KR20150115696A - 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 혈청형의 동정 방법 및 그 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 혈청형의 동정 방법 및 그 키트를 개시한다. 구체적으로 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi)의 sca 유전자 특히 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역의 길이 차이에 의한 혈청형(serotype)의 효과적인 동정 방법 및 키트를 개시한다.

Description

오리엔티아 쯔쯔가무시균의 혈청형의 동정 방법 및 그 키트{A Method and a Kit for Identification of Serotype of Orientia tsutsugamushi}

본 발병은 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi)의 혈청형(serotype)의 동정 방법 및 그 키트에 관한 것이다.

쯔쯔가무시병(scrub typhus)은 진드기 유충을 매개로 한 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi, 이하 "쯔쯔가무시균")의 인체 감염으로 인하여 일어난다. 주로 러시아 동부, 일본, 중국, 말레이시아, 태국 베트남 등의 아시아-태평양 지역에서 발병하는 급성 열성병의 한 종류이며 10억 명에 달하는 인구가 이 병의 잠재적인 위험군에 속한다.

매해 백만 명 정도가 발병하는데 1-2주간의 잠복기를 지니며 발열, 오한, 발진, 가피 생성, 근육통, 림프절 종대 등의 증상을 나타낸다. 감기와 유사한 약한 증상에서 끝나기도 하나 생명에 치명적인 상태까지 이를 수 있다. 초기의 진단을 통해 독시사이클린(doxycycline), 클로람페니콜(chloramphenicol) 등의 적절한 항생제 처리로 쉽게 치료될 수 있으나 여러 종류의 혈청형(serotype)들에 의한 재감염의 위험이 많은 편이다.

쯔쯔가무시균은 하나의 종으로 분류되고 있으나, 항원 구조가 다른 혈청형이 다수 존재하며, 이러한 항원의 차이에 따라 현재까지는 20가지 이상의 쯔쯔가무시균이 구별되고 있는데, 원형(prototype) 혈청형은 길리엄(Gilliam), 카프(Karp) 및 카토(Kato)로 분류된다(Eisemann and Osterman 1985, Am J Trop Med Hyg. Nov;34(6):1173-8; Akira Tamura and Akiyoshi Kawamura 1991, J. CLIN. MICROBIOL. Feb. 1991, Vol. 29, No. 2 ; WOO-HYUN CHANG et al.1993, J. CLIN. MICROBIOL Mar. 1993, p. 598-605). 한국에서는 길리암, 카프 및 보령이 주요 혈청형이며, 이 중 보령 혈청형이 가장 많이 분류된다(Chang WH et al 1995 J Korean Med Sci 10: 227-38 ;Lee et al 2010, J.Trop Med Hyg 83(4):930-5 Yang et al 2011, 　PLoS ONE 6(8): e22731).

사람에서의 쯔쯔가무시병에 대한 면역은 한 가지 혈청형에 특이적이기 때문에 병에 걸린 후 생기는 방어 면역 능력은 같은 혈청형에 대해서는 수년간 지속되나 다른 혈청형에 대해서는 방어 능력을 보이지 않는다(no cross-immunity). 예를 들면, 4 개월 동안 관찰한 환자 중에서 처음에 길리엄(Gilliam) 혈청형에 감염되고 2 달 후에 카프(Karp) 혈청형에 재감염된 예가 증명된 바 있다. 또한 쯔쯔가무시균의 혈청형에 따라 사람과 설치류에서 독성, 발병 정도의 차이가 보이는 만큼 혈청형의 동정은 효과적인 치료와 백신 적용에 있어서 중요한 의미를 지닌다(Kang and Chang, 1999. Microbiol Immunol.43(3):229-34.; Kim et al., 2007, Mil Med. Jul;172(7):759-64.; Kelly et al., 2009, Clin Infect Dis. Mar 15;48).

쯔쯔가무시병을 진단하기 위한 방법으로는 면역형광염색법, 항체 반응을 이용한 면역크로마토법, 유전자증폭법 등이 있다. 면역형광염색법을 수행하기 위해서는 균을 배양하기 위한 생물안전시설(biosafety level 3)이 필요하며 연구자의 숙련 정도가 결과에 많은 영향을 끼친다. 쯔쯔가무시균을 동정하기 위하여 가장 주요하게 사용하고 있는 마커인 TSA56은 혈청형별로 다양한 변이를 지니고 있어 유전자증폭법을 이용할 경우 민감도가 떨어지는 문제가 있으며 면역크로마토법을 이용할 경우에는 다양한 혈청형 구별을 위하여 여러 종류의 항원을 필요로 한다. 현재 tsa56 유전자뿐만 아니라 47kDA 유전자, groEL를 타겟으로 한 유전자증폭법이 수행되고 있으나, 유전자를 증폭한 후 추가적으로 염기서열을 분석하여야 혈청형 분류가 가능하며 이는 시간과 비용의 측면에서 부담이 될 수 있다((Day, N P J et al 2009 Clin Microbio Inf　May;15(5):488-95).

따라서 보다 신속하고 저렴한 비용으로 혈청형의 동정이 가능한 방법이 여전히 요구된다 할 것이다.

한편 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질은 ScaA, ScaB, ScaC, ScaD, ScaE의 5가지 그룹으로 나누어지는데(Ha et al., 2011 Infect Immun 79:1718-27), 숙주세포의 피브로넥틴(fibronectin)과 상호작용하여 숙주세포에 침입에 관여하는 단백질이다.

Sca 단백질은 그람(-) 균에서 단백질이 외벽을 통과하여 분비되거나 발현할 수 있도록 C-말단 부위에는 오토트랜스포터(autotransporter) 도메인을 지니고 N-말단 부위에 신호 서열(signal peptide)을 지니며 중간에는 외벽 밖으로 발현하는 부위인 패신저(passenger) 도메인을 지닌다.

본 발명은 sca 유전자 중 특히 scaD 유전자의 패신저 도메인의 길이(length) 차이를 이용하여 서열 분석 없이도 쯔쯔가무시균의 혈청형을 동정할 수 있는 방법을 개시한다.

본 발명의 목적은 쯔쯔가무시균의 혈청형 동정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발병의 다른 목적은 쯔쯔가무시균의 혈청형 동정 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

전술하였듯이, 쯔쯔가무시균은 급성 열성병 중 하나인 쯔쯔가무시병의 원인이 되는 균으로 이들의 혈청형을 구별하는 것은 감염시의 적절한 치료나 백신을 개발·적용하기 위하여 중요하지만 현재 개발되어 있는 방법은 비용 측면이나 시간 소모적 측면에서 비효율적이다.

본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 길리엄, 카프, 카토 및 보령(Gilliam, Karp, Kato, Boryong) 혈청형의 유전체 DNA를 분리하여 scaA , scaB, scaC , scaD 및 scaE 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭할 경우, scaA와 scaC의 패신저 도메인 유전자는 모든 혈청형에서 동일한 패턴으로 검출되었으나, scaB 패신저 도메인 유전자는 보령 혈청형에서만 검출되었고 scaE의 패신저 도메인 유전자는 카토 혈청형에서는 검출되지 않았으며, scaD 패신저 도메인의 유전자는 길리엄, 카프, 카토 및 보령 혈청형에서 각기 다른 길이로 검출됨을 확인하였다. 특히 길리엄, 카프 및 카토에서는 육안으로도 크기 차이를 뚜렷이 확인할 수 있었다.

보령 혈청형을 기초로 하여 작성된 Sca 단백질의 구조적 모식도를 [도 1]에 나타내었으며, [도 1]에서 아미노산 서열의 길이 및 위치는 모두 보령 혈청형을 기초로 표시되어 있다. scaA, scaB, scaC, scaD 및 scaE 유전자의 증폭된 영역은 [도 1]에서 라인(line)으로 표시된 패신저 도메인(passenger domain) 영역이며, SP는 신호서열(signal peptide), RPT는 내부 반복 서열(internal repeat sequence), TM은 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane), AT는 오토트랜스포터 도메인(autotransporter doamin)을 의미하고, AA는 아미노산을 의미한다.

나아가 본 발명자들은 상기 패신저 도메인 증폭 산물의 염기서열을 분석하여 서열번호 1 내지 16에 나타내었고, 그 패신저 도메인의 아미노산 서열을 분석하여 서열번호 17 내지 32에 나타내었으며, 보령 혈청형에서만 검출된 scaB 유전자의 패신저 도메인을 제외하고, 나머지 유전자의 패신저 도메인의 아미노산 서열을 정렬·비교하여 ScaA에 대해서는 [도 3]에, ScaC에 대해서는 [도 4]에, ScaD에 대해서는 [도 5] 및 [도 6]에, ScaE에 대해서는 [도 7]에 나타내었다. [도 7]에서는 카토 혈청형에서 scaE 유전자의 패신저 도메인이 검출되지 않았기 때문에, 카토 혈청형을 제외한 나머지 혈청형들의 아미노산 서열만이 정렬·비교되어 있다.

각 sca 유전자의 패신저 도메인의 증폭 산물에 대한 염기서열의 서열번호와 그에 거의 상응하는 아미노산 서열에 대한 서열번호를 아래의 [표 1]에 정리하였다.

패신저 도메인 증폭 산물의 염기서열 및 패신저 도메인의 아미노산 서열의 서열번호

Sca유전자 증폭산물의 염기서열 서열번호			Sca 단백질 패신저 도메인 아미노산 서열의 서열번호
구분	서열번호	길이(bp)	구분	서열번호	길이(AA)
scaA(KP)	1	1134	ScaA(KP)	17	378
scaA(KT)	2	1084	ScaA(KT)	18	361
scaA(GM)	3	1137	ScaA(GM)	19	379
scaA(BR)	4	1161	ScaA(BR)	20	387
scaB(BR)	5	1047	ScaB(BR)	21	349
scaC(KP)	6	1542	ScaC(KP)	22	514
scaC(KT)	7	1551	ScaC(KT)	23	517
scaC(GM)	8	1552	ScaC(GM)	24	517
scaC(BR)	9	1578	ScaC(BR)	25	526
scaD(KP)	10	1587	ScaD(KP)	26	529
scaD(KT)	11	1316	ScaD(KT)	27	438
scaD(GM)	12	1208	ScaD(GM)	28	402
scaD(BR)	13	1965	ScaD(BR)	29	655
scaE( KP )	14	1346	ScaE(KP)	30	448
scaE(GM)	15	1344	ScaE(GM)	31	448
scaE( BR )	16	1332	ScaE(BR)	32	444

전술한 바의 실험 결과를 고려할 때, 일 측면에 있어서 본 발명은 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법으로 파악할 수 있다.

본 발명의 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법은 scaD 유전자의 패신저 도메인의 길이 차이를 이용하는 방법으로서, 구체적으로, (a) 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계, (b) 상기 DNA로부터 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토 및 길리엄 사이에서 서로 다른 길이로 증폭되도록 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계, 및 (c) 그 증폭 산물의 길이를 비교하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 쯔쯔가무시균이 포함된 세포, 조직 또는 체액(혈액, 타액, 소변 등)을 말하는 것으로, 얻어진 그대로 직접 사용하거나, 쯔쯔가무시균의 DNA의 분리를 용이하게 하기 위하여 상기 시료를 전처리한 후에 사용할 수 있다. 전처리는 예를 들면 시료의 원심분리(예컨대 원심분리에 의한 혈액으로부터의 혈장 또는 혈청의 분리), 시료 중의 세포의 파괴, 시료의 희석, 시료의 여과, 시료의 증류, 시료의 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등에 의해 이루어질 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대 에탄올 분리법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 이들을 혼합한 방법 등을 이용할 수 있으며, 또 예컨대 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007)], 문헌[Doyle et al, 1987. Phytochem Bull 19: 11-15], 문헌[Want et al, 1993. Nucleic Acids Res 21: 4153-4154], 문헌[Lodhi et al., 1994. Plant Mol Biol Rep 12(1):6-13] 등에 개시된 방법을 이용·응용하여 수행할 수 있다. 통상은 생명공학회사에 제작·유통되는 DNA 추출용 키트를 이용하게 될 것이다. 그러한 DNA 추출용 키트로서는 예컨대 아래의 실시예에서 사용된 RBC Genomic DNA extraction kit(RBC Bioscience Co., Taipei City, Taiwan)나, Roche사(Germany), Epicenter Technology 사(WI), XTRANA 사(CO), Cepheid 사(CA), Qiagen 사(NL) 또는 Beckman Coulter 사(US)가 판매하는 키트 등을 들 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 상기 (b) 단계의 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토 및 길리엄 사이에서 서로 다른 길이로 증폭되도록 하기 위해서는 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역에서 서열이 보존된 부위(consensus region)를 기초로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계·제작하되, 그 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 설계·제작의 기초가 되는 서열 보존 부위는 증폭될 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역의 길이가 서로 달라지는 부위에서 선정될 필요가 있다.

따라서 ScaD 단백질의 패신저 도메인의 아미노산 서열을 정렬·비교한 [도 5] 및 [도 6]의 서열에서, 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 설계의 기초가 되는 서열 보존 부위는, 예컨대 보령 균주 기준 정방향 프라이머의 경우는 [도 5] 및 [도 6]의 아미노산 서열 위치 1 내지 84에서 선정될 수 있고, 역방향 프라이머의 경우는 [도 5] 및 [도 6]의 아미노산 서열 위치 574 내지 648에서 선정될 수 있다. 여기서 만일 정방향 프라이머가 [도 5] 및 [도 6]의 아미노산 서열 위치 1 내지 84 중 서열 위치 1 내지 10의 서열을 기초로 설계·제작되고, 역방향 프라이머의 경우는 [도 5] 및 [도 6]의 아미노산 서열 위치 574 내지 648 중 서열 위치 638 내지 648의 서열을 기초로 제작될 경우 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역의 증폭 산물은 이를 [도 5] 및 [도 6]를 참조하여 아미노산 길이로 환산하게 되면, 카프 혈청형에서는 523개의 아미노산에 상응하는 길이의 증폭 산물이 얻어질 것이고, 카토 혈청형에서는 432개의 아미노산에 상응하는 길이의 증폭 산물이 얻어질 것이며, 길리엄 혈청형에서는 396개의 아미노산에 상응하는 길이의 증폭 산물이 얻어질 것이다. 이들 증폭 산물의 길이 차는 후술하는 바와 같이 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에서의 전기영동을 이용할 경우 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 식별이 가능하다.

또한 예컨대, ScaD 단백질의 패신저 도메인의 아미노산 서열을 정렬·비교한 [도 5] 및 [도 6]의 서열에서, 보령 균주 기준 정방향 프라이머 설계의 기초가 되는 서열 보존 부위가 아미노산 서열 위치 141 내지 150에서 선정되고, 역방향 프라이머 설계의 기초가 되는 서열 보존 부위가 서열 위치 638 내지 648의 서열에서 선정될 경우, 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역의 증폭 산물은 이를 [도 5] 및 [도 6]를 참조하여 아미노산 길이로 환산하게 되면 카프 혈청형에서는 389개의 아미노산에 상응하는 길이의 증폭 산물이 얻어질 것이고, 카토 혈청형에서는 292개의 아미노산에 상응하는 길이의 증폭 산물이 얻어질 것이며, 길리엄 혈청형에서는 263개의 아미노산에 상응하는 길이의 증폭 산물이 얻어질 것이다. 이들 길이의 차도 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 식별이 가능하다.

이처럼 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토 및 길리엄 사이에서 서로 다른 길이로 증폭되도록 카프, 카토 및 길리엄 사이의 서열 보존 부위를 기초로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 설계·제작할 경우, 증폭되는 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역의 카프, 카토 및 길리엄 사이에서의 길이 차는 그 길이 차를 당업자가 식별하는 것이 가능한 한 임의의 차이더라도 무방하나, 50bp 이상, 100bp 이상, 150bp 이상 순으로 되도록 하는 경우가 바람직하다.

또 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 설계의 기초가 되는 카프, 카토 및 길리엄 사이의 서열 보존 부위는 100% 서열 상동성을 보일 필요는 없으며, 이를 기초로 설계·제작되는 프라이머 서열이 주형 DNA와 특이적으로 결합하여 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있으면 되므로 70% 이상의 서열 상동성을 보이더라도 충분하나, 주형 DNA와 특이적으로 결합하여 안정적인 상보적 결합을 유지하기 위해서는 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 보이는 부위인 것이 바람직할 것이다.

한편 본 명세서에서, "프라이머 (primer)"란 주형 DNA에 특이적으로 결합하여 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 이러한 프라이머는 DNA 뿐만 아니라 RNA일 수 있으며, 또한 뉴클레아제나 열에 안정한 PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), HNA(Hexitol Nucleic Acids), ANA(Altritol Nucleic Acids), MNA(Mannitol Nucleic Acids), RNA(Ribose Nucleic Acids) 등의 핵산 유사체일 수도 있다.

또한 본 명세서에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.

이러한 프라이머의 길이는 주형 DNA와 특이적으로 결합하여 안정한 상보적인 결합을 형성하고 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 한 특별한 제한이 없다. 프라이머의 길이는 온도, 버퍼의 염 농도 등 증폭 조건을 고려하여 결정될 것이다. 통상은 10 내지 100 뉴클레오티드 범위의 길이를 가지도록 설계·제작될 것이나, 프라이머의 길이가 너무 짧거나 너무 길 경우에 주형 DNA와 비특이적 결합이 형성될 수 있으므로 15 내지 50 뉴클레오티드의 길이를 가지도록 설계되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 (b) 단계의 증폭 단계는 전술한 바의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction;PCR)에 의해서 이루어질 수 있으며, 이 중합효소연쇄반응은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 통상은 생명공학회사에서 제작유통되는 키트를 이용하게 될 것인데, 이러한 DNA의 증폭용 키트는 이러한 DNA의 증폭용 키트는 일반적인 PCR 방법뿐만 아니라, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법, 중합효소 리가아제 체인 반응법, Gap-LCR(Gap-filling Ligase Chain Reaction)법, 리페어 체인 반응법과, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응법, RCA(rolling circle amplification) 등의 등온증폭(isothermal amplification) 방법 등을 이용한 키트일 수 있다(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560, 1989; Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16, 1991; WO 90/01069; EP 439,182; Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173, 1989; U.S. Pat. No. 5,130,238)

또 본 발명의 방법에서, 상기 (c)단계의 증폭 산물의 길이 비교 단계도 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 일반적으로는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 증폭된 산물을 전기영동하는 방법을 이용하게 될 것이다. 전기영동 후에는 인터칼레이터 예컨대 에티듐 브로마이드, 에티듐 호모다이머-1, 에티듐 호모다이머-2, 에티듐 유도체, 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 유도체, 에티듐-아크리딘 헤테로다이머, 에티듐 모노아지드 등을 처리하여 증폭 산물을 검출·확인할 수 있다. 구체적인 검출·확인 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Nucleic Acid Microarray and the Latest PCR Method, published by Shujunsha, Japan]에 기재된 방법 등을 참조할 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 카프, 카토 및 길리엄 사이에서 서로 다른 길이로 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함함을 특징으로 한다.

그러한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 전술한 바와 같이 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역에서 서열이 보존된 부위(consensus region)를 기초로 설계·제작되며, 그 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 설계·제작의 기초가 되는 서열 보존 부위는 카프, 카토 및 길리엄의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역이 증폭될 경우 길이가 서로 달라지는 부위에서 선정되게 된다. 보다 구체적으로 이와 관련하여서는 전술한 바의 설명이 그대로 적용된다.

본 발명의 키트는 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료를 분리하기 위한 수단, 생물학적 시료의 전처리 수단, DNA 증폭용 키트 등의 DNA 서열의 증폭 수단, 본 발명의 키트의 사용 방법을 교시한 설명서 및/또는 인터칼레이터 등의 증폭 산물의 검출·확인을 위한 수단 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트의 사용 방법을 교시한 설명서는 본 발명이 개시하는 서열들의 일부·전부 및/또는 본 발명이 개시하는 서열들의 일부·전부를 비교·정렬한 서열을 포함할 수 있으며, 종이 형태나 CD, 디스크, DVD 등 컴퓨터 판독 가능한 형태일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형에서 보령 혈청형을 동정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 scaB 유전자의 패신저 도메인 영역의 검출 유무를 이용하거나 scaD 유전자의 패신저 도메인의 길이 차이를 이용할 수 있는데, (i) 본 발명의 방법이 scaB 유전자의 패신저 도메인 영역의 검출 유무를 이용할 경우, (a) 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계, (b) scaB 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계, 및 (c) 그 증폭 유무를 검출하는 단계를 포함하여 구성되며, (ii) 본 발명의 방법이 scaD 유전자의 패신저 도메인의 길이 차이를 이용할 경우는 전술한 바의 본 발명의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법과 유사하게 (a) 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계, (b) 상기 DNA로부터 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토, 길리엄 및 보령 혈청형 사이에서 서로 다른 길이로 증폭되도록 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계, 및 (c) 그 증폭 산물의 길이를 비교하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명의 방법이 scaB 유전자의 패신저 도메인 영역의 검출 유무를 이용할 경우, 상기 (a) 단계 및 상기 (c) 단계는 전술한 바의 본 발명의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 적용될 수 있다.

상기 (b) 단계의 scaB 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계는 scaB 유전자의 패신저 도메인 영역의 서열을 기초로 제작된 프라이머를 이용하여 이루어질 수 있다. 여기서 프라이머의 제작 및 유전자 증폭과 관련하여서도 전술한 바의 본 발명의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 적용될 수 있다. scaB 서열은 상기 [표 1] 및 본 발명이 개시하는 서열목록을 참조할 수 있다.

본 발명의 방법이 scaD 유전자의 패신저 도메인의 길이 차이를 이용할 경우, 그 각 단계에 대해서도 전술한 바의 본 발명의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 적용될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형에서 보령 혈청형을 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트가 scaB 유전자의 패신저 도메인 영역의 검출 유무를 이용할 경우, scaB 유전자의 패신저 도메인 영역의 서열을 기초로 제작된 프라이머를 포함함을 특징으로 하며, 추가적으로 전술한 바의 본 발명의 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하기 위한 키트와 관련하여 설명한 바와 마찬가지로 생물학적 시료를 분리하기 위한 수단, 생물학적 시료의 전처리 수단, DNA 증폭용 키트 등의 DNA 서열의 증폭 수단, 본 발명의 키트의 사용 방법을 교시한 설명서 및/또는 인터칼레이터 등의 증폭 산물의 검출·확인을 위한 수단 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 scaD 유전자의 패신저 도메인의 길이 차이를 이용할 경우는 카프, 카토, 길리엄 및 보령 혈청형의 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 카프, 카토, 길리엄 및 보령 혈청형 사이에서 서로 다른 길이로 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함함을 특징으로 한다. 여기서도 추가적으로 본 발명의 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하기 위한 키트와 관련하여 설명한 바와 마찬가지로 생물학적 시료를 분리하기 위한 수단, 생물학적 시료의 전처리 수단, DNA 증폭용 키트 등의 DNA 서열의 증폭 수단, 본 발명의 키트의 사용 방법을 교시한 설명서 및/또는 인터칼레이터 등의 증폭 산물의 검출·확인을 위한 수단 등을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형 중 카토 혈청형을 동정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 scaE 유전자의 패신저 도메인 영역의 검출 유무를 이용하는 방법으로서, (a) 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계, (b) scaE 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계, 및 (c) 그 증폭 유무를 검출하는 단계를 포함하여 구성된다.

여기서도 상기 (b)의 증폭 단계의 수행을 위해서 프라이머 설계·제작을 제외하고는 전술한 바의 설명이 그대로 적용될 수 있는데, 프라이머 설계·제작은 카프 및 길리엄의 scaE 유전자의 패신저 도메인 영역의 서열을 기초로 이루어지며, 특히 카프 및 길리엄 사이에서 보존된 부위를 기초로 이루어지는 것이 바람직하다. 보존된 부위를 기초로 설계·제작된 프라이머를 이용할 경우 증폭 단계는 카프 및 길리엄 각각에 대해서 이루어질 필요가 없게 된다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형 중 카토 혈청형을 동정하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트도 scaE 유전자의 패신저 도메인 영역의 검출 유무를 이용하는 것으로, 원형 혈청형 중 카프 및 길리엄의 scaE 유전자의 패신저 도메인 영역의 서열을 기초로 제작된 프라이머를 포함함을 특징으로 하며, 그 프라이머는 전술한 바의 이유에서 바람직하게는 카프 및 길리엄 사이에서 보존된 부위를 기초로 제작된 것이 바람직하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형 및 보령 혈청형을 동정하기 위한 방법으로서, 구체적으로는 서열 분석을 통하여 분석된 서열을 본 발명의 개시하는 서열과 비교함을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명의 서열 분석을 통한 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형 및 보령 혈청형을 동정하기 위한 방법은 (a) 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계, (b) scaA , scaB , scaC , scaD 및 scaE 유전자 중 하나 이상의 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계 및 (c) 그 증폭 산물의 서열을 분석하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명의 서열 분석을 통한 동정 방법은 원형 혈청형 및 보령 혈청형 사이에서 보존되지 아니한 영역을 이용하는 것이 바람직하며, 보존되지 아니한 영역은 본 발명의 개시하는 서열목록과 비교·정렬 서열 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 전술한 바의 모든 동정 방법은 각 단일 방법 결과의 신뢰성을 높이기 위하여 2 가지 이상 서로 병행되어 사용될 수도 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi)의 sca 유전자 특히 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역의 길이 차이에 의한 혈청형(serotype)의 효과적인 동정 방법 및 키트를 제공할 수 있다.

도 1은 Sca 단백질의 구조적 모식도와 증폭된 염기서열에 상응하는 아미노산 위치를 도시한 것이다.
도 2는 sca 유전자 패신저 도메인의 증폭 산물의 전기영동 사진이다.
도 3은 보령 및 원형 혈청형(카토, 카프 및 길리암)의 ScaA의 패선저 도메인의 아미노산 서열을 비교·정렬한 서열이다.
도 4는 보령 및 원형 혈청형(카토, 카프 및 길리암)의 ScaC의 패신저 도메인의 아미노산 서열을 비교·정렬한 서열이다.
도 5 및 6은 보령 및 원형 혈청형(카토, 카프 및 길리암)의 ScaD의 패신저 도메인의 아미노산 서열을 비교·정렬한 서열이다.
도 7은 보령 및 원형 혈청형 중 카프 및 길리암의 ScaE의 패신저 도메인의 아미노산 서열을 비교·정렬한 서열이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 쯔쯔가무시균의 유전체 DNA 분리

실험에 사용할 쯔쯔가무시균 길리엄, 카프, 카토, 보령(Gilliam, Karp, Kato, Boryong) 혈청형의 유전체 DNA(genomic DNA)를 확보하였다.

쯔쯔가무시균 길리엄, 카프, 카토, 보령(Gilliam, Karp, Kato, Boryong) 혈청형의 유전체 DNA 획득하기 위하여 L929 세포(마우스 섬유아세포주; ATCC NTCT929)를 각 균주로 감염시켜 전체 DNA를 확보하였다. 구체적으로 감염 3-4일 후 간접면역형광기술을 수행하여 감염률을 확인하고 감염률이 90% 이상이 되면 세포를 600xg의 속도에 20분 동안 원심 분리하여 펠렛을 모은 후 6.5ml의 Tris-sucrose(TS) 완충액(33 mMTris-Cl[pH 7.4] and 0.25 M sucrose)에 현탁시켰다. 현탁된 세포를 Polytron homogenizer (Wheaton Inc. Millville, NJ)를 이용하여(10stroke) 균질화한 후 5분 동안 200xg로 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 TS 완충액에 들어있는 40% Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)과 섞은 후 2500xg에서 60분 동안 원심분리하고 원심분리 후 나타나는 균 층을 모은 후 다시 7700xg로 30분 동안 원심분리하였다. 최종적으로 쯔쯔가무시균이 수집되면 RBC Genomic DNA extraction kit(RBC Bioscience Co., Taipei City, Taiwan)를 이용하여 균의 유전체 DNA를 확보하였다.

< 실시예 2> DNA 의 PCR 증폭

쯔쯔가무시균 보령 혈청형의 정보(GeneBank acession number AM494475.1)를 기초로 하여 아래 [표 2]와 같이 디자인된 프라이머와 상기 <실시예 1>에서 분리한 유전체 DNA를 이용하여 scaA, scaB, scaC, scaD 및 scaE 유전자를 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystemss, USA)를 사용하여 증폭하였다. 여기서 PCR의 수행 조건은 다음과 같다: 95℃(5mins)에서 pre heating후95℃(30s)-55℃(30s)-72℃(90s)을 40cycle 반복 진행 후 72℃(5mins)의 추가 반응을 하였음. 그리고 scaA, scaB, scaC, scaD 및 scaE 유전자의 증폭된 영역은 Sca 단백질의 구조적 모식도를 도시한 [도 1]에서 라인(line)으로 표시된 패신저(passenger domain) 영역이며, 여기서 아미노산 위치 표기는 보령 혈청형을 기준으로 하였다.

PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고 크기를 비교하였다.

그 전기영동 사진을 [도 2]에 나타내었다.

[도 2]에 나타낸 실험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 아래 [표 2]의 프라이머를 이용하여 각 sca 유전자의 패신저 도메인 유전자 증폭 결과, scaD 패신저 도메인의 유전자는 길리엄, 카프, 카토, 보령 혈청형에서 각기 다른 크기로 검출되었으며, scaB 패신저 도메인의 유전자는 보령 혈청형에서만 검출되었다. 또한 scaE의 패신저 도메인은 카토 혈청형에서는 검출되지 않았으며 scaA와 scaC의 패신저 도메인은 모든 혈청형에서 동일한 패턴으로 검출되었다. 따라서 scaD의 패신저 도메인 유전자를 증폭하여 그 증폭 산물의 크기를 비교할 경우 길리엄, 카프, 카토, 보령 혈청형을 구별할 수 있으며, 추가적으로 scaD의 유전자 증폭하여 얻은 혈청형 구별 결과를 scaB의 패신저 도메인과 scaE의 패신저 도메인 유전자 증폭 결과와 통합하여 재확인할 수도 있다.

< 실시예 3> 쯔쯔가무시균의 Sca 유전자 서열 분석 및 계통도 작성

상기 <실시예 2>에서 얻은, 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 길리엄, 카프, 카토, 보령(Gilliam, Karp, Kato, Boryong) 혈청형의 sca 유전자 증폭 산물(패신저 도메인 부위임)을 마크로젠사(Macrogen Co., Seoul, south Korea)에 위탁하여 서열을 분석하였으며, 그 결과를 서열번호 1 내지 16에 나타내었다.

또한 sca 유전자의 증폭 산물의 아미노산 서열을 분석하여 서열번호 17 내지 32에 나타내었으며, 그 증폭 부위의 아미노산 서열 전체 또는 일부를 비교·정렬하여 도 3 내지 7에 나타내었다.

분석된 패신저 도메인의 아미노산 서열을 비교한 결과, ScaA 단백질의 경우 65.8 내지 81.8%의 서열 상동성을 보였으며, ScaC 단백질은 77.4 내지 97.5%, ScaD는 69.7 내지 93.8%, ScaE는 62.8 내지 85.3%의 서열 상동성을 보였다.

한편 scaD 유전자 크기 차이는 RPT의 개수 차이에 기인하는 것으로 판단되는데, RPT의 아미노산 서열을 두 가지의 유형으로 구분할 수 있었다. 제1의 유형은 약 70 여개의 아미노산으로 이루어지고, 제2의 유형은 16개의 아미노산으로 이루어져 있었다.

보령 혈청형에서 제1의 유형의 RPT 염기서열은 도 5 및 도 6에서 ScaD 서열 전반부에서 라인과 블럭으로 표시되어 있으며, 제2의 유형의 RPT 염기서열은 ScaD 서열 후반부에서 블럭과 라인으로 표시되어 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> A Method and a Kit for Identification of Serotype of Orientia tsutsugamushi <130> PP12-000-01 <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1134 <212> DNA <213> Orientia tsutsugamushi <400> 1 atgttacttg gagattatac tgttacagct caaactaatg aagaaaatgg tggaatcagt 60 ataggtaatg caaaaattga ccttagcagc aatacactaa ctctggctag tgatagtatt 120 agcatattgg gacataagtc aaaaaaagga tctagtacta atcctgaaaa atttaagaag 180 aagcctgtta ctgtatttag tataaactat actactaact cagatgggac tgttaaaact 240 caaggtaagt taaaattgag taaatactac gatccaaata acaaaataat agtaaatgtc 300 gatcatcaag gagatttaag ggatttaagt aaacatggaa ctcaaaccgt gatacagcct 360 gtagatattg ctaacactgg agggctagct gtagataact tggtctacat gtgcgatggt 420 aaatgcaagt ggcagccagt agagtgctct gatggaaaat tcgtatttgc tggattggta 480 gataagaaga aaaaagacaa aggagatgat ggcacttcag gtagcagtgg taggagtgca 540 gccccatctg ctagagttag tccagaagta agtgatgatg aagaaggtga taagggtgaa 600 gatatacaag cgtctactgt ttctcattta catagtgagg atagtgctca 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35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 ggcggatcca gtacaactca aaggatatta gg 32 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 cggtcgacac tactacaaat gtttgatcc 29 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ggcggatcca tgtaccaatc taat 24 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 cggtcgacaa aattagttcc tatatg 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 aaggatccca attaagtgag cgacta 26 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 cggaattcta ccgtagcaac agtaacagc 29 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 ggcggatcca atgtaaatgc acagcccaa 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 cggtcgacct gtactgttgc tattttaga 29

Claims (6)

1. (a) 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계,
   (b) 상기 DNA로부터 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토 및 길리엄 사이에서 서로 다른 길이로 증폭되도록 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계, 및
   (c) 그 증폭 산물의 길이를 비교하는 단계를
   포함하는 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄을 동정하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 카프, 카토 및 길리엄 혈청형의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역에서 서열이 보존된 부위(consensus region)를 기초로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계하여 제작하는 단계를 포함하되,
   증폭되는 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토 및 길리엄 혈청형 사이에서의 길이 차가 서로 간에 100bp 이상이 되도록 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 설계하여 제작하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 카프, 카토 및 길리엄 혈청형의 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 카프, 카토 및 길리엄 혈청형 사이에서 서로 다른 길이로 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청인 카프, 카토 및 길리엄 혈청형을 동정하기 위한 키트.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 카프, 카토 및 길리엄 혈청형의 scaD 유전자 패신저 도메인 영역에서 서열이 보존된 부위(consensus region)를 기초로 설계하여 제작되되,
   증폭되는 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 카프, 카토 및 길리엄 혈청형 사이에서의 길이 차가 서로 간에 100bp 이상이 되도록 설계하여 제작된 프라이머인 것을 특징으로 하는 키트.
   
5. (a) 오리엔티아 쯔쯔가무시균이 포함된 생물학적 시료로부터 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 DNA를 얻는 단계,
   (b) 상기 DNA로부터 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역이 보령, 카프, 카토 및 길리엄 혈청형 사이에서 서로 다른 길이로 증폭되도록 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 증폭하는 단계, 및
   (c) 그 증폭 산물의 길이를 비교하는 단계를
   포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄 혈청형으로부터 보령 혈청형을 동정하는 방법.
   
6. 보령, 카프, 카토 및 길리엄 혈청형의 scaD 유전자의 패신저 도메인 영역을 보령, 카프, 카토 및 길리엄 혈청형 사이에서 서로 다른 길이로 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 원형 혈청형인 카프, 카토 및 길리엄 혈청형으로부터 보령 혈청형을 동정하기 위한 키트.
   

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