KR20150114096A

KR20150114096A - 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR20150114096A
Application number: KR1020140037870A
Authority: KR
Inventors: 이성률; 김나리; 한진
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2015-10-12

Abstract

본 발명은 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 성게로부터 추출되는 항산화 퀴노이드 색소인 에키노크롬은 세포에 독성을 나타내지 않으며, 아세틸콜린에스테레제의 활성을 비가역적 및 경쟁적 방식으로 저해함으로써 아세틸콜린의 과도한 분해를 억제할 수 있어 생체 내 활용성을 높일 수 있다. 또한 에키노크롬은 부가적으로 NO 소거능을 가지고 있어 과도한 NO 생성과 관련된 염증 반응을 저해 또는 감소시킬 수 있다.
따라서 본 발명의 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 아세틸콜린 결핍에 의한 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.

Description

에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative neurological disease comprising echinochrome}

본 발명은 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

알츠하이머 질환은 치매를 일으키는 퇴행성 뇌질환으로, 매우 서서히 발병하여 점진적으로 진행되는 경과가 특징이며, 초기에는 주로 최근의 일에 대한 기억력에 문제를 보이다 질환이 진행되면 언어기능이나 판단력 등 다른 여러 인지기능의 이상을 동반하게 되며, 결국에는 모든 일상생활 기능을 상실하게 된다. 알츠하이머 질환 환자의 뇌는 전체적으로 위축되고 작아지며 신경세포의 신경원섬유 변화와 조직 내에 노인 반점의 침착이 관찰된다.

또한 알츠하이머 환자에게서는 뇌 내에 존재하는 중요 신경전달물질 중의 하나인 아세틸콜린이 정상인에 비해 두드러지게 감소되는데, 이는 아세틸콜린을 생성하는 콜린 작동성 뉴런의 기능부전 또는 사멸에 기인하는 것으로 알려져 있다.

아세틸콜린(Acetylcholine; Ach)은 중추신경계의 신경전달물질(neurotransmitter)로의 역할 외에도 평활근 세포의 막 전위에 영향을 주어 이온 채널 조절함으로써 혈관 이완을 유도하고, 허혈성 재관류에 의한 스트레스로부터 심근을 보호하는 역할을 한다. 아세틸콜린에스테레제(Acetylcholinesterase; AchE; E.C. 3.1.1.7)는 카르복실가수분해효소 그룹에 속하고, 부교감 신경의 조절 하에 있는 기관 및 자유 신경절 등에 존재하여 시냅스 신호 전달 물질을 제어하는 역할을 한다. 아세틸콜린이 아세틸콜린에스테레제에 의해 콜린과 아세트산으로 가수분해되면, 신경전달물질로써의 활성을 잃게 된다.

따라서 알츠하이머 질환 등과 같은 아세틸콜린 부족에 의해 야기되는 신경계 질환을 조절하기 위해서는 아세틸콜린의 생체 활용도를 높이는 것이 중요하며, 이를 위해 아세틸콜린에스테레제의 활성 조절 물질이 주요 치료의 목표이다.

아세틸콜린에스테레제 저해제 또는 항-콜린가수분해효소는 콜린성 시냅스, 혈관 또는 다른 목표 조직에서 아세틸콜린의 농도 및 지속기간을 증가시키며, 최근에는 아세틸콜린 감소에 의해 발생되는 알츠하이머병의 치료 방법으로 아세틸콜린에스테레제 저해제에 대한 관심이 증가함에 따라 인체에 안전하며 효과적인 아세틸콜린에스테레제 저해제에 대한 개발이 필요한 실정이다.

또한 생체 내에서 과도한 산화질소의 생성은 신경세포의 손상에 의한 퇴행성 신경질환에 대한 중요한 원인 인자임이 밝혀짐에 따라 생체 내에서 과도한 산화질소의 생성을 억제할 수 있는 물질은 퇴행성 신경질환으로의 전이를 억제할 수 있는 중요한 요소이다.

한국공개특허 제10-2010-0053734호

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 아세틸콜린에스테레제 저해제를 제공하여, 아세틸콜린 부족에 의해 발생 되는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 허혈성 뇌질환, 중증 근무력증 및 기억장애 질환 또는 과도한 활성산화질소에 의한 신경세포 소멸에 따른 퇴행성 중추 신경계질환을 예방 또는 치료하고자 한다.

상기 퇴행성 신경계 질환은 알츠하이머 질환, 치매, 파킨슨 질환, 허혈성 뇌질환, 중증 근무력증 및 기억장애 질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있다.

상기 에키노크롬은 아세틸콜린에스테레제의 활성을 저해하고 세포 내 생성되는 질소를 제거함으로써 퇴행성 신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 퇴행성 신경계 질환 치료용 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 상기 에키노크롬을 0.1 내지 90 중량부로 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 성게로부터 추출되는 항산화 퀴노이드 색소인 에키노크롬은 세포에 독성을 나타내지 않으며, 비가역적(irreversible)이고 경쟁적(competitive)인 방법으로 아세틸콜린에스테레제의 활성을 억제할 수 있다. 또한 활성산화질소(nitric oxide, NO)를 소거함으로써, 과도한 NO 생성에 의해 유도될 수 있는 비정상적 평활근세포 혈관 이완 및 염증 반응을 조절할 수 있다.

따라서 본 발명의 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 아세틸콜린에스테레제 저해제 또는 아세틸콜린 부족에 의한 퇴행성 중추 신경계질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 에키노크롬의 화학구조이며, 에키노크롬은 자연계에 존재하는 폴리하이드록시나프토퀴논계 화합물로 적갈색을 나타낸다.
도 2는 A7r5 (랫 대동맥 혈관 평활근세포)와 H9c2 (랫의 심근유사세포) 세포에서 에키노크롬의 세포독성을 확인한 결과로, 항산화력을 가진 물질은 매우 불안정하여 빛과 공기에 노출되는 경우 고유한 항산화력을 잃고 원래의 성분과 다른 독성형태로 변할 가능성이 있다. 따라서 이 가능성을 배제하기 위해 에키노크롬의 세포독성은 표준적인 방법으로 보존된 것(차광과 공기접촉 차단)과 48시간 이상 공기와 빛에 노출시킨 형태(exhaused echinochrome)의 두 가지 종류로 처리하였다. 도 2A는 A7r5세포에 표준보관 된 에키노크롬과 exhausted 에키노크롬을 0, 0.1, 1, 10, 25 또는 50μM로 24시간 처리한 후 MTT 환원법으로 세포 독성을 확인한 결과이며, 도 2B는 상기 동일한 과정으로 H9c2 세포에서 에키노크롬의 세포 독성 및 exhausted 에키노크롬의 세포독성을 확인한 결과이며, 실험결과는 대조군 (에키노크롬 미처리군)의 생존율을 100%로 하였을 때의 상대적인 생존율을 의미하고, 평균±표준오차 값으로 나타내었다.
도 3은 에키노크롬의 항-아세틸콜린에스테레제 활성을 확인한 결과로, 도 3A는 에키노크롬 농도에 의한 아세틸콜린에스테레제 활성을 광학밀도(O.D)의 변화(Vmax)로 측정한 대표적인 결과이며, 도 3B는 다양한 농도 (0 ~ 100 μM)의 에키노크롬이 보이는 아세틸콜린에스테레제의 억제력에 대한 결과이며, 네오스티그민은 항-아세틸콜린에스테레제에 대한 양성대조군으로 사용하였다. Echc; 에키노크롬, AchE; 아세틸콜린에스테레제. *; p<0.05 vs AchE 단독.
도 4는 에키노크롬에 의한 아세틸콜린에스테레제의 활성 억제가 가역적 또는 비가역적인지를 확인하기 위해, 에키노크롬에 노출되는 시간에 따른 아세틸콜린에스테레제의 활성변화를 확인한 결과로, 도 4A는 에키노크롬 (10과 20 μM)과 아세틸콜린에스테레제(100 mU/ml)를 혼합한 후 10, 30 또는 60분 경과 후에 아세틸콜린에스테레제 활성변화를 측정한 결과이며, 도 4B는 에키노크롬에 의한 아세틸콜린에스테레제의 활성 억제가 경쟁적 또는 비경쟁적인지를 확인하기 위해 아세틸콜린의 농도에 따른 아세틸콜린에스테레제의 활성 억제 정도를 확인한 결과로 10 또는 25 μM의 에키노크롬 존재 하에서 50 또는 100 μM 아세틸콜린에서 아세틸콜린에스테레제의 활성억제 정도를 측정한 결과이며, 에키노크롬이 없는 조건에서 아세틸콜린에스테레제의 활성을 100%로 하고, 이에 대한 상대적인 활성도를 나타낸 결과이다.(*; p<0.05 vs 아세틸콜린에스테레제 단독, #; p<0.05 vs 10 μM 아세틸콜린과 아세틸콜린에스테레제). Ach; 아세틸콜린, Echc; 에키노크롬. *; p<0.05 vs AchE와 10분간 반응 그룹, #; p<0.05 vs 10 μM 아세틸콜린 그룹.
도 5는 A7r5 세포에서 에키노크롬의 NO 소거능을 측정한 결과로 질소공여자인 나이트로푸루시드 나트륨 (sodium nitroprusside, SNP) 투여 전의 형광 강도를 100%로 설정하고, 0.1, 1, 10, 25 또는 50 μM 에키노크롬 존재 하에서 나이트로푸루시드 나트륨에 의해 유도되는 상대적인 NO 생성량을 측정한 결과이다. DAF-FM; 산화질소 특이적인 형광물질, SNP; 나이트로푸루시드 나트륨, Echc; 에키노크롬. *; p<0.05 vs 2mM SNP), #; p<0.05 vs 대조군.

보다 상세하게는 상기 에키노크롬은 성게로부터 추출되는 폴리하이드록시나프타퀴논(polyhydroxynaphthaquinone)계열의 항산화 퀴노이드 색소로 도 1과 같이 오쏘하이드록실 작용기와 케톨 구조로 구성되며, 에키노크롬의 모이어티는 금속 이온 킬레이트 작용 및 항산화 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.

상기 에키노크롬은 아세틸콜린에스테레제의 활성을 저해하고 세포 내 과도하게 생성되는 산화질소를 제거함으로써 활성산화질소에 의해 매개되는 퇴행성 신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 에키노크롬의 아세틸콜린 가수분해효소 억제 효과를 확인한 결과, 도 3과 같이 아세틸콜린에스테레제의 활성은 에키노크롬의 농도 의존적으로 억제되었다. 또한 평활근 세포인 A7r5에서 질소 공여자인 나이트로프루시드 나트륨(SNP)과 에키노크롬을 각각 단독 또는 병합처리한 결과 SNP 단독 처리군에서는 NO 생성이 증가된 반면, SNP 및 에키노크롬 병합 처리군에서는 에키노크롬의 농도 의존적으로 향상된 NO 소거 효과가 확인되었다.

상기 결과로부터 본 발명의 에키노크롬을 유효성분으로 함유한 조성물은 비가역적이고 경쟁적인 반응으로 아세틸콜린에스테레제(IC₅₀= 16.4 μM)를 억제하고, NO 소거 활성과 같은 생물학적 특성을 이용하여 인체에 안전하며 효과적인 신규한 아세틸콜린에스테레제 억제제로 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 중추신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 중추신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 에키노크롬의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 본 발명에 따른 이삭사초 추출물에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 에키노크롬의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

또한 본 발명은 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 아세틸콜린에스테레제 저해제를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 화학 물질 및 세포 배양

1-1. 화학물질

도 1과 같은 화학구조의 에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 약물인 히스토크롬(Histochrome®)은 탄산나트륨(Sodium carbonate)과 염화나트륨(sodium chloride)이 포함된 0.9 mM 등장액에 750μM로 용해되어져 있는 수용액상태로 러시아 과학 아카데미의 극동 연구소, 유기화학 태평양 연구소로부터 제공받았다. 아세틸콜린에스테레제 활성 측정을 위한 비색법에 기반한 Amplite^TM 비색 아세틸콜린에스테레제 분석 키트(AAT Bioquest, Sunnylvale, CA)를 사용하였다. 또한 특이적 산화질소(NO) 지표로 4-아미노-5-메틸아미노-2,7-디플루오로플루오레세인 디아세테이트(4-amino-5-methylamino- 2,7-difluorofluorescein diacetate; DAF-FM)를 Molecular Probes (Eugene, OR)로부터 구매하였다. 부교감 신경 흥분제로 사용되며 가역적 아세틸콜린에스테레제 억제물질인 네오스티그민 브로마이드(Neostigmine bromide)는 시그마에서 구입하여 아세틸콜린에스테레제 억제에 대한 양성 대조군으로 사용되었으며, 그 밖의 모든 화학 물질은 Sigma (St Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 세포 배양

랫의 심근 세포주인 H9c2(ATCC CRL-1446)와 랫의 대동맥 혈관 평활근 세포주인 A7r5(ATCC CRL-1444)를 ATCC로부터 구입하여 고농도 글루코스; 10% 태아소혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (100units/mL 페니실린과 100μg/mL 스트렙토마이신: Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)로 세포를 배양하였다.

< 실시예 2> 에키노크롬 세포 독성 확인

에키노크롬의 세포독성을 확인하기 위해, 랫의 심근 세포주인 H9c2와 랫의 대동맥 혈관 평활근 세포주인 A7r5를 각각 96-웰 조직 배양 플레이트(Nunc, Denmark)에 한 웰 당 2×10⁴ 개의 세포로 접종하고 0.1, 1, 10, 25 또는 50 μM의 각각 다른 농도의 에키노크롬을 24시간 동안 처리하였다. 에키노크롬 처리 후 세포 생존을 확인하기 위해, 세포에 250μg/mL MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드]를 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. 그 후 생존 세포 내에 생성된 보라색의 포르마잔을 디메틸 설폭시화물(DMSO)로 용해시킨 후 Molecular device microplate reader (Menlo Park, CA)를 이용하여 560nm에서 광학밀도(OD)를 측정하였다.

전체 포르마잔 생성은 배양 배지 내 생존 세포 수와 비례하며, 에키노크롬을 처리하지 않은 배지의 OD값을 100%로 설정하였고, 실험군은 이에 대한 상대 값으로나타내었다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며, 일원 분산 분석(one way ANOVA)법으로 통계분석 하였으며 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

그 결과, 도 2와 같이 H9c2 및 A7r5 세포에 에키노크롬의 농도를 50μM까지 증가시켜 24시간 동안 처리하였지만 유의적인 세포 독성은 확인되지 않았다.

또한 항산화제로 알려진 에키노크롬이 공기와 빛의 노출에 따라 항산화 가능성이 소실되거나 다른 독성물질로의 변환가능성을 배제하기 위해, 실온 및 차광과 같은 표준적인 보존조건에서 에키노크롬을 48시간 이상 빛 및 실내공기에 노출시킨 후 에키노크롬(exhausted ehcinochrome)의 세포독성을 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 에키노크롬이 소진된 실험(exhausted ehcinochrome)군에서도 상기 결과와 같이 A7r5와 H9c2 세포 모두에서 유의한 세포 독성은 확인되지 않았다.

상기 결과로부터 에키노크롬이 비표준적인 조건에서 보존되더라고 최소한 세포독성을 유발하는 물질로 변화되지 않는 것을 확인하였다.

< 실시예 3> 에키노크롬에 의한 아세틸콜린에스테레제 활성 억제 확인

에키노크롬의 아세틸콜린에스테레제 억제 활성을 확인하기 위해, 비색법에 기반한 Amplite^TM아세틸콜린에스테레제 분석 키트를 이용하였다. 먼저 정제된 아세틸콜린에스테레제 50 units/ml을 0.1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin)에 용해시켰다. 또한 효소 100 mU/ml 및 보조 기질 5,5-디티오비스-2-니트로벤조익 산 200μM과 0.1, 1, 10, 25, 50 또는 100 μM의 에키노크롬을 혼합하여 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다.

상기 모든 화합물을 인산완충액(100 mM Na₂HPO₄, 100 mM NaH₂PO₄, pH =7.4)에 용해시킨 후 각각의 웰 당 최종 부피가 50μL가 되도록 하였다. 그 후 200μM 농도의 아세틸콜린을 각각의 웰에 50μL씩 첨가함으로써 반응을 시작하였으며, Molecular device microplate reader (SpectraMax M2^e, Sunnyvale, CA )를 이용하여 412nm에서 20분 동안 50초 간격으로 측정하여 흡광도의 변화와 최고 발색속도(Vmax)를 측정하였다.

아세틸콜린에스테레제 활성은 아세틸콜린의 분해에 의해 생성되는 DTNB(2,2'-디니트로-5,5'-디티오벤조익산)-티오콜린을 통하여 확인되었으며, 네오스티그민 브로마이드(IC₅₀=0.006 μM)를 아세틸콜린에스테레제 억제반응의 양성 대조군으로 사용하였다.

주어진 아세틸콜린 농도나 반응 시간에서 아세틸콜린에스테레제 단독 활성을 100%으로 하고 이에 대한 상대적인 백분율로 아세틸콜린에스테레제 억제활성을 표시하였다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며, t-test 또는 일원 분산 분석 (one way ANOVA) 법으로 통계분석 하였으며 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

그 결과, 도 3과 같이 에키노크롬에 의한 항-아세틸콜린에스테레제 활성 억제는 에키노크롬 농도에 의존적이였으며, IC₅₀값은 16.4μM로 측정되었다. 반면, 강력한 아세틸콜린에스테레제 억제제인 네오스티그민 브로마이드의 IC₅₀값은 0.006μM로 확인되었다.

상기 결과로부터 네오스티그민 브로마이드에 의한 아세틸콜린에스테레제의 활성억제가 에키노크롬에 비해 상대적으로 크게 나타났으나, 네오스티그민 브로마이드는 두통, 시력저하, 수정체떨림과 같은 심각한 부작용을 유발하며, 청산가리 보다 5배 높은 독성을 가지고 있는 반면, 에키노크롬의 경우 임상에서 안질환 치료에 활용되고 있으며 알려지 부작용이 없는 안전한 물질이다.

아세틸콜린에스테레제는 가역적 또는 비가역적으로 구분되는데, 도 4A를 참고하면, 에키노크롬의 아세틸콜린에스테레제 억제 활성은 에키노크롬과의 혼합시간에 의존적으로 억제되었으며, 상기 결과로부터 에키노크롬은 아세틸콜린에스테레제의 작용기전의 비가역적 억제자로 확인되었다.

또한 도 4B와 같이 에키노크롬의 억제 활성을 각각 다른 농도의 아세틸콜린 으로 분석한 결과, 에키노크롬의 억제활성은 아세틸콜린 농도에 의존적인 것이 확인된 반면, 반응속도는 아세틸콜린 농도에 차이를 보이지 않았다.

상기 결과로부터 에키노크롬은 아세틸콜린에스테레제의 경쟁적 억제자(competitive inhibitor)임이 확인되었다.

< 실시예 4> 에키노크롬에 의한 산화질소( NO ) 소거 효과 확인

산화질소(nitric oxide; NO)는 혈관 상태 유지에 중요한 역할을 하고 다양한 신호 과정에 관여하고 아세틸콜린은 혈관내피 세포에서 NO생성을 촉진하여 혈관평활근 세포의 이완을 촉진한다.

아세틸콜린에스테레제 억제에 의한 혈관내피세포에서 과도한 산화질소의 생성은 급격한 혈관이완이나, 신경세포의 손상을 유발할 수 있기 때문에 과도한 산화질소를 소거하는 기능은 신경세포의 보호에 중요한 역할을 함에 따라, 산화질소 공여자인 나이트로프루사이드 나트륨(SNP)에 의한 산화질소 생성이 에키노크롬에 의해 조절될 수 있는지 확인하였다.

48-웰 조직 배양 플레이트(Nunc, Denmark)에 A7r5 세포를 한 웰당 2×10⁴ 개의 세포로 접종하여 배양하였다. 다음날 NaCl 135 mM, KCl 5.4 mM, HEPES 5 mM, NaH₂PO₄ 0.33 mM, MgCl₂ 0.5 mM, glucose 16.6 mM 및 CaCl₂ 1.8 mM이 포함된 티로드(Tyrode) 용액으로 두 번 세척한 후 10 μM DAF-FM를 세포에 37℃, 20분 동안 처리 한 후 티로드 용액으로 세척하고, 50 μM 농도의 에키노크롬을 10분간 처리한 후 NO 공여자인 2mM 나이트로프루사이드나트륨(sodium nitroprusside; SNP)를 세포에 처리하여 NO의 생성을 유발하였다.

DAF-FM 형광강도는 SpectraMax M2e (Molecular Devices, Oregon)를 이용하여 여기(excitation)/방출(emission): 495/515 nm로 측정하였으며, SNP (baseline) 처리 직후 및 SNP 노출 30분 후에 SpectraMax M2e (Molecular Devices, Oregon)를 이용하여 스캔모드로 형광광도의 증감을 측정하였으며, 그 결과를 상대적 형광 변화량으로 나타내었다.

상대적 DAF-FM 형광변화량은 [(나이트로프루사이드 나트륨 처리 후 DAF-FM 형광값-나이트로프루사이드 나트륨 처리 전 DAF-FM 형광값)/나이트로프루사이드 나트륨 처리 전 DAF-FM 형광값×100] 식으로 계산하였으며, DAF-FM으로 염색 후 나이트로프루사이드 나트륨(SNP)를 처리하지 않은 그룹을 음성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 5와 같이 나이트로프루사이드 나트륨을 처리하지 않거나, 에키노크롬 단독 처리의 경우 DAF-FM 형광값의 유의한 변화가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 에키노크롬 자체는 산화질소를 생성하지 않는 것이 확인되었다.

또한 도 5와 같이 나이트로프루사이드 나트륨을 처리하면 NO의 생성을 의미하는 DAF-FM 형광강도가 250% 이상 증가한 반면, 에키노크롬 0.1, 1, 10, 25 또는 50 μM의 농도로 전 처리한 후 나이트로프루사이드 나트륨을 처리하면 생성되는 산화질소 양은 에키노크롬 농도 의존적으로 감소하였다.

상기 결과와 같이 에키놈크롬 존재하에서 나이트로프루사이드 나트륨에 의해 생성되는 산화질소에 의한 DAF-FM 형광 감소를 통하여 에키노크롬에 의한 즉각적인 산화질소 소거효과를 확인할 수 있었다.

에키노크롬의 산화질소 소거능은 염증반응과 같은 과도한 산화질소 생성조건이나 병적상태에 적용될 수 있으며, 아세틸콜린에 의한 과도한 산화질소의 생성이나 염증 등과 같은 병적인 조건하에서의 과도한 산화질소 생성은 에키노크롬에 의해 억제될 수 있음이 확인되었다.

상기 전술한 바와 같이, 에키노크롬은 비가역적 항-아세틸콜린에스테레제 활성(IC50= 16.4 μM)과 산화질소(NO) 소거 활성을 가지며 이러한 생물학적 특성을 이용하여 특정 임상치료에 응용할 수 있는 새로운 아세틸콜린에스테레제 억제제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 주사제의 제조

에키노크롬 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

에키노크롬 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

에키노크롬 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

이하, 본 발명에 따른 에키노크롬을 이용한 건강식품 제조예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제조예 1> 건강식품의 제조

에키노크롬 10 mg, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎), 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

< 제조예 2> 건강음료의 제조

에키노크롬 10 mg, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환은 알츠하이머 질환, 치매, 파킨슨 질환, 허혈성 뇌질환, 중증 근무력증 및 기억장애 질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 에키노크롬은 아세틸콜린에스테레제의 활성을 저해하고 세포 내 과도하게 생성되는 산화질소를 제거함으로써 퇴행성 신경계 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경계 질환 치료용 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 상기 에키노크롬을 0.1 내지 90 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
에키노크롬을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경계 질환 예방 또는 개선용 건강식품.