ｃＪｕｎ（ウエスタンの場合には１：２５０及び染色の場合には１：５００、Cell Signaling #9261）；抗全ＪＮＫ（１：５００、Cell Signaling # 9252）；抗ＪＮＫ２（１：５００、Cell Signaling #4672）；抗ＪＮＫ３（１：５００、Cell Signaling #2305）；抗β−チューブリン（「Ｔｕｊ」、１：１０００、Covance #MMS-435P-250）；抗アクチン（１：５０００、BD # 612656）；抗切断型カスパーゼ−３（１：５００、Cell Signaling # 9664）；Ｂｒｎ３（１：１００、Santa Cruz Biotechnology # sc-6026）；γ−シヌクレイン（１：２００、Abcam # ab55424）；ＮＦ−Ｍ（１：２００、Covance MMS-583S）。抗ＵＳＰ９Ｘ（ラットモノクローナル４Ｂ３）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて生産されたものであり、ヒトＵＳＰ９ＸのＣ末端の１９８アミノ酸に対して生成されたものである。バキュロウイルスで発現させた、ＤＯＣドメインからなるアミノ酸Ｄ３８１２−Ｑ３９６１を含むＰｈｒ１断片でウサギを免疫することによって、Ｐｈｒ１に対する抗体を作製した。次いで、使用前に同じペプチドをロードしたカラムを使用して、血清をアフィニティー精製した。Ｐｈｒ１ｍａｇ突然変異体では、タンパク質のこの部分が存在しない。以下のペプチド：ＰＥＫＤＬ−ｐＴ−ＰＴＨＶＬＱＬＨＣ（配列番号１２）、ＨＲＤＬＫ−ｐＳ−ＰＮＭＬＩＴＹＤＣ，ＲＮＶＰＱＫＬ−ｐＳ−ＰＨＳＫＲＰＣ（配列番号１３）でウサギを免疫することによって、ＤＬＫ上のＴ４３、Ｓ２７２及びＳ５３３リン酸化部位に対する抗体を作製し、使用前にアフィニティー精製した。
以下の阻害剤を所定濃度で使用した：シクロヘキシミド（５μＭ、Calbiochem # 239764）；オカダ酸（「ＯＡ」、２００ｎＭ、Sigma # O8010）、ＭＧ１３２（３０μＭ、Fisher # NC9937881）；ＪＮＫ阻害剤Ｖ（「ＪＮＫＶ」、１０μＭ、EMD # 420129）；ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩ（「ＪＮＫＶＩＩ」、１０μＭ、EMD # 420134）；ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ（「ＪＮＫＶＩＩＩ」、１０μＭ、EMD # 420135）。
ＨＡ−Ｕｂ−ビニルスルホンを使用するＵＳＰ９Ｘ活性アッセイ−ＨＡタグ付ユビキチンビニルスルホンは、Enzo Life Sciencesから入手した。Borodovsky, A.ら Chemistry & biology 9, 1149-1159 (2002)のように、アッセイを実施した。簡潔に言えば、抗ＮＧＦ又はＮＧＦ（コントロールとして）で培養ＤＲＧを処理した。次いで、ＤＲＧを溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ及び１００μＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁し、溶解のためにデカントした。次いで、溶解物を６．６μｇ／ｍＬ ＨＡ−ユビキチンビニルスルホンと共に２５℃で２時間インキュベートした。Ｎ−エチルマレイミドをネガティブコントロールとして５μＭで追加した。サンプル緩衝液中で煮沸することにより、反応を停止させた。
リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ（リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ）−RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)を使用して、分離したＤＲＧ及び網膜由来のＲＮＡサンプルを採取した。プレデザインＴａｑｍａｎプライマーセットは、Applied Biosystemsに注文した。プライマーセットのカタログ番号は、以下の通りであった：ＤＬＫ−Ｍｍ００４３７３７８＿ｍ１（ＦＡＭ標識）、ＧＡＰＤＨ−４３５２３３９Ｅ（ＶＩＣ標識）。7500 Real-Time PCR systemにおいてTaqman RNA-to-Ct One-Step Kit (Applied Biosystems # 4392938)を使用して、比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）アッセイを実施し、７５００ソフトウェアで分析した。ＧＡＰＤＨ内因性コントロール及びＤＬＫプライマーを多重化した。すべてのアッセイには、５回の技術的反復が含まれていた。エラーバーは、これら５回の技術的反復から計算した相対量の標準偏差を表す。
ラムダプロテインホスファターゼアッセイ−ラムダプロテインホスファターゼ、ＰＭＰ用の１０×ＮＥ緩衝液及び１０ｍＭ ＭｎＣｌ２はすべて、New England Biolabsから入手した。ＤＲＧについては、ホスファターゼ阻害剤もＥＤＴＡも用いない以外は本明細書における他のＤＲＧ溶解物と同じ条件で、溶解物を回収した。８００単位のラムダプロテインホスファターゼ又は等量の５０％グリセロール（モックコントロールとして）を含む１×ＰＭＰ緩衝液及び１ｍＭ ＭｎＣｌ２と共に溶解物を３０℃で３０分間インキュベートした。サンプル緩衝液を加熱し、ゲル上にロードすることにより、反応を停止させた。
ＤＬＫの安定性を決定するためのシクロヘキシミドの経時変化−先の方法の小見出しに詳述されているように、時間０において、ＮＧＦを含有せず抗ＮＧＦ及びシクロヘキシミドを含有する培地とＤＲＧ培養培地を交換した。所定時点で溶解物を回収し、ＤＬＫについてブロッティングした。実験を３回実施し、ローディングコントロールと比較してＤＬＫを定量した。時間０における量に対する平均ＤＬＫ量を各時点について計算した。２本の直線の傾きを比較するための線形回帰統計分析を、Graphpad Prismソフトウェアで実施した。
免疫沈降−抗ユビキチン免疫沈降（ＩＰ）については、Ｅ１２．５ ＣＤ−１マウス（Charles River Laboratories）から切除したＤＲＧを、前述のように３０μＭ ＭＧ１３２及び５μＭ Ｎ−エチルマレイミドの溶解緩衝液を追加して溶解した。プロテインＧ結合Dynabeads (Life Technologies)、６μｇの抗ユビキチン抗体（clone FK2, Millipore）又は等価物を用いて、溶解物を３０分間プレクリアした。
インビトロＪＮＫキナーゼアッセイ−抗Ｆｌａｇ標識磁性ビーズ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、２９３Ｔ細胞溶解物から、Ｆｌａｇタグ付ＤＬＫＳ３０２Ａを免疫沈降した。洗浄後、ＤＬＫ結合Ｆｌａｇビーズを２，０００単位のラムダプロテインホスファターゼ、１×ＰＭＰ緩衝液及び１×ＭｎＣｌ２と共に３０℃で３０分間インキュベートして、精製ＤＬＫからすべてのリン酸基を除去した。次いで、ホスファターゼ阻害剤を含有する緩衝液でビーズを洗浄し、キナーゼ反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、２ｍＭ ＤＴＴ、３０μＭ ＡＴＰ）を含む２本のチューブに分割した。１２６ｎｇのＧＳＴタグ付ヒト組換えＪＮＫ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２本のチューブの一方に追加し、それらを３０℃で９０分間インキュベートした。サンプル緩衝液中で加熱することにより、ＦｌａｇビーズからＤＬＫを溶出し、サンプルをブロッティング用のゲルにロードした。
実施例１−ニューロンストレス反応は、多様な哺乳動物ストレスパラダイムにおけるＤＬＫレベルの増加につながる
無脊椎動物（Xiong, X.ら (2010)）及び細胞培養系モデル（Xu, Z.ら (2001)）で観察されているように、ニューロンストレスに対する一般的な応答として全ＤＬＫレベルが増加するかを決定するために、全ＤＬＫタンパク質レベルを調べた。信頼性及び再現性のあるＤＬＫ依存性神経変性を示す２つのニューロンストレスモデルを選択した：培養胚感覚ニューロンの神経増殖因子（ＮＧＦ）離脱アッセイ（発生神経細胞死のモデル）及び網膜視神経挫滅アッセイ（神経損傷及び緑内障のモデル）３，１８。培養胚性後根神経節細胞（ＤＲＧ）では、ＤＬＫタンパク質レベルは、ＮＧＦ離脱に応じて、ＮＧＦの存在下で培養したストレスを受けていないニューロンと比較して約２倍増加した（図１ａ、ｅ）。同様に、視神経挫滅の３日以内に、網膜全体におけるＤＬＫレベルもほぼ１．５倍増加した（図１ｂ、ｅ）。視神経から単離したサンプルでは、ＤＬＫレベルの増加は近位部位でのみ起こり、遠位軸索では起こらない（図１ｃ、ｄ）。各場合において、ＤＬＫレベルは、神経変性の発症（これは、ＮＧＦ離脱の１６時間後及び網膜神経挫滅の３−７日後に始まる）よりもかなり早い時点で増加した。
ＤＬＫタンパク質量の増加は、ＤＬＫの見掛けの分子量の増加〜５ｋＤａ（図１ａ、ｂ、ｄ）を伴っていた（図１ｆ）。＋ＮＧＦ条件及び−ＮＧＦ条件では、ラムダプロテインホスファターゼでＤＲＧ溶解物を処理してリン酸基を切断すると、ＤＬＫの分子量が均一になったが（図１ｇ）、これは、移動度シフトが、リン酸化の結果であったことを実証している。網膜神経挫滅では、ＤＬＫはＲＧＣでのみリン酸化され、他の網膜細胞型ではリン酸化されない（図８ａ）。
いくつかの事例において、ＤＬＫの移動度シフトが観察されているが（Xu, Z., Maroney, A.C., Dobrzanski, P., Kukekov, N.V. & Greene, L.A. Molecular and cellular biology 21, 4713-4724 (2001); Mata, M.ら The Journal of biological chemistry 271, 16888-16896 (1996)）、他では観察されておらず、それが観察された際に、この現象の原理は十分に理解されていない。これらの相反する結果は、研究グループで使用されているＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液条件の差異に少なくとも部分的に起因する可能性がある（図８ｂ）。
実施例２−ＤＬＫタンパク質は、栄養因子離脱に応じて安定化される
ストレス誘導性のＤＬＫレベルの上昇を説明するための考えられる機構には、（１）Ｄｌｋの転写の増加、（２）タンパク質翻訳の増加、又は（３）ＤＬＫの安定性の増加が含まれる。可能性１を検討するために、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを実施して、栄養因子離脱を受けたＤＲＧ及び神経挫滅網膜におけるＤＬＫ転写産物の量を定量した。何れの条件においても、ストレスを受けていないコントロールと比較して、ＤＬＫ転写産物レベルの検出可能な変化は示されなかったが（図２ａ）、これは、ＤＬＫタンパク質レベルの上昇が転写後の機構によるものであることを実証している。ＤＬＫの安定性がニューロンストレスにより影響を受けるかを決定するために、ＮＧＦの存在下又は非存在下においてシクロヘキシミドでＤＲＧを８時間処理してタンパク質翻訳を阻害し、この時間の後に残っていたＤＬＫの量を決定した。ＮＧＦ欠乏によって、ＤＬＫの安定性の〜２．５倍の増加が観察されたが（図２ｂ−ｃ）、これは、ＤＬＫタンパク質レベルの上昇が、ニューロンストレスに応じてタンパク質安定性が増強された結果であることを示している。
ＤＬＫのストレス依存性レギュレーションにおけるリン酸化の役割をさらに調査するために、ＮＧＦの存在下で培養したストレスを受けていないＤＲＧをオカダ酸（広範なホスファターゼ阻害剤）で処理して、ＤＬＫのリン酸化を増強した。この処理は、ＤＬＫの見掛けの分子量及び全レベルの両方を増加させるのに十分であったが、これは、ＤＬＫのリン酸化がタンパク質安定性をレギュレートすることを示唆している（図２ｄ）。ＭＧ１３２による処理は、ＤＬＫのリン酸化の増加を伴わずにＤＬＫレベルの増加をもたらしたが、これは、非リン酸化ＤＬＫが通常はプロテアソームによって分解されることを示唆している（図２ｄ）。
実施例３−ニューロンストレスは、Ｐｈｒ１のモデュレーションを介してＤＬＫのユビキチン化をレギュレートする
ニューロンストレスがＤＬＫのユビキチン化を減少させて、ＤＬＫの安定性を増強するかを決定するために、＋ＮＧＦ ＤＲＧ及び−ＮＧＦ ＤＲＧからユビキチン化タンパク質を免疫沈降したところ、−ＮＧＦ条件では、ＤＬＫのユビキチン化が顕著に減少していることが見出された（図３ａ）。無脊椎動物系では、Ｅ３ユビキチンリガーゼのＰＨＲファミリー（ＰＡＭ／ｈｉｇｈｗｉｒｅ／ＲＰＭ−１）が、ＤＬＫタンパク質レベルをレギュレートし、ｆａｔ ｆａｃｅｔｓ遺伝子（これは、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）をコードする）とｄｌｋホモログとの間の遺伝的相互作用が実証されている（Collins, C.A., Wairkar, Y.P., Johnson, S.L. & DiAntonio, A. (2006); Nakata, K.ら (2005); Xiong, X.ら (2010)）。しかしながら、Ｐｈｒ１ ＫＯマウス胚由来の全脳溶解物は、ＤＬＫタンパク質量の変化を示さないので（Bloom, A.J., Miller, B.R., Sanes, J.R. & DiAntonio, A. (2007)）、ＤＬＫをレギュレートするために、脊椎動物において同様の経路が存在するかについては不明であった。哺乳類ニューロンでのＤＬＫレベルのレギュレートにおけるユビキチンプロテアソーム系の役割を直接調査するために、これら２つの遺伝子のマウスホモログにおいて、機能喪失型対立遺伝子を有するＤＲＧを培養した。
最初に、ＵＳＰ９Ｘ（ｆａｔ ｆａｃｅｔｓの最も近縁なマウスホモログ）コンディショナルノックアウトマウス由来のＤＲＧを培養した。ＤＬＫのターンオーバーを制御するＤＵＢのノックアウトについて予測されるように、ＵＳＰ９Ｘを欠くＤＲＧ（Ｃｒｅ＋）では、Ｃｒｅ−ＤＲＧと対比して、ＤＬＫレベルの〜３５％の減少が観察された（図３ｂ、ｃ）。しかしながら、ＵＳＰ９Ｘのノックアウトは基本的なＤＬＫレベルに影響を及ぼしたが、Ｃｒｅ−ニューロンにおけるＤＬＫタンパク質量の−ＮＧＦ：＋ＮＧＦ比は、Ｃｒｅ＋ニューロンにおけるものとほぼ同一であった（図３ｃ）。この観察結果と一致して、ユビキチンビニルスルホンによる架橋により、ＵＳＰ９Ｘ活性は、ＮＧＦ離脱によって変化しないことが明らかになった（図９）。したがって、本発明者らはＵＳＰ９ＸはＤＬＫを脱ユビキチン化するが、ＤＬＫレベルのストレス依存性変化には不要であると結論する。
対照的に、機能喪失型Ｐｈｒ１ｍａｇ対立遺伝子についてホモ接合性のＤＲＧ（Lewcock, J.W.ら (2007)）は、ＮＧＦの存在下では、野生型コントロールと比較してＤＬＫレベルの増加を示したが、ＮＧＦ欠乏後のＤＬＫレベルには影響はなく、その結果、ストレス条件及び非ストレス条件におけるＤＬＫレベルはほぼ同等であった（図３ｄ、ｅ）。加えて、Ｐｈｒ１ｍａｇホモ接合性ニューロンは、ユビキチン化ＤＬＫの量がより少なかった（図３ｆ）。これらの観察結果は、ニューロンストレスによるＤＬＫのユビキチン化の観察された減少と共に（図３ａ）、ＤＬＫのユビキチン化の変化が、少なくとも部分的には、Ｐｈｒ１活性のモデュレーション又はそのＤＬＫとの相互作用によるものであることを示唆している。しかしながら、Ｐｈｒ１ｍａｇニューロンにおけるＤＬＫ量の増加は、ｃ−Ｊｕｎなどの下流標的の下流シグナル伝達及びリン酸化を駆動するのに十分ではなかった。したがって、ＤＬＫのみの上昇は、下流シグナル伝達事象を誘導するのに十分ではなく、ＤＬＫの活性化にはさらなるインプットが必要である。
実施例４−ＤＬＫ活性及びＪＮＫ活性は、ＤＬＫの安定化に必要である
ニューロンストレスは、ユビキチン化の減少を介して、ＤＬＫのリン酸化及び安定化をもたらし、オカダ酸処理もＤＬＫのリン酸化及び安定化を引き起こす。これは、ＤＬＫのリン酸化とＤＬＫの安定化との間の関連性の可能性を示唆している。リン酸化がＤＬＫタンパク質の安定性をどのようにしてレギュレートし得るかを決定するために、一過性トランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦｌａｇタグ付マウスＤＬＫの発現を調べた。２９３Ｔ細胞において発現した野生型ＤＬＫは、二量体化して自己リン酸化するので構成的に活性である（Mata, M.ら (1996)）。ニューロンにおける非ストレス条件対ストレス条件をある程度模倣するために、本発明者らは、ＭＬＫ３との相同性により本発明者らが同定した推定活性化ループ内のリン酸化部位を突然変異させることにより、キナーゼ失活型ＤＬＫを作製した（Leung, I.W. & Lassam, N. The Journal of biological chemistry 276, 1961-1967 (2001)）。このような点突然変異体の１つであるＤＬＫＳ３０２Ａは、発現した際に、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を引き起こすことができなかったが、これは、それがキナーゼ活性を欠くことを裏付けている。興味深いことに、ＤＬＫＳ３０２Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における野生型ＤＬＫよりも低いレベルで発現していた。ＵＳＰ９Ｘと共発現させると、ＤＬＫＳ３０２Ａの発現が野生型レベルまで増加したが、これは、観察されたより低いタンパク質レベルが、不活性ＤＬＫのユビキチン化の増加によるものであることを示唆している（図４ａ）。これらのデータは、ニューロンにおける本発明者らの観察結果と一致している。ＤＬＫＳ３０２Ａで観察されたタンパク質発現の減少が、この特定の突然変異の効果ではなくキナーゼ活性の消失の結果であったことを確認するために、ＤＬＫロイシンジッパーのみを含有する短縮型構築物（これは、全長ＤＬＫの二量体化を防止することによって、ドミナントネガティブとして作用する）（Nihalani, D., Merritt, S. & Holzman, L.B. The Journal of biological chemistry 275, 7273-7279 (2000)）で野生型ＤＬＫをコトランスフェクトした。ＤＬＫＳ３０２Ａで観察されたものと同様に、ＤＬＫ活性の減少は、ＧＦＰと共発現したＤＬＫと比較して低いＤＬＫ発現をもたらした（図４ｂ）。
ＤＬＫ経路の活性がタンパク質安定化に必要と思われたので、下流シグナル伝達がＤＬＫの安定性において役割を果たすかを調べた。ＤＬＫをドキシサイクリン誘導的に発現した安定細胞株を使用し、２つの構造的に異なるＪＮＫ阻害剤で細胞を処理した（図４ｃ）。ＪＮＫ阻害剤は両方とも、ＤＬＫタンパク質のレベルを低下させることができた。
神経系におけるこの知見の妥当性を決定するために、ｓｉＲＮＡを使用して、ＪＮＫ２ノックアウトＤＲＧにおけるＪＮＫ３発現をノックダウンし、ストレス誘導性神経変性の大部分をレギュレートする２つのＪＮＫファミリーメンバーを除去した（Coffey, E.T.ら The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 22, 4335-4345 (2002); Chang, L., Jones, Y., Ellisman, M.H., Goldstein, L.S. & Karin, M. Developmental cell 4, 521-533 (2003)）。コントロールｓｉＲＮＡと比較して、ＪＮＫ３のノックダウンはＤＬＫの増加を減衰したが、ＤＬＫの見掛けの分子量にいくらかの変化が依然として観察された（図４ｄ）。ＪＮＫ活性は、ＤＬＫの安定化に必要なＤＬＫ上の特定部位のリン酸をもたらすフィードバック機構を発生させるが、他のＪＮＫ非依存性リン酸化事象も起こると仮説した。網膜神経挫滅モデルでは、挫滅の１８時間後において、ＪＮＫ２／３ダブルノックアウトは、同腹子コントロールと比較して、ＤＬＫレベル又は分子量の増加を示さないが（図４ｅ、矢印）、これは、ＤＬＫのＪＮＫ依存性リン酸化が成体インビボ傷害パラダイムで起こることを実証している。
実施例５−ＤＬＫの安定化に必要なリン酸化部位の同定
ＤＬＫ上の機能的に関連するリン酸化部位を同定するために、細胞培養物中のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）と併せて質量分析を使用した。これらの研究のために、同位体濃縮（重）型のリジン（１３Ｃ６ １５Ｎ２）及びアルギニン（１３Ｃ６ １５Ｎ４）又はそれらの非標識カウンターパート（軽）を含有するＳＩＬＡＣ培地中で、ＦＬＡＧタグ付ＤＬＫを発現する２９３Ｔ細胞を培養した。４組の条件（重対軽）を確立して、ＤＬＫの全存在量及びＤＬＫのリン酸化の程度に対するＪＮＫ活性及びＤＬＫ活性の効果を分析した：１）野生型（ＷＴ）ＤＬＫ対ＤＬＫＳ３０２Ａ、２）ＤＬＫＳ３０２Ａ対構成的に活性なＪＮＫ構築物（Lei, K.ら Molecular and cellular biology 22, 4929-4942 (2002)）と共発現させたＤＬＫＳ３０２Ａ、３）ＷＴ ＤＬＫ対ＷＴ ＤＬＫとＪＮＫ阻害剤、及び４）ＷＴ ＤＬＫ対ＷＴ ＤＬＫとオカダ酸（図５ａ）。
ＤＬＫ上の一連のリン酸化ペプチドを同定したところ、その存在量は試験条件に応じて変化していた。ＤＬＫの全存在量に関する条件間差異を補正した後（材料及び方法を参照のこと）、そのリン酸化状態が、ＤＬＫ及びＪＮＫ依存性リン酸化と一致して変化した部位を同定した（図５ｂ、ｃ）。変化の規模の点で上位３つの部位は、Ｎ末端ドメインにおけるＴ４３、キナーゼドメインにおけるＳ２７２、及びロイシンジッパードメインの直ぐＣ末端側のＳ５３３であった。ＪＮＫ及びＤＬＫの予測活性と一致して、複数のリン酸化部位を含有するペプチドについても変化が観察された。キナーゼ活性化ループ内の公知のリン酸化部位（Ｓ２９５−Ｔ３０６）は、ＤＬＫのキナーゼ活性に依存するが、ＪＮＫ非依存性であることが見出された。この知見は、ＪＮＫがＤＬＫの活性を直接モデュレートするのではなく、ＤＬＫの安定性に影響を与える因子を制御するモデルと一致する。興味深いことに、ＭＡＰＫ基質モチーフと一致して（Songyang, Z.ら Molecular and cellular biology 16, 6486-6493 (1996)）、ＤＬＫの配列内では、上位の同定部位は隣接プロリンを含有していた。
実施例６−安定化ＤＬＫでは、同定部位がリン酸化される
ＤＬＫの安定性に対する上位３つの各同定部位のリン酸化の効果を決定するために、それぞれのアラニン点突然変異体を２９３Ｔ細胞で発現させた。ｃ−Ｊｕｎのリン酸化によって測定したところ、Ｓ２７２がＤＬＫ活性に必要であった。Ｓ２７２突然変異体に起因するＤＬＫの安定性の変化を、キナーゼ活性の消失によって起こったものと区別することは不可能であったため、この点突然変異をさらに追求しなかった。興味深いことに、Ｔ４３及びＳ５３３はＤＬＫ活性に不要であったが、ＤＬＫＴ４３Ａ及びＤＬＫＳ５３３Ａ突然変異体は、野生型ＤＬＫよりも低レベルで発現しており（図６ａ）、これは、タンパク質安定性の減少と一致している。質量分析の結果と一致して、Ｔ４３、Ｓ２７２及びＳ５３３残基に対して生じたリン酸化特異的抗体は、点突然変異体だけではなくキナーゼ失活型ＤＬＫＳ３０２Ａにおいても、これらの部位のリン酸化の消失があることを実証した（図６ａ）。
ニューロンでは、Ｔ４３及びＳ５３３のリン酸化がストレス依存的に起こるかを調べた。この疑問に答えるために、野生型ＤＲＧを栄養因子欠乏状態にし、２つの各リン酸化部位に対して特異的な抗体で溶解物をブロッティングした（図６ｂ）。リン酸化Ｔ４３をターゲティングする抗体は、ラムダホスファターゼ処理により解消した−ＮＧＦ条件では免疫応答性を示したが、これは、リン酸化標的抗原に対するこの抗体の特異性を実証している。栄養因子欠乏状態のＤＬＫ ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ Ｃｒｅ−及びＣｒｅ＋溶解物のブロッティングにより、ＤＬＫに対するこの抗体の特異性が実証された（図６ｃ）。加えて、挫滅網膜由来の免疫沈降ＤＬＫでは、Ｔ４３及びＳ５３３の両方のリン酸化を検出することができる（図６ｄ）。したがって、これらの部位のリン酸化は、ニューロンにおけるＤＬＫの安定性に寄与するという仮説と一致して、Ｔ４３及びＳ５３３は、インビボではニューロンストレス後にリン酸化される。精製ＪＮＫ及びＤＬＫを使用したインビトロキナーゼアッセイにより、Ｔ４３及びＳ５３３は両方とも、ＪＮＫによって直接リン酸化され得ることが示された（図６ｅ）。したがって、ＪＮＫは、インビボでＤＬＫを直接リン酸化し得る。
実施例７−ＤＬＫは、下流アポトーシス促進性シグナル伝達を用量依存的にモデュレートする
ＤＬＫタンパク質量が、栄養因子離脱及び視神経挫滅に応じて増加するという観察結果は、ＤＬＫタンパク質レベルが、ニューロンストレス後にＤＬＫにより誘導される下流シグナル伝達の程度に直接的な影響を与えるかについての調査を促した。これを行うために、本発明者らは、ＷＴ同腹仔に存在するＤＬＫの約５０％の量を発現するＤＬＫノックアウトヘテロ接合体を使用した。ＮＧＦ離脱の３時間の間に（図７ａ）、ＤＬＫ ＫＯ対立遺伝子についてヘテロ接合性のニューロンは、ＷＴコントロールと比較して低レベルのｐ−ｃＪｕｎ及びｐ−ＪＮＫを示した。したがって、ＤＲＧでは、ＤＬＫの量が、アポトーシス促進性シグナル伝達の量を直接制御する。
網膜神経挫滅では、ＤＬＫヘテロ接合性マウスにおけるアポトーシス促進性シグナル伝達が、ＤＬＫ野生型マウスと比較して同様に減少している。神経挫滅の６時間後において、ヘテロ接合性挫滅網膜におけるｐ−ｃＪｕｎ陽性核の数は、ＷＴ網膜で見られる数と比較して約７０％減少している（図７ｂ、ｃ）。同様に、挫滅の３日後において、ＤＬＫヘテロ接合体では、カスパーゼ−３陽性細胞の量は８５％超減少しているが（図７ｄ、ｅ）、Ｂｒｎ３陽性核の総数は２倍超増加している（図７ｄ、ｆ）。これらのマーカーの変化は、抑制されたストレス応答があることを示している（Watkins, T.A.ら In Press (2013)）。より後の時点では、これらのマーカーは、ＷＴ網膜で観察されるものと区別不可能になるが、これは、ヘテロ接合体におけるアポトーシスシグナル伝達の減少が、絶対的な減少ではなく遅延であることを実証している（図１１）。これは、神経挫滅後のアポトーシス促進性シグナル伝達が遮断されるＤＬＫノックアウト（Watkins, T.A.ら In Press (2013)）とは異なる。したがって、ＤＬＫレベルのモデュレーションは、ニューロンストレス後のインビボ及びインビトロの両方における下流アポトーシスシグナル伝達の量及び進行を調整する。
ＤＬＫレベルは、通常の条件下ではＰｈｒ１及びＵＳＰ９Ｘを介して厳密にレギュレートされると提案されている。特にＰｈｒ１突然変異体では、ＤＬＫレベルはストレスの非存在下で増加するが、これは下流シグナル伝達をもたらさない：したがって、さらなる因子がＤＬＫの活性化に必要である。ニューロンストレス（例えば、ＮＧＦ欠乏及び損傷）は、ＤＬＫのキナーゼ活性の活性化並びに下流標的ＭＫＫ４／７及びＪＮＫのリン酸化をもたらす。次いで、ＪＮＫ依存性フィードバック機構が、ＤＬＫのリン酸化及び安定化をもたらす。ＮＧＦ離脱で観察されるように、安定化は、ユビキチン化の変化を介して起こる。ユビキチン化のこの変化は、おそらくは、Ｐｈｒ１の活性、又はＰｈｒ１に対するＤＬＫの基質アベイラビリティの変化を介して起こるが、さらなるＥ３ユビキチンリガーゼもＤＬＫのユビキチン化に関与する可能性がある。何れの場合も、ＪＮＫからの正のフィードバックによるユビキチン化の減少は、ＤＬＫレベルの迅速なスイッチ様のアップレギュレーション、並びにアポトーシスの活性化及び軸索変性をもたらす。
ＤＬＫのキナーゼ活性は、ホモ二量体化及び自己リン酸化を必要とし（Nihalani, D., Merritt, S. & Holzman, L.B. (2000)）、活性化ループの自己リン酸化は、関連キナーゼＭＬＫ３のキナーゼ活性に必要である（Leung, I.W. & Lassam, N. (2001)）。したがって、ＮＧＦ離脱及び神経挫滅で観察されたＤＬＫのリン酸化が、ＤＬＫの活性化ループの自己リン酸化、又は上流活性化キナーゼによるＤＬＫの活性化ループのリン酸化の結果であると推測するのが妥当であろう。実際、これにより、ＪＮＫ阻害が、ニューロンストレス後にＤＬＫ内のすべての部位のリン酸化を完全には阻害しないという観察結果が説明される可能性がある（図４）。キナーゼのレギュレーションの機構的な理解は、多数のキナーゼの活性化ループのリン酸化に主に集中していた。上記実験は、活性化ループの外側の特定の残基におけるＤＬＫのリン酸化には下流キナーゼが必要であるという明確な機構の証拠を提供する。これらの残基のリン酸化は、ＤＬＫ活性に影響を与えずにＤＬＫの安定性に影響を与える。
理解を明確にするために、例示及び実施例として上記本発明をいくらか詳細に説明したが、これらの説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用されたすべての特許及び科学文献の開示は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。

Claims (21)

  1. ニューロンにおけるデュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の安定性を減少させるための方法であって、ＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害してＤＬＫの安定性を減少させる薬剤をニューロン又はその一部に投与することを含む、方法。
  2. デュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）の特定のアミノ酸残基のリン酸化を減少させ又は阻害するための方法であって、ＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害する薬剤をニューロン又はその一部に投与することを含み、前記リン酸化の減少又は阻害が、ＤＬＫタンパク質の安定性の減少をもたらす、方法。
  3. 患者における神経変性を阻害又は予防するための方法であって、デュアルロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）のリン酸化を減少させ又は阻害する薬剤を患者に投与することを含み、前記リン酸化の減少又は阻害が、ＤＬＫの安定性を減少させる、方法。
  4. 前記薬剤が、特定のＤＬＫアミノ酸残基のリン酸化を減少させ又は阻害する、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 前記特定のＤＬＫアミノ酸残基が、配列番号１（ヒト）の４３位のトレオニン（Ｔ４３）；配列番号２（マウス）の４３位のトレオニン；配列番号１（ヒト）の５００位のセリン（Ｓ５００）；配列番号２（マウス）の５３３位のセリン（Ｓ５３３）；及び他の種由来のＤＬＫ又はアイソフォームにおける同等の残基から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. ＤＬＫのリン酸化を減少させ又は阻害する前記薬剤が、抗体、小分子、ポリペプチド及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）から選択される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 前記薬剤が抗体である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. 前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ’）２断片から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ニューロン又はその一部が、ヒト被験体、神経移植片若しくは神経移植物、又はエクスビボ若しくはインビトロに存在する、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  10. 前記ニューロンが、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、網膜神経節細胞ニューロン及び皮質ニューロンからなる群より選択される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  11. ＤＬＫのリン酸化の前記減少又は阻害が、ＤＬＫのキナーゼ活性に影響を与えない、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 前記薬剤がＪＮＫ阻害剤である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
  13. ＪＮＫ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
  14. 前記ＪＮＫ阻害剤が、ＪＮＫ１；ＪＮＫ２；ＪＮＫ３；並びにＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３の任意の組み合わせから選択されるＪＮＫを阻害する、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 前記ＪＮＫ阻害剤が、ＪＮＫ阻害剤Ｖ、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩ（ＴＡＴ−ＴＩ−ＪＩＰ１５３−１６３）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ及びｓｉＲＮＡから選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記患者が、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、無脊椎椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、ポルフィリン症、ハンチントン病、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、レビー小体認知症、前頭側頭認知症、脱髄疾患、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・ツース病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、牛海綿状脳症、ピック病、癲癇、及びＡＩＤＳ認知症複合、慢性疼痛、線維筋痛、脊椎痛、手根管症候群、癌からの疼痛、関節炎、坐骨神経痛、頭痛、手術からの疼痛、筋痙攣、背痛、内臓痛、損傷からの疼痛、歯痛、神経痛、例えば、神経原性又は神経障害性の疼痛、神経炎症又は損傷、帯状疱疹、椎間板ヘルニア、靱帯損傷及び糖尿病、糖尿病、癌、ＡＩＤＳ、肝炎、腎機能不全、コロラドダニ熱、ジフテリア、ＨＩＶ感染、ハンセン病、ライム病、結節性多発動脈炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、梅毒、全身性エリテマトーデス又はアミロイドーシスによって引き起こされる末梢神経障害及び神経痛、毒性化合物、重金属、工業溶剤、薬物、化学療法剤、ダプソン、ＨＩＶ薬、コレステロール低下薬、心圧若しくは血圧の薬又はメトロニダゾールへの曝露によって引き起こされる神経損傷、物理的、機械的又は化学的外傷によって引き起こされる神経系への損傷、統合失調症、妄想性障害、分裂情動障害、統合失調症様障害、共有精神病性障害、精神病、妄想性人格障害、統合失調質人格障害、境界性人格障害、反社会的人格障害、自己愛性人格障害、強迫性障害、譫妄、認知症、気分障害、双極性障害、鬱病、ストレス障害、パニック障害、広場恐怖症、社会恐怖症、心的外傷後ストレス障害、不安障害及び衝動制御障害、緑内障、格子状ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型又は乾燥型ＡＭＤに伴う光受容体の変性、他の網膜変性、視神経結晶腔、視神経症並びに視神経炎から選択される疾患又は症状を患っている、請求項３から１５の何れか一項に記載の方法。
  17. ニューロンにおけるストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を検出するための方法であって、（ａ）生物学的サンプルと、リン酸化型ＤＬＫを特異的に認識する抗体とを接触させること；及び（ｂ）前記生物学的サンプル中の前記リン酸化型ＤＬＫに対する前記抗体の結合を検出することを含み、前記抗体による結合がストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を示す、方法。
  18. 前記リン酸化型ＤＬＫに対する前記抗体の結合を測定することをさらに含み、前記生物学的サンプル中の前記抗体の結合がコントロールと比べて増加していることが、ストレス依存性又はアポトーシス促進性ＤＬＫ活性を示唆する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記生物学的サンプルが、ニューロン、神経細胞溶解物、及びニューロンから精製されたＤＬＫから選択される生物学的材料を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記抗体が、配列番号１（ヒト）の４３位のトレオニン（Ｔ４３）；配列番号２（マウス）の４３位のトレオニン；配列番号１（ヒト）の５００位のセリン（Ｓ５００）；配列番号２（マウス）の５３３位のセリン（Ｓ５３３）；及び他の種由来のＤＬＫ又はアイソフォームにおける同等の残基から選択されるアミノ酸残基でリン酸化されたＤＬＫに特異的に結合する、請求項１７から１９の何れか一項に記載の方法。
  21. 前記ＤＬＫのリン酸化が、ニューロンストレス又はニューロン損傷に対するものである、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
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