KR20150116610A - 애기장대 유래의 s26d 단백질 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 At3g23050 단백질 변이체, 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 At3g23050 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 복합 스트레스 내성을 증가시키는 방법, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 At3g23050 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 애기장대 유래의 At3g23050 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 복합 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다.

Description

애기장대 유래의 S26D 단백질 변이체 및 이의 용도{S26D protein variant from Arabidopsis thaliana and uses thereof}

본 발명은 옥신 신호전달 기작 조절을 통한 복합 재해 내성 식물체 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 At3g23050 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 26번째 아미노산인 세린을 아스파르트산으로 치환시킨 유전자 변이체의 과발현을 통해 야생형에 비해 건조 스트레스와 병원균에 대한 질병 발생에 내성을 가진 식물체의 개발에 관한 것이다.

식물 호르몬 옥신은 세포 분열, 세포 팽창과 분화, 배 발생 동안의 패턴형성, 맥관구조 또는 다른 조직, 원뿌리 및 곁뿌리 또는 줄기 분열 조직의 성장조절과 같은 다양한 식물 발달 과정에 관여한다. 호르몬의 생리 조절 활성은 수용체 단백질과 호르몬의 결합 및 이로부터 파생되는 일련의 신호전달 과정을 통해 일어나며 따라서 신호전달 조절자의 발견과 기작규명은 식물 호르몬 신호전달 작용기작 규명을 위해 필요하다. 옥신 신호전달 과정에서 중요한 조절자인 AUX/IAA (옥신/인돌아세트산) 유전자는 단백질의 발현이 옥신에 의해서 엄격하게 조절되는 단백질 패밀리를 코딩한다. AUX/IAA 단백질은 4개의 보존된 아미노산 서열 도메인 (도메인 I, II, III 및 IV)을 가지고 있다. 도메인 I은 TOPLESS 단백질과 결합하여 전사 억제자 기능에 필요하고 도메인 II는 AUX/IAA 단백질의 분해에 관여한다. 도메인 III 및 IV는 ARF 전사 인자와 결합하여 ARF 단백질의 활성을 억제하는 기능을 가지고 있다. 옥신 함량이 낮을 때 AUX/IAA 단백질은 ARF 단백질과 결합하여 옥신 반응 유전자의 전사를 억제하고 있으나, 옥신이 활성화된 상태에서는 AUX/IAA 단백질은 SCF^TIR1 복합체와 결합하여 유비퀴틴화되어 프로테아좀 작용에 의해서 분해된다. 이로 인해 ARF 단백질은 활성화되어 옥신 반응 유전자의 전사를 유도하여 식물체의 성장과 발달을 조절한다고 알려져 있다(Gray et al. Nature 414, 271-276, 2001).

환경 스트레스는 식물의 성장과 발달을 저해하고 많은 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소 중 하나로 작용한다. 식물은 이러한 환경 스트레스를 극복하기 위해서 식물의 성장과 발달 과정을 조절함으로써 환경 스트레스에 대한 방어기작을 가지고 있다. 따라서 식물의 성장과 환경 스트레스의 방어기작에 중요한 옥신과 앱시스산 호르몬의 상호작용에 관한 연구는 환경 스트레스에 대한 저항성을 가진 식물 개발에 중요하다. 기존의 많은 연구자들은 AUX/IAA 단백질의 도메인 II에 존재하는 분해 모티프 서열을 변형시켜 AUX/IAA 단백질을 분해시키지 못하는 형질전환체를 구축하여 옥신 신호전달 과정을 연구하였다. 따라서, 인위적인 AUX/IAA 단백질의 변형이 아닌 식물의 성장과 환경 스트레스의 상호작용에서 AUX/IAA 단백질의 신호전달 과정에 관한 연구는 미흡하다.

한편, 한국등록특허 제0977398호에서는 복합스트레스 내성 형질전환 식물체 및 이의 제조 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0704751호에서는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 애기장대 유래의 At3g23050 S26D 단백질 변이체 및 이의 용도에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 유래의 At3g23050 유전자가 코딩하는 단백질의 26번째 세린(Serine) 잔기를 아스파르트산(Aspartic Acid) 잔기로 치환시킨 유전자 변이체의 과발현을 통해 야생형에 비해 건조 스트레스와 병원균에 의한 질병 발생에 내성을 가진 형질전환 식물체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 단백질의 26번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 복합 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 복합 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 애기장대 유래의 At3g23050 유전자가 코딩하는 단백질의 26번째 세린 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환시킨 유전자 변이체의 과발현을 통해 건조 스트레스와 병원균에 의한 질병 발생에 내성을 가진 식물체를 개발하였다. 따라서, At3g23050 S26D 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 이용하면 조건 불리 지역에 적합한 환경 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 개발하거나 바이오 연료 작물을 개발하는데 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 At3g23050 유전자의 특정 아미노산 서열과 이의 26번째 세린 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환시킨 At3g23050 S26D 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 At3g23050 및 At3g23050 S26D 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터의 구조 모식도이다.
도 3은 At3g23050 및 At3g23050 S26D 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 각각 형질전환된 애기장대의 RT-PCR 분석 결과(A)와 At3g23050 및 At3g23050 S26D 단백질의 발현 수준을 Flag-tag 항체를 이용하여 분석한 결과(B)이다.
도 4는 건조 스트레스에 따른 At3g23050 WT, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체 및 야생형 애기장대의 생육상태를 비교한 사진이다. (A)정상 조건에서 3주간 키운 식물체 (B)9 일간 건조스트레스 처리 (C) 재관수 3일후의 식물체 사진
도 5는 건조 스트레스에 따른 At3g23050 WT, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체 및 야생형 애기장대의 수분 증발량을 측정한 결과이다.
도 6은 병원균 처리에 따른 At3g23050 WT, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체 및 야생형 애기장대에서의 병원균 성장 정도(A), 살리실산 농도(B), PR1 유전자의 발현 양상을 실시간 PCR로 분석(C)한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 단백질의 26번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 단백질 변이체에서, 상기 치환은 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 At3g23050 유전자(서열번호 1)가 코딩하는 아미노산 서열 내의 26번째 세린(Serine) 잔기를 복합 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 임의의 다른 아미노산으로 치환할 수 있으며, 바람직하게는 아스파르트산(Aspartic Acid) 잔기로 치환할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 따라서, 상기 단백질 변이체는 바람직하게는 26번째 세린(Serine) 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 애기장대 유래의 At3g23050 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 변이시킨 At3g23050 S26D 변이체는 식물의 복합 스트레스에 대한 내성에 관련된다.

본 발명에 따른 단백질 변이체의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 복합 스트레스 내성을 의미한다.

본 발명은 또한 상기 단백질 변이체의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 단백질 변이체와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

본 발명의 "복합 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 포함하는 환경 스트레스를 말하며 크게 생물학적 스트레스 (biotic stress)와 비생물적 스트레스 (abiotic stress)로 구별된다. 생물학적 스트레스 요인은 대표적으로 병원균을 들 수 있으며, 비생물학적 스트레스 요인은 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "복합 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다. 본 발명에 있어서, 상기 복합 스트레스는 바람직하게는 건조 스트레스 또는 병원균 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 병원균 스트레스는 구체적으로는 박테리아 병원균 스트레스일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) DC3000 병원균 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 복합 스트레스 내성 관련 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다.

본 발명의 구현 예에 따라, 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 애기장대 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 애기장대 단백질 변이체를 코딩하는 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단 (예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (A. tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지 (phage), 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서 (enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 인간 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물 세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포가 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114. 1973), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580. 1983) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al ., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145. 1988) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479.1980), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456. 1973), 전기천공법 (Neumann, E. et al ., EMBO J., 1:841. 1982), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al ., Gene, 10:87. 1980), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190. 1985), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572. 1990) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 복합 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 복합 스트레스는 건조 스트레스 또는 병원균 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전자의 식물로의 도입은 본 발명의 유전자를 포함하는 적합한 벡터를 사용하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 벡터를 식물 숙주세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 복합 스트레스는 건조 스트레스 또는 병원균 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있으며, 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체는 고구마, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두, 애기장대 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 단백질의 26번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 복합 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 단백질의 26번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환함으로써 식물체의 복합 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: At3g23050 WT 유전자와 At3g23050 S26D cDNA 합성

At4g23050 WT 유전자의 cDNA는 애기장대의 잎으로부터 분리한 총 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행함으로써 제조하였다. 상기 총 RNA의 분리는 알앤이지 플랜트 키트(RNeasy plant kit, Qiagen)를 사용하여 수행하였으며 프라이머는 공지된 유전자 서열(GenBank accession no: At3g23050)을 기초로 하여 디자인하였다. 보다 구체적으로, RT-PCR은 상기에서 분리한 총 RNA 2 ㎍를 시료로 하고 원-스텝 RT-PCR 키트(Qiagen)를 사용하여 수행하였으며 조건은 50℃에서 30분, 95℃에서 15분 동안 반응시켜 역전사한 다음 상기 역전사 결과 수득된 cDNA를 주형으로 하여 프라이머는 BamHI 과 SalI 제한효소 서열을 포함한 정방향 (5'-GGATCCATGATCGGCCAACTTATGAAC-3' : 서열번호 4) 및 역방향(5'-GTCGACTCAAGATCTGTTCTTGCAGTA-3' : 서열번호 5) 프라이머를 사용하여 95℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 15초씩 25회 반복함으로써 PCR 증폭 산물을 수득하였다.

At3g23050 S26D cDNA 합성은 PCR-매개된 자리지정 돌연변이 유발 방법을 기초로 하여 QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)를 사용하여 수행하였으며 At3g23050 WT cDNA를 주형으로 프라이머는 정방향 (5'-CCCGGCGGCGCTGAAGCAGTTGAGGATCCTGCCAAA-3' : 서열번호 6) 및 역방향(5'-GCTTCCCACCGCCGATTTGGCAGGATCCTCAACTGC-3' : 서열번호 7) 프라이머를 사용하였다.

실시예 2: At3g23050 유전자의 과발현 벡터의 제조 및 상기 벡터를 이용하여 At3g23050 유전자를 과발현하는 형질전환체 제조

At3g23050 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제조하기 위하여 상기 실시예 1의 At3g23050 WT과 At3g23050 S26D 유전자의 cDNA를 제한효소 BamHI 및 SalI으로 잘라서 CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터가 포함된 벡터인 pGreenII의 동일한 자리에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다(도 2). 재조합 벡터는 아그로박테리움 GV3101 균주를 이용해 플로랄 딥 방법(Clough et al. Plant J. 16, 735-743, 1998)으로 야생형 애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하였다. 형질전환된 종자는 하이그로마이신이 포함된 MS 배지에서 선별되었다.

선별된 애기장대를 토양으로 옮겨서 4주간 키운 다음 잎(rosette)을 채취하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 총 RNA를 분리한 후 RT-PCR을 수행함으로써 At3g23050 유전자의 과발현 여부를 조사하였다(도 3A). 유전자 특이적 프라이머는 정방향(5'-GCCAAATCGGCGGTGGGAAGC-3' : 서열번호 8) 및 역방향(5'-GTAGTTCCTCACAGGTGGCCA-3' : 서열번호 9) 프라이머를 사용하였다. 대조군으로는 튜불린(Tubulin)을 암호화하는 프라이머인 정방향(5'-CAACGCTACTCTGTCTGTCC-3' : 서열번호 10) 및 역방향(5'-TCTGTGAATTCCATCTCGTC-3' : 서열번호 11) 프라이머를 사용하였다. 상기 실험 결과, At3g23050 WT 라인 2, 6 및 13번과 At3g23050 S26D 라인 7, 12 및 15번 각각 3개의 형질전환체에서 야생형에 비해 At3g23050 유전자의 과발현을 확인할 수 있었다(도 3A).

과발현된 형질전환체에 도입된 At3g23050 단백질의 발현 수준을 분석하기 위해, FLAG-tag 항체를 이용해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 3B). At3g23050 S26D 유전자가 과발현된 7, 2 및 15번 라인에서 At3g23050 단백질이 강한 발현을 나타내었다. 하지만, At3g23050 WT 유전자가 과발현된 형질전환체는 야생형과 비슷한 단백질 발현 정도를 나타내었다.

실시예 3: At3g23050 유전자가 과발현된 형질전환체의 건조 스트레스 저항성 조사

토양에 야생형 애기장대, 상기 실시예 2의 At3g23050 WT 및 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체의 종자를 토양에 파종한 후 장일조건 (16시간 광/8시간 암)으로 23℃에서 4주간 생육시켰다. 그 다음 2주간 물 공급을 중단하여 건조 스트레스를 가한 후 물을 재공급하고 이틀 후의 생육상태를 관찰하였다. 실험 결과, 야생형 애기장대와 At3g23050 WT 형질전환체는 90% 이상이 고사하는 것으로 나타났다. 반면, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체는 대부분이 생존하는 것으로 나타났다(도 4).

본 발명에 따른 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체의 건조 스트레스 저항성을 보다 구체적으로 조사하기 위하여 야생형 애기장대, 상기 실시예 2의 At3g23050 WT 및 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체를 2주간 생육시킨 다음 3, 4, 5번 잎을 각각 잘라 3M 페이퍼 위에 잎의 뒷면(abaxial side)이 위로 오게 하여 1시간 간격으로 6시간 동안 잎의 무게를 측정함으로써 시간의 경과에 따른 수분 증발량을 비교하였다. 실험 결과, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체는 야생형과 At3g23050 WT 과발현 형질전환체에 비해 수분손실이 적은 것으로 나타났다(도 5). 따라서, 본 발명에 따른 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체는 야생형이나 At3g23050 WT 형질전환체에 비해 증산작용이 억제되어 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4: At3g23050 유전자가 과발현된 형질전환체의 내병성 조사

At3g23050 유전자가 식물의 박테리아 병원균에 대한 저항성과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, 병원균의 처리에 따른 야생형, At3g23050 WT 및 At3g23050 S26D 형질전환체의 내병성 정도를 비교하였다. PstDC3000(Pseudomonas syringae DC3000) 병원균을 배양하여 인필터레이션 버퍼인 10 mM MgCl₂에 약 1x10⁵ cfu/ml이 되게 현탁하였다. 토양에서 4주간 생육시킨 야생형 애기장대, 상기 실시예 2의 At3g23050 WT 및 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체의 잎 뒷면에 병원균을 접종하였고 3일 후 내병성 정도를 체크하였다. 실험 결과, 야생형 애기장대와 At3g 23050 WT 형질전환체에 비해 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체는 병원균 성장이 억제되어 있음을 확인하였다(도 6A).

본 발명에 따른 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체의 내병성을 보다 구체적으로 조사하기 위하여 야생형 애기장대, At3g23050 WT 및 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체를 MS 배지에서 2주간 생육시킨 다음 채취하여 액체질소에 급속 냉동시켰다. 다음으로 막자사발에서 분쇄한후 식물체 분말 1 mg을 이용하여 HPLC를 통해 전체 살리실산 호르몬 함량을 측정하였다(도 6B). 실험 결과, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체는 야생형과 At3g23050 WT 과발현 형질전환체에 비해 살리실산 함량이 5배 정도 많은 것을 확인하였다.

기존의 연구결과에 의하면 박테리아 병원균에 대한 식물의 방어기작은 살리실산 호르몬의 증가에 의한 PR1 (pathogenesis - related protein 1) 유전자의 발현을 통해 일어난다고 보고되어 왔다. 따라서, 각 식물의 PR1 유전자의 발현을 비교하기 위해 야생형 애기장대, At3g23050 WT 및 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체의 종자를 토양에 파종한 후 4주간 생육시켰다. 상기에서 배양한 PstDC3000 병원균을 접종하여 PR1 유전자의 발현 변화를 Realtime PCR을 통해 조사하였다(도 7C). PR1 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GTGGGTTAGCGAGAAGGCTA-3' : 서열번호 12) 및 역방향(5'-ACTTTGGCACATCCGAGTCT-3' : 서열번호 13) 프라이머를 사용하였다. 실험 결과, At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체에서 병원균을 처리하지 않았을 때와 병원균을 처리하고 12시간 후 PR1 유전자의 발현은 야생형과 At3g23050 WT 과발현 형질전환체에 비해 증가되어 있음을 확인하였다(도 6C). 따라서, 본 발명에 따른 At3g23050 S26D 유전자 과발현 형질전환체는 야생형이나 At3g23050 WT 형질전환체에 비해 살리실산 호르몬 함량의 변화에 의한 PR1 유전자의 발현이 증가되어 박테리아 병원균에 대한 내성을 가짐을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> S26D protein variant from Arabidopsis thaliana and uses thereof <130> PN13309 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 732 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgatcggcc aacttatgaa cctcaaggcc acggagctct gtctcggcct ccccggcggc 60 gctgaagcag ttgagagtcc tgccaaatcg gcggtgggaa gcaagagagg cttctccgaa 120 accgttgatc tcatgctcaa tcttcaatct aacaaagaag gctccgttga tctcaaaaac 180 gtttctgctg ttcccaagga gaagactacc cttaaagatc cttctaagcc tcctgctaaa 240 gcacaagtgg tgggatggcc acctgtgagg aactacagga agaacatgat gactcagcag 300 aagaccagta gtggtgcgga ggaggccagc agtgagaagg ccgggaactt tggtggagga 360 gcagccggag ccggcttggt gaaggtctcc atggacggtg ctccatatct gaggaaagtt 420 gacctcaaga tgtacaaaag ctaccaggat ctttctgatg cattggccaa aatgttcagc 480 tcctttacta tgggaaacta tggagcacaa ggaatgatag atttcatgaa cgagagcaag 540 ctaatgaatc tgctgaatag ctctgagtat gtgccaagct acgaggacaa agatggtgac 600 tggatgctcg ttggcgatgt cccatgggaa atgtttgtcg agtcttgcaa acgtttgcgc 660 attatgaagg gatctgaagc agttggactt gctccgagag caatggagaa gtactgcaag 720 aacagatctt ga 732 <210> 2 <211> 243 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ile Gly Gln Leu Met Asn Leu Lys Ala Thr Glu Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Pro Gly Gly Ala Glu Ala Val Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ala Val 20 25 30 Gly Ser Lys Arg Gly Phe Ser Glu Thr Val Asp Leu Met Leu Asn Leu 35 40 45 Gln Ser Asn Lys Glu Gly Ser Val Asp Leu Lys Asn Val Ser Ala Val 50 55 60 Pro Lys Glu Lys Thr Thr Leu Lys Asp Pro Ser Lys Pro Pro Ala Lys 65 70 75 80 Ala Gln Val Val Gly Trp Pro Pro Val Arg Asn Tyr Arg Lys Asn Met 85 90 95 Met Thr Gln Gln Lys Thr Ser Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Lys Ala Gly Asn Phe Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu Val Lys 115 120 125 Val Ser Met Asp Gly Ala Pro Tyr Leu Arg Lys Val Asp Leu Lys Met 130 135 140 Tyr Lys Ser Tyr Gln Asp Leu Ser Asp Ala Leu Ala Lys Met Phe Ser 145 150 155 160 Ser Phe Thr Met Gly Asn Tyr Gly Ala Gln Gly Met Ile Asp Phe Met 165 170 175 Asn Glu Ser Lys Leu Met Asn Leu Leu Asn Ser Ser Glu Tyr Val Pro 180 185 190 Ser Tyr Glu Asp Lys Asp Gly Asp Trp Met Leu Val Gly Asp Val Pro 195 200 205 Trp Glu Met Phe Val Glu Ser Cys Lys Arg Leu Arg Ile Met Lys Gly 210 215 220 Ser Glu Ala Val Gly Leu Ala Pro Arg Ala Met Glu Lys Tyr Cys Lys 225 230 235 240 Asn Arg Ser <210> 3 <211> 243 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 Met Ile Gly Gln Leu Met Asn Leu Lys Ala Thr Glu Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Pro Gly Gly Ala Glu Ala Val Glu Asp Pro Ala Lys Ser Ala Val 20 25 30 Gly Ser Lys Arg Gly Phe Ser Glu Thr Val Asp Leu Met Leu Asn Leu 35 40 45 Gln Ser Asn Lys Glu Gly Ser Val Asp Leu Lys Asn Val Ser Ala Val 50 55 60 Pro Lys Glu Lys Thr Thr Leu Lys Asp Pro Ser Lys Pro Pro Ala Lys 65 70 75 80 Ala Gln Val Val Gly Trp Pro Pro Val Arg Asn Tyr Arg Lys Asn Met 85 90 95 Met Thr Gln Gln Lys Thr Ser Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Lys Ala Gly Asn Phe Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu Val Lys 115 120 125 Val Ser Met Asp Gly Ala Pro Tyr Leu Arg Lys Val Asp Leu Lys Met 130 135 140 Tyr Lys Ser Tyr Gln Asp Leu Ser Asp Ala Leu Ala Lys Met Phe Ser 145 150 155 160 Ser Phe Thr Met Gly Asn Tyr Gly Ala Gln Gly Met Ile Asp Phe Met 165 170 175 Asn Glu Ser Lys Leu Met Asn Leu Leu Asn Ser Ser Glu Tyr Val Pro 180 185 190 Ser Tyr Glu Asp Lys Asp Gly Asp Trp Met Leu Val Gly Asp Val Pro 195 200 205 Trp Glu Met Phe Val Glu Ser Cys Lys Arg Leu Arg Ile Met Lys Gly 210 215 220 Ser Glu Ala Val Gly Leu Ala Pro Arg Ala Met Glu Lys Tyr Cys Lys 225 230 235 240 Asn Arg Ser <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatccatga tcggccaact tatgaac 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtcgactcaa gatctgttct tgcagta 27 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cccggcggcg ctgaagcagt tgaggatcct gccaaa 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcttcccacc gccgatttgg caggatcctc aactgc 36 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccaaatcgg cggtgggaag c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtagttcctc acaggtggcc a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caacgctact ctgtctgtcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tctgtgaatt ccatctcgtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtgggttagc gagaaggcta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 actttggcac atccgagtct 20

Claims (12)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 유래의 단백질의 26번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체.
2. 제1항에 있어서, 상기 26번째 아미노산이 세린에서 아스파르트산으로 치환된 것을 특징으로 하는 단백질 변이체.
3. 제1항 또는 제2항의 단백질 변이체를 코딩하는 유전자.
4. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제4항의 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 복합 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 복합 스트레스는 건조 스트레스 또는 병원균 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체의 복합 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
8. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 복합 스트레스는 건조 스트레스 또는 병원균 스트레스인 것을 특징으로 하는 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
10. 제8항 또는 제9항의 방법에 의해 제조된 복합 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체.
11. 제10항의 형질전환 식물체의 종자.
12. 제3항의 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 복합 스트레스 내성 증가용 조성물.

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