KR20150093896A

KR20150093896A - 난용성 물질을 함유하는 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150093896A
Application number: KR1020140014191A
Authority: KR
Inventors: 천종우; 손상재; 정진희; 김정수
Original assignee: (주)에이씨티
Priority date: 2014-02-07
Filing date: 2014-02-07
Publication date: 2015-08-19
Also published as: KR101601954B1

Abstract

본 발명은 생리활성 기능을 가지고 있으나 물, 오일 등과 같은 소재에 쉽게 용해되지 않고 열, 빛, 산소 등과 같은 외부 스트레스에 의하여 쉽게 파괴되어서 화장품에 적용하기에 적합하지 않은 난용성의 활성물질을 나노입자 크기의 고 함량으로 캡슐화함으로써, 화장품 제조에 용이하게 적용하면서 유효성분의 역가가 손실되는 것을 방지할 수 있는 나노입자와 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 나노입자는 저온의 용매에 대한 용해도가 낮은 난용성 활성물질을 고 함량으로 함유하면서 경피 흡수가 용이한 나노 크기로 형성되므로, 상온에서 활성성분이 피부로 흡수되는 경피흡수율을 향상시킬 수 있어서 화장료의 생리활성 효과가 우수하며, 또한 열, 빛, 산소 등과 같은 외부인자에 의하여 쉽게 산화되고 파괴되는 활성성분이 나노입자를 감싸는 코팅막에 의하여 외부인자로부터 보호되어 성상 및 함량 안정성이 향상되고, 건조에 의해 용매가 제거되므로 용매에 용해되어 있는 용존산소에 의해 활성성분이 산화되는 것을 방지할 수 있으므로 역가가 손실되는 것이 방지되며, 수상에 쉽게 분산되고 분산 안정성이 우수하여 장기간 보관하여도 본래의 활성이 유지된다.

Description

난용성 물질을 함유하는 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 포함하는 화장료 조성물{Nanoparticle Containing Poor Soluble Materials, Method for Preparation the Nanoparticle, and Cosmetic Composition Containing the Nanoparticle}

본 발명은 생리활성 기능을 가지고 있으나 물, 오일 등과 같은 소재에 쉽게 용해되지 않고 열, 빛, 산소 등과 같은 외부 스트레스에 의하여 쉽게 파괴되어서 화장품에 적용하기에 적합하지 않은 난용성의 활성물질을 나노입자 크기의 고 함량으로 캡슐화함으로써, 화장품 제조에 용이하게 적용하면서 유효성분의 역가가 손실되는 것을 방지할 수 있는 나노입자와 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품이란 피부를 건강하고 아름답게 하기 위하여 피부에 직접 사용하는 것으로서, 피부미백이나 주름개선 등의 활성을 나타내는 활성물질, 용매, 계면활성제와 같은 첨가제 등이 혼합되어 제조된다.

화장품 산업에서 주름개선 성분으로 알려진 올레아놀릭산(oleanolic acid)과 우르솔릭산(ursolic acid)은 트리터페노이드(triterpenoid) 계열의 물질로서 자연계에서 많이 발견된다.

이러한 물질들은 피부 외용제로써 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 및 MMP-2(Matrix metalloproteinas)의 저해 효과, 콜라겐 생합성 및 항염 효과가 다수 보고되고 있으나, 물 또는 화장품에 사용되는 오일류에 대한 용해도가 너무 낮아서 목표로 하는 세포까지 이동하거나 세포 내의 수용체까지 도달하기 어렵다.

올레아놀릭산의 경우 25 ℃의 물에는 거의 녹지 않고 65 배의 에테르, 106 배의 95 % 에탄올, 118 배의 클로로포름, 180 배의 아세톤, 235 배의 메탄올에 용해되고, 우르솔릭산의 경우 15 ℃에서 88 배의 메탄올, 178 배의 에탄올, 140 배의 에테르, 388 배의 클로로포름에 용해된다.

이와 같이 물을 포함하는 여러 가지 용매에 대한 낮은 용해도는 유효성분의 낮은 피부흡수율에 직접적으로 관련이 있으며, 이는 생리활성 효과의 저해로 이어진다.

또한, 종래에는 난용성 물질을 안정화하기 위하여 난용성 물질을 용매에 포화상태까지 용해한 후 계면활성제를 이용하여 수중유형(oil in water, o/w형)의 에멀젼 또는 나노입자를 제조하였다.

이렇게 얻어진 에멀젼 또는 나노입자는 물 또는 폴리올 등에 분산된 형태로 존재하고 유통기간 중의 변질을 방지하기 위하여 방부제를 넣고 제균 필터를 거쳐 제조되나, 이러한 에멀젼 또는 나노입자가 안정성을 확보하기 위하여는 난용성 물질을 고 함량으로 함유하기가 어려웠다.

한국공개특허공보 제10-2012-0054906호에서는 올레아놀릭산의 안정화 나노리포좀을 제조하기 위하여 폴리올, 올레아놀릭산, 계면활성제, 인지질 및 물을 포함하는 혼합물을 제조하였으며, 나노리포좀의 외상을 이루는 폴리올은 프로필렌클라이콜, 디프로필렌클라이콜, 1,3-부틸렌글라이콜, 그리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글라이콜, 펜틸렌글라이콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성되고 전체 리포좀의 15~30 중량%가 함유된다.

또한, 올레아놀릭산을 용해하기 위한 오일성분으로는 헥사테칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C₁₀ _-40 지방알콜 및 이의 혼합물이 이용된다.

그런데 상기 발명은 올레아놀릭산을 용해하기 위하여 고온으로 가온된 오일에 올레아놀릭산을 용해한 후 레시틴(lecithin) 등을 이용하여 유중수 형태의 미셀(micelle)을 제조하므로, 난용성 물질인 올레아놀릭산의 용해도를 고함량 수준으로 함유하기에는 어려움이 있다.

또한, 한국등록특허공보 제10-0715311호에서는 난용성 물질인 우르솔릭산을 포함하는 캡슐을 제조하기 위하여 우르솔릭산 구조의 수산기에 산 또는 염기성을 처리하여 염 형태로 전환함으로써 이중 층 내부의 수상 부분에 우르솔릭산이 위치하는 경피흡수 촉진용 캡슐을 제조하였다.

그러나 상기 발명은 유효성분인 우르솔릭산의 구조를 그대로 유지하지 않고 산 또는 염기로 처리한 염의 형태로 전환시킴으로 인하여 유효성분 본연의 활성을 그대로 유지하기 어렵고, 피부의 pH를 장기적으로 변화시켜 피부 트러블 등의 문제를 야기할 수 있다.

또한, 미백 개선 물질로 알려진 하이드록시시나믹산(hydroxycinnamic acid)은 p-쿠마릭산(para-coumaric acid)으로 더욱 알려져 있으며, o-쿠마릭산(ortho-coumaric acid), m-쿠마릭산(metha-coumaric acid) 및 p-쿠마릭산과 같은 3가지 형태의 이성질체가 존재하는데, 이들 중 p-쿠마릭산은 자연계에서 가장 많이 발견되고 피부 외용제로서 멜라닌 합성 저해 효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있다.

p-쿠마릭산의 경우 차가운 물과 에탄올에는 매우 적은 양이 용해되고 뜨거운 물과 에탄올에는 많은 양이 용해가 되는데, 제조과정에서는 뜨거운 물 또는 에탄올에 용해되어도 화장품을 제조한 후에는 온도가 상온 상태로 낮아져 용해되었던 쿠마릭산이 침상형태로 다시 재결정화되어 소비자가 사용하는 과정에 문제를 일으킬 수 있다.

한국공개특허공보 제10-2013-0087650호에서는 소수성 액상 고분자 매질에 자외선 차단 활성화제를 함침한 피부약리학적 조성물이 개시되어 있으며, 상기 자외선 차단 활성화제 중에는 쿠마릭산이 포함되고 소수성 액상 고분자 매질로서 폴리글리세린, 폴리프로필렌글리콜, 하이드로게네이티드 폴리이소부텐, 하이드로게네이티드 폴리도데켄 등이 사용되었으며, 쿠마릭산을 에탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 디프로필렌글리콜 등에 용해시키고 계면활성제를 이용하여 수상에서 안정한 미셀 형태의 캡슐을 제조하였다.

그러나 이 또한 사용된 알코올 또는 폴리올에 대한 쿠마릭산의 용해도에 한계가 있어서 고 함량의 포집이 어려운 실정이다.

본 발명이 해결하려는 과제는 용매에 대한 용해도가 낮은 난용성 활성물질을 고 함량으로 화장료에 함유되도록 하며, 화장료에서 생리활성 효과를 나타내는 활성물질을 공기 중의 열, 빛, 산소 등의 외부 스트레스와 용매에 용해되어 있는 용존산소로부터 차단하여 화장료에서 본연의 생리학적 활성을 나타낼 수 있도록 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 양친성 블록 공중합체 30~70 중량%와 레시틴 5~40 중량%로 구성되는 벽제 내부에 난용성 물질 5~50 중량%가 함유된 나노입자로 형성되며, 상기 양친성 블록 공중합체와 레시틴의 소수성 블록은 나노입자의 중심부로 배향하고 친수성 블록은 나노입자의 외부로 배향하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 유기용매를 40~60 ℃로 가온한 후 난용성 물질과 양친성 블록 공중합체를 용해시켜 유상을 제조하는 단계; 0~10 ℃의 물에 레시틴을 용해하여 수상을 제조하는 단계; 상기 유상과 수상을 혼합하고 균질화하여 에멀젼을 제조하는 단계; 및 상기 에멀젼을 건조하는 단계;를 포함하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 난용성 물질, 양친성 블록 공중합체 및 레시틴의 혼합비율은 난용성 물질 5~50 중량%, 양친성 블록 공중합체 30~70 중량% 및 레시틴 5~40 중량%의 비율로 혼합되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 균질화는 호모믹서를 이용하여 4000~6000 rpm으로 5~15 분간 균질화한 다음, 고압균질기를 이용하여 800~1500 bar의 압력에서 1~3 회 더 균질화하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 건조는 동결건조방식으로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 상기 난용성 물질은 올레아놀릭산, 우르솔릭산, 세라마이드, 타자로틴, 아다팔렌, 쿠마릭산 및 퀘세틴으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸포름아마이드 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한, 상기 양친성 블록 공중합체는 폴록사머, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴록사렌, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산), 폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤, 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리(아크릴산)-폴리스티렌, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리스티렌 및 폴리(아크릴산)-폴리(부타디엔)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한, 상기 레시틴은 하이드로제네이티드 레시틴인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기의 나노입자를 함유하는 화장료 조성물을 제공하며, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 나노입자는 저온의 용매에 대한 용해도가 낮은 난용성 활성물질을 고 함량으로 함유하면서 경피 흡수가 용이한 나노 크기로 형성되므로, 상온에서 활성성분이 피부로 흡수되는 경피흡수율을 향상시킬 수 있어서 화장료의 생리활성 효과가 우수하다.

또한, 열, 빛, 산소 등과 같은 외부인자에 의하여 쉽게 산화되고 파괴되는 활성성분이 나노입자를 감싸는 코팅막에 의하여 외부인자로부터 보호되어 성상 및 함량 안정성이 향상되고, 건조에 의해 용매가 제거되므로 용매에 용해되어 있는 용존산소에 의해 활성성분이 산화되는 것을 방지할 수 있으므로 역가가 손실되는 것이 방지되며, 수상에 쉽게 분산되고 분산 안정성이 우수하여 장기간 보관하여도 본래의 활성이 유지된다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부미백, 주름개선, 피부보습, 항염 및 여드름 개선에 우수한 효과를 제공한다.

도 1은 본 발명의 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 형상을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 나노입자의 경시적인 경피흡수율을 측정한 그래프이다.

본 발명에서는 피부 외용제로 사용시 피부미백, 주름개선, 피부보습, 항산화, 피부결 개선, 항염 및 여드름 개선 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으나 화장료에 사용되는 물과 오일류에 대한 용해도가 너무 낮아서 화장품에서 생리활성 효과가 낮게 관찰되는 난용성 물질을 나노입자화 하여 화장료 조성물을 제조하였다.

본 발명에 따른 나노입자는 화장료에서 활성을 나타내는 난용성 물질을 제1벽제인 양친성 블록 공중합체와 함께 40~60 ℃로 가온된 유기용매에 용해시켜 유상(oil phase)을 제조하고 제2벽제 역할을 하는 레시틴을 0~10 ℃의 냉각된 물에 용해하여 수상(water phase)을 제조한 다음, 상기 유상과 수상을 혼합하고 균질화하여 미세입자의 나노캡슐을 제조한 후 건조하여 나노캡슐의 내부와 외부에 존재하는 유기용매와 물을 제거함으로써 내부에 난용성 물질을 함유하는 나노입자를 형성하는 과정으로 제조된다.

이때, 상기에서 혼합되는 물질들의 혼합비율은 난용성 물질 5~50 중량%, 양친성 블록 공중합체 30~70 중량% 및 레시틴 5~40 중량%로 혼합되는 것이, 제조되는 나노입자의 난용성 물질 함유량을 최대로 하면서 양친성 블록 공중합체와 레시틴이 코팅막을 충분히 형성할 수 있도록 하는 면에서 바람직하고, 나머지의 유기용매와 물은 나노입자의 제조과정 중에 제거되므로 난용성 물질, 양친성 블록 공중합체 및 레시틴이 충분히 용해되는 범위에서 최소량을 사용한다.

상기 조성물에서 난용성 물질은 올레아놀릭산, 우르솔릭산, 세라마이드(ceramide), 타자로틴(tazarotene), 아다팔렌(adapalene), 쿠마릭산 및 퀘세틴(quercetin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단독 또는 2 종 이상의 혼합물일 수 있다.

또한, 상기 조성물에서 난용성 물질을 용해하기 위한 유기용매는 물과 혼합이 가능한 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 아세톤(acetone), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide) 및 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)로 이루어진 군에서 단독 또는 2 종 이상의 혼합물을 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 조성물에서 제1벽제로 이용되는 양친성 블록 공중합체는 공중합체에 친수성 블록과 소수성 블록을 모두 가지고 있어서 수상 또는 유상에서 미셀을 형성하는데, 이러한 양친성 블록 공중합체로서 본 발명에서는 폴록사머(poloxamer), 폴리(락티드-코-글리콜리드){poly(lactide-co-glycolide)}, 폴록사렌(poloxalene), 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산){(poly(oxyethylene)-poly(lactic acid))}, 폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(polyethylene glycol-polycaprolactone), 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(methoxy polyethylene glycol-polycaprolactone), 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드){(poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)}, 폴리(아크릴산)-폴리스티렌{(poly(acrylic acid)-polystyrene}, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리스티렌{(poly(ethylene oxide)-polystyrene} 및 폴리(아크릴산)-폴리(부타디엔){poly(acrylic acid)-poly(butadiene)}으로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 2 종 이상의 혼합물인 것이 바람직하다.

또한, 상기 조성물에서 제2벽제로 이용되는 레시틴은 난황, 콩기름, 간, 뇌 등에 다량 존재하는 인지질의 하나로서, 한쪽에는 친유성이 강한 지방산기를 가지고 있고 반대쪽에는 친수성이 강한 인산, 콜린 부분을 가지고 있어서, 물과 오일의 혼합물을 안정화시키는 유화제로 작용할 수 있으며, 하이드로제네이티드 레시틴(hydrogenated lecithin)이거나 일반 레시틴을 이용할 수 있다.

상기 유상과 수상의 균질화는 고압균질기(microfludizer)를 이용하여 균질화하는 것이 바람직하고, 호모믹서(homomixer)를 이용하여 4000~6000 rpm으로 5~15 분간 균질화한 다음 고압균질기를 이용하여 800~1500 bar의 압력에서 1~3 회 더 균질화하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 건조는 가열건조 또는 감압증류방식이 아닌 동결건조방식을 통하여 유기용매와 물을 제거하는 것이 열에 취약한 활성물질의 파괴를 방지하는 면에서 바람직하다.

화장료에서 생리활성 효과를 나타내는 활성물질은 공기 중의 열, 빛, 산소 등의 외부 스트레스에 의해 쉽게 파괴되어 본연의 생리학적 활성을 상실하므로 활성물질을 순수한 형태 그대로 화장료에 사용하는 것은 문제가 있으며, 따라서 활성물질을 외부 스트레스와 용매에 용해되어 있는 용존산소로부터 차단할 필요가 있다.

이를 위하여, 본 발명에서는 상기와 같이 난용성 물질이 양친성 블록 공중합체와 레시틴이 용해된 용매에 균질화된 상태에서 건조되므로, 유상의 유기용매와 수상의 물이 제거되면서 양친성 블록 공중합체와 레시틴이 난용성 물질 표면에 나노 크기로 코팅되며, 이때 양친성 블록 공중합체와 레시틴의 소수성 블록이 중심부로 배향하고 친수성 블록은 외부로 배향되어 난용성 물질을 감싸는 벽제 역할을 한다.

즉, 난용성 생리활성물질을 심물질로 하고 그 외각은 양친성 블록 공중합체와 레시틴으로 코팅막을 형성하면서 유기용매 또는 물이 제거된 나노입자를 형성하는데, 상기 코팅막은 난용성 물질을 열, 빛, 산소 등의 외부 스트레스로부터 보호하고 나노입자로부터 유기용매 또는 물이 제거되므로 용존산소로부터도 차단하여 산소에 의한 난용성 물질의 산화 메커니즘을 방지할 수 있으며, 또한 상기 나노입자는 외곽에 친수성 블록이 형성되어 수상에서의 분산성이 우수하고 40 ℃ 이상으로 가온된 물에 쉽게 용해된다.

상기와 같이 제조된 난용성 활성물질 함유 나노입자는 도 1에 도시된 바와 같이, 양친성 블록 공중합체(B) 30~70 중량%와 레시틴(C) 5~40 중량%로 구성되는 벽제 내부에 난용성 물질(A) 5~50 중량%가 함유된 형태로 형성되며, 양친성 블록 공중합체와 레시틴의 소수성 블록은 나노입자의 중심부로 배향하고 친수성 블록은 나노입자의 외부로 배향하는 구조를 가진다.

상기와 같이 제조되는 나노입자는 유효성분인 난용성 물질을 종래에 알려진 함량 이상으로 포집이 가능하고 부피를 줄이면서 제균 과정 등을 생략할 수 있어서 경제적인 측면에서도 우수한 효과를 얻을 수 있다.

상기의 방법에 의하여 제조된 난용성 물질을 함유하는 나노입자는 전체 화장료 조성물의 총중량에 대하여 0.1~20.0 중량％ 함유될 수 있고 피부미백, 주름개선, 피부보습, 항산화, 피부결 개선, 항염 및 여드름 개선 용도로 사용될 수 있으며, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제의 제형으로 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀더 상세하게 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

<실시예 1> 쿠마릭산이 함유된 나노입자의 제조

300 ㎖ 비이커에 에탄올 100 g을 넣고 50 ℃로 가온하면서 쿠마릭산 10 g과 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 60 g을 천천히 넣으면서 용해시켰다.

다른 1.5 ℓ 비이커에 물 1 ℓ를 넣고 레시틴 30 g을 용해시킨 다음 0 ℃로 냉각하였으며, 여기에 상기 에탄올 혼합물을 천천히 넣으면서 호모믹서(T.K. HOMOMIXER MARK II Model 2.5)를 이용하여 5000 rpm으로 10 분 동안 균질화하였다.

상기 혼합물을 고압호모게나이저(Microfludizer, Medel:M-110F)로 1200 bar에서 2 회 처리하고 -85 ℃의 냉동고에 2 일 동안 정치 후 동결건조기(일신바이오베이스 Model FD8508)를 이용하여 동결건조하여 쿠마릭산이 함유된 나노입자를 제조하였다.

<실시예 2> 올레아놀릭산이 함유된 나노입자의 제조

실시예 1에서, 에탄올 대신에 테트라하이드로퓨란을 용매로 사용하고 난용성 유효성분으로서 쿠마릭산 대신에 올레아놀릭산을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 올레아놀릭산이 함유된 나노입자를 제조하였다.

<실시예 3> 세라마이드가 함유된 나노입자의 제조

300 ㎖ 비이커에 에탄올 100 g을 넣고 50 ℃로 가온하면서 세라마이드 25g과 폴록사머 20 g을 천천히 넣으면서 용해시켰다.

다른 1.5 ℓ 비이커에 물 1 ℓ를 넣고 레시틴 5 g을 용해시킨 다음 0 ℃로 냉각하였으며, 여기에 상기 에탄올 혼합물을 천천히 넣으면서 호모믹서를 이용하여 5000 rpm으로 10 분 동안 균질화하였다.

상기 혼합물을 고압호모게나이저로 1000 bar에서 3 회 처리하고 -85 ℃의 냉동고에 2 일 동안 정치 후 동결건조기를 이용하여 동결건조하여 세라마이드가 함유된 나노입자를 제조하였다.

<실시예 4> 타자로틴이 함유된 나노입자의 제조

300 ㎖ 비이커에 메탄올 100 g을 넣고 50 ℃로 가온하면서 타자로틴 15 g과 폴록사머 25 g을 천천히 넣으면서 용해시켰다.

다른 1.5 ℓ 비이커에 물 1 ℓ를 넣고 레시틴 10 g을 용해시킨 다음 0 ℃로 냉각하였으며, 여기에 상기 메탄올 혼합물을 천천히 넣으면서 호모믹서를 이용하여 5000 rpm으로 10분 동안 균질화하였다.

상기 혼합물을 고압호모게나이저로 1000 bar에서 3 회 처리하고 -85 ℃의 냉동고에 2 일 동안 정치 후 동결건조기를 이용하여 동결건조하여 타자로틴이 함유된 나노입자를 제조하였다.

<실시예 5> 퀘세틴이 함유된 나노입자의 제조

300 ㎖ 비이커에 아세톤 100 g을 넣고 40 ℃로 가온하면서 퀘세틴 10 g과 폴록사머 30 g을 천천히 넣으면서 용해시켰다.

다른 1.5 ℓ 비이커에 물 1 ℓ를 넣고 레시틴 10 g을 용해시킨 다음 0 ℃로 냉각하였으며, 여기에 아세톤 혼합물을 천천히 넣으면서 호모믹서를 이용하여 5000 rpm으로 10 분 동안 균질화하였다.

<시험예 1> 난용성 물질이 함유된 나노입자의 외관 안정성 평가

상기 실시예 1 내지 5에서 제조된 나노입자의 안정성을 확인하기 위하여, 제조된 나노입자를 20 ㎖ 유리바이알에 넣고 5 ℃, 25 ℃, 45 ℃ 및 일광에 보관한 다음 1 주일 간격으로 변색, 변취 및 조습성(燥濕性)의 외관 성상 변화를 관찰하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

외관 안정성 평가결과

구분		제조 직후	1 주 후	2 주 후	3 주 후	4 주 후
실시예 1	5 ℃	○	○	○	○	○
	25 ℃	○	○	○	○	○
	45 ℃	○	○	○	○	◑
	일광	○	○	○	○	○
실시예 2	5 ℃	○	○	○	○	○
	25 ℃	○	○	○	○	○
	45 ℃	○	○	○	○	○
	일광	○	○	○	○	○
실시예 3	5 ℃	○	○	○	○	○
	25 ℃	○	○	○	○	○
	45 ℃	○	○	○	○	○
	일광	○	○	○	○	○
실시예 4	5 ℃	○	○	○	○	○
	25 ℃	○	○	○	○	○
	45 ℃	○	○	○	○	◑
	일광	○	○	○	○	○
실시예 5	5 ℃	○	○	○	○	○
	25 ℃	○	○	○	○	○
	45 ℃	○	○	○	○	○
	일광	○	○	○	○	◑
○:변화 없음, ◑:약한 변색, ▣:약한 변취, ★:완전 변색 및 변취 발생

상기 표 1과 같이 나노입자를 다양한 조건에서 보관한 후 외관의 경시변화를 관찰한 결과, 쿠마릭산과 타자로틴은 4 주 후에 45 ℃에서 약한 노란색으로 변색이 일어났고 퀘세틴은 4 주 후 일광 하에서 약간 어두운 빛으로 변색되었으나, 이러한 정도는 화장품 제형 내에서 극복이 가능한 수준이다.

그 외에는 변색, 변취 및 눅눅해지는 조습성을 보이지 않았다.

<시험예 2> 유효 성분의 함량 안정성 평가

상기 실시예의 나노입자에 함유된 유효 활성성분의 경시적인 안정성을 확인하기 위하여, 제조된 나노입자를 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 난용성 물질의 성분분석을 실시하였다.

분석시료는 상기 시험예 1에서의 시료를 사용하였으며, 각 시료에 대한 HPLC의 분석조건은 하기와 같다.

(1) 쿠마릭산의 분석 조건

1) Detector: UV-Vis Detector (310 ㎚)

2) Column: Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 ㎛)

3) Column oven: 30 ℃

4) Mobile phase: 1% Acetic acid/ACN (gradient)

5) Flow rate: 1.0 ㎖/min

6) Inject volume: 20 ㎕

(2) 올레아놀릭산

1) Detector: UV-Vis Detector (203 ㎚)

2) Column: Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 ㎛)

3) Column oven: 30 ℃

4) Mobile phase: 0.1 % Phosphoric acid/ACN = 10/90

5) Flow rate: 1.0 ㎖/min

6) Inject volume: 20 ㎕

(3) 세라마이드

1) Detector: ELS-Detector (Gain:5, 40psi, 60 ℃)

2) Column: SunFire Pre silica C18 4.6 X 150 ㎜, 5μm

3) Column oven: 30 ℃

4) Mobile phase: Chloroform / MeOH = 95/5

5) Flow rate: 1.0 ㎖/min

6) Inject volume: 20 ㎕

(4) 타자로틴

1) Detector: UV-Vis detector (233 ㎚)

2) Column: Mightysil RP-18 GP 250-4.6 ㎜ (5 ㎛)

3) Column oven: 30 ℃

4) Mobile phase: AN/ 0.1% Phosporic aicd = 9/1

5) Flow rate: 1.0 ㎖/min

6) Inject volume: 20 ㎕

(5) 퀘세틴

1) Detector: UV-Vis detector (363 ㎚)

2) Column: Mightysil RP-18 GP 250-4.6 ㎜ (5 ㎛)

3) Column oven: 30 ℃

4) Mobile phase: MeOH/ 2.5% Acetic aicd = 5/5

5) Flow rate: 1.0 ㎖/min

6) Inject volume: 20 ㎕

유효 성분의 함량 안정성 평가결과

유효 성분의 함량 안정성 실험 결과
구분		제조 직후	1 주 후	2 주 후	3 주 후	4 주 후
실시예 1	5 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
	25 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
	45 ℃	100.0	99.8±0.1	100.0	98.2±0.4	97.8±0.6
	일광	100.0	100.0	99.2±0.3	99.4±0.4	98.5±0.7
실시예 2	5 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
	25 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	99.2±0.3
	45 ℃	100.0	100.0	99.9±0.2	99.6±0.2	99.1±0.1
	일광	100.0	100.0	98.8±0.7	99.3±0.8	99.0±0.8
실시예 3	5 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
	25 ℃	100.0	99.3±0.6	100.0	100.0	99.4±0.4
	45 ℃	100.0	99.9±0.1	99.3±0.7	98.7±0.6	98.3±0.5
	일광	100.0	100.0	99.4±0.2	99.1±0.2	98.5±0.7
실시예 4	5 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
	25 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	98.4±0.6
	45 ℃	100.0	99.2±0.3	99.1±0.2	97.9±0.6	97.6±0.5
	일광	100.0	100.0	100.0	100.0	99.4±0.5
실시예 5	5 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0
	25 ℃	100.0	100.0	100.0	100.0	99.4±0.7
	45 ℃	100.0	100.0	99.4±0.8	98.7±0.1	97.9±0.1
	일광	100.0	100.0	100.0	100.0	98.6±0.7

상기 표 2과 같이 나노입자를 다양한 조건에 보관한 후 HPLC를 이용하여 난용성 유효성분의 함량을 측정한 결과, 4 주차까지 모두 97 % 이상의 안정성을 보였으며, 이를 통하여 유효 활성성분이 나노입자로 캡슐화되면서 공기, 빛, 열과 같은 외부 스트레스로부터 효과적으로 보호되어 화장품 제형 내에서도 안정성을 유지할 것으로 판단된다.

<시험예 3> 입도 분석기를 이용한 나노입자의 평균입도 분포 및 제타 전위 측정

나노입자는 시간에 따라 일정한 온도에서 분산 안정성이 저하되는 현상이 있는데, 이를 구분하면 크게 입자이동(particle migration)과 입자크기변화(particle size variation)로 구분된다.

입자이동은 분산된 입자가 상층 또는 하층으로 이동하는 것으로서 상층부로 이동시 크리밍(creaming) 현상이라 하고 하층부로 이동시 퇴적(sedimentation) 현상이고 하며, 또한 입자크기변화는 작은 입자가 뭉쳐져 큰 입자를 형성하는 응집(flocculation) 현상과 작은 입자가 뭉쳐져 하나의 큰 입자를 형성하는 응결(coalescence) 현상으로 구분한다.

이와 같은 나노입자의 변화를 관찰하기 위하여 입도 분포를 측정하였으며, 입도 분포 측정을 위한 시료는 상기 실시예 1~5의 나노입자를 0.5 %(w/w)로 물에 희석하고 분광광도계 큐벳트(spectrophotometer cuvette PS, ratiolab®) 4 ㎖에 넣어 측정하였다.

또한, 용액에 분산되어 있는 입자는 표면극성기의 해리와 이온의 흡착에 의해 전기적으로 음 또는 양으로 대전하고 있으며, 입자 주위에는 계면전하를 중화하기 위해 과잉으로 존재하는 반대 부호를 가진 이온과 소량의 동일한 전하를 지닌 이온이 확산적으로 분포하고 있는데 이를 전기이중층(eletric double layer)이라고 한다.

콜로이드 입자를 외부에서 전장을 가하면 반대방향으로 이동하고 이때의 이동속도를 가해준 전장의 세기와 유체역학적인 효과를 고려하여 계산된 것이 제타 전위이다.

이러한 제타 전위를 측정하기 위하여 제타사이저(Malvern Zetasizer Nano-ZS nanoseries)를 이용하여 관찰하였으며, 제타 전위 측정을 위한 시료는 상기 실시예 1~5의 나노입자를 0.1 %(w/w)로 정제수에 희석한 후 접이식 모세관 셀(capillary folded cell, Malvern®) 0.7 ㎖에 넣어 측정하였다.

평균입도 분포 및 제타 전위 측정결과

구분	평균입도 분포 (㎚)	제타 전위 (㎷)
실시예 1	113.4	-37.4
실시예 2	107.3	-35.9
실시예 3	172.4	-31.4
실시예 4	109.9	-35.5
실시예 5	125.6	-35.8

상기 표 3의 결과를 보면, 모든 나노입자는 100~200 ㎚ 사이의 크기를 보였으며, 실시예 3의 경우 다른 실시예에 비하여 난용성 물질의 함유량이 높아서 입자의 평균입도 분포가 상대적으로 크게 측정되었다.

나노입자의 제타 전위는 +30 ㎷ 이상 또는 -30 ㎷ 이하일 경우 분산 안정성이 좋은 것으로 판단하고, +30 ㎷ 이하 또는 -30 ㎷ 이상일 경우 분산 안정성이 좋지 않다고 판단한다.

실시예 1 내지 5의 제타 전위는 모두 -30 ㎷ 이하로 측정되어, 본 발명에 따른 나노입자의 우수한 분산 안정성을 확인하였다.

<시험예 4> 난용성 물질에 대한 나노입자 제조 전/후의 생리활성도 측정

(1) 쿠마릭산의 미백 생리활성도 측정

미백 생리활성도 측정은 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다.

본 시험에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였으며, 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F10 멜라닌 형성 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하여 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도의 순수한 쿠마릭산과 실시예 1의 쿠마릭산이 함유된 나노입자를 처리하여 72 시간 동안 배양하였다.

배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어내고 세포 수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다.

세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 변형하여 실시하였는데, 셀 펠릿을 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 1 회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1 % Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ㎖를 첨가하여 5 분간 와류하여 세포를 파쇄하였다.

원심분리(3000 rpm, 10 분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10 % DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 ㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 하기식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 4에 기재하였다.

멜라닌 생성 저해율(%)=(A-B)/A×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

멜라닌 생성 저해율 분석결과

시료명	처리농도 (%, w/v)	멜라닌 생성 저해율(%)
순수 쿠마릭산	0.1	1.83
실시예 1	0.1	1.91

상기 표 4의 결과를 보면, 본 발명의 쿠마릭산을 함유하는 나노입자는 B16F10 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있는데, 실시예 1에서 제조된 나노입자가 순수한 쿠마릭산을 이용한 멜라닌 생성 저해율보다 높은 미백 효과를 발휘함을 확인하였으며, 이로써 쿠마릭산을 함유하는 나노입자를 포함하는 화장료 조성물은 멜라닌 생성 억제에 매우 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

(2) 올레아놀릭산의 주름개선 생리활성도 측정

섬유아세포를 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.

순수한 올레아놀릭산과 실시예 2에서 제조된 나노입자의 최종 농도가 50, 100, 500 ㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 상기 배양이 완료된 섬유아세포에 첨가하여 18 시간 동안 동일 조건에서 배양한 후 1 시간 동안 자외선(UV)을 조사하여 세포에 스트레스를 주었다.

이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하고 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였으며, 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현량을 확인하였다.

유전자 증폭은 유전자증폭기(thermal cycler)(GenePro, Hangzhou bioer tech., 중국)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer(F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 ㎕로 조정한 후 95 도 5 분 1 cycle/95 도 1 분/51 도 2 분/72 도 1 분 28 cycle 증폭, 72 도에서 5 분간 반응하는 조건으로 수행하였다.

생성된 프로콜라겐(procollagen)의 발현율은 아래의 식에 따라 계산하였으며, 대조구로는 시료를 처리하지 않고 자외선을 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

프로콜라겐 발현율(%)=B/A×100

A: 대조구에서의 프로콜라겐 발현량

B: 시료 처리 및 자외선 조사 섬유아세포의 프로콜라겐 발현량

상기 시험결과, 하기의 표 5와 같은 결과를 얻었다.

프로콜라겐 발현율(%) 분석결과

시료 농도 (㎍/㎖)	순수한 올레아놀릭산	실시예 2
0	2.62	2.62
50	46.54	44.46
100	98.34	103.45
500	131.82	159.16

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 순수한 올레아놀릭산을 사용한 경우보다 올레아놀릭산을 나노입자화한 실시예 2에서 피부 주름과 관련 있는 콜라겐 생합성 촉진효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다.

(3) 세라마이드의 보습 활성도 측정

각질형성세포를 10 % 소태아혈청이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 1×10⁶의 세포농도로 접종하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.

순수한 세라마이드와 실시예 3에서 제조된 세라마이드가 50 % 함유된 나노입자를 최종 농도가 0.5 %가 되도록 DMEM 배지에 희석하여 제조한 희석용액을 상기 배양이 완료된 각질형성세포에 첨가하여 18 시간 동안 동일 조건에서 배양하였다.

이후 Trizol reagent를 이용하여 각질형성세포를 회수하고 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성한 다음, 합성된 cDNA로부터 HAS-3(hyaluronan synthase-3) 유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현량을 확인하였으며, 유전자 증폭 방법은 상기 시험예 1과 같다.

10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer(F: GAG GAC TGG TAC CAT CAG AA, R: GCC AGA TTT GTT GAT GGT AGC), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 ㎕로 조정한 후 94 도 5 분 1 cycle/94 도 30 초/50 도 30 초/72 도 1 분 28 cycle 증폭, 72 도에서 5 분간 반응하는 조건으로 수행하였다.

생성된 HAS-3의 발현율은 아래의 식에 따라 계산하였으며, 대조구로는 시료를 처리하지 않은 정상 각질형성세포를 사용하였다.

HAS-3 발현율(%)=B/A×100

A: 대조구에서의 HAS-3 발현 량

B: 시료 처리 세포의 HAS-3 발현 량

시험결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

HAS-3 발현율(%) 분석결과

시료 농도(㎍/㎖)	순수한 세라마이드	실시예 3
500	27.46	35.97

상기 표 6의 결과에서 확인되는 바와 같이, 순수한 세라마이드를 사용하였을 때보다 세라마이드를 50 % 함유한 실시예 3의 나노입자로 시험한 결과에서 보습과 관련 있는 HAS-3의 발현 촉진 효과가 더 높게 나타남을 알 수 있다.

(4) 타자로틴의 항염 생리활성도 측정

인간 정상 섬유아세포를 12공 평판배양기에 1×10⁵ 개의 농도로 배양하고 LPS((lipopolysaccharide)를 처리한 후, 순수한 타자로틴과 타자로틴을 30 % 함유한 실시예 4의 나노입자를 1 ppm, 10 ppm, 20 ppm의 농도로 포함하는 배지로 교체하였다.

배양 2 일째에 세포를 수확하여 웨스턴블랏(Western blot) 방법을 사용하여 유도된 TNF-α(tumor necrosis factor alpha)와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 양을 정량하였으며, 대조구로서 타자로틴을 포함하지 않고 배양한 미처리군을 100으로 기준하여 측정값과의 비교치를 산출하였다.

TNF-α와 COX-2 생합성율 분석결과

구분		TNF-α 생합성율 (%)	COX-2 생합성율 (%)
대조구		100	100
순수한 타자로틴	1 ppm	84	91
	10 ppm	72	76
	20 ppm	43	66
실시예 4	1 ppm	79	83
	10 ppm	67	78
	20 ppm	38	69

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 순수한 타자로틴보다도 타자로틴을 30 % 함유한 나노입자가 TNF-α와 COX-2의 생합성을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 염증반응을 억제하는 결과로 나타나, 본 발명의 화장료 조성물이 피부 트러블을 완화하는 효능 또한 뛰어남을 확인하였다.

(5) 퀘세틴의 항산화도 측정

항산화활성을 평가하기 위하여 순수한 퀘세틴과 퀘세틴을 20 % 함유한 실시예 5 나노입자의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 프리라디칼 소거활성 시험(DPPH free radical scavenging effect assay)을 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 DPPH 라디칼에 대한 시료의 환원력으로 측정하였으며, DPPH를 에탄올에 용해하여 0.4 mM 용액을 제조하고, 또한 표준물질(standard)로 사용하는 BHT(Butylated hydroxyl toluene 또는 2,6-Di-tert-butyl-p-cresol)를 에탄올에 용해하여 준비하였다.

96 웰 플레이트에 농도별로 준비된 시료 또는 BHT 100 ㎕와 0.4 mM DPPH 용액 100 ㎕을 넣고 혼합하여 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

시료 대신에 증류수를 사용한 것을 대조구로 하여, 하기의 식을 이용하여 시료 또는 표준물질(BHT)의 DPPH 프리라디칼 소거능(%)을 계산하였다.

DPPH 프리라디칼 소거능(%)={1-(시료 또는 표준물질의 흡광도/대조구의 흡광도)}×100

DPPH 프리라디칼 소거능(%) 분석결과

농도 (ppm)	순수한 퀘세틴	실시예 5
10	0.00	0.00
50	13.41	16.78
100	44.29	49.46
500	84.57	89.84
BHT*(100ppm)	78.12

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 순수한 퀘세틴보다 퀘세틴을 함유한 실시예 5의 나노입자 모두가 농도에 따른 DPPH 프리라디칼 소거능이 우수한 것을 확인할 수 있다.

<시험예 5> 경피흡수율 측정

생체 외 피부흡수시험법은 시험물질이 피부를 통과하여 용액 저장소로 이동한 양을 측정하는 방법으로서, 인체 피부 또는 다른 종의 피부를 사용할 수 있고 시험물질에 대하여 반복측정이 가능하다.

또한, 사용할 수 있는 시험물질의 범위가 넓고 윤리적 이유로 생체 내 시험으로는 평가할 수 없는 피부손상과 피부흡수에 대한 관계를 연구할 수 있는 장점이 있으며, 물질의 조성에 따른 피부흡수와 투과를 비교할 수 있어서 인체 내 피부흡수에 의한 위험성 평가 등에 유용한 모델로 사용할 수 있다.

경피흡수율 측정 실험을 위하여 하기 표 9와 같이 난용성 물질이 함유된 나노입자를 포함하는 화장료를 제조(실시예 6~10)하고 HPLC를 이용하여 시간의 흐름에 따른 난용성 물질의 경피흡수율을 측정하였다.

기증받은 백인 여성의 허벅지 표피를 Franz-type diffusion cell(Lab fine instruments, 한국)에 장착하고 diffusion cell의 Receptor 용기(10 ㎖)에 50 mM 인산염 완충액(pH 7.4, 0.1 M NaCl)을 넣어준 후, 37 도, 600 rpm으로 혼합하고 분산시켰으며, 실시예 6~10의 각 화장료에 대하여 1 ㎖씩을 donor 용기에 넣어 주었다.

정한 시간에 따라 24 시간 동안 흡수·확산시키고, 시작 후 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 24 시간에 한 번씩 용기 안에 흡수된 안정화된 미백 유도체를 2 ㎖씩 수거하였고, 흡수 확산이 일어나는 피부의 면적은 1.28 ㎠이 되도록 하였다.

미백 유도체의 흡수확산이 끝난 후에는 흡수되지 못하고 피부에 남아 있는 유화물을 건조된 킴와이프스 종이 또는 10 ㎖의 인산염 완충액으로 씻어주고, 포셉(forcep)을 사용하여 미백 유도체가 흡수·확산되어 있는 피부를 갈아준 후, 피부 내부로 흡수된 에멀젼을 4 ㎖의 디클로로메탄을 사용하여 추출하였다.

이후 추출액을 0.45 ㎛ 나일론 멤브레인(nylon membrane) 여과막으로 여과하고 상기 시험예 2에서와 같은 HPLC 조건으로 정량하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 도시하였다.

난용성 물질이 함유된 나노입자를 포함하는 화장료 조성물 제조(중량%)

성　　 분	실시예 6	실시예 7	실시예 8	실시예 9	실시예 10
실시예 1	2.0	0.0	0.0	0.0	0.0
실시예 2	0.0	2.0	0.0	0.0	0.0
실시예 3	0.0	0.0	2.0	0.0	0.0
실시예 4	0.0	0.0	0.0	2.0	0.0
실시예 5	0.0	0.0	0.0	0.0	2.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
세테아릴알콜	2.2	2.2	2.2	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6
경화식물유	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100	100	100

도 2에서와 같이, 시간의 흐름에 따라 실시예 6 내지 10에 의하여 제조된 난용성 물질을 함유하는 나노입자는 실제 사람 피부를 투과하여 흡수된다는 것을 HPLC 시험을 통하여 확인하였다.

A:난용성 물질, B:양친성 블록 공중합체, C:레시틴

Claims

양친성 블록 공중합체 30~70 중량%와 레시틴 5~40 중량%로 구성되는 벽제 내부에 난용성 물질 5~50 중량%가 함유된 나노입자로 형성되며, 상기 양친성 블록 공중합체와 레시틴의 소수성 블록은 나노입자의 중심부로 배향하고 친수성 블록은 나노입자의 외부로 배향하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자.
청구항 1에 있어서,
상기 난용성 물질은 올레아놀릭산, 우르솔릭산, 세라마이드, 타자로틴, 아다팔렌, 쿠마릭산 및 퀘세틴으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자.
청구항 1에 있어서,
상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸포름아마이드 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자.
청구항 1에 있어서,
상기 양친성 블록 공중합체는 폴록사머, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴록사렌, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산), 폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤, 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리(아크릴산)-폴리스티렌, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리스티렌 및 폴리(아크릴산)-폴리(부타디엔)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자.
청구항 1에 있어서,
상기 레시틴은 하이드로제네이티드 레시틴인 것을 특징으로 하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자.
유기용매를 40~60 ℃로 가온한 후 난용성 물질과 양친성 블록 공중합체를 용해시켜 유상을 제조하는 단계;
0~10 ℃의 물에 레시틴을 용해하여 수상을 제조하는 단계;
상기 유상과 수상을 혼합하고 균질화하여 에멀젼을 제조하는 단계; 및
상기 에멀젼을 건조하는 단계;를 포함하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 난용성 물질, 양친성 블록 공중합체 및 레시틴의 혼합비율은 난용성 물질 5~50 중량%, 양친성 블록 공중합체 30~70 중량% 및 레시틴 5~40 중량%의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 난용성 물질은 올레아놀릭산, 우르솔릭산, 세라마이드, 타자로틴, 아다팔렌, 쿠마릭산 및 퀘세틴으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸포름아마이드 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 양친성 블록 공중합체는 폴록사머, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴록사렌, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(락틱산), 폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤, 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리(아크릴산)-폴리스티렌, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리스티렌 및 폴리(아크릴산)-폴리(부타디엔)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 레시틴은 하이드로제네이티드 레시틴인 것을 특징으로 하는, 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 균질화는 호모믹서를 이용하여 4000~6000 rpm으로 5~15 분간 균질화한 다음, 고압균질기를 이용하여 800~1500 bar의 압력에서 1~3 회 더 균질화하는 것을 특징으로 하는, 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 건조는 동결건조방식으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 난용성 물질을 함유하는 나노입자의 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 나노입자를 함유하는 화장료 조성물.
청구항 14에 있어서,
상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.