KR20150063527A - 지방산 에스테르의 효소적 합성을 위한 3-단계 방법 - Google Patents

지방산 에스테르의 효소적 합성을 위한 3-단계 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방 알코올 및 지방산이 30 내지 50℃ 범위의 온도에서 효소의 존재 하에 반응되고, 생성되는 물이 제거되고, 50 내지 80℃ 의 온도에서 진공 중에서 반응이 완료되는, 지방 알코올로부터의 에스테르의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

지방산 에스테르의 효소적 합성을 위한 3-단계 방법 {THREE-STAGE METHOD FOR THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF FATTY ACID ESTERS}
본 발명은 합성 동안 형성되는 물의 대부분이 액체 형태로 제거되는, 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 제조 방법을 포함한다.
지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 효소적 합성은 알려져 있다. 효소적 합성은 형성되는 반응의 물의 완전한 증발과 함께 합성이 진행되는 환경 친화적 과정이다.
지방산 에스테르의 제조를 위한 리파아제의 산업적 사용이, 예를 들어, Geoffrey Hills 에 의해 Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 2003, pp. 601-607 에서 기재되었다. 생산되는 지방산 에스테르, 특히 미리스틸 미리스테이트는 반응물이 칼럼을 통해 여러번 펌핑되고 형성되는 반응의 물이 감압 하에 증발되는 고정상 과정으로 생산된다.
지방산 에스테르는 미용 피부 관리 제품에서 유체 (oil bodies) 또는 연화제로서 사용이 증가하고 있다. 감각 특성 및 최적 피부과적 내성 (tolerance) 에 관한 시장의 높은 수요를 만족시키기 위해, 신규한 유체 및 유체 혼합물이 지속적으로 개발 및 시험되고 있다. 이러한 지방산 에스테르의 혁신적 제조 기술도 이의 일부이다.
이미 언급된 바와 같이, 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 합성은 물을 형성하며, 반응 평형을 완전한 합성을 향해 이동시키기 위해 물은 제거되어야 한다. 효소적으로 촉진되는 지방산 에스테르의 제조는 최적 효소 안정성을 유지하기 위해 비교적 낮은 온도에서 수행되어야 한다. 따라서, 물을 증발시키기 위해 매우 강한 진공이 요구된다. 이러한 증발은 매우 많은 에너지를 소비한다.
또한 뱃치 반응기 (batch reactor) 로 규모를 확대할 때 문제들이 생기는 것으로 밝혀졌다. 10-100㎥ 의 전형적 생산 반응기에서, 충전 깊이로 인해 상부 층에서만 압력 하락에 의해 물 증발이 일어난다. 또한 반응은 80-90% 의 전환율까지 매우 신속하고, 전형적으로 5 시간 미만으로 진행하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 그 결과 이 기간 동안 생산 반응기에서 형성되는 물의 양은 산업적 수단에 의해 제거될 수 없거나 매우 큰 장비 자원으로만 제거될 수 있다. 게다가, 반응의 물의 증발에 필수적인, 요구되는 에너지 투입은 반응기 내의 낮은 내부 온도 때문에 간신히 반응기 내로 도입될 수 있다.
추가의 문제는 효소 촉매가 높은 온도에서 오직 매우 낮은 안정성을 갖거나 비활성화되는 사실에 있다. 효소는 매우 온도-민감성이라고 알려져 있다. 따라서, 에스테르 합성은 60-80℃ 초과의 온도에서 일어날 수 없다. 특히 효소의 장기간 안정성은 짧은 사슬 알코올 및 짧은 사슬 지방산 (C8/C10) 의 존재에 하에 더 낮은 온도에서, 약 40℃ 로부터, 하락하는 것으로 밝혀졌으므로, 반응은 이상적으로는 약 40℃ 의 온도에서 수행되어야 한다.
이들 선행 기술의 효소적 에스테르 합성의 문제 및 단점에 기초하여, 본 발명의 목적은 더 낮은 전체 에너지 소비가 보장되고, 대형 뱃치 반응기로 규모를 확대할 때 문제가 생기지 않고, 개선된 효소 안정성이 보장되는, 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 제조를 가능하게 하는 기술을 확립하는 것이다.
이러한 목적은 특허 청구항 1 에 따른 방법으로 달성되었다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 제조 방법에 관한 것이다:
반응 평형이 달성될 때까지 30 내지 50℃ 범위의 온도에서 효소의 존재 하에 화학식 R1-OH (식 중, R1 은 탄소수 6 내지 22 의 지방족 선형 또는 분지형 탄화수소 기임) 의 지방 알코올과, 화학식 R2-COOH (식 중, R2 는 탄소수 6 내지 22 의 지방족 선형 또는 분지형 탄화수소 기임) 의 지방산의 반응;
반응 동안 형성되는 물의 제거; 및
50 내지 80℃ 의 온도에서 감압 하에 반응의 완료.
종속항은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예를 정의한다.
본 발명에 따른 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 제조 방법은 선행 기술에 따른 상응하는 과정으로부터 명백해진 문제 및 단점에 대한 효과적 해결책이다. 본 발명의 방법은 반응이 평형을 이룰 때까지 초기에 감압 없이 낮은 온도에서 합성이 수행되는 3-단계 효소적 절차이다. 두번째 단계에서 반응의 물이 제거된다. 그 다음, 세번째 반응 단계에서, 완전한 전환이 달성될 때까지 감압 하에 단계 1 보다 높은 온도에서 지방산 에스테르가 합성된다.
도 1 은 본 발명에 따라 제조된 에스테르의 증류에 의한 정제 후의 GC 크로마토그램을 보여준다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 반응의 완료 동안, 즉 완전한 전환이 달성될 때까지, 스트리핑 (stripping) 기체 분위기에서 합성이 수행된다. 모든 종래의 스트리핑 기체가 스트리핑 기체로서 사용될 수 있다. 적합한 스트리핑 기체의 예는 질소, 공기, 이산화탄소 및 아르곤이지만, 바람직하게는 질소가 스트리핑 기체로서 사용된다.
본 발명에 따른 방법의 본질적 특징은 제 1 단계가 반응 평형이 달성될 때까지 초기에 감압 없이 수행되는 것이다. 예를 들어 디캔팅에 의해, 반응 동안 형성되는 물을 제거하기 전까지, 반응은 본 발명에 따라 다시 시작되지 않으며, 그 때 감압이 적용된다. 이러한 반응의 완료 동안 100 내지 10 000 Pa 의 압력이 이용된다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서 반응의 완료 동안 1500 내지 4500 Pa 의 압력이 이용된다.
시작시 감압 없이 수행되는, 반응은 비교적 낮은 온도에서 수행된다. 바람직하게는 35 내지 45℃ 의 온도 범위가 선택된다.
반응의 완료 동안, 이상적으로는 55 내지 65℃ 의 더 높은 온도 범위가 이용된다.
본 발명에 따른 방법은 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 합성을 촉진할 수 있는 임의의 효소의 존재 하에 수행될 수 있다. 실제로 리파아제가 효소로서 사용되는 것이 유리하다고 입증되었다. 바람직한 리파아제는, 예를 들어, 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 로부터의 리파아제 B 이다. 효소는 바람직하게는 고정된 형태 (immobilized form) 로 사용된다. 바람직한 고정 방법은, 예를 들어, 지지체 재료 위로의 흡착이다. 지지체 재료의 예는 Accurel MP 1000 및 Lewatit VPOC 1600 이다. 실제로, 합성에서 0.5 내지 5.0 중량% 의 양의 고정된 효소를 사용하는 것이 유리하다고 입증되었다. 지지체 위에 고정된 효소 촉매의 특별한 장점은 또한 이것이 반응 동안 형성되는 물이 배출되는 동안 메쉬 (mesh) 또는 필터 (filter) 를 이용하여 용이하게 보유 (retain) 될 수 있다는 점이다.
본 발명에 따른 방법은, 예를 들어, 하기과 같이 수행될 수 있다:
효소적 합성의 제 1 단계에서, 반응 평형이 달성될 때까지 뱃치 반응기 내의 혼합물은 기계적으로 진탕, 예를 들어 교반된다. 이러한 단계에서, 80% 이상의 에스테르 생성물 전환율이 달성된다.
반응 동안 형성되는 물을 제거하는 중간 단계에서, 바람직하게는 0.5 내지 2 시간 동안, 뱃치의 기계적 진탕은 중단되고, 그 결과 물이 분리되는 것이 가능하다. 물은 이상적으로는 저부 배출구를 통해 배출되고, 한편 고정된 효소는, 예를 들어 반응기 내의 메쉬 또는 필터 유닛을 이용하여, 보유된다.
감압 하에 반응이 완료되는 마지막 단계는 동일한 뱃치 반응기 내에서 전환율 95% 이상, 바람직하게는 95% 초과의 에스테르 생성물 전환율까지 수행된다. 이상적으로는, 제 1 단계로부터의 효소가 다시 사용될 수 있으므로, 경제적 관점에서, 고정된 효소는 전체 합성에 재사용될 수 있다.
에스테르 합성에서 출발 재료로서 사용되는 지방 알코올 및 지방산은 산업용 지방 알코올 또는 지방산일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 지방 알코올 및 지방산은 재생가능 원료로부터 수득된다.
지방 알코올은 하기 화학식의 일차 지방족 알코올을 의미한다고 이해된다:
R1 -OH
(식 중, R1 은 탄소수 6 내지 22 의 지방족, 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기임). 하나 이상의 이중 결합을 갖는 불포화 탄화수소 잔기도 포함된다. 전형적 예는 카프로일 알코올, 카프릴 알코올, 2-에틸헥실 알코올, 카프릭 알코올, 라우릴 알코올, 이소트리데실 알코올, 미리스틸 알코올, 세틸 알코올, 팔모레일 알코올, 스테아릴 알코올, 이소스테아릴 알코올, 올레일 알코올, 엘라이딜 알코올, 페트로셀리닐 알코올, 리놀릴 알코올, 리놀레닐 알코올, 엘라에오스테아릴 알코올, 아라킬 알코올, 가돌레일 알코올, 베헤닐 알코올, 에루실 알코올 및 브라시딜 알코올 및 또한 그들의 혼합물이다. 탄소수 8 내지 18 의 지방 알코올이 바람직하다.
지방산은 하기 화학식의 지방족 카르복시산을 의미한다고 이해된다:
R2COOH
(식 중, R2 는 탄소수 6 내지 22 의 지방족, 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기임). 하나 이상의 이중 결합을 갖는 불포화 탄화수소 잔기도 포함된다. 전형적 예는 카프로산, 카프릴산, 2-에틸헥산산, 카프르산, 라우르산, 이소트리데칸산, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 이소스테아르산, 올레산, 엘라이드산, 페트로셀린산, 리놀레산, 리놀렌산, 엘라에오스테아르산, 아라키드산, 가돌레산, 베헨산 및 에루크산 및 또한 그들의 혼합물이다. 탄소수 8 내지 18 의 산업용 지방산이 바람직하다.
본 발명에 따른 에스테르 제조 방법은 바람직하게는 원-포트 프로세스 (one-pot process) 로 수행된다. 이러한 목적에 바람직한 반응기는 뱃치 반응기 또는 고정상 루프 (fixed-bed loops) 를 갖는 뱃치 반응기이다.
본 발명에 따라 제조된 지방산 에스테르를 가공하기 위해, 추가의 정제 및 보존 단계가 수행될 수 있다. 이들은 예를 들어 미반응 반응물의 제거를 위한 포어런 증류 (forerun distillation) 를 포함한다. 예를 들어, 색 개선을 위한 생성물 증류 (product distillation) 가 또한 수행될 수 있다. 냄새 최적화를 위한 탈취가 또한 성공적으로 수행될 수 있다고 밝혀졌다. 예를 들어, 생성물 안정화를 위해 항산화제 (예컨대 토코페롤) 의 첨가가 또한 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 공지된 지방산 에스테르 제조 과정에 비해 매우 많은 장점을 갖는다. 하나의 상당한 개선은 전체 반응이 감압 하에 수행되는 선행 기술의 과정에 비해 적은 물이 증발되므로 전체적으로 극히 낮은 양의 에너지가 소비된다는 점이다.
제 2 단계, 즉 물이 제거되는 중간 시기에서, 물은 소수성 에스테르로부터 매우 신속히 분리되므로, 물은 유리하게는 저부 배출구를 사용하여 분리될 수 있다. 대형 뱃치 반응기에서, 이는 반응의 물의 완전한 증발보다 짧은 반응 시간이 달성되는 것을 가능하게 한다. 반응 평형 상태로의 전환율은 실제로 뱃치 크기와 무관하고, 주로 혼합에 의해 영향을 받는다.
추가의 장점은 효소 안정성의 이례적 개선이 달성되는 점이다. 그 이유는 제 1 과정 단계가 제 3 단계보다 상당히 더 낮은 온도에서 수행되기 때문이다. 게다가, 제 3 단계에서 탈활성화 성분, 예컨대 출발 재료의 농도가 명백히 더 낮다.
마지막으로, 매우 양호한 최종 전환율이 관찰된다. 이는 제 3 단계에서 이용되는 더 높은 온도에 기인한다. 그 결과, 99% 초과의 생성물 전환율이 가능하다. 스트리핑 기체의 부가적 사용은 최종 전환율의 증가를 추가로 촉진한다.
하기 실시예는 본 발명에 따른 방법을 설명하는 역할을 한다.
실시예
실시예 1: 3-단계 과정에서 효소의 장기간 안정성 (실험실 규모)
1:1 비율의 Lewatit VPOC 1600 (Lanxess) 및 상업적으로 입수가능한 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 로부터의 리파아제 B (Novozymes 로부터의 Lipozyme CalB L) 를 밤새 실온에서 20 배 양의 물 중에서 교반했다. 고정된 효소를 여과하고 합성에 직접 사용했다.
패들 교반기 (paddle stirrer) 가 있는 1 L 반응기에서, 650 g 의 옥탄올 및 지방산의 등몰 혼합물 (옥탄산 및 데칸산의 산업용 혼합물) 을 2 중량% 의 고정된 효소와 반응시켰다. 혼합물을 45℃ 에서 4 h 동안 대기압에서 교반했다. 4 h 후에 교반을 중단하고, 산가의 확인을 위해 샘플을 제거했다. 30 min 후에 수상을 반응기로부터 배출시키고, 반응이 재시작되었다. 온도를 60℃ 로 상승시키고, 20 mbar 의 오일 펌프 진공을 가하고, 반응 혼합물을 질소로 플러싱 (flush) 했다. 뱃치를 일정한 조건 하에 추가 18 h 동안 교반했다. 이러한 반응 기간에 뒤이어, 뱃치를 배출시키고, 산가를 측정하여 전환율을 확인하고, 새로운 뱃치를 동일한 조건 하에 동일한 효소로 개시했다. 총, 10 개의 뱃치를 동일한 효소로 처리했다. 지방 알코올 / 지방산 혼합물의 출발 산가는 210 이었다.
Figure pct00001
10 개의 사이클에 걸쳐, 4 h 의 반응 시간 후에, 반응은 사실상 평형 상태에 도달했으며, 전환율은 90% 바로 아래였다. 22 h 의 전체 반응 시간 후에, 감압 하에 물이 제거되고, 모든 10 개의 뱃치에서 97% 초과의 전환율이 달성되었다. 10 개의 뱃치 전체에서 효소 활성의 상당한 상실이 관찰되지 않았다.
실시예 2: 10 ㎥ 반응기에서 3-단계 과정에 의한 합성
10 ㎥ 반응기에는 패들 교반기 (paddle stirrer), 가열 자켓 (heating jacket), 반응기 저부의 질소 스파저 (nitrogen sparger) 및 젯트 진공 시스템 (jet vacuum system) 이 갖춰져 있었다. 또한, 메쉬를 저부 배출구에 설치하여 촉매를 보유시켰다. 효소 고정 및 반응을 동일한 반응기에서 수행했다.
140 ㎏ 의 Accurel MP 1000 및 1500 ㎏ 의 에탄올을 반응기에 충전하고 0.5 h 동안 교반하고, 그 후 에탄올을 저부 배출구를 통해 배출시켰다. 3000 ㎏ 의 물을 반응기에 첨가하고, 150 ㎏ 의 Lipozyme CalB L 을 첨가하면서 교반했다. 고정을 16 h 동안 25℃ 에서 수행했다. 수용액을 반응기로부터 배출시키고, 보유된 고정물 (immobilizate) 을 물로 1 회 세정했다.
반응기 내의 총 고정된 효소에 6550 ㎏ 의 옥탄올 및 지방산의 혼합물 (옥탄산 및 데칸산의 산업용 혼합물) 을 첨가했다. 혼합물을 4 h 동안 45℃ 및 대기압에서 교반했다. 4 h 후에 교반을 중단하고, 산가의 확인을 위해 샘플을 제거했다. 30 min 후에 수상 (약 350 ㎏) 을 반응기로부터 배출시키고, 반응이 재시작되었다. 온도를 60℃ 로 상승시키고, 약 30 mbar 의 젯트 진공을 가하고, 반응 혼합물을 질소로 퍼징 (purge) 했다. 뱃치를 교반하면서 추가 12 h 동안 인큐베이션했다. 이러한 반응 기간 후에 뱃치를 여과 메쉬를 통해 배출시키고, 백 필터 (bag filter) 를 통해 미세하게 여과했다. 총, 9 개의 뱃치를 동일한 효소로 처리했으며, 유의한 효소 탈활성화가 탐지되지 않았다.
4 h 의 반응 시간 후에, 모든 뱃치는 25 - 30 의 산가를 가졌으며, 이는 85% 초과의 전환율에 해당한다. 반응의 종료에 뒤이어, 모든 뱃치는 2 미만의 산가를 가졌으며, 이는 지방산을 기준으로 99% 이상의 전환율에 해당한다. 반응 생성물은 투명하고 거의 무색이었다. 총, 52 000 ㎏ 초과의 생성물이 98% 초과의 수율로 제조되었다.
실시예 3: 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 에스테르의 생성물 품질
실시예 2 로부터의 생성물을 증류에 의해 추가로 정제하고 탈취했다. 이를 위해, 생성물을 연속적으로 연결된 3 개의 칼럼으로 이루어지는 생산 증류를 통해 공급했다. 생성물을 2000 ㎏/h 의 흐름 속도로 계량해 넣고, 제 1 칼럼에서, 미전환 반응물로 이루어지는 초기 분획을 90 ㎏/h 의 속도로 상승시켰다. 제 2 칼럼에서, 에스테르를 오버헤드 (overhead) 증류시켜 색을 개선하고, 제 3 칼럼에서, 에스테르를 120℃ 에서 10% 증기로 탈취하여 냄새를 개선했다.
그에 따라 수득된 생성물 (옥틸 옥타노에이트 및 옥틸 데카노에이트의 혼합물) 은 210 의 비누화값, 0.1 미만의 산가, 0.1 미만의 히드록실가 및 0.1 미만의 퍼옥시드가를 가졌다. Hazen 색수 (color number) 는 10 이었고, 운점은 - 12℃ 였다. GC 분석에 의한 에스테르 함량은 99.4% 였다 (도 1). 이러한 도면에서, 2 개의 주요 피크가 옥틸 옥타노에이트 (~ 6 min RT) 및 옥틸 데카노에이트 (~ 7 min RT) 로서 인식가능하다.
실시예 4: 온도의 함수로서의 효소 안정성
1:1 비율의 Lewatit VPOC 1600 (Lanxess) 및 상업적으로 입수가능한 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 로부터의 리파아제 B (Novozymes 로부터의 Lipozyme CalB L) 를 밤새 실온에서 20 배 양의 물 중에서 교반했다. 고정된 효소를 여과하고 합성에 직접 사용했다.
밀봉가능한 병 내에, 각 경우에 50 g 의 옥탄올 및 지방산의 등몰 혼합물 (옥탄산 및 데칸산의 산업용 혼합물) 을 2 중량% 의 고정된 효소 (1 g) 와 반응시켰다. 혼합물을 22 h 동안 30℃, 45℃ 및 60℃ 에서 병렬적으로 진탕시켰다. 이러한 반응 기간에 뒤이어, 뱃치를 여과하고, 산가를 측정하여 전환율을 확인했다. 총, 9 개의 뱃치를 동일한 효소로 3 가지 온도에서 처리했다. 지방 알코올 / 지방산 혼합물의 출발 산가는 210 이었다.
Figure pct00002
30℃ 및 45℃ 에서 22 h 의 반응 시간 후에, 9 개의 뱃치 전체에서 효소 활성의 상당한 상실이 관찰되지 않았다. 60℃ 에서, 뱃치 5 로부터 활성의 상당한 상실이 관찰되고, 그 후 9 개의 뱃치 후에 25% 미만의 출발 전환율이 달성된다.
실시예 5: 온도의 함수로서의 효소 안정성
Accurel MP 1000 (Membrana) 을 1 h 동안 10-배 과잉량의 에탄올 중에서 인큐베이션하고, 그 후 여과했다. 1:1 비율의 에탄올-모이스트 (moist) Accurel MP 1000 및 상업적으로 입수가능한 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 로부터의 리파아제 B (Novozymes 로부터의 Lipozyme CalB L) 를 밤새 실온에서 20 배 양의 물 중에서 교반했다. 고정된 효소를 여과하고 합성에 직접 사용했다.
밀봉가능한 병 내에, 각 경우에 50 g 의 옥탄올 및 지방산의 등몰 혼합물 (옥탄산 및 데칸산의 산업용 혼합물) 을 2 중량% 의 고정된 효소 (1 g) 와 반응시켰다. 혼합물을 22 h 동안 30℃, 45℃ 및 60℃ 에서 병렬적으로 진탕시켰다. 이러한 반응 기간에 뒤이어, 뱃치를 여과하고, 산가를 측정하여 전환율을 확인했다. 총, 9 개의 뱃치를 동일한 효소로 3 가지 온도에서 처리했다. 지방 알코올 / 지방산 혼합물의 출발 산가는 210 이었다.
Figure pct00003
30℃ 및 45℃ 에서 22 h 의 반응 시간 후에, 9 개의 뱃치 전체에서 효소 활성의 상당한 상실이 관찰되지 않았다. 60℃ 에서, 뱃치 5 로부터 활성의 약간의 상실 및 뱃치 6 으로부터 활성의 상당한 상실이 관찰된다. 9 개의 뱃치 후에 35% 미만의 출발 전환율이 달성된다.
추가의 뱃치를 60℃ 에서 20 mbar 의 감압에서 자켓이 있는 반응기에서 처리했다. 800 g 의 상기 반응물 혼합물 및 Accurel MP 1000 위에 고정된 2% 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 로부터의 리파아제 B 를 뱃치마다 사용했다. 총, 8 개의 뱃치를 연속적 교반 및 질소 스파징 (sparge) 하면서 처리했다. 3 h 및 22 h 후에 두 번 샘플을 취했다. 물의 축적이 관찰되지 않았다.
Figure pct00004
60℃ 의 반응 온도에서, 또한 감압 조건 하에 물을 연속적으로 제거하면서, 촉매의 신속한 탈활성화가 일어난다. 4 개의 사이클 후에, 3 h 에 취해진 샘플도 반응 속도의 저하를 보이며, 한편 6 - 7 개의 사이클 후에 22 h 후에도 완전 전환율이 더이상 달성되지 않는다.
실시예 1, 4 및 5 를 비슷한 양의 효소 및 반응물의 동일한 혼합물로 수행했다. 45℃ 에서 평형에 도달하는 반응 및 60℃ 에서 감압 하에 추가의 전환이 수행되는 에스테르 합성의 3-단계 절차에서 (실시예 1), 10 개의 반응 사이클 전체에서 효소 활성의 유의한 감소가 관찰되지 않는다. 이와 대조적으로, Lewatit VPOC 1600 지지체 (실시예 4) 및 Accurel MP 1000 (실시예 5) 를 둘다 이용하는 60℃ 에서의 직접 반응은, 5 개의 사이클 후에도, 효소 활성의 유의한 감소를 초래했다.
비교는 특히 실시예에서 사용된 반응물들이 효소에 탈활성화 영향을 발휘한다는 것을 보여준다. 옥탄올은 강한 용매 특질을 갖고, 옥탄산 및 데칸산은 꽤 강한 산이다. 동시에, 효소의 탈활성화는 선택되는 반응 온도에 크게 좌우된다.
제 1 단계에서 더 낮은 온도에서 80% 초과의 반응물이, 그 후 더 높은 온도에서 나머지 10 - 20% 의 반응물이 전환되는 3-단계 합성은, 높은 온도에서의 반응물의 직접 전환과 비교시 유의하게 개선된 효소 안정성을 초래한다. 제 2 반응 단계에서 감압 하의 물의 제거는 더 낮은 온도에서보다 유의하게 더 양호하게 작업하므로, 3-단계 절차는 산업적 실행에 특히 적합하다.
추가의 저장 시험에서 효소는 반응물 혼합물에서보다 생성된 에스테르에서 더 양호한 안정성을 갖는 것으로 확인되었다. 생성물 혼합물에서 45℃ 에서 1 개월 동안 고정물의 저장은 효소 활성의 유의한 감소를 초래하지 않았다.
비교 실시예 1: 10 ㎥ 반응기에서 감압 하의 에스테르 합성
고정 및 반응을 실시예 2 에 기재된 바와 동일한 반응기에서 수행했다. 고정을 실시예 2 에 기재된 바와 같이 수행했고, 반응물 혼합물 및 바이오촉매 및 반응물의 비율은 동일했다.
반응기에서, 6550 ㎏ 의 옥탄올 및 지방산의 혼합물 (옥탄산 및 데칸산의 산업용 혼합물) 을 총 고정된 효소에 첨가했다. 혼합물을 4 h 동안 45℃ 에서 교반하고, 30 mbar 의 젯트 진공을 사용하여 질소로 스파징했다. 4 h 후에 샘플을 취하고, 존재하는 물의 양을 분석했다. 샘플의 산가는 26 이었으며, 이는 87% 초과의 전환율에 해당한다.
반응기에서 4 h 후에 물이 축적되고: 형성된 물의 양의 약 75% 가 45℃ 의 온도에서 진공 펌프에 의해 반응기로부터 제거될 수 없는 것으로 밝혀졌다. 언급된 온도에서 증발에 의해 초기에 형성된 물을 제거하기 위해, 약 16 h 이 요구되었을 것이다. 수상의 완전한 제거 전까지 시스템은 추가로 반응할 수 없었을 것이다.
20 - 100 ㎥ 의 크기를 갖는 미용 및 산업용 에스테르의 전형적 생산 반응기에서, 비교적 높은 충전 수준 및 불리한 표면 대 부피 비율로 인해 물의 제거가 더 오래 걸리는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 반응 온도를 80 - 100℃ 로 상승시켜야만, 물이 더욱 신속히 제거될 수 있다. 그러나, 이 경우에 효소의 탈활성화가 매우 심하므로, 이러한 과정 변화는 적합한 해결책이 아니다.
발명의 실시예 2 에서 보여지는 바와 같이, 반응은 4 h 후에 중단되므로 수상이 반응기로부터 단시간 내에 제거될 수 있다. 더 낮은 온도 (30 - 45℃) 에서도, 반응의 평형에의 도달은 약 4 h 내에 달성된다. 물이 분리된 후에, 반응물의 대부분이 이미 반응되었으므로, 상당한 효소 탈활성화 없이 더 양호한 수상의 제거를 위해 반응 온도가 예를 들어 60℃ 로 상승될 수 있다. 따라서 전체 반응은 12 - 20 h 내에 수행될 수 있다.

Claims (15)

  1. 하기 단계를 포함하는, 지방 알코올 및 지방산으로부터의 에스테르의 제조 방법:
    - 반응 평형이 달성될 때까지 30 내지 50℃ 범위의 온도에서 효소의 존재 하에 화학식 R1-OH (식 중, R1 는 탄소수 6 내지 22 의 지방족 선형 또는 분지형 탄화수소 기임) 의 지방 알코올과 화학식 R2-COOH (식 중, R2 는 탄소수 6 내지 22 의 지방족 선형 또는 분지형 탄화수소 기임) 의 지방산의 반응;
    - 반응 동안 형성되는 물의 제거; 및
    - 50 내지 80℃ 의 온도에서 감압 하에 반응의 완료.
  2. 제 1 항에 있어서, 반응의 완료가 스트리핑 (stripping) 기체 분위기에서 수행되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 사용되는 스트리핑 기체가 질소, 공기, 이산화탄소 또는 아르곤인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응의 완료 동안 100 내지 10 000 Pa 의 압력이 적용되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 반응의 완료 동안 1500 내지 4500 Pa 의 압력이 적용되는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응이 35 내지 45℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응의 완료가 55 내지 65℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파아제가 효소로서 사용되는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 효소가 고정된 형태 (immobilized form) 로 사용되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 고정된 효소가 0.5 내지 5.0 중량% 의 양으로 사용되는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 지방 알코올이 탄소수 8 내지 18 의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐 기를 갖는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 지방산이 탄소수 8 내지 18 의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐 기를 갖는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 에스테르 제조가 원-포트 프로세스 (one-pot process) 로 수행되는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 및 보존 단계가 부가적으로 수행되는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 포어런 증류 (forerun distillation), 색 개선을 위한 생성물 증류 (product distillation), 냄새 최적화를 위한 탈취 및/또는 항산화제의 첨가가 수행되는 방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62262997A (ja) * 1986-05-02 1987-11-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ワツクスの製造方法
JPH0315383A (ja) * 1989-06-12 1991-01-23 Agency Of Ind Science & Technol 酵素の活性復元方法と高温反応方法
JP3093403B2 (ja) * 1991-12-05 2000-10-03 石原薬品株式会社 高級飽和脂肪酸の含フッ素脂肪族アルキルエステルの製法
JP2001245686A (ja) * 1999-12-27 2001-09-11 Osaka City 脂肪酸低級アルコールエステルの製造方法
CN1279174C (zh) * 2002-05-10 2006-10-11 北京化工大学 固定化脂肪酶催化合成脂肪酸低碳醇酯
DE102005037989A1 (de) * 2005-08-11 2007-02-15 Cognis Ip Management Gmbh Verfahren zur chemo-enzymatischen Herstellung von Fettsäureestern
JP2009183210A (ja) * 2008-02-06 2009-08-20 Taiyo Corp グリセリンリシノール酸モノエステル及びポリグリセリンリシノール酸モノエステルの製造方法

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