KR20150119009A

KR20150119009A - 자간전증의 개시를 예측하기 위한 진단 기구

Info

Publication number: KR20150119009A
Application number: KR1020157024420A
Authority: KR
Inventors: 저스틴 엘. 그로브; 마크 케이. 산틸란
Original assignee: 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2014-02-10
Publication date: 2015-10-23
Also published as: EP2954324A4; MX2015010174A; EP2954324A1; WO2014124392A1; JP2016507753A; CA2900366A1; CN105308456A; US20150374698A1; EP2954324B1; US20150377876A1; WO2014124396A1; US20180228806A1; US9937182B2

Abstract

대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하기 위한 검정, 키트, 방법 및 장치가 개시되어 있다.

Description

자간전증의 개시를 예측하기 위한 진단 기구{DIAGNOSTIC TOOLS TO PREDICT ONSET OF PREECLAMPSIA}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 각각 2013년 2월 8일자로 출원된 미국 특허출원 제61/762,831호 및 제61/762,830호 뿐만 아니라 2013년 11월 13일자로 출원된 미국 특허출원 제61/906,074호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다.

고혈압은 전세계 모든 임신부의 10% 이하에서 심해진다. 미국에서, 자간전증은 모든 임신부의 5 내지 7%, 대략 1년에 300,000명의 임신부에서 발병한다. 또한, 이는 불균형적으로 모든 산모-태아 이환률 및 사망률의 15%를 나타낸다. 자간전증은, 성장 제한, 양수과소증, 태아 사망, 산모 발작, 뇌졸중, 뇌혈관 출혈, 및 산모 사망과 같은 즉각적인 산모-태아 이환률을 야기하는 것으로 알려져 있다(73). 자간전증 이력을 갖는 어머니는, 심근 경색 및 뇌졸중을 포함하는 추가의 심장 질환의 위험이 증가된다(23, 52, 53). 또한, 자간전증 임신부로부터 태어난 아이도 후기 아동기에서 또는 성인으로서 뇌졸중(40), 뇌전증(91), 및 대사, 영양 및 혈액 질환(90)의 위험이 증가된다. 명백하게, 자간전증은 태아와 어머니 둘 다에 즉각적이고 장기간의 효과를 갖는다. 그러나, 이의 발병은 잘 이해되어 있지 않다. 그 결과, 자간전증에 대한 예방적, 치료적 및 치유적 양상을 규정하기가 힘들다. 자간전증에 대한 유일하고 진정한 치유책은 태아 및 기능장애성 태반의 분만이다. 이러한 분만은 흔히 조산이며, 추가의 이환률 및 사망률에 기여한다(73). 이러한 사실은, 자간전증을 치료할 수 있는 적절한 통합적 경로를 찾아내는 것의 중요성을 강조한다.

신경뇌하수체 호르몬, 아르기닌 바소프레신(AVP; 도 1)은, 사람 및 동물 모델에서의 혈압 및 혈액 조성의 공지된 조절인자이다. AVP는, 아프리카계 미국인(4), 노인(19), 및 울혈성 심부전(25) 또는 신부전(3)을 갖는 환자를 포함하는 선택된 인구에서 혈압 조절에 있어서 주요한 인자이다. 이 호르몬은, 특이적으로 저-레닌 고혈압(76)을 가진 환자에서 원인이 되는 것으로 보이며, 저-레닌 고혈압은 고-레닌 고혈압(16%)보다 사람 본태성 고혈압 인구의 보다 큰 부분(27%)을 차지한다(49).

증거들은, 자간전증의 발병에 있어서 AVP에 대한 가능한 잠재적 역할을 지지한다. 코펩틴은 AVP와 함께 번역되고 AVP에 대해 1:1 화학양론 비로 혈장으로 방출된다(도 1). 코펩틴은 순환시 AVP보다 훨씬 더 안정하기 때문에, 이 펩타이드의 측정은 AVP의 직접 측정보다 훨씬 더 일관되고 신뢰할 수 있다. 임신 후기 혈장 코펩틴 수준은 사람에서 자간전증의 중증도 및 관련 비정상 태반 도플러(Doppler) 속도 측정법과 상관성이 있었다(21, 101). 또한, 임신 초기 코펩틴의 발현 패턴은 분명하지 않다.

본 발명의 요약

제1 양상에서, 대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하기 위한 키트는 임신 제1 분기(first trimester) 동안 대상체로부터 채취한 샘플 중의 코펩틴의 검출에 특이적인 항체 검출 검정을 포함한다.

한 실시형태에서, 상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇨 중 하나 이상을 포함한다.

추가의 실시형태에서, 상기 샘플은 뇨이다.

키트의 다른 실시형태에서, 상기 검정은 테스트 스트립 또는 ELISA를 포함한다.

추가의 실시형태에서, 대조군과 비교하여 약 1/4배의 코펩틴 수준의 증가가 대상체의 임신 동안 자간전증의 발병을 예측한다.

다른 실시형태에서, 항체 검출 검정은 또한 바소프레신 및 뉴로피신 II를 검출한다.

제2 양상에서, 대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하는 방법은, 임신 제1 분기 동안 대상체로부터 뇨 샘플을 수집하는 단계, 및 항체 검출 검정을 사용하여 대조군과 비교하여 코펩틴 수준의 차이를 측정하는 단계를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 대상체의 자궁 및 제동맥 중 하나 이상에 대해 도플러 속도 측정(Doppler velocimetry measurement)을 실시함을 추가로 포함한다.

제3 양상에서, 대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하기 위한 키트는, 대상체로부터 채취한 샘플 중의 LNPEP의 검출에 특이적인 효소 검출 검정을 포함한다.

한 실시형태에서, 상기 효소 검출 검정은 항체 검출 검정이다.

추가의 실시형태에서, 상기 효소 검출 검정은 효소 활성 검정이다.

다른 실시형태에서, 상기 키트는 코펩틴에 대해 특이적인 항체 검출 검정을 추가로 포함한다.

다른 실시형태에서, 대조군과 비교하여 약 1/4배의 LNPEP 수준의 감소 및 코펩틴 수준의 증가가 대상체 임신 동안 자간전증의 발병을 예측한다.

제4 양상에서, 대상체가 자간전증 발병 성향이 있는지를 예측하기 위한 시험 장치는, 바소프레신 유전자의 단백질 생성물의 검출을 위한 시험 검정을 포함하는 기판, 샘플 적용 영역, 및 판독 영역을 포함한다. 사용자에 의한 대상체 유래의 샘플의 적용시, 상기 시험 장치는, 대상체가 임신중인지, 대상체가 자간전증 발병 성향이 있는지를 나타내는 정보를 사용자에게 제공한다.

장치의 한 실시형태에서, 상기 기판은 플라스틱, 유리, 금속, 셀룰로스성 물질, 중합체, 및 직물, 및 이들의 배합물 중 하나 이상을 포함한다.

장치의 다른 실시형태에서, 샘플 적용 영역은 판독 영역에 유동적으로 연결되어 있다.

장치의 추가의 실시형태에서, 사용자에 의한 샘플 적용 영역으로의 대상체 유래의 샘플의 적용시, 검출 검정이 장치 내에 맞물릴 수 있다.

장치의 다른 실시형태에서, 사용자에게 제공되는 정보는 판독 영역에서의 표시(indicium)를 포함한다.

장치의 추가의 실시형태에서, 상기 장치는, 상기 장치에 의해 제공되는 정보를 해석하기 위한 사용자 지침서를 추가로 포함한다.

다른 실시형태에서, 상기 시험 장치는 복수의 시험 검정을 포함한다.

도 1은 바소프레신(AVP) 유전자의 단백질 생성물을 도시한다. 신호 서열은 세포 이출(cellular export)을 위한 단백질을 표적으로 한다. 이어서, 아르기닌 바소프레신(AVP)이 생성되고, AVP 담체 단백질 뉴로피신 II 및 코펩틴과 1:1 몰 비로 방출된다. AVP는 혈장 내에서 매우 짧은 반감기를 나타내는 반면, 코펩틴은 훨씬 더 안정하고 주로 뇨로 제거되며, 여기서, 이것은 면역-기반 검정에 의해 용이하게 검출될 수 있다(3, 5).
도 2는, 본원에서 고려되는 시험 검정을 도시한다. 패널 A는, 사용되지 않은 시험 검정 장치를 나타내고, 패널 B는 사용자가 샘플을 장치가 샘플이 자간전증에 대해 증가된 위험을 갖지 않는(- 징후) 임신부(+ 징후)로부터 유래한 것임을 나타내는 곳에 적용하는 장치를 나타내고, 패널 C는, 사용자가 샘플을 샘플이 자간전증의 증가된 위험을 갖는 임신부(이중 + 징후)로부터 유래한 것임을 나타내는 장치에 적용하는 장치를 도시한다.
도 3. sRA 마우스에서의 증가된 바소프레신. A: 암컷 sRA 및 대조군 동물에서 시삭상핵(SON, 상부 및 중간 렬, 4마리의 별개의 동물 유래) 및 실방핵(PVN, 하부 렬, 2마리의 별개의 동물 유래)에서의 아르기닌 바소프레신(AVP) 면역반응성. sRA 동물에서 SON의 역교차(retrochiasmatic) 부분에서 강한 면역반응성 AVP 뉴런의 수가 증가함을 주지한다. ON, 시삭; 3V, 제3 뇌실. 막대 = 200μm. B: 한배새끼(littermate) 대조군 및 sRA 마우스(각 그룹 n = 3마리 암컷)의 PVN 및 SON을 통한 4개의 일련의 절편(200μm 간격으로 떨어져 있음)에서, 직경이 10μm 초과인 사이드당 총 면역반응성 세포 단편. C: 혈장 코펩틴 수준(n = 4마리 수컷 + 4마리 암컷 대조군, 4마리 수컷 + 4마리 암컷 sRA). D: 뇨 코펩틴 농도, 총 1일 뇨 용적, 및 뇨로의 총 1일 코펩틴 손실(n = 12마리 수컷 + 5마리 암컷 대조군, 10마리 수컷 + 7마리 암컷 sRA). 모든 데이터는 평균 ± SE이다. *P < 0.05 vs. 대조군.
도 4. 바소프레신 수용체 길항제에 대한 혈압 반응. A: V1A/V2 비펩타이드 길항제 코니밥탄(conivaptan)의 만성 피하 주입(22ng/h)의 기저선에서 및 10일째 테일-커프(tail-cuff)에 의해 모니터링된 수축기 혈압(BP)(n = 2마리 수컷 + 4마리 암컷 대조군, 2마리 수컷 + 4마리 암컷 sRA). 암컷 sRA 마우스에서 비선택적 V1A/V2 수용체 길항제 코니밥탄(22ng/h)의 피하 주입하기 전 3일 동안 및 주입하는 동안 18일 동안의 시간당 원격측정 혈압(B, MAP) 및 심박수(C, HR) 기록을 나타낸다. D: (B 및 C에서) 코니밥탄 주입 실험 동안의 자발적인 보행의 신체 활동 계수. E: V2-선택적 길항제 톨밥탄(tolvaptan)의 만성 피하 주입(22ng/h)의 기저선에서 및 10일째 테일-커프에 의해 모니터링된 수축기 BP(n = 4마리 수컷 + 5마리 암컷 대조군, 4마리 수컷 + 6마리 암컷 sRA). F: 피하 톨밥탄 주입(약물 X 횟수, P = 0.029)의 기저선에서 및 10일 후 sRA 마우스(n = 4마리 암컷)로부터의 시당간 평균 전파원격측정 MAP 기록. 모든 데이터는 평균 ± SE이다. *P < 0.05 vs. 대조군,

P < 0.05 vs. 기저선 sRA.
도 5. 복부 대동맥의 혈관 반응성. A: 100mmol/l KCl에 대한 최대 수축 반응(maximum contractile response). B 및 C: PGF₂ _α에 대한 반-최고치 수축 후의 수준별 용량(graded dose)의 아세틸콜린 및 니트로프루시드 나트륨에 대한 이완 반응. D 내지 H: 수준별 용량의 아르기닌 바소프레신, 페닐에프린, 엔도텔린-1, 안지오텐신 II, 및 프로스타글란딘-F_2α(PGF₂ _α)에 대한 수축 반응(n = 6마리 수컷 대조군, 5마리 수컷 sRA). 모든 데이터는 평균 ± SE이다. *P < 0.05 vs. 대조군.
도 6. 장간막 동맥 혈관 반응성. A: 100mmol/l KCl에 대한 최대 수축 반응. B: 수준별 용량의 아르기닌 바소프레신, 페닐에프린, 및 엔도텔린-1에 대한 수축 반응(n = 6마리 수컷 대조군, 6마리 수컷 sRA). C: 칼슘-비함유 조건에서, 75mmHg 내강 압력에서 유지된 장간막 동맥의 외부 및 내강 직경, 벽 두께, 중막-대-내강 비(media-to-lumen ratio) 및 단면적. D: AVP V1A 수용체, 엔도텔린-1 ETA 수용체, RGS2 및 RGS5의 장간막 동맥 mRNA 발현(V1A, RGS2, 및 RGS5; n = 4마리 수컷 + 5마리 암컷 대조군, 4마리 수컷 + 3마리 암컷 sRA. ETA, n = 4마리 수컷 대조군, 4마리 수컷 sRA). 모든 데이터는 평균 ± SE이다. *P < 0.05 vs. 대조군.
도 7. 혈청 전해질. A: 혈청 나트륨 농도. B: 혈청-이온화 칼슘 농도(기저선: n = 8마리 수컷 및 12마리 암컷 대조군, 5마리 수컷 및 8마리 암컷 sRA; 톨밥탄: n = 4마리 수컷 및 5마리 암컷 대조군, 4마리 수컷 및 6마리 암컷 sRA). 모든 데이터는 평균 ± SE이다. *P < 0.05 vs. 대조군.

P < 0.05 vs. 기저선 sRA.
도 8. 자간전증성 여성의 저장된 샘플에서의 코펩틴 수준의 초기 ELISA 스크린.
도 9. 임신 3개월까지의 산모 혈장 코펩틴, 시스타틴 C, 및 바소프레시나제(LNPEP) 단백질 농도. (A) 비-임신부 및 정상 혈압의 임신부와 비교하여, 혈장 코펩틴 농도는, 결국 자간전증을 발병한 여성에서 3개의 임신 분기(trimester) 모두에서 유의하게 증가하였다. 중요하게, 코펩틴은 일찍이 임신 6주에 극도로 증가하였다. (B) 혈장 시스타틴 C는, 자간전증을 경험했거나 경험하지 않은 여성에서 유사한 방식으로 재태 기간(gestational age)에 의해 영향을 받았다. (C) 혈장 LNPEP는 재태 기간에 의해 그리고 자간전증 상태에 의해 본질적으로 변하지 않았다. *P<0.05 vs 비임신 및 임신 기간-매치된 대조군 임신부 샘플.
도 10. 임의의 공변량에 대한 조정 부재시 산모 혈장 코펩틴의 예측 값. 후속적인 자간전증 발병에 대한 예측 기구로서의, 공변량에 대한 교정 부재시 코펩틴의 유용성의 수신기 조작기 특성(Receiver operator characteristic; ROC) 분석.
도 11. C57Bl/6J 마우스에서 자간전증-유사 표현형을 유도하기에 충분한 바소프레신. (A) 바소프레신 주입이 생식력을 유의하게 감소시켰다. X² P<0.005. (B) 바소프레신 주입은, 임신한 마우스에서 고혈압 및 단백뇨를 유도하는 것으로 밝혀진다. (C) 바소프레신 주입에 의한 상당한 태아 성장 제한을 설명하는, 예시적인 임신 18일째 태아의 영상. (D) 사구체 내피세포증을 예시하는 신장 피질의 전자 현미경 사진. 상부 2개의 패널은 정상 한계 내의 사구체 기저막 두께를 갖는 염수 주입된 동물 유래의 것이다(얇은 백색 화살표). 하부 2개의 패널은 바소프레신을 주입받은 동물 유래의 것이다. 여분의 내피 세포막이 존재하며(두꺼운 흑색 화살표), 기저막은 전자 고밀도 재료로 현저하게 두꺼워져 있다(두꺼운 백색 화살표).

본 발명은, 적어도 부분적으로, 임신 동안 코펩틴 수준의 초기 측정이 임신 후기에 자간전증을 발병하는 대상체를 예측한다는 발견에 기초한다. 게다가, 바소프레신 및 기타의 펩타이드 호르몬을 분해하는 아연-의존성 아미노펩티다제인 LNPEP(류실/시스티닐 아미노펩티다제)의 혈청 수준의 측정이 또한 임신 후기에 자간전증을 발병하는 대상체를 진단하는 것으로 믿어진다. 자간전증 발병의 이러한 지표를 검출하기 위한 검정 및 방법들을 조합하고, 대상체의 자궁 및 제동맥 중의 적어도 하나에 대한 도플러 속도 측정법을 포함한 자간전증에 대한 추가의 검정과 추가로 결합시킬 수 있다. 추가의 검정들을 이수성에 대한 혈청 스크리닝과 같은 본원에 기재된 검정 및 당업계에 공지된 기타의 검정들과 조합할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 이러한 방식으로, 단일 장치가 산모 및/또는 태아에 영향을 미칠 수 있는 다수의 상태들을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

한 실시형태에서, 코펩틴 및/또는 LNPEP의 수준을 측정함으로써 자간전증의 발병을 진단하기 위한 검정은 가용성 Fit-1(s-Flt-1) 및/또는 PIGF(태반 성장 인자)를 측정하기 위한 수단, 예를 들면, 항체-매개 검출 등을 추가로 포함할 수 있다. sFlt-1(가용성 fms-유사 티로신 키나제-1- 또한 VEGF 수용체-1로서 공지됨)은 신생혈관생성 인자(proangiogenic factor) VEGF(혈관 내피 성장 인자) 및 PIGF에 결합하여 이의 유리 순환 수준을 감소시킨다. 예를 들면, sEng, VEGF, PIGF, 자궁 동맥 도플러(Dopplers), hCG, 인히빈, papp-a, afp, 에스트리올, 목덜미 투명대(nuchal translucency), 인터루킨, 예를 들면, IL- 1β 또는 IL-6, 고 감도 C-반응성 단백질 및 PAPP-A와 같은 자간전증관과 관련된 바이오마커를 포함한 추가의 마커를 또한 자간전증을 예측하기 위해 코펩틴과 함께 또는 코펩틴에 추가하여 평가할 수 있다.

다른 실시형태에서, 이미 자간전증을 진단받은 환자에서 코펩틴 수준 단독 측정 또는 다른 자간전증 마커와 조합한 측정은 질환 악화의 예후인자(prognosticator)일 수 있으며, 의사가 외래 환자 기대 요법(outpatient expectant management), 환자 기대 요법(inpatient expectant management) 또는 태아의 즉시 분만과 같은 추가의 관리 결정을 내리는데 도움을 줄 수 있다.

대상체에서 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하기 위해 고려되는 키트는 하나 이상의 항체 검출 또는 적어도 대상체로부터 채취한 샘플 중의 코펩틴 및/또는 LNPEP의 검출에 특이적인 기타의 검정(시험 검정)을 포함할 수 있다. 샘플은 대상체로부터 임신 초기에, 예를 들면, 임신 제1 분기에 채취한다. 제2 분기 및 제3 분기를 포함한 임신 후기 샘플을 또한 측정할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 또한, 임신전 샘플이 임신부에 대한 대조군으로서 및/또는 예측 샘플 자체로서 평가될 수도 있다. 항체-기반 검출 검정이 본원에서 고려되지만, 예를 들면, 단백질- 및/또는 펩타이드-특히 검정, 효소 활성 검정(효소 검출 검정) 및 질량 분광분석법을 포함한, 당업계에 공지된 바와 같은 추가의 시험 검정 또는 검출 검정, 예를 들면, 코펩틴- 및 LNPEP-특이 검정 또는 바소프레신 유전자의 단백질 생성물에 특이적인 검정이 또한 본원에서 고려된다. 키트는 양성 및 음성 대조군 샘플, 검정 시약 뿐만 아니라 지침서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 고려되는 샘플은 전혈, 혈청 및/또는 혈장을 포함한 혈액 분획, 뇨, 조직, 세포, 및, 예를 들면, 땀과 눈물을 포함한 체액을 포함한다. 하나의 바람직한 샘플은 혈장이다. 다른 바람직한 샘플은 혈청이다. 다른 바람직한 샘플은 뇨이다. 한 실시형태에서, 키트는 혈장, 혈청 또는 뇨에 사용될 수 있는 항체 검출 검정을 포함하며, 즉, 어떠한 신체 샘플이라도 단일 검정을 위해 사용될 수 있다.

추가의 실시형태에서, 검정은 테스트 스트립, ELISA, 또는 기타의 항체-기반 또는 기타의 표적-특이 검정, 예를 들면, 표적 효소의 존재여부가 효소 활성으로 인해 발색 수단 등에 의해 검출되는 효소 활성 검정을 포함할 수 있다. 테스트 스트립은 바이엘 코포레이션(Bayer Corporation)(Elkhart, IN)의 미국 특허 제6,210,971호 또는 제5,733,787호(각각은 본원에 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같은 통상의 방식으로 제조될 수 있다. 테스트 스트립은 당업계에 공지된 바와 같이 표적 에피토프의 부착과 하나 이상의 발색성, 형광성 또는 발광성 반응의 개시를 결합시켜 목적하는 표적의 결합을 나타낼 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 테스트 스트립은 지지 물질의 층에 결합된 대사산물을 고정시킬 수 있는 흡수성 기판으로서 특징지워질 수 있다. 널리 공지된 고체 상 지지체는 종이, 셀룰로스, 합성 수지, 예를 들면, 나일론으로 만들어진 섬유 또는 부직포를 포함할 수 있다. 흡수재(absorbent material)는 전형적으로 유리 섬유 또는 합성 중합체 시트와 같은 지지 물질의 층에 결합되어 구조적 지지를 제공한다. 기타의 적합한 고체 상 지지체가 본원에서 고려된다.

또한, 두 가지(또는 그 이상, 예를 들면, 세 가지 또는 네 가지) 검정을, 예를 들면, 발색 또는 기타의 수단(예를 들면, 뇨 분석 또는 기타의 샘플을 기초로 함)을 사용하는 임신 검사와 같은 단일 검정 장치에 조합할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 임신 검사 이외에, 자간전증의 예측을 위한 하나 이상의 검사가 포함된다. 이러한 실시형태에서, 임신에 대한 "양성" 결과(대상체가 임신임)가 1차 표시로 나타날 수 있고, (자간전증에 대한 소인을 나타내는) 자간전증 검사에 대한 "양성" 결과는 2차 표시로 나타날 수 있다.

다른 실시형태에서, 코펩틴 및 LNPEP와 같은 임신 및 다중 자간전증 예측 마커에 대해 검사하는 3시험 검정이 고려된다. 이러한 방식으로, 자간전증을 동반하는 임신의 예측을 위한 보다 큰 특이성이 단일 시험으로 취해질 수 있다.

시험 검정은 최종 사용자(예를 들면, 임신인지 자간전증의 위험이 있는지를 알고 싶어하는 여성)에 의해 구입될 수 있는 일회용 장치에 삽입될 수 있다. 시험 검정 장치는 뇨, 혈액, 또는 다른 몇 가지 샘플을 이의 단일 또는 다중 부분에 적용하고, 시험 검정을 규정된 시간, 예를 들면, 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분 또는 약 1시간 동안 항온배양하고, 결과를 시험 검정 장치가 구입되거나 시험 검정 장치 자체에 있는 패키지와 관련된 해석 키에 비교함으로써 사용될 수 있다. 고려되는 시험 장치(10)가 도 2에 도시되어 있다. 시험 장치(10)는 기판(12), 샘플 적용 영역(14) 및 판독 영역(16)을 갖는다. 기판은, 예를 들면, 플라스틱, 유리, 금속, 셀룰로스성 물질, 중합체, 직물 및 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 샘플 적용 영역(14)은 기판(12) 내에서 및/또는 기판의 표면 상에서 판독 영역(16)에 유동적으로 연결될 수 있다. 유체 연통(fluid communication)은 하나 이상의 미세유체 채널, 심지, 모세관 작용을 야기하는데 적합한 공간 등을 통해 이루어질 수 있다. 사용자에 의해 대상체로부터의 샘플을 샘플 적용 영역(14)에 적용시, 하나 이상의 시험이 보조 물질(예를 들면, 액체 담체 및/또는 검정 시약)의 적용에 의해 맞물릴 수 있다. 보조 물질의 예는 물, 염수, pH 완충제, 변색제, 단백질, 효소 및/또는 펩타이드를 포함한다. 항온배양 기간 후, 시험 검정은 시험(들)의 결과를 나타내는 판독치를 판독 영역(16)에서 사용자에게 제공할 수 있다. 패널 B는 시험 장치(10)에 적용된 샘플이 자간전증에 대한 소인이 없는(- 신호로 나타냄) 임신부(+ 신호로 나타냄)로부터 온 것이라는 시나리오를 묘사한다. 패널 C는 시험 장치(10)에 적용된 샘플이 자간전증에 대한 소인을 갖는 임신부로부터 온 것이라는 시나리오를 묘사한다(이중 + 신호). 어떠한 표시도 장치에 사용될 수 있다. 게다가, 시험 장치에 적용된 샘플이 비-임신부로부터 온 것이라는 시나리오는 이중 - 신호를 갖거나 신호를 전혀 갖지 않을 수 있다(나타내지 않음).

대조군과 비교하여, 예를 들면, 약 1/100배, 또는 약 1/50배, 또는 약 1/25배, 또는 약 1/16배, 또는 약 1/8배, 또는 약 1/4배, 또는 약 2배, 또는 그 이상이나 미만을 포함한 샘플에서의 코펩틴 수준의 증가가 대상체의 임신 동안의 자간전증의 발병을 예측하는 것으로 간주된다.

유사하게, 대조군과 비교하여, 예를 들면, 약 1/100배, 또는 약 1/50배, 또는 약 1/25배, 또는 약 1/16배, 또는 약 1/8배, 또는 약 1/4배, 또는 약 2배, 또는 그 이상이나 미만을 포함한 샘플에서의 LNPEP 수준의 감소가 대상체의 임신 동안의 자간전증의 발병을 예측하는 것으로 간주된다.

한 실시형태에서, 대상체에서 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하는 방법은 임신 제1 분기 동안 대상체로부터 샘플, 예를 들면, 뇨를 수집하고, 항체 검출 검정 또는 기타의 검정을 사용하여 샘플에서 코펩틴 수준을 측정하고, 대상체의 코펩틴 수준을 대조군과 비교함으로써 대상체가 임신 후기에 자간전증을 발병할 가능성이 있는지를 결정함을 포함할 수 있다. 검정은, 예를 들면, 기판의 색 변화, 빛 방출, 빛 방출 강도의 변화, 밀도계측 또는 불투명도/반투명도의 변화에 의해 데이터를 제공할 수 있다. 이러한 데이터는 결국, 대조군과 비교하여 플롯팅될 수 있는 데이터 포인트로 변환될 수 있다.

상기 방법은 대상체의 자궁 및 제동맥 중의 적어도 하나에 대한 도플러 속도 측정을 수행함을 추가로 포함할 수 있다.

임신 초기(early pregnancy)란, 적어도 무월경 20주 전, 보다 바람직하게는, 적어도 임신 약 16주, 또는 약 12주, 또는 약 8주, 또는 약 4주 전을 의미한다. 임신 초기는 또한 임신 제1 분기 동안일 수 있다.

"환자" 또는 "대상체"란, 사람과 같은 여성 대상체를 의미한다. 본원에서 고려되는 대조군은 단독의 연령-매치된 건강한 임신 대상체, 또는 다수의 연령-매치된 건강한 임신 대상체 또는 다수의 건강한 임신 대상체의 개체군, 또는 다수의 건강한 임신 대상체의 개체군으로부터의 혈청 및/또는 뇨 샘플을 포함할 수 있으며, 이들 중의 아무도 임신 동안 후에 자간전증을 발병하지 않는다. 또한, 소정의 대조군은 소정의 음성 대조군일 수도 있다. 예를 들면, 소정의 음성 대조군은 임신 동안 자간전증을 발병하는 하나의 또는 다수의 대상체를 포함한다.

여기서 고려되는 항체 검출 검정은 관심있는 특정 분자를 표적으로 하는 항체 또는 항체 서브파트를 사용하는 검정을 포함할 수 있다. 분자의 검출은 항체 또는 항체 서브파트와 관련된 지표, 예를 들면, 형광 분자, 효소, 크로마젠, 화학-발광, 또는 방사 화학 및 이들의 조합과 함께 분자로의 항체 부착을 통해 일어날 수 있다. 관심있는 분자, 예를 들면, 코펩틴 또는 기타의 AVP 유전자 단백질 생성물은 컬럼 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 질량 분광분석법 및 이들의 조합으로 측정할 수 있는 것으로 추가로 구상된다.

항체 검출 검정의 한 가지 예는 ELISA이다. ELISA는 코펩틴의 항원 또는 에피토프 또는 바소프레신 및 뉴로피신 II와 같은 바소프레신(AVP) 유전자의 단백질 생성물의 기타의 공동발현 영역에 특이적인 향체를 포함할 수 있다(도 1). 항원은 천연 또는 합성 단백질 또는 이의 단편, 다당류, 또는 핵산일 수 있다. 숙련가들은 항원이 면역 반응을 유도하고 항체 형성을 끌어낼 수 있음을 알고 있다. 항체는 이물질의 존재에 반응하여 합성되는 분자일 수 있으며, 여기서, 각각의 항체는 이의 합성을 자극하는 이물질에 대해 특이 친화력을 갖는다. 항체의 특이 친화력은 전체 분자 항원에 대해서가 아니라 그 위의 에피토프라고 불리는 특정 부위에 대해 필요할 수 있다(문헌 참조: Kindt et al., Kuby Immunology, 6th Edition 574 pps, (2006), 전문이 기재된 것과 같이 본원에 참고로 인용됨). 항체는, 예를 들면, 단밸질-결합 또는 기타의 항원-결합 특징을 갖는 천연 또는 합성 단백질 또는 이의 단편 또는 핵산(예를 들면, 압타머)일 수 있다. 항체는 이질 단백질, 미생물 및 독성에의 노출을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항원성 자극에 대한 반응으로 생산될 수 있다. 패널이 패널의 항원에 특이적인 하나 이상의 항체를 함유하는 샘플과 접촉하는 경우, 항원과 항원에 특이적인 항체 간에 면역복합체가 형성된다. 당업게의 통상의 숙련가는 당업계에서 통상적으로 사용되는 기술로 항원-항체 면역복합체 형성을 평가할 수 있다. 본원에서 고려되는 면역복합체 형성을 평가하는데 적합한 추가의 검정의 예는 파지 면역블롯 및 방사면역검정을 포함한다. 예를 들면, 문헌(참조; Dubovsky et al, J. Immunother. 30:675-683 (2007), 전문이 기재된 것과 같이 본원에 참고로 인용됨)를 참고한다.

명세서에 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 숙련가에 의해 및 공개된 본문을 참고로 하여 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

다양한 실시형태들이 명세서에서 "포함하는(comprising)"이라는 표현을 사용하여 나타내어져 있지만, 다양한 상황하에서, 관련 실시형태는 "로 이루어진" 또는 "로 필수적으로 이루어진"이라는 표현을 사용하여 기재될 수도 있는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 나타내는 것으로 주지되어야 하며, 예를 들면, "면역글로불린 분자(an immunoglobulin molecule)"는 하나 이상의 면역글로불린 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a" (또는 "an"), "하나 이상(one or more)" 및 "적어도 하나(at least one)"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.

하기 실시예는 본 발명에 따르는 바람직한 마커 및 방법들을 개시한다. 그러나, 이러한 실시예는 예시로 제공되며 본원의 어떤 것도 본 발명의 전반적인 범위에 대한 제한으로서 간주되어서는 안되는 것으로 이해되어야 한다. 부록 A에 포함된 첨부파일은 인용에 의해 포함된다.

실시예

실시예 1. 뇌 레닌- 안지오텐신계의 형질전환 활성화( transgenic activation)를 갖는 마우스에서의 고혈압은 바소프레신 의존적이다.

뇌 내에서의 국소 조직 레닌-안지오텐신계(RAS)의 활성은, 다수 형태의 고혈압에서 증가된 혈압의 발달과 유지에 연루되어 있다. 고혈압에서 뇌 RAS 활성에 대한 원인적 역할을 구체적으로 입증하는 증거들이 다양한 설치류 모델로부터 유래된다. 이러한 다수의 모델로는 말초 안지오텐신 주입 모델(59, 77, 100), 증가된(18) 및 억제된(36, 48, 65) 혈장 레닌 모델, 심인성(55), 한냉 손상(cold exposure)(82), 신장 외상(96), 수면 무호흡(16) 모델, 형질전환 TGR(mRen2)27 래트(83), 및 Dahl 염-민감성(36) 및 고염 식이(47, 61, 95)로 유지된 자연발생 고혈압 래트(SHR)가 포함된다. 뇌 안지오텐신의 혈압 영향을 설명하는 두 가지 주요한 메커니즘이 입증되어 있다. 첫째, 시삭상핵(SON) 및 실방 시상하부핵(PVN) 내에서의 RAS의 작용이 아르기닌 바소프레신(AVP, 항이뇨 호르몬, ADH, 또는 아르기프레신으로서도 공지됨)의 생산과 방출을 자극한다(6, 13, 22, 38, 66, 69, 83). 둘째, RAS의 후뇌 및 뇌간 작용이 압반사 기능 및 교감 출력(sympathetic output)을 변화시킨다(28, 32). 흥미롭게도, 개체군의 AVP-발현 뉴런은 PVN에서 후뇌 및 척수로 돌출되며, 교감 신경 활성의 조절에 관여하는 것으로 보이며, 이것은 이들 두 가지 메커니즘 간의 가능한 AVP-매개된 교차 작용(cross-talk)을 시사한다.

몇몇 연구들이 사람 대상체의 이종 그룹에서 혈압 조절에 있어서의 AVP의 상당한 역할을 입증하는데 실패하였지만(63), AVP는 선택된 사람 개체군에서의 혈압 조절에 대한 유의한 기여인자로서 연루되어 왔다(25, 62). 구체적으로, 아프리카계 미국인(4), 노인(19), 울혈성 심부전(25) 또는 만성 신부전(3)을 갖는 환자 모두는 AVP-의존성 혈류역학적 변화를 나타낸다(9). 중요하게도, 이들 사람 개체군 모두는 낮은 수준의 순환 레닌을 나타낸다(98). 저-레닌 고혈압이 고-레닌 고혈압(16%)보다 더 큰 부분의 사람 본태성 고혈압(27%)을 차지하기 때문에(49), AVP의 치료 표적이 고혈압 환자의 선택된 개체군을 위한 항고혈압 치료요법으로서 성급하게 간과될 수 있는지는 불확실하다.

함께, 이들 발견은, 본 발명자들로 하여금 AVP의 상승이, 만성적으로 증가된 뇌 RAS 활성으로 인해 고혈압을 야기하거나 유지하고 이러한 맥락에서 AVP의 작용의 메커니즘(들)을 조사하는데 필요한지에 대한 의문을 갖게 하였다. 본 발명자들은, 뇌 RAS의 형질전환 활성화가 혈장 AVP를 증가시키고, 혈관 수축과 변화된 신장 기능의 소정 조합을 통해 뇌 RAS에 의해 고혈압을 유도하는데 AVP의 작용이 필요하다는 가설을 세웠다. 이들 가설을 실험하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 실험실에서 이미 개발한 독특한 형질전환 동물 모델을 사용하였다(27, 71). 이러한 이중-형질전환 모델("sRA" 모델)은 안지오텐시노겐의 레닌-매개된 개열의 종 특이성의 이점을 이용하여 RAS의 뇌-특이적 과다활성(brain-specific hyperactivity)을 야기한다. 본 발명자들은, 이둘 동물이 왕성한 만성 고혈압, 번갈증, 다뇨증 및 증가된 안정시 대사율을 나타낸다는 것을 이미 입증하였다. 중요하게도, 본 발명자들은, 또한, sRA 마우스가, 증가된 신장 교감 신경 활성에도 불구하고 증가된 혈장 AVP 수준 및 순환 RAS의 억제를 나타낸다는 것을 이미 알고 있었다(27). 여기서, 본 발명자들은, 이러한 모델에서 (구체적으로 시삭상핵에서) 증가된 뉴런 AVP 면역염색, AVP의 증가된 1일 분비, AVP에 대한 sRA 마우스의 혈관구조의 왕성한 탈감작, 및 고혈압 및 저나트륨혈증의 유지에 있어서의 V2 AVP 수용체 신호전달의 필요성을 입증하였다. 이들 발견은 sRA 마우스의 고혈압에서의 AVP에 대한 주요 역할을 강조한다.

재료 및 방법:

동물. 모든 동물 작업은 아이오와 대학 동물실험 관련 위원회(University of Iowa Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었으며, 국립 보건원 "실험 동물 보호 및 사용에 대한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)"에 따라 수행하였다.

이중-형질전환(sRA) 마우스는, 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다(27, 71). 간략하게, 뉴런-특이성 시냅신 프로모터에 의한 전사 조절 하에서 사람 레닌을 발현하는 "sR" 마우스를, 이의 자체 프로모터에 의한 전사 조절 하에서 사람 안지오텐시노겐을 발현하는 "A" 마우스와 함께 길렀다(라인 11110/2 X 4284/1). 반응의 종 특이성 때문에, 사람 안지오텐시노겐만이 개열되어 사람 레닌에 의해 안지오텐신 I을 형성한다. 이에 의해 RAS의 과다활성이 sRA 새끼에서 중첩 전이유전자 발현 부위(즉, 안지오텐시노겐을 정상적으로 생산하는 중추 신경계의 서브섹션)에 제한된다.

면역조직화학. 뇌에서의 AVP의 면역조직화학 검출은, 아르기닌8-바소프레신(Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA)의 처음 6개 아미노산에 상응하는 합성 펩타이드에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 50㎛ 두께의 절편에서 수행하였다. 4% 파라포름알데히드 및 0.5% 글루타르알데히드로 고정된 6개(3개의 sRA, 3개의 야생형) 뇌 관류로부터 절편을 절단하여 항체의 1:1,000 희석액 중에서 4℃에서 24h 동안 항온배양하였다. sRA 마우스의 뇌를 확인을 위해 "표시하고(notched)", 야생형 동물 유래의 절편과 함께 항온배양하였다. 비오티닐화 염소 항-토끼 2차 항체 및 아비딘-고추냉이 퍼옥시다제에서 항온배양한 후, 3,3=-디아미노벤지딘을 크로마젠으로서 사용하여 면역반응성을 검출하였다. 전후방 수준(rostrocaudal level)에 대해 매치시킨 각 동물로부터의 4개의 절편에서, 10㎛보다 큰 AVP-면역염색된 단편을, NIH로부터의 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 PVN 및 SON에서 계수하였다.

혈압(테일- 커프 ). 여기서, 본 발명자들은, 우선 이전에 기재된 바와 같이 Visitech Systems BP-2000 테일-커프 혈압 모니터링 시스템을 사용하여 sRA 마우스에서 혈압을 조사하였다(79). 간략하게, 동물을 1wk 동안 매일 가온된 안전장치 박스(restraint box)에 적응시켰다. 일단 적응되면, 2wk 동안 매일 각 동물로부터 수축기 혈압의 30회 측정치를 평균내어 기저선 혈압을 평가하였다. 코니밥탄(Vaprisol, YM 087, 22ng/h sc, Baxter Healthcare) 또는 톨밥탄(OPC-41061, 22ng/h sc, Sigma Aldrich)을 삼투성 미니펌프(모델 1004, Alzet)에 의해 마우스의 별개의 서브세트에 전달하였다. 삼투성 미니펌프 이식 후, 10일 동안 매일 혈압을기록하여 약물 효과를 평가하였다.

혈압(원격측정). 전파원격측정 혈압을, 이전에 보고된 바와 같이 필수적으로 경동맥으로부터 기록하였다(27). 간략하게, 원격측정기 프로브(DSI, 모델 TA1 1PA-C10)를 케타민-크실라진 마취 하에 총 경동맥에 삽입하였다. 회복 2일 초과 후, 혈압, 심박수 및 자발적 신체 활동을 Dataquest 프로그램(DSI)을 사용하여 5분마다 30s 동안 기록하였다. 기저선 기록 후, 이소풀루란 마취 하에 견갑간 절개를 통해 등의 피하 공간에 이식한 삼투성 미니펌프를 통해 마우스에게 코니밥탄과 톨밥탄을 만성적으로 전달하였다.

대동맥 혈관 반응성: 복부 대동맥 고리를, 이전에 기재된 바와 같이 혈관 반응성에 대해 평가하였다(30). 간략하게, 마우스를 과용량의 펜토바르비탈(50mg, i.p.)에 의해 안락사시키고, 복부 대동맥을 신속하게 제거하여, 다음을 함유하는 크레브스 완충액(Kreb's buffer)에 넣었다(mmol/L): 118.3 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS04, 1.2 KH2P04, 25 NaHC03, 2.5 CaCl2 및 11 글루코스. 혈관 고리(길이 4 내지 5mm)를 기관 욕(organ bath) 중에서 37℃에서 산소화된 크레브스 완충액(95% 02/5% C02)에 현탁시키고, 강철 후크(steel hook)를 통해 힘 변환기에 연결하였다. 안정시 긴장을 45분에 걸쳐 0.5그램으로 조절하였다. 수축 반응을 AVP(10^-10 내지 10^-6 mol/L), 페닐에프린(PE, 10^-8 내지 3x10^-5), 엔도텔린-1(ET-1, 10^-10 내지 10^-7), 프로스타글란딘 F2α(PGF2α, 10^-7 내지 10^-4) 및 안지오텐신 II(Ang II, 10^-10 내지 10^-7)에 대한 반응으로 시험하였다. PGF2α(max의 40 내지 50%; 3x10^-6 내지 6x10^-6)에 대한 준최대 수축 후, 아세틸콜린(10^-8 내지 3x10^-5) 및 니트로프루시드 나트륨(10^-9 내지 10^-5)에 대한 이완 반응을 측정하였다.

장간막 동맥 혈관 반응성: 장간막 동맥의 2차 분지를 절개하고, 냉각된 산소화(21% 02, 5% C02 및 74% N2) 크레브스 완충액에 넣었다. 동맥의 단편(약 1mm 길이)을 혈관 챔버(DMT)로 옮기고, 유리 미세피펫을 삽관하고, 명주 결찰사로 단단히 매었다. 동맥을 유동 없이 서서히 40mmHg로 가압하였다. 30분 평형화 후, 100mM KCl에 대한 수축 반응에 의해 혈관 생존력을 시험하였다. 이어서, PE(10^-9 내지 10^-5 mol/L), AVP(10^-12 내지 10^-7 mol/L) 및 ET-1(10^-11 내지 10^-8 mol/L)에 대한 혈관 반응을 평가하였다. 이어서, 동맥을 10^-5mol/L 니트로프루시드 나트륨 및 2mmol/L EGTA를 함유하는 칼슘-비함유 크레브스 완충액으로 과주입하여 혈관을 최대로 확장시켰다. 내부 및 외부 직경을 75mm Hg에서 측정하였다. 벽 두께, 중막/내강 비 및 단면적(CSA)을 네베스 등(Neves, et al.)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 계산하였다(58).

유전자 발현: 장간막 동맥(상장간막 동맥은 제외함) 및 신장을 액체 질소 중에서 스냅 동결시키고, RNA를 Trizol® 중에서 추출하였다. 총 RNA를, 제조업자의 프로토콜에 따라 RNA Purelink® Minikit(Invitrogen)를 사용하여 단리하였다. 농도를 NanoDrop ND-1000을 사용하여 측정하였다. cDNA는 Superscript III®(Invitrogen)을 사용하여 RT-PCR에 의해 생성하였다. qRT-PCR은 TaqMan 유전자 발현 검정(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다: β-액틴에 대해 표준화된 RGS2(Mm00501385_m1), RGS5(Mm00501393_m1), V1A(Mm00444092_m1), ETA(Mm01243722_m1), GAPDH(4352932E), 또는 SYBR188 그린 검정(표 1의 프라이머 서열: NKCC2, NCC, NHE3, ENaC-α, ENaC-β, ENaC-γ, NKA-α, V2R, AQP1, AQP2, AQP3, AQP4, PGES, 및 UT1-A). Bio-Rad로부터의 SYBR-그린 시약을 사용하였으며, 모든 실시간 반응은 Bio-Rad iQ5 iCycle® 상에서 수행하였다.

혈액 및 뇨 분석: 하악부 출혈(submandibular bleed)에 의해 전혈을 리튬 헤파린 피복된 튜브에 수집함으로써 혈장을 수득하고, 이어서, 5,000xg에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겨 분석시까지 -80℃에서 동결시켰다. 뇨는, 이미 기재된 바와 같이 Nalgene 단일-마우스 대사 케이지를 사용하여 수집하였다(20). 코펩틴은, ELISA 키트(USCN Life Sciences)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 측정하였다. 혈액 화학반응 및 뇨 크레아티닌은, 소형 iSTAT 임상 화학 분석기(Abbott)와 CHEM8+ 카트리지를 사용하여 측정하였다. 뇨 단백질은, 바이신코닉산 검정 키트(Thermo Fisher/Pierce)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 측정하였다.

통계: 데이터는, 적절하게 반복 측정하여 ANOVA로 분석하였다. Post-hoc 분석은, Bonferroni 다중-비교 절차를 사용하여 수행하였다. EC₅₀ 및 최대 반응 계산은, 개별 용량-반응 데이터 세트를 4-파라미터 로지스틱 함수(힐 기울기 방법)에 피팅함으로써 수행하였다; y = min + (max - min)/(1+(x/EC₅₀)^힐 기울기). 모든 mRNA 배수 변화(fold change)는 Livak 방법을 사용하여 계산하였다(51). 모든 분석적 비교는 SigmaStat / SigmaPlot(Systat)을 사용하여 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ± sem으로 제시된다.

결과:

sRA 및 야생형 동물 둘 다에서, AVP 면역반응성은, 예상대로 세포에서 시교차상핵(SCN), SON, PVN, 및 시상하부의 원형 핵에서 관찰되었다(39, 93). AVP-면역반응성 섬유를 SON 및 PVN로부터 정중융기(median eminence)로 추적할 수 있었다(도 3A). sRA와 야생형 동물 간의 SCN 및 PVN에서의 AVP 면역반응성 뉴런의 수에는 명확한 차이가 없었지만, 뉴런 및 섬유 면역반응성은 sRA 동물에서 일관되게 더 조밀하였다. sRA와 대조군 동물 간의 가장 눈에 띄는 차이는 야생형 동물에서의 후시삭 SON과 비교하여 sRA 동물의 SON의 후시삭 부분(도 3A 및 B)에서 검출된 AVP 면역반응성 뉴런의 수가 배가되었다는 것이다. 코펩틴은, 완전 번역된 AVP 프로단백질의 COOH-말단 단편이며, 따라서, AVP와 1 : 1 몰 비로 번역된다. 이것은 AVP보다 훨씬 더 큰 생물학적 반감기를 나타내기 때문에, 이것은 AVP 자체보다 더신뢰할 수 있는 만성 AVP 방출의 척도로서 제안되었다(84). 코펩틴 수준은 sRA 마우스 유래의 혈장에서 유의하게 감소되었다(도 3C). 그러나, 이의 작은 크기(38개 아미노산, 4.22 kDa) 때문에, 이 단백질은 신장에 의해 혈장으로부터 신속하게 제거된다. 코펩틴 농도가 sRA 마우스로부터의 뇨에서 증가되는 것으로 보이지만, 차이는 유의하게 다르지 않았다. 그러나, 본 발명자들이 sRA 마우스의 극도로 증가된(약 7배) 뇨 생산율을 설명한 후, 뇨로의 총 1일 코펩틴 제거율이 sRA 마우스에서 극도로 증가된다는 것이 자명하다(약 20배, 도 3D). 이들 데이터는, 함께 sRA 마우스에서 AVP 분비가 대략 20배 증가함을 나타낸다. 뇨로의 총 1일 코펩틴 소실에 있어서의 큰 차이는 총 1일 뇨 크레아티닌에 대한 표준화 후에도 여전히 존재하거나(8배)(크레아티닌: 대조군, 0.20 ± 0.03 vs. sRA, 0.40 ± 0.05 mg/일, P < 0.01, 및 코펩틴/크레아티닌: 대조군, 49 ± 36 vs. sRA, 406 ± 176 pg/mg, P = 0.05) 또는 총 1일 뇨 단백질에 대한 표준화 후에도 여전히 존재하였다(10배)(단백질: 대조군, 41 ± 4 vs. sRA, 86 ± 9 mg/일, P < 0.01, 및 코펩틴/단백질: 대조군, 180 ± 100 vs. sRA, 1,845 ± 665 mg/mg, P = 0.02).

기저선 조건 하에서, sRA 마우스는, 테일-커프에 의해 쉽게 검출될 수 있는 고혈압을 나타내었다(도 4A). 이들 데이터는 직접 캐뉼라에 의해 그리고 전파원격측정에 의해 측정되는 바와 같이 이 모델에서 본 발명자들이 이전에 공개한 고혈압의 척도를 되풀이하였다(27, 71). 비선택적 비펩타이드 AVP V1A/V2 수용체 길항제 코니밥탄의 만성 피하 주입은 sRA 마우스에서 고혈압을 완전히 표준화시켰다. 기저선에서 그리고 18일의 연속 피하 코니밥탄 주입 동안 모범 sRA 마우스에서의 혈압의 지속적인 기록은, 혈압의 점진적이지만 상당한 감소를 입증하였으며(도 4B), 이것은 심박수에 있어서의 약간의 감소를 병행하였다(도 4C). 중요하게도, 자발적인 신체 활동은 기록 기간 전반에 걸쳐 정상을 유지하였고, 이것은 동물이 수술 및 코니밥탄 주입으로 인해 기면 상태에 있거나 달리 아프지 않았음을 시사한다(도 4D).

sRA 마우스의 고혈압에서 다양한 바소프레신 수용체 서브타입의 상대적 기여도를 해부하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 V2-선택적 길항제 톨밥탄의 만성 피하 주입의 혈압 결과를 실험하였다. 톨밥탄의 만성 주입은, 코니밥탄에서 관찰된 것(도 4A)과 거의 동일한 혈압 표준화(도 4E)를 야기하였다. 중요하게도, 이러한 혈압 감소는, 전파원격측정을 사용하여 시험한 sRA 마우스의 코호트에서 확인되었다(도 4F).

sRA 마우스에서의 만성 고혈압 및 바소프레신-특이적 변화에 대한 추가의 증거는 혈관 반응성 검정으로부터 나온다. 첫째, 복부 대동맥 고리를, 선택된 혈관수축제 및 혈관확장제 화합물에 대한 반응성에 대해 생체 외에서 실험하였다. sRA 마우스로부터의 대동맥 고리는 염화칼륨에 대해 정상적인 수축제 반응(constrictor response)을 나타내었다(도 5A). 복부 대동맥 고리는 혈관확장제 아세틸콜린에 대한 반응으로 왕성한 우측 변화(rightward shift)를 나타내었지만(표 2), 니트로프루시드 나트륨에 대해서는 정상적인 반응을 나타내었으며, 이것은 만성 고혈압 모델에서 전형적인 내피 기능이상을 나타낸다(도 5, B 및 C). AVP 수준에 있어서의 만성 증가를 뒷받침하여, sRA 마우스로부터의 복부 대동맥은 AVP에 대한 수축제 반응의 왕성한 억제를 나타내었으며(도 5D), 이것은 우측 (감소된) 효력 변화 및 최대 반응의 유의한 억제로의 추세 둘 다를 반영하였다(표 2). PE, ET-1, ANG II, 또는 PGF₂ _α에 대한 수축 반응에서는 어떠한 효력 또는 효능 변화도 관찰되지 않았으며(도 5, E 내지 H), 이것은 sRA 혈관구조에 있어서의 AVP 특이적 변화를 시사한다.

다음으로, 말초 저항을 조절하는 데에는 보다 작은 동맥이 중요하다는 것을 인정하여, 장간막 동맥의 이차 분지의 혈관 반응성을, 가압 근운동 기록법(pressurized myography)을 사용하여 실험하였다. 장간막 동맥 분지는 염화 칼륨에 대한 수축 반응에서 유의한 감소를 나타내었다(도 6A); 그러나, sRA 마우스에서의 이러한 낮은 KCl 반응에 대한 다른 수축제 반응의 표준화는 데이터 해석에 있어서 질적인 영향을 미치지 않았다(나타내지 않음). 복부 대동맥 고리와 유사하게, sRA 마우스로부터의 장간막 동맥은, AVP에 대한 우측 변화 및 최대 반응의 유의한 억제에 대한 추세를 나타내었다(표 2)(도 6B).

장간막 동맥은 PE에 대해 정상적인 수축 반응을 나타내었으며, 효능 또는 효력에 있어서는 변화가 없었다. ET-1에 대한 반응으로, sRA 마우스로부터의 장간막 동맥은 정상적인 최대 반응 및 작지만 통계학적으로 유의한 좌측 효력 변화를 나타내었다. 이들 데이터는 sRA 마우스의 보다 작은 동맥에서의 AVP-특이적 탈감작을 확인시켜 주며, AVP가 sRA 마우스에서 만성적으로 증가된다는 결론을 추가로 뒷받침한다. sRA 마우스로부터의 장간막 동맥은, 이 모델에서 만성 고혈압의 추가의 증거를 제공하는 상당한 부영양성 내측 재형성(remodeling)을 나타내었다. 대조군과 sRA 마우스 간에 외측 직경에 있어서의 차이는 검출되지 않았지만(도 6C), 내강 직경은, 증가된 벽 두께 때문에 sRA 마우스에서 유의하게 더 작았다. 이것은 증가된 중막-대-내강 비를 초래하지만 단면적에 있어서는 유의한 변화가 없었다.

AVP에 대한 감소된 혈관 반응성을 설명하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 V1A 수용체의 발현을 측정하였다. sRA 마우스로부터의 장간막 동맥은 상당히 억제된 V1A 수용체 mRNA를 나타내지만 ETA 수용체 발현에 있어서는 변화가 없었다(도 6D). 게다가, G 단백질 신호전달-2(RGS2) 발현의 조절인자는 선택적으로 하향조절되었지만 RGS5 발현에 있어서는 변화가 없었다.

혈관 V1A 하향조절과는 대조적으로, 신장 V2 수용체 및 아쿠아포린-2 mRNA 수준은 sRA 마우스에서 변하지 않았다(표 3). sRA 마우스에서 발현에 있어서 유의한 변화를 보인 유일한 신장 수송체(renal transporter)는 염화 나트륨 공동 수송체(NCC, 대조군의 5배, P < 0.05)이었지만, 나트륨/수소 교환체(NHE)는 감소 추세를 보였고(NHE3, 대조군의 0.6배, P = 0.08), ENaC-α 서브유닛은 증가 추세를 보였다(ENaC-α, 대조군의 10배, P = 0.08). 이들 신장 유전자 발현 검정은 단지 수컷 sRA 및 한배새끼 대조군 마우스에서 수행하였으며, 그룹당 적은 수(n = 각각 4마리)의 반복으로 인해 통계적 검증력이 낮다는 것을 주지해야 한다. 따라서, NHE3 및 ENaC-α에 있어서의 변화는 둘 다 생리학적으로 유의할 수 있다.

마지막으로, sRA 마우스의 심혈관 표현형에 있어서의 V2-매개된 메커니즘을 더욱 직접적으로 조사하기 위해, 본 발명자들은 톨밥탄에 대한 혈액 화학 반응을 실험하였다(표 4). 본 발명자들은 이전에 기저선 조건 하에 sRA 마우스에서 대략 4mM 저나트륨혈증을 입증하였다(27). 여기서, 본 발명자들은 sRA 마우스는 저나트륨혈증성(도 7A)이고, 저칼슘혈증성(도 7B)이며, 만성 톨밥탄 전달이 이들 불균형 둘 다를 교정한다는 것을 알아냈다(둘 다에 대해 유전자형 X 약물 상호작용 P < 0.05). 또한, sRA 마우스는 클로라이드, 총 C02, 글루코스, 혈액 요소 질소, 크레아티닌, 헤마토크리트 및 음이온 갭에 있어서 변화를 나타낸 반면, 톨밥탄 처리는 이들 종점 중의 일부(칼륨, 클로라이드 및 혈액 요소 질소)에 영향을 미쳤고, 이것은 유전자형 X 약물 상호작용은 밝혀지지 않았기 때문에 유전자형과는 무관한 방식으로 영향을 미쳤다(표 4).

논의

여기서 본 발명자들은, 뇌 RAS에 의해 유도된 고혈압에 AVP가 필요하다는 가설을 시험하기 위해 독특한 이중-형질전환 모델을 시험하였다. 뇌의 면역조직화학 실험은, 시삭상 시상하부 핵의 후시삭 부분에서는 AVP 수준이 증가되었지만 sRA 마우스에서 PVN 면역염색에 있어서는 일관된 변화가 없음이 밝혀졌다. 고혈압에서의 AVP 신호전달에 필요한 역할을 확인한 결과, 바소프레신 V1A/V2 수용체의 만성 차단이 sRA 마우스에서 혈압 표준화를 초래하였다. PE, ET-1, ANG II, 및 PGF₂ _α에 대한 다발성 동맥에 있어서의 혈관 반응성이 sRA 마우스에서는 크게 변하지 않았지만, AVP에 대한 반응은 크게 탈감작화되었다. V2 수용체의 선택적 억제는 sRA 마우스에서 강력한 항고혈압 작용을 가졌으며, 이 모델에서 전형적인 저나트륨혈증을 표준화시켰다. 함께, 이들 데이터는, 뇌 RAS-유도된 고혈압의 유지에 있어서 V2 수용체에서 작용하는 AVP에 대한 필수적인 역할을 강력하게 뒷받침한다.

증가된 AVP 신호전달이 다수의 모델에서 고혈압에 대한 메커니즘으로서 제안되었다. 신체 전반에 걸쳐 RAS의 단단히 조절되거나 강력하게 과발현된 형질전환 과활성을 갖는 마우스는, 고혈압을 유지하기 위해 증가된 AVP 신호전달을 필요로 한다(17, 57). 증가된 뇌 RAS 활성(38, 48, 65)에 의존하는 데옥시코르티코스테론 아세테이트(DOCA)-염 고혈압도 AVP 신호전달에 의존한다. DOCA-염 처리는, 증가된 혈장 AVP 수준을 초래한다(14, 54, 56, 92). 래트로의 안지오텐신-전환 효소 억제제 캅토프릴의 뇌실내 주입은 DOCA-염 고혈압을 방지 및 역전시키며, 감소된 혈압에도 불구하고 혈장 바소프레신 수준에 있어서의 감소와 관련되었다(38). 또한, AVP에 대한 DOCA-염 고혈압의 의존성은, DOCA-염의 고혈압 효과가 이들 동물에서 크게 약화되기 때문에, AVP-결핍 브래틀버러(Brattleboro) 래트를 사용하여 입증되었다(14, 99). 다양한 고혈압 모델로부터의 이들 발견들을 보완하여, 안지오텐시노겐의 감소된 신경교 생산을 나타내는 TGR(ASrAOGEN) 래트는 저혈압이며 감소된 혈장 AVP 수준을 나타낸다(74). 또한, 이러한 동물들은 뇌 내에서의 AVP V1A 수용체 발현 패턴의 변화를 나타내며(11), 이것은 뇌 RAS-AVP 상호작용을 더욱 뒷받침한다. V1A AVP 수용체가 결핍된 마우스는 저혈압이지만, 뇌, 혈관, 심장, 혈소판 및 간 수용체의 상대적 중요성은 불확실하다(2, 46).

AVP의 생산 및 방출에 대한 RAS의 효과는 일찍이 1970년에 보고되었으며, 이때 봉주르 및 멜빈(Bonjour and Melvin)(6)은, 말초 투여된 레닌 또는 안지오텐신 II가 개에서 혈장 AVP의 용량-의존적 증가를 초래하였음을 입증하였다. 뇌 내에서 AVP 방출에 대한 안지오텐신의 직접적인 작용에 대한 증거가 단리된 래트 신경뇌하수체를 사용한 생체외 실험에 의해 제공되었다(22). 뇌궁하 기관의 전해질 병변(37) 또는 뇌궁하 기관으로부터의 원심 돌기의 횡절단(45) 둘 다가 정맥내 ANG II에 대한 반응으로 혈장으로의 AVP의 방출을 약독화시킨다. 따라서, 여기서 sRA 형질전환 마우스에서의 증가된 뇌 AVP 염색 및 증가된 1일 코펩틴(및 이에 의해 AVP) 방출의 입증이 기대되었다. 형태학적 및 기능적인 증거가 AVP 방출에 있어서의 AT1 및 AT2 수용체 둘 다에 대한 역할을 뒷받침하기 때문에 AVP 증가에 대해 특이적인 RAS 수용체 서브타입을 원인적으로 링크시키기 위한 추가의 연구가 요구된다.

SON에서의 강력히 증가된 AVP 면역반응성은 sRA 마우스에서 증가된 AVP를 야기하는 것과 같이 시삭상신경뇌하수체 경로에서의 ANG II-매개된 과다활성을 수반한다. SON으로의 ANG II 주사는 신경분비 세포를 탈분극시키고(93), ANG II-면역반응성 뉴런 및 축색 말단은, AVP 면역반응성 뉴런으로 얽힌 설치류 SON에서 발견되며, ANG II 및 AVP는 일부 뉴런에 공동국소화(colocalize)된다(39). 따라서, SON 내에서의 ANG II의 국소 생산 및/또는 작용이 AVP 생산 및 분비를 조절할 것 같다.

AVP는 수용체의 4개 이상의 서브타입에 대한 내인성 작용제(agonist)이다. V1A 수용체 서브타입은 주로 혈관구조에서 발견되며, 주로 Gαq를 통해 신호전달되고, 혈관 수축을 매개한다. 또한, V1A 수용체는 뉴런에 존재하며, cAMP를 통해 신호전달되어 뉴런 기능을 조절하는 것으로 밝혀진다(2, 89). V1B 수용체 서브타입은 주로 뇌에서 발견되고, Gαq를 통해 신호전달되고, 부신피질자극 호르몬을 자극한다. V2 수용체 서브타입은 주로 신장 네프론의 집합관에서 발견되며, Gαs를 통해 신호전달되고, 아쿠아포린 가동화를 통한 물 재흡수를 자극한다. 폐(20) 및 소뇌(43)와 같은 신외 조직에서 V2 수용체의 발현에 대한 몇 가지 증거가 있지만, 이들 조직에서의 이들의 생리학적 유의성은 불확실하다. 또한, 마지막으로, AVP는 쿨린(Cullin)-5로서도 공지된 VACM-1 수용체에서의 작용제이며, 여기서, 이것은 내피 세포 및 신장 집합관에서 칼슘 가동화를 유발한다(7, 8). 장간막 동맥 V1A 수용체가 sRA 마우스에서 하향조절되지만 신장 V2 수용체 발현은 변하지 않는다는 본 발명자들의 측정은, sRA 마우스의 고혈압에서 AVP-매개된 신장 물 보유에 대한 보다 큰 역할을 시사할 수 있다. 본원에서 직접 시험하지는 않았지만, 이러한 결론은, 코니밥탄의 효과(효과를 보기 위해 몇 일간 주입, 도 3B), 톨밥탄의 항고혈압 효과(도 3, E 및 F), 및 항이뇨 호르몬(SIADH)의 부적절한 분비 증후군을 대표하는 이 모델에서의 기저선 저나트륨혈증 및 저칼슘혈증의 표준화(표 4 및 도 6)에 대한 느린 시간 경과(slow time course)에 의해 지지된다(24). RGS2는 심혈관계 전반에 걸쳐 발현되고, Gαq-매개된 GPCR 신호전달을 부정적으로 조절하는 작용을 하고, 이에 따라, 혈관수축 반응에 반대한다(75). 사람 환자에서의 연구 결과, RGS2 발현과 혈압 간의 음의 상관성이 밝혀졌으며, 고혈압 환자는 감소된 RGS2 발현을 나타내고 저혈압 환자는 증가된 RGS2 발현을 나타내었다(35, 75, 94). 유사한 상관성은 고혈압 동물 모델에서 관찰되며(10, 11), 본 연구에서도 다시 관찰되었다(도 5D). RGS2는 조직-특이적 방식으로 조절되는 것으로 공지되어 있으며, 심혈관 조직 내에서 RGS2는 다중 2상 메커니즘을 통해 조절된다(97). 다양한 호르몬/수용체 조합에 의한 Gαq의 급성 활성화가 RGS2를 신속하게 상향조절하고, 가능하게는 음의 피드백 메커니즘으로서 작용한다. 대조적으로, Gαq 시스템의 만성 자극은 RGS2 발현의 긴장성 억제를 야기하는 것으로 보인다(10, 11, 88, 97). RGS2가 결핍된 마우스는 말초 혈관 수축의 만성 증가로 인해 왕성한 고혈압을 나타낸다(31, 34). RGS2 녹아웃 마우스로부터의 혈관 평활근 세포에서의 바소프레신-유도된 칼슘 과도상태(transient)가 증강되며, 이것은 V1A 수용체가 Gαq 신호전달을 사용하기 때문에(2, 89) 아마도 이들 수용체를 통한 RGS2와 AVP 신호전달 간의 관계를 강조한다(86). 또한, RGS2 녹아웃 마우스는 야생형 동물보다도 상당히 더 큰 만성 고혈압으로부터의 말단-기관 손상을 나타낸다(81). 또한, RGS2는 아데닐릴 사이클라제의 조정을 통해 신장에서 cAMP 신호전달을 약독화시키며(29, 85), 이것이 V2 수용체, Gαs, 및 cAMP를 통한 AVP 신호전달의 조절을 초래할 수 있다. 실제로, RGS2의 조정은 신장 V2 수용체 신호전달 및 생체내 AVP의 신장 효과에 크게 영향을 미친다(72). 따라서, 증가된 AVP 신호전달과 함께 다양한 조직에서의 RGS2의 조정이 만성적으로 증가된 뇌 RAS 활성의 맥락에서 고혈압의 유지에 기여할 수 있다고 추측해 보는 것은 흥미로운 일이다. 병리학적 상태에서의 V1A 수용체 및 V2 수용체에 대한 상이한 조절 패턴이 이전에 기재된 바 있다. 고츠 등(Gozdz et al.)(26)은, 고-레닌 고혈압의 TGR(mRen2)27 래트 모델에서 심장 V1A 수용체는 대조군 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트와 비교하여 상향조절되는 반면 신장 V2 수용체는 스트레인 간에 변화가 없음을 이미 입증하였다. 트린더 등(Trinder et al.)(87)은, 타입 1 진성 당뇨병의 스트렙토조토신-주사 모델에서 래트가 V1 수용체의 감소된 간 및 신장 발현 및 AVP-유도된 이노시톨 포스페이트 생산을 나타내는 반면, 신장 V2 수용체 및 AVP-유도된 cAMP 생산은 다시 변하지 않는다는 것을 이미 입증하였다. 따라서, 혈관 V1A 수용체는 하향조절되고 AVP에 대한 혈관 반응성은 탈감작화되는 반면 신장 V2 수용체 및 이들의 기능은 크게 변하지 않는다는 본 발명자들의 조사 결과는 이례적이지 않다.

이전에, 본 발명자들은 기저선 조건(12:12 명-암 사이클의 광 위상으로 4h 수집됨) 하에서 암컷 sRA 마우스에서 혈장 AVP 수준에 있어서의 왕성한(2배) 증가를 입증하였으며, 이러한 차이는 수컷에서는 검출되지 않았다(27). 혈장 AVP 농도의 배가는 대조군 수컷에서의 혈장 AVP에 영향을 미치지 않는 매우 잠시 동안(4 h)의 물 제한 후 sRA 수컷에서도 달성되었다. 본 연구에서, 본 발명자들은 뇨로의 코펩틴 손실(이러한 4-kDa 펩타이드의 제거를 위한 주요 메커니즘)은 수컷 및 암컷 마우스 둘 다에서 동일하였음을 밝혀내었다(도 2D). 뇨 코펩틴 측정은 AVP 분비 속도와 관련되지만, 직접적인 혈장 AVP 측정은 AVP 분비 및 분해/제거 둘 다와 관련된다. 따라서, 본 발명자들은 이제 AVP 분비 속도는 수컷 및 암컷 sRA 마우스 둘 다에서 유사하게 증가되지만, AVP 분해/제거의 속도에는 성-특이적 차이가 존재한다는 가설을 세운다. AVP 수용체 차단이, 본 연구에서 두 가지 성별 모두에서 고혈압을 효과적으로 없애준다는 측정(도 3)이 이러한 가설을 추가로 뒷받침한다. AVP 제거 메커니즘에 있어서의 성-특이적 차이에 대한 연구는 진행중이다.

관점 및 유의성

총체적으로, 본 발명자들의 데이터는, AVP 분비 증가를 추진하는 증가된 뇌 RAS 활성의 모델을 뒷받침한다. 후속적으로, V2 수용체에 대한 AVP 작용은, 증가된 혈압 및 저나트륨혈증에 기여한다. 본 발명자들은, 이들 효과들이 과도한 물 보유를 통해 매개되며, 이것은 이 모델의 심각한 번갈증과 조합되는 경우, 가능하게는 압력-이뇨 메커니즘을 통해 다뇨증 표현형을 초래한다고 가설을 세운다. 신장 집합관 아쿠아포린-2 가동화에서의 V2 수용체의 널리 공지된 기능에 기초하여, 본 발명자들은 신장-매개된 메커니즘이 sRA 마우스에서 과다활성인 것으로 의심하지만, 본 발명자들은 톨밥탄의 관찰된 항고혈압 작용에 원인이 되는 V2 수용체의 국소화를 여기서 직접 실험하지는 않았다. 이들 데이터는 SIADH(24) 또는 증가된 AVP 생산 또는 감소된 제거를 특징으로 하는 기타의 질환들의 실험 모델로서의 sRA 마우스의 사용을 지지할 수 있다. 안지오텐신 펩타이드의 뇌-특이적 생성 및 작용이 심혈관 기능, 체액 균형, 대사 조절, 및 심지어 학습 및 기억의 조절을 위해 상당한 관심을 받고 있다. 또한, 바소프레신은 체액 균형, 혈압 조절 및 각종 거동(배우자 유대, 이타심, 학습, 기억, 체액, 및 식품 섭취)에 있어서의 이들의 역할에 대해 널리 인지되어 있으며, 이의 생산 및 방출은 뇌 내에서 안지오텐신에 의해 자극되는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서, 안지오텐신작용성 고혈압의 주요 매개인자로서의 바소프레신의 영향은, 동시에 1) 바소프레신을 뇌 RAS의 기타의 새로 인지된 기능들(예를 들면, 대사 조절, 학습 및 기억 등)의 가능한 매개인자로서 규명하고; 2) 안지오텐신민감성, 바소프레신-생산성 뇌 구조(예를 들면, 시삭상핵)를 특히 저-레닌 고혈압을 갖는 선택된 사람 개체군에서 고혈압 및 기타의 장애들을 치료 표적으로 하기 위해 실질적으로 더 많은 조사를 받을 수 있는 주요 심혈관 조절 중추로서 규명한다(3, 4, 9, 19, 25, 49, 62, 63, 98).

실시예 2. 자간전증을 발병할 경향이 있는 산모에 대한 조기 임상 스크린으로서의 코펩틴.

임신부는 이들의 산전 관리 시작시부터 모집하였다. MFTB(Maternal Fetal Tissue Bank)에 등록된 여성들은, 임신 전반에 걸쳐 임상적으로 지시된 채혈 때마다 연구용으로 산모 혈액 샘플을 제공하였다. 또한, 임상적으로 지시된 검사 또는 과정으로부터 양수 샘플, 뇨 샘플, 태아 삭상 조직 혈액 및 태반 조직을 수집하여 연구용으로 사용한다. 산모와 아이의 건강에 관한 단기 및 장기 임상 정보도 추출하여 샘플과 연관시켰다. 지금까지, 1500명이 넘는 여성들이 현재 25,000개 이상의 분취된 샘플로 MFTB에 등록되어 있다.

자간전증성 여성의 저장된 샘플 중의 코펩틴 수준의 초기 ELISA 스크린은 임신 제3 분기까지 코펩틴 수준 증가 추세를 입증하였다(도 8).

실시예 3. 코펩틴에 의한 자간전증의 임신 제1 분기 초기 예측: 바소프레신 분비과다가 자간전증 발병의 초기 사건인가?

자간전증은 미국에서 모든 임신부의 5 내지 7%, 대략 1년에 300,000명에서 발병한다. 아직, 이것은 불균형적으로 모든 산모-태아 이환률 및 사망률의 15%를 야기한다(73). 자간전증은, 태아 성장 제한, 산모-태아 사망, 및 어머니와 자녀에 대한 미래의 성인 신경 질환 및 심혈관 질환과 같은 즉각적인 장기간 산모-태아 이환률을 야기하는 것으로 알려져 있다(23, 40, 52, 53, 90, 91). 이의 발병이 잘 이해되어 있지 않기 때문에, 자간전증에 대한 예방적, 치료적 및 치유적 양상을 규정하기가 힘들다. 이것은, 자간전증을 예측 및 치료할 수 있는 적합하고 통합적인 경로를 찾아내는 것의 중요성을 강조한다. 한 가지 가능한 경로가 바소프레신 경로이다.

바소프레신은 짧은 생물학적 반감기(혈중에서 대략 5 내지 20분)를 나타내며, 이것이 이 호르몬의 직접적인 측정을 복잡하게 만든다. 바소프레신은, 작고 불활성인 앞분절(pro-segment), 코펩틴과 1:1 화학양론 비로 번역된다. 코펩틴은 주로 신장 배설에 의해 제거되며 혈장에서 매우 안정하다. 그 결과, 이것은 바소프레신 분비에 대한 매우 유용한 바이오마커이다(3). 줄피카로글루 등(Zulfikaroglu et al.)(101)은, 최근에 자간전증성에서 순환 코펩틴이 제2 분기 말/제3 분기 초에 증가함을 입증하였다. 게다가, 아프리카계 미국인, 노인, 및 만성 심부전 또는 신부전을 갖는 환자를 포함하는 선택된 개체군은 바소프레신-의존성 고혈압을 나타낸다(3, 4, 9, 19). 또한, 이러한 개체군은, 낮은 순환 레닌-안지오텐신계 활성을 특징으로 한다. 흥미롭게도, 정상 혈압 임신부에 비해, 자간전증성 임신부는 또한 레닌-안지오텐신계의 감소된 순환 활성을 나타낸다(33). 이러한 데이터는, 본 발명자들으로 하여금 자간전증의 발병에 있어서 바소프레신 분비과다에 대한 잠재적인 원인적 역할, 및 임신 초기에 자간전증에 대한 신규한 예측 바이오마커로서의 코펩틴의 가능한 유용성에 대한 가설을 세울 수 있게 한다.

방법

바이오샘플 및 임상 데이터 획득: 산모 혈장 및 임상 환자 정보는 아이오와 대학 IRB-승인된(IRB# 200910784) 산모 태아 조직 은행(MFTB)으로부터 입수하였다. 이 은행에서는, 임신부를 장차 이들의 산전 관리 시작시부터 모집한다. MFTB 포함 기준은 아이오와 대학 병원 & 클리닉에서 산전 관리를 받는 영어를 구사하는 > 18세의 여성을 포함한다. MFTB 배제 기준은 재소자, HIV+ 또는 C형 간염 양성 여성을 포함한다. MFTB에 등록한 여성은, 이들이 임신 전반에 걸쳐 임상적으로 지시된 채혈 때마다 연구용으로 산모 혈액 샘플을 제공한다. MFTB에서 모든 산모 혈액은 균일하게 가공한다. 산모 혈장 및 연막(buffy coat)을 단리하고, 분취하고, -80℃에서 저장한다. MFTB에 의해 입수한 산모 및 신생아 임상 데이터는, 표준화된 데이터 추출 양식을 사용하여 전자 의무 기록으로부터의 데이터 추출을 통해 입수한다. 추출된 임상 데이터를 저작자들 중의 둘(MKS 및 DAS)에 의해 정확도 및 완전도에 대해 일상적으로 모니터링한다. 또한, 중앙 전자 의무 기록 데이터베이스를 문의할 수 있는 아이오와 대학 임상 전환 과학 연구소로부터의 생물정보학 공동연구자에 의해 추가의 데이터를 추출한다.

코호트 어셈블리: 자간전증 케이스에 대한 포함 기준은, UIHC에서 분만하였고, MFTB에 등록되어 있으며, 분만시 자간전증을 진단받은 여성을 포함하였다. 자간전증의 케이스의 진단 및 분류는 분석을 위한 표준 ACOG(American College of Obstetrics and Gynecology) 정의에 기초하였다(1). 이러한 케이스는, MFTB 데이터베이스를 분만시 은행 참가자의 경증 및 중증 자간전증 ICD-9 코드(642.4x, 642.5x, 642.7x, 642.9x)의 생물정보학 문의와 상호-참조함으로써 확인하였다. 각각의 잠재적인 케이스의 전자 의무 기록을 평가하여 ACOG 정의에 의해 자간전증의 진단을 확인하였다. 연령-매치된 산모 혈장 샘플 및 대조군 개체군에 대한 상응하는 임상 데이터는, MFTB 데이터베이스를 사용하여 입수하였다. 샘플 수집시 재태 기간은 임신 분기(trimester)로 분류하였다: 임신 제1 분기(<13 전체 임신 주수), 임신 제2 분기(13-26 전체 임신 주수) 및 임신 제3 분기(>26주).

절차: 모든 산모 혈장 코펩틴 농도는, 사람 코펩틴에 특이적인 시판 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)(USCN Life Science, Inc, Houston, TX)을 사용하여 이중으로 측정하였다. 검정은, 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 이 검정을 위한 사람 코펩틴의 최소 검출 가능 용량은 5.4pg/mL이었다. 검정내 변동 계수는 < 10%이며, 검정간 변동 계수는 < 12%이다. 신장 기능 또는 바소프레신 분해가 임신 전반에 걸쳐 코펩틴 농도에 영향을 미치는지를 실험하기 위해, 혈장 시스타틴 C(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 바소프레시나제(LNPEP, USCN Life Science, Inc, Houston, TX)를, 시판 ELISA 키트를 사용하여 모든 샘플에서 이중으로 측정하였다.

동물 연구: 암컷 C57Bl/6J 마우스는 잭슨 실험실(Jackson Laboratories)로부터 8-12주령으로 입수하였다. 바소프레신(240ng/hr) 또는 염수 비히클을 주입하는 삼투성 미니펌프를 견갑골 사이에 절개를 통해 피하 공간에 삽입하였다. 회복한지 3일 후, 암컷을 수컷 C57Bl/6J 마우스와 교미시켰다. 질전의 존재가 임신 0.5일째를 나타내었다. 테일-커프 혈량측정법에 의해 교미 전 및 임신 전반에 걸쳐 혈압을 추적하였다. 임신 18일째에, 암컷을 부검을 위해 희생시켰다. 새끼 중량을 기록하였다. 어미 신장 절편을 생성하고, 아이오와 대학 병리과에 의해 전자 현미경법으로 영상화하였다. 모든 연구는 아이오와 대학 동물실험 관련 위원회(ACURF# 1211239)에 의해 승인되었다.

통계학적 분석: 당해 연구의 주 목표는 자간전증을 발병한 임신부와 자간전증을 발병하지 않은 임신부 간의 임신 제1 분기 코펩틴 농도의 차이가 자간전증의 발병을 예측하는지를 알아내는 것이었다. 대조군(310pg/mL) 및 경증 자간전증성(620pg/mL) 간의 줄피카로글루 등(Zulfikaroglu et al.)(101)으로부터의 임신 후기 산모 혈장 코펩틴 농도에 있어서의 최소 효과 크기와 180pg/mL의 보고된 최대 표준 편차, 80%의 검증력 및 α = 0.05를 사용하면, 그룹당 단지 7명의 참가자가 필요하다. 3개 변수의 간명한(parsimonious) 혼합 효과 회귀 모델을 설명하기 위해, 그룹당 최소 30개 샘플이 사용되었다.

모든 통계학적 분석은 SigmaPlot 12.0 소프트웨어(Systat Software, Inc, California)로 수행하였으며, SAS 9.1 소프트웨어(SAS Institute Inc, Cary, NC)를 사용하여 확인하였다. 단계적 회귀를 사용하여 이러한 데이터세트에 대한 모델을 개발하고 가능한 교락(confounding)에 대해 평가하였다. 로지스틱 회귀 모델을 구성하고, 수신자 조작 특성 곡선을 회귀 진단을 위해 구성하였다. 또한, 카이 제곱(chi square) 또는 피셔 정확 검증(Fisher exact test)을 범주형 변수에 사용하였다. 연속 변수에 대해서는, Student's t-검증 또는, 정상에 대한 기준이 충족되지 않았다면, Mann-Whitney 검증을 사용하였다. 모든 변수들은 0.05의 유의 수준에서 검증하였다.

결과

총 30명의 개인 대조군(C) 대상체와 51명의 개인 자간전증성(P) 대상체가 이 연구에서 사용되었다. 각 첨가자에 대해 전체 정원의 임신 제1 분기(C=12, P=20), 제2 분기(C=10, P=20) 및 제3 분기(C=30, P=51) 혈장 샘플이 이용 가능한 것은 아니었다. 산모 연령, 회임 횟수(gravida), 체질량 지수, 만성 고혈압 및 기존 당뇨병을 갖는 산모의 퍼센트는 대조군과 자간전증 그룹 간에 유사하였다(표 5). 또한, 이들 그룹 간의 인종 분포 또한 유사하였으며, 최근 아이오와 인구 조사 데이터를 기초로 하여 대중이 대개 백인인 아이오와 인구를 반영하였다. 이러한 산모 특성 중에서, 단지 자간전증의 이력만이 대조군 vs. 자간전증 그룹(53.3% vs. 17.7%, p=0.002)에서 상당히 더 높았다. 두 그룹 간의 분만 특성을 평가하는 경우(표 5), 그룹들 간에 전형적인 차이가 관찰되었다. 자간전증 그룹은 분만시 상당히 더 낮은 재태 기간(36.2주 vs. 38.7주, P=0.001), 보다 높은 쌍둥이 임신률(21.6 vs. 0%, P=0.016) 및 보다 낮은 출생시 체중(2777.0그램 vs. 3424.0그램, P=0.0001)을 나타내었다. 이러한 조사 결과들은 자간전증과 관련된 공지된 병적 상태와 일치한다: 혈관성 원인 및 조산으로 인한 보다 높은 조기 분만률, 보다 높은 쌍둥이 임신률 및 보다 낮은 출생시 체중(80).

도 9A에서 보이는 바와 같이, 산모 혈장 코펩틴 농도의 측정으로 임신 제1 분기(2045 vs. 903 pg/mL, p=0.008), 임신 제2 분기(1806 vs. 706 pg/mL, p=0.001) 및 임신 제3 분기(1890 vs. 822 pg/mL, p=0.0006)에 대조군, 비-자간전증 여성과 비교하여 자간전증을 발병한 임신부에서 평균 코펩틴이 상당히 증가하는 것으로 밝혀졌다. 혈장 코펩틴에 있어서의 이러한 그룹간 차이는, 혈장 시스타틴 C 및 바소프레시나제 수준이 각각의 임신 분기에서 그룹들 간에 유사하였기 때문에, 각각 혈장 시스타틴 C 및 바소프레시나제에 의해 측정되는 바와 같이 신장 기능 및 바소프레신 분해에 있어서의 변화와는 관련이 없을 것 같다(도 9B 및 9C).

코펩틴에 있어서의 상당한 증가를 고려하여, 본 발명자들은 산모 혈장 코펩틴 농도가 자간전증의 발병을 예측하는지를 심문하기 위해 각 임신 분기에 대한 수신자 조작 특성 곡선을 구성하였다. 게다가, 이 곡선으로부터 최적의 코펩틴 농도 컷오프를 구하였다. 도 10에서 보이는 바와 같이, ROC는 임신 제1 분기(AUC=0.80, p=0.005), 임신 제2 분기(AUC=0.87, p=0.002) 및 임신 제3 분기(AUC=0.72, p=0.004)에 상당한 곡선하 면적을 입증하였다. 이러한 데이터는 평균 산모 혈장 코펩틴 농도가 자간전증의 발병을 예측함을 나타낸다.

또한, 본 발명자들은 임상적으로 유의적인 공변량이 특정 임신 분기에 자간전증의 발병과 코펩틴 농도의 연관성을 변화시키는지를 밝혀냈다. 로지스틱 회귀 모델은 자간전증의 진단을 종속 변수로 하여 구성하였다. 참가자들은 특정 임신 분기에 대해 소정의 컷오프 위인지 아래인지에 따라 둘로 나누었다. 임신 분기 특이 컷오프 값(임신 제1 분기: 1018pg/mL, 임신 제2 분기: 943pg/mL, 임신 제3 분기: 860pg/mL)을 사용하여, 임상적으로 유의적인 공변량에 대해 조절하면서 컷오프 위 또는 아래에 있는 상태를 독립 변수로서 사용하여 모델을 생성하였다. 산모 연령, 체질량 지수, 당뇨병, 만성 고혈압, 자간전증의 이력, 및 쌍둥이 임신과 같은 임상적으로 유의적인 공변량에 대해 조절한 후, 코펩틴 농도는 임신 제1 분기, 제2 분기 및 제3 분기에서 자간전증의 발병과 여전히 상당하게 연관되었다(표 6). 임신 제2 분기 [코펩틴] 컷오프 및 자간전증의 이력을 포함하는 모델을 제외한, 모든 모델들은 자간전증의 발병을 유의적으로 예측한다. 이러한 결과들은 코펩틴 농도가 대조군과 비교하여 자간전증을 발병할 임신부의 혈장에서 상당히 증가된다는 본 발명자들의 조사결과를 확인시켜 준다. 코펩틴 농도에 있어서의 이러한 왕성한 증가는 일찍이 임신 제1 분기에 발생하며, 임상적으로 유의적인 산과 및 혈관 공변량의 잠재적 교락 효과에도 불구하고 임신 전반에 걸쳐 증가된 채로 있다. 마지막으로, 본 발명자들은 임신 동안의 바소프레신의 만성 증가가 마우스에서 자간전증-유사 표현형을 유발하기에 충분하다고 것을 관측하였다. 바소프레신 주입은 임신률을 상당히 감소시키며(도 11A), 이것은 생식 병태생리학에 있어서의 이 호르몬의 역할을 강조한다. 성공적인 임신 동안의 바소프레신 주입은 혈압의 왕성한 증가 및 뚜렷한 단백뇨(도 11B), 상당한 태아 성장 제한(도 11C) 및 병적 사구체 내피세포증(도 11D)을 포함한 기본적인 자간전증 표현형을 야기하였다.

본 발명자들의 데이터는 코펩틴이 자간전증의 발병의 강력한 예측인자(predictor)임을 입증한다. 보다 중요하게도, 이것은 일찍이 임신 6주에 임신 전반에 걸친 자간전증의 발병을 예측한다. 이러한 조사 결과는 자간전증의 예측에 있어서의 중요한 진보를 나타낸다. 현재, sFLT-1 및 엔도글린(Endoglin) 같은 항-혈관신생 인자는 자간전증을 진단하기 일찍이 12주 전부터 증가한다(50). sFLT-1, 엔도글린, 및 기타의 항-혈관신생 인자의 추적 조사 분석은 이러한 인자들의 시험 특성이 임상 실습에 적용하기에는 부실하다는 것을 시사한다(44). 게다가, 이러한 인자들의 한계는 전반적인 항혈관신생 인자의 상당한 변화가 일찍이 단지 임신 제2 분기에 발생하는 것으로 보고되었다는 것이다.

최근에, 자간전증의 임신 제1 분기 예측인자를 확인하기 위해 상당한 노력이 투입되어 왔다. 이러한 조사들은 임신 제1 분기 순환 과다글리코실화 사람 만성 성선자극호르몬(hCG)(41), 인터루킨-1β(78), 고감도 C-반응성 단백질(42), 및 임신-관련 혈장 단백질-A(PAPPA)(15)를 포함하였다. 이러한 인자들은 자간전증을 불량하게 내지는 중간 정도로 예측하는 것으로 나타났다. 항혈관신생 마커가 자간전증의 발병에 있어서 가능성이 있음을 고려하여, 이들을 임신 제1 분기에 조사하였다. 자궁 동맥 도플러(UAD) 분석과 함께, 이러한 인자들은 단지 자간전증(60)을 적당히 예측하는 것으로 나타났다(AUC=0.74). 임신 제1 분기의 증가된 자궁 동맥 도플러 박동 지수(Doppler pulsatile index)는 자간전증의 발병과 상관성이 있다. 푼 등(Poon et al.)은 임신 제1 분기에 산모 이력 및 이수성 마커와 결부된 UAD가 AUC = 0.96으로 자간전증을 매우 잘 예측할 수 있음을 입증하였다. UAD 자체는 AUC = 0.91을 가졌다(67, 68). UAD가 강력한 도구일 수는 있지만, 신뢰할 수 있는 UAD는 태아 의학 재단(Fetal Medicine Foundation)과 같은 검증된 프로그램을 통해 상당한 검정간 가변성을 줄이기 위해 초음파기사를 상당히 훈련시키는 것을 필요로 한다(64). 이러한 훈련이 모든 병원 환경에서 이용 가능한 것은 아닐 수 있다. 분명히, 가능한 임신 초기에 자간전증의 간단한 예측인자를 찾아내는 것이 유용하며, 코펩틴이 제일 간단하고 개별적으로 예측되는 바이오마커를 나타낸다. 혈장 코펩틴 측정을 다른 공지된 임신-제1 분기 검정과 결합시키면 예측력을 더욱 증가시킬 수 있다. 태반 조절장애, 내피 세포 기능장애, 면역학, 산화 스트레스, 변화된 혈관 생물학 및 혈관신생을 포함한 다수의 프로세스로 인해 자간전증의 단일 원인을 찾아내는 것이 거의 불가능하다. 자간전증은 다중 경로로부터 야기되는 질환이기 때문에, 예측 모델의 개발 및 자간전증 치료를 위한 치료 경로의 탐색은 이러한 다중 경로의 업스트림 조절인자 또는 유도인자로부터 나오는 것이 필요할 수 있다. 바소프레신은 이러한 경로들 중의 다수의 핵심에 있다. 코펩틴, 및 이에 의해 바소프레신 분비를 자간전증에 대한 새로운 매우 초기 임신 진단 바이오마커로서 인정함과 이에 더해서 본 발명자들의 바소프레신-주입된 마우스 모델로부터의 결과가 집합적으로, 임신 초기에 증가된 바소프레신 분비가 자간전증의 발병에 기여할 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 아르기닌 바소프레신은 주로 뇌의 시삭상핵 및 실방핵의 대세포 뉴런내에서 합성되는 펩타이드이지만, 이것은 선택된 말초 조직에 의해 소량으로 생산된다. 대세포 뉴런으로부터의 축색 돌기는 뇌하수체후엽을 포함하며, 자극시 바소프레신이 순환계로 방출된다. 이때 바소프레신은 다수의 수용체 타입에 작용하여 궁극적으로 혈액 용적, 혈관 수축을 증가시키고, 삼투압을 감소시킨다(70).

자간전증의 발병에 대한 바소프레신의 관련성은 바소프레신의 면역활성 성질 및 자간전증의 면역학적 개시 사건에 의해 강화된다. 러셀과 윌리(Russell and Walley)(70)에 의해 및 치칸자와 그로스먼(Chikanza and Grossman)(12)에 의해 검토된 바와 같이, 바소프레신은 다양한 면역조절 효과를 갖는다. 작용 부위 및 용량에 따라, 바소프레신은 종양 괴사 인자-α, 인터루킨- 1β, 인터페론-γ, β-엔돌핀, 및 프로스타글란딘 E2에 영향을 미치고 영향을 받는 것으로 알려져 있다 - 이들 대부분은 자간전증시 변한다. 바소프레신은 자가 혼합 림프구 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있다. 바소프레신은 사람 T 세포, B 세포 및 단핵구/대색세포에 의해 생산되고, 이에 작용한다. 고용량의 바소프레신은 사람 피부 섬유아세포에 의한 프로스타글란딘 E2 합성의 확대를 야기한다. 또한, 바소프레신-결핍 고혈압 브래틀버러 래트는 증가된 호중구를 포함한 순환 면역 세포 집단 및 기능에 있어서 상당한 변화를 나타낸다. 이러한 데이터는 본 연구에서 관찰된 임신 초기의 증가된 바소프레신 분비와 과도한 말초 면역 활성화 및 후속적인 자간전증 발병 간의 잠재적인 관계를 시사한다. 따라서, 본 발명자들의 데이터 및 기타의 데이터를 기초로 하여, 본 발명자들은 바소프레신이 자간전증을 촉발시키는 면역학적 환경을 개시하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 사실로 받아들인다.

본 연구는 고품질의 임상 데이터 및 산모 태아 조직 은행에 의해 제공된 바이오샘플 충실도로부터 혜택을 받았다. 게다가, 본 연구는 본 발명자들이 요망하는 결과를 평가하도록 적절하게 통제함으로써 강화되었다. 본 연구의 한 가지 약점은 아이오와에서는 대부분 백인 인구라는 것이다. 코펩틴과 자간전증 간의 관계가 임상 공변량 조절 후 탄탄하기는 하지만, 본 발명자들은 인종으로 인한 변화를 분석하도록 적절하게 통제하지는 못한다. 상당한 공변량 조절된 연관성을 찾았음에도 불구하고 이러한 분석을 위해서는 더 큰 샘플 크기가 필요하다.

필수적으로 모든 공지된 메커니즘은 임신 후기 동안 신속하고 연속적으로 발생하거나 전개되기 때문에, 자간전증을 정의하는 분자 사건 및 임상적 연관성의 시간적 조직화는 지금까지 다소 혼란스러웠다. 본 발명자들의 데이터는 바소프레신 분비에 있어서의 임신 초기 증가를 명백히 입증하며, 따라서, 다른 모든 공지된 메커니즘을 바소프레신 작용의 잠재적인 표적으로서 정렬한다. 이러한 결과는 자간전증의 예측에 있어서의 혈장 바소프레신/코펩틴 측정의 유용성을 강조하며, 자간전증에서의 바소프레신에 대한 잠재적인 원인적 역할과 일치한다. 마우스로부터의 본 발명자들의 데이터가 바소프레신이 자간전증-유사 표현형을 야기하기에 충분하다는 것을 입증하지만, 바소프레신에 의한 자간전증의 유도를 매개하는 조직, 수용체 및 메커니즘을 규명하기 위해서는 추가의 연구들이 필요하다. 자간전증의 발병에 대한 바소프레신 신호전달의 필요성 및 장애를 치료하기 위해 이러한 시스템을 표적화하는 유용성을 평가하는데 상당한 임상 연구들이 필요하다. 마지막으로, 과도한 바소프레신 분비를 유도하는 메커니즘을 확인하고, 자간전증을 개시하는 사건(들)을 보다 잘 이해하기 위해서는 추가의 조사들이 필요할 것이다.

참조문헌

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Claims

대상체로부터 채취한 샘플[여기서, 샘플은 임신 제1 분기((first trimester) 동안 채취된다] 중의 코펩틴의 검출에 특이적인 항체 검출 검정을 포함하는, 대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하기 위한 키트.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇨 중 하나 이상을 포함하는, 키트.
제2항에 있어서, 상기 샘플이 뇨인, 키트.
제3항에 있어서, 상기 검정이 테스트 스트립 또는 ELISA를 포함하는, 키트.
제1항에 있어서, 대조군과 비교하여 약 1/4배의 코펩틴 수준의 증가가 대상체의 임신 동안 자간전증의 발병을 예측하는, 키트.
제1항에 있어서, 상기 항체 검출 검정이 또한 바소프레신 및 뉴로피신 II를 검출하는, 키트.
대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하는 방법으로서, 상기 방법은,
임신 제1 분기 동안 대상체로부터 뇨 샘플을 수집하는 단계; 및
항체 검출 검정을 사용하여 대조군과 비교하여 코펩틴 수준의 차이를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하는 방법.
제7항에 있어서, 대상체의 자궁 및 제동맥 중 하나 이상에 대해 도플러 속도 측정(Doppler velocimetry measurement)을 실시함을 추가로 포함하는, 방법.
대상체로부터 채취한 샘플 중의 LNPEP의 검출에 특이적인 효소 검출 검정을 포함하는, 대상체에서의 자간전증의 발병 가능성을 진단 또는 예측하기 위한 키트.
제9항에 있어서, 상기 효소 검출 검정이 항체 검출 검정인, 키트.
제9항에 있어서, 상기 효소 검출 검정이 효소 활성 검정인, 키트.
제9항에 있어서, 코펩틴에 대해 특이적인 항체 검출 검정을 추가로 포함하는, 키트.
제12항에 있어서, 대조군과 비교하여 약 1/4배의 LNPEP 수준의 감소 및 코펩틴 수준의 증가가 대상체의 임신 동안 자간전증의 발병을 예측하는, 키트.
바소프레신 유전자의 단백질 생성물의 검출을 위한 시험 검정을 포함하는 기판;
샘플 적용 영역; 및
판독 영역을 포함하는, 대상체가 자간전증 발병 성향이 있는지를 예측하기 위한 시험 장치로서,
사용자에 의한 대상체 유래의 샘플의 적용시, 상기 시험장치는, 대상체가 임신중인지, 대상체가 자간전증 발병 성향이 있는지를 나타내는 정보를 사용자에게 제공하는, 시험 장치.
제14항에 있어서, 상기 기판이 플라스틱, 유리, 금속, 셀룰로스성 물질, 중합체, 직물, 및 이들의 조합을 포함하는, 시험 장치.
제14항에 있어서, 상기 샘플 적용 영역이 판독 영역에 유동적으로 연결되어 있는, 시험 장치.
제14항에 있어서, 사용자에 의한 샘플 적용 영역으로의 대상체 유래의 샘플의 적용시, 하나 이상의 시험 검정이 장치 내에 맞물릴 수 있는, 시험 장치.
제14항에 있어서, 사용자에게 제공되는 정보가 판독 영역에서의 표시(indicium)를 포함하는, 시험 장치.
제14항에 있어서, 상기 장치에 의해 제공되는 정보를 해석하기 위한 사용자 지침서를 추가로 포함하는, 시험 장치.
제14항에 있어서, 상기 시험 장치가 복수의 시험 검정을 포함하는, 시험 장치.