KR20150068581A

KR20150068581A - 재조합 효모를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법

Info

Publication number: KR20150068581A
Application number: KR1020130154359A
Authority: KR
Inventors: 서진호; 김수정; 서승오
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2015-06-22
Also published as: US9328358B2; KR101590993B1; US20150167027A1

Abstract

본 발명은 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)의 생합성 경로가 대사공학적으로 조절된 재조합 효모를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것으로, 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소 활성이 억제되고, 2,3-부탄다이올 생합성 관련 외래 유전자와 자일로스 대사 관련 외래 유전자가 도입된 재조합 효모를 이용하여 글루코스 또는 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 고생산성으로 생산할 수 있다.

Description

재조합 효모를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법{Method for production of 2,3-Butanediol with recombinant yeast}

본 발명은 생물학적 방법을 통해 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)을 생산하는 방법에 관한 것으로, 2,3-부탄다이올의 생합성 경로가 대사공학적으로 조절된 재조합 효모를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소 활성이 억제되고, 2,3-부탄다이올 생합성 관련 외래 유전자가 도입된 재조합 효모를 이용하여 글루코스 또는 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

바이오플랫폼 화합물은 바이오매스 유래 원료를 기반으로 하여 생물학적 또는 화학적 전환을 통해 생산된 것으로, 고분자 모노머, 신소재 등의 합성에 사용되고 있다.

바이오플랫폼 화합물 중 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)은 용매, 부동액, 가소제 합성에 이용되는 화합물질이며, 합성고무 제조에 사용되는 부타디엔(butadien), 연료첨가제인 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone), 식품첨가제로 사용되는 아세토인(acetoin), 다아아세틸(diacetyl)로의 전환이 가능하여 최근 각광을 받고 있는 소재이다.

2,3-부탄다이올의 생산은 대부분 미생물 발효를 통한 생물학적 방법으로 이루어지고 있는데, 여기에는 대사공학 기술을 이용한 신규 균주 개발 및 발효공정의 최적화가 요구된다. 또한, 기질로 작물계 바이오매스에 비해 상대적으로 저렴한 섬유소계 바이오매스를 사용할 수 있는 균주의 개발도 가격 경쟁력이 있는 2,3-부탄다이올의 생산을 위해 상당히 중요한 고려사항이라 할 수 있다.

종래에 2,3-부탄다이올 생산 균주로는 크렙실라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙실라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 애어로박터 애어로제네스(Aerobacter aerogenes) 등이 주로 이용되고 있는데, 이들 균주는 2,3-부탄다이올을 고수율 및 고생산성으로 생산할 수 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이들 대부분이 병원성 미생물로 분류되고 있어, 안전 및 산업화 측면에 제약이 따른다. 따라서, 비병원성 미생물을 이용하여 2,3-부탄다이올을 고효율로 생산할 수 있는 균주의 선별 및 개발이 요구된다.

이에 GRAS(generally recognized as safe) 미생물로 알려진 효모를 이용한 2,3-부탄다이올 생산 개발이 대안이 될 수 있다. 하지만, 야생 효모는 2,3-부탄다이올 생산 균주로 사용하기에는 다음의 한계점을 가진다.

첫 번째로, 효모는 2,3-부탄다이올 생산 박테리아와 비해 비효율적인 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 가진다.

두 번째로, 효모는 2,3-부탄다이올의 주요 전구체인 피루베이트를 에탄올 생산에 사용하기 때문에, 2,3-부탄다이올 생산 수율이 2,3-부탄다이올 생산 박테리아와 비교해 현저히 낮다.

마지막으로, 효모는 목질계 바이오매스 내 주 탄소원인 자일로스를 대사하지 못하기 때문에 목질계 바이오매스를 기질로 한, 경제적인 2,3-부탄다이올의 생산이 어렵다.

대한민국 특허공개번호 제10-2012-0107021호 (공개일자 2012년 09월 28일)에는, 비병원성 2,3-부탄다이올 생산을 위한 이종 대장균 및 제조방법으로, (a) 아세토락테이트 디카복실실레이즈(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오티드; 및 (b) 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된(cotransformed) 2,3-부탄다이올 과발현용 대장균이 기재되어 있다. 또한, 대한민국 특허공개번호 제10-2012-0128776호 (공개일자 2012년 11월 28일)에는, 2,3-부탄다이올 생산을 위한 크렙시엘라 뉴모니아 균주 및 제조방법으로, (a) 아세토락테이트 디카복실실레이즈(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 아세토락테이트 신타제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 아세토인 리덕타제(acetoin reductase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환 또는 공동 형질전환된(cotransformed) 2,3-부탄다이올 과발현용 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 균주가 기재되어 있다.

본 발명에서는 효모로 알려진 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하여, 글루코스 또는 자일로스로부터 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)을 고생산성으로 생산하는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 제1형태로, 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되고, 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고, 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다.

효모로 불리우는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)생산에 있어서 에탄올 생산이 가장 큰 장애물로 여겨지는데 이는 2,3-부탄다이올 생산을 위한 전구체인 피루베이트가 2,3-부탄다이올 생합성 보다는 에탄올 생합성에 사용되기 때문이다(하기 참고도 1 참조). 이러한 맥락에서 본 발명에서는 기본적으로 피루베이트 데카르복실라아제가 결여된 균주를 사용하고자 하였다. 또한, 추가적으로 아세토락테이트 신타아제, 아세토락테이트 데카르복실라아제, 부탄다이올 데하이드로지나아제가 발현되도록 추가적으로 형질전환된 균주를 사용하고자 하였다. 일반적으로 박테리아에서의 2,3-부탄다이올 생합성은 피루베이트가 아세토락테이트 신타아제에 의하여 아세토락테이트(acetolactate)로, 아세토락테이트 데카르복실라아제에 의하여 아세토인(acetoin)으로 전환되며, 최종적으로 부탄다이올 데하이드로지나아제 효소에 2,3-부탄다이올로 전환된다. 하지만, 효모의 경우, 아세토락테이트 데카르복실라아제 유전자가 존재하지 않기 때문에 비효소적 반응을 통하여 아세토락테이트가 다이아세틸(diacetyl)로 전환되며, 부탄다이올 데하이드로지나아제 효소에 의하여 아세토인과 2,3-부탄다이올로 전환되게 된다. 이 경로 이외에도 피루베이트 또는 아세트알데히드(acetaldehyde)의 중합에 의하여 아세토인이 생성될 수 있지만 효모에서 과량의 2,3-부탄다이올을 생산하기에는 아세토인의 양이 충분하지 않다고 보고되고 있다 (하기 참고도 1 참조 요망). 따라서, 피루베이트로부터 아세토락테이트를 경유하여 아세토인이 생성되는 경로를 강화할 필요가 있는 것이다.

결론적으로, 본 발명에서는 2,3-부탄다이올을 효율적으로 생산하기 위하여 2,3-부탄다이올 생합성 전구체인 피루베이트를 축적할 수 있도록 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주를 구축하였고, 2,3-부탄다이올 생합성 경로 보강을 위하여 아세토락테이트 신타아제, 아세토락테이트 데카르복실라아제를 도입하고, 효모 내부의 부탄다이올 데하이드로지나아제의 과발현을 진행하여 글루코스로부터 2,3-부탄다이올을 효율적으로 생산한 것이다.

한편, 본 발명의 제1형태에 있어서, 상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능 소실은, 바람직하게 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC 1 유전자 및 피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)를 암호화하는 PDC5 유전자 각각의 일부가 파쇄되거나, 전부가 제거함으로써 달성가능하다.

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 동질 효소(isozyme)로 피루베이트 데카르복실라아제 1, 피루베이트 데카르복실라아제 5, 피루베이트 데카르복실라아제 6을 가지고 있다. 하지만 기존 보고에 따르면 피루베이트 데카르복실라아제 1, 피루베이트 데카르복실라아제 5를 암호화하는 PDC1, PDC5 유전자의 파쇄만으로도 전체 피루베이트 데카르복실라아제 활성이 제거된다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 바람직하게 PDC1, PDC5 유전자 파쇄를 통하여 전체 피루베이트 데카르복실라아제 활성이 제거된 균주를 구축하였다.

한편, 본 발명의 제1형태에 있어서, 상기 재조합 피루베이트 데카르복실라아제 결여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 바람직하게 글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자가 변형된 것이 좋다.

상기 피루베이트 데카르복실라아제 결여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 2,3-부탄다이올 생산 모균주로 사용하기 위하여 다음의 두 가지 단점을 가지고 있다. 첫 번째로 피루베이트 데카르복실라아제 효소 비활성으로 인하여 라이신과 지방산 합성에 사용되는 전구체인 아세트알데히드의 생성이 차단되기 때문에 아세트알데히드를 합성할 수 있도록 외부에서 C₂ 화합물 (에탄올 또는 아세테이트)을 첨가해야만 균주가 생존할 수 있다. 또한, 이 균주는 에탄올 생합성 경로의 차단으로 인해 세포 내에 축적된 NADH를 호흡을 통하여 재산화시켜야만 한다. 하지만, 글루코스가 호흡 관련 효소들의 발현을 억제함으로 호흡 과정이 억제되고 결과적으로 세포 내 과량의 NADH가 축적되어 궁극적으로 세포의 성장이 지연되는 특징을 보인다.

따라서, 이 문제를 해결해야 하는데, 본 발명에서는, 글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자를 변형시킴으로써 달성가능함이 확인되었다.

일반적으로 Mth1 효소는 글루코스 유입에 관여하는 헥소스 트랜스포터(hexose transporter)를 암호화하는 HXT 유전자의 전사를 억제한다. 만약 세포 외부에 글루코스가 존재할 경우, Mth1은 카세인 키나아제 I (casein kinase I)에 의하여 인산화되고 결국 분해된다. Mth1의 분해로 인하여 억제된 HXT 유전자의 전사가 회복되고, 그 결과 글루코스가 세포 내로 유입되게 된다. 과도한 글루코스 유입은 균주의 에탄올 합성 경로의 차단에 따른 세포 내 피루베이트 축적 및 레독스(redox) 불균형을 불러일으켜 균주가 글루코스 배지 내에서 성장하지 못하도록 한다.

그런데, 본 발명에서와 같이, Mth1 효소가 카세인 키나아제 I (casein kinase I)에 의하여 인산화된 후, 분해되지 않도록 Mth1 효소에 유전적 변이를 가하면 글루코스 배지 내에서도 성장할 수 있게 되는 것이다. 유전적 변이는 Mth1 효소가 카세인 키나아제 I에 의해 인산화되지 않도록 Mth1 유전자에 변이를 주면 되는데, 래보래토리 이볼루션(laboratory evolution) 또는 점돌연변이(point mutation) 등 본 발명의 기술분야에서 이미 구축된 다양한 유전공학적 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 래보래토리 이볼루션에 따른 진화공법으로 MTH1 유전자의 241번째 G 염기가 C염기로 변이되었고, 이로 인하여 81번째 아미노산이 알라닌에서 프롤린으로 변경된 변이주를 선별할 수 있었다. 다만, 본 발명에서는 래보래토리 이볼루션(laboratory evolution)에 따른 진화공법에 의해 상기와 같은 변이가 일어난 균주를 선별하였지만, 본 발명에서 수행한 유전자 분석을 통해 MTH1 유전자 상의 상기와 같은 모균주와의 차이점을 확인하였기 때문에, 모균주에 대해 점돌연변이(point mutation)을 가하는 방법을 통해서도 MTH1 유전자의 241번째 G 염기가 C염기로 변이되고, 이로 인하여 81번째 아미노산이 알라닌에서 프롤린으로 변경된 변이 균주를 얼마든지 구축할 수 있을 것이다.

한편, 본 발명은 제2형태로, 자일로스 리덕타아제(xylose reductase) 및 자일리톨 데하이드로지나아제(xylitol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환되고, 자이룰로오스 키나아제(xylulose kinase)가 발현되도록 형질전환되며, 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되고, 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고, 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다.

본 발명의 제2형태는 본 발명의 제1형태 균주와 대비하여 볼 때, 자일로스를 대사하기 위하여 필요한 효소를 발현하도록 추가적으로 형질전환된 것에 특징이 있다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 산업적으로 에탄올 생산 균주로 사용되지만, 자일로오스를 탄소원으로 이용하지는 못한다. 이는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 자일로오스 리덕타아제(xylose reductase; XR)와 자일리톨 데하이드로지나아제(xylitol dehydrogenase; XDH)를 갖고 있지 않아 자일로오스를 자일룰로오스(xylulose)로 전환하는 대사활성이 없기 때문이다. 따라서, 자일로오스로부터 2,3-부탄다이올을 생산하기 위해서는 XR과 XDH 효소를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 도입해야 한다. XR과 XDH가 도입되어 형질전환된 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 자일로오스는 자이룰로오스로 전환되며, 자일룰로오스는 추가적으로 도입된 자이룰로키나아제(xylulokinase; XK)에 의해 자이룰로오스 5-포스페이트(xylulose 5-phosphate)로 전환되어, 5탄당 인산회로를 통해 대사가 진행된다. XK는 효모 내에 존재하는 효소이기는 하나 이를 과발현하지 않고 XR과 XDH만 균주 내로 도입하면, 자일로오스로부터 2,3-부탄다이올을 생산할 수는 있지만, 생산 수율 및 생산성이 현저히 낮은 문제가 있다. 따라서 이를 해소하기 위해서는 XK도 과발현시키는 것이 좋다(하기 참고도 1 참조).

한편, 본 발명의 제2형태에 있어서, 상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능 소실은, 바람직하게 피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC 1 유전자 및 피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)를 암호화하는 PDC5 유전자 각각의 일부가 파쇄되거나, 전부가 제거함으로써 달성가능하다.

한편, 본 발명의 제2형태에 있어서, 상기 자일로스 대사 가능한 피루베이트 데카르복실라아제 결여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 바람직하게 글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자가 변형된 것이 좋다. MTH1 유전자의 유전적 변이에 따른 구체적인 작용 및 효과에 대한 설명은 상기 본 발명의 제1형태에서 충분히 설명하였으므로, 그 설명한 것으로 대체하기로 한다.

한편, 본 발명은 제3형태로, 글루코스를 함유하는 배지에 상기 본 발명 '제1형태' 또는 제1형태에 추가적으로 글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자가 변형된 형태’의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서는 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase) 효소의 활성 제거와 2,3-부탄다이올 생합성 경로의 강화를 통하여 2,3-부탄다이올을 효율적으로 생산할 수 있는 효모를 구축하였으며, 특히 유가식 배양을 통하여 최종 96.2 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이 결과는 본 발명에서 구축한 재조합 효모를 이용하여 산업적 스케일의 2,3-부탄다이올 생산 가능성을 의미한다.

한편, 본 발명의 제3형태에 있어서, 상기 배양은 산소를 공급하면서 수행하는 것이 좋다. 글루코스로부터 2,3-부탄다이올 생산 시 해당과정에서 두 분자의 NADH가 생성되지만, 그 중 한 분자만이 2,3-부탄다이올을 생산하는데 전환되므로 레독스(redox) 평형 상태가 되지 않는다. 따라서 NADH 재산화를 위한 산소의 공급은 2,3-부탄다이올 생산에 주요 요소가 될 것이다. 본 발명의 실험에 의할 경우, 산소의 공급이 증가됨에 따라 글루코스 소모 속도와 세포 생장이 촉진되는 경향을 보였고, 2,3-부탄다이올의 생산성도 증가하였으나 과량의 산소를 공급할 경우, 주산물이 2,3-부탄다이올이 아닌 아세토인이 생성되기 때문에 최적의 산소 공급이 요구된다.

한편, 본 발명의 제3형태에 있어서, 상기 배양은 바람직하게 글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다. 기질이 지속적으로 공급되는 유가식 배양을 통해 2,3-부탄다이올의 생산량을 높일 수 있다.

한편, 본 발명은 제4형태로 자일로스를 함유하는 배지에 상기 '제2형태' 또는 ‘제2형태에 추가적으로 글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자가 변형된 형태’의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서는 글루코스보다 경제적인 기질인 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 생산하고자, 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소의 활성을 제거한 효모에 자일로스 대사 유전자를 도입하여 자일로스로부터 2,3-부탄다이올의 주요 전구체인 피루베이트를 축적하는 균주를 구축하였고, 2,3-부탄다이올 생합성 경로의 강화를 통하여 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 효율적으로 생산할 수 있는 효모를 구축하였다. 이 효모를 이용할 경우, 약 80 g/L 자일로스로부터 약 20 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있음이 확인되었다. 또한, 유가식 배양을 통하여 글루코스 자일로스 혼합당에서 52.2 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한, 2,3-부탄다이올은 이성질체 중 (R, R)-2,3-부탄다이올만이 선택적으로 생산됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 본 발명의 재조합 효모를 이용하여 목질계 바이오매스 기반의 경제적인 2,3-부탄다이올 생산이 가능함을 의미하는 것이다.

한편, 본 발명의 제4형태에 있어서, 상기 배지는 바람직하게 글루코스를 추가로 포함하는 것이 좋다. 자일로스를 포함하는 배지에 글루코스를 추가로 첨가함으로써 배양 균주의 성장을 더욱 도모할 수 있어 바람직하다.

한편, 본 발명의 제4형태에 있어서, 상기 배양은 바람직하게 산소를 공급하면서 수행하는 것이 좋다. 본 발명에서 산소의 공급에 따른 레독스 평형 복구에 관한 기술적 의의는 상기 본 발명의 제3형태 설명에서 이미 서술하였으므로, 그 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

한편, 본 발명의 제4형태에 있어서, 상기 배양은 바람직하게 자일로스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다. 2,3-부탄다이올 생산의 기질이 되는 자일로스를 지속적으로 공급함으로써 자일로스의 생산량을 더욱 향상시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 제4형태에 있어서, 글루코스가 배지에 추가로 포함된 경우, 상기 배양은 바람직하게 자일로스 및 글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다. 자일로스 및 글루코스를 지속적으로 공급함으로써, 2,3-부탄다이올의 생산성 향상과 균주의 지속적 성장을 도모할 수 있다.

종래의 효모를 이용할 경우, 미량의 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)을 생산할 수 밖에 없었으나, 본 발명에서는 2,3-부탄다이올을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 효모를 구축하였고, 발효공정 최적화를 통하여 고생산성으로 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있음을 확인하였다.

또한, 추가적으로 2,3-부탄다이올의 경제적 생산성을 높이고자, 기질로 목질계 유래의 자일로스를 이용할 수 있는 시스템도 구축하였는데, 자일로스로부터 2,3-부탄다이올이 고생산성으로 생산될 수 있음을 확인하였다.

도 1에서 (A)는 PDC1과 PDC5 유전자 파쇄를 확인시켜주는 사진으로, PDC1과 PDC5 유전자의 파쇄는 SOS4 균주의 짧아진 유전자 PCR 단편(1번: PDC1 유전자 PCR 단편, 2번: PDC5 유전자 PCR 단편, 3번: PDC6 유전자 PCR 단편, M: 사이즈마커)으로 확인되었다. 도 1에서 (B)는 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 결여 균주(SOS2)와 글루코스 대사 가능 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주(SOS4)의 생장을 확인시켜 주는 사진이다 (YPE20: 2% 에탄올, YPD20: 2% 글루코스, YPD100: 10% 글루코스를 함유한 YP 배지).
도 2는 글루코스 대사 가능한 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주들(TAM 균주와 SOS4 균주)의 MTH1 유전자 변이 비교 결과이다.
도 3은 SOS4 균주의 발효 양상을 보여준다. (A) 미세호기 조건에서 2% 글루코스를 함유한 YP배지, (B) 호기 조건에서 2% 글루코스를 함유한 YP배지.
도 4는 BD4 균주와 대조군 균주의 미세호기 조건에서 글루코스 소모와 2,3-부탄다이올 생산을 비교한 결과이다. (A) 2% 글루코스를 포함한 YP배지에서의 대조군, (B) 2% 글루코스를 포함한 YP배지에서의 BD4, (C) 10% 글루코스를 포함한 YP배지에서의 BD4.
도 5는 여러 산소 조건에서 BD4의 발효 양상을 보여준다. (A) 0 vvm, 300 rpm, (B) 0.25 vvm, 300 rpm, (C) 1.0 vvm, 300 rpm, (D) 1.0 vvm, 500 rpm.
도 6은 BD4 균주의 유가식 배양 결과이다.
도 7은 자일로스를 함유한 YP 배지에서 SOS4X 균주의 발효 양상을 보여준다.
도 8은 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 자일로스로부터 2,3-부탄다이올 생산 결과를 보여준다. (A) 4% 자일로스를 포함한 YP배지에서의 대조군, (B) 4% 자일로스를 포함한 YP배지에서의 BD4X.
도 9는 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 고농도 자일로스 및 '글루코스와 자일로스 혼합당'으로부터 2,3-부탄다이올 생산 결과를 보여준다. (A) 8% 자일로스를 포함한 YP배지, (B) 2% 글루코스과 8% 자일로스를 포함한 YP배지.
도 10은 BD4X 균주에 의해 생성된 2,3-부탄다이올의 이성체의 가스 크로마토그래피(Gas chromatography)를 통한 분석 결과이다. (A) 아세토인과 2,3-부탄다이올 표준물질(standard), (B) BD4X 균주가 글루코스를 대사하여 생성한 2,3-부탄다이올 이성체, (C) BD4X 균주가 자일로스를 대사하여 생성한 2,3-부탄다이올 이성체.
도 11은 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 제한된 글루코스를 공급한 자일로스 유가식 배양 결과이다.
도 12는 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 글루코스과 자일로스 유가식 배양 결과이다.

본 발명에서는 하기 참고도 1과 같은 대사공학적 기법을 이용하여 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol) 고생산성 재조합 효모를 개발하고, 이를 이용하여 글루코스 또는 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 고생산성으로 생산하고자 하였다.

[참고도 1]

우선, 효모의 주된 부산물인 에탄올 생성을 억제하기 위하여 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소를 암호화하는 PDC1과 PDC5 유전자를 파쇄하였다.

또한, 2,3-부탄다이올의 비효율적인 생합성 경로를 우회하고자 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase), 아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase) 유전자를 도입하였고, 추가적으로 효모 내부의 부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase) 유전자를 과발현하였다.

또한, 목질계 바이오매스 유래 기질인 자일로스를 이용하기 위하여 자일로스 대사 관련 유전자 자일로스 리덕타아제(xylose reductase), 자일리톨 데하이드로지나아제(xylitol dehydrogenase), 자이룰로오스 키나아제(xylulose kinase)를 도입하여, 자일로스로 부터 2,3-부탄다이올을 고수율로 생산할 수 있는 균주도 구축하였다.

본 발명에서 구축한 균주의 배양(회분식, 유가식) 결과를 표 1에 정리하였다.

구축된 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 2,3-BD 생산

균주 (균주특징)	배양법	탄소원	2,3-BD 생산량 (g/L)	2,3-BD 수율 (g 2,3-BD/g 탄소원)	2,3-BD 생산성 (g/L·h)
BD4 - 피루베이트 데카르복실라아제 결여 - alsS , alsD , BDH1 유전자 과발현	회분식	글루코스	34.8	0.36	0.32
BD4 - 피루베이트 데카르복실라아제 결여 - alsS , alsD , BDH1 유전자 과발현	유가식	글루코스	96.2	0.28	0.39
BD4X - 피루베이트 데카르복실라아제 결여 - XYL1 , XYL2 , XYL3 유전자 도입 - alsS , alsD , BDH1 유전자 과발현	회분식	자일로스	20.7	0.27	0.18
	유가식	글루코스¹ ⁾ 자일로스	43.6	0.25	0.16
	유가식	글루코스² ⁾ 자일로스	49.6	0.26	0.19

¹⁾ 글루코스 제한적 자일로스 유가식 배양

²⁾ 글루코스 자일로스 동시에 고농도로 공급

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: PDC1 과 PDC5 유전자 파쇄를 통하여 에탄올을 생성하지 않고 글루코스로부터 피루베이트를 축적하는 균주( SOS4 ) 구축]

(1) 개요

야생 효모에 박테리아 유래의 2,3-부탄다이올 생합성 경로의 도입은 에탄올의 생산으로 인하여 상대적으로 낮은 2,3-부탄다이올 수율을 보이기 때문에 효율적이기 못하였다.

따라서, 우리는 효율적인 2,3-부탄다이올 생산을 위하여 효모의 에탄올 생합성 경로가 차단되고, 이로 인하여 2,3-부탄다이올 전구체인 피루베이트를 축적할 수 있는 모균주 (SOS2)를 구축하고자 하였다. 또한, 글루코스 대사 가능 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주 (SOS4)를 만들고자 하였다.

(2) 재료 및 방법

가. 균주 및 플라스미드

피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 결여 균주 (SOS2) 및 글루코스 대사 가능 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주 (SOS4)를 만들기 위한 모균주로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) D452-2를 사용하였다. 유전자 조작을 위하여 에스체리키아 콜리아(Escherichia coli) Top 10을 사용하였다. 본 실험에 사용된 균주와 플라스미드, PDC1 및 PDC5 결여 균주 제작을 위해 사용된 프라이머는 각각 표 2과 표 3에 명시하였다.

본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드

균 주
이 름	설 명	출 처
D452-2	Saccharomyces cerevisiae , MAT, leu2, his3, ura3, and can1	Hosaka, 1992^a
SOS2	D452-2 Δ pdc1, Δ pdc5	본 연구
SOS4	D452-2 Δ pdc1, Δ pdc5 (C₂ 독립적 고농도 글루코스에서 진화된 균주)	본 연구
SOS4X	SOS4 ura3::URA3 pSR6-X123	본 연구
CON	SOS4 (pRS426GPD, pRS423GPD, pRS425GPD)	본 연구
BD4	SOS4 (pRS426_AlsS, pRS423_AlsD, pRS425_BDH1)	본 연구
CON-X	SOS4X (pRS423GPD, pRS425GPD)	본 연구
BD4X	SOS4X (pRS423_AlsS_AlsD, pRS425_BDH1)	본 연구
플라스미드
이 름	설 명	출 처
pRS426GPD	URA3, GPD promoter, CYC1 terminator, 2μ origin, Amp^r	Christianson, 1992^b
pRS423GPD	HIS3, GPD promoter, CYC1 terminator, 2μ origin, Amp^r	Christianson, 1992^b
pRS425GPD	LEU2, GPD promoter, CYC1 terminator, 2μ origin, Amp^r	Christianson, 1992^b
pRS306
pRS426_AlsS	pRS426GPD 플라스미드에 Bacillus subtilis str.168 유래 alsS 유전자 함유	본 연구
pRS423_AlsD	pRS423GPD 플라스미드에 B. subtilis str.168 유래 alsD 유전자 함유	본 연구
pRS423_AlsS_AlsD	pRS423GPD 플라스미드에 B. subtilis str.168 유래 alsS, alsD 유전자 함유	본 연구
pRS425_BDH1	pRS425GPD 플라스미드에 S. cerevisiae D452-2 유래 BDH1 유전자 함유	본 연구
pSR6-X123	pRS306 TDH3 _P -XYL1-TDH3 _T , PGK1 _P -XYL2-PGL1 _T , TDH3 _P -XYL3-TDH3 _T	Kim et al. 2012^c

^aHosaka, K., Nikawa, J., Kodaki, T., Yamashita, S., (1992) A dominant mutation that alters the regulation of INO1 expression in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biochemistry-Tokyo 111, 352-358.

^bChristianson, T.W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H., Hieter, P., (1992) Multifunctional yeast high-copy number shuttle vectors. Gene 110, 119-122.

^cKim, S. R., Ha, S. J., Kon, I. I., Jin, Y. S., (2012) High expression of XYL2 coding for xylitol dehydrogenase is necessary for efficient xylose fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering 14, 336-343.

본 발명에 사용된 프라이머 (밑줄은 제한효소 사이트)

PDC1 파쇄
목표 DNA (제한효소)	염기서열
F-d_ PDC1 -1(XbaI)	GCTCTAGACTTGAAAAAGGAACAAGCTC
R-d_ PDC1 -2	GATTTGACTGTGTTATTTTG
F-d_ PDC1 -3(AscI)	CAAAATAACACAGTCAAATCGGCGCGCCTTTTTATGTAACGAAAAATAAATTGGTTCATATTATTACTGATTCGGTAATCTCCGA
R-d_ PDC1 -4(XbaI)	GCTCTAGATGCTTATAAAACTTTAACTAATAATTAGAGATTAAATCGCGGGTAATAACTGATATAATTA
R-d_ PDC1 - check	GACTGTCGGCAACTTCTTG
PDC5 파쇄
목표 DNA (제한효소)	염기서열
F_d_ PDC5 -1 (XbaI)	GCTCTAGAAGGTTCAAAGACTCTATAAG
R-d_ PDC5 -2	GTTCTTCTTGTTATTGTATTG
F-d_ PDC5 -3 (AscI)	CAATACAATAACAAGAAGAACGGCGCGCCTAGTATAATAAATTTCTGATTTGGTTTAAAATATCAACTAGATTCGGTAATCTCCGAA
R-d_ PDC5 -4 (XbaI)	GCTCTAGA CTATATCTATGCCAATTATTTACCTAAACATCTATAACCTGGGTAATAACTGATATAATTA
R-d_ PDC5 - check	AGGTACAAAACCGAATACG
유전자 복제
목표 DNA (제한효소)	염기서열
F_ AlsS (BamHI)	CGGGATCCATGTTGACAAAAGCAACAAAAGA
R_ AlsS (XhoI)	CCGCTCGAGCTAGAGAGCTTTCGTTTTCA
F_ AlsD (BamHI)	CGGGATCCAAAATGAAACGAGAAAGCAACATTC
R_ AlsD (XhoI)	CCGCTCGAGTTATTCAGGGCTTCCTTCAG
F_ BDH1 (BamHI)	CGGGATCCAAAATGAGAGCTTTGGCATATTTC
R_ BDH1 (XhoI)	CCGCTCGAGTTACTTCATTTCACCGTGATTG

나. 배지 및 배양 조건

에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)는 50 μg/mL 암피실린이 포함된 LB(Lysogeny broth) 배지에서 배양하였고, 효모는 2%(w/v) 글루코스를 함유한 YP (10 g/L yeast extract, 20 g/L Bacto peptone) 배지에서 배양하였다. 형질전환 효모를 선별하기 위해서는 선택배지인 YSC (6.7 g/L Yeast Nitrogen Base (YNB), 2% 글루코스, 적절한 아미노산) 배지를 사용하였다.

다. 효모 형질 전환

피루베이트 데카르복실라제(Pyruvate decarboxylase) 효소 관련 유전자 파쇄를 위한 카세트(cassette) 및 2,3-부탄다이올 생합성 유전자 과발현을 위한 플라스미드 삽입은 'EZ-Transformation kit (BIO 101, Vista, CA)'를 사용하였고 YSC 배지에서 선별하였다. 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주 제작 시 URA 마커 재생을 위하여 FOA 배지를 사용하였다.

라. PDC1, PDC5 유전자 파쇄 및 래보래토리 이볼루션(laboratory evolution)

PDC1과 PDC5 유전자의 파쇄는 PCR에 의하여 증폭된 유사 염기 서열과 URA3 마커 회수 방법을 이용하였는데, 그 과정은 하기 참고도 2(PCR을 이용한 PDC1 유전자 파쇄 모식도)와 같았다.

[참고도 2]

PDC1 , PDC5 유전자 파쇄 카세트는 상기 표 3에 명시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 획득하였고, 파쇄 카세트가 삽입되어 PDC1 유전자가 파쇄된 형질 전환체는 우라실 아미노산이 제거된 YSC 선택 배지에서 선별하였다. 이 형질 전환체를 YP 배지에서 24시간 동안 배양 후 URA3 마커 회수를 위하여 FOA 플레이트에서 배양하였다. 마커가 회수된 PDC1 파쇄 균주에, PDC5 유전자도 위와 같은 방법으로 추가 파쇄하여 피루베이트 데카르복실라아제 활성이 제거된 SOS2 균주를 구축하였다.

한편, C₂ 화합물에 독립적인 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주를 만들기 위하여 C₂ 화합물인 아세테이트의 양을 점진적으로 줄이며 계대배양하였다. 또한, 이 균주를 고농도 글루코스를 대사할 수 있는 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주로 만들기 위하여 C₂ 화합물에 독립적으로 진화된 균주를 배지 내 글루코스의 양을 점차적으로 늘려 계대배양하였다. 총 10회의 계대배양을 수행하였고, 그 결과 C₂ 화합물에 독립적이며 고농도 글루코스를 대사할 수 있는 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주(SOS4)를 구축하였다.

(3) 결과

에탄올 생합성 경로를 차단하기 위하여 PDC1과 PDC5 유전자의 파쇄를 시행하여 피루베이트 데카르복실라아제 효소의 활성이 제거된 균주(SOS2)를 구축하였다. 하지만 SOS2 균주는 글루코스 배지에서 성장하지 못하며 아세테이트 또는 에탄올과 같은 C₂ 화합물을 공급한 배지에서만 생장하는 모습을 보였다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 배지 내 C₂ 화합물의 농도를 줄이고, 글루코스 농도를 늘리는 진화공법을 이용하여 C₂ 화합물에 독립적이며 글루코스에서 생존 가능한 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주(SOS4)를 선별하였다.

도 1의 (A)는 SOS4 균주의 PDC1과 PDC5 유전자 파쇄를 확인시켜주는 사진으로, PDC1과 PDC5 유전자의 파쇄는 SOS4 균주의 짧아진 PCR 단편(1번: PDC1 유전자 PCR 단편, 2번: PDC5 유전자 PCR 단편, 3번: PDC6 유전자 PCR 단편, M: 사이즈마커)으로 확인되었다. 도 1 (A)에서, Δ PDC1은 PDC1 유전자만 파쇄된 것이고, SOS4는 PDC1 및 PDC5 유전자가 모두 파쇄된 것이다.

도 1의 (B)에서 보는 바와 같이 SOS2 균주는 에탄올 배지에서는 생장하지만, 2%(w/v), 10%(w/v) 글루코스 배지에서는 생장하지 못하는 반면, SOS4 균주는 에탄올 배지를 비롯하여 글루코스 배지에서도 생장하였다. 도 1에서 (B)는 SOS2 균주와 진화된 SOS4 균주의 생장을 확인시켜 주는 사진이다 (YPE20: 2% 에탄올, YPD20: 2% 글루코스, YPD100: 10% 글루코스를 각각 함유한 YP 배지).

[실시예 2: 상기 실시예 1에서 구축한 C2 화합물에 독립적이며, 글루코스 대사가 개선된 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 결여 균주(SOS4)의 유전자 분석]

(1) 개요

상기 SOS4 균주에서, C₂ 화합물에 독립적이며 글루코스 대사가 개선된 형질에 기여한 유전적 변이를 찾고자, 넥스트 제너레이션 게놈 시퀀싱(Next generation genome sequencing)을 수행하였다.

(2) 재료 및 방법

야생 효모 D452-2와 글루코스 대사가 가능하도록 진화된 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주(SOS4)의 유전체(genomic) DNA를 추출하여 유전체의 염기서열을 비교하였다. 'TruSeq DNAseq sample prep kit'를 이용하여 'shotgun DNAseq libraries'를 만들어, 이 라이브러리를 qPCR을 통하여 정량화 한 후 'TruSeq SBS sequencing kit'를 사용하여 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.

(3) 결과

SOS4 균주에서, 글루코스 감지 조절 유전자인 MTH1 유전자의 241번째 G 염기가 C염기로 변이되었고, 이로 인하여 81번째 아미노산이 알라닌에서 프롤린으로 변경되었음을 확인하였다.

일반적으로 Mth1 효소는 글루코스 유입에 관여하는 헥소스 트랜스포터(hexose transporter)를 암호화하는 HXT 유전자의 전사를 억제한다. 만약 세포 외부에 글루코스가 존재할 경우, Mth1은 카세인 키나아제 I (casein kinase I)에 의하여 인산화되고 결국 분해된다. Mth1의 분해로 인하여 억제된 HXT 유전자의 전사가 회복되고, 그 결과 글루코스가 세포 내로 유입되게 된다. 따라서 과도한 글루코스 유입은 SOS2 균주의 에탄올 합성 경로의 차단에 따른 세포 내 피루베이트 축적 및 레독스(redox) 불균형을 불러일으켜 SOS2 균주가 글루코스 배지 내에서 성장하지 못하게 하도록 한다.

이와 반대로 본 발명에서 구축한 Mth1 돌연변이 균주 SOS4는, 외부에 글루코스가 존재하더라도, Mth1 효소 변형으로 Mth1이 분해되지 못하고 이로 인해 HXT 유전자의 전사가 회복되지 못하여, 글루코스의 유입이 천천히 진행된다. 이렇게 지연된 글루코스의 유입은 에탄올 합성 경로의 차단에 따른 세포 내 피루베이트 축적 및 레독스 불균형을 완화시켜 글루코스 배지에서도 느리게나마 SOS4 균주가 성장하게 하는 것이다.

최근 보고된 연구에 따르면, 글루코스에서의 생장 저해가 완화된 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주(TAM)의 Mth1 효소의 분해에 관여하는 인산화 부위와 PEST 부위를 포함하는 부분의 염기 제거가, Mth1 효소의 분해를 억제시키고, 그 결과 Mth1 변이 균주의 글루코스 대사 억제 작용이 해소되었음을 보고하였다. 아마도 우리가 발견한 241번째 염기의 변이에 의한 아미노산의 변형도 이와 유사하게 Mth1의 분해 억제를 야기하고, 그 결과 C₂ 독립적이며, 글루코스 대사능이 개선된 특징을 부여한 것으로 생각된다.

도 2는 글루코스 저항성을 보이는 두 피루베이트 데카르복실라아제 결여 변이 균주(TAM 균주와 SOS4 균주)의 MTH1 유전자 변이 비교 결과이다.

[실시예 3: SOS4 균주의 피루베이트 축적 확인]

(1) 개요

SOS4의 생장 및 피루베이트 축적 양상을 확인하기 위하여 2% 글루코스를 함유한 YP 배지에서 미세호기와 호기적 조건에서 회분식 배양을 수행하였다.

(2) 재료 및 방법

플라스크를 이용한 발효 실험을 위하여 2%(w/v) 글루코스를 함유한 선택 배지(YSC) 5 mL에서 전배양을 수행하였다. 2%(w/v) 또는 10%(w/v) 글루코스를 함유한 50 mL YP 배지에 초기 OD 1로 세포를 접종하여 회분식 배양을 수행하였다. 미세 호기 조건을 위하여 교반 속도를 80 rpm으로 유지하였다.

(3) 결과

미세호기 조건에서 SOS4 균주는 120 시간에 걸쳐 2% 글루코스를 소모하여 약 4.5 g/L의 피루베이트를 배지 내에 축적하였고, 호기적 조건에서는 그보다 빠르게 글루코스를 소모하며, 약 4 g/L의 피루베이트를 축적하였다. 이러한 SOS4 균주의 피루베이트의 축적 및 에탄올 생산의 억제 양상은 피루베이트 데카르복실라아제(pyruvate decarboxylase) 효소의 활성이 완전히 제거됐음을 의미한다.

도 3은 SOS4 균주의 발효 양상을 보여주는데, (A)는 미세호기 조건에서 2% 글루코스를 함유한 YP배지, (B)는 호기 조건에서 2% 글루코스를 함유한 YP배지에서의 발효 양상이다.

[ 실시예 4: 2,3- 부탄다이올 생합성 경로가 보강된 피루베이트 데카르복실라아제 결여 효모( BD4 )의 2,3- 부탄다이올 생산]

(1) 개요

SOS4 균주가 에탄올을 생성하지 않고 피루베이트를 축적함을 보였기 때문에, 축적된 피루베이트를 2,3-부탄다이올로 효율적으로 전환하기 위하여, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 alsS, alsD 유전자를 도입하고 효모 내 BDH1 유전자를 과발현하여 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 보강하였다.

(2) 재료 및 방법

2,3-부탄다이올 생합성 유전자인 alsS , alsD , BDH1의 복제를 위해 사용된 프라이머는 상기 표 2과 표 3에 명시하였다. alsS, alsD, BDH1 유전자를 포함하는 pRS426_alsS, pRS423_alsD, pRS425_BDH1 플라스미드는 항시 발현 GPD 프로모터의 조절 하에 SOS4 균주에 도입되었다. 유전자 조작을 위하여 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) Top 10을 사용하였다.

(3) 결과

상기의 방법을 통해 alsS, alsD, BDH1 유전자가 도입된 BD4 균주를 구축하였고, 이 균주는 에탄올 생산 없이 32시간 내에 20 g/L의 글루코스로부터 약 6 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 또한, 글루코스 소모 속도도 대조군과 비교하여 4배 이상 향상되었다. 2,3-부탄다이올의 양을 증가시키기 위하여 10% 글루코스를 함유한 YP 배지에서 회분식 배양을 시행하였다. 그 결과 BD4 균주는 120시간 동안 100 g/L의 글루코스를 소모하여 높은 수율(0.34 g 2,3-부탄다이올/g 글루코스)과 생산성(0.26 g/Lh)을 나타내며 약 32 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다.

도 4는 BD4 균주와 대조군 균주의 미세호기 조건에서 글루코스 소모와 2,3-부탄다이올 생산을 비교한 결과인데, (A)는 2% 글루코스를 포함한 YP배지에서의 대조군, (B)는 2% 글루코스를 포함한 YP배지에서의 BD4, (C)는 10% 글루코스를 포함한 YP배지에서의 BD4이다.

[ 실시예 5: 2,3- 부탄다이올 생산에 산소 공급의 영향 조사]

(1) 개요

글루코스로부터 2,3-부탄다이올 생산시 해당과정에서 두 분자의 NADH가 생성되지만 그 중 한 분자만이 2,3-부탄다이올을 생산하는데 전화되므로 레독스(redox) 평형 상태가 되지 않는다. 따라서 NADH 재산화를 통한 NAD+ 재생을 위한 산소의 공급이 2,3-부탄다이올 생산에 주요 요소로 생각된다. 특히 호기적 조건에서 글리세롤 생성의 억제 양상은 산소에 의하여 증가된 호흡을 통하여 세포질 내 NADH 재산화가 이루어졌음을 짐작할 수 있다.

따라서, 글리세롤과 아세토인 같은 부산물의 생성 억제를 통하여 2,3-부탄다이올을 효율적으로 생산하기 위하여 최적의 산소 조건 탐색을 실시하였다. 산소 공급과 2,3-부탄다이올 생산의 상관 관계를 연구하기 위하여 100 g/L 글루코스를 공급한 후 다양한 산소 공급 조건에서 회분식 배양을 수행하였다.

(2) 재료 및 방법

산소 공급량 (0, 0.25, 1 vvm)과 교반 속도 (300, 500 rpm)의 조합을 통하여 발효기 내에 다양한 산소 농도를 제공하였다. 다양한 산소 공급 하의 회분식 배양은 1L 발효기를 사용하였고 pH 5.5, 온도 30 ℃를 유지하였다. 균주는 상기에서 구축된 BD4 균주를 사용하여 초기 접종 OD를 1로 10%(w/v) 글루코스를 포함한 500 mL YP 배지에 접종하였다.

(3) 결과

도 5에서 보는 바와 같이 산소의 공급이 증가됨에 따라 글루코스 소모 속도와 세포 생장이 촉진되는 경향을 보였고, 여러 산소 조건 중 300 rpm, 1 vvm 산소 공급 조건 하에서 가장 높은 수율 (0.36 g 2,3-부탄다이올/g 글루코스)과 생산성 (0.32 g/L-h)을 보였으며 약 35 g/L 의 2,3-부탄다이올를 생산하였다. 도 5는 여러 산소 조건에서 BD4의 발효 양상을 보여준다. (A) 0 vvm, 300 rpm, (B) 0.25 vvm, 300 rpm, (C) 1.0 vvm, 300 rpm, (D) 1.0 vvm, 500 rpm.

[ 실시예 6: 유가식 배양을 통한 2,3- 부탄다이올 생산]

(1) 개요

BD4 균주가 2,3-부탄다이올 생산 균주로서 적합한지 판단하기 위하여 간헐적인 글루코스 첨가(glucose dumping)에 따른 유가식 배양을 수행하였다.

(2) 재료 및 방법

고농도의 2,3-부탄다이올을 얻기 위하여 유가식 배양을 수행하였다. 유가식 배양은 1L 발효기를 사용하였고 pH 5.5, 온도 30 ℃를 유지하였다. 초기 접종 OD를 10으로 하여 10%(w/v) 글루코스를 포함한 500 mL YP 배지에 접종하였고, 글루코스가 소모되는 시점에 800 g/L의 글루코스 용액을 이용하여 100 g/L의 농도로 글루코스를 계속적으로 공급하였다.

(3) 결과

244 시간의 배양시간 동안 0.28 g 2,3-부탄다이올/g 글루코스 수율과 0.39 g/Lh의 생산성을 보이며, 약 96.2 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하여 2,3-부탄다이올 생산 균주로서 가능성을 확인하였다. 도 6은 BD4 균주의 유가식 배양 결과이다.

[ 실시예 7: 자일로스를 대사하여 피루베이트 를 축적하는 효모 균주( SOS4X ) 의 구축]

(1) 개요

모균주인 SOS4에 세페르소마이세스 시티피테스(Scheffersomyces stipites) 유래의 자일로스 대사 효소 자일로스 리덕타아제(xylose reductase), 자일리톨 데하이드로지나아제(xylitol dehydrogenase), 자이룰로오스 키나아제(xylulose kinase)를 암호화하는 XYL1, XYL2, XYL3를 도입하여 자일로스로부터 피루베이트를 축적할 수 있는 균주(SOS4X)를 구축하고자 하였다.

(2) 재료 및 방법

(가) 균주 및 플라스미드

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) D452-2 유래의 피루베이트 데카르복실라아제 결여 균주 (SOS4)에 세페르소마이세스 시티피테스(Scheffersomyces stipites) 유래의 XYL1, XYL2, XYL3 유전자가 삽입된 벡터 (pSR6-X123)를 유전체(genomic) DNA의 URA 마커 부분에 삽입하여 SOS4X 균주를 구축하였다. (상기 표 2) 유전자 조작을 위하여는 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) Top 10을 사용하였다.

(나) 배지 및 배양 조건

에스체리키아 콜라이(E. coli)는 50 μg/mL 암피실린이 포함된 LB 배지에서 배양하였고, 효모는 4% 자일로스를 함유한 YP 배지에서 배양하였다. 혼합당 발효를 위하여 2% 글루코스와 8% 자일로스를 함유한 YP 배지에서 배양하였다. 형질전환 효모를 선별하기 위하여 선택배지인 YSC 배지를 사용하였다.

(다) 효모 형질 전환

자일로스 대사 관련 유전자 도입 및 2,3-부탄다이올 생합성 유전자 과발현을 위한 플라스미드 삽입은 'EZ-Transformation kit (BIO 101, Vista, CA)'를 사용하였고, YSC 배지에서 선별하였다.

(3) 결과

SOS4X 균주는 72시간에 걸쳐 40 g/L 자일로스 중 14 g/L를 소모하여 3.2 g/L의 피루베이트를 배지 내에 축적하였다. 도 7은 자일로스를 함유한 YP 배지에서 SOS4X 균주의 발효 양상을 보여준다.

[ 실시예 8: 2,3- 부탄다이올 생합성 경로가 도입된 자일로스 대사 가능 피루베이트 데카르복실라아제 결여 효모( BD4X )에 의한 자일로스로부터 2,3- 부탄다이올 생산]

(1) 개요

SOS4X 균주가 자일로스로부터 피루베이트를 축적함을 보였기 때문에, 이 균주를 이용하여 2,3-부탄다이올 생산 균주(BD4X)를 구축하고 2,3-부탄다이올의 생산 여부를 확인하였다.

(2) 재료 및 방법

2,3-부탄다이올 생산을 위하여 alsS, alsD, BDH1 유전자를 포함하는 pRS423_AlsS_AlsD, pRS425_BDH1 플라스미드를 항시 발현 프로모터의 조절 하에 SOS4X 균주에 도입하여 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 생산할 수 있는 BD4X 균주를 구축하였다 (상기 표 2 참조).

플라스크를 이용한 발효 실험을 위하여 2%(w/v) 글루코스를 함유한 선택 배지(YSC)에서 전배양을 수행하였다. 4%(w/v) 또는 8%(w/v) 자일로스를 함유한 50 mL YP 배지에 초기 OD 10으로 세포를 접종하여 본배양을 수행하였다. 미세 호기 조건을 위하여 교반 속도를 80 rpm으로 유지하였다.

(3) 결과

대조군 균주(CON-X)는 72시간 동안 40 g/L의 자일로스 중 약 12 g/L의 자일로스를 대사하여 3.6 g/L의 피루베이트를 축적하였지만, 2,3-부탄다이올 생합성 경로가 도입된 BD4X 균주는 투입된 대부분의 자일로스를 소모하며 9 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이는 축적된 피루베이트가 2,3-부탄다이올 생합성 경로의 도입으로 효율적으로 2,3-부탄다이올로 전환되었음을 의미하며, 동시에 자일로스 대사 속도의 향상을 의미한다. 도 8은 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 자일로스로부터 2,3-부탄다이올 생산 결과를 보여준다. (A)는 4% 자일로스를 포함한 YP배지에서의 대조군 (CON-X)의 발효 양상이고, (B)는 4% 자일로스를 포함한 YP배지에서의 BD4X의 발효 양상이다.

[ 실시예 9: BD4X 균주에 의한 고농도 자일로스 및 글루코스과 자일로스 혼합당으로부터 2,3- 부탄다이올 생산]

(1) 개요

2,3-부탄다이올의 양을 증가시키기 위하여 고농도의 자일로스 또는 '글루코스/자일로스 혼합당'을 기질로 사용하여 2,3-부탄다이올의 생산량 변화를 확인하고자 하였다.

(2) 재료 및 방법

고농도 자일로스에서 2,3-부탄다이올의 생성 양상을 확인하기 위해, 8%(w/v) 자일로스를 함유한 YP 배지에서 회분식 배양을 시행하였다. 또한, 혼합당 발효를 위하여는 '8%(w/v) 자일로스와 2%(w/v) 글루코스 혼합당'을 이용하였다.

(3) 결과

8% 자일로스를 함유한 YP 배지에서 회분식 배양을 시행한 결과, 120시간 동안 BD4X 균주는 공급된 자일로스를 대부분 소모하고 수율 0.27 g 2,3-부탄다이올/g 자일로스와 생산성 0.18 g/Lh를 나타내며, 20 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다.

한편, 2% 글루코스와 8% 자일로스 혼합당에서 발효를 진행한 결과, BD4X는 혼합당에서 오직 자일로스만을 기질로 하였을 경우보다 수율이 향상된 0.29 g 2,3-부탄다이올/g 혼합당의 수율을 보였으며, 최종 26 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다.

도 9는 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 고농도 자일로스 및 글루코스과 자일로스 혼합당으로부터 2,3-부탄다이올 생산 결과를 보여준다. (A) 8% 자일로스를 포함한 YP배지, (B) 2% 글루코스과 8% 자일로스를 포함한 YP배지.

[ 실시예 10: BD4X 에 의하여 생산된 2,3- 부탄다이올 입체이성체 분석]

(1) 개요

2,3-부탄다이올의 입체이성체는 2,3-부탄다이올를 생산하는 미생물에 따라 결정된다. BD4X에 의하여 생산된 2,3-부탄다이올의 입체이성체를 확인하기 위하여 세포 배양액의 상등액을 카이럴(chiral) 컬럼이 장착된 GC(Gas Chromatography)를 통하여 분석하였다.

(2) 재료 및 방법

2,3-부탄다이올 입체 이성체를 분석하기 위하여 HP-Chiral-20B GC 컬럼이 장착된 GC 크로마토그라피(Gas Chromatography)기계를 이용하여 분석하였다. 분석 조건은 다음과 같다.

- 이동 기체: 질소 (30 mL/min)

- 주입구 온도: 240℃, 이온감지장치 온도: 250℃

- 컬럼의 온도 조절: 시작 (50℃) -> 온도 상승 (10℃/분) -> 등온 구역 (5분간 80℃) -> 온도 상승 (5℃/분) -> 등온 구역 (7분간 100℃) -> 온도 상승 (40℃/분) -> 등온 구역 (5분간 240℃)

(3) 결과

일반적으로 효모가 생산한 2,3-부탄다이올는 약 70-80%가 (R, R)-2,3-부탄다이올이며, 나머지가 meso-2,3-부탄다이올이다. 하지만 BD4X에 의하여 생산된 2,3-부탄다이올는 97% 이상 (R, R)-2,3-부탄다이올이었다. 도 10은 BD4X 균주에 의해 생성된 2,3-부탄다이올의 입체이성체의 GC를 통한 분석 결과이다. (A) 아세토인과 2,3-부탄다이올 입체이성질체 스탠다드, (B) BD4X 균주가 글루코스를 대사하여 생성한 2,3-부탄다이올 입체이성체, (C) BD4X 균주가 자일로스를 대사하여 생성한 2,3-부탄다이올 입체이성체.

[ 실시예 11: BD4X 의 유가식 배양 ( 자일로스 유가식 배양)]

(1) 개요

BD4X가 자일로스로부터 2,3-부탄다이올을 생산하기에 적합한 균주인지 최종적으로 판단하기 위하여 자일로스 유가식 배양을 시행하였다.

(2) 재료 및 방법

고농도의 2,3-부탄다이올을 얻기 위하여 초기 접종 OD를 10으로 하여 유가식 배양을 수행하였다. 유가식 배양을 위하여 1 L 발효기를 사용하였고 pH 5.8, 온도 30 ℃를 유지하여 진행하였다. 균주를 500 mL YP 배지에 접종하였고 미세호기(300 rpm, 0.25vvm) 조건을 유지하였다. 글루코스 농도를 1 g/L 이하로 일정하게 유지하도록 공급하고 8%(w/v) 자일로스를 간헐적으로 투입하는 방법을 통해 발효를 진행하였다. 즉, 초기 80 g/L 자일로스가 소모되는 시점에 800 g/L의 자일로스 용액을 이용하여 80 g/L의 농도로 자일로스를 계속적으로 공급하였고, 글루코스는 800 g/L 글루코스 용액을 이용하여 발효가 진행되는 기간동안 지속적으로 1.2 g/h 혹은 0.3 g/h 속도로 공급하였다.

(3) 결과

상기의 글루코스 제한 8% 유가식 배양을 통하여, 273 시간 동안 43.6 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 도 11은 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 자일로스 유가식 배양 결과이다.

[ 실시예 12. BD4X 의 유가식 배양 ( 글루코스 , 자일로스 유가식 배양)]

(1) 개요

글루코스과 자일로스 유가식 배양을 시행하였다. 7%(w/v) 글루코스, 4%(w/v) 자일로스 혼합당의 간헐적으로 투입하는 방법으로 발효를 진행하였다.

(2) 재료 및 방법

고농도의 2,3-부탄다이올을 얻기 위하여 초기 접종 OD를 10으로 하여 유가식 배양을 수행하였다. 유가식 배양을 위하여 1 L 발효기를 사용하였고, pH 5.8, 온도 30℃를 유지하여 진행하였다. 균주를 500 mL YP 배지에 접종하였고, 미세호기조건 (300 rpm, 0.25vvm) 조건을 유지하였다. 7% 글루코스, 4% 자일로스 혼합당을 간헐적으로 투입하는 방법을 통해 발효를 진행하였다. 혼합당 투입을 위해서는 초기 70 g/L 글루코스와 40 g/L 자일로스가 모두 소모된 시점에 800 g/L 글루코스와 자일로스 용액을 이용하여 7% 글루코스와 4% 자일로스 농도로 당을 간헐적으로 투입하였다.

(3) 결과

상기 혼합당의 유가식 배양을 통하여 290 시간 동안 52.2 g/L의 2,3-부탄다이올을 생산하였다. 이때 생산수율은 0.26 g 2,3-부탄다이올/ g 혼합당이다. 도 12는 BD4X 균주의 미세호기 조건에서 글루코스과 자일로스 유가식 배양 결과이다.

Claims

피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되고,
아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며,
아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고,
부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
제1항에 있어서,
상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능 소실은,
피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC 1 유전자 및 피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)을 암호화하는 PDC5 유전자 각각의 일부가 파쇄되거나, 전부가 제거된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
제1항에 있어서,
상기 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는,
글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자가 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
자일로스 리덕타아제(xylose reductase) 및 자일리톨 데하이드로지나아제(xylitol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환되고,
자이룰로오스 키나아제(xylulose kinase)가 발현되도록 형질전환되며,
피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능이 소실되도록 형질전환되고,
아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)가 발현되도록 형질전환되며,
아세토락테이트 데카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)가 발현되도록 형질전환되고,
부탄다이올 데하이드로지나아제(butanediol dehydrogenase)가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
제4항에 있어서,
상기 피루베이트 데카르복실라아제 (pyruvate decarboxylase)의 기능 소실은,
피루베이트 데카르복실라아제 1 (pyruvate decarboxylase 1)을 암호화하는 PDC 1 유전자 및 피루베이트 데카르복실라아제 5 (pyruvate decarboxylase 5)을 암호화하는 PDC5 유전자 각각의 일부가 파쇄되거나, 전부가 제거된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
제4항에 있어서,
상기 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는,
글루코스 감지 효소인 Mth1가 카세인 키나아제 Ⅰ (casein kinase Ⅰ)에 의해 인산화된 후 분해되지 않도록 MTH1 유전자가 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae).
글루코스를 함유하는 배지에 상기 제1항 또는 제3항의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올(2,3-Butanediol)의 생산방법.
제7항에 있어서,
상기 배양은,
산소를 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
제7항에 있어서,
상기 배양은,
글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
자일로스를 함유하는 배지에 상기 제4항 또는 제6항의 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 배지는,
글루코스를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 배양은,
산소를 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
제10항에 있어서,
상기 배양은,
자일로스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.
제11항에 있어서,
상기 배양은,
자일로스 및 글루코스를 지속적으로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올의 생산방법.