KR20150104892A - 반코마이신 저항성 엔테로코커스 특이적인 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물 및 시료 중 반코마이신 저항성 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법 - Google Patents

반코마이신 저항성 엔테로코커스 특이적인 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물 및 시료 중 반코마이신 저항성 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

반코마이신 저항성 엔테로코커스 특이적인 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물 및 시료 중 반코마이신 저항성 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법이 제공된다.

Description

반코마이신 저항성 엔테로코커스 특이적인 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물 및 시료 중 반코마이신 저항성 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법{Primer set specific for a vancomycin resistant Enterococcus, composition comprising the same and method for detecting a vancomycin resistant Enterococcus in a sample}
반코마이신 저항성 엔테로코커스 특이적인 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물 및 시료 중 반코마이신 저항성 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
장구균 (Enterococci)은 위장관 및 여성 생식기관 (genital tract)의 통상적 서식자로서 고려되는 그람-양성 구균이다. 장구균 종은 사람에서 특별히 병인성이 아니지만, 반코마이신 내성 장구균 (vancomycin resistant enterococci: VRE)은 원내감염의 주요한 병원균이다. 최근 반코마이신 내성 장구균에 의한 병원내 감염이 증가하고 있다. 현재 중환자실에서 분리되는 장구균 (Enterococcus faecalis)의 30 내지 45%에서 반코마이신에 내성을 보인다. VRE에 대한 적절한 감염관리가 필요한 상황이다.
VRE 선별 고형 배지에 접종하거나 선별 액체 배지에 증균 후 고형배지에 접종하는 통상의 검출방법은 결과 보고까지 4 내지 7일이 소요된다. 따라서, 반코마이신 내성 장구균을 저비용으로 단시간 내에 정확하게 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양상은 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 반코마이신 내성 유전자를 발현하거나 가지고 있는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제1 프라이머 세트: 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제2 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제3 프라이머 세트: 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;로 구성된 제4 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트;와
서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제5 프라이머 세트: 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제6 프라이머 세트; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제7 프라이머 세트: 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제8 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하데 사용하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 단일 또는 복수 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 복소 프라이머 세트를 포함하는 상기 프라이머 세트는 제1 내지 제4 프라이머 세트의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트 중 하나의 프라이머 세트;와 상기 프라이머 세트는 제5 내지 제8 프라이머 세트의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트 중 1 내지 4개의 프라이머 세트를 포함하는 것, 제1 내지 제4 프라이머 세트의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트 중 두 개의 프라이머 세트;와 상기 프라이머 세트는 제5 내지 제8 프라이머 세트의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트 중 1 내지 4개의 프라이머 세트를 포함하는 것, 제1 내지 제4 프라이머 세트의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트 중 3개의 프라이머 세트;와 상기 프라이머 세트는 제5 내지 제8 프라이머 세트의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트 중 1 내지 4개의 프라이머 세트를 포함하는 것, 또는 제1 내지 제4 프라이머 세트의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트;와 상기 프라이머 세트는 제5 내지 제8 프라이머 세트의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트 중 1 내지 4개의 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.
상기 프라이머는 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 12 내지 25, 12 내지 24, 12 내지 23, 12 내지 22, 12 내지 21, 12 내지 20, 12 내지 19, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 14 내지 25, 14 내지 24, 14 내지 23, 14 내지 22, 14 내지 21, 14 내지 20, 14 내지 19, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 14 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 17, 17 내지 25, 17 내지 23, 또는 17 내지 20nt의 길이를 갖는 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트, 제6 프라이머 세트, 제7 프라이머 세트 및 제8 프라이머 세트는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자를 각각 특이적으로 증폭하기 위한 것일 수 있다.
상기 프라이머는 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2, 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6이 포함될 수 있다.
상기 프라이머 세트는, 표적 유전자인 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자 중 하나 이상에 특이적인 폴리뉴클레오티드 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제1 프로브: 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제2 프로브; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제3 프로브: 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제4 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 유전자에 특이적인 프로브;와
서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제5 프로브: 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제6 프로브; 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제7 프로브: 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제8 프로브;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자에 특이적인 프로브;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 더 포함할 수 있다. 제1 프로브, 제2 프로브, 제3 프로브, 제4 프로브, 제5 프로브, 제6 프로브, 제7 프로브 및 제8 프로브는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자 (ddl2), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자를 각각 특이적으로 검출하기 위한 것일 수 있다.
엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh)는 gi29374661, 또는 gi307638684, 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh)는 gi484100370, gi389867183, 또는 gi388532432, 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자 (ddl2)는 gi62632242, gi62632240, 및 gi1244571, 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh)는 gi482850047, 또는 gi325573643의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자는 엔테로코커스 속 유래의 것일 수 있다.
상기 프로브는 검출가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2, 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3, 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6이 포함될 수 있다. 상기 프로브는 실시간-PCR에 사용될 수 있는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 실시간-PCR에 사용될 수 있는 검출가능한 표지는 FRET 쌍일 수 있다. 상기 프로브는 TaqManTM 프로브일 수 있다.
상기 프로브는 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 12 내지 25, 12 내지 24, 12 내지 23, 12 내지 22, 12 내지 21, 12 내지 20, 12 내지 19, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 14 내지 25, 14 내지 24, 14 내지 23, 14 내지 22, 14 내지 21, 14 내지 20, 14 내지 19, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 14 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 17, 17 내지 25, 17 내지 23, 또는 17 내지 20nt의 길이를 갖는 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트를 다중 PCR에 사용함으로써, 시료 중의 반코마이신 내성을 갖는 미생물과 엔테로코커스 종을 동시에 확인하고 검출할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트를 복수의 단일 PCR (single)에 동시에 사용함으로써, 시료 중의 반코마이신 내성을 갖는 미생물과 엔테로코커스 종을 동시에 확인하고 검출할 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 검출은 상기 프라이머 세트를 사용하여 시료 중의 표적 핵산을 증폭하고, 그 증폭 산물을 측정함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaciton: PCR), 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction: LCR), 및 가닥치환 증폭 (strand displacment amplification: SDA)와 같은 표적 핵산 서열에 프라이머를 혼성화시키고, 그 혼성화된 프라이머를 연장하는 과정을 반복함으로써 증폭되는 것일 수 있다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다. 상기 검출은 하나 이상의 엔테로코커스 종의 검출과 그의 반코마이신 저항성을 동시에 검출하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 바와 같은 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 세트를 포함하는, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 세트는 위에서 설명한 바와 같다. 상기 조성물은 액상 또는 고상 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 또한, 핵산 증폭 반응에 사용되는 시약 또는 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 물, 용매, 또는 버퍼, 염 (salt), 대조군 핵산, 효소 보조인자, dNTP, DNA 폴리머라제 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 조성물에 프로브가 포함되는 경우, 이들 프로브는 기판에 고정된 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 바와 같은 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 세트를 포함하는, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서, 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하기 위한 다중 중합효소연쇄반응 (PCR) 과정에 동시에 사용하기 위한 프라이머 세트는 위에서 설명한 바와 같다. 상기 키트는 또한, 핵산 증폭 반응에 사용되는 시약 또는 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 물, 용매, 염 (salt), 대조군 핵산, 또는 버퍼, 효소 보조인자, dNTP, DNA 폴리머라제, 지시 프로토콜 (manual protocol) 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 키트에 프로브가 포함되는 경우, 이들 프로브는 기판에 고정된 것일 수 있다. 상기 기판은 마이크로어레이일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제1 프라이머 세트: 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제2 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제3 프라이머 세트: 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;로 구성된 제4 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트를 제공하는 단계;
서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제5 프라이머 세트: 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제6 프라이머 세트; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제7 프라이머 세트: 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제8 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 제공하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트와/또는 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 반코마이신 내성 유전자를 발현하거나 갖고 있는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 포함하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시켜 표적 핵산에 상기 프라이머 세트를 혼성화시키는 단계로서, 상기 표적 핵산은 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자 중 하나 이상인 것인 단계;
상기 혼성화 산물 중의 프라이머를 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
증폭된 산물 중 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계;를 포함하는, 반코마이신 내성 유전자를 발현하는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기한 바와 같은 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트 및 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 제공하는 단계 및 를 포함한다. 상기 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트 및 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트에 대하여는, 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하데 사용하기 위한 프라이머 세트에서 설명한 바와 동일하다.
상기 방법은 또한, 상기 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트와/또는 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 반코마이신 내성 유전자를 발현하거나 갖고 있는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 포함하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시켜 표적 핵산에 상기 프라이머 세트를 혼성화시키는 단계로서, 상기 표적 핵산은 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자 중 하나 이상인 것인 단계를 포함한다.
상기 접촉은 상기 시료와 프라이머 세트를 액체 매질 중에서 인큐베이션함으로서 이루어질 수 있다. 상기 인큐베이션은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다. 상기 액체 매질은 물, 버퍼, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 액체 매질은 PCR 시약을 포함하는 PCR 시약 혼합물일 수 있다. 상기 인큐베이션은 혼성화가 일어나는 적절한 온도에서 수행될 수 있다. 혼성화 온도는 4℃ 내지 65℃, 예를 들면 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 또는 60℃ 내지 65℃일 수 있다. 상기 접촉은 PCR에서 어닐링에 해당하는 것일 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)과 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (bodily fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 직장 스왑 (swab) 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 의료기기와 같은 무생물의 표면으로부터 채취된 것일 수 있다. 상기 시료는 이미 개체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 방법은 생체 외 또는 인 비트로 방법일 수 있다.
상기 방법은 제1 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)가 존재한다는 것을 나타내고, 제2 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium)가 존재한다는 것을 나타내고, 제3 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum)이 존재한다는 것을 나타내고, 제4 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)가 존재한다는 것을 나타내고, 제5 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanA에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내고, 제6 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanB에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내고, 제7 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanC1에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내고, 제8 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanC2/3에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 시료 중에 존재하는 미생물의 종의 확인과 함께 반코마이신 내성 여부를 동시에 검출할 수 있다.
상기 방법은 상기 혼성화 산물 중의 프라이머를 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다.
상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaciton: PCR), 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction: LCR), 및 가닥치환 증폭 (strand displacment amplification: SDA)와 같은 표적 핵산 서열에 프라이머를 혼성화시키고, 그 혼성화된 프라이머를 연장하는 과정을 반복함으로써 증폭되는 것일 수 있다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다. 상기 검출은 하나 이상의 엔테로코커스 종의 검출과 그의 반코마이신 저항성을 동시에 검출하는 것일 수 있다. 상기 PCR은 또한, 실시간 PCR (real time PCR: RT-PCR), 또는 정량적 실시간 PCR일 수 있다.
상기 방법은 증폭된 산물 중 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계를 포함한다. 상기 확인은 증폭 산물을 분리하거나, 검출함으로써 확인할 수 있다. 상기 분리는 전기영동, 혼성화, 또는 그 조합에 의할 수 있다. 상기 검출은 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브를 표적 핵산과 결합시키기고 그로부터 신호를 검출하는 것일 수 있다. 증폭 산물 중 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계는, 증폭 산물을 증폭 산물에 특이적인 프로브와 혼성화시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 혼성화 산물을 검출함으로써, 표적 핵산을 존재를 확인할 수 있다.
상기 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제1 프로브: 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제2 프로브; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제3 프로브: 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제4 프로브;와 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제5 프로브: 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제6 프로브; 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제7 프로브: 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제8 프로브;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 프로브에 대하여는 설명한 바와 같다.
상기 방법은 시료로부터 핵산을 분리하는 단계, 또는 핵산을 분리하는 단계 전에 엔테로코커스 속 미생물을 강화 (enrichment)시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 시료로부터 핵산을 분리하는 단계는 접촉하는 단계 전에 수행될 수 있다. 상기 강화시키는 단계는 엔테로코커스 속 미생물을 선택적으로 증식시킬 수 있는 배지 중에서 수행될 수 있다. 핵산의 분리 및 강화는 알려진 방법에 의할 수 있다.
상기 방법은 또한, 개체로부터 시료를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 개체는 동물, 예를 들면, 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 돼지, 소, 말, 염소, 양, 또는 고양이일 수 있다. 상기 분리는 엔테로코커스 속 균의 감염이 의심되는 조직, 예를 들면 감염 조직 또는 상처로부터 채취하는 것일 수 있다. 상기 방법은 사람을 제외한 동물에 대하여 수행하는 것일 수 있다. 상기 방법은 분리된 시료에 대하여 수행되는 인 비트로 방법일 수 있다.
일 양상에 따른 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 세트에 따르면, 시료 중의 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 효율적으로 검출하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 조성물 또는 키트에 따르면, 시료 중의 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 효율적으로 검출하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 반코마이신 내성 유전자를 발현하는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법에 의하면, 반코마이신 내성 유전자를 발현하는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 효율적으로 검출할 수 있다.
도 1은 프라이머 세트 1 내지 4를 각각 사용한 단일 PCR의 증폭 산물을 전기 영동한 결과를 나타낸다.
도 2는 표 1의 프라이머 세트를 사용한 실시간 PCR에 의하여 증폭된 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanA의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 4는 VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanB의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 5는 VanC 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanC의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 6은 VanC 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanC2/C3의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 엔테로코커스 속 4개 종 및 4개 반코마이신 내성 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트의 설계
(1) 엔테로코커스 속 4개 종을 검출하기 위한 프라이머 세트의 설계 및 특성 확인
먼저, 엔테로코커스 속 4개 종 즉, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis: 이하 "Efs"라고도 함), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium: 이하 "Efm"이라고도 함), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum: 이하 "Eg"라고도 함), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus:: 이하 "Ec"라고도 함)를 각각 특이적으로 검출하기에 적합한 프라이머 세트를 선발하였다. 이러한 선발은 엔테로코커스 속 미생물의 게놈 서열을 비교 분석하여, 상기 4개 종에 특이적으로 존재하는 영역을 표적 서열로 선발하였다. 구체적으로, 엔테로코커스 갈리나룸 ddl2 유전자의 경우, gi62632242, gi62632240, 및 gi1244571을, 엔테로코커스 페칼리스 ldh의 경우, gi29374661, 및 gi307638684를, 엔테로코커스 페시움 ldh의 경우, gi484100370, gi389867183, 및 gi388532432, 엔테로코커스 카셀리플라부스 ldh의 경우, gi482850047, 및 gi325573643의 ldh 유전자 서열을 Clustalx2 프로그램을 이용하여 정렬하고, 각 종의 특이적인 영역을 확보하여 프라이머와 프로브를 설계하였다.
그 결과, 엔테로코커스 속 4개 종 즉, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) ldh 유전자, 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) ldh 유전자, 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) ddl2 유전자, 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) ldh 유전자를 표적 서열로 하는 프라이머 세트를 선별하였다. 프라이머 세트의 구체적 성질은 표 1과 같다.
프라이머 서열번호 크기 Tm (℃) 추정 PCR 산물
길이 (bp)
엔테로코커스 페칼리스 ldh 포워드 1 20 54.3 88
리버스 2 19 53.0
엔테로코커스 페시움 ldh 포워드 4 19 50.9 80
리버스 5 21 53.4
엔테로코커스 갈리나룸 dll2 포워드 7 23 55.5 66
리버스 8 18 51.4
엔테로코커스 카셀리플라부스 ldh 포워드 10 18 53.8 96
리버스 11 20 54.3
다음으로, 항생제 내성 균주 은행에서 입수한 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)(CCARM5022), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium)(CCARM5024), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum)(CCARM5023), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)(CCARM5027)를 PCR 반응당 일정한 수 (103, 102, 101, 100개)로 반응 웰에 첨가하고 표 1의 각 프라이머 세트를 첨가한 후 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다. PCR은 96-웰 중 8개의 각 프라이머를 8개 웰에서 동일한 조건에서 PCR을 동시에 진행하였다. PCR은 LC480 기기 (LightCycler, Roche)를 사용하고, 열순환 조건은 95℃에서 2초 및 60℃에서 10초를 45회 반복하였다. 2xPCR 용액은 다음과 같은 조성물을 갖는다:
10x z-taq buffer (R006A, TaKaRa) 20ul
25mM dNTP 16ul
z-Taq (R006A, TaKaRa) 2ul
포워드 프라이머/리버스 프라이머/프로브 믹스(최종 1uM: 1uM: 400nM) 10ul 물 52ul
총 반응액 부피 100ul
상기 4개 프라이머 세트를 각각 포함하는 반응 용액을 사용하여 단일 PCR을 통한 증폭 산물을 Bioanalyzer 2100 (Agilent)로 분석한 결과 단일 증폭 산물을 생성하는 것으로 확인되었다. 또한, 표 2와 같은 결과를 얻었다. 증폭 결과는 실시간으로 증폭 산물의 Tm을 측정함으로써, 증폭 산물이 생성되는 것인지, 또는 부산물 없이 생성되는지를 확인하였다. 이 결과는 Bioanalyzer 2100 (Agilent)로 분석한 결과와 일치함을 확인하였다.
시료
(세포수/반응)		 Ec Efm Efs Eg
103 83.07 77.44 77.59 76.44
102 83.11 77.42 77.59 76.38
10 82.88 77.54 77.58 76.37
1 - 73.61 77.54 76.32
표 2에서, Ec, Efm, Efs 및 Eg는 각각 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 및 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum)을 각각 나타내고, 증폭 산물의 Tm 값을 단위 ℃로 나타낸 것이다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 카셀리플라부스를 제외하고, 반응액 당 1개의 박테리아를 검출할 수 있었다. 또한, 얻어진 Tm은 단일 값으로서 존재하기 때문에 특이도 (specificity)가 높았다.
도 1은 증폭 산물을 전기 영동한 결과를 나타낸다. 도 1에서, 첫 번째 레인 M은 크기 마커이며, 엔테로코커스의 종에 따라 특이적으로 디자인된 타겟 증폭 산물의 단일 밴드를 나타낸다. 이는 수 카피의 유전자까지 검출이 가능함을 나타낸다.
도 2는 표 1의 프라이머 세트를 사용한 실시간 PCR에 의하여 증폭된 결과를 나타낸 도면이다. 실시간 PCR은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제1 프로브: 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제2 프로브; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제3 프로브: 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제4 프로브를 각각 포함하는 단일 PCR로 수행되었다. 실시간 검출은 Taqman® PCR assay를 이용하여 이루어졌다.
(2) 4개 반코마이신 저항성 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트의 설계 및 특성 확인
먼저, 4개 반코마이신 저항성 유전자 즉, VanA, VanB, VanC1, 및 VanC2/C3 를 각각 특이적으로 검출하기에 적합한 프라이머 세트를 선발하였다. 이러한 선발은 엔테로코커스 속 미생물의 상기 유전자 서열을 비교 분석하여, 4개 유전자에 특이적으로 존재하는 영역을 표적 서열로 선발하였다. 구체적으로, NCBI로부터 해당 유전자 서열 각각 5 내지 10개를 Clustalx2를 이용하여 정렬하여 (align) 특이적인 영역을 확인하고 고속 PCR에 적합한 인자를 조합하여 짧은 증폭 산물이 생성되도록 디자인하였다.
그 결과, 4개 반코마이신 저항성 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 선별하였다. 프라이머 세트의 구체적 성질은 표 3과 같다.
프라이머 서열번호 크기 Tm (℃) 추정 PCR
산물 크기(bp)
VanA 포워드 13 22 62.1 68
리버스 14 23 629.
VanB 포워드 16 18 56.3 77
리버스 17 22 58.4
VanC1 포워드 19 25 64.1 63
리버스 20 22 60.1
VanC2/C3 포워드 22 18 53.8 79
리버스 23 18 53.8
다음으로, 항생제 내성 균주 은행으로부터 얻은 반코마이신 저항성 엔테로코커스 (CCARM5022, CCARM5024, CCARM5023, CCARM5027)를 10x연속 (serial) 희석 방법에 의해 PCR 반응당 일정한 수 (103, 102, 10, 1개)로 반응 웰에 첨가하고 표 3의 프라이머 세트 중 가능한 두 개 세트 조합, 세 개 세트 조합 및 네 개 세트를 첨가한 후 다중 실시간-PCR (multiplex real time-PCR)을 수행하였다. PCR은 LC480 기기 (LightCycler, Roche)를 사용하고, 열순환 조건은 95℃에서 2초 및 60℃에서 10초를 45회 반복하였다. 이중 PCR의 경우, 2xPCR 용액은 다음과 같은 조성물을 갖는다:
10x z-taq buffer (R006A, TaKaRa) 20ul
25mM dNTP 16ul
z-Taq 효소 (R006A, TaKaRa) 4ul
제1 포워드 프라이머/리버스 프라이머/프로브 믹스
(최종 1uM:1uM:400nM)10ul
제2 포워드 프라이머/리버스 프라이머/프로브 믹스
(최종 1uM:1uM:400nM)12ul
물 38ul
총 반응액 부피 100ul
프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제5 프로브: 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제6 프로브; 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제7 프로브: 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로 구성된 제8 프로브를 각각 사용하였다. 프로브는 5' 및 3' 말단이 FAM 및 -NFQ-MGB로 각각 표지되었다.
도 3은 VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanA의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 4는 VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanB의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 5는 VanC 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanC의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 6은 VanC 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웰에 대하여 실시간-PCR 한 결과로서, VanC2/C3의 시간에 따른 양을 나타내는 PCR 곡선 (A) 및 전기영동 사진 (B)을 나타낸다.
도 3 내지 6에서 세로축은 FAM으로부터 나오는 형광을 관측한 반응단위 (response unit)이며, 가로축은 사이클 수이고, M은 크기 마커, 103, 102, 101, 및 100는 각각 반응액 당 특정 엔테로코커스 수를 나타낸다. 도 3 및 4의 VanA 및 VanB 유전자의 존재는, 반코마이신 저항성 엔테로코커스 CCARM 5024 (E.feacium) 및 CCARM 5022 (E.feacalis) 균주를 각각 사용하였고, 도 5 및 도 6의 VanC1, 및 VanC2/3의 존재는 반코마이신 저항성 엔테로코커스 CCARM 5023 (E.galinarum) 및 CCARM 5027 (E.casselilfavus) 균주를 각각 사용하였다. 도 3 내지 6에 나타낸 바와 같이, 반응액 당 2 내지 8개의 세포까지 검출할 수 있었다.
다음으로 4개 반코마이신 저항성 유전자를 갖는 엔테로코커스 속 종에 대하여, VanA, VanB, VanC1, 및 VanC2/3에 특이적인 상기한 프라이머 세트를 사용하여, PCR 증폭하여, 상기 방법에 따른 표적 핵산 증폭 및 검출의 민감도와 분석 민감도 (analytical specificity)를 측정하였다. PCR 조건은 상기한 바와 같다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 반코마이신 저항성 유전자 각각에 특이적인 프라이머를 포함한 다중 PCR에 의하여, 반응액 당 1개 엔테로코커스까지 검출할 수 있었다.
Van 유전자형 균주 번호 VanA(카피/반응액) VanB(카피/반응액) VanC1 VanC2/3
vanA CCARM 5024 100이상 ND ND ND
vanB CCARM 5022 ND 100이상 ND ND
vanC1 CCARM 5020 ND ND 100이상 ND
vanC2/3 CCARM 5027 ND ND ND 100이상
또한, 4개 반코마이신 저항성 유전자 VanA, VanB, VanC1, 및 VanC2/3에 특이적인 상기한 프라이머 세트를 사용하고, 반코마이신 저항성 엔테로코커스 33종을 주형으로 PCR 증폭하여, 포함성 (inclusivity) 특이도를 측정하였다. PCR 조건은 상기한 바와 같다. 각 균주의 gDNA는 ATCC와 NCTC, 및 CCARM 균주 은행에서 QC를 거친 gDNA로서 FDA 가이드에 따라 105-106 개에 해당하는 gDNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 표 5에 나타낸 33종을 검출할 수 있었다.
번호
개체		 VRE-strain No.
 참조(reference) 본 실시예에 따른 유전형 분석결과
유전형 VanA VanB VanC1 VanC2/C3 유전형
1 Efm, NJ-3 ATCC 51299 VanB1 x o x x VanB
2 Efm,VRE ATCC 70022 VanA o x x x VanA
3 Efs,Taxo 239 ATCC 51575 미지 x o x x VanB
4 Eg ATCC 49573 VanC1 x x o x VanC1
5 Ec ATCC 25788 VanC2/C3 x x x o VanC2/C3
6 Efs ATCC 29212 미지 x x x x VSE
7 Efm ATCC 19434 VanD x x x x VSE
8 Eg ATCC BAA-748 미지 x x o x VanC1
9 Ec ATCC 700327 미지 x x x o VanC2/C3
10 Efm,MMC4 ATCC 51559 VanA o x x x VanA
11 Efs,V583 ATCC 700802 VanB x o x x VanB
12 Efs CCARM 0011 미지 x x x x VSE
13 Efm CCARM 5108 VSE x x x x VSE
14 Efs CCARM 5177 VSE x x x x VSE
15 Efm CCARM 5262 VSE x x x x VSE
16 Efm CCARM 5223 VSE x x x x VSE
17 Efs CCARM 5115 VSE x x x x VSE
18 Efs CCARM 5200 VSE x x x x VSE
19 Efs CCARM 5196 VSE x x x x VSE
20 Efs ATCC 29200 VanE x x x x VSE
21 Efs CCARM 5021 VanA o x x x VanA
22 Efm CCARM 5004 VanA o x x x VanA
23 Efm CCARM 5011 VanA o x x x VanA
24 Efs CCARM 5025 VanB x o x x VanB
25 Efs CCARM 5013 VanB x o x x VanB
26 Efs CCARM 5022 VanB x o x x VanB
27 Efs CCARM 5015 VanB x o x x VanB
28 Eg CCARM 5023 VanC x x o x VanC1
29 Eg CCARM 5026 VanC1 x x o x VanC1
30 Eg CCARM 5020 VanC1 x x o x VanC1
31 Ec CCARM 5017 VanC2 x x x o VanC2/C3
32 Ec CCARM 5027 VanC2 x x x o VanC2/C3
33 Efm CCARM 5024 VanA o x x x VanA
표 5에서, Ec, Efm, Efs 및 Eg는 각각 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 및 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum)을 각각 나타낸다.
또한, 4개 반코마이신 저항성 유전자 VanA, VanB, VanC1, 및 VanC2/3에 특이적인 상기한 프라이머 세트를 사용하고, 반코마이신 저항성 미생물 105종을 주형으로 PCR 증폭하여, 배제성 (exclusivity) 특이도를 측정하였다. PCR 조건은 상기한 바와 같다. PCR에 사용된 105 종의 균주는 균주 은행에서 gDNA를 분양받아 주형으로 사용하여는 것으로 하였으며, FDA 가이드에 따라 106-107개에 해당하는 gDNA를 주형으로 사용하여 PCR를 수행하여, 교차반응이 일어나는지 확인하였다. 그 결과, 표 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 속 균주가 아닌 105종에 대하여는 교차 반응을 보이지 않았다.
No . Bank No . Organism ( VRE ) v anA v anB v anC1 v anC2 /3
1 ATCC 19606 Acinetobacter baumannii ND ND ND ND
2 ATCC 7966 Aeromonas hydrophila ND ND ND ND
3 ATCC 8750 Alcaligenes faecalis subsp.Faecalis ND ND ND ND
4 ATCC 10702 Bacillus cereus ND ND ND ND
5 ATCC 15703 Bifidobacterium adolescentis ND ND ND ND
6 ATCC 15697 Bifidobacterium longum ND ND ND ND
7 BAA-1061 Campylobacter coli ND ND ND ND
8 ATCC 33292 Campylobacter jejuni sub sp .jejuni ND ND ND ND
9 ATCC 10231 Candida albicans ND ND ND ND
10 VR-879 Chlamydia trachomatis ND ND ND ND
11 ATCC 8090 Citrobacter freundii ND ND ND ND
12 BAA-895 Citrobacter koseri ND ND ND ND
13 ATCC 13124 Clostridium perfringens ND ND ND ND
14 ATCC 11437 Clostridium sporogenes ND ND ND ND
15 ATCC 25559 Eggerthella lenta ND ND ND ND
16 ATCC 15038 Enterobacter aerogenes ND ND ND ND
17 ATCC 13047 Enterobacter cloacae ND ND ND ND
18 ATCC 10541 Enterococcus hirae ND ND ND ND
19 ATCC 35401 Escherichia coli ND ND ND ND
20 ATCC 35469 Escherichia fergusonii ND ND ND ND
21 ATCC 49145 Gardnerella vaginalis ND ND ND ND
22 ATCC 43504 Helicobacter pylori ND ND ND ND
23 CRL-2221 Homo sapiens ND ND ND ND
24 ATCC 700324 Klebsiella oxytoca ND ND ND ND
25 ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae ND ND ND ND
26 ATCC 4357 Lactobacillus acidophilus ND ND ND ND
27 ATCC 23272 Lactobacillus reuteri ND ND ND ND
28 ATCC 19435 Lactococcus lactis ND ND ND ND
29 BAA-680 Listeria innocua ND ND ND ND
30 ATCC 19114 Listeria monocytogenes ND ND ND ND
31 ATCC 49031 Peptostreptococcus anaerobius ND ND ND ND
32 ATCC 51903 Plesiomonas shigelloides ND ND ND ND
33 ATCC 25845 Prevotella melaninogenica ND ND ND ND
34 ATCC 12453 Proteus mirabilis ND ND ND ND
35 ATCC 33672 Providencia stuartli ND ND ND ND
36 ATCC 15442 Pseudomonas aeruginosa ND ND ND ND
37 ATCC 700007 Pseudomonas putida ND ND ND ND
38 BAA-731 Salmonella choleraesuis (typhimurium) ND ND ND ND
39 BAA-1577 Salmonella enterica subsp. Arizonae ND ND ND ND
40 BAA-1584 Salmonella enterica subsp. Enterica ND ND ND ND
41 ATCC 27137 Serratia marcescens ND ND ND ND
42 BAA 1717 Staphylococcus aureus ND ND ND ND
43 ATCC 12228 Staphylococcus epidermidis ND ND ND ND
44 ATCC 13637 Stenotrophomonas maltophilia ND ND ND ND
45 BAA-1138 Streptococcus agalactiae ND ND ND ND
46 BAA-854 Streptococcus uberis ND ND ND ND
47 ATCC 10790 Veillonella parvula ND ND ND ND
48 ATCC 17802 Vibrio parahaemolyticus ND ND ND ND
49 NCTC 0302163v Cytomegalovirus ND ND ND ND
50 NCTC 0812214v Enterovirus ND ND ND ND
No. Bank No. Organism (VRE) vanA vanB vanC1 vanC2/3
51 NCTC 0812218v Enterovirus ND ND ND ND
52 ATCC 15309 Acinetobacter lwoffii ND ND ND ND
53 ATCC 35098 Anaerococcus tetradius ND ND ND ND
54 ATCC 43185 Bacteroides caccae ND ND ND ND
55 ATCC 43183 Bacteroides stercoris ND ND ND ND
56 ATCC 10565 Candida catenulata ND ND ND ND
57 ATCC 33431 Cedecea davisae ND ND ND ND
58 ATCC 25405 Citrobacter amalonaticus ND ND ND ND
59 ATCC 51115 Citrobacter sedlakii ND ND ND ND
60 ATCC 8260 Clostridium beijerinckii ND ND ND ND
61 ATCC 638 Clostridium bifermentans ND ND ND ND
62 ATCC 859 Clostridium butyricum ND ND ND ND
63 ATCC 11957 Clostridium chauvoei ND ND ND ND
64 ATCC 19400 Clostridium fallax ND ND ND ND
65 ATCC 19401 Clostridium histolyticum ND ND ND ND
66 ATCC 14501 Clostridium innocuum ND ND ND ND
67 ATCC 19402 Clostridium novyi ND ND ND ND
68 ATCC 49531 Clostridium orbiscindens ND ND ND ND
69 ATCC 25780 Clostridium paraputrificum ND ND ND ND
70 ATCC 25582 Clostridium ramosum ND ND ND ND
71 ATCC 35704 Clostridium scindens ND ND ND ND
72 ATCC 9714 Clostridium sordellii ND ND ND ND
73 ATCC 19403 Clostridium sphenoides ND ND ND ND
74 ATCC 29900 Clostridium spiroforme ND ND ND ND
75 ATCC 14940 Clostridium symbiosum ND ND ND ND
76 ATCC 19405 Clostridium tertium ND ND ND ND
77 ATCC 19406 Clostridium tetani ND ND ND ND
78 ATCC 33030 Corynebacterium genitalium ND ND ND ND
79 ATCC 15947 Edwardsiella tarda ND ND ND ND
80 ATCC 43198 Enterococcus cecorum ND ND ND ND
81 ATCC 51266 Enterococcus dispar ND ND ND ND
82 ATCC 49427 Enterococcus raffinosus ND ND ND ND
83 ATCC 33650 Escherichia hermannii ND ND ND ND
84 ATCC 8501 Fusobacterium varium ND ND ND ND
85 ATCC 27824 Gemella morbillorum ND ND ND ND
86 ATCC 13337 Hafnia alvei ND ND ND ND
87 ATCC 33999 Leminorella grimontii ND ND ND ND
88 ATCC 19120 Listeria grayi ND ND ND ND
89 ATCC 14963 Peptoniphilus asaccharolyticus ND ND ND ND
90 ATCC 25260 Porphyromonas asaccharolytica ND ND ND ND
91 ATCC 35198 Proteus penneri ND ND ND ND
92 ATCC 9886 Providencia alcalifaciens ND ND ND ND
93 ATCC 9250 Providencia rettgeri ND ND ND ND
94 ATCC 27592 Serratia liquefaciens ND ND ND ND
95 ATCC 9207 Shigella boydii ND ND ND ND
96 ATCC 29930 Shigella sonnei ND ND ND ND
97 ATCC 43078 Streptococcus dysgalactiae ND ND ND ND
98 ATCC 27335 Streptococcus intermedius ND ND ND ND
99 ATCC 43970 Yersinia bercovieri ND ND ND ND
No. Bank No. Organism (VRE) VanA VanB VanC1 VanC2/3
100 ATCC 49176 Abiotrophia defectiva ND ND ND ND
101 ATCC 27757 Clostridium nexile ND ND ND ND
102 ATCC 25986 Collinsella aerofaciens ND ND ND ND
103 ATCC 43380 Yersinia rohdei ND ND ND ND
104 ATCC 49490 Trabulsiella guamensis ND ND ND ND
105 ATCC BAA-1803 Clostridium difficile ND ND ND ND
실시예 2: VRE 에 감염된 환자 시료에 대한 검증
실시예 1에 설명된 엔테로코커스 종 특이적 유전자에 특이적인 제1 내지 제4 프라이머 세트와 4개 반코마이신 저항성 유전자에 특이적인 제5 내지 8 프라이머 세트 및 상기 엔테로코커스 종 특이적 유전자 및 반코마이신 저항성 유전자에 특이적인 제1 내지 제8 프로브를 사용하여, 환자 시료에 대하여 VRE 감염 여부를 검증하였다.
검증을 위한 PCR은 웰에 제1 내지 제4 프라이머 세트 각각, 또는 제5 내지 제8 프라이머 세포 중 2개 프라이머 세트 씩 즉, VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트; 및 VanC1 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트와 제1 내지 제8 프로브를 포함하고, 환자 시료 1ul를 주형으로 하여, 총 반응액 20ul로 하여 PCR을 수행하였다.
구체적인 PCR 조건은, 환자 시료를 물로 10배씩 연속 (serial) 희석한 희석액 1ul를 반응 웰에 첨가하고 제1 내지 제4 프라이머 세트 각각, 또는 VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트; 또는 VanC1 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트 및 제1 내지 제8 프로브를 첨가한 후 8 개의 웰에서 동시에 동일 조건에서 수행되는 단일 실시간-PCR (real time-PCR)을 수행하였다. PCR은 LC480 기기 (LightCycler, Roche)를 사용하고, 열순환 조건은 95℃에서 2초 및 60℃에서 10초를 45회 반복하였다.
2xPCR 용액 (master mix)은 다음과 같은 조성물을 갖는다:
10x z-taq buffer (R006A, TaKaRa) 20ul
25mM dNTP 16ul
z-Taq 효소 (R006A, TaKaRa) 4ul
제1 포워드 프라이머/리버스 프라이머/프로브 믹스
(최종 1uM:1uM:400nM) 10ul
제2 포워드 프라이머/리버스 프라이머/프로브 믹스
(최종 1uM:1uM:400nM) 12ul
물 38ul
총 반응액 부피 100ul
VRE에 감염된 것으로 확인된 53명으로부터 53개의 시료를 채취하였다. 이중 29개는 직장 면 스왑 (rectal cotton swab)이고, 24개는 액체 배양 용액이었다. 액체 배양 용액은 환자로부터 분리된 직장 면 스왑을 얻고, 혈액 배양 배지(blood culture medium) BHI (BD Difco)에 첨가하고, 37℃에서 교반 인큐베이터(shaking incubator)에서 3일 이내에서 배양한 것이다. 대조군으로서, 동일한 시료에 대하여 VITEK® 2 system 및 PCR kit (Roche)를 사용하여 표적핵산을 증폭 및 검출하였다.
그 결과, 참조시료 (reference sample)인 52개 임상 환자 시료 (clinical patient sample)에 대하여, 상기한 바와 같은 4개 균주에 특이적인 제1 내지 제4 프라이머 세트 각각, 또는 4개 저항성 유전자에 특이적인 제5 내지 제8 프라이머 세트 중 VanA 특이적 프라이머 세트와 VanB 특이적 프라이머 세트; 또는 VanC1 특이적 프라이머 세트와 VanC2/C3 특이적 프라이머 세트 및 제1 내지 제8 프로브를 포함하는 웰의 단일 PCR을 동시에 동일 조건에서 수행한 결과, 일치율 (concordance ratio)은 98.1%이고, 민감도 (sensitivity) 100% (95% 신뢰구간 (confidence interval) (87.1-100), 특이도 (specificity)는 96.1% (95% 신뢰구간(81.1-99.3)이었다.
상기와 같이 엔테로코커스 종의 속과 항생제 내성을 동시에 검출할 수 있었다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Primer set specific for a vancomycin resistant Enterococcus, composition comprising the same and method for detecting a vancomycin resistant Enterococcus in a sample <130> PN102639 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: Enterococcus feacalis ldh forward <400> 1 gctgttaaga caactaagtc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: Enterococcus feacalis ldh reverse <400> 2 ctcacgcatt agcatttac 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: Enterococcus feacalis ldh probe <400> 3 tcgtcataag tagcagcat 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: Enterococcus feacium ldh forward <400> 4 ttggcattta cttcaccta 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: Enterococcus feacium ldh reverse <400> 5 gctgtaataa caactaagtc a 21 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus feacium ldh probe <400> 6 ctacttacgc agacgca 17 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus gallinarum ddl2 forward primer <400> 7 acaggctttc tttgatattt atg 23 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus gallinarum ddl2 reverse primer <400> 8 gccaataaac tgcctttg 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus gallinarum ddl2 probe <400> 9 ttcgctactc tggttctca 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nterococcus casseliflavus ldh forward primer <400> 10 cctacaccat catcgaga 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nterococcus casseliflavus ldh reverse primer <400> 11 cagcattttc atcgtctaag 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nterococcus casseliflavus ldh probe <400> 12 atccgtgcta aggctac 17 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA forward primer <400> 13 ggctcatcct tcggtgtgaa aa 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA reverse primer <400> 14 cttgccgatt caattgcgta gtc 23 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA probe <400> 15 tcgtccgcgc tattg 15 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB forward primer <400> 16 acgcttacct accctgtc 18 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB reverse primer <400> 17 cgtactgttt actttggtta cg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB probe <400> 18 cggcacggtc aggttcgtcc tt 22 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanC1 forward primer <400> 19 tgcttacggt tctactgtgt tgatc 25 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanC1 reverse primer <400> 20 atgccgcagc caatttcaat ac 22 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanC1 probe <400> 21 ccgctatcgc cttttg 16 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanC2/3 forward primer <400> 22 cgcagtgctc ctacaaaa 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanC2/3 reverse primer <400> 23 accgacagtc aaagagtc 18 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanC2/3 probe <400> 24 taccgcaacc gatctcaaca ccg 23

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제1 프라이머 세트: 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제2 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제3 프라이머 세트: 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;로 구성된 제4 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트를 제공하는 단계;
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제5 프라이머 세트: 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제6 프라이머 세트; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제7 프라이머 세트: 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제8 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 제공하는 단계;
    상기 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트와/또는 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트를 반코마이신 내성 유전자를 발현하거나 갖고 있는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 포함하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시켜 표적 핵산에 상기 프라이머 세트를 혼성화시키는 단계로서, 상기 표적 핵산은 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자 중 하나 이상인 것인 단계;
    상기 혼성화 산물 중의 프라이머를 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 산물 중 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계;를 포함하는, 반코마이신 내성 유전자를 발현하는 하나 이상의 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 각 프라이머 세트는 각각 다른 표지에 의하여 표지된 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 제1 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)가 존재한다는 것을 나타내고,
    제2 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium)이 존재한다는 것을 나타내고,
    제3 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum)이 존재한다는 것을 나타내고,
    제4 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)가 존재한다는 것을 나타내고,
    제5 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanA에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내고,
    제6 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanB에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내고,
    제7 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanC1에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내고,
    제8 프라이머 세트의 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 VanC2/3에 내성인 미생물이 존재한다는 것을 나타내는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트, 제6 프라이머 세트, 제7 프라이머 세트 및 제8 프라이머 세트는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자를 각각 증폭하기 위한 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 증폭 산물 중 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계는, 증폭 산물을 증폭 산물에 특이적인 프로브와 혼성화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 프로브는
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제1 프로브:
    서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제2 프로브;
    서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제3 프로브:
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제4 프로브;
    서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제5 프로브:
    서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제6 프로브;
    서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제7 프로브: 및
    서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제8 프로브;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 더 포함하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 프로브는 검출가능한 표지로 표지된 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 시료로부터 핵산을 분리하는 단계, 또는 핵산을 분리하는 단계 전에 엔테로코커스 속 미생물을 강화 (enrichment)시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제1 프라이머 세트: 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제2 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제3 프라이머 세트: 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;로 구성된 제4 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 엔테로코커스 종 특이적 프라이머 세트;와
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제5 프라이머 세트: 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제6 프라이머 세트; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제7 프라이머 세트: 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 제8 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반코마이신 저항성 유전자 특이적 프라이머 세트;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하는데 사용하기 위한 프라이머 세트.
  12. 청구항 11의 프라이머 세트를 포함하는, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus)로 구성된 군으로부터 선택된 반코마이신 저항성 엔테로코커스 종을 검출하기 위한 키트.
  13. 청구항 12에 있어서, 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트, 제6 프라이머 세트, 제7 프라이머 세트 및 제8 프라이머 세트는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자2 (ddl2), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자를 각각 증폭하기 위한 것인 키트.
  14. 청구항 12에 있어서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제1 프로브:
    서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제2 프로브;
    서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제3 프로브: 및
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제4 프로브;와
    서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제5 프로브:
    서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제6 프로브;
    서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제7 프로브: 및
    서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 제8 프로브;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 더 포함하는 키트.
  15. 청구항 14에 있어서, 제1 프로브, 제2 프로브, 제3 프로브, 제4 프로브, 제5 프로브, 제6 프로브, 제7 프로브 및 제8 프로브는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), 엔테로코커스 갈리나룸 (Enterococcus galinarum) D-알라닌: D-알라닌 리가제 유전자 (ddl2), 및 엔테로코커스 카셀리플라부스 (Enterococcus casseliflavus) 락테이트 데히드로게나제 유전자 (ldh), VanA, VanB, VanC1 및 VanC2/3 유전자를 각각 검출하기 위한 것인 키트.
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