CN105050620A - 调节dlk稳定性的方法 - Google Patents

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萨拉·亨特沃克-罗德里格斯
唐纳德·柯克帕特里克
约瑟夫·韦斯利·卢科克
阿伦德哈蒂·森古普塔·戈什
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Abstract

本发明提供降低神经元中双亮氨酸拉链激酶(DLK)稳定性，或降低或抑制DLK的某些氨基酸残基的磷酸化的方法，所述方法包括向神经元、或其部分施用降低或抑制DLK的磷酸化和降低DLK的稳定性的试剂，以及用于抑制或预防患者中神经元变性的方法，所述方法通过向患者施用抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的磷酸化的试剂进行。

Description

调节DLK稳定性的方法
相关申请
本申请要求2013年2月28日提交的美国临时申请号61/770,959的权益，其通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及通过抑制DLK磷酸化来降低双亮氨酸拉链激酶(DLK)的稳定性从而预防神经元变性的方法。
背景
轴突变性和神经元细胞死亡在改善神经元连接的发育过程中(Oppenheim，R.W.Annualreviewofneuroscience14，453-501(1991)；Luo，L.＆O′Leary，D.D.Annualreviewofneuroscience28，127-156(2005))，损伤后清除损伤细胞(Quigley，H.A.等人Investigativeophthalmology＆visualscience36，774-786(1995))，和在神经变性疾病比如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和阿尔茨海默病(Vila，M.＆Przedborski，S.Naturereviews.Neuroscience4，365-375(2003))中发生。在这些背景下引发神经变性的因素广泛变化的同时，对于很多神经变性背景似乎常见的保守信号传导事件已经被鉴定为起始轴突变性和神经元凋亡。其一个实例是JunN-末端激酶(JNKs)，在两种发育中，其在激活轴突变性和神经元凋亡中作用于Bax和c-Jun的上游(Ham，J.等人Neuron14，927-939(1995)；Kuan，C.Y.等人Neuron22，667-676(1999)；Southwell，D.G.等人Nature491，109-113(2012)；White，F.A.，Keller-Peck，C.R.，Knudson，C.M.，Korsmeyer，S.J.＆Snider，W.D.TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience18，1428-1439(1998))，并且作为神经变性疾病的病理学的一部分(Hunot，S.等人PNAS101，665-670(2004)；Martin，L.J.Journalofneuropathologyandexperimentalneurology58，459-471(1999)；Vila，M.等人PNAS98，2837-2842(2001)；Yao，M.，Nguyen，T.V.＆Pike，C.J.TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience25，1149-1158(2005))。在这些背景下，Bax-依赖性胱天蛋白酶激活似乎对于进行JNK激活下游的程序性细胞死亡和轴突变性是必要的(Simon，D.J.等人TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience32，17540-17553(2012)；Pettmann，B.＆Henderson，C.E.Neuron20，633-647(1998)；Gagliardini，V.等人Science263，826-828(1994)；Yuan，J.＆Yankner，B.A.Nature407，802-809(2000))。
带有双亮氨酸拉链的激酶(DLK)是需要应激诱导的神经元JNK激活的混合谱系(mixedlineage)激酶(MLK)家族的进化保守的、高度神经元特异的成员(Hirai，S.等人Geneexpressionpatterns：GEP5，517-523(2005)；Ghosh，A.S.等人TheJournalofcellbiology194，751-764(2011)；Watkins，T.A.等人DLKinitiatesatranscriptionalprogramthatcouplesapoptoticandregenerativeresponsestoaxonalinjury.出版中(2013)；Chen，X.等人TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience28，672-680(2008)。哺乳动物中DLK的丧失足以减弱发育中的凋亡和轴突变性以及接着的轴突损伤(Ghosh，A.S.等人(2011)；Watkins，T.A.等人.出版中(2013)；Chen，X.等人(2008)；Miller，B.R.等人Natureneuroscience12，387-389(2009))。在无脊椎动物中，通过连续遗传筛选鉴定了DLK的明显的功能，其表明E3泛素连接酶的PHR家族(PAM/highwire/RPM-1)负性调节DLK水平以控制突触发育(Collins，C.A.，Wairkar，Y.P.，Johnson，S.L.＆DiAntonio，A.Neuron51，57-69(2006)；Nakata，K.等人Cell120，407-420(2005))。去泛素化酶(DUB)fatfacets(faf)的过表达产生类似于highwire突变体的突触表型，提示Faf可能对抗PHR连接酶以正性调节DLK水平(Collins，C.A.，Wairkar，Y.P.，Johnson，S.L.＆DiAntonio，A.(2006))。类似的机制似乎在果蝇(Drosophila)中神经损伤之后调节DLK，其中DLK水平以PHR-依赖性方式快速上调(Xiong，X.等人TheJournalofcellbiology191，211-223(2010))。在线虫(C.elegans)中，损伤后DLK活性也通过与将DLK激活限制于神经元的损伤区域的更短的DLK同种型异二聚化来调节(Yan，D.＆Jin，Y.Neuron76，534-548(2012))。
尽管通过无脊椎系统中的研究获得了机制知识，关于在哺乳动物神经元中DLK是否被类似调节，知道的很少。缺乏Phrl(小鼠PHR泛素连接酶)表达的小鼠在整个脑中在DLK丰度方面未显示明显的改变，并且DLK的丧失未能抑制在Phr1突变体中观察到的轴突路径寻找缺陷(Bloom，A.J.，Miller，B.R.，Sanes，J.R.＆DiAntonio，A.Genes＆发育21，2593-2606(2007))。然而，在神经元损伤的范例中通过泛素-蛋白酶体系统对DLK水平的调节尚未严格检查。
DLK是感受神经元损伤并引发变性和再生信号传导的MAP3K(Ghosh，A.S.等人(2011)；Watkins，T.A.等人.出版中(2013)；Miller，B.R.等人(2009)；Shin，J.E.等人神经元74，1015-1022(2012))。DLK的丧失足以以多种神经元应激范例完全抑制JNK激活和下游响应(Watkins，T.A.等人.出版中(2013)，但在哺乳动物神经元中DLK自身如何被神经元应激调节尚不清楚。本文中描述的实施例表明，在哺乳动物神经元中：(1)响应神经元应激，DLK量早期快速增加，(2)，DLK水平受正反馈环控制，其中JNK活性调节许多DLK内调节蛋白稳定性的位点的磷酸化(3)DLK水平受Phr1和USP9X调节，(4)DLK蛋白稳定性的改变可以独立于应激诱导的DLK信号传导激活而发生，和(5)DLK蛋白量直接控制下游信号传导量。
概述
本发明提供通过抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的磷酸化调节DLK稳定性的方法。本发明还提供通过施用抑制DLK的磷酸化，尤其是，抑制DLK的特定氨基酸残基的磷酸化的试剂抑制或预防患者中神经元变性的方法。
本发明基于这样的观察结果：各种类型的神经元应激后DLK水平可再现地增加。不受理论限制，尽管，Phr1和去泛素化酶(DUB)USP9X都不调节DLK活性，但行使功能以紧密调节神经元中DLK蛋白的丰度。神经元-损伤-依赖性激活后，DLK成为高度磷酸化的，其通过不同于调节DLK激酶活性的那些的激酶结构域外的特异JNK依赖性磷酸化事件导致增加的蛋白稳定性。因此，DLK通路激活产生增加DLK蛋白水平的反馈机制，其转而增强下游靶点的磷酸化并将分级的或局部DLK信号传导转化为允许神经元正确针对损伤进行反应的更完全的响应。
在一个实施方案中，本发明提供降低神经元中双亮氨酸拉链激酶(DLK)稳定性的方法，所述方法包括向神经元、或其部分，施用、降低或抑制DLK的磷酸化和降低DLK稳定性的试剂。在某些实施方案中，所述试剂抑制或降低特定的一个DLK氨基酸残基或多个DLK氨基酸残基的磷酸化。
在其它实施方案中，本发明提供抑制或降低双亮氨酸拉链激酶(DLK)的某些氨基酸残基的磷酸化的方法，所述方法包括向神经元或其部分施用抑制或降低DLK的某些氨基酸残基的磷酸化的试剂，其中磷酸化的抑制或降低导致DLK蛋白稳定性的降低。
在其它实施方案中，本发明提供抑制或预防患者中神经元变性的方法，其中所述方法包含向患者施用抑制或降低双亮氨酸拉链激酶(DLK)的磷酸化的试剂，其中磷酸化的抑制或降低降低DLK的稳定性。在某些实施方案中，所述试剂抑制或降低特定的一个DLK氨基酸残基或多个DLK氨基酸残基的磷酸化。
在其它实施方案中，本发明提供检测神经元中应激依赖性或促凋亡DLK活性的方法，所述方法包括：(a)将生物样品与特异识别DLK的磷酸化形式的抗体接触；和(b)检测抗体对生物样品内DLK的磷酸化形式的结合，其中被抗体结合表明应激依赖性或促凋亡DLK活性。在某些实施方案中，所述方法还包含测量抗体对DLK的磷酸化形式的结合，其中相对于对照，在生物样品中对抗体结合的增加，表明神经元中应激依赖性或促凋亡DLK活性。在其它实施方案中，生物样品包含选自神经元、神经元细胞裂解产物和从神经元纯化的DLK的生物材料。
在某些实施方案中，用于本发明的方法的试剂抑制或降低特定DLK氨基酸残基的磷酸化，比如SEQIDNO：1(人DLK)第43位的苏氨酸(T43)；SEQIDNO：2(鼠DLK)第43位的苏氨酸；SEQIDNO：1(人DLK)第500位的丝氨酸(S500)；SEQIDNO：2(鼠DLK)第533位的丝氨酸(S533)或其任意组合。在另外的实施方案中，用于本发明方法的试剂抑制特定氨基酸残基的磷酸化，所述特定氨基酸残基为来自其它物种或同种型的DLK中与SEQIDNO：1(人DLK)第43位的苏氨酸(T43)；SEQIDNO：2(鼠DLK)第43位的苏氨酸；SEQIDNO：1(人DLK)第500位的丝氨酸(S500)；SEQIDNO：2(鼠DLK)第533位的丝氨酸(S533)等同的残基和其任意组合。
在其它实施方案中，本发明方法的试剂选自抗体、小分子、多肽和短干扰RNA(siRNA)。在某些实施方案中，所述试剂是抗体。在特定实施方案中，所属抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。
在进一步实施方案中，将用于本发明方法的试剂施用于神经元或其部分。在某些实施方案中，所述神经元或其部分存在于人受试者中、神经移植物或神经移植体中，或是离体的(exvivo)或体外的(invttro)。
在另外的实施方案中，用于本发明方法的试剂是JNK抑制剂和/或所属方法还包括施用其它试剂，所述试剂是JNK抑制剂。在特定实施方案中，所述JNK抑制剂抑制JNK1、JNK2、JNK3或JNK1，JNK2和JNK3的任意组合。在某些实施方案中，用于本发明方法的JNK抑制剂抑制JNK1、JNK2和JNK3；或JNK1和JNK2；或JNK1和JNK3；或JNK2和JNK3。在特定实施方案中，所述JNK抑制剂选自JNK抑制剂V、JNK抑制剂VII(TAT-TI-JIP153-163)、JNK抑制剂VIII和siRNA，其抑制JNK多肽的表达。
在另外的实施方案中，治疗的患者患有选自以下各项的疾病或病症：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森叠加病(Parkinson’s-plusdiseases)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛(trigeminalneuralgia)、舌咽神经痛(glossopharyngealneuralgia)、贝尔麻痹(Bell’sPalsy)、重症肌无力(myastheniagravis)、肌营养不良(musculardystrophy)、进行性肌萎缩(progressivemuscularatrophy)、原发性侧索硬化(primarylateralsclerosis，PLS)、假性延髓性麻痹(pseudobulbarpalsy)、进行性延髓性麻痹(progressivebulbarpalsy)、脊髓性肌萎缩(spinalmuscularatrophy)、遗传性肌萎缩(inheritedmuscularatrophy)、无脊椎动物盘综合征(invertebratedisksyndromes)、颈椎病(cervicalspondylosis)、神经丛疾病(plexusdisorders)、胸廓出口破坏综合征(thoracicoutletdestructionsyndromes)、周围神经病(peripheralneuropathies)、卟啉病(prophyria)、亨廷顿病、多系统萎缩(multiplesystematrophy)、进行性核上性麻痹(progressivesupranuclearpalsy)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration)、路易小体痴呆(dementiawithLewybodies)、额颞叶痴呆(frontotemporaldementia)、脱髓鞘性疾病(demyelinatingdiseases)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)、多发性硬化(multiplesclerosis)、进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease)、朊病毒病(priondisease)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、格-施-沙综合征(syndrome)(GSS)、致死性家族失眠症(fatalfamilialinsomnia，FFI)、牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy)、皮克病(Pick’sdisease)、癫痫(epilepsy)、和AIDS痴呆综合征、慢性疼痛、纤维肌痛(fibromyalgia)、脊柱痛、腕管综合征(carpeltunnelsyndrome)、癌症痛、关节炎、坐骨神经痛、头痛、外科手术疼痛、肌肉痉挛、背痛、内脏痛、损伤疼痛、牙痛、神经痛、比如神经原性或神经病性疼痛、神经炎症或损伤、带状疱疹、椎间盘突出(herniateddisc)、韧带撕裂(tornligament)、和糖尿病、由糖尿病、癌症、AIDS、肝炎、肾功能障碍、科洛拉多蜱传热(Coloradotickfever)、白喉(diphtheria)、HIV感染、麻风(leprosy)、莱姆病(lymedisease)、结节性多动脉炎(polyarteritisnodosa)、类风湿性关节炎、结节病(sarcoidosis)、舍格伦综合征(Sjogrensyndrome)、梅毒(syphilis)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus)、或淀粉样变性(amyloidosis)引起的周围神经病或神经痛、由暴露于毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物、化疗剂、氨苯砜(dapsone)、HIV药物、降胆固醇药物、心脏或血压药物、或甲硝唑(metronidazole)引起的神经损伤、由物理、机械或化学外伤引起的神经系统损伤、神经分裂症(schizophrenia)、妄想性精神障碍(delusionaldisorder)、分裂情感性精神障碍(schizoaffectivedisorder)、精神分裂症样(schizopheniform)、分担类精神障碍(sharedpsychoticdisorder)、精神病(psychosis)、偏执性人格障碍(paranoidpersonalitydisorder)、分裂样人格障碍(schizoidpersonalitydisorder)、边缘型人格障碍(borderlinepersonalitydisorder)、反社会性人格障碍(anti-socialpersonalitydisorder)、自恋性人格障碍(narcissisticpersonalitydisorder)、强迫性障碍(obsessive-compulsivedisorder)、谵妄(delirium)、痴呆(dementia)、心境障碍(mooddisorders)、双相性精神障碍(bipolardisorder)、抑郁症、应激障碍(stressdisorder)、惊恐性障碍(panicdisorder)、广场恐怖症(agoraphobia)、社交恐怖症(socialphobia)、外伤后应激障碍(post-traumaticstressdisorder)、焦虑症(anxietydisorder)、和冲动控制障碍(impulsecontroldisorders)、青光眼、角膜网络状营养不良(latticedystrophy)、色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)、年龄相关的黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光受体变性、其它视网膜变性、光神经玻璃疣、视神经病、和视神经炎。
附图简述
图1体外和体内应激范例中，DLK蛋白水平和分子量响应神经元应激增加。(a)在神经生长因子(NGF)的存在下将胚胎背根神经节(DRG)神经元培养5天并且随后在四个分开的试验中除去NGF3小时。作为响应，DLK量增加并且该增加伴随着DLK迁移率向上迁移。cJun磷酸化(p-cJun)作为DLK激活的下游结果发生。(b)手术后3天收集视神经被挤压的视网膜和其未被挤压的对侧对照。在视网膜神经挤压后，挤压的视网膜中DLK水平和分子量增加3天。(c)视网膜神经挤压模型的示意图，显示视网膜的位置、挤压位点、近端神经和远端神经。(d)在挤压的神经内，仅近端神经中的DLK在神经挤压后经历整个视网膜中观察到的分子量和量的应激依赖性的增加。神经挤压在给定基因型的小鼠上进行并且在24小时后收集神经。WT：C57BL/6.Cre-：DLKlox/DLKlox；Cre-.Cre+：DLKlox/DLKlox；Cre+。在挤压(红色箭头)后在近端神经中可以观察到迁移率的迁移。*：对DLK印迹的神经裂解产物中观察到的背景条带。(e)(a)中显示的-NGF相对+NGF样品的和(b)中显示的挤压的相对未挤压的样品的DLK蛋白量的平均比例。在各个应激范例中，在ImageLab中测量DLK的量并且标准化为肌动蛋白上样对照。在NGF去除样品中，对于条件的各个相邻组采集-NGF和+NGF的DLK比例。在视网膜神经挤压中，对于四只小鼠中的每一只，采集挤压的和未挤压的眼中DLK量的比例。TF去除：平均值＝2.12±0.127。神经挤压：平均值＝1.497±0.157。*通过Mann-WhitneyU检验，将平均值与1相比，P＝0.02。(f)+NGF和-NGF样品中DLK的平均分子量(MW)。在ImageLab中使用分子量分析工具，将DLK的分子量与已知的一组分子量标准进行比较来计算分子量。+NGF：平均值＝115.1±.7723。-NGF：平均值＝120.0±.8050。通过Mann-WhitneyU检验，*P＝0.03。(g)λ蛋白磷酸酶(λpp)处理DRG裂解产物使-NGF和+NGF条件下的DLK分子量相等。所有误差线是平均值的标准误差。
图2在胚胎感觉神经元中，响应于营养因子去除，DLK蛋白被稳定。(a)在-NGF相对+NGF培养条件(蓝色线条)中或在来自3个重复小鼠的挤压的相对未挤压的视网膜(黑色线条)中通过qRT-PCR测量DLK转录本的相对量。误差线是基于三个技术重复的标准偏差。-NGF相对+NGF：1.036±0.0234。小鼠1：0.995±.0315。小鼠2：0.970±.0462。小鼠3：0989±0.040。(b)在5μM放线菌酮的存在下营养因子去除和+NGF对照的8-小时时间进程。(c)(b)中进行的实验的三个重复试验的定量。相对于肌动蛋白上样对照对各个时间点的条带进行定量，并且计算各个时间点的平均条带强度并除以t＝0时的强度。绘制的是与在时间0的量相比在给定时间残留的DLK的相对量。误差线是标准偏差。每个时间过程匹配于GraphPadPrism软件中的线。当用ANCOVA比较两条线的斜率时，*P＝0.0109。(d)将DRGs用给定条件处理三小时并裂解。OA：200nM大田软海绵酸(okadaicacid)。MG132以30μM使用。
图3泛素-蛋白酶体系统以应激依赖性的方式调节DLK水平。(a)通过营养因子去除来减少DLK泛素化。收集除去NGF的和对照DRGs并在3小时的处理后裂解。将泛素化的蛋白从裂解产物免疫沉淀并且将免疫沉淀对DLK和泛素印迹。使用小鼠IgG对照作为阴性对照以证明抗体特异性。(b)在NGF去除后在USP9Xloxp/loxpCre-和Cre+胚胎DRGs中对DLK、USP9X、p-cJun和微管蛋白的蛋白质印迹。(c)对于DLK和USP9X的印迹的定量显示在(b)中。USP9X(左图)的～95％的丧失导致DLK水平的总体降低，但是不改变+和-NGF条件中DLK的相对水平(右图：Cre+相对于Cre-的倍数改变)。(d)与Phr1WT相比，在Phr1mag功能丧失的突变体中，+NGF条件中DLK蛋白水平升高。尽管有该增加，在Phr1mag突变体中p-cJun的下游激活未受影响。(e)对Tuj上样对照标准化的(d)中显示的DLK印迹的定量。(f)泛素化蛋白的免疫沉淀表明，DLK在Phr1mag/mag纯合子中比在PhrWT/mag杂合子对照中更少泛素化。左图：用抗-泛素(“Ub”)免疫沉淀接着对DLK印迹。用小鼠IgG的免疫沉淀用作对抗体特异性的对照。括号：强调Phr1mag杂合子和纯合子之间观察到的主要不同：敲除小鼠中缺少多泛素化的DLK。右图：输入的裂解产物对DLK和微管蛋白的印迹。尽管有更多DLK存在于输入量中的事实，但通过抗-泛素抗体拉下更少的DLK。
图4DLK稳定化依赖于DLK活性和DLK的下游靶点。(a)HEK293T细胞的瞬时转染表明，DLK的激酶失活(dead)版本(S302A)以比野生型DLK更低的水平表达。用USP9X共转染拯救该效果。(b)和与GFP表达构建体共转染相比，DLK与显性阴性的N末端标记有myc表位的DLK亮氨酸拉链结构域构建体(myc-DLK-LZ)共转染，降低DLK表达。(c)在具有可诱导dox的DLK表达构建体的稳定细胞中用两种不同JNK抑制剂(JNK8和JNK7，均为10μM)抑制JNK活性，减少DLK表达。(d)JNK2KO背景下敲除JNK3阻断在胚胎DRGs中利用NGF去除所观察到的DLK量的增加。(e)在神经挤压后18小时，JNK2/3双敲除视网膜不具有如在来自同窝出生的对照的挤压的视网膜中观察到的，通过更高分子形式(箭头)测定的激活的DLK。
图5鉴定鼠DLK中磷酸化状态受DLK或JNK活性调节的磷酸化位点。(a)在用于质谱的重和轻SILAC条件下，DLK在293T细胞中的表达。表达后，将Flag-标记的DLK免疫沉淀(IP)并且将给定条件的IPs合并用于DLK中磷酸化位点的比率分析。WTDLK：野生型DLK。DLKS302A：激酶失活点突变体。CA-JNK：组成型活性的JNK构建体(参见方法)。JNKi：JNK抑制剂8，10μM。OA：大田软海绵酸，200nM。(b)DLK结构域和指出的磷酸化位点的位置的示意图。编号基于鼠DLK。N-term：DLK的N-末端结构域。激酶结构域：催化的DLK结构域。LZ：亮氨酸拉链基序。C-term：C-末端结构域。根据参考文献Holzman，L.B.，Merritt，S.E＆Fan，G.TheJournalofbiologicalchemistry269，30808-30817(1994)排列结构域。(c)鉴定的磷酸化位点改变的概述。列出的位点表明不同条件中最大效果和一致性，或在S295-T306的情况下，是激酶激活环内的已知位点。∞：该位点的磷酸化在条件A中观察到，但在条件B中未观察到。N/A：该位点磷酸化在任何条件中均未观察到。给出的数字是条件A相对条件B中位点磷酸化的倍数改变，并且上或下箭头表明改变的方向(例如，对于顶部右侧框，T43的磷酸化在表达DLK的大田软海绵酸-处理的细胞中比不用大田软海绵酸的表达DLK的细胞中高7.78倍)。*：该位点含有苏氨酸(T)或丝氨酸(S)，随后是脯氨酸。在大多数MAPK磷酸化位点中发现侧翼连接的脯氨酸。标题为“与JNK假设匹配？”的栏概述了横跨四个条件的磷酸化模式是否与由JNK导致的该位点的磷酸化发生并且是DLK的稳定化的原因的假设相匹配。核对符号：磷酸化模式与该假设一致。～：磷酸化模式与该假设部分一致。x：磷酸化模式与该假设不一致。对于S643，10.3的Ascore以～90％置信度证实在前的丝氨酸。具有小于13的Ascores的磷酸化位点通常被认为定位不清楚，但是因为S643是四个连续丝氨酸中的最后一个并且位于仅邻脯氨酸，我们得出结论，磷酸化在该位点发生并且不是S642。对于最后一行(S295-T306)，在该肽上检测到两个磷酸化的残基，但是因为缺少决定离子的位点，不能清楚地分配单个、双重修饰的序列。鉴于可能的置换数，可能存在多个多磷酸肽序列。因此，对于该双重修饰的序列的数据合计显示，而不是由位点具体显示。
图6神经元应激后，鉴定的位点是磷酸化的(a)对来自HEK293T细胞的裂解产物的蛋白质印迹，其中野生型DLK(DLKWT)和给定的不能磷酸化的(phosphoincompetent)点突变体瞬时表达。p-T43，p-S272，p-S533：用磷酸化特异性抗体对这些位点中的每个进行印迹。(b)DLKT43和DLKS533可以直接被JNK磷酸化。将纯化的DLKS302A与(右侧泳道)或不与(左侧泳道)纯化的JNK3孵育并且用所示的磷酸化特异抗体印迹。(c)对来自除去营养因子的感觉神经元的裂解产物的蛋白质印迹表明，抗磷酸化T43免疫反应性在-NGF条件下出现。用λ蛋白磷酸酶处理表明抗体对磷酸化的蛋白的特异性。(d)印迹来自DLKloxp/loxpCre-和Cre+胚胎的除去营养因子的DRGs表明，抗-p-T43抗体是对DLK特异的。(e)从挤压的视网膜裂解产物和未挤压对照免疫沉淀DLK，接着用磷酸化-T43和磷酸化-S533-特异的抗体印迹，表明这些位点在视神经挤压后是磷酸化的。左图：对免疫沉淀的输入表明随神经挤压DLK水平和磷酸化的增加(明显的分子量迁移)。右图：使用抗-DLK或对照兔IgG从挤压的裂解产物或未挤压对照免疫沉淀，接着用给定抗体印迹。
图7DLK以剂量依赖的方式调节下游促凋亡信号传导。(a)DLK+/+(WT)和DLK+/-(het)DRGs中营养因子去除的时间进程揭示，杂合神经元中DLK蛋白水平的降低导致降低的JNK和cJun的下游激活。(b，d)在DLK+/+和DLK+/-小鼠中神经挤压的视网膜的染色，和(c，e，f)显示的染色的定量。(b，c)挤压后6小时p-cJun。显示的定量是每个视网膜p-cJun阳性细胞的平均数量。通过student’st检验，*P＝0.0014。WT的平均值＝2291±299。het的平均值＝689±97.6。n＝7只WT和5只het动物。(d)挤压后3天胱天蛋白酶-3和Brn3染色(e)定量每个视网膜中胱天蛋白酶-3-阳性细胞的平均数量。通过student’st检验，*P＝0.0001。WT的平均值＝823±36。het的平均值＝79±20。n＝4只WT和3只het动物。(f)在挤压的相对未挤压视网膜中每个视网膜的Brn3-阳性细胞比例的定量。通过student’st检验，*P＝.0253。WT平均值＝0.27±0.086。het平均值＝0.56±0.017。误差线是平均值的标准误差。n＝5只WT和4只het动物。比例尺＝100μm。
图8DLK凝胶迁移率随神经元应激的观察。(a)注射有AAV-Cre病毒的来自野生型(WT)和DLKloxp/loxp(loxp)小鼠的3-天挤压的视网膜裂解产物的印迹。在野生型视网膜中以成对的形式(红色箭头)观察到DLK凝胶迁移率位移，但是这在loxp小鼠中未观察到。因为loxp小鼠在视网膜神经节细胞中仅具有重组的Dlk，这表明，与视网膜神经挤压一起出现的上条带(红色箭头)具体是由于视网膜神经节细胞中DLK的磷酸化。(b)利用两种不同运行缓冲液的SDS-PAGE中DLK的迁移率的差异。MOPS缓冲液：含有MOPS的SDS-PAGE运行溶液作为缓冲液。MES缓冲液：含有MES的SDS-PAGE运行溶液作为缓冲液。
图9USP9X活性不随营养因子去除而改变。将+和-NGF-处理的DRGs与HA-标记的泛素乙烯基砜(其共价结合于去泛素化酶(DUBs)的活性位点)孵育，表明利用营养因子去除，USP9X活性无改变。抑制DUB的N-乙基马来酰亚胺(NEM)用作阴性对照。
图10在Phr1KO神经元中，NGF去除后感觉神经元轴突变性的时间进程无差异。从野生型或Phr1敲除同窝胚胎培养胚胎DRGs并在3天后体外除去NGF。18小时后，两种培养物同等地退化，如通过微管蛋白染色看到的。
图11视神经挤压后细胞生存力、完整轴突结构和视网膜中神经元应激信号传导的激活的表征。(a)在挤压后两周对Brn3、γ-突触核蛋白和神经丝-M(NF-M)染色，与未挤压野生型对照相比较。(b)手术后24小时野生型和DLK杂合视网膜中的p-cJun染色。在此时间点在野生型和杂合视网膜之间未观察到p-cJun染色的显著差异。
图12对于视网膜裂解产物样品上总JNK、JNK2和JNK3的印迹。在JNK2/3双敲除中观察到免疫反应性丧失。
发明实施方案详述
I.定义
如本文使用的术语“双亮氨酸拉链激酶(dualleucinezipperkinase)”或“DLK”，除非另有说明，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然的DLK，所述脊椎动物来源包括哺乳动物比如灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。术语包括“全长”，未加工的DLK以及由在细胞中加工而产生的DLK的任何形式，包括由DLK前体-mRNA编码的各种多肽同种型、天然存在的DLK变体(例如，剪接的变体或等位基因变体)和本领域已知的DLK的翻译后修饰的加工形式。DLK的一种这样的变体实例包括同种型2(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q12852-2)。DLK也以名称“有丝分裂原-激活的蛋白激酶激酶激酶12”、“MAP3K12”、“带有双亮氨酸拉链的激酶”，“亮氨酸拉链蛋白激酶”(ZPK)和“MAPK-上游激酶”(MUK)而为人所知。人DLK长度为859个氨基酸，如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q12852中所述的，并且通过引用并入本文。对于人DLK的示例性氨基酸序列如下：
MACLHETRTPSPSFGGFVSTLSEASMRKLDPDTSDCTPEKDLTPTHVLQLHEQDAGGPGGAAGSPESRASRVRADEVRLQCQSGSGFLEGLFGCLRPVWT
MIGKAYSTEHKQQQEDLWEVPFEEILDLQWVGSGAQGAVFLGRFHGEEVAVKKVRDLKETDIKHLRKLKHPNIITFKGVCTQAPCYCILMEFCAQGQLYEVLRAGRPVTPSLLVDWSMGIAGGMNYLHLHKIIHRDLKSPNMLITYDDVV
KISDFGTSKELSDKSTKMSFAGTVAWMAPEVIRNEPVSEKVDIWSFGVVLWELLTGEIPYKDVDSSAIIWGVGSNSLHLPVPSSCPDGFKILLRQCWNSK
PRNRPSFRQILLHLDIASADVLSTPQETYFKSQAEWREEVKLHFEKIKSEGTCLHRLEEELVMRRREELRHALDIREHYERKLERANNLYMELNALMLQLELKERELLRREQALERRCPGLLKPHPSRGLLHGNTMEKLIKKRNVPQKLS
PHSKRPDILKTESLLPKLDAALSGVGLPGCPKGPPSPGRSRRGKTRHRKASAKGSCGDLPGLRTAVPPHEPGGPGSPGGLGGGPSAWEACPPALRGLHHDLLLRKMSSSSPDLLSAALGSRGRGATGGAGDPGSPPPARGDTPPSEGSAPGSTSPDSPGGAKGEPPPPVGPGEGVGLLGTGREGTSGRGGSRAGSQHLTPAALLYRAAVTRSQKRGISSEEEEGEVDSEVELTSSQRWPQSLNMRQSLSTFSSENPSDGEEGTASEPSPSGTPEVGSTNTDERPDERSDDMCSQGSEIPLDPPPSEVIPGPEPSSLPIPHQELLRERGPPNSEDSDCDSTELDNSNSVDALRPPASLPP(SEQIDNO：1).
鼠DLK长度为888个氨基酸，如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q60700中所述，并且其通过引用并入本文。对于鼠DLK的示例性氨基酸序列如下：
MACLHETRTPSPSFGGFVSTLSEASMRKLDPDTSDCTPEKDLTPTQCVLRDVVPLGGQGGGGPSPSPGGEPPPEPFANSVLQLHEQDTGGPGGATGSPESRASRVRADEVRLQCQSGSGFLEGLFGCLRPVWTMIGKAYSTEHKQQQEDLWEVPFEEILDLQWVGSGAQGAVFLGRFHGEEVAVKKVRDLKETDIKHLRKLKHPNIITFKGVCTQAPCYCILMEFCAQGQLYEVLRAGRPVTPSLLVDWSMGIAGGMNYLHLHKIIHRDLKSPNMLITYDDVVKISDFGTSKELSDKSTKMSFAGTVAWMAPEVIRNEPVSEKVDIWSFGVVLWELLTGEIPYKDVDSSAIIWGVGSNSLHLPVPSSCPDGFKILLRQCWNSKPRNRPSFRQILLHLDIASADVLSTPQETYFKSQAEWREEVKLHFEKIKSEGTCLHRLEEELVMRRREELRHALDIREHYERKLERANNLYMELNALMLQLELKERELLRREQALERRCPGLLKSHPSRGLLHGNTMEKLIKKRNVPQKLSPHSKRPDILKTESLLPKLDAALSGVGLPGCPKGPPSPGRSRRGKTRHRKASAKGSCGDLPGLRAALPPHEPGGLGSPGGLGVGPSAWDACPPALRGLHHDLLLRKMSSSSPDLLSAALGARGRGATG
GARDPGSPPPPQGDTPPSEGSAPGSTSPDSPGGAKGEPPPPVGPGEGVGLLGTGREGTAGRGGNRAGSQHLTPAALLYRAAVTRSQKRGISSEEEEGEVDSEVELPPSQRWPQGPNMRQSLSTFSSENPSDVEEGTASEPSPSGTPEVGSTNTDERPDERSDDMCSQGSEIPLDLPTSEVVPEREASSLPMQHQDGQGPNPEDSDCDSTELDNSNSIDALRPPASLPP(SEQIDNO：2).
术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们呈现出所需的抗原-结合活性即可。
“抗体片段”是指不是完整抗体，而是包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的部分的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
作为参考抗体的“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中以50％以上阻断参考抗体对其抗原的结合的抗体，并且相反，参考抗体在竞争测定中以50％以上阻断抗体对其抗原的结合。示例性的竞争测定在本文中提供。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体：其中部分源自特定来源或物种的重链和/或轻链的，同时重链和/或轻链的剩余部分来自不同来源或物种。
试剂，例如药物制剂的“有效量”，是指在剂量给药时和对于必须的时期有效取得所需治疗或预防结果的量。
“人抗体”是拥有对应于由人或人细胞产生的或源自利用人抗体组库(repertoires)或其他人抗体-编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。该人抗体的定义具体排除了包含非人抗原-结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非-人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一种，并且通常两种可变结构域，其中所有或基本上所有HVRs(例如，CDRs)对应于非-人抗体的那些，并且全部或基本上全部FRs对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包含至少部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体(例如，非-人抗体)的“人源化形式”是指经历人源化的抗体。
“个体”或“患者”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类比如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或患者或受试者是人。
“分离的”抗体是从其天然环境中分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如，电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定。对于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上均质的抗体群体的抗体，即，包含所述群体的个体抗体相同和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的制备过程中产生，这种变体通常小量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各个单克隆抗体针对抗原的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明作为基本上获自均质的抗体群体的抗体的特征，并且不被看作是需要通过任何特定的方法制备所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这种方法和其它用于制备单克隆抗体的示例性方法在本文中描述。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的使用说明，其含有关于适应证、用途、剂量、施用、联合治疗、禁忌证和/或关于使用这种治疗性产品的警告的信息。
术语“药物制剂”是指这样的形式的制剂：其允许包含在其中的活性成分的生物活性有效，并且其不含有对于将要施用所述制剂的受试者而言有不可接受的毒性的其它成分。
“药用载体”是指药物制剂中非活性成分的成分，其对受试者无毒。药用载体包括，但不限于，缓冲液、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文使用的，“治疗(treatment)”(和其语法上的变化形式比如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理进程过程中进行。治疗的所需效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理结果的减弱、预防转移、降低疾病进展速度、疾病状态的改善或缓和以及减轻或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于推迟疾病的发生或减缓疾病的进程。
术语“短干扰RNA(siRNA)”是指干扰基因表达的小的双链RNAs。siRNAs是RNA干扰(双链RNA沉默同源基因的过程)的传递者。siRNAs通常包含两条长为约15-25个核苷酸的单链RNA，其形成双链体，其可以包含单链突出。通过酶复合体例如，聚合酶对双链RNA的加工，产生双链RNA的切割，从而产生siRNAs。RNA干扰(RNAi)沉默复合体使用siRNA的反义链引导mRNA切割，从而促进mRNA降解。为了使用siRNAs例如，在哺乳动物细胞中沉默特定基因，选择碱基对区域以避免对不相关mRNA的机会性互补。在本领域中已经比如，例如，由Fire等人，Nature391：806-81(1998)和McManus等人，Nat.Rev.Genet.3(10)：737-747(2002)鉴定了RNAi沉默复合体。
术语“干扰RNA(RNAi)”用于本文，是指导致特定mRNAs的催化降解的双链RNA，并且因此可以用于抑制/降低特定基因的表达。
如本文使用的措词“预防轴突变性”、“预防神经元变性”、“预防神经元的变性”、“抑制神经元的变性”、“抑制轴突变性”或“抑制神经元变性”包括(i)在新诊断为具有神经变性疾病或病症或出于发生新的神经变性疾病或病症的患者中抑制或预防轴突或神经元变性的能力和(ii)在已经患有神经变性疾病或病症或具有神经变性疾病或病症的症状的患者中抑制或预防进一步轴突或神经元变性的能力。预防轴突或神经元变性包括降低或抑制轴突或神经元变性，其可以以完全或部分抑制神经元或轴突变性为特征。这可以例如，通过分析神经系统功能来评价。以上列出的术语还包括体外和离体的方法。此外，措词“预防神经元变性”和“抑制神经元变性”包括关于整个神经元或其部分，比如神经元细胞体、轴突、和树突的这种抑制。与不接受一种以上本文所述试剂的对照受试者或群体相比，施用一种以上如本文中描述的试剂可以导致在受试者或群体中以下疾病的一种以上(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、或9)症状中至少的10％的减少(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或甚至100％的减少)：神经系统病症；继发于在神经系统外具有主要效果的疾病、病状、或治疗的神经系统病症；物理、机械或化学外伤引起的对神经系统的损伤；疼痛，视觉相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病(例如，震颤、运动缓慢、共济失调、平衡缺失、抑郁、减少的认知功能、短期记忆丧失、长期记忆丧失、精神混乱、人格改变、语言困难、感官知觉丧失、对触摸敏感、四肢麻木、肌无力、肌肉瘫痪、肌肉痛性痉挛、肌肉痉挛、饮食习惯显著改变、过度恐怖或担心、失眠、妄想、幻觉、疲劳、背痛、胸痛、消化问题、头痛、快速心律、头晕、视力模糊、视觉阴影或视觉区域缺失、视物变形症、彩色视觉障碍、暴露于强光后降低的视觉功能恢复、和视觉对比敏感度的丧失)。与未施用一种以上本文所述的试剂的神经元群体或受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突、或树突)的数量相比，施用一种以上本文所述的试剂可以导致神经元群体中或受试者中变性的神经元(其神经元体、轴突、或树突)数量至少10％的减少(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或甚至100％的减少)。与不用一种以上本文所述试剂治疗的对照受试者或群体相比，施用一种以上本文所述的试剂可以导致受试者或受试者群体中发生为以下疾病的可能性至少10％的降低(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或甚至100％的降低)：神经系统疾病；继发于在神经系统外具有主要效果的疾病、病状、或治疗的神经系统病症；物理、机械或化学外伤引起的对神经系统的损伤；疼痛，视觉相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。
如本文使用的术语“施用”是指将神经元或其部分与本文所述的试剂接触。这包括将试剂施用于其中存在所述神经元或其部分的受试者，以及将试剂引入其中培养有神经元或其部分的培养基中。
如本文使用的术语“神经元”表示神经系统细胞，所述神经系统包括中央细胞体或胞体，和两种类型的延伸或突出：树突，通常多数神经元信号通过树突传递至细胞体，和轴突，通常多数神经元信号从细胞提通过轴突传递至效应细胞，比如目标神经元或肌肉。神经元可以将信息从组织或器官传递至中枢神经系统(传入或感觉神经元)并且将信号从中枢神经系统传递至效应细胞(传出或运动神经元)。中枢神经系统(脑和脊柱)内其它神经元，命名为中间神经元联结神经元。可以根据本发明进行治疗的神经元类型的某些具体实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、视网膜神经节细胞、视网膜视神经和皮质神经元。
“与”一种以上其它治疗剂“联合”施用包括同时(同时发生)和以任意顺序连续施用。
如本文使用的，术语“神经元应激”意为向神经元施加应激比如，但不限于，疾病、损伤、缺血、兴奋毒性、轴突横断、UV辐射、用细胞因子刺激、神经酰胺暴露、或缺少神经生长因子。神经元应激可以导致神经元变性和细胞死亡，包括由在神经元中激活凋亡信号传导级联导致的。
如本文使用的术语“应激依赖性DLK活性，”意为响应神经元应激的DLK激活。
如本文使用的术语“促凋亡DLK活性，”意为会促进或诱导神经元中凋亡信号传导级联的DLK激活。
II.方法
在一个方面，本发明部分基于DLK响应神经元中应激或损伤而被磷酸化的发现。DLK磷酸化的增加导致DLK的稳定化和损伤的或应激的神经元中DLK蛋白水平的增加。DLK中某些氨基酸残基响应神经元应激或损伤被磷酸化并且对于增加的DLK稳定性和对于轴突变性和神经元凋亡所必需的DLK的最终应激-依赖性或促凋亡活性是重要的。
因此，本发明包括通过使用抑制或降低DLK磷酸化的试剂从而降低DLK稳定性的来预防或抑制神经元变性的方法。此外，本发明包括抑制或降低DLK的某些氨基酸残基的磷酸化从而降低DLK稳定性的方法。在其它方面，本发明包括用于降低神经元中DLK稳定性的方法，所述方法包括向神经元或其部分施用抑制或降低DLK磷酸化的试剂并且在某些情况下，所述试剂抑制DLK的某些氨基酸残基的磷酸化，其中磷酸化的降低导致DLK稳定性的降低.
本发明还包括用于检测神经元中应激依赖性或促凋亡活性的方法，所述方法包括将生物样品与特异识别DLK的磷酸化形式的抗体接触并检测所述抗体对DLK的磷酸化形式的结合，其中抗体结合DLK的磷酸化形式，表明或表示应激依赖性或促凋亡DLK活性。
用于本发明方法的神经元或其部分包括选自由以下组成的组的神经元：小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮质神经元、交感神经元、视网膜神经节细胞、视网膜视神经和海马神经元。
用于本发明方法的试剂包括DLK磷酸化的抑制剂。此外，用于本发明方法的试剂例如选自由以下组成的组：抗体、多肽、肽、肽体(peptibodies)、核酸分子、短干扰RNAs(siRNAs)、多核苷酸、适体、小分子和多糖。在抗体的情况中，抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或抗体片段(例如，Fv、Fab、Fab′、或F(ab′)2片段)。
用于本发明方法的其它试剂包括磷酸化DLK比如JNK的蛋白的抑制剂。非限制性实例包括JNK1，JNK2和/或JNK3的抑制剂。另外的实例包括JNK1和JNK2；JNK1和JNK3；JNK1和JNK3；JNK2和JNK3；以及JNK1、JNK2和JNK3的抑制剂。这种JNK抑制剂包括但不限于JNK抑制剂V、JNK抑制剂VII(TAT-TI-JIP153-163)、JNK抑制剂VIII，SC-202673、SY-CC-401、SP600125、AS601245、和XG-102、以及来自EMDBiosciences的目录编号420119、420130、420131、420123、420116、420118、420136、420129、420135、420134、420133、420140、和420128以及抑制JNK1、JNK2、JNK3或其任意组合的表达的siRNA。例如靶向各种JNKs的siRNA序列包括TTGGATGAAGCCATTAGACTA(SEQIDNO：3))的JNK1序列、ACCTTTAATGGACAACATTAA(SEQIDNO：4)或AAGGATTAGCTTTGTATCATA(SEQIDNO：5))的JNK2序列，和CCCGCATGTGTCTGTATTCAA(SEQIDNO：6))的JNK3序列。
在某些实施方案中，本发明方法中的神经元或其部分存在于受试者，比如人受试者中。所述受试者，例如，正发生为选自由以下组成的组的疾病或病症或处于发生为选自由以下组成的组的疾病或病症的分险中：(i)神经系统疾病，(ii)继发于在神经系统外具有主要效果的疾病、病状、或治疗的神经系统病症，(iii)物理、机械或化学外伤引起的对神经系统的损伤，(iv)疼痛，(v)视觉相关的神经变性，(vi)记忆丧失，和(vii)精神疾病。
神经系统疾病的实例包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假性延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、遗传性肌萎缩、无脊椎动物盘综合征、颈椎病、神经丛疾病、胸廓出口破坏综合征、周围神经病、卟啉病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、帕金森病叠加病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、路易小体痴呆、额颞叶痴呆、脱髓鞘性疾病、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、进行性神经性腓骨肌萎缩症、朊病毒病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、格-施-沙综合征(GSS)、致死性家族失眠症(FFI)、牛海绵状脑病、皮克病、癫痫(epilepsy)、和AIDS痴呆综合征。
疼痛的实例包括慢性疼痛、纤维肌痛、脊柱痛、腕管综合征、癌症痛、关节炎、坐骨神经痛、头痛、外科手术疼痛、肌肉痉挛、背痛、内脏痛、损伤疼痛、牙痛、神经痛比如神经原性或神经病性疼痛、神经炎症或损伤、带状疱疹、椎间盘突出、韧带撕裂和糖尿病。
继发于在神经系统外具有主要效果的疾病、病状、或治疗的神经系统病症的实例包括由糖尿病、癌症、AIDS、肝炎、肾功能障碍、科洛拉多蜱传热、白喉、HIV感染、麻风、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、结节病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮、和淀粉样变性引起的周围神经病或神经痛。
物理、机械或化学外伤引起的对神经系统的损伤实例包括由暴露于毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物、化疗剂、氨苯砜、HIV药物、降胆固醇药物、心脏或血压药物、和甲硝唑引起的神经损伤。其它实例包括烧伤、创伤、外科手术、事故、缺血、长期暴露于寒冷温度、卒中、颅内出血、和脑出血。
精神疾病的实例包括神经分裂症、妄想性精神障碍、分裂情感性精神障碍、精神分裂症样、分担类精神障碍、精神病、偏执性人格障碍、分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会性人格障碍、白恋性人格障碍、强迫性障碍、谵妄、痴呆、心境障碍、双相性精神障碍、抑郁症、应激障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社交恐怖症、外伤后应激障碍、焦虑症、和冲动控制障碍。
视觉相关的神经变性的实例包括青光眼、角膜网络状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关的黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光受体变性、其它视网膜变性、光神经玻璃疣、视神经病和视神经炎。青光眼的实例包括原发性青光眼(primaryglaucoma)、低压青光眼(low-tensionglaucoma)、原发性闭角型青光眼(primaryangle-closureglaucoma)、急性闭角型青光眼(acuteangle-closureglaucoma)、慢性闭角型青光眼(chronicangle-closureglaucoma)、间歇性闭角型青光限(intermittentangle-closureglaucoma)、慢性开角型青光眼(chronicopen-angleclosureglaucoma)、色素性青光眼(pigmentaryglaucoma)、录脱性青光眼(exfoliationglaucoma)、发展性青光眼(develepmentalglaucoma)、继发性青光眼(secondaryglaucoma)、晶状体溶解性青光眼(phacogenicglaucoma)、继发于眼内出血的青光眼(glaucomasecondarytointraocularhemorrhage)、外伤性青光眼(traumaticglaucoma)、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、药物诱发的青光眼(drug-inducedglaucoma)、毒性青光眼(toxicglaucoma)、和与眼内肿瘤视网膜脱落、严重的眼部化学烧伤和虹膜萎缩(irisatrophy)相关的青光眼。
在某些实施方案中，根据本发明的方法，将神经元或其部分与试剂接触，包括向受试者施用包含所述试剂的药物组合物。施用通过例如，静脉内输注；通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径注射；或外用或眼部施用来进行。此外，本发明的方法包括向受试者施用一种以上其它的试剂。
在其它实例中，根据本发明的方法治疗的神经元或其部分是离体的或体外的(例如，神经移植物或神经移植体)。
本发明还包含鉴定用于抑制神经元或其部分变性的试剂的方法。这些方法包括在轴突或神经元变性测定(例如，抗-神经生长因子(NGF)抗体、去血清/KCl降低、视网膜视神经挤压和/或鱼藤酮治疗)中将神经元或其部分与候选试剂接触。在候选试剂的存在下，相对于对照，检测出降低的神经元或其部分的变性，表明鉴定出了用于抑制神经元或其部分变性的试剂。候选试剂，例如，选自由以下组成的组：抗体、多肽、肽、肽体、核酸分子、短干扰RNAs(siRNAs)、多核苷酸、适体、小分子、和多糖。
A.鉴定和表征用于本发明方法的试剂的筛选测定
本发明部分基于应激诱导的或神经元损伤诱导的DLK磷酸化导致DLK的稳定性和最终促凋亡DLK活性的发现。
本发明包括通过使用本文所述的抑制或降低DLK磷酸化的试剂抑制和/或预防神经元或轴突变性的方法。如本文所述，比如在神经系统疾病或神经系统损伤的治疗中，方法在体内(invivo)进行。比如在神经元功能的实验室研究和神经移植物或移植体的治疗中，所述方法在体外(invitro)或离体(exvivo)进行。
用于本发明方法的试剂在本文中描述。其它用于本发明的试剂可以使用下文总结的标准筛选方法鉴定。
除了这里描述的试剂之外，其它用于本发明方法的抑制或降低DLK的磷酸化和抑制或预防神经元变性的试剂可以使用以下测定和测定的组合来筛选。除了下文描述的测定(对于其，读出(read-out)是DLK的磷酸化或神经元或轴突变性的抑制)之外，本发明还应用针对检测仅结合或检测DLK的某些磷酸化形式的试剂的测定。因此，本发明包括使用鉴定结合DLK的特定磷酸化形式或与DLK的特定磷酸化形式复合的化合物的筛选测定。
在结合测定中，相互作用是结合，并且形成的复合体可以在反应混和物中被分离或检测。在特定实施方案中，目标多肽或试剂候选物通过共价或非共价连接被固定在固相上，例如，固定在微孔板上。非共价连接通常通过用多肽溶液包被固体表面并干燥来完成。备选地，特异于要固定的目标多肽的固定的抗体，例如，单克隆抗体，可以用于将其锚定在固体表面。测定通过将未固定的成分(其可以用检测标记来标记)加入固定的成分，例如含有锚定成分的包被表面来进行。当反应完全时，例如，通过洗涤去除未反应的成分，并且检测锚定在固体表面上的复合体。当最初未固定的成分携带检测标记时，检测出固定在表面上的标签，表明发生复合。在最初未固定的成分不携带标签的情况下，可以例如，通过使用标记的特异结合固定的复合体的抗体检测复合。
此外，用于测量候选试剂对蛋白激酶活性的影响的测定是本领域已知的，并且包括直接磷酸化测定，通常通过放射标记的磷酸盐、针对底物的磷酸化-特异的抗体、和基于细胞的测量激酶活性的下游影响(例如，激活报告基因)的测定来体现。除了基于荧光偏振的备选测定之外，这些主要策略可以以小规模或高通量用于鉴定、确认、或表征、抑制剂(参见，例如，Favata等人，J.Biol.Chem.273：18623-18632，1998；Parker等人，J.Biomol.Screening5：77-99，2000；Singh等人，Comb.Chem.HighThroughputScreen8：319-325，2005；Garton等人，Meth.Enz.439：491-500，2008；andKupchko等人，Anal.Biochem.317：210-217，2003)。
本文具体讨论的筛选测定仅是为了说明。可以根据特定靶点和试剂类型(例如，抗体、多肽、肽、非肽小有机分子、核酸分子等)来选择的多种其它测定，对于本领域技术人员而言是公知的并且也可以用于本发明。
本文所述的测定还可以用于筛选化合物文库，包括但不限于，化学文库、天然产物文库(例如，微生物、动物、植物等的集合)、和包含随机肽、寡核苷酸或小有机分子的组合文库。在特定实施方案中，本文中的测定用于筛选抗体文库，包括但不限于，初次进行实验的人、重组、合成、和半合成抗体文库。所述抗体文库可以，例如，是噬菌体展示文库，包括单价文库(平均每个噬菌体粒子展示一种单链抗体或抗体片段)，和多价文库(平均每个病毒粒子展示两种以上抗体或抗体片段)。然而，要根据本发明筛选的抗体文库不限于噬菌体展示文库。其它展示技术包括，例如，核糖体或mRNA展示(Mattheakis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：9022-9026，1994；Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：4937-4942，1997)，微生物细胞展示，比如细菌展示(Georgiou等人，NatureBiotech.15：29-34，1997)，或酵母细胞展示(Kieke等人，蛋白Eng.10：1303-1310，1997)，在哺乳动物细胞上展示，孢子展示，病毒展示，比如逆转录病毒展示(Urban等人，NucleicAcidsRes.33：e35，2005)，基于蛋白-DNA连接的展示(Odegrip等人，Proc.Acad.Natl.Sci.U.S.A.101：2806-2810，2004；Reiersen等人，NucleicAcidsRes.33：e10，2005)，和微珠展示(Sepp等人，FEBSLett.532：455-458，2002)。
上文描述的测定中获得结果可以在神经元和/或轴突变性的体外和/或体内测定中证实。备选地，神经元和/或轴突变性的体外和/或体内测定可以用作初步测定以鉴定本文所述的抑制剂和拮抗剂。
i)基于细胞的和体外神经元或轴突变性测定
在试剂被证实为降低或抑制DLK磷酸化时，可以在如本文所述的神经元或轴突变性模型中，以及在适当的动物模型系统中测试抑制剂。
用于鉴定和表征抑制或降低DLK磷酸化并且因此抑制神经元或轴突变性的其它试剂的，并且可以用于本发明方法的示例性的测定，简述如下。
用于确认降低或抑制DLK磷酸化，同样抑制神经元或轴突变性的试剂，以及用于鉴定在本发明方法中使用的其它试剂的测定，在以下实例中详细描述并且简要总结如下。这些测定包括(i)抗-神经生长因子(抗-NGF)抗体测定，(ii)去血清/氯化钾(KCI)降低测定，(iii)鱼藤酮变性测定，(iv)视网膜视神经挤压和(iv)长春新碱变性测定。本领域中已知的另外的评价神经元或轴突变性的测定也可用于本发明。
NGF是小的，分泌蛋白，包括在靶神经元的分化和存活中。用NGF处理培养的神经元导致轴突增殖，同时，用抗-NGF抗体处理该神经元导致轴突变性。用抗-NGF抗体处理神经元还导致多种可通过显微镜检测的不同形态学改变，并且其可以被监测以观察候选抑制剂的效果。这些改变包括静脉曲张形成、加长的线粒体的丧失、静脉曲张中线粒体的积累、细胞骨架解体和轴突片段化。被发现抵消由抗-NGF抗体引起的所述形态学改变中的任一种的试剂可以被认为是神经元或轴突变性的候选抑制剂，如果需要，其可以在其它系统，比如本文中所述的那些中测试。此外，如在实施例1中所述和在例如，图1-3中所说明的，NGF去除导致DLK蛋白的增加。因此，被发现预防DLK蛋白的增加试剂可以被认为是用于本发明方法的候选试剂。
去血清/KCl降低测定基于从小鼠(例如，P7小鼠)脑分离的小脑颗粒神经元(CGN)的培养物的使用。在该测定中，将神经元培养在含有KCl的培养基中并且随后切换为含有更少KCl的培养基(包含5mMKCl的BasalMediumEagles)，其诱导神经元变性。被发现在去除KCl时阻断或降低神经元变性(其可以通过例如用神经元标志物(例如，抗-III型β-微管蛋白)染色的固定神经元的图像分析来检测)的试剂，可以被认为是神经元或轴突变性的候选抑制剂，如果需要，其可以在其它系统，比如本文中所述那些中测试。
另一种神经元或轴突变性的模型包括将培养的神经元与鱼藤酮(2R，6aS，12aS)-1，2，6，6a，12，12a-六氢-2-异丙烯基-8，9-二甲氧基苯并吡喃[3，4-b]呋喃(2，3-h)苯并吡喃-6-酮)接触，鱼藤酮是天然存在于多种植物根和茎中的杀虫剂和杀昆虫剂，干扰线粒体电子传递，并在注射入大鼠时引起帕金森病样症状。被发现在鱼藤酮的存在下阻断或降低培养的神经元的变性(其可以通过例如用例如，针对神经元特异的βIII微管蛋白的抗体染色的固定神经元的图像分析来检测)的试剂，可以被认为是神经元或轴突变性的候选抑制剂，如果需要，其可以在其它系统，比如本文中所述那些中测试。
神经元或轴突变性的其它模型包括将培养的神经元与长春新碱接触，长春新碱为结合微管蛋白二聚体并阻止微管结构组装的生物碱。被发现在长春新碱的存在下阻断或降低培养的神经元的变性(其可以通过例如分析用例如，针对神经元特异的βIII微管蛋白的抗体染色的固定神经元的图像来检测)的试剂，可以被认为是神经元或轴突变性的候选抑制剂，如果需要，其可以在其它系统，比如本文中所述那些中测试。
神经元或轴突变性的视网膜视神经挤压模型进一步在实施例中描述，而且也在Quigley，H.A.等人Retinalganglioncelldeathinexperimentalglaucomaandafteraxotomyoccursbyapoptosis.Investigativeophthalmology＆visualscience36，774-786(1995)和Ghosh，A.S.等人DLKinducesdevelopmentalneuronaldegenerationviaselectiveregulationofproapoptoticJNKactivity.TheJournalofcellbiology194，751-764(2011)中描述，其二者均通过引用并入本文。
ii)神经元或轴突变性的动物模型
用于本发明的体内测定包括神经变性疾病的动物模型，比如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化(例如，小鼠中的实验性自身免疫性脑炎(EAE))的动物模型。此外，可以使用脊柱和外伤性脑损伤模型。可以用于表征用于本发明的试剂的体内测定的非限制性实例描述如下。
在肌萎缩性侧索硬化(ALS)的情况下，表达超氧化物歧化酶1(SOD1)的突变体形式的转基因小鼠概括了ALS的表型和病理学(Rosen等人，Nature362(6415)：59-62，1993)。除了SOD1小鼠外，已经开发出多种肌萎缩性侧索硬化(ALS)小鼠模型并且可以用于本发明。这些包括运动神经元变性(Mnd)、进行性运动神经病(pmn)、wobbler(Bird等人，ActaNeuropathologica19(1)：39-50，1971)、以及TDP-43突变体转基因小鼠(Wegorzewska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，Oct.15，2009网络公开)。此外，已经开发了犬模型并且可以用于本发明(遗传性犬脊髓性肌萎缩(HCSMA))。
可以用于表征用于本发明方法的抑制剂的，模拟帕金森病的病理学、组织学、生物化学和临床特征的动物模型，包括利血平(reserpine)(兔；Carlsson等人，Nature180：1200，1957)；脱氧麻黄碱(methamphetamine)(啮齿类和非人灵长类；Seiden等人，DrugAlcoholDepend1：215-219，1975)；6-OHDA(大鼠；Perese等人，BrainRes.494：285-293，1989)；MPTP(小鼠和非人灵长类；Langston等人，Ann.Neurol.46：598-605，1999)；百草枯(paraquat)/代森锰(maneb)(小鼠；Brooks等人，BrainRes.823：1-10，1999和Takahashi等人，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.66：167-170，1989)；鱼藤酮(大鼠；Betarbet等人，Nat.Neurosci.3：1301-1306，2000)；3-硝基酪氨酸(小鼠；Mihm等人，J.Neurosci.21：RC149，2001)；和突变的α-突触核蛋白(synuclein)(小鼠和果蝇；Polymeropoulos等人，Science276：2045-2047，1997)模型。
遗传改造的动物(包括小鼠、苍蝇、鱼和蠕虫)已经用于研究阿尔茨海默病的病理机制。例如，β-淀粉样蛋白的转基因小鼠产生与阿尔茨海默病一致的记忆缺陷(Gotz等人，Mol.Psychiatry.9：664-683，2004)。模型(比如这些)可以用于表征用于本发明的试剂。
多种动物模型在本领域中用于研究卒中，包括小鼠、大鼠、沙鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪和猴。多数局灶性脑缺血模型包括一条主要脑血管比如大脑中动脉的阻塞(参见，例如，Garcia，Stroke15：5-14，1984和Bose等人，BrainRes.311：385-391，1984)。这些模型中的任一个也可以用于本发明。
B.制备抗体剂
预防或降低DLK磷酸化的抗体；结合DLK的某些磷酸化形式的抗体；和通过本发明的结合和活性测定鉴定的抗体可以通过本领域已知的方法制备，包括重组DNA技术。
1.抗原制备
任选地缀合于其它分子的可溶性抗原或其片段，可以用作产生抗体的免疫原。示例性的序列在实施例中描述，并且可以用于制备制造用于本发明的抗体的抗原。其它抗原和其用于制备抗体的形式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
2.多克隆抗体
多克隆抗体通常通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。其可以用于使用双功能或衍生化剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2、或R1NCNR(其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原缀合于在要免疫的物种中具有免疫原性的蛋白，例如，钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如，100μg或5μg蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗式完全佐剂混合并将溶液在多位点皮内注射，将动物针对抗原、免疫原性缀合物、或衍生物免疫。一个月后将动物用弗式完全佐剂中的1/5至1/10的初始量的肽或缀合物通过在多个位点皮下注射加强免疫。七至14天后，将动物取血并将血清进行抗体滴度测定。加强免疫动物直到滴度平台(plateaus)。将动物用相同抗原但缀合于不同蛋白和/或通过不同交联剂的缀合物加强免疫。缀合也可以在重组细胞培养中以蛋白融合物进行。此外，聚集试剂比如明矾适于加强免疫应答。
3.单克隆抗体
单克隆抗体可以使用由Kohler等人，Nature256：495，1975首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。在杂交瘤方法中，将小鼠或其它合适的宿主动物，比如仓鼠或猕猴，如上文描述的免疫以诱导产生或能够产生将特异结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。备选地，淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用融合剂比如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。
将由此制备的杂交瘤细胞在含有一种以上抑制未融合的母本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的合适的培养基中接种并生长。例如，如果所述母本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基将通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT-缺陷细胞的生长。
示例性的骨髓瘤细胞是有效融合的，支持通过选择的产生抗体的细胞稳定高水平产生抗体的，并且对培养基比如HAT培养基敏感的那些。这些中，可以被认为用于应用的特定骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，比如源自可从SalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，Calif.，USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和可从AmericanTypeCultureCollection，Manassas，Va.，USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞的那些。也已经描述人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001，1984；Brodeur等人，MonoclonalAntibodiesProductionTechniquesandApplications，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。
针对抗原测定杂交瘤细胞生长的培养基的单克隆抗体产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定，比如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。
在检定了杂交瘤细胞产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可以通过标准方法，将克隆通过有限稀释步骤亚克隆和生长(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。用于该目的的合适培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以将杂交瘤细胞在动物中以腹水肿瘤体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化步骤将由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水或血清中分离，所述常规免疫球蛋白纯化步骤比如，例如，蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
容易分离编码单克隆抗体的DNA并使用常规步骤测序(例如，通过使用能够特异结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这种DNA的来源。一旦被分离，DNA可以置于表达载体中，然后将其转染入不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞比如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。重组产生抗体和从文库分离抗体将在下文详述。
4.抗体片段单克隆抗体
在某些实施方案中，用于本文中方法的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段、和下文所述其它片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，NewYork)，pp.269-315(1994)中；还参见WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含救援受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原-结合位点的抗体片段，其可以是双价的或双特异的。参见，例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabodies)和四抗体(tetrabodies)也在Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中描述。
单-结构域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单-结构域抗体是人单-结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)制备，如本文中所述。
5.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，用于本文中的方法的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体，例如，在美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非-人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非-人灵长类，比如猴的可变区)和人恒定区。在进一步实例中，嵌合抗体是“类型转换的”抗体，其中类型或亚类已经从母体抗体的类型或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原-结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非-人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留母体非-人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一种以上可变结构域，其中HVRs，例如，CDRs，(或其部分)源自非-人抗体，并且FRs(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体还将任选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非-人抗体(例如，HVR残基源自的抗体)的相应残基替代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法，例如，在Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中综述，并且进一步，例如，在Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86：10029-10033(1989)；美国专利号5，821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Kashmiri等人，Methods36：25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)接枝(grafting))；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面重修(resurfacing)”)；Dall’Acqua等人，Methods36：43-60(2005)(描述“FR替换(shuffling)”)；和Osbourn等人，Methods36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述对于FR替换的“导向选择”方法)中描述。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳适合(best-fit)”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；源自特定亚类的轻链或重链可变区的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
6.人抗体
在某些实施方案中，用于本文中方法的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域中的各种技术制备。人抗体通常在vanDijk和vandeWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中描述。
人抗体可以通过将免疫原施用于改造以响应抗原激发(challenge)而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体的转基因动物来制备。这种动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代内源免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机整合入动物染色体。在这种转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常被失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还参见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述技术；美国专利号7,041,870，其描述K-M技术，和美国专利申请公开号US2007/0061900，其描述技术)。由这种动物产生的完整抗体的人可变区可以进一步例如，通过与不同人恒定区组合来改造。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法来制备。已经描述了用于人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见，例如，KozborJ.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalantibodyProductionTechniquesandApplications，pp.51-63(MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991).)通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中描述。其它方法包括，例如，在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，XiandaiMianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三原杂交瘤(Trioma)技术)还在Vollmers和Brandlein，HistologyandHistopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology，27(3)：185-91(2005)中描述。
人抗体还可以通过分离选自源自人的噬菌体展示文库Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将这种可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术在下文描述。
7.源自文库的抗体
用于本发明方法的抗体可以通过筛选具有所需一种活性或多种活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域中已知多种方法用于产生噬菌体展示文库和用于筛选这种文库获得拥有所需结合特性的抗体。这种方法例如，在Hoogenboom等人于MethodsinMolecularBiology178：1-37(O’Brien等人，编辑，人Press，Totowa，NJ，2001)中综述并且，例如，在McCafferty等人，Nature348：552-554；Clackson等人，Nature352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，于MethodsinMolecularBiology248：161-175(Lo，编辑，HumanPress，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)中进一步描述。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的组库分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆并随机重组如噬菌体文库中，然后可以将其筛选抗原-结合噬菌体，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中描述的。噬菌体通常展示抗体片段，为单链Fv(scFv)片段或为Fab片段。来自免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，不需要构建体杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆初次进行实验的组库，以提供针对宽范围的非自身和自身抗原的抗体的单一来源，而无任何免疫，如由Griffiths等人，EMBOJ，12：725-734(1993)所述的。最后，初次进行实验的文库也可以通过克隆来自干细胞的未重排的V-基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度编码高度可变CDR3区和完成体外重组来以合成方法制备，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文被认为是人抗体或人抗体片段。
8.多特异性抗体
在某些实施方案中，用于本文的方法的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一个针对DLK、磷酸化的DLK或DLK的特定磷酸化形式并且另一个针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合DLK的两个不同表位。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature305：537(1983))，WO93/08829，和Traunecker等人，EMBOJ.10：3655(1991))，以及“凸起-进入-孔洞(knob-in-hole)”改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过设计静电转向效果来制备抗体Fc-异二聚分子(WO2009/089004A1)；交联两种以上抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体(diabody)”技术用于制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；和例如，在Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述制备三特异性抗体，来制备。
利用三个以上功能性抗原结合位点改造的抗体，包括“章鱼(Octopus)抗体”，也包括在本文中(参见，例如US2006/0025576A1)。
用于本文的方法的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合DLK、磷酸化的DLK或DLK的特定磷酸化形式以及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见，例如US2008/0069820)。
9.重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物来制备，例如，美国专利号4,816,567中所述的。这种核酸可以编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，尤其是当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，MethodsinMolecularBiology，Vol.248(B.K.C.Lo，编辑，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)表达之后，抗体可以从可溶部分中的细菌细胞糊状物中分离并可以进一步纯化。
除了原核生物之外，真核微生物比如丝状真菌或酵母是用于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化样式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多可以与昆虫细胞联合使用的杆状病毒毒株，尤其是由于草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体大PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，驯化以在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以使用。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是SV40转化的猴肾CV1(COS-7)；人胚胎肾系(如，例如，在Graham等人，J.GenVirol.36：59(1977)中所述的293或293细胞)；幼苍鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如，例如，在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；例如，在Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国苍鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系比如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于抗体制备的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，Vol.248(B.K.C.Lo，编辑，HumanaPress，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003)。
C.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，在本文中提供的任何试剂用于检测生物样品中磷酸化的DLK或DLK的特定磷酸化形式。如本文使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，比如神经元或其部分。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测的方法的试剂。在进一步的方面，提供检测生物样品中磷酸化的DLK和/或DLK的特定磷酸化形式(例如，在选自人或鼠DLK序列(分别为SEQIDNOs：1和2)第43位的苏氨酸的氨基酸残基处；在人DLK序列(SEQIDNO：1)第500位的丝氨酸处和鼠DLK序列(SEQIDNO：2)第533位的丝氨酸处磷酸化的DLK；和其任意组合)的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与特异识别本文所述的DLK磷酸化形式的抗体，在允许抗体结合DLK的磷酸化形式的条件下相接触，并且检测在抗体和DLK的磷酸化形式之间是否形成复合体。这种方法可以是体外或体内方法。所述抗体用于选择具有应激依赖性和/或促凋亡DLK活性的神经元和/或检测应激依赖性的和/或促凋亡DLK活性。
在某些实施方案中，提供用于本发明方法的标记的抗体。标记包括，但不限于，直接检测的标记或部分(比如荧光、发色团、电子致密、化学发光和放射活性标记)，以及例如，通过酶反应或分子相互作用直接检测的部分，比如酶或配体。示例性的标记包括，但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团比如稀土螯合物或荧光素和其衍生物、丹磺酰、伞形酮、荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HR)、碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶，杂环氧化酶比如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与使用过氧化氢以氧化染料前体比如HRP的酶偶联，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲和素，自旋标记，细菌噬菌体标记，稳定自由基，等。
D.治疗方法和组合物
本文中提供的任何试剂可以用于治疗方法。
在某些实施方案中，本发明提供一种试剂，所述试剂用于治疗具有神经变性疾病、病状或病症的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的试剂。在一个这种实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种其它治疗剂，例如，下文所述的。在进一步实施方案中，本发明提供一种试剂，所述试剂用于抑制或预防神经元变性。在某些实施方案中，本发明提供一种试剂，所述试剂用于抑制或预防个体中神经元变性的方法，所述方法包括向个体施用有效量的试剂以抑制或降低DLK的磷酸化并且从而降低DLK蛋白稳定性。根据任意上述实施方案，“个体”优选是人。
用于本发明方法的试剂(和任何其它治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内、和鼻内，并且如果需要用于局部治疗，在病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。剂量给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，比如部分根据施用是否短暂或长久，静脉内或皮下注射。各种剂量给药时间安排包括但不限于经各个时间点的单次或多次施用，推注施用，并且在本文中考虑脉冲输注。
与优良临床实践一致的方式配制、剂量给药和施用用于本发明方法的试剂。在该情况下考虑的因素包括要治疗的特定疾病、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、递送试剂的位点、施用方法、施用时间安排、和执业医生已知的其它因素。抗体不需要，但任选地与一种以上目前用于预防或治疗所述疾病的试剂一起配制。这种其它试剂的有效量依赖于存在于制剂中的抗体的量、疾病或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常以相同剂量和以本文所述的施用途径施用，或以约本文所述的剂量的约1至99％，或以经验上/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
当试剂靶点位于脑中时，本发明的某些实施方案提供试剂以穿过血脑屏障。某些神经变性疾病与血脑屏障的渗透性的增加相关，从而试剂(例如，抗体或抗原-结合片段)被容易地引入脑。当血脑屏障保持完整时，存在一些本领域已知的方式，用于将分子跨过其转运，包括，但不限于，物理方法、基于脂的方法、和基于受体和通道的方法。
将试剂比如抗体或抗原-结合片段跨血脑屏障转运的物理方法包括，但不限于，完全绕开血脑屏障，或通过在血脑屏障上产生开口。绕开方法包括，但不限于，直接注射入脑(参见，例如，Papanastassiou等人，GeneTherapy9：398-406，2002)，间隙输注/增强传送的递送(参见，例如，Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：2076-2080，1994)，和在脑中移植递送装置(参见，例如，Gill等人，NatureMed.9：589-595，2003；和GliadelWafers.TM.，GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括，但不限于，超声(参见，例如，美国专利公开号2002/0038086)，渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt，E.A.，ImplicationoftheBlood-BrainBarrieranditsManipulation，第1和2卷，PlenumPress，N.Y.，1989))，由例如，缓激肽(bradykinin)或透化剂A-7透化(参见，例如，美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)，以及用含有编码抗体或抗原-结合片段的基因的载体转染跨在血脑屏障上的神经元(参见，例如，美国专利公开号2003/0083299)。
将试剂比如抗体或抗原-结合片段跨血脑屏障转运的基于脂的方法包括，但不限于，将抗体或抗原-结合片段包裹在脂质体中，所述脂质体与结合血脑屏障的血管内皮细胞上的受体的抗体结合片段偶联(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0025313)，和将抗体或抗原-结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0204354)或载脂蛋白E(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0131692)中。
将抗体或抗原-结合片段跨血脑屏障转运的基于受体和通道的方法包括，但不限于，使用糖皮质激素阻断剂以增加血脑屏障的渗透性(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0089473)，抑制ABC药物转运体(参见，例如，美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种以上转铁蛋白受体的活性(参见，例如，美国专利申请公开号2003/0129186)，和将抗体阳离子化(参见，例如，美国专利号5,004,697)。
为了预防或治疗疾病，本发明抗体的合适剂量(当单独或与一种以上其它另外的治疗剂使用时)将依赖于要治疗的疾病类型、抗体类型、疾病的严重度和进程、是否施用抗体用于预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的反应和主治医师的判断。抗体适于一次或经一系列治疗施用于患者。根据疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是施用于患者的起始候选剂量，不论例如，通过一次以上分开的施用，或通过连续输注。根据上文提到的因素，一个典型的每日剂量可以范围从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于经多日或更长时间的重复施用，根据状况，治疗将通常持续，直到发生对疾病症状的所需抑制。一种示例性的抗体剂量范围将从约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，一种以上约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的剂量可以施用于患者。这种剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如这样，患者接受约二至约二十，或例如约六个剂量的抗体)。可以施用更高的起始加载剂量，接着一次以上更低的剂量。示例性的剂量给药方案包含施用。然而，其它剂量给药方案可以是有用的。该治疗过程容易通过常规技术和测定监测。
E.制造的物品
在本发明的另一个方面中，提供含有用于治疗、预防和/或诊断上文所述的疾病的材料的制造的物品。制造的物品包含容器和容器上或与容器相关的标记或药品说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料比如玻璃或塑料形成。容器装有组合物，所述组合物为自身或与有效用于治疗、预防和/或诊断疾病的另一种组合物组合并且可以具有无菌接入口(例如容器可以是具有可由皮下注射针头刺破的塞子静脉内溶液带或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗体。标记或药品说明书表明所述组合物用于治疗特别的疾病。此外，制造的物品可以包含(a)第一容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含进一步的细胞毒素的或另外的治疗剂。本发明的该实施方案中的制造的物品还可以包含药品说明书，其表明所述组合物可以用于治疗特定疾病。备选地，或此外，制造的物品还可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含药用缓冲液，比如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括从商业和用于的角度所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
III.实施例
以下是本发明方法和组合物的实例。要理解，已知上文提供的一般描述，可以进行各种其它实施方案。
材料和方法
以下材料和方法用于下文所述的实施例。
小鼠模型-如Ghosh，A.S.等人(2011)，Watkins，T.A.等人(2013)，Lewcock，J.W.等人Neuron56，604-620(2007)，和Sabapathy，K.等人Currentbiology：CB9，116-125(1999)所述，产生DLK杂合和敲除小鼠，DLK条件敲除小鼠，Phr1mag小鼠，和JNK2敲除小鼠。JNK3敲除小鼠在C57B1/6ES细胞中通过genOway(Lyon，Francewww.genoway.com)通过与靶载体同源重组产生。靶载体含有3.8kb和6.5kb的同源臂并且以新霉素抗性盒替代外显子11的大部分。删除的区域包括JNK活性所需的T-P-Y三肽双磷酸化基序。当外显子10和12剪接在一起时，neo盒插入产生移码，在外显子14产生早期终止子。通过PCR和DNA印迹筛选新霉素抗性ES细胞克隆以证实盒的同源重组。JNK3基因型的确定通过PCR以如下引物进行：
引物1：5’-CCAGTAACATTGTAGTCAAGTCT-3’(SEQIDNO：7)
引物2：5’-TGGTCTTCCGCTTGGTAT-3’(SEQIDNO：8)
引物3：5’-CGCCTTCTATCGCCTTCT-3’(SEQIDNO：9)
引物1和2在WT等位基因中产生249-bp片段并且在KO等位基因中不产生产物。引物1和3在KO等位基因中产生435-bp片段并且在WT等位基因中无产物。对来自JNK2/3双敲除和同窝动物对照的视网膜样品中的JNK2和JNK3的印迹表明敲除小鼠中JNK2和JNK3蛋白的丧失(图12)。
由LexiconPharmaceuticals从C57BL/6ES细胞产生USP9X条件敲除小鼠。它们含有在外显子31侧面具有loxp位点的USP9X等位基因，其编码催化的Cys1560。Loxp位点通过同源重组，使用与FRT侧面相接的新霉素盒与外显子31的5’的4.7kb和3’的4.0kb的同源臂插入ES细胞中。通过对盒的同源重组的DNA印迹筛选新霉素抗性ES细胞克隆。将含有在序列两端加上loxp位点的(floxed)等位基因的小鼠与Flp删除株杂交以去除新霉素盒。为了获得在序列两端加上loxp位点的USP9X等位基因的可诱导重组，将USP9X条件敲除小鼠与Rosa-Cre-ERT2品系(其含有编码Cre-雌激素受体融合蛋白的构建体插入rosa基因座的插入物)杂交(Seibler，J.等人Nucleicacidsresearch31，e12(2003))。对于DRG实验，将USP9Xloxp/loxp；Cre-和USP9Xloxp/loxp；Cre+小鼠杂交用于定时妊娠并且对胚胎鉴定基因型从而确认存在或不存在Cre。通过将10μM4-羟基他莫西芬(4-OHT，Sigmacatalog#H7904)加入细胞48小时来诱导培养的DRGs中的重组。还将4-OHT加入Cre-对照细胞。
原代神经元培养-将背根神经节从胰酶消化(除了在外植体的情况下)的E12.5至E13.5小鼠胚胎解剖出，并且在用聚-d-赖氨酸和层粘连蛋(1aminin)(BioCoat，BD)包被的小室载玻片上，在含有N3补充物、40mM葡萄糖、和25ng/mLNGF的F12培养基中培养。铺板后那天，将3μM阿拉伯呋喃糖酐(AraC，Sigma)加入培养基中，两天后去除，并且将培养基用没有AraC的N3/F12/NGF替代。对于NGF去除实验，体外4至5天后，将培养基用不含NGF并含有25μg/mL抗-NGF抗体(Genentech)的培养基替代1至3小时。
对于siRNA实验，使用Amaxanucleofection系统(Lonza)转染解离的DRGs。JNK3siRNA(正义5’-ACATCGTAGTCAAGTCTGATTT-3’(SEQIDNO：10)，反义5’-ATCAGACTTGACTACGATGTTT(SEQIDNO：11))在Genentech合成(Kim，M.J.等人Neuron56，488-502(2007))。对照siRNA是来自Dharmacon的ON-TARGETplus非靶向siRNA#1。
蛋白质印迹-通过在冰上孵育30min.将DRG培养物在含有50mMTrispH7.5、150mMNaCl、5mMEDTA和0.1％TritonX-100的缓冲液中裂解。通过在冰上孵育30min.将HEK293T细胞在放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液中裂解。在RIPA缓冲液中，使用具有3mm碳化钨珠子(Qiagen)的TissueLyser(Qiagen)将视网膜和神经组织样品裂解6min。除非另有说明，所有裂解液含有完全蛋白酶抑制剂混合物和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche)。293T和视网膜裂解产物的蛋白浓度通过BCA测定(Pierce)来确定。将样品加在在NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶上(Invitrogen)并进行标准免疫印迹步骤。除了指出的情形外，用于DLK印迹的凝胶在MOPS缓冲液(Invitrogen)中电泳(run)。由于Phr1的大尺寸，用于Phr1印迹的样品在3-8％Tris-醋酸盐凝胶(Invitrogen)上电泳。利用化学发光和暴露于膜将印迹可视化。对于相对蛋白表达和分子量定量，还在Chemidoc(Bio-Rad)上将印迹可视化。将定量(Bio-Rad)上进行。将蛋白表达针对上样对照(肌动蛋白或微管蛋白)标准化。将分子量相对于PrecisionPlusProteinWesternCStandards(Bio-Rad)标准化。
抗体和抑制剂-使用以下抗体用于染色和蛋白质印迹：抗-DLK(1∶1000，在Genentech根据参考文献Hirai，S.等人Development129，4483-4495(2002)制备)；抗-p-JNK(1∶250，CellSignaling#9251)；抗-p-cJun(用于蛋白质印迹：1∶250并且用于染色：1∶500，CellSignaling#9261)；抗-总JNK(1∶500，CellSignaling#9252)；抗-JNK2(1∶500，CellSignaling#4672)；抗-JNK3(1∶500，CellSignaling#2305)；抗-β-微管蛋白(“Tuj”，1∶1000，Covance#MMS-435P-250)；抗-肌动蛋白(1∶5000，BD#612656)；抗-切割的-胱天蛋白酶-3(1∶500，CellSignaling#9664)；Brn3(1∶100，SantaCruzBiotechnology#sc-6026)；γ-突触核蛋白(1∶200，Abcam#ab55424)；NF-M(1∶200，CovanceMMS-583S)。抗-USP9X(大鼠单克隆4B3)在Genentech制备并且针对人USP9X的198C-末端氨基酸产生。针对Phr1的抗体通过用包含氨基酸D3812-Q3961(其由DOC结构域构成，在杆状病毒中表达)的Phr1片段免疫兔来产生。然后使用加载有使用前的相同肽的柱子将血清亲和纯化。蛋白的该部分在Phr1mag突变体中缺失。针对DLK上T43、S272和S533磷酸化位点的抗体通过用以下肽免疫兔来产生：PEKDL-pT-PTHVLQLHC(SEQIDNO：12)，HRDLK-pS-PNMLITYDC，RNVPQKL-pS-PHSKRPC(SEQIDNO：13)并且在使用前亲和纯化。
以给定浓度使用以下抑制剂：放线菌酮(5μM，Calbiochem#239764)；大田软海绵酸(“OA”，200nM，Sigma#O8010)，MG132(30μM，Fisher#NC9937881)；JNK抑制剂V(“JNKV”，10μM，EMD#420129)；JNK抑制剂VII(“JNKVII”，10μM，EMD#420134)；JNK抑制剂VIII(“JNKVIII”，10μM，EMD#420135)。
使用HA-Ub-乙烯基砜的USP9X活性测定-HA-标记的泛素乙烯基砜获自EnzoLifeSciences。如在Borodovsky，A.等人Chemistry＆biology9，1149-1159(2002)中的进行所述测定。简言之，将培养的DRGs用抗-NGF或用NGF作为对照来处理。然后将DRGs重悬在裂解缓冲液(50mMTrispH7.5、5mMMgCl2、250mM蔗糖、1mMDTT、2mMATP、和100μMPMSF)中并且匀浆以裂解。然后将裂解产物与6.6μg/mLHA-泛素乙烯基砜在25℃孵育2小时。将N-乙基-马来酰亚胺以5μM加入，作为阴性对照。过在样品缓冲液中煮沸来终止反应。
实时定量逆转录PCR(Real-TimeqRT-PCR)-使用RNeasyPlusMiniKit(Qiagen)收集来自解离的DRGs和视网膜的RNA样品。从AppliedBiosystems订购预先设计的Taqman引物组。引物组的目录号如下：DLK-Mm00437378_m1(FAM标记)，GAPDH-4352339E(VIC标记)。使用TaqmanRNA-to-CtOne-StepKit(AppliedBiosystems#4392938)在7500Real-TimePCR系统上进行比较Ct(ΔΔCt)测定并且在7500软件行分析。GAPDH内源对照和DLK引物多重使用。所有测定包括五个技术重复。误差线表示从这五个技术重复计算的相对量的标准偏差。
λ蛋白磷酸酶测定-λ蛋白磷酸酶、用于PMP的10XNE缓冲液和10mMMnCl2均获白NewEnglandBiolabs。对于DRGs，在无磷酸酶抑制剂或EDTA，但在别的方面与本稿件中的其他DRG裂解产物相同的条件下收集裂解产物。将裂解产物与1XPMP缓冲液和1mMMnCl2，与800单位的λ蛋白磷酸酶或相当体积的50％甘油作为对照在30℃孵育30min。通过与样品缓冲液一起加热并加载在凝胶上来终止反应。
确定DLK稳定性的放线菌酮时间进程-在时间0，将DRG培养基用不含NGF、抗-NGF和放线菌酮的培养基替代，如在之前方法副标题中详述的。在给定时间点收集裂解产物并对DLK印迹。将实验进行三次并且将DLK相对于上样对照定量。对于各个时间点，计算相对于时间0DLK的平均量。线性回归和统计分析以比较两条线的斜率，在GraphpadPrism软件中进行。
免疫沉淀-对于抗-泛素免疫沉淀(IPs)，如之前所述，将从E12.5CD-1小鼠(CharlesRiverLaboratories)解剖的DRGs裂解，并且在裂解缓冲液中加入30μMMG132和5μMN-乙基马来酰亚胺。将裂解产物用蛋白G缀合的Dynabeads(LifeTechnologies)预清除30min.。6μg抗-泛素抗体(克隆FK2，Millipore)或相当物。
体外JNK激酶测定-使用抗-Flag-缀合的磁珠(Sigma)将Flag-标记的DLKS302A从293T细胞裂解产物免疫沉淀。洗涤后，将结合DLK的Flag珠子与2,000单位的λ蛋白磷酸酶、1XPMP缓冲液、和1XMnCl2在30℃孵育30min.以从纯化的DLK去除所有磷酸根基团。然后将珠子用含有磷酸酶抑制剂的缓冲液洗涤并且用激酶反应缓冲液(50mMHEPESpH7.2，10mMMgCl2、1mMEGTA、0.01％Triton-X-100、2mMDTT、30μMATP)分为两管。将126ngGST-标记的人重组JNK3(Millipore)加入两管中的一管中并且将它们在30℃孵育90min。通过在样品缓冲液中加热，将DLK从Flag珠子洗脱，并且将样品上样于凝胶用于印迹。
实施例1-神经元应激应答导致各种哺乳动物应激范例中DLK水平增加
检测总DLK蛋白水平以确定总DLK水平是否随着对神经元应激的一般响应而增加，如在无脊椎动物(Xiong，X.等人(2010))和基于细胞培养的模型(Xu，Z.等人(2001))中所观察到的。选择两种神经元应激模型(其产生可靠的和可重复的DLK依赖性的神经变性)：培养的胚胎感觉神经元的神经生长因子(NGF)去除测定，发育的神经元细胞死亡模型，和视网膜视神经挤压测定，神经损伤和青光眼模型3，18。与未应激的在NGF的存在下培养的神经元相比，在培养的胚胎背根神经节细胞(DRGs)中，DLK蛋白水平响应NGF去除，以大约2-倍增加(图1a，e)。类似地，在视神经挤压的三天内，整体视网膜的DLK水平以接近1.5倍增加(图1b，e)。在从视神经分离的样品中，DLK水平的增加仅在近端侧发生而在远端轴突中不发生(图1c，d)。在每种情况下，DLK水平在远早于神经元变性开始前的时间点增加，所述神经元变性在NGF去除后16天和在视网膜神经挤压后3-7天开始。
DLK蛋白量的增加伴随着～5kDa(图1f)的DLK表观分子量的增加(图1a，b，d)。用λ蛋白磷酸酶处理DRG裂解产物以切割磷酸根基团使+NGF和-NGF条件下DLK的分子量相等(图1g)，表明，迁移率位移是磷酸化的结果。在视网膜神经挤压中，DLK仅在RGC’s中被磷酸化并且在其它视网膜细胞类型中不被磷酸化(图8a)。
在一些情况中观察到DLK迁移率位移(Xu，Z.，Maroney，A.C.，Dobrzanski，P.，Kukekov，N.V.＆Greene，L.A.Molecularandcellularbiology21，4713-4724(2001)；Mata，M.等人TheJournalofbiologicalchemistry271，16888-16896(1996))，但是在其它情况中没有观察到，并且当已经观察到它时，该现象的基础尚未被很好地了解。这些相矛盾的结果可能至少部分由于跨研究组使用的SDS-PAGE缓冲液条件的不同(图8b)。
实施例2-响应营养因子去除，DLK蛋白被稳定
解释应激-诱导的DLK水平上升的可能机制包括：(1)增加的Dlk转录，(2)增加的蛋白翻译，或(3)增加的DLK稳定性。至于可能性1，进行实时qRT-PCR以定量经历营养因子去除的DRGs和神经挤压的视网膜中DLK转录本的量。两种条件均不显示与未应激对照相比可检测的DLK转录本水平的改变(图2a)，表明DLK蛋白水平的上升是由于转录后机制。为了确定DLK稳定性是否受神经元应激影响，在存在或不存在NGF的情况下经8小时的时期将DRGs用放线菌酮处理以抑制蛋白翻译，并且确定该时期保留的DLK量。NGF去除，观察到DLK稳定性的～2.5-倍增加(图2b-c)，表明DLK蛋白水平的上升是响应神经元应激的增强的蛋白稳定性的结果。
为了进一步研究磷酸化在DLK的应激依赖性的调节中的作用，将未应激的在NGF的存在下培养的DRGs用大田软海绵酸(广谱磷酸酶抑制剂)处理，以增强DLK磷酸化。该处理足以增加DLK的表观分子量和总水平，提示DLK的磷酸化调节蛋白稳定性(图2d)。用MG132处理产生DLK水平的增加，而不产生DLK磷酸化的增加，提示非磷酸化的DLK通常由蛋白酶体降解(图2d)。
实施例3-神经元应激通过调节Phr1来调节DLK泛素化
为了确定神经元应激是否降低DLK泛素化以增强DLK稳定性，从+NGF和-NGFDRGs免疫沉淀泛素化的蛋白，并且发现DLK泛素化在-NGF条件下显著降低(图3a)。在无脊椎动物系统中，E3泛素连接酶(PAM/highwire/RPM-1)的PHR家族调节DLK蛋白水平并且已经证明了fatfacets基因(编码去泛素化酶(DUB))和dlk同源物之间的遗传相互作用(Collins，C.A.，Wairkar，Y.P.，Johnson，S.L.＆DiAntonio，A.(2006)；Nakata，K.等人(2005)；Xiong，X.等人(2010))。然而，因为来自Phr1KO小鼠胚胎的全脑裂解产物在DLK蛋白量上未显示出改变(Bloom，A.J.，Miller，B.R.，Sanes，J.R.＆DiAntonio，A.(2007))，因此，不清楚在脊椎动物中是否存在相似的通路以调节DLK。为了直接研究泛素蛋白酶体系统在哺乳动物神经元中调节DLK水平的作用，培养在这两种基因的小鼠同源物中缺失功能等位基因的DRGs。
培养来自USP9X(最接近fatfacets的小鼠同源物)的条件小鼠敲除的第一DRGs。如对于敲除DUB(控制DLK周转)所预期的，相对于Cre-DRGs，在缺少USP9X的DRGs(Cre+)中观察到DLK水平～35％的降低(图3b，c)。然而，在敲除USP9X对DLK的基础水平具有影响的同时，Cre-神经元中DLK蛋白量的-NGF：+NGF比例几乎与Cre+神经元中的相同(图3c)。与该观察结果一致，与泛素乙烯基砜交联，揭示USP9X活性不由NGF去除改变(图9)。因此，我们得出结论，USP9X将DLK去泛素化，但是对于DLK水平的应激依赖性改变而言不需要。
相反，对于失去功能Phr1mag等位基因的纯合的DRGs(Lewcock，J.W.等人(2007))，与野生型对照相比，在NGF的存在下呈现DLK水平的增加，同时在NGF去除后不影响DLK水平，导致应激的和未应激条件下大致相当的DLK水平(图3d，e)。此外，Phr1mag纯合神经元具有更低的泛素化DLK数量(图3f)。这些观察结果与在神经元应激情况下观察到的DLK泛素化降低(图3a)一起，提示DLK泛素化的改变至少部分由于Phr1活性的调节或其与DLK的相互作用。然而，Phr1mag神经元中DLK量的增加不足以驱动下游信号传导和下游靶点比如c-Jun的磷酸化。因此，单独升高的DLK不足以诱导下游信号传导事件并且对于DLK激活需要另外的输入。
实施例4-对于DLK稳定化，需要DLK活性和JNK活性
神经元应激通过降低的泛素化导致DLK磷酸化和稳定化，并且大田软海绵酸处理也引起DLK磷酸化和稳定化。这提示DLK磷酸化和DLK稳定化之间可能的关联。为了确定磷酸化可能怎样调节DLK蛋白稳定性，检测通过瞬时转染的Flag-标记的鼠DLK在HEK293T细胞中的表达。293T细胞中表达的野生型DLK是组成型活性的，因为其二聚化且自身磷酸化(Mata，M.等人(1996))。为了在一定程度上模拟神经元中未应激的相对于应激的条件，通过突变我们通过与MLK3的同源性鉴定的推定的激活环中的磷酸化位点来制备DLK的激酶失活版本(Leung，I.W.＆Lassam，N.TheJournalofbiologicalchemistry276，1961-1967(2001))。一个这种点突变体，DLKS302A，当表达时不能引起c-Jun的磷酸化，确认其缺少激酶活性。有趣的是，DLKS302A在HEK293T细胞中比野生型DLK更低水平表达。与USP9X共表达增加DLKS302A的表达至野生型水平，提示观察到的更低蛋白水平是由于失活DLK的增加的泛素化(图4a)。这些数据与我们在神经元中的观察结果一致。为了确认在DLKS302A的情况下观察到的蛋白表达的降低是激酶活性的丧失的结果而不是该特定突变的效应，将具有仅含有DLK亮氨酸拉链的截短的构建体的野生型DLK(其用作防止全长DLK二聚化的显性阴性)(Nihalani，D.，Merritt，S.＆Holzman，L.B.TheJournalofbiologicalchemistry275，7273-7279(2000))共转染。类似于对于DLKS302A所观察到的，与GFP共表达DLK相比，DLK活性的降低导致降低的DLK表达(图4b)。
因为DLK通路活性似乎对于蛋白稳定化是必要的，检测下游信号传导是否在DLK稳定性中起作用。使用以可由强力霉素诱导的方式表达DLK的稳定细胞系并且将细胞用两种结构上不同的JNK抑制剂处理(图4c)。两种JNK抑制剂都能降低DLK蛋白水平。
为了确定该研究结果在神经元系统中的相关性，使用siRNA敲低JNK2敲除DRGs中的JNK3表达，去除调节大多数应激诱导的神经元变性的两种JNK家族成员(Coffey，E.T.等人TheJournalofneuroscience：theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience22，4335-4345(2002)；Chang，L.，Jones，Y.，Ellisman，M.H.，Goldstein，L.S.＆Karin，M.Developmentalcell4，521-533(2003))。与对照siRNA相比，尽管也观察到DLK表观分子量的一些改变，JNK3敲低减弱了DLK的增加(图4d)。假定尽管还发生了其它JNK独立的磷酸化事件，JNK活性产生反馈机制，导致对于DLK稳定化所需的DLK上特定位点的磷酸化。在视网膜神经挤压模型中，与同窝动物对照相比，在挤压后18小时时，JNK2/3双敲除不显示DLK水平或分子量的增加(图4e，箭头)，表明DLK的JNK-依赖性的磷酸化也在成体体内损伤的范例中发生。
实施例5-DLK稳定化所需磷酸化位点的鉴定
为了鉴定DLK上功能上相关磷酸化位点，使用质谱法联合细胞培养中氨基酸同位素标记(SILAC)。对于这些研究，将表达FLAG-标记的DLK的293T细胞培养在含有赖氨酸(13C6 15N2)和精氨酸(13C6 15N4)的同位素富集(重)型或其未标记对应物(轻)的SILAC培养基中。建立四个成对条件(轻相对于重)以详细分析JNK和DLK活性对DLK的整体丰度和DLK磷酸化程度的影响：1)野生型(WT)DLK相对DLKS302A，2)DLKS302A相对与组成型活性的JNK构建体共表达的DLKS302A(Lei，K.等人Molecularandcellularbiology22，4929-4942(2002))，3)WTDLK相对JNK抑制剂情况下的WTDLK，和4)WTDLK相对大田软海绵酸情况下的WTDLK(图5a)。
鉴定了DLK上的一系列磷酸化肽，其丰度响应测试的条件而改变。在修正条件中的整体DLK丰度的差异(参见材料和方法)，鉴定磷酸化状态与DLK和JNK--依赖性的磷酸化一致的方式改变的位点(图5b，c)。就改变幅度而言前三名的位点是N-末端结构域的T43、激酶结构域中的S272、和紧接亮氨酸拉链结构域C-末端的S533。根据预测的JNK和DLK活性，还对含有多个磷酸化位点的肽观察到改变。发现激酶激活环(S295-T306)内已知的磷酸化位点依赖于DLK的激酶活性，但不依赖于JNK。该研究结果与JNK不直接调节DLK活性，而是控制影响DLK稳定性的因子的模型相匹配。有趣的是，在DLK的序列内，鉴定出的第一名的位点含有与MAPK底物基序一致的侧翼脯氨酸(Songyang，Z.等人Molecularandcellularbiology16，6486-6493(1996))。
实施例6-鉴定的位点在稳定的DLK中是磷酸化的
为了确定鉴定的前三名位点中的每个的磷酸化对DLK稳定性的影响，在293T细胞中表达各自的丙氨酸点突变体。通过c-Jun磷酸化测量时对于DLK活性需要S272。不可能将由S272突变体导致的DLK稳定性的改变与由于激酶活性缺失发生的那些相区分，因此不进一步研究该点突变。有趣的是，对于DLK活性不需要T43和S533，但是DLKT43A和DLKS533A突变体以比野生型DLK更低的水平表达(图6a)，与蛋白稳定性的降低一致。针对T43、S272和S533残基产生的磷酸化特异的抗体表明，不仅在点突变体中存在这些位点的磷酸化的丧失，而且在激酶失活DLKS302A中也有，与质谱法结果一致(图6a)。
检测在神经元中T43和S533的磷酸化是否以应激依赖性的方式发生。为了回答这个问题，将野生型DRGs营养因子除去并且将裂解产物用特异于两个磷酸化位点中的每个的抗体印迹(图6b)。靶向磷酸化-T43的抗体在-NGF条件下显示免疫反应性，其通过λ磷酸酶处理消除，表明抗体对于磷酸化的靶抗原的特异性。印迹除去营养因子的DLKloxp/loxpCre-和Cre+裂解产物，表明该抗体对DLK的特异性(图6c)。此外，T43和S533二者的磷酸化可以在从挤压的视网膜免疫沉淀的DLK中检测到(图6d)。因此，T43和S533在体内神经元应激后是磷酸化的，与这些位点的磷酸化促进神经元中DLK稳定性的假设一致。使用纯化的JNK和DLK的体外激酶测定表明，T43和S533二者都可以直接被JNK磷酸化(图6e)。因此，JNK可以直接在体内磷酸化DLK。
实施例7-DLK以剂量依赖的方式调节下游促凋亡信号传导
DLK蛋白量响应营养因子去除和视神经挤压而增加的观察结果提示检测DLK蛋白水平是否直接影响神经元应激后由DLK诱导的下游信号传导的程度。为了这样做，我们使用大致表达WT同窝动物中存在的DLK量的50％的DLK敲除杂合子。在NGF去除的三小时时间过程中(图7a)，与WT对照相比，对于DLKKO等位基因杂合的神经元显示更低的p-cJun和p-JNK水平。因此，在DRGs中，DLK的量直接控制促凋亡信号传导的量。
在视网膜神经挤压中，与DLK野生型小鼠相比，在DLK杂合小鼠中，存在类似的促凋亡信号传导的降低。在视神经挤压后6小时，与在WT视网膜中发现的数量相比，杂合的挤压的视网膜中的p-cJun-阳性细胞核数量降低约70％(图7b，c)。同样，在挤压后三天，DLK杂合子中胱天蛋白酶-3-阳性细胞的量降低＞85％(图7d，e)，同时Brn3-阳性细胞核的总数量增加＞2-倍(图7d，f)。这些标志物的改变表明，存在消除的应激响应(Watkins，T.A.等人.出版中(2013))。在更晚的时间点，这些标志物变得不能与在WT视网膜中观察到的相区分，表明杂合子中降低的凋亡信号传导是推迟，而不是绝对的降低(图11)。这不同于DLK敲除，其中促凋亡信号传导在神经挤压后被阻断(Watkins，T.A.等人.出版中(2013))。因此，在神经元应激后，DLK水平的调节调整体内和体外下游凋亡信号传导的量和进程。
建议的是，DLK水平在正常条件下通过Phr1和USP9X紧密调节。尤其在Phr1突变体中，在缺少应激的情况下，DLK水平增加，但这不导致下游信号传导；因此，需要另外的因素用于DLK激活。神经元应激(例如除去NGF和损伤)导致DLK激酶活性的激活和下游靶点MKK4/7和JNK的磷酸化。然后JNK-依赖性的反馈机制导致DLK的磷酸化和稳定化。如在NGF去除中观察到的，稳定化通过泛素化的改变而发生。泛素化的该改变可能通过Phr1活性或DLK对Phr1的底物利用度的改变而发生，尽管可能另外的E3泛素连接酶也参与DLK的泛素化。在任何情况下，由于来自JNK的正反馈引起的泛素化的降低导致DLK水平快速的、开关样的(switch-like)的上调和凋亡和轴突变性的激活。
DLK激酶活性需要同源二聚化和自磷酸化(Nihalani，D.，Merritt，S.＆Holzman，L.B.(2000))，并且激活环上的自磷酸化是相关激酶MLK3的激酶活性所需的(Leung，I.W.＆Lassam，N.(2001))。因此，假设在NGF去除和神经挤压中所观察到的DLK的磷酸化是DLK激活环上自磷酸化，或通过上游激活激酶导致的DLK激活环的磷酸化的结果，将是合理的。这的确可能解释JNK抑制不完全抑制神经元应激后DLK内所有位点的磷酸化的观察结果(图4)。激酶调节机制的理解主要集中在许多激酶的激活环的磷酸化上。上述实验提供其中激活环外的特定残基的DLK磷酸化需要下游激酶的不同机制的证据。这些残基的磷酸化影响DLK的稳定性但不影响DLK活性。
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尽管为了清楚理解，之前的发明已经通过说明和实例的方式详细描述，说明书和实施例不应该被认为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确通过引用以其整体并入。

Claims (21)

1.一种降低神经元中双亮氨酸拉链激酶(DLK)稳定性的方法，所述方法包括向神经元、或其部分施用降低或抑制DLK的磷酸化和降低DLK稳定性的试剂。
2.一种降低或抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的某些氨基酸残基的磷酸化的方法，所述方法包括向神经元或其部分施用降低或抑制DLK的磷酸化的试剂，其中磷酸化的降低或抑制导致DLK蛋白稳定性的降低。
3.一种抑制或预防患者中神经元变性的方法，其中所述方法包括向患者施用降低或抑制双亮氨酸拉链激酶(DLK)的磷酸化的试剂，其中磷酸化的降低或抑制降低DLK的稳定性。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述试剂降低或抑制特定DLK氨基酸残基的磷酸化。
5.权利要求4所述的方法，其中所述特定DLK氨基酸残基选自：SEQIDNO：1(人)第43位的苏氨酸(T43)；SEQIDNO：2(小鼠)第43位的苏氨酸；SEQIDNO：1(人)第500位的丝氨酸(S500)；SEQIDNO：2(小鼠)第533位的丝氨酸(S533)；和来自其它物种或同种型的DLK中的等同残基。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中降低或抑制DLK磷酸化的试剂选自抗体、小分子、多肽和短干扰RNA(siRNA)。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述试剂是抗体。
8.权利要求7所述的方法，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述神经元或其部分存在于人受试者中，存在于神经移植物或神经移植体中，或是离体的或体外的。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述神经元选自由以下组成的组：小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、视网膜神经节细胞神经元和皮质神经元。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中DLK磷酸化的降低或抑制不影响DLK激酶活性。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述试剂是JNK的抑制剂。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用JNK的抑制剂。
14.权利要求12或13所述的方法，其中JNK的抑制剂抑制选自JNK1；JNK2；JNK3；以及JNK1、JNK2和JNK3的任意组合的JNK。
15.权利要求14所述的方法，其中JNK的抑制剂选自JNK抑制剂V、JNK抑制剂VII(TAT-TI-JIP153-163)、JNK抑制剂VIII和siRNA。
16.权利要求3-15中任一项所述的方法，其中所述患者患有选自下述的疾病或病症：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森叠加病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、遗传性肌萎缩、无脊椎动物盘综合征、颈椎病、神经丛疾病、胸廓出口破坏综合征、周围神经病、卟啉病、亨廷顿病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、路易小体痴呆、额颞叶痴呆、脱髓鞘性疾病、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、进行性神经性腓骨肌萎缩症、朊病毒病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、格-施-沙综合征(GSS)、致死性家族失眠症(FFI)、牛海绵状脑病、皮克病、癫痫、和AIDS痴呆综合征、慢性疼痛、纤维肌痛、脊柱痛、腕管综合征、来自癌症的疼痛、关节炎、坐骨神经痛、头痛、外科手术疼痛、肌肉痉挛、背痛、内脏痛、受伤疼痛、牙痛、神经痛比如神经原性或神经病性疼痛、神经炎症或损伤、带状疱疹、椎间盘突出、韧带撕裂、和糖尿病、由糖尿病、癌症、AIDS、肝炎、肾功能障碍、科洛拉多蜱传热、白喉、HIV感染、麻风、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、结节病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮、或淀粉样变性引起的周围神经病或神经痛、暴露于毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物、化疗剂、氨苯砜、HIV药物、降胆固醇药物、心脏或血压药物、或甲硝唑而引起的神经损伤、由物理、机械或化学外伤引起的神经系统损伤、神经分裂症、妄想性精神障碍、分裂情感性精神障碍、精神分裂症样、分担类精神障碍、精神病、偏执性人格障碍、分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会性人格障碍、自恋性人格障碍、强迫性障碍、谵妄、痴呆、心境障碍、双相性精神障碍、抑郁症、应激障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社交恐怖症、外伤后应激障碍、焦虑症、和冲动控制障碍、青光眼、角膜网络状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关的黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光受体变性、其它视网膜变性、视神经玻璃疣、视神经病、和视神经炎。
17.检测神经元中应激依赖性或促凋亡DLK活性的方法，所述方法包括：(a)将生物样品与特异识别DLK的磷酸化形式的抗体接触；和(b)检测抗体对生物样品内DLK磷酸化形式的结合，其中被抗体结合表明应激依赖性或促凋亡DLK活性。
18.权利要求17所述的方法，所述方法还包括测量抗体对DLK的磷酸化形式的结合，其中相对于对照，生物样品中抗体结合的增加表明应激依赖性或促凋亡DLK活性。
19.权利要求17或18所述的方法，其中所述生物样品包含选自神经元、神经元细胞裂解产物和从神经元纯化的DLK的生物材料。
20.权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性结合在选自下述的氨基酸残基处磷酸化的DLK：SEQIDNO：1(人)第43位的苏氨酸(T43)；SEQIDNO：2(小鼠)第43位的苏氨酸；SEQIDNO：1(人)第500位的丝氨酸(S500)；SEQIDNO：2(小鼠)第533位的丝氨酸(S533)；和来自其它物种或同种型的DLK中的等同残基。
21.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中DLK的磷酸化是对神经元应激或损伤的响应。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022221218A1 (en) * 2021-04-12 2022-10-20 The Regents Of The University Of California Gene therapy for neuroprotection

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056609A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 Washington University Methods and compositions for inhibition of axonal degeneration by modulation of the dlk/jnk pathway
WO2010048446A2 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
WO2011050192A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
CN102549159A (zh) * 2009-03-17 2012-07-04 欧科库尔纳有限责任公司 通过抑制针对δ样1同源物(DLK1)的天然反义转录物来治疗DLK1相关的疾病

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003207104A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-09 Eisai Co., Ltd. Novel fused ring indazole compounds
EP1487436A4 (en) * 2002-03-08 2009-06-03 Signal Pharm Inc POLYTHERAPY FOR TREATING, PREVENTING OR MANAGING PROLIFERATIVE DISORDERS AND CANCERS
US7241779B2 (en) * 2003-12-23 2007-07-10 Cephalon, Inc. Fused pyrrolocarbazoles
US20080051319A1 (en) * 2006-08-22 2008-02-28 Children's Medical Center Corporation Inhibiting JNK Signaling Promotes CNS Axon Regeneration

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056609A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 Washington University Methods and compositions for inhibition of axonal degeneration by modulation of the dlk/jnk pathway
WO2010048446A2 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
CN102549159A (zh) * 2009-03-17 2012-07-04 欧科库尔纳有限责任公司 通过抑制针对δ样1同源物(DLK1)的天然反义转录物来治疗DLK1相关的疾病
WO2011050192A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEAN-PHILIPPE COUTURE等: "DLK", 《UCSD NATURE MOLECULE PAGES》 *
马仙珏等: "双亮氨酸拉链激酶DLK 对JNK 信号通路的调控作用及机制", 《遗传》 *

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