KR20150113651A

KR20150113651A - 생물전환 기술을 이용한 진세노사이드 Rg3-고함유 발효 홍삼의 제조방법

Info

Publication number: KR20150113651A
Application number: KR1020140037950A
Authority: KR
Inventors: 송하석
Original assignee: 송하석
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2015-10-08
Also published as: KR101616104B1

Abstract

본 발명은 생물전환 기술을 이용한 발효 홍삼의 제조방법에 관한 것으로, 사포닌의 진세노사이드 Rg3로 전환 방법, 진세노사이드 Rg3-고함유 발효 인삼 또는 발효 홍삼의 제조방법 및 진세노사이드 Rg3 고함유 방법을 제공한다. 본 발명은 생물전환(bio-conversion) 기술을 이용한 간단한 방법으로 용이하게 Rg3 고함유 발효 홍삼을 제조할 수 있다.

Description

생물전환 기술을 이용한 진세노사이드 Rg3-고함유 발효 홍삼의 제조방법{Method for Preparing Ginsenoside R3-rich Fermented Red Genseng Using Bio-conversion}

본 발명은 생물전환 기술을 이용한 진세노사이드 Rg3-고함유 발효 홍삼의 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 식물 분류학상 오가피과(Panax)의 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있다. 인삼은 지금까지 많은 약리실험을 통해 콜레스테롤 저하, 지질과산화 억제, 혈압강하, 혈류증가, 뇌혈관확장, 심장기능항진, 항부정맥, 항혈전, 혈소판응집 억제, 만성신부전 치료 효과, 세포독성 및 암 억제, 면역조절 작용, 기억력 증가, 뇌대사 항진, 항스트레스, 항산화 작용, 항노화 작용, 항궤양 및 위액분비 억제, 작업 능력 항진, 방산선에 대한 보호작용, 항당뇨, 해독, 간세포 효소 증가, 천식 치료, 항염증, 진통작용, 빈혈치료, 생식능력 증진 및 성수행능력 증진, 알코올 혈중농도 저하, 항알러지, 항암제 등의 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

최근에는 이러한 인삼의 약효성분이 인체 내로 용이하게 흡수되도록 하며, 인삼에 극미량으로 존재하는 성분들을 강화시키는 방법으로서 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하거나 및 효소를 처리하는 방법 등이 사용되고 있다.

대한민국 특허출원 공개 제2006-0001834호는 인삼 또는 홍삼에 김치 유산균을 접종하고 유기산을 처리하는 단계를 포함하는 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법을 개시하고 있다. 대한민국 특허출원 공개 제2003-61756호는 인삼을 아스퍼질러스로 발효한 후 전분 분해효소 및 단백질 분해효소로 분해하는 것을 특징으로 하는 기능성 및 관능성이 우수한 인삼 발효액의 제조방법을 개시하고 있다.

또한, 대한민국 특허출원 공개 제2006-74970호는 락토바실러스 카제이 하세가와 균주로 인삼 내의 배당체 성분을 분해하여 얻은 분해물을 포함하는 발효인삼을 개시하고 있다. 대한민국 특허출원 공개 제1998-040224호는 다양한 락토바실러스 균주로 인삼을 발효하여 사포닌 분해물을 포함하는 발효인삼을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 항암, 신경보호, 항비만 및 진통 등의 효능을 갖는 진세노사이드 Rg3을 고함유 시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인삼 또는 홍삼에 유산균을 접종하여 배양하고 배양물을 열처리하는 단계를 반복하면 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드가 인체에 유용한 형태의 진세노사이드 Rg3로 전환됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 사포닌의 진세노사이드 Rg3로 전환 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 Rg3-고함유 발효 인삼 또는 홍삼의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 Rg3 고함유 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, (a) 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계; (b) 상기 1차 유산균을 배양하여 1차 배양물을 제조하는 단계; (c) 상기 1차 배양물을 열처리 하는 단계; (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 2차 유산균을 접종하는 단계; (e) 상기 2차 유산균을 배양하여 2차 배양물을 제조하는 단계; 및 (f) 상기 2차 배양물을 열처리 하는 단계를 포함하는 사포닌의 진세노사이드 Rg3로 전환 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계; (b) 상기 1차 유산균을 배양하여 1차 배양물을 제조하는 단계; (c) 상기 1차 배양물을 열처리 하는 단계; (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 2차 유산균을 접종하는 단계; (e) 상기 2차 유산균을 배양하여 2차 배양물을 제조하는 단계; 및 (f) 상기 2차 배양물을 열처리 하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3 고함유 발효 인삼 또는 발효 홍삼의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계; (b) 상기 1차 유산균을 배양하여 1차 배양물을 제조하는 단계; (c) 상기 1차 배양물을 열처리 하는 단계; (d) 상기 단계 (c)의 결과물에 2차 유산균을 접종하는 단계; (e) 상기 2차 유산균을 배양하여 2차 배양물을 제조하는 단계; 및 (f) 상기 2차 배양물을 열처리 하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3 고함유 방법을 제공한다.

본 발명자들은 항암, 신경보호, 항비만 및 진통 등의 효능을 갖는 진세노사이드 Rg3을 고함유 시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인삼 또는 홍삼에 유산균을 접종하여 배양하고 배양물을 열처리하는 단계를 반복하면 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드가 인체에 유용한 형태의 진세노사이드 Rg3로 전환됨을 확인하였다.

본 발명은 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드(즉, 사포닌)을 전환하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 홍삼의 주 효능 진세노사이드, 즉 Rg3 를 고함유 시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 “사포닌”은 특별하게 다른 언급이 없는 한, 진세노사이드, 즉 인삼사포닌과 동일한 의미로 사용되고 있다.

본 명세서에서, 본 발명은 “사포닌의 진세노사이드 Rg3로 전환 방법”, “진세노사이드 Rg3-고함유 발효 인삼 또는 홍삼의 제조방법” 및 “진세노사이드 Rg3 고함유 방법”으로 표현되고 있으나, 상기 3가지 방법은 서로 동일한 과정을 공유하고 있기 때문에 실질적으로는 동일한 방법으로 취급될 수 있다.

기재의 편의상, 본 발명의 방법은 인삼 또는 홍삼에 적용되는 것으로 본 명세서에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 다양한 형태로 가공된 모든 인삼, 예컨대, 수삼, 미삼, 백삼 및 홍삼에 적용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업자에게 명확하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 홍삼에 적용된다.

본 발명의 방법의 각 단계를 언급하면서 사용되는 용어 “인삼”은 홍삼을 만들기 위한 처리를 하지 않은 인삼을 의미한다. 인삼은 홍삼과 비교하여 진세노사이드 Rg3의 함량이 낮은 특징이 있다.

본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 전칠삼(P. notoginseng), 회기삼(P. quiquefolius), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 이용되는 홍삼은 상기 인삼을 가공처리 하여 제조된 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 인삼은 고려삼 또는 전칠삼이다.

본 발명의 주요한 특징은 1차 및 2차의 상기 인삼 또는 홍삼의 유산균 배양과정을 실시하는 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종한다.

본 발명에 적합한 유산균은 당업계에 공지된 다양한 유산균을 포함한다.

본 명세서에서 용어 “유산균(lactic acid bacteria)”은 탄수화물 대사의 주산물로서 유산을 생산하는 박테리아 군을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 유산균은, 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 프로리오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 페디오코커스(Pediococcus)로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리엄 브라베(Bifidobacterium brave), 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 류코노스톡 멘센테로이드스(Leuconostoc mensenteroides), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 엔테로코커스 파에시엄(Enterococcus faecium) 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 사케이 및 비피도박테리엄 비피덤이다.

본 발명에 따르면, 유산균은 상술한 유산균의 1종 또는 1종 이상의 혼합 유산균을 이용할 수 있다.

유산균의 접종은 인삼 또는 홍삼의 추출액에 할 수 있고, 혹은 인삼 또는 홍삼 뿌리의 절편이 침지된 물에 할 수도 있다. 유산균의 접종량은 특별히 제한되지 않으며, 인삼 또는 홍삼의 추출액 전체 부피에 대하여 0.01-10.00 %(v/v)가 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.01-1.00 %(v/v)이다.

유산균을 접종한 다음 이 유산균을 적합한 조건 하에서 배양한다. 이 경우, 이용되는 배지는 인삼 또는 홍삼의 추출액 자체, 또는 인삼 또는 홍삼 뿌리의 절편이 침지된 물 자체를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 인삼 또는 홍삼 성분 이외의 다른 배지 성분이 포함되면, 최종 산물의 질이 떨어지는 문제점이 있다.

본 발명에서의 유산균 배양은 통상적인 유산균 배양 조건에서 실시된다.

인삼 또는 홍삼에 접종한 유산균을 배양한 다음, 배양 결과물을 열처리한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (c)의 열처리는 90-180℃, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 100-150℃, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 110-130℃에서 실시된다. 만일, 열처리를 90℃ 미만에서 하면, 진세노사이드의 전환율이 매우 낮아지며, 180℃ 초과에서 하면, 진세노사이드 및 기타 유용성분들이 파쇄 되는 문제점이 있다.

단계 (c)의 열처리는, 매우 짧은 시간 동안 실시된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (c)의 열처리는 1-90분, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 5-40분, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 5-25분 동안 실시된다.

단계 (c)의 열처리는 대기압 하에서 실시될 수 있으나, 본 발명의 일 구현예에 따르면 대기압보다 높은 기압 하에서 실시된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 단계 (c)의 열처리는 1.1-3.0 기압, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 1.2-1.8 기압에서 실시된다.

본 발명은 인삼 또는 홍삼의 1차 유산균 발효 후, 2차 유산균 발효를 실시한다.

본 발명의 2차 유산균 발효는 상기 1차 유산균 발효와 동일한 방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법은 2차 유산균 발효의 열처리 이후에, 추가적인 유산균 발효를 통해 사포닌의 전환을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 “사포닌의 진세노사이드 Rg3로 전환 방법”, “진세노사이드 Rg3-고함유 발효 인삼 또는 홍삼의 제조방법” 및 “진세노사이드 Rg3 고함유 방법”은 1차 유산균 발효를 통해 발효 전과 비교하여, 인삼 또는 홍삼 내 Rd 함량을 10-50배, 15-40배 또는 20-30배 증가시키고, 2차 유산균 발효를 통해 발효 전 및 1차 유산균 발효와 비교하여 Rg3 함량을 50-100배, 60-90배 또는 70-80배 증가시킨다.

상술한 과정을 통하여, 인산 또는 홍삼 고유의 진세노사이드가 전환된 인삼 또는 홍삼액, 즉 Rg3가 고함유된 인삼 또는 홍삼액을 얻을 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 사포닌의 전환 방법, 발효 인삼 또는 발효 홍삼의 제조방법 및 진세노사이드 Rg3 고함유 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 생물전환(bio-conversion) 기술을 이용한 간단한 방법으로 용이하게 Rg3 고함유 발효 홍삼을 제조할 수 있다.

도 1은 유산균을 이용한 홍삼의 1차 발효 결과를 보여준다.
도 2는 유산균을 이용한 홍삼의 2차 발효 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유산균의 선택

본 발명에서 이용되는 유산균은 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에서 구입한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 및 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 이용하였다. 상기 유산균의 배양 배지 및 배양 조건은 표 1과 같다.

유산균	배양배지	조건
Lactobacillus sakei	Lactobacillus agar(BD, 미국)	37 ℃ (혐기성)
Bifidobacterium bifidum	Bifidobacterium agar(BD, 미국)	37 ℃ (혐기성)

실시예 2: 유산균을 이용한 1차 전환

홍삼 농축액을 증류수로 10배 희석한 후 희석된 홍삼 농축액에 락토바실러스 사케이를 접종하였다. 접종량은 희석한 홍삼 농축액 전체 중량의 0.1 %(v/v)로 하였다. 접종 후, 30 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 본 발명의 균주에 의해 생물전환된 사포닌을 분석하였다. 회수한 제1발효물을 부탄올을 이용하여 층 분리를 하였고, 부탄올 층을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 Waters LC system(Waters, 미국)를 사용하여 실시하였고, 컬럼은 SUPELCO C18(25 ㎝×4.6 ㎜, 5 ㎛), 샘플 로딩양은 10 ㎕로 하였다. 이동상은 100% 물 및 100% 아세트니트릴로 110분 동안 농도구배를 하여 수득하였다. 유속은 분당 1.2 ㎖로 하였으며, 203 ㎚에서 검출하였다. 실험결과는 도 1에 나타나있다.

실시예 3: 1차 열처리 단계

락토바실러스 사케이를 통한 발효가 완료되면, 더 이상의 진세노사이드 전환을 막기 위하여 121℃, 1.5 기압 하에서 15분 동안 고온 가압 처리하여 멸균하였다.

실시예 4: 유산균을 통한 2차 전환

제1발효물에 비피도박테리엄 비피덤을 접종하였다. 접종량은 제1발효물 전체 중량의 0.1%(v/v)로 하였다. 접종 후, 35 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 다음, 본 발명의 균주에 의해 생물전환된 사포닌을 분석하였다. 회수한 제2발효물을 부탄올을 이용하여 층 분리를 하였고, 부탄올 층을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은 Waters LC system(Waters, 미국)를 사용하여 실시하였고, 컬럼은 SUPELCO C18(25 ㎝×4.6 ㎜, 5 ㎛), 샘플 로딩양은 10 ㎕로 하였다. 이동상은 100% 물 및 100% 아세트니트릴로 110분 동안 농도구배를 하여 수득하였다. 유속은 분당 1.2 ㎖로 하였으며, 203 ㎚에서 검출하였다. 실험결과는 도 2에 나타나있다.

실시예 5: 2차 열처리 단계

비피도박테리엄 비피덤을 이용한 발효가 완료되면, 더 이상의 진세노사이드 전환을 막기 위하여 121℃, 1.5 기압 하에서 15분 동안 고온 가압 처리하여 멸균하였다.

성분명	발효전	1차 발효	2차 발효
Rb1	10.2 ㎎/g	0.9 ㎎/g	0.8 ㎎/g
Rd	1.2 ㎎/g	29.3 ㎎/g	22.1 ㎎/g
Rg3	0.3 ㎎/g	0.3 ㎎/g	22.1 ㎎/g

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 발효전과 비교하여, 1차 및 2차 발효를 거친 후에 Rg3 함량이 70배 이상 증가한 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 사포닌의 진세노사이드 Rg3로 전환 방법:
(a) 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계;
(b) 상기 1차 유산균을 배양하여 1차 배양물을 제조하는 단계;
(c) 상기 1차 배양물을 열처리 하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 2차 유산균을 접종하는 단계;
(e) 상기 2차 유산균을 배양하여 2차 배양물을 제조하는 단계; 및
(f) 상기 2차 배양물을 열처리 하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3-고함유 발효 인삼 또는 발효 홍삼의 제조방법:
(a) 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계;
(b) 상기 1차 유산균을 배양하여 1차 배양물을 제조하는 단계;
(c) 상기 1차 배양물을 열처리 하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 2차 유산균을 접종하는 단계;
(e) 상기 2차 유산균을 배양하여 2차 배양물을 제조하는 단계; 및
(f) 상기 2차 배양물을 열처리 하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3 고함유 방법:
(a) 1차 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계;
(b) 상기 1차 유산균을 배양하여 1차 배양물을 제조하는 단계;
(c) 상기 1차 배양물을 열처리 하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물에 2차 유산균을 접종하는 단계;
(e) 상기 2차 유산균을 배양하여 2차 배양물을 제조하는 단계; 및
(f) 상기 2차 배양물을 열처리 하는 단계.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 유산균 또는 2차 유산균은 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 프로리오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 페디오코커스(Pediococcus)으로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 1차 유산균 또는 2차 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리엄 브라베(Bifidobacterium brave), 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum), 류코노스톡 멘센테로이드스(Leuconostoc mensenteroides), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 엔테로코커스 파에시엄(Enterococcus faecium) 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 1차 유산균 또는 2차 유산균은 락토바실러스 사케이 및 비피도박테리엄 비피덤인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 단계 (f)의 열처리는 100-150℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 단계 (f)의 열처리는 5-25분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 단계 (f)의 열처리는 1.2-1.8 기압에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.