KR20150074450A

KR20150074450A - 감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증 치료 및 개선 조성물

Info

Publication number: KR20150074450A
Application number: KR1020130162244A
Authority: KR
Inventors: 김무성; 이상린; 박용대; 윤준식; 이태봉
Original assignee: 주식회사 마크로케어
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2015-07-02
Also published as: KR101543998B1

Abstract

본 발명은 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증 치료 및 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 알칼로이드계 화합물은 고지질식이로 콜레스테롤과 저밀도 지단백의 수치가 증가한 랫트에서 혈중 콜레스테롤과 저밀도 지단백 농도를 감소시키고, 지방간 동물모델에서 중성지방과 콜레스테롤의 수치를 효과적으로 감소시킴으로써, 지방간, 특히 비알코올성 지방간에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증 치료 및 개선 조성물{Composition for treating and improving fatty liver and hyperlipidemia comprising extract of olive as an active ingredient}

본 발명은 감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증 치료 및 개선을 위한 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

한국인의 혈장 콜레스테롤 농도는 서양인의 콜레스테롤 수준에 비하여 아직 낮은 범위이지만 최근 20～30년 사이에 10 ㎎/㎗ 이상 높아졌으며, 특히 낮은 연령층에서의 상승이 두드러지고 있다.

이로 인해 최근 수년간 고혈압, 뇌혈관 장애, 심질환의 환자 수는 해를 거듭할수록 증가하고 있으며, 심근경색 환자의 연령은 점차 낮아지고 있다. 이러한 변화는 동물성 지방과 단백질 섭취량이 현저히 증가한 한국인의 식생활 변화에서 그 원인을 찾을 수 있다.

한편, 콜레스테롤은 탄소수 27개로 이루어진 불용성 스테로이드계 화합물로서, 동물세포의 필수적인 막 성분일 뿐만 아니라 프로게스틴(progestins), 코르티코스테로이드 (corticosteroids), 성호르몬인 앤드로겐(androgens)과 에스트로겐 (estrogens)의 전구체로 작용하며, 장으로부터 지방이나 지용성 비타민의 흡수에 필요한 담즙산(bile acids)의 형성, 간으로부터 지방을 말초조직으로 운반하기 위해 간에서 형성되는 초저밀도 지단백질(VLDL; very-low-density lipoprotein)의 형성에도 사용되어 진다.

콜레스테롤은 그의 축적이나 이용을 위해서 합성 또는 흡수된 조직으로부터 필요로 하는 조직까지 운반되어야 하고 트리글리세라이드(triglyceride)와 마찬가지로 혈장에서 지단백질 형태로 존재하면서 이동되고 대사된다.

또한, 간은 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 분비할 때 주로 초저밀도 지단백질의 형태로 분비하며 이는 혈관벽의 지단백질 분해효소의 작용으로 트리글리세라이드가 제거되면서 중간밀도 지단백질(IDL; intermediate density lipoprotein)로 변하고 중간밀도 지단백질은 잔여 트리글리세라이드가 제거되어 저밀도 지단백질 (LDL;low-density lipoprotein)로 변하게 되는데, 저밀도 지단백질은 장기간 혈액 내에 체류하게 되며 혈장 콜레스테롤의 대부분 (60-70%)은 저밀도 지단백질의 형태로 존재하게 된다. 혈중 저밀도 지단백질은 간 및 말초조직에 의해 다시 섭취되고, 말단조직의 잉여 콜레스테롤은 역전이 시스템 (reverse cholesterol transport system)을 거쳐 다시 간으로 수송되어 담즙산염의 형태로 장으로 분비되어 배출된다.

혈중 저밀도 지단백질(LDL)은 세포막의 LDL-수용체를 통해 세포 내로 이동되는데 세포 내 콜레스테롤의 농도가 높을 경우 LDL-수용체의 합성속도는 감소되며 혈액으로부터 콜레스테롤의 흡수가 느려진다. 혈중 콜레스테롤의 농도가 높을 경우에 심각한 병에 이를 수 있는데 생합성에 의한 콜레스테롤과 식품으로 섭취된 콜레스테롤의 양이 세포막, 담즙산, 스테로이드 호르몬의 합성에 필요한 양 이상일 경우에 혈관 내에 콜레스테롤의 축적이 일어나 혈관을 좁혀 혈류를 방해할 수도 있으며, 심할 경우에는 혈관의 폐색(관상 동맥경화)이 일어나 혈류를 정지시켜 조직이 사멸되기까지 한다.

현재 이러한 심혈관 질환을 일으키는 주요 위험 요인으로 혈장 콜레스테롤 수준의 증가, 특히 LDL-콜레스테롤의 증가를 들고 있는데 따라서 이를 정상 수준으로 유지하는 것이 심혈관 질환을 방지하는 목적이 되고 있다. 사람의 경우 하루에 대략 300～500 ㎎의 콜레스테롤이 식이 중으로 섭취되며 700～900 ㎎ 정도가 체내에서 합성되는데 체내 총 콜레스테롤의 2/3 가량이 체내에서 직접 합성되기 때문에 콜레스테롤 생합성을 저해함으로써 LDL-수용체의 합성 속도를 증가시켜 혈장 콜레스테롤 수준을 낮추는 방법이 효과적인 것으로 여겨지고 있다.

지금까지의 심혈관 질환의 치료제는 혈장 콜레스테롤을 낮추는 제제, 동맥 경화증상을 경감·완화시키는 제제, 심혈관 질환의 진전을 차단 또는 역전시키는 제제의 3가지로 구분될 수 있다. 이들 중에서 혈장 콜레스테롤을 낮추는 제제가 가장 광범위하게 사용되고 있으며 주로 혈중 LDL-콜레스테롤이나 총 콜레스테롤의 수준을 낮추는 작용을 한다.

상기 제제는 작용 기작에 따라 세포 내 콜레스테롤의 이화작용을 촉진함으로써 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 담즙산 격리제(bile acid sequestrant), 피브르산(fibric acid)의 유도체, 니코틴산(nicotinic acid)과 프로부콜 (probucol) 등이 있으며, 콜레스테롤 생합성 조절효소인 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A reductase)를 저해하여 LDL-수용체의 합성 속도를 증가시켜 혈장 콜레스테롤 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 컴팩틴(compactin) 유도체인 로바스타틴(lovastatin), 프로바스타틴(pravastatin), 심바스타틴(symvastatin)등이 있으며 콜레스테롤 전달효소인 ACAT (acyl-CoA: cholesterolacyltransferase)의 활성을 저해하여 콜레스테롤의 흡수를 억제함으로써 혈장 콜레스테롤의 수준을 낮추는 제제, 예를 들면, 일본에서 주로 개발된 퍼팩틴(purpactin), 에피코리퀴논(epicohliquinone), 아카테린

(acaterin), 헬민토스포롤(helminthosporols), 락테리 (lacteritin), 짚세틴 (gypsetin), 엔니아틴(enniatins), 글리소프레닌(glisoprenins), 피리피로펜 (pyripyropenes), 터펜돌(terpendoles) 등으로 나눌 수 있다.

이외에도, 고밀도 지단백질(HDL)에 있는 콜레스테롤을 저밀도 지단백질(LDL)로 전달하는 효소인 콜레스테롤 전이 단백질(cholesterolestertransfer protein, CETP)을 저해함으로써 고지혈증을 억제하여 동맥경화증을 예방하고자 하는 시도가 미국의 업존사 (UpjohnCo.), 머크사 (Merck Co.)를 비롯한 많은 제약회사에서 진행되고있다. 또한, 콜레스테롤 합성에 관여하는 중요한 효소인 스쿠알렌 합성효소 (SQS, squalene synthase)의 저해제를 탐색하는 연구가 최근에 새로이

시작되어 머크사의 자라고즈산(zaragozic acid) 및 글락소사 (Glaxo Co.)의 스쿠알레스타틴(squalestatin)등의 신물질을 미생물로부터 분리한 것이 보고되고 있다.

지방간에서 축적된 지방의 대부분은 중성지방(triglyceride)이며, 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 비알코올성 지방간은 비만, 인슐린 과민증, 당뇨병으로 앓고 있는 사람에게서 많이 발생하며 인슐린 저항성이나 과도한 지방 분해에 의해 혈액내 유리 지방산의 농도가 높아지는 것에 기인하여 나타난다.

현재 지방간을 약물학적으로 치료하는데 유용한 약제는 거의 없는 상태이며 운동과 식이요법만이 권장되고 있기 때문에 지방간 치료제 개발이 요구된다.

한편 천연물질로부터 항 콜레스테롤 작용 또는 지방간 치료 효과를 갖는 유효물질을 찾고자 하는 연구가 다수 보고되었다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제 10-0640094호는 녹차씨유를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 녹차씨유가 혈장 콜레스테롤 농도를 저하시키며, 간의 지질과산화 정도를 유의적으로 감소시킴에 의해 고지방식이 섭취에 따른 산화적 스트레스를 방어하는 효과가 있으므로, 이를 포함하는 조성물은 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다고 개시하고 있다. 또한 대한민국 특허공개 제 2013-0110929호는 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 알칼로이드계 화합물은 생체 내 안정성을 가지고 있으며, ANT1 효소의 활성을 증가시키고, 지방간 동물모델의 간조직 내에서 지방산화를 촉진하고 이로 인해 지방축적 및 중성지방 생성을 효과적으로 억제함으로써, 지방간, 특히 비알코올성 지방간에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다고 개시하고 있다.

KR

10-0640094

R

KR

2013-0110929

A

이에 본 발명자들은 천연물로부터 항 콜레스테롤 활성 또는 지방간 치료 효과를 갖는 신물질을 찾고자 예의 연구 노력한 결과, 감람나무 열매추출물에서 항 콜레스테롤 활성이 강한 분획을 추출하고 상기 분획이 혈중 콜레스테롤 농도를 효과적으로 저해하여 고지혈증, 고혈압, 뇌혈관 장애, 심질환, 비알코올성 지방간 등의 예방 및 치료용으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은

감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 하기 화학식 1의 하이드록시타이로솔을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한 본 발명은 감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 하이드록시타이로솔을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료용 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 감람나무 열매 추출물은 고지질식이로 콜레스테롤과 저밀도 지단백의 수치가 증가한 랫트에서 혈중 콜레스테롤과 저밀도 지단백 농도를 감소시키고, 지방간 동물모델에서 콜레스테롤과 중성지방의 수치 감소 효과가 우수하여 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 이용 가능할 뿐만 아니라, 지방간 및 고지혈증 예방 및 개선용 건강기능식품, 건강보조식품에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 감람나무 열매 추출물의 HPLC 분석 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 감람나무 열매 추출물의 H＆E 염색을 통한 지방간 개선 효과를 도시한 사진이다.
도 3은 고지질식이 투여로 인한 비만 랫트의 간기능을 나타내는 전이효소(AST, ALT)의 감람나무 열매 추출물 투여에 따른 변화를 측정한 그래프이다.

본 발명은 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하기 화학식 1의 하이드록시타이로솔을 유효성분으로 포함하는 지방간 및 고지혈증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 감람나무(Olea europaea LINN) 열매 추출물은 하기와 같은 방법으로 얻을 수 있다. 감람나무 열매를 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조하고 분쇄한다. 감람나무 열매는 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 분쇄된 감람나무 열매에 적당한 양의 용매를 가하여 완전히 침지되도록 하여 감람나무 열매는 추출물을 수득한다. 추출 방법은 실온

에서 함침 하거나 가온할 수 있다. 상기 추출 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 이들의 혼합용매로부터 선택된 1 종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이며, 더욱 바람직하게는 에탄올이다. 상기 감람나무 열매 추출물을 여과 및 농축한 후, 헥산, 클로르포름, 및 에틸아세테이트 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는다. 상기 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수한 항 콜레스테롤 활성 및 지방간 치료 효과를 나타내었다.

상기 감람나무 열매 에틸아세테이트 분획물으로부터 액체 크로마토그래피를 이용하여 활성 물질을 분리하였으며, 활성물질이 하이드록시타이로솔임을 확인하였다.

본 발명에서 사용하는 크로마토그래피는 이에 제한되지 않으나, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), LH-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피

(TLC; Thin layer chromatography) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liqid chromatography)등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔은 고지질식이로 콜레스테롤과 저밀도 지단백의 수치가 증가한 랫트에서 혈중 콜레스테롤과 저밀도 지단백 농도를 감소시키고, 지방간 동물모델의 간 조직 내에서 콜레스테롤 및 중성지방의 생성을 효과적으로 억제한다.

따라서, 본 발명에 따른 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔은 고지혈정, 지방간 특히 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 또는 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔 단독으로 사용하거나 또는 다른 약학적 활성 화합물과의 결합체나 집합체의 형태로도 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔은 다른 공지된 고지혈증, 지방간의 예방 또는 치료 약물과 혼합하여 복합제제 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 고지혈증, 지방간의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물는 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피하내 경로를 통해 통상적인 방식이 가능하다. 이때, 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하여, 피하내 투여가 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 성인의 경우 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔을 1일 1회 0.01㎍/kg/day~100㎍/kg/day, 바람직하게는 0.01㎍/kg/day~10㎍/kg/day의 용량으로 투여할 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회에 나누어 투여할 수 도 있다.

본 발명에서, 건강기능식품이란 질병의 예방 및 치료, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 조성물은 고지혈증, 지방간의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한, 지방간 및 고지혈증의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학투여형태 또는 건강음료 등의 형태인 건강기능식품 및 건강보조식품으로의 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 기능성 건강음료 조성물은 지시된 비율로, 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(포도당, 과당 등), 디사카라이드(말토스, 슈크로스 등), 및 폴리사카라이드(덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당과 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한이 없으나, 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 감람나무 열매 추출물 및 이로부터 분리된 하이드록시타이로솔은 지방간 및 고지혈증의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100mL를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 감람나무 열매 추출물 제조

감람나무 열매 추출물을 얻기 위해서 아래와 추출공정을 진행하였다.

준비된 감람나무 열매 열매 시료경동시장에서 10 kg을 구입하였고, 그 중 1kg을 블렌더로 처리한 다음, 1 리터 병에 시료 100g을 넣었다. 75% 에탄올을 용기에 넣었다 (1L 기준-에탄올 750+ D.W 250). 3일 동안 37℃에서 shaking incubation한 다음, 3일 동안 incubation된 시료를 여과하였다(Vaccume 이용, filter paper size 2). 여과된 시료를 농축을 하였다(EYELA Rotary evaporator N-1000을 이용). 농축이 완료된 시료는 3~4일 동안 동결 건조를 하였다(-40℃ 이하, vaccum5~10 조건을 유지하는지 수시로 확인, 농축이 완료 된 후 바로 동결건조를 시키지 못하는 경우 시료를 4℃에서 보관).

이 동결건조된 시료(180g)에 에탄올 수용액(10 v/v%)을 가하여 현탁하고, n-헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트 순으로 분획하여 n-헥산 가용추출물, 클로로포름 가용추출물, 에틸아세테이트 가용추출물 및 물 가용추출물을 수득하였다. 이때, 분별 추출은 분별 깔데기 등을 이용하여 추출하였다. n-헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 순서대로 이용하여 분별 추출하여 n-헥산 가용추출물(34.5 g/100 g), 클로로포름 가용추출물(4.5g/100 g), 에틸아세테이트 가용추출물 (55.6 g/100 g)을 수득하였다.

상기에서 얻은 감람나무 열매의 추출물을 헥산으로 분획하여 비극성 부분을 분리하고, 남은 수층을 에틸아세테이트로 분획하여 감압 농축하였다. 이렇게 극성별로 나누어진 헥산층, 에틸아세테이트층, 물층의 분획들에서 에틸아세테이트분획을 실리카 겔로 세 분획 하고 다시 여러 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 각각의 세 분획에서 계속하여 유효성분들을 분리하였다. 분획 및 물질의 분리는 실리카 겔뿐 아니라, sephadex LH-20, ODS-A, diol, preparative MPLC, 또는 preparative HPLC 등의 다양한 크로마토그래피법을 이용하여 시행하였다.

본 발명에 따른 감람나무 열매의 추출물을 극성에 따라 분획하고 각각의 분획에서 에틸아세테이트 분획 실리카 겔을 포함한 여러 가지 column을 사용하여 분리를 시도하여 1D NMR과 2D NMR 방법을 이용하여 구조를 동정하고 LC/MS, UV, IR과 같은 최신 기기를 사용하여 단일 물질의 구조 확인을 완료하였다. 상기의 절차에 의해 분획된 단일물질은 첨부된 화학식 1의 하이드록시타이로솔이 포함되어 있었다(도 1 참조).

실험예 1: 동물실험을 통한 고 지혈증 예방 및 치료 효과 확인

실험동물은 8주령 웅성 SD계 랫트(~250g)를 4주 동안 고지혈증을 유도하기 위하여 5.5 wt% 옥수수유, 2 wt% 콜레스테롤, 1 wt% 콜산, 91.5 wt% 일반사료를 함유한 고지질 식이(western diet)를 실시하였다.

상기 실시예 1에서 얻은 감람나무 열매 추출물의 효과를 검증하기 위하여 1 군(일반식이+vehicle), 2 군(고지질 식이 diet+vehicle), 3 군(고지질 식이 +감람나무 열매추출물; 0.1g/kg), 4 군(고지질 식이 +감람나무 열매추출물; 0.3g/kg)로 총 4 군으로 구분하였다. 일반식이는 표준 랫트 사료로 단백질(~14 wt%), 지방(~10 wt%)과 탄수화물(~76 wt%)를 함유한다.

식이는 28일 동안 매일 오전에 물 또는 감람나무 열매 추출물(0.1g/kg 또는 0.3g/kg)을 경구투여(oral gavage) 하였다. 각 그룹의 랫트를 마취한 후 안와정맥혈을 통해 채혈한 후 혈장 분리를 위해 상온에서 30분간 인큐베이션 후 4℃에서 1500g로 15분간 원심분리를 2회 실시한 후 상층액을 획득한 다음 혈액생화학분석기(Hitachi)를 통해 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성지질(TG)를 분석하였다. 그 결과는 아래 표 1에 나타내었다.

실험군		대조군	고지질식이 투여군	고지질식이+감람나무 열매 추출물 0.1g/kg 투여군	고지질식이+감람나무 열매 추출물 0.3g/kg 투여군
총 콜레스테롤(mM/L)	전	1.87±0.13	2.23±0.07	2.46±0.10	2.27±0.10
총 콜레스테롤(mM/L)	후	1.73±0.07	5.67±0.32	5.45±0.27	4.81±0.31
트리글리세라이드(mM/L)	전	0.70±0.01	0.71±0.01	0.71±0.01	0.70±0.01
트리글리세라이드(mM/L)	후	0.70±0.01	0.68±0.01	0.65±0.01	0.61±0.01
LDL(mM/L)	전	0.68±0.03	0.81±0.11	0.82±0.08	0.92±0.07
LDL(mM/L)	후	0.40±0.04	9.91±1.25	8.74±0.60	6.92±0.70
HDL(mM/L)	전	0.94±0.07	1.05±0.02	1.10±0.05	1.08±0.05
HDL(mM/L)	후	0.91±0.05	0.44±0.04	0.59±0.05	0.65±0.07

상기 표 2의 결과에 나타낸 바와 같이, 고지질 식이에 의해 콜레스테롤과 저밀도 지단백의 수치가 증가하였지만, 감람나무 열매 추출물 투여에 의해 증가된 혈중 콜레스테롤과 저밀도 지단백 수치가 유의하게 감소되었다.

실험예 2: 동물실험을 통한 비알코올성 지방간 예방 및 치료 효과 확인

지방간 모델에서 감람나무 열매의 지방간 억제 활성을 확인하기 위해 in vivo 지방간 모델을 유도하여 실험하였다. 5주령 웅성 SD계 랫트를 구입하여 일주일간 실험실 환경에서 순화시킨 뒤 4주간 고지방식이 실험에 사용하였다. 각 군의 실험식이 조성은 아래 표 1에 나타내었다. 16시간 절식 후 에테르 마취 하에 개복하여 복부 대동맥에서 채혈한 후 상온에서 30분간 방치한 후 1500rpm 10간 원심 분리한 다음 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청에서 TG(Triglycerides), LDL(low-density lipoproteins)을 kit(아산제약)을 통해 측정하고, 혈청 내 AST, ALT, total cholesterol, ALP는 혈액분석기 Express PLUS(CHIRON, DIAGNOSTIC, USA)를 통해 AST, ALT를 측정하였다. 체중은 실험 시작 시점부터 매 2주간 측정하며, 최종투여 후 간을 적출하여 간의 무게를 측정하여 체중/간 의 비를 계산하였다(표 3). 간 조직내 총 지질(total lipid)과 콜레스테롤, 트리글리세라이드를 측정하기 위하여, 간조직을 균질화하여 얻은 샘플을 원심분리한 후 kit(아산제약)을 사용하여, 지방간 개선효과를 확인하였다(표 4). 분리된 혈청에서 TG(Triglycerides), AST, ALT, 총 콜레스테롤, ALP를 측정하였다. 또한, 간 조직내 지방을 확인하여, 단계별로 점수표를 작성하고 이를 통해 결과를 확인하였으며, 간 조직내 MDA(지질과산화 물)의 양을 측정하여, 지방간 개선효과를 확인하였다.

각 그룹의 마우스 간을 획득하였다. 각 그룹별로 획득된 마우스 간을 10% 포름알데하이드로 고정 후 파라핀 블록을 제작하고 마이크로 절편기로 잘라 조직절편을 획득하여 H＆E(Hematoxylin ＆ Eosin) 염색을 실시한 후 지방간 형성 및 개선 효과를 분석하였다.

시험군	대조군 사료(4 주)
정상 대조군	일반사료 + Water (8ml/kg)
대조군	고지질식이 (5 wt% 옥수수유, 1 wt% 콜레스테롤, 0.5 wt% 콜산, 93.5 wt% 일반사료)
HFD+감람나무 열매 추출액 0.1g/kg	고지질식이+실시예 1 감람나무 열매 추출액 0.1g/kg
감람나무 열매 추출액 0.3g/kg	고지질식이+ 실시예 1 감람나무 열매 추출액 0.3g/kg

시험군	몸무게(g)	간무게(g)	간무게/몸무게
정상 대조군	242±12.7	7.0±0.36	0.030 ±0.002
대조군	295±13.5	12.5±1.15	0.041±0.003
HFD+감람나무 열매 추출액 0.1g/kg	265±12.1	10.9±1.34	0.040±0.005
HFD+감람나무 열매 추출액 0.3g/kg	236±12.5	10.0±1.12	0.040±0.002

도 2는 본 발명에 따른 감람나무 열매 추출물의 H＆E 염색을 통한 지방간 개선 효과를 도시한 사진이다. 이때 A는 정상대조군, B는 대조군, C는 고지질식이와 함께 감람나무 열매 추출물 0.1g/kg 투여군, D는 고지질식이와 함께 감람나무 열매 추출물 0.3g/kg 투여군이다.

도 2를 참조하면, 고지질식이만 투여한 대조군(B)은 간조직에 약간의 지방층이 생겨 지방간이 유도된 것으로 사료되며, 고지질식이와 함께 감람나무 열매 추출물을 투여한 실험군(C, D)에서는 간조직에 지방층이 대조군(B)보다 덜 나타나는 것으로 보아 감람나무 열매 추출물의 투여로 지방간을 억제함을 알 수 있었다.

시험군	콜레스테롤 (mg/g)	TG (mg/g)	ALP (U/L)	MDA (umol/g liver)
정상대조군	82 ± 9.3	61.3 ± 7.6	121 ± 12.0	261 ± 26.4
대조군	446 ± 69.0	209 ± 34.7	377 ± 75.2	453 ± 38.8
HFD+감람나무 열매 추출액 0.1g/kg	325 ± 40.2	159 ± 18.5	275 ± 34.6	375 ± 24.7
감람나무 열매 추출액 0.3g/kg	225 ± 30.2	109 ± 16.0	215 ± 17.5	295 ± 11.7

도 3은 정상대조군, 대조군, 감람나무 열매 추출물 투여군의 AST(GOT), ALT(GPT) 수치를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3의 결과에 나타난 바와 같이, 지방간의 유도로 인하여 AST(GOT), ALT(GPT) 큰 폭의 상승은 있지 않았으나 감람나무 열매 추출물의 투여로 유의성 있게 낮추어 주는 것으로 나타났다. 그러나 표 4를 참조하면, 콜레스테롤, 중성지방(Triglycerides), ALP, MDA 등은 대조군의 수치가 상승하였으며, 감람나무 열매 추출물의 투여로 유의성 있게 낮추어 줌을 나타내고 있다.

<제제예 1: 약학적 제제예>

1-1. 정제의 제조

실시예 1의 감람나무 열매 추출물 60 mg

규산칼슘 20 mg

유당 130 mg

미결정셀룰로오스 100 mg

스테아린산마그네슘 적량

탈크 적량

코팅제 적량

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-2. 캅셀제의 제조

실시예 1의 감람나무 열매 추출물 60 mg

유당 160 mg

전분 적량

통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

1-3. 연질캅셀제의 제조

실시예 1의 감람나무 열매 추출물 60mg

트윈 80 175mg

PEG400 190mg

프로필렌 카보네이트 100mg

프로필렌글리콜 적량

폴록사머 407 적량

통상의 연질캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

<제제예 2 : 식품 제조예>

2-1. 건강식품의 제조

실시예 1의 감람나무 열매 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

2-1. 음료의 제조

꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량% 및 물 89.7362 중량%와 실시예 1의 감람나무 열매 추출물 10 중량%을 배합하여 통상의 방법으로 음료를 제조하였다.

Claims

감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 감람나무 열매 추출물은 에틸아세테이트 용매 추출 분획에서 분리한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
하기 화학식 1의 하이드록시타이로솔을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]
제4항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
감람나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 개선용 식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 감람나무 열매 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
하기 화학식 1의 하이드록시타이로솔을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 고지혈증의 예방 및 치료용 식품 조성물:
[화학식 1]
제9항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.