KR20150074774A - 진세노사이드 Rd를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화장료 조성물에 과한 것으로, 자세하게는 진세노사이드 Rd(ginsenoside Rd)를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단 또는 피부노화 억제 용도를 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진세노사이드 Rd는 자외선 조사 시 피부세포에서 유발되는 활성산소종의 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, 자외선 조사 시 피부세포에서 유도되는 MMP-2 및 MMP-9의 활성 또는 발현을 억제하는 효과가 우수함에 따라, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 자외선 차단 및 피부노화 방지를 위한 기능성 화장료의 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

진세노사이드 Rd를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물{Cosmetic composition for UV protecting or prevention of skin aging comprising ginsenoside Rd}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 진세노사이드 Rd(ginsenoside Rd)를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단 또는 피부노화 억제 용도를 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화 (photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다.

특히 태양광에 포함된 자외선은 피부에 직접적으로 과도하게 조사되면, 홍반 형성이나 피부세포 내의 멜라닌색소 생성을 촉진시켜 기미나 잡티 발생의 원인이 되기도 하며, 표피에 분비되는 피지와 반응하여 과산화지질을 생성함으로써 피부 트러블을 발생시키기도 하고, 심할 경우 피부암 발생의 원인이 되기도 한다. 자외선은 파장에 따라 UV-A (320~400 nm), UV-B (280~320 nm), UV-C (200~280 nm)로 구분되며, 이 중 지표에 도달하여 인체에 영향을 주는 자외선은 UV-A 및 UV-B로 알려져 있다.

또한, UV-B 노출은 피부 내에서 자유라디칼(free radical) 형성과 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 발생을 증가시키고, DNA, 세포막 및 단백질 등 세포성분들에 대한 산화적 스트레스를 유발시켜 피부노화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, 최근 천연 항산화제의 UV-B로 유도된 피부 손상을 막기 위한 다양한 연구가 진행 중이다(Joshi et al., 2012; Gonzales-Castaet al., 2011; Petrova et al., 2011; Ho et al., 2010).

인삼(Panax ginseng CA Meyer)은 쌍떡잎식물 산형화목 두릅나무과(Araliacaeae)의 여러해살이 풀로서 한의학적으로 기허에 주로 사용되는 가장 중요한 보약으로 알려져 있다. 인삼에는 사포닌 성분, 정유성분, 식물스테롤, 폴리아세틸렌, 페놀성 물질과 같은 지용성 성분, 다당체 성분 등과 같이 주요 효능성분을 함유하고 있어 항당뇨 작용, 심혈관 장애 개선, 항동맥경화 작용, 중추신경계 조절, 두뇌활동 촉진 및 신경세포 보호, 항암 및 항산화작용, 면역기능 조절, 성기능 장애 개선, 다이어트 효능 등과 같은 효능이 있는 것으로 이미 보고되어 있다.

이러한 인삼의 효능은 주로 인삼 사포닌이 관여하는데, 현재 인삼 사포닌은 약 30종이 화학 구조가 밝혀져 있으며, 화학 구조의 특성에 따라 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol, PPD)계(19종), 프로토파낙사트리올 (Protopanaxatriol, PPT)계(10종) 및 올레안(Oleanane)계(1종) 사포닌으로 구분된다. 인삼은 그 품종에 따라서 사포닌 함량이 달라지는데, 우리의 고려인삼은 동속 식물종인 미국이나 캐나다에서 생산되는 서양삼과 중국 전칠삼 등에 비해 약리활성을 나타내는 많은 종류의 사포닌(Ginsenosides)을 다량 함유하며 Rh2, Rg3, Rf등의 성분은 독자적으로 존재하여 여러 종의 삼 중에서 가장 우수한 품질로 인정받고 있다.

한편, 진세노사이드 Rd는 인삼의 주요 활성성분에 해당하며 프로토파낙사트리올계 진세노사이드의 하나의 종류로서, 현재까지 상기 진세노사이드 Rd와 관련된 연구로는 항암, 항염증, 상처치유 및 신경세포 보호 활성 등이 보고된 바 있다(Rd inhibits the proliferation and survival of gastric and breast cancer cells by inhibiting melastine type transient receptor potential 7 channel activity [Kim, 2013], The anti-inflammatory effects of Rd are due to the down-regulation of NF-κB and the consequent expressional suppressions of iNOS and COX-2 [Kim et al., 2013], Application of Rd to an excision wound in mice shows an effective healing process [Kim et al., 2013], Rd attenuates Aβ-induced pathological tau phosphorylation by altering the functional balance of glycogen synthase kinase-3β and protein phosphatase 2A [Li et al., 2013], Rd can reduce the accumulation of leukocytes and down-regulate multiple proinflammatory cytokines through modulation of JNK and p38 activation [Yang et al., 2012], Rd potentiates hydrogen peroxide-induced apoptosis of basilar artery smooth muscle cells through the mitochondrial pathway [Li et al., 2012], Rd protects SD rats and cultured cortical neurons against okadaic acid-induced toxicity [Li et al., 2011]).

그러나 진세노사이드 Rd와 관련하여 UV-B 조사에 따른 피부 광노화 억제 활성에 대해서는 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 진세노사이드 Rd가 자외선 조사에 의해 생성되는 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하고, MMP(matrix metalloproteinases)를 억제하는 활성을 통해 피부 광노화 억제 효과가 우수하여 기능성 화장품의 소재로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0820072

그러므로 본 발명의 목적은 자외선에 의해 유발되는 활성산소종 및 MMP-2 활성의 억제 효과가 우수하면서도, 피부에 안정적인 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 진세노사이드 Rd(ginsenoside Rd)를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 조성물에 1~100μM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 자외선 조사에 의해 생성되는 활성산소종의 생성 억제 및 MMP-2의 활성 억제 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자외선은 280~320nm의 파장을 갖는 UV-B일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rd는 자외선 조사 시 피부세포에서 유발되는 활성산소종의 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, 자외선 조사 시 피부세포에서 유도되는 MMP-2 및 MMP-9의 활성 또는 발현을 억제하는 효과가 우수함에 따라, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 자외선 차단 및 피부노화 방지를 위한 기능성 화장료의 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Ambo Institute(Korea)에서 얻은 순수 정제된 진세노사이드 Rd 화합물의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 피부 세포에 진세노사이드 Rd를 농도별로 전처리한 후 UV-B 조사에 따른 활성산소종 소거활성 결과를 나타낸 것이다(2a: HaCat, 2b: CCD986).
도 3은 인간 피부 세포에 진세노사이드 Rd를 농도별(5, 12, 30μM)로 전처리한 후 UV-B 조사에 따른 산화질소 수준을 측정하여 나타낸 것이다(3a: HaCat, 3b: CCD986).
도 4는 인간 피부 세포에 진세노사이드 Rd를 농도별(5, 12, 30μM)로 전처리한 후 UV-B 조사에 따른 세포생존율을 측정하여 나타낸 것이다(4a: HaCat, 4b: CCD986).
도 5a 내지 5c는 인간 피부 세포에 진세노사이드 Rd를 농도별(5, 12, 30μM)로 전처리한 후 UV-B 조사에 따른 MMP-9 또는 MMP-2의 젤라틴 융해활성을 젤라틴 자이모그래피 분석을 통해 확인한 결과이다(5a: HaCat_MMP-9, 5b: HaCat_MMP-2, 5c: CCD986_MMP-2).
도 5d 및 5e는 인간 피부 세포에 진세노사이드 Rd를 농도별(5, 12, 30μM)로 전처리한 후 UV-B 조사에 따른 MMP-2 단백질의 발현 정도를 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(5d: HaCat, 5e: CCD986).

본 발명자들은 자외선으로부터 피부를 효과적으로 보호할 수 있는 새로운 화장품 소재를 연구하던 중, 인삼 유래의 진세노사이드 Rd의 자외선 차단 및 피부노화 방지 효과를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 진세노사이드 Rd는 하기의 구조식을 갖는다.

상기 진세노사이드 Rd의 피부노화에 미치는 영향을 규명하기 위해 본 발명자들은 다음과 같은 실험을 수행하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat 세포 및 인간 피부 섬유아세포주인 CCD986을 대상으로 진세노사이드 Rd를 농도별로 처리한 후, UV-B를 조사에 따른, 각 세포내에서 발생되는 활성산소종 및 산화질소의 양을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 진세노사이드 Rd을 전처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 UV-B의 조사에 따른 활성산소종이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 2a 및 2b 참조).

자외선 중에서 UV-B는 활성산소종의 생성을 촉진시키고, 산화 스트레스를 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 UV-B 조사된 세포에서 진세노사이드 Rd가 활성산소종을 효과적으로 감소시킬 수 있다는 상기 결과를 토대로 본 발명자들은 진세노사이드 Rd를 UV-B 차단에 따른 피부노화 방지 또는 억제를 위한 화장품의 소재로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

한편, 활성산소종 억제 결과와는 달리 진세노사이드 Rd의 자외선에 의한 산화질소에 미치는 영향을 분석한 결과, 산화질소(NO)의 생성에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 3a 및 3b 참조).

일반적인 산화질소(NO)는 생리적인 현상인 혈압 조절과 신경전달 매개체로 작용하며, 면역반응에 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만 유도형 NOS에 의해 과발현된 NO는 염증반응을 일으키고 면역체계의 이상을 나타낸다. 또한, 각종 스트레스 유도제에 의해 iNOS가 유도되고 이로 인해 세포내에서 NO가 비정상적으로 축적되면 반응성 질소종(RNS; reactive nitorgen species)이 생성되고 이러한 반응성 질소종은 극기야 세포가 죽음에 이르게 되는 원인이 되기도 한다.

그러나 본 실험 결과에 의하면, 이러한 산화질소 생성은 UV-B 조사와는 관련성이 없는 것으로 조사되었다. 따라서 UV-B는 산화질소 생성 기작과는 무관하며, 진세노사이드 Rd가 UV-B 조사 시 유발되는 활성산소종의 생성 억제 기작을 통해 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있음을 입증하였다.

한편, 기질 금속단백분해효소(Matrix Metalloproteinase; MMPs)는 아연 이온에 의존적이며, 기저막이나 간질성 조직 등에 존재하는 세포외 기질(Extracellular Matrix; ECM)을 분해하는 단백분해효소이다(Steven D shapiro, Cell Biol, 10, 602, 1998). 이는 비활성형 전구체로 합성되어진 후, 단백질 가수분해에 의해 활성화 되며, MMPs의 활성은 유전자의 발현과 비활성효소의 활성화 과정, 효소활성의 억제 과전에 의해 조절된다고 알려져 있다(Woodhouse et al., Cancer, 80, 1529, 1997; Wass et al., Br J Cancer, 86, 1876, 2002; Nagase et al., J Biol Chem, 274, 21491, 1999).

이러한 MMPs는 기질 특이성에 따라 약 20여 가지가 알려져 있으며, 기질 특이성과 기본 구조에 따라 총 5종류로 구분될 수 있는데, 즉, 콜라게나아제(MMP-1, MMP-8, MMP-13), 젤라티나아제(MMP-2, MMP-9), 스트로멜라이신(MMP-3, MMP-7, MMP-10, MMP-11, MMP-12), 멤브레인 타입-MMPs (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP), 비분류된 MMPs로 분류된다(Kleiner DE et al., Cancer Chemother Pharmacol (1999) 43; 42-51).

MMPs의 일반적인 구조는 신호 펩타이드, 프로펩타이드 도메인, 아연 (Zn) 결합 부위를 가지고 있는 촉매성 도메인(catalytic domain) 그리고 힌지 영역에 의해 촉매성 도메인과 연결되어 있는 헤모펙신-유사 도메인(haemopexin-like domain)으로 이루어져 있다.

또한, 이렇게 다양한 MMPs들 중에서 젤라티나아제(MMP-2, MMP-9)는 악성의 조직에서 지속적으로 검출되고 종양의 공격성, 전이적 능력과 관계가 있다고 알려져 있으며(Wilson CL et al., Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94; 1402-1407, Fingleton BM et al., APMIS (1999) 107; 102-110), MMP-2 와 MMP-9 은 많은 수용체들에 있어서 아주 유사한 효소들이다. 하지만 이들 발현의 조절, 당화 (glycosylation), 프로엔자임(proenzyme)의 활성화 및 기질에 있어서는 분명한 차이점이 있다. 예를 들어, MMP-2는 72-kDa의 비당화된 단백질인 반면 92-kDa의 MMP-9 은 프로도메인(prodomain) 과 촉매성 도메인에 2개의 당화된 부위를 가지고 있다(L.P. Kotra et al., Bioorg Chem (2002) 30; 356-370, P.M. Rudd et al., Biochemistry (1999) 38; 13937-13950, T.S. Mattu et al., Biochemistry (2000) 39; 15695-15704). 또한, 항상 발현하고 있으면서 작용하는 MMP-2와 달리, MMP-9는 TNF-α와 같은 염증성 매개체의 자극으로 발현이 증가되는 것이 특징이며, NF-κB 등 특정 전사인자에 의해서 조절된다(Sanseau et al., J Biol Chem, 227, 35766, 2002). 이는 세포외 기질 대부분의 성분을 분해할 수 있어 상처 치유 태아의 발생 및 신생혈관생성, 월경, 배란, 임신 등 조직이 재구성되는 과정에서 생리학적인 각각의 기능을 정상적으로 유지시키지만 과도하게 발현되면 피부노화, 류마티스성 관절염, 만성궤양, 치주염, 동맥경화, 종야의 성장 및 종양세포의 침윤과 전이 등 여러 병리 현상에 관여하는 것이 보고 되었다(Linda et al., Chem Biol, 2, 466, 1998).

또한, 이러한 MMP들은 자외선 노출을 받은 피부에서 복잡한 신호전달 경로를 거쳐 교원질의 합성이 감소되면서 그 발현이 증가된다고 알려져 있으며(Lee et al., J. Dermatol Sci, 17, 182, 1998), 예를 들어 자외선 A 조사 시에는 MMP-1이 활성화 되는 것으로 알려져 있으며, 자외선 B 조사 시에는 MMP-2의 활성이 증가된다. 자외선 조사에 의한 피부 내의 MMP-2 활성이 증가되면 피부 내 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로써 진피층의 콜라겐의 붕괴에 영향을 미치고, 광노화에 매우 중요한 역할을 하고 있는 것이 보고된 바 있다.

그러므로 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 의해 콜라겐이 감소하면, 피부의 강도와 장력이 떨어지고 피부를 보호하는 기능이 현저히 감소됨으로써 피부노화도 가속화된다. 따라서 자외선으로부터 이러한 MMPs의 활성 또는 발현을 억제하는 물질은 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 용도로 활용될 수 있다.

이에 본 발명자들은 진세노사이드 Rd가 자외선 조사에 의한 MMP(특히 MMP-9 및 MMP-2)의 활성 또는 발현을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였으며, 그 결과 UV-B로 조사된 인간 피부 세포에서 진세노사이드 Rd를 전처리한 경우 MMP-9 및 MMP-2의 활성 또는 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 상기와 같은 결과를 통해 진세노사이드 Rd가 MMP-9 및 MMP-2의 활성 또는 발현의 억제를 통해 피부노화를 방지할 수 있는 화합물 소재로 유용함을 확인할 수 있었다(도 5a~5e 참조).

뿐만 아니라, 본 발명의 진세노사이드 Rd는 피부 세포에 대해 세포 독성을 유발시키지 않아 세포 안정성을 갖는 특징이 있다.

이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat 세포 및 인간 피부 섬유아세포주인 CCD986 세포를 대상으로 진세노사이드 Rd를 농도별로 처리한 후, MTT 분석을 통해 세포 사멸 정도를 분석하였는데, 농도를 달리하여 처리한 각 실험군(0, 5, 12, 30uM) 모두 진세노사이드 Rd를 처리하지 않은 대조군과 세포 생존율에서 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(도 4a 및 4b 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 진세노사이드 Rd는 피부 세포에 독성을 나타내지 않으므로, 피부에 적용하는 화장품의 제조에 안심하고 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 진세노사이드 Rd를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 자외선 조사에 의해 생성되는 활성산소종의 생성을 억제하고, MMP-2 및 MMP-9의 활성을 효과적으로 억제하는 기능을 가질 수 있다.

상기 조성물에는 진세노사이드 Rd가 1~100μM의 농도로 함유될 수 있는데, 진세노사이드 Rd를 1μM 미만으로 함유되는 경우에는 목적하고자 하는 상기 기술된 효과를 얻지 못하며, 100μM을 초과하는 경우에는 피부에 예상치 못한 부작용이 발생할 수 있고, 효과 증대 정도가 미미하기 때문에, 상기 기술된 범위의 함량으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진세노사이드 Rd의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001-20중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-20중량%이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 자외선 중에서도 UV-B에 의한 피부보호 및 자외선 차단 효과를 가지는데, 일반적으로 자외선은 자외선 A, B 및 C의 3가지 파장 영역으로 구분된다.

먼저, UV-A (320~400nm)는 오존층에 흡수되지 않으며 파장영역이 0.32~0.40㎛에 해당하고, UV-B에 비하여 에너지량이 적지만 피부를 그을릴 수 있다. 피부를 태우는 주역은 UV-B 이지만 UV-A는 피부를 벌겋게 만들 뿐 아니라 피부 면역 체계에 작용하여 피부 노화에 따른 장기적 피부 손상을 일으킬 수 있다. 최근에는 UV-A 노출 시간이 피부를 그을릴 정도로 길어지면 피부암 발생의 위험이 UV-B의 경우와 같아진다는 연구 결과가 보고되기도 하였다.

UV-B (280~320nm)는 대부분은 오존층에 흡수되지만, 일부는 지표면에 도달한다. 지구에 극소량이 도달하는 UV-B는 파장영역이 0.28~0.32㎛에 해당하는 자외선으로서, 동물체의 피부를 태우고 피부 조직을 뚫고 들어가며 때로는 피부암을 일으키는데, 피부암 발생의 원인은 대부분 태양 광선의 노출 및 UV-B와 관련이 있다.

또한, UV-C (100~280nm)는 오존층에 완전히 흡수된다. 파장영역이 0.20~0.29㎛인 자외선 중 UV-C는 염색체 변이를 일으키고 단세포 유기물을 죽이며, 눈의 각막을 해치는 등 생명체에 해로운 영향을 미친다. 다행히 UV-C로 알려진 이 범위의 자외선은 성층권의 오존에 의해 거의 모두 흡수된다.

본 발명의 조성물이 제공하는 피부 보호를 위한 자외선 차단은 상기 3가지의 자외선 중에서 280~320nm의 파장 영역을 갖는 UV-B에 해당한다.

나아가 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 진세노사이드 Rd 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 상기 진세노사이드 Rd를 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 화합물을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 화합물의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.

본 발명에 따라 상기 진세노사이드 Rd를 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 피부노화 방지용 화장료 조성물은 상기 진세노사이드 Rd를 나노리포좀 충 중량 기준으로 0.1~20.0중량%로 함유할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

시약

하기 실시예를 위해 사용한 시약들은 다음과 같다. 먼저, 진세노사이드 Rd[Rd, purity≥98%]는 Ambo Institute(대한민국, 서울)로부터 구입한 것을 사용하였고, 젤라틴, 니트레이트(nitrite), SDS(sodium dodecyl sulfate), MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), DCFH-DA(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate) 및 Griess 시약은 시그마 사(St Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 또한, DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린-스테렙토마이신 및 트립신-EDTA는 HyCone Laboratories Inc.(Logan, UT, USA)로부터 수득한 것을 사용하였으며, 모든 시약들은 상용되고 있는 최상의 품질의 것을 사용하였다.

세포배양

인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat(ATCC, Manassas, VA, USA) 및 인간 피부 섬유아세포주인 CCD986(ATCC, Manassas, VA, USA)은 열처리로 불활성된 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO₂의 습윤 대기 및 37℃의 온도가 유지되는 조건 하에서 배양시켰다.

UV -B 자외선 처리

하기 실험에서 수행한 자외선 처리는 자외선 B(UV-B)로서 자외선 램프(peak, 312 nm; model VL-6.M, Vilber Lourmat, Marine, France)를 사용하여 조사하였고, 조사 강도는 센서(bandwidth, 280 to 320 nm; model CX-312, Vilber Lourmat)가 장착된 라디오미터(model VLX-3W, Vilber Lourmat)기기를 사용하여 측정하였다. 상기 배양된 세포들을 대상으로 하기 각 실험에서 70 mJ/cm² UV-B를 조사하였다.

통계처리

실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 실험군들의 통계적 비교는unpaired Student's t-test를 통해 수행하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

< 실시예 1>

진세노사이드 Rd 의 UV -B 조사에 의한 활성산소종 생성 억제 활성

본 발명자들은 UV-B 조사 시 세포내에서 발생되는 활성산소종(ROS)에 대해 본 발명의 진세노사이드 Rd의 활성산소종 소거 활성을 확인하기 위해 앞서 배양한 인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat 2.0×10⁵ 및 인간 피부 섬유아세포주인 CCD986 1.0×10⁵ 세포수에 대해 각각 5, 12 및 30μM 농도의 진세노사이드 Rd를 자외선 조사 30분 전에 전처리한 후, 70 mJ/cm² UV-B를 조사하였다. 또한, 상기 진세노사이드 Rd의 활성산소종 소거활성을 측정하기 위해, Royall 및 Ischiropoulos에 의해 고안된 방법인 레독스-민감성 형광 프로브인 DCFH-DA를 이용하였는데, 즉 상기 진세노사이드 Rd를 처리한 세포들에 10μM의 DCFH-DA를 처리하고, 37℃에서 30분 동안 배양시킨 다음, 1mL의 FBS가 없는 배지로 2번 세척 후, 다시 1mL의 FBS가 없는 배지를 첨가한 다음, 70 mJ/cm² UV-B를 조사하였다. 이후, 세포들을 수거하고 Multi-Mode Microplate Reader (Synergy^TMMx, BioTekInstruments, Winooki, VT, USA)를 사용하여 세포내 활성산소종의 양을 측정하였고, 활성산소종(ROS)의 수준은 DCF-fluorescence로 나타내었다.

그 결과 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 진세노사이드 Rd를 전처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 활성산소종을 억제하는 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었는데, 특히 진세노사이드 Rd를 30μM의 농도로 처리한 실험군에서 활성산소종의 생성이 80% 이상 두드러지게 감소되는 것으로 나타났다.

< 실시예 2>

진세노사이드 Rd 의 UV -B 조사에 의한 산화질소 생성 억제 활성

본 발명자들은 진세노사이드 Rd가 UV-B 조사로 인해 피부 세포에서 생성되는 산화질소에 미치는 영향을 조사하였는데, 상기 실시예 1에서와 동일한 방식으로 진세노사이드 Rd를 각각의 농도별로 전처리하고 UV-B가 조사된 각 세포들(HaCat, CCD986)로부터 세포 상층액을 수득한 후, 산화질소 양을 측정하여 분석하였다.

산화질소 측정은 배양된 세포의 배양액을 대상으로 Griess 반응(Sherman et al., 1993)을 이용한 비색분석(colorimetric assay)을 통해 측정하였는데, 보다 구체적으로는 상기 세포 배양액과 동일 부피의 Griess 시약(1% sulfanilamide-0.1% N-1-naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride in 2.5% phosphoricacid)을 배양액과 혼합하여 10분간 상온에서 반응시켰다. 이후 550nm의 흡광도에서 ELISA 분석을 통해 측정하였고, 이때 표준 곡선은 이미 알려진 아질산나트륨의 농도(0~160uM)를 이용하여 작성하여 사용하였다.

그 결과 도 3a 및 3b에서 나타낸 바와 같이, 산화질소의 생성은 자외선 조사 유무에 상관없이 일정 수준이 측정되는 것으로 나타났고, 또한 진세노사이드 Rd의 처리양에 관계없이 일정 수준이 측정되는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 피부세포 내에서 산화질소의 생성은 자외선 조사, 특히 UV-B 조사와는 관련성이 없음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

세포 독성 여부 측정

본 발명자들은 진세노사이드 Rd가 피부 세포주들에 대해 독성(세포 생존에 미치는 영향)을 유발하는지 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.

이를 위해 HaCat(2.0×10⁵ 세포수) 및 CCD98(1.0×10⁵ 세포수) 각각을 24웰 플레이트에 분주하고 37℃에서 밤새도록 배양한 다음, 1ml의 PBS로 2번 세척한 다음, 1ml의 혈청이 없는 배지를 첨가하였다. 이후 진세노사이드 Rd를 농도별로 30분 동안 전처리하고 앞서 기술한 조건과 동일하게 UV-B를 조사하였다. 이후 배지를 제거하고 세포들을 5/ml MTT 용액과 반응시킨 후 세포들을 DMSO로 용해시키고 포르마잔으로 고정시킨 후, MTT의 환원정도를 540nm의 흡광도에서 분석하였다.

그 결과 도 4a 및 4b에서 나타낸 바와 같이, 상기 세포주에서는(HaCat, CCD986) 본 실험에서 수행한 조건, 즉 진세노사이드 Rd의 처리량(30μM의 농도까지) 및 자외선 조사(70mJ/cm²)강도에서는 세포들의 생존에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 진세노사이드 Rd가 피부 세포에 독성을 유발시키지 않아 피부에 직접 응용하는 기능성 화장품의 소재로 안전하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

자외선 조사에 의한 MMPs 의 활성에 미치는 진세노사이드 Rd 의 영향

기질단백질 분해효소인 MMPs(matrix metallproteinases)는 자외선 조사 시 MMP1, MMP2 및 MMP9와 같은 특정 MMP 패밀리들의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있으며, 프로토콜라겐의 생합성을 억제하여 콜라겐의 함량을 감소시켜 피부의 주름생성을 촉진시키고, 색소 침착을 유발하여 피부톤을 칙칙하게 만든다.

이에 본 발명자들은 진세노사이드 Rd가 자외선 조사 시 발현이 증가되는 MMP2 및 MMP9의 활성에 미치는 영향을 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 통해 조사하였다.

이를 위해, 먼저 상기 실시예 1에서 사용한 동일 조건으로 처리 및 배양된 HaCat 및 CCD986 세포 각각의 배양액을 수득한 다음, 1mg/ml의 젤라틴이 함침된 10%(v/v) SDS-PAGE 겔에서 비환원 조건으로 전기영동 시켰고, 겔 안의 단백질들은 2.5% Triton X-100을 사용하여 상온에서 30분 동안 배양하여 변성시켰고 이러한 과정을 2번 반복 수행한 다음, 50 mM Tris buffer, pH 7.8, 5 mM CaCl₂,0.15MNaCl,1%TritonX-100가 함유된 버퍼로 24시간 동안 반응시켰다. 이후 겔을 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색시켰고, 젤라틴 분해 효소들은 푸른색 백그라운드 대비 클리어 존(clear zone)의 존재 여부로 확인하였으며, MMP2 및 MMP9은 각 단백질의 크기와 비교하여 활성 정도를 분석하였다.

그 결과 도 5a 내지 5c에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 진세노사이드 Rd가 전처리된 실험군에서 UV-B에 의해 유도되는 MMP-2 및 MMP-9의 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 자외선 조사에 따른 MMP-2 단백질 발현여부에 진세노사이드 Rd가 어떠한 영향을 미치는지 웨스턴 블럿을 수행하였는데, 이를 위해 0, 5, 12, 30uM 농도의 진세노사이드 Rd를 HaCat 및 CCD986 세포에 각각 전처리하고, 자외선 B를 조사하여 수득한 세포 배양액을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하여 전기영동 한 후, PVDF 막으로 단백질들을 이동시킨 후, 2% bovine serum albumin이 함유된 1x TBS-Tween 20으로 블록킹시킨 후, 항-pro-MMP-2 항체, 항-MMP-2 항체 (ALX-210-753, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) 및 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-pAb-HRP-conjugate; ADI-SAB-300, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 반응시킨 후, enhanced West-save up ^TM(AbFrontier,Seoul,Korea)을 이용하여 가시화시켰다.

그 결과 도 5d 및 5e에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 진세노사이드 Rd가 전처리된 실험군에서 자외선 조사에 의해 유도되는 MMP-2의 단백질 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

이하에서는 본 발명의 진세노사이드 Rd를 이용한 자외선 차단 및 피부노화 억제 효과를 갖는 기능성 화장료의 제조방법에 대한 제형예를 기재하였다.

< 제형예 1>

유연화장수(스킨로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
진세노사이드 Rd	0.8
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

< 제형예 2>

영양화장수( 밀크로션 )

하기 표에 나타난 바와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
진세노사이드 Rd	2.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리어탄올아민	1.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔리탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
EDTA-2Na	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

< 제형예 3>

영양크림

하기 표에 나타난 바와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
진세노사이드 Rd	8.0
세토 스테아릴 알코올	2.0
글리세릴 스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔리탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동파라핀	3.0
싸이클론메치콘	3.0
비에치티이	0.05
델타 토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1.3-부틸렌글리콜	2.0
산타검	0.1
EDTA-2Na	0.5
향, 방부제	미량
정제수	to 100

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

1. 하기 구조식을 갖는 진세노사이드 Rd(ginsenoside Rd)를 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물:
   

   

   .
2. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 Rd는 조성물에 1~100μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 Rd는 자외선 조사에 의해 생성되는 활성산소종의 생성을 억제하고, MMP-2의 활성을 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 자외선은 280~320nm의 파장을 갖는 UV-B인 것을 특징으로 하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 자외선 차단용 또는 피부노화 방지용 화장료 조성물.

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