KR20150062698A - 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체 - Google Patents

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Abstract

항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

Description

항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체{Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody}
항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
안지오포이에틴2(Angiopoietin2, Ang2)는 혈관내피세포에 존재하는 수용체 Tie2의 길항적인 (antagonistic) 리간드로서(Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar;10(3):165-77), Tie2의 작용물질 (agonist)인 Angiopoietin1 (Ang1)과 Tie2 결합에 대해 경쟁함으로써 Tie2에 의한 신호전달을 억제하는 기능이 있음이 알려져 있다 (Science. 1997 Jul 4;277(5322):55-60). 따라서 Ang2는 혈관내피세포의 안정성을 유지하는 Ang1-Tie2 신호전달을 저해하게 되고, 결과적으로 혈관의 역동적인 재배열 (dynamic rearrangement)을 통한 신생혈관형성을 촉진할 수 있다 (Science. 1997 Jul 4;277(5322):48-50). 신생혈관형성과정은 암의 성장에 필수적인 요소이므로 위와 같은 Tie2 의존적인 Ang2의 기능을 저해하여 신생혈관형성을 억제함으로써 암의 추가적인 성장을 막을 수 있음은 여러 전임상 모델의 연구에 의해 알려져 있고 (J Natl Cancer Inst. 2012 Mar 21;104(6):461-75), 실제로 Ang2 특이적 항체를 이용하여 암의 진행을 막으려는 시도가 Regeneron사, Astrazeneca사, Armgen 사등의 여러 글로벌 제약 회사에 의해 이루어지고 있다. 그러나 최근 연구들에 의하면, 이러한 신생혈관억제제 투입시 암세포는 급격한 산소결핍상태를 회피하는 기작의 작동으로 인하여 오히려 전이를 촉진할 수 있음이 제시되었다 (Nat Rev Clin Oncol. 2011 Mar 1;8(4):210-21). 따라서 신생혈관억제의 이러한 심각한 부작용을 막기 위해서는, 암전이 관련 단백질의 기능 또한 동시에 억제하는 것이 필수적이다.
한편,　c-Met 은 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK (Receptor Tyrosine Kinase)로써, 그 리간드인 HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scattering Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 많은 종류의 암세포에 과 발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. 또한 리간드의 이름이 의미하듯, HGF/SF를 통한 c-Met signaling은 거의 모든 종류의 epithelial tumor의 cell-cell contact를 약화시켜 scattering을 야기하는 대표적인 암 전이 초기단계의 단백질이다 (Nat Rev Cancer. 2012 Jan 24;12(2):89-103). 특히, c-Met 유전자의 upstream에는 hypoxia-response element들이 존재하여, 산소결핍 상황에서 그 유전자의 발현이 증가함은 잘 알려져 있다 (Oral Oncol. 2006 Jul; 42(6):593-8).
따라서, Ang2와 c-Met을 동시에 표적한다면, 암세포의 성장과 전이를 보다 효과적으로 억제할 수 있을 것이며, 이러한 이유로 Ang2와 c-Met을 동시에 표적하는 약물의 개발이 요구된다.
일 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 제공한다.
상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2의 아미노산의 3차 구조에서, 루프 1의 외부 노출 아미노산 잔기, 루프 2의 외부 노출 아미노산 잔기, 및 루프 3의 외부 노출 아미노산 잔기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 또는 상기 외부 노출 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 3차 구조상 연속하는 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체와 경쟁적으로 인간 Ang2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 예는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도를 제공한다.
암세포에서 많이 발현되어 있는 대표적인 타겟인 Ang2만 인지하는 기존의 표적치료제는 c-Met의 과발현과 돌연변이를 유도하여 암세포가 약물에 대한 내성을 획득하게 함으로써 그 치료 효과를 감소시키는 경우가 있었다. 본 발명자들은 c-Met과 Ang2을 동시에 인지하는 이중항체가 약물에 대한 내성의 원인이 되는 c-Met에 의한 암세포의 신호전달을 사전에 차단함으로써 내성의 발생을 방지하고, 내성이 생긴 암세포에서도 우수한 암세포의 억제 효과를 보임을 확인하였다.
본 발명의 일 예는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 제공한다. 상기 이중 특이 항체는 c-Met과 Ang2을 동시에 인지하고 결합하여 기능을 저해함으로써 상승된 항암 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함한다. 　한편, "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. "항원 결합 단편"은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
하기하는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 설명에서, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 이중 특이 항체의 하나의 표적인 "c-Met"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.
본 발명에서 제공되는 이중 특이 항체의 또 다른 표적인 "Ang2"는 신생혈관 형성과 밀접한 관련이 있으며 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래의 Human Ang2 (Accession # O15123), 원숭이 유래의 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 유래의 Mouse Ang2 (Accession # NP_031452, Accession # O35608 등), 래트 유래의 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있다.
상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체에서 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 부위는 Ang2와의 결합에 있어서 Tie-2 수용체와 경쟁함으로써, Ang2와 Tie-2 수용체와의 결합을 저해하는 것일 수 있으며, 예컨대, Ang2의 Tie-2 수용체와의 결합 부위를 인식 및/또는 결합함으로써 Ang2와 Tie-2 수용체와의 결합을 저해하는 것일 수 있다. 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 부위는 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용하는 사람의 Ang2 단백질을 인식하고, 그 수용체인 Tie-2 수용체와의 결합을 억제함으로써, 신생혈관 생성, 암 발생, 및/또는 암세포의 전이를 억제하고, Ang2의 활성 및/또는 과생성과 연관된 질병에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 갖는다.
또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 부위는 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 활성을 추가로 가질 수 있다. 상기 인테그린(integrin)은 세포 부착을 매개하는 대표적인 단백질로서, 알파(α) 서브유닛과 베타(β) 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머 구조이다. 포유류에서는 18 종류의 알파 서브유닛과 8종류의 베타 서브유닛이 동정되어 있다. 상기 인테그린으로 상기 인테그린은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 인테그린, 원숭이 인테그린, 마우스 인테그린, 래트 인테그린 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 각 종(species) 마다 24종의 인테그린이 알려져 있으며, 이들의 아미노산 서열은 잘 동정되어 있어서 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 사항이다. 예컨대, 상기 인테그린은 인간 인테그린일 수 있고, 대표적인 인테그린 종류로서 alpha5beta1(α5β1)(α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1)(αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3)(αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같이, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하는 효과에 더하여, 암세포의 성장 및/또는 암전이에 관여하는 다른 단백질인 인테그린과 Ang-2와의 결합을 저해함으로써, 보다 증진된 암세포 성장 저해 및/또는 암전이 억제 효과를 가지고, Tie2가 발현하지 않는 세포에서도 이러한 효과를 발휘할 수 있다.
일 예에 있어서, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 상기 항 Ang2 항체는 인간 Ang2 (hAng2; 서열번호 172; Accession # O15123)의 루프 1 (서열번호 172 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위), 루프 2(서열번호 172 중 447번째 아미노산부터 454번째 아미노산까지의 부위), 및 루프 3(서열번호 172 중 460번째 아미노산부터 468번째 아미노산까지의 부위)으로 이루어진 부위의 전부 또는 일부(예컨대, 각 루프 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상), 또는 서열번호 172 중에서 루프 1, 루프 2, 또는 루프 3의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 인접하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로서 인식하거나, 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항 Ang2 항체는 인간 Ang2의 루프 1에 위치하는 I434, 루프 2에 위치하는 A449 및 P452, 및 루프 3에 위치하는 N467 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 상기 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 인접하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 항 Ang2 항체는 인간 Ang2의 루프 1에 위치하는 I434, 루프 2에 위치하는 A449 및 P452, 및 루프 3에 위치하는 N467 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부분에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
[Ang2 (서열번호 172; 루프 1, 루프 2 및 루프 3을 각각 순서대로 밑줄로 표시하였으며, 각 에피토프를 굵은 글씨로 표시함)]
MWQIVFFTLS CDLVLAAAYN NFRKSMDSIG KKQYQVQHGS CSYTFLLPEM DNCRSSSSPY
VSNAVQRDAP LEYDDSVQRL QVLENIMENN TQWLMKLENY IQDNMKKEMV EIQQNAVQNQ
TAVMIEIGTN LLNQTAEQTR KLTDVEAQVL NQTTRLELQL LEHSLSTNKL EKQILDQTSE
INKLQDKNSF LEKKVLAMED KHIIQLQSIK EEKDQLQVLV SKQNSIIEEL EKKIVTATVN
NSVLQKQQHD LMETVNNLLT MMSTSNSAKD PTVAKEEQIS FRDCAEVFKS GHTTNGIYTL
TFPNSTEEIK AYCDMEAGGG GWTIIQRRED GSVDFQRTWK EYKVGFGNPS GEYWLGNEFV
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NDFSTKDGDN DKC I CKCSQM LTGGWWFD A C G P SNLNGMYY PQRQNT N KFN GIKWYYWKGS
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상기 에피토프 부위는 Ang2의 3차원 구조의 루프 1, 2, 또는 3에 위치하는 노출된 아미노산 잔기로서, Tie-2 수용체와의 결합에 직접 참여하거나, Tie-2 수용체와의 결합 부위에 포함되거나 인접하여 위치한다 (도 1 참조). 따라서, 상기 에피토프들 중 하나 이상을 인식하고 결합하는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와의 결합에 있어서 Tie-2 수용체와 경쟁하게 되므로, Ang2와 Tie-2 수용체의 결합을 저해하게 된다.
상기 "인접하는 아미노산"은 단백질의 1차 구조뿐 아니라, 2차 또는 3차 구조상에서 서로 인접하는 아미노산을 의미하는 것일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "인접하는 아미노산"은 단백질의 1차, 2차 또는 3차 구조 상에서 연속하는 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다.
또한, 상기 에피토프 부위를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항 Ang2 항체뿐 아니라, 상기 항 Ang2 항체와 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 역시 Ang2와의 결합에 있어서 Tie-2 수용체와 경쟁 가능하므로, Ang2와 Tie-2 수용체의 결합을 저해할 수 있다. 이와 같이 경쟁적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 에피토프와 3차원 구조상의 인접한 부위를 에피토프로 인식하는 항체일 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 항체는 Ang2와의 결합 친화도(Kd)가 0.001 내지 10nM, 구체적으로 0.01 내지 1 nM, 보다 구체적으로 0.1 내지 0.8 nM인 것일 수 있다
따라서, 본 발명의 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 에피토프를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 및 이와 경쟁적으로 Ang2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서 다음의 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 122 내지 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 122 내지 127로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:
X1-Y-X2-M-S (서열번호 151)
X3-I-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Y-Y-A-D-S-V-K-G(서열번호 152)
상기 서열번호 151에서,
X1은 아스파르트산 (D), 세린(S), 또는 아스파라진(N), 예컨대, 아스파르트산 (D) 또는 아스파라진(N)이고,
X2는 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 타이로신(Y)이며,
상기 서열번호 152에서,
X3은 알라닌(A), 글라이신(G), 류신(L), 또는 세린(S)이고, 예컨대, 알라닌(A), 글라이신(G), 또는 세린(S)이고,
X4는 타이로신(Y) 또는 세린(S)이며,
X5는 프롤린(P), 히스티딘(H), 또는 세린(S)이고,
X6는 아스파르트산 (D), 글라이신(G), 또는 세린(S)이며,
X7는 세린(S), 글라이신(G), 또는 아스파르트산(D)이며,
X8은 글라이신(G) 또는 세린(S)이고,
X9는 아스파라진(N) 또는 세린(S)이며,
X10은 라이신(K), 이소류신(I), 또는 트레오닌(T)이다.
항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서 다음의 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2) 및 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:
X11-G-S-S-S-N-I-G-X12-N-X13-V-X14 (서열번호 153)
X15-X16-X17-X18-R-P-S (서열번호 154)
X19-X20-W-D-X21-S-L-X22-X23 (서열번호 155)
상기 서열번호 153에서,
X11은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,
X12는 아스파라진(N) 또는 세린(S)이며,
X13은 알라닌(A), 타이로신(Y), 또는 아스파르트산(D)이고,
X14는 아스파라진(N), 세린(S), 트레오닌(T), 또는 타이로신(Y)이며,
상기 서열번호 154에서,
X15는 알라닌(A) 또는 세린(S)이고,
X16은 아스파르트산(D) 또는 아스파라진(N)이며,
X17은 세린(S) 또는 아스파라진(N), 예컨대 세린(S)이고,
X18은 아스파라진(N), 라이신(K), 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이며,
상기 서열번호 155에서,
X19는 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,
X20은 세린(S), 알라닌(A), 또는 트레오닌(T), 예컨대 세린(S) 또는 트레오닌(T)이며,
X21은 타이로신(Y), 또는 아스파르트산(D), 예컨대 타이로신(Y)이고,
X22는 세린(S) 또는 아스파라진(N), 예컨대 세린(S)이며,
X23은 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이다.
구체예에서, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기한 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2) 및 서열번호 122 내지 129로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 122 내지 127로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2) 및 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1-KABAT CDRH2-KABAT CDRH3-KABAT
DYAMS(서열번호109) AIYPDSGNKYYADSVKG(서열번호115) ARHSSDPKVKSGYYDDGMDV(서열번호122)
DYYMS(서열번호110) GIYPSGGSTYYADSVKG(서열번호116) ARDPSTLTYAGFDY(서열번호123)
NYAMS(서열번호111) AISSGGGNIYYADSVKG(서열번호117) AKSGIQPSPPSMSSAYAMDV(서열번호124)
DYAMS(서열번호109) SIYPDDGNTYYADSVKG(서열번호118) ARHTSHHTSIDGYYYYGMDG(서열번호125)
DYDMS(서열번호112) SISHGDSNKYYADSVKG(서열번호119) AKSSGIQESPPTYYYYGMDV(서열번호126)
DYAMS(서열번호109) SIYPDDGNTYYADSVKG(서열번호118) AKHPVRLNLHPMYYYYGMDV(서열번호127)
SYDMS(서열번호113) LISPDSSSIYYADSVKG(서열번호120) AKDLISFWRGGFDY(서열번호128)
DYDMS(서열번호114) GISSDDGNTYYADSVKG(서열번호121) ARPTIDKYTLRGYYSYGMDV(서열번호129)
또한 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT CDRL2-KABAT CDRL3-KABAT
SGSSSNIGNNAVN(서열번호130) ADSNRPS(서열번호138) GSWDYSLSG(서열번호145)
SGSSSNIGNNYVT(서열번호131) ADSHRPS(서열번호139) ATWDYSLSG(서열번호146)
SGSSSNIGNNDVY(서열번호132) ANSHRPS(서열번호140) GTWDYSLSG(서열번호147)
TGSSSNIGNNDVS(서열번호133) SDSKRPS(서열번호141) GSWDYSLSG(서열번호145)
SGSSSNIGSNAVN(서열번호134) ADSNRPS(서열번호138) GSWDYSLSG(서열번호145)
TGSSSNIGNNAVS(서열번호135) SDSQRPS(서열번호142) ATWDYSLSA(서열번호148)
SGSSSNIGSNYVN(서열번호136) SDSHRPS(서열번호143) GAWDDSLSG(서열번호149)
TGSSSNIGSNYVS(서열번호137) SDNKRPS(서열번호144) GTWDDSLNG(서열번호150)
구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 109 내지 114 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 109 내지 112 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 115 내지 121 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 115 내지 119 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 122 내지 129 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 122 내지 127 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 130 내지 137 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 130 내지 135 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 138 내지 144 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 138 내지 142 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 145 내지 150 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 145 내지 148 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 156 내지 163으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 156 내지 161로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 164 내지 171로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 164 내지 169로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 수 있다.
따라서, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 156 내지 163으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 156 내지 161로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 164 내지 171로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 164 내지 169로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따른 항 Ang2 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 아래의 표 3에 정리하였다:
중쇄가변영역 아미노산 서열 경쇄가변영역 아미노산 서열
EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSSDPKVKSGYYDDGMDVWGQGTLVAVSS (서열번호 156) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 164)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSTLTYAGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 157) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 165)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIQPSPPSMSSAYAMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 158) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 166)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHTSHHTSIDGYYYYGMDGWGQGTLVTVSS (서열번호 159) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 167)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISHGDSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSGIQESPPTYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 160) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 168)
EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPVRLNLHPMYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 161) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 169)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISPDSSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLISFWRGGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 162) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 170)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISSDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPTIDKYTLRGYYSYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 163) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLNGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 171)
또 다른 예에서, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 113 또는 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 120 또는 121의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 128 또는 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 136 또는 137의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 143 또는 144의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 149 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 162 또는 163의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 170 또는 171의 아미노산 서열을 포함하는 것이 수 있다. 따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 162 또는 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 170 또는 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있으며, c-Met에 작용하여 세포내이동(internalization) 및 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.
따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하고,
상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열인 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다:
일반식 Ⅰ
Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),
일반식 Ⅱ
Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa5-Thr (서열번호 5),
일반식 Ⅲ
Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr (서열번호 6),
일반식 Ⅳ
Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)
일반식 Ⅴ
Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa13 (서열번호 8)
일반식 Ⅵ
Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa16-Thr (서열번호 9)
상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa1은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa2는 Glu 또는 Asp이며,
상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa3은 Asn 또는 Lys이며, Xaa4는 Ala 또는 Val이고, Xaa5는 Asn 또는 Thr이며,
상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa6은 Ser 또는 Thr이고,
상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa7은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa8은 Ser 또는 Trp이고, Xaa9은 His 또는 Gln이며, Xaa10는 Lys 또는 Asn이고,
상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa11은 Ala 또는 Gly이며, Xaa12은 Thr 또는 Lys이고, Xaa13는 Ser 또는 Pro이며,
상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa14은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa15는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa16는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.
일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
이에, 본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 효율성을 증진시키기 위하여, 상기 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되어 아미노산 서열이 변형된 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 영역은 서열번호 100 또는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 상기 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 항 c-Met 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00220인 하이브리도마 세포에서 생산되는, c-Met 단백질의 세포외 부위(extracellular region)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있다 (대한민국 공개특허 제2011-0047698호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).
상기의 항 c-Met 항체는 대한민국 공개특허 제2011-0047698호에 정의된 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 항 c-Met 항체의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
한편, 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄이며, 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 상기 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 36번 (kabat numbering에 따름, 서열번호 68 내의 62번째 아미노산 위치) 히스티딘 (histidine)이 티로신 (tyrosine)으로 치환된 형태의 폴리펩티드이다. 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 생산량이 증가될 수 있다. 또한 상기 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 상기 서열번호 68의 아미노산 서열 중 1번째부터 20번째까지의 시그널 펩타이드를 제외한 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 kabat numbering에 의한 27e 위치(kabat numbering에 따름, 서열번호 108 내 32번째 위치; CDR-L1 내부)의 세린(Ser)이 트립토판(Trp)으로 치환된 것으로, 상기 치환으로 인하여, 일 구체예에 따른 항체의 활성(예컨대, c-Met에 대한 결합친화도, c-Met 분해 활성 및 Akt 인산화 억제 활성 등)이 보다 증진될 수 있다.
이하, 상기 항 c-Met 항체와 항 Ang2 항체에 공통된 설명을 기재한다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. scFv-Fc는 단쇄 Fv와 불변 영역이 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결되어 있는 구조이다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 아미노산 길이와 종류를 적절하게 선택할 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
항 Ang2　항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 Ang2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.
일 예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단, 예컨대 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다.
이 때, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질이 세포 내로 이동하고 분해되는 것을 매개하는 역할을 하므로, 이러한 역할을 온전히 수행하기 위하여 완전한 항체 구조를 갖는 것이 유리할 수 있고, 항 Ang2 항체는 Ang2에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하므로, Ang2를 인식하는 항원 결합 단편을 포함하여도 무방할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met에 대한 완전한 항체 (예컨대 IgG형 항체) 및 상기 항체의 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 또는 scFv-Fc)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.
구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2, 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2는 서열번호 156 내지 163으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 164 내지 171로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met항체, 및 상기 항 c-Met 항체의 C 말단에 연결된 서열번호 156 내지 163으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 164 내지 171로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 중쇄는 서열번호 189의 아미노산 서열 (이 중, 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 상기 서열번호 189의 18번째부터 738번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 경쇄는 앞서 설명한 항 c-Met 항체의 경쇄와 같을 수 있으며, 예컨대, 서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체의 세포 내재화 (internalization) 및 분해 (degradation) 활성에 의하여, c-Met 및 Ang2의 활성 저해뿐 아니라 c-Met 및 Ang2를 분해시켜 총량을 감소시킴으로써 보다 근본적인 차단을 가능하게 한다. 따라서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 기존의 Ang2 표적 치료제, 예컨대 항 Ang2 항체 또는 항 c-Met 항체에 대하여 내성이 생긴 환자에 적용시에도 유효한 효과를 얻을 수 있다.
다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 Ang2/Tie2 신호전달체계 및/또는 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 질병은 신생혈관 형성 및/또는 혈관 투과성 증가 및/또는 Ang2 또는 c-Met 과발현과 관련된 질병을 의미할 수 있으며, 예컨대, 암; 암전이; 미숙아 망막병증, 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성 녹내장 등의 안구혈관질환; 건선, 천식, 류마티스성 관절염, 폐렴, 만성 염증 등의 염증 질환; 감염성질환(감염); 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관질환; 신장질환; 패혈증; 천식; 부종; 유전성 출혈성 모세혈관 확장증 (Hereditary hemorrhagic telangiectasia; HHT) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 암은 상기 암의 예방 및/또는 치료는 암 및/또는 암전이의 예방 및/또는 치료를 의미할 수 있다.
상기 암은 Ang2 및/또는 c-Met의 과발현 및/또는 비정상적인 활성화와 관련된 것일 수 있다. 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다 특히, 상기 암은 기존의 항암제, 예컨대 c-Met에 대한 길항제 또는 Ang2에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암일 수 있다. 상기 암은 원발성 암과 전이성 암을 모두 포함한다.
상기 약학적 조성물 또는 방법에 있어서, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제와 함께 제공될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 ㎎/kg 범위 내이다. 예컨대, 상기 약학적 조성물, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체)이 소망하는 효과, 즉 암을 예방 및/또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
한편, 상기 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 대상 또는 상기 예방 및/또는 치료 방법의 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등의 영장류 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 상기 포유류로부터 분리된 세포 또는 조직 또는 이의 배양물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 기존의 항암제, 예컨대 상기 암관련 표적 단백질(예컨대, c-Met, Ang2 등)에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암환자일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항 c-Met/항 Ang2 항체는 Ang2/Tie2 신호전달의 저해제와 c-Met/HGF 신호전달의 저해제의 두 성질을 모두 갖춘 물질로써, 다음과 같은 이점을 갖는다:
1. Ang2/Tie2 저해제와 HGF/c-Met 저해제 단독 투여 및 병용 투여 시보다 효능 증진 및 투여 농도 감소.
3. 원발성 암뿐 아니라 전이성 암의 치료제로 사용
4. 암 이외의 Ang2/Tie2 신호전달체계와 HGF/c-Met 신호전달체계가 관여하는 다른 질병에의 응용
도 1은 일 실시예에 따른 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 항 Ang2 항체 처리에 의한 Ang2와 인테그린 간 결합 저해 정도를 보여주는 그래프이다 (대조항체 1: Regeneron Ang2 항체, 대조항체 2: Astra Zeneca Ang2 항체).
도 3은 일 실시예에 따른 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 c-Met에 대한 친화도를 보여주는 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 Ang2에 대한 친화도를 보여주는 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체 처리에 의한 암세포(HUVEC) 성장 저해 효과를 보여주는 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체 처리에 의한 암세포(LEC) 성장 저해 효과를 보여주는 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체 처리에 의한 암세포 전이 억제 효과를 보여주는 결과이다.
이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 항 c- Met 항체의 제작
1.1. c- Met 에 대한 마우스 항체 ' AbF46' 의 생산
1.1.1. 마우스의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 마우스에 한 마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 상기 항원으로 사용된 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 앞서 주사한 양의 절반인 50 ㎍을 동량의 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)과 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 하기의 세포융합과정을 수행하였다.
1.1.2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조
세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양 배지(DMEM, GIBCO, Invitrogen)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 108 개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 108 개를 혼합한 다음, 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상기 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양 배지(DMEM)에 들어있는 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양 배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리 배지(HAT 배지)에 1~2×105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다.
1.1.3. c- Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
상기 참고예 1.1.2에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.
마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다.
상기 참고예 1.1.2에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 상기 준비된 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
위와 같은 반응 정도 확인에 의하여, 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 2009년 10월 6일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국 세포주연구재단에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다 (한국 공개특허 제2011-0047698 참조).
1.1.4. 단일클론 항체의 생산 및 정제
상기 참고예 1.1.3에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.
먼저 10%(v/v) FBS가 포함된 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서, 상기 세포 침전물을 배양 배지(DMEM) 배지 50 ㎖에 재현탁시킨 후, 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
이후, 원심분리하여, 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여, 4℃에 보관하거나 바로 모아서 항체의 분리 정제에 사용하였다. 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 상기 준비된 배양액 50 ㎖ 내지 300 ㎖로부터 항체를 순수 정제한 후, 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실시예에 사용하였다.
1.2. c- Met 에 대한 키메릭 항체 chAbF46 의 제작
일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 항체 chAbF46을 제작하였다.
중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 38)로, 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL- BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 39)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(서열번호 39)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터를 각각 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시켰다. 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.
1.3. 키메릭 항체 chAbF46 으로부터 인간화 항체 huAbF46 의 제작
1.3.1. 중쇄의 인간화( Heavy chain humanization )
H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 상기 참고예 1.2에서 정제된 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 40)와 H3-heavy(서열번호 41)를 구축하였다.
H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 42)를 구축하였다.
1.3.2. 경쇄의 인간화( Light chain humanization )
H1-light(서열번호 43) 및 H2-light(서열번호 44) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.
H3-light(서열번호 45)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.
H4-light(서열번호 46)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.
이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 47, H3-heavy; 서열번호 48, H4-heavy; 서열번호 49)을 pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit 에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 50, H2-light; 서열번호 51, H3-light; 서열번호 52, H4-light; 서열번호 53)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy (서열번호 42) 및 H4-light(서열번호 46)이다.
1.4. huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 제작
huAbF46 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 이용하여 huAbF46 항체의 scFv를 제작하기 위한 유전자를 디자인하였다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 'VH-링커-VL'의 형태가 되도록 하고, 상기 링커는 'GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS'(서열번호 54)의 아미노산 서열을 가지도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 huAbF46 항체의 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 55)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 이를 발현시키기 위한 벡터를 서열번호 56에 나타내었다.
이후, 상기 벡터로부터 발현된 결과물을 분석하여, c-Met에 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다.
　
1.5. 친화도 성숙( affinity maturation )을 위한 라이브러리 유전자의 제작
1.5.1. 표적 CDR 의 선정 및 프라이머 제작
huAbF46 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)을 위하여 6개의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)를 상기 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터 'Kabat numbering'에 의하여 정의하였으며, 각각의 CDR은 하기 표 4와 같다.
CDR 아미노산 서열
CDR-H1 DYYMS(서열번호 1)
CDR-H2 FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 2)
CDR-H3 DNWFAY(서열번호 3)
CDR-L1 KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 10)
CDR-L2 WASTRVS(서열번호 11)
CDR-L3 QQSYSAPLT(서열번호 12)
항체 CDR의 무작위 서열 도입을 위하여 다음과 같이 프라이머를 제작하였다. 기존의 무작위 서열 도입 방식은 돌연변이를 주고자 하는 부위에 동일한 비율의 염기 (25% A, 25% G, 25% C, 25% T)가 도입되도록 N 코돈을 이용하였으나, 본 실시예에서는 huAbF46 항체의 CDR에 무작위 염기를 도입하기 위하여, 각 CDR의 아미노산을 코딩하는 3개의 야생형(wild-type) 뉴클레오타이드 중 첫번째와 두번째 뉴클레오타이드의 85%는 그대로 보존하고, 나머지 3개의 염기를 각각 5%씩 도입하는 방식을 취하였다. 또한, 세 번째 뉴클레오타이드는 동일하게(33% G, 33% C, 33% T)가 도입되도록 프라이머를 디자인하였다.
　
1.5.2. huAbF46 항체의 라이브러리 제작 및 c- Met 에 대한 결합력 확인
CDR의 무작위 서열 도입을 통한 항체 라이브러리 유전자의 구축은 상기 참고예 1.5.1과 같은 방법으로 제작된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 주형으로 huAbF46 항체의 scFv를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 도 1에 나타낸 방법과 같이 2개의 PCR 절편을 제작하고, 이를 중복 확장 중합효소연쇄반응(overlap extension PCR) 방법을 통하여, 원하는 CDR만 각각 돌연변이된 huAbF46 항체의 scFv 라이브러리 유전자를 확보하여 제작된 6개의 CDR을 각각 표적으로 하는 라이브러리들을 구축하였다.
이렇게 제작된 라이브러리는 야생형과 각 라이브러리의 c-Met에 대한 결합력을 확인하였으며,　각각의 라이브러리는 야생형에 비하여 c-Met에 대한 결합력이 대부분 낮아지는 경향을 보였으나, 일부 c-Met에 대한 결합력이 유지되는 돌연변이들을 확인하였다.
　
1.6. 제작된 라이브러리로부터 친화도가 개선된 항체의 선별
상기 구축된 라이브러리로부터 c-Met에 대한 라이브러리의 결합력을 향상시킨 후, 각각의 개별 클론으로부터 scFv의 유전자 서열을 분석하였다. 확보된 유전자 서열은 각각 하기 표 5와 같으며, 이를 IgG 형태로 변환하였다. 하기 클론 중에서, L3-1, L3-2, L3-3, L3-5으로부터 생산된 4종의 항체를 선별하여 후속 실험을 수행하였다.
클론 이름 도출된 라이브러리 CDR 서열
H11-4 CDR-H1 PEYYMS(서열번호 22)
YC151 CDR-H1 PDYYMS(서열번호 23)
YC193 CDR-H1 SDYYMS(서열번호 24)
YC244 CDR-H2 RNNANGNT(서열번호 25)
YC321 CDR-H2 RNKVNGYT(서열번호 26)
YC354 CDR-H3 DNWLSY(서열번호 27)
YC374 CDR-H3 DNWLTY(서열번호 28)
L1-1 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 29)
L1-3 CDR-L1 KSSRSLLSSGNHKNYLA(서열번호 30)
L1-4 CDR-L1 KSSKSLLASGNQNNYLA(서열번호 31)
L1-12 CDR-L1 KSSRSLLASGNQNNYLA(서열번호 32)
L1-22 CDR-L1 KSSHSLLASGNQNNYLA(서열번호 33)
L2-9 CDR-L2 WASKRVS(서열번호 34)
L2-12 CDR-L2 WGSTRVS(서열번호 35)
L2-16 CDR-L2 WGSTRVP(서열번호 36)
L3-1 CDR-L3 QQSYSRPYT(서열번호 13)
L3-2 CDR-L3 GQSYSRPLT(서열번호 14)
L3-3 CDR-L3 AQSYSHPFS(서열번호 15)
L3-5 CDR-L3 QQSYSRPFT(서열번호 16)
L3-32 CDR-L3 QQSYSKPFT(서열번호 37)
　　
1.7. 선별된 항체의 IgG 로의 변환
선별된 4종의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-XhoI'(서열번호 38)로 구성되며, 중쇄의 경우 친화도 성숙 후에 항체의 아미노산이 변경되지 않았으므로, huAbF46 항체의 중쇄를 그대로 사용하였다. 다만, 힌지 영역(hinge region)은 인간 IgG1의 힌지가 아닌 U6-HC7 힌지(서열번호 57) 로 치환하였다. 경쇄는 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-XhoI'로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였으며, 친화도 성숙 후에 선별된 상기 4종 항체의 경쇄 가변영역을 포함하여 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 58 내지 서열번호 61)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(서열번호 38)을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 절편(L3-1 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 58, L3-2 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 59, L3-3 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 60, L3-5 유래 CDR-L3를 포함하는 DNA 절편: 서열번호 61)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여 클로닝함으로써, 친화력 성숙된 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 친화력 성숙된 4종의 항체(이하, huAbF46-H4-A1(L3-1 유래), huAbF46-H4-A2 (L3-2 유래), huAbF46-H4-A3 (L3-3 유래), 및 huAbF46-H4-A5(L3-5 유래)로 명명함)를 정제하였다.
1.8. 불변영역 및/또는 힌지영역이 치환된 huAbF46 - H4 -A1의 제조
상기 참고예 1.7에서 선별된 4종의 항체 중에서, c-Met과의 결합친화도가 가장 높고, Akt 인산화 및 c-Met 분화 정도가 가장 낮은 것으로 측정된 huAbF46-H4-A1을 대상으로, 힌지영역 또는 불변영역 및 힌지영역이 치환된 항체를 제작하였다.
huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파(kappa) 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(U6-HC7)으로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge)로; huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 중쇄 및 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄로 이루어진 항체를 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)로 각각 명명하였다. 또한, 한편, 상기 3종의 항체는 생산량 증대를 위하여 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 경쇄의 36번 히스티딘 (histidine)을 모두 티로신 (tyrosine)으로 치환하였다.
상기 3종 항체를 제작하기 위해, huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, U6-HC7힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 62)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 63), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG1 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 64)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 65), huAbF46-H4-A1의 중쇄 가변영역, 인간의 IgG2 힌지 및 인간의 IgG2 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 66)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 67), 36번 히스티틴이 티로신으로 치환된 huAbF46-H4-A1의 경쇄 가변영역 및 인간의 카파 불변영역으로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 68)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 69)를 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을, pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293 F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2 , 130 rpm incubator에서 5일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 3종의 항체(huAbF46-H4-A1(U6-HC7), huAbF46-H4-A1(IgG2 hinge), huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc))를 정제하였다. 이 중에서 본 발명에 따른 항 c-Met 항체를 대표하여 huAbF46-H4-A1(IgG2 Fc)을 선택하여 하기의 실시예에 사용하였으며, 편의상 상기 항체를 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2로 명명하였다.
참고예 2. 항- Ang2 항체 제조
2.1. Ang2 -결합 scFv 클론
인간 Ang2 폴리펩타이드(R&D systems; Human Ang2; Accession # O15123(hAng2); 서열번호 84)에 대하여 파지 디스플레이 scFv 라이브러리(이화여대 산학협력단으로부터 입수)를 사용하여 완전 인간 Ang2 항체를 제작하였다. 구체적 프로토콜은 다음과 같다.
상기 Ang2 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug(microgram)/㎖, 1 ug/㎖ 및 0.1 ug/㎖의 양으로 평판하여 1차, 2차, 3차 패닝을 통하여 ANG-2 에 반응하는 항체를 enrich 시키는 과정을 수행하였다. PBS 에 용해된 약 3%(v/v)의 우유를 사용하여 이뮤노튜브의 표면을 차단시킨 후, 약 0.5 ㎖ 의 3%(v/v) 우유에 상기 기재된 동일한 파지 디스플레이 scFv 라이브러리로부터 유래하는 약 1×1012 개의 파지 입자를 넣고 함께 37℃로 1시간 동안 항온 처리하여 blocking 하였다. 그 후 Ang2 로 평판된 이뮤노튜브에 우유로 blocking 한 파지를 넣고 실온에서 1 시간 동안 항온 처리 하여 Ang2 와 파지를 결합시켰다.
파지의 항온 처리 후, 파지 표면을 PBS 와 약 0.1%(v/v) 트윈 20으로 3 내지 5 회 세척한 후,　100 mM 트리에탄올아민을 사용하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 E. coli ER2537 세포(New England Biolabs,. USA) 내로 감염시키고 증폭시킨 뒤 수득하여 다음 단계인 스크리닝에 사용하기 위하여 준비하였다. 이러한 과정을 상기 Ang2 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug/㎖, 1 ug/㎖ 및 0.1 ug/㎖의 양으로 평판하여 3회 반복 실시 후에, 하기 기재한 바와 같이 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 친화 검정(실시예 2 참조) 을 사용하여 측정한 인간 Ang2(Accession # O15123), 마우스 Ang2(Accession # NP_031452Ang2Ang2)를 인식하는 약 600개의 특정한 Ang2-결합 scFv 클론을 확인하였다.
2.2. 항- Ang2 항체 생산 클론　선별 및 항체 정제
ELISA 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여, 상기 참고예 2.1에서 얻어진 약 600개의 Ang2-결합 scFv 클론들로부터 항-Ang2 항체를 생산하는 70 개의 클론들을　선별하였다. 구체적으로, Ang2에 결합하고 Tie2 결합을 억제할 수 있는 클론 중에서 ELISA OD 가 높은 클론들을 선별하였다. 그런 다음, 각각의 클론들을 OD 600=1.0 수준까지 ampicillin 이 첨가된 SB Media 에서 배양하여 1 mM IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) 주입 후 주변 세포질(periplasm) 분획을 모아 NI-NTA 칼럼(QIAGEN)을 이용하여 항-Ang2 단클론항체를 부분 정제하였다.
2.3. Ang2 : Tie -2 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )
결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 4　ug/ul의　인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.
Ang2:Tie-2 neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 2에서 정제된 각각의 scfv 형태의 항-Ang2 항체(1, 10, 100, 1000 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 400 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hAng2와 함께 상기 hTie2-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul(microliter)의 양으로 넣어주고 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온 ℃에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H2SO4 용액 50 ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 Ang2:Tie-2의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 6에 나타내었다.
항체 명칭 Ang2:Tie-2 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 18.9
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 24.3
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 36.3
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 39.7
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 9.9
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 6.5
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 10
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 6.6
상기 표 6에서와 같이,　항-Ang2 항체가 Ang2와 Tie-2수용체 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.
2.4. hAng2 , mAng2 , 의 결합 ELISA
상기 제작된 항체의 각각의 항원들에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 5~20　ug/ml의　인간 Ang2, 마우스 Ang2(Mouse Ang2; Accession # NP_031452) (이상, R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 상기 제작된 각각의 scFv 형태의 항-Ang2 항체를 상기 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다.
그런 다음, 0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-HA(HA-probe Antibody (F-7) HRP conjugated)　항체 (Santacruz)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:1,000 비율(v/v)로 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 양으로 넣어주고, 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 이후, 5N H2SO4 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 인간 Ang2 및 마우스 Ang2 단백질에 대한 50% 결합　농도(Kd)를 구함으로써 항-Ang2 항체가 각각의 단백질에 대한 결합력 정도를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 7에 나타내었다:
항체 명칭 인간 Ang2
(Kd, nM) 		마우스 Ang2 (Kd, nM)
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 9.3 5.1
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 5.3 15.8
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 5.3 11.7
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 3.8 8.7
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 4.3 37.8
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 4.9 28.6
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 12.1 23.8
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 3 20.7
　2.5. Ang2 에피토프 맵핑( mapping )
상기 얻어진 항 Ang2 항체들에 대해 각각의 에피토프를 확인하기 위하여 Ang2 단백질의 수용체 결합 부위를 인위적으로 돌연변이를 일으킨 재조합 단백질을 이용하여 ELISA를 수행하였다.
96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 100 nM의 상기 선별한 항-Ang2 scFv 50 ul로 코팅하였다.　그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 1% BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.　 Ang2의 S417, Q418, P419, N421, I434, D448, A449, P452, Y460, N467, K468, 또는 F469 잔기를 알라닌으로 치환(mutation)시키고, FLAG(N-DYKDDDDK-C; 1012 Da)로 Tagging하여, 상기 플레이트의 각각의 웰에 각각 250ng씩 넣어준 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 그런 다음, 0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체 (SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 양으로 넣어주고 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다.
마지막으로, 상기 플레이트의 각 웰에 100 μl의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H2SO4 용액 50μl로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. Mutation 을 시킨 Ang2와의 결합력을 mutation 을 시키지 않은 Ang2와 비교함으로 Ang2 항체들에 대한　각각의 에피토프를 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 8 및 표 9에 나타내었다:　
　 항체 명칭
(SAIT-ANG-2 생략)		 native Ang2 의 결합력에 대한Mutant Ang2 와의 결합력(%)
I434 A449 P452 Y460 N467 K468 F469
AB-2-E6 5.3 3.3 24.0 40.0 72.1 94.0 112.3
AB-4-H10 32.9 71.0 269.8 245.8 29.8 214.5 276.7
AB-8-A5 4.0 30.5 86.5 91.6 90.7 101.0 101.5
AB-7-C9 8.7 14.5 85.0 78.1 86.6 97.3 89.4
AB-3-D3 93.4 100.6 97.3 95.1 90.9 95.9 96.4
AB-4-C11 7.2 4.8 70.0 74.3 81.7 94.8 102.3
AB-4-F5 68.6 14.0 15.0 21.8 11.3 87.4 259.0
AB-4-F11 69.0 16.7 91.6 96.1 92.0 101.5 104.9
대조항체1 93.3 95.8 95.4 86.7 94.4 86.9 3.2
(상기 표 중, 대조항체 1은 Regeneron Ang2 항체이다)　
클론 번호 (Clone #) 에피토프 (결합부위)
1 AB-2-E6, AB-7-C9, AB-4-C11 I434, A449
2 AB-8-A5 I434
3 AB-4-F11 A449
4 AB-4-F5 A449, P452, N467
2.6. 항- Ang2 인간　항체 유전자 클로닝
상기 상체 선별 결과물로부터 얻어진 각각의 항체 생산 E. coli glycerol stock으로부터　써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 각 클론들에서 생산되는 단클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열을　증폭시켰다:
PCR 조건
94℃에서 5분간;
[94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 30　사이클;
72℃에서 6분간;
4℃로 냉각
프라이머: pC3X-f: 3'-GCACGACAGGTTTCCCGAC-5'(서열번호 190), pC3X-b: 3'-AACCATCGATAGCAGCACCG-5'(서열번호 191).
각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)으로 세정하였다.
상기 확보된 PCR 결과물들을 클로닝한 후 공시된 방법으로 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하였다. 그 결과 아래의 표 10과 표 11에 나타난 CDR 서열들을 확보할 수 있었다.
　 중쇄 CDR 아미노산 서열
항체명칭 CDRH1-KABAT CDRH2-KABAT CDRH3-KABAT
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 DYAMS(서열번호109) AIYPDSGNKYYADSVKG(서열번호115) ARHSSDPKVKSGYYDDGMDV(서열번호122)
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 DYYMS(서열번호110) GIYPSGGSTYYADSVKG(서열번호116) ARDPSTLTYAGFDY(서열번호123)
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 NYAMS(서열번호111) AISSGGGNIYYADSVKG(서열번호117) AKSGIQPSPPSMSSAYAMDV(서열번호124)
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 DYAMS(서열번호109) SIYPDDGNTYYADSVKG(서열번호118) ARHTSHHTSIDGYYYYGMDG(서열번호125)
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 DYDMS(서열번호112) SISHGDSNKYYADSVKG(서열번호119) AKSSGIQESPPTYYYYGMDV(서열번호126)
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 DYAMS(서열번호109) SIYPDDGNTYYADSVKG(서열번호118) AKHPVRLNLHPMYYYYGMDV(서열번호127)
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 SYDMS(서열번호113) LISPDSSSIYYADSVKG(서열번호120) AKDLISFWRGGFDY(서열번호128)
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 DYDMS(서열번호114) GISSDDGNTYYADSVKG(서열번호121) ARPTIDKYTLRGYYSYGMDV(서열번호129)
　 경쇄 CDR 아미노산 서열
항체명칭 CDRL1-KABAT CDRL2-KABAT CDRL3-KABAT
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 SGSSSNIGNNAVN(서열번호130) ADSNRPS(서열번호138) GSWDYSLSG(서열번호145)
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 SGSSSNIGNNYVT(서열번호131) ADSHRPS(서열번호139) ATWDYSLSG(서열번호146)
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 SGSSSNIGNNDVY(서열번호132) ANSHRPS(서열번호140) GTWDYSLSG(서열번호147)
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 TGSSSNIGNNDVS(서열번호133) SDSKRPS(서열번호141) GSWDYSLSG(서열번호145)
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 SGSSSNIGSNAVN(서열번호134) ADSNRPS(서열번호138) GSWDYSLSG(서열번호145)
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 TGSSSNIGNNAVS(서열번호135) SDSQRPS(서열번호142) ATWDYSLSA(서열번호148)
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 SGSSSNIGSNYVN(서열번호136) SDSHRPS(서열번호143) GAWDDSLSG(서열번호149)
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 TGSSSNIGSNYVS(서열번호137) SDNKRPS(서열번호144) GTWDDSLNG(서열번호150)
2.7. 완전　항체의 발현 및 정제
상기 참고예 2.6에서 얻어진 중쇄와 경쇄의 가변영역(아래의 표 12 및 13 참조)을 각각 서로 다른 벡터에 클로닝시켰다. 중쇄 가변영역은 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter)를 가지고 있으며 인간 IgG1의 불변영역(constant region)과 Fc 영역을 포함하는 벡터 pOPTI-VEC (Invitrogen)에 클로닝하였다. 경쇄는 CMV 프로모터를 가지고 있으며, 인간 IgG1의 불변 영역을 포함하고 있는 벡터 pFUSE2-CLIg-hl2 (Invivogen)에 클로닝을 하였다.
구체적으로 중쇄와 그를 포함하는 벡터는 ecorI(neb)와 NheI(neb)의 제한효소(restriction enzyme)를 처리하고, 경쇄와 그를 포함하는 벡터는 ecorI(neb)과 avrII(neb)의 제한 효소를 처리한 후, T4 DNA Ligase(New England Biolab)로 라이게이션(ligation)을 시켜 원하는 가변영역이 포함된 인간 항체 발현용 중쇄 벡터와 경쇄 벡터를 제조하였다.
이렇게 하여 얻어진 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 293-F　세포 (invitrogen)에 같이 트랜스펙션(transfection)시켰다. 상기 세포를 혈청(serum)을 넣지 않은 293-f expression medium (Invitrogen)배지에서 37℃에서 배양 시키면서 5 일째 되는 날 배양액을 회수 하였다. SDS-PAGE로 확인한 결과 상기　배양을 통해 얻어진 배양액은 하기의 표 9의 가변영역의 서열을 포함하는 중쇄와 경쇄로 구성된 인간 항체를 포함하였다. 상기 발현된 키메릭 항체가 함유된 배양액을 1000 xg 속도로 10 분간 원심분리하여 잔류 하는 세포 및 불순물을 제거한 후 항체 Fc 영역과 강한 친화력을 갖는 Protein A(GE-Healthcare)를　이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 low PH elution을 통해 항체를 정제하였다.
상기 정제된 항체의 중쇄 가변부와 경쇄 가변부의 아미노산 서열과 염기 서열을 분석하여 아래의 표 12 및 표 13에 나타내었다:
항체 명칭 중쇄가변영역 아미노산 서열 경쇄가변영역 아미노산 서열
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSSDPKVKSGYYDDGMDVWGQGTLVAVSS (서열번호 156) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 164)
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSTLTYAGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 157) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 165)
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIQPSPPSMSSAYAMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 158) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 166)
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHTSHHTSIDGYYYYGMDGWGQGTLVTVSS (서열번호 159) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 167)
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISHGDSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSGIQESPPTYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 160) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 168)
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPVRLNLHPMYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 161) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 169)
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISPDSSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLISFWRGGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 162) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 170)
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISSDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPTIDKYTLRGYYSYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 163) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLNGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 171)
(상기 표 중에서 굵은 체로 표시한 부분은 순서대로 CDR1, CDR2, 및 CDR3를 나타냄)
항체 명칭 중쇄가변영역 뉴클레오티드 서열 경쇄가변영역 뉴클레오티드 서열
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 GAAGTGCAGCTTCTGGAATCAGGCGGTGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCAGCCTCAGGCTGTCTTGCGCAGCCAGCGGATTTACCTTCTCCGATTACGCCATGAGCTGGGTTAGACAGGCCCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCAGTGCCATTTACCCCGACTCCGGGAATAAGTATTACGCTGACTCTGTGAAAGGTAGATTCACTATCTCAAGAGACAACTCCAAAAATACATTGTACTTACAGATGAACTCACTGCGCGCTGAGGATACAGCAGTGTATTATTGTGCGCGGCACTCGAGTGATCCTAAGGTCAAAAGCGGATACTATGACGACGGCATGGATGTTTGGGGCCAAGGGACTCTCGTAACCGTGTCTTCT(서열번호 173) CAGTCAGTCCTGACACAGCCCCCTAGTGCTTCCGGAACCCCTGGGCAGAGGGTGACCATCTCATGCTCAGGTAGCTCCAGCAACATTGGAAACAATGCAGTTAATTGGTATCAGCAACTGCCCGGGACCGCCCCAAAGCTTCTGATCTACGCTGATAGTAATAGACCATCTGGAGTGCCTGACAGATTCAGTGGTTCGAAAAGCGGCACTTCTGCATCCTTGGCCATTTCTGGCTTAAGATCTGAAGATGAGGCCGACTATTACTGTGGCTCTTGGGACTACTCCCTGAGCGGATATGTGTTTGGGGGCGGAACTAAGCTCACAGTCCTAGGC (서열번호174)
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 GAGGTCCAGCTGCTCGAATCAGGCGGTGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGCTCCCTGAGGTTAAGTTGCGCCGCTTCTGGCTTTACATTTAGCGATTATTACATGTCCTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGGAAAGGTCTGGAGTGGGTGAGCGGAATTTACCCTTCCGGGGGAAGCACCTATTACGCGGATTCTGTAAAGGGTAGATTCACTATCTCAAGAGACAATTCTAAGAATACCCTGTATTTGCAGATGAACAGTCTTAGAGCCGAAGACACAGCAGTTTATTATTGTGCAAGAGACCCCAGTACTCTAACCTACGCTGGCTTCGATTACTGGGGACAAGGAACGCTCGTGACAGTGTCAAGC (서열번호 175) CAAAGTGTTCTCACACAGCCGCCATCCGCTTCCGGGACCCCTGGACAGAGAGTGACCATCAGTTGTAGTGGCTCTTCGAGCAATATTGGCAATAACTATGTGACATGGTATCAGCAGCTTCCTGGAACAGCCCCCAAACTGCTCATCTATGCCGACAGCCACAGACCATCAGGTGTCCCCGATAGATTTTCTGGGTCAAAGTCAGGAACTAGCGCAAGCCTGGCCATTTCTGGATTAAGGTCCGAGGACGAAGCTGATTACTATTGCGCAACTTGGGACTACTCTCTGTCTGGTTACGTGTTCGGCGGCGGAACCAAGTTGACGGTCCTAGGC (서열번호 176)
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 GAGGTGCAACTCCTGGAGTCAGGAGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGTCTTAGACTCTCGTGTGCCGCAAGCGGGTTTACATTCAGTAACTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCTGGAAAGGGACTGGAATGGGTTTCTGCCATTAGCTCCGGCGGAGGTAATATCTATTACGCTGATTCCGTTAAAGGGAGGTTTACAATCTCTCGGGATAACAGCAAAAATACTTTGTATCTGCAGATGAATAGCTTAAGAGCCGAAGACACTGCAGTGTACTACTGCGCGAAGAGCGGTATTCAACCCTCTCCACCATCCATGTCATCAGCTTATGCAATGGACGTATGGGGGCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGTTCT (서열번호 177) CAGAGCGTCCTGACACAACCTCCATCCGCTTCTGGGACGCCTGGACAGAGAGTGACAATTTCTTGCAGCGGCTCATCTTCAAATATTGGAAACAATGACGTTTATTGGTACCAGCAGCTCCCAGGGACCGCCCCAAAGCTGCTGATCTATGCAAACTCACACAGACCCAGCGGAGTGCCCGATAGATTCAGTGGATCCAAATCCGGCACTAGTGCCAGCTTGGCAATCTCGGGGCTGAGATCTGAAGACGAGGCTGATTACTATTGTGGTACCTGGGATTACTCCTTAAGTGGTTACGTGTTTGGCGGGGGCACTAAGCTTACCGTCCTAGGC (서열번호 178)
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 GAAGTACAGCTGCTGGAGTCGGGTGGTGGACTGGTTCAGCCAGGAGGCTCATTAAGGCTGAGCTGCGCCGCAAGCGGTTTCACTTTTTCTGATTATGCTATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCTGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCTCAAGTATTTACCCCGACGATGGAAATACCTACTATGCCGATAGCGTGAAGGGGCGCTTTACAATCTCTAGAGATAATTCTAAAAACACCCTGTACCTTCAAATGAACTCATTGCGGGCAGAAGACACAGCGGTGTACTATTGTGCTAGACACACGTCCCACCATACCAGCATCGACGGCTACTATTATTACGGGATGGACGGCTGGGGCCAGGGCACTCTCGTGACAGTGTCCAGT(서열번호 179) CAGTCAGTCCTGACTCAGCCACCCTCCGCAAGCGGGACACCTGGACAAAGAGTTACTATCTCTTGCACCGGGTCAAGCTCCAATATCGGTAACAATGATGTGAGTTGGTACCAGCAGTTACCAGGCACCGCCCCGAAACTGCTTATTTACTCAGACAGCAAAAGACCCTCTGGCGTGCCTGACAGATTCTCAGGAAGCAAGAGTGGCACGTCTGCTTCCTTGGCCATTTCGGGTCTGAGATCCGAGGACGAAGCTGATTATTATTGTGGAAGCTGGGATTATAGTCTGTCTGGCTACGTGTTTGGGGGCGGAACCAAGCTCACAGTCCTAGGC (서열번호 180)
IT-ANG-2-AB-4-F5 GAGGTGCAGTTGCTCGAGTCCGGGGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGAGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCAGCCTCAGGTTTCACATTCTCCGATTACGACATGTCCTGGGTTAGGCAAGCCCCCGGCAAGGGGCTGGAATGGGTAAGCTCTATCAGCCACGGCGACAGTAACAAATATTATGCAGACTCTGTTAAGGGACGGTTTACCATTTCACGCGATAACTCAAAGAATACACTGTACCTTCAAATGAATAGTCTCAGAGCTGAAGATACCGCCGTGTATTACTGTGCTAAATCGTCCGGAATCCAGGAGAGTCCCCCTACTTATTACTACTATGGGATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCTGCTAGC (서열번호181) CAGTCTGTGTTGACCCAGCCCCCTTCTGCATCTGGCACCCCCGGACAGAGAGTCACTATAAGTTGTTCTGGTAGCTCCTCAAATATCGGCTCAAACGCCGTGAATTGGTACCAGCAATTACCAGGAACAGCTCCTAAGCTGCTTATCTATGCAGACAGTAACAGACCAAGCGGCGTTCCTGATAGATTCTCAGGCTCCAAGTCCGGGACTAGTGCCTCGCTGGCTATTAGCGGTCTCAGAAGTGAAGATGAGGCCGATTACTATTGCGGAAGCTGGGACTACTCCCTGAGCGGCTATGTGTTTGGAGGAGGGACAAAACTCACCGTCCTAGGC (서열번호 182)
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 GAGGTGCAACTGCTGGAGAGTGGTGGGGGCCTTGTTCAGCCCGGCGGATCCTTGAGGCTGTCATGCGCTGCGTCTGGCTTTACTTTCAGCGATTACGCAATGAGTTGGGTGAGACAGGCTCCAGGAAAAGGCCTGGAATGGGTCAGCTCCATTTATCCTGACGATGGTAACACATATTACGCCGACAGCGTAAAAGGACGGTTCACCATCTCTCGCGATAATTCTAAGAACACCCTGTATCTCCAGATGAATAGCCTGAGAGCAGAAGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGCATCCTGTGAGATTAAACCTGCACCCAATGTACTATTATTACGGCATGGACGTTTGGGGGCAGGGGACACTCGTGACTGTCTCCTCA (서열번호 183) CAGTCTGTGTTAACACAACCTCCAAGTGCATCCGGAACGCCGGGCCAGAGAGTGACTATCAGCTGCACCGGCAGCTCGTCCAATATCGGTAACAACGCAGTTAGTTGGTACCAGCAGCTTCCCGGCACAGCTCCAAAGCTCTTGATTTACAGCGATTCACAAAGACCTAGTGGTGTCCCCGATAGATTTTCTGGGAGTAAGAGCGGGACCAGTGCCTCCCTGGCTATATCAGGACTGAGATCTGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTGCCACTTGGGACTATTCACTCTCTGCCTATGTGTTCGGGGGCGGAACCAAACTGACAGTCCTAGGC (서열번호 184)
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 GAGGTTCAGTTGCTGGAGAGTGGCGGCGGCTTAGTGCAGCCAGGTGGCAGCCTGCGCCTTTCTTGTGCCGCCAGTGGGTTTACCTTCTCCTCCTACGACATGAGCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAAGGTCTTGAATGGGTGTCACTGATCAGCCCTGACAGTTCCTCAATCTATTATGCAGATTCAGTCAAGGGAAGATTTACCATAAGCAGAGATAATTCCAAGAATACTCTGTACCTACAGATGAACTCGCTCAGAGCCGAAGATACCGCAGTCTACTACTGCGCTAAAGACCTGATTTCTTTCTGGAGGGGGGGATTCGACTATTGGGGGCAAGGAACACTCGTAACAGTGTCTAGC (서열번호 185) CAGAGCGTGCTCACCCAACCTCCCAGTGCATCCGGAACGCCTGGTCAGAGAGTGACAATTAGCTGCTCAGGGTCTTCCTCTAACATCGGGTCCAATTATGTCAATTGGTATCAGCAGTTGCCAGGTACAGCTCCCAAACTGCTGATCTACAGTGATTCCCACAGACCTAGCGGCGTTCCAGACAGATTTAGCGGATCCAAGTCGGGAACTTCTGCAAGCCTCGCTATTTCTGGCCTGAGAAGTGAGGACGAAGCCGATTATTACTGTGGGGCCTGGGACGATTCATTATCAGGATACGTGTTCGGAGGCGGCACCAAGCTTACTGTCCTAGGC (서열번호 186)
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 GAGGTACAGCTGCTGGAAAGTGGGGGCGGTCTGGTGCAGCCAGGGGGAAGCCTCCGGCTTTCATGCGCCGCAAGCGGCTTTACATTCAGTGACTATGACATGAGTTGGGTCCGACAAGCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCTGGAATCTCCTCCGATGACGGCAATACTTATTACGCTGACTCCGTTAAAGGTAGGTTCACCATCTCTCGCGATAACTCTAAAAACACCCTCTACCTGCAGATGAATAGCTTGAGGGCAGAAGATACGGCTGTCTACTATTGTGCCAGACCTACAATTGACAAGTACACATTAAGAGGGTATTATTCATACGGCATGGATGTTTGGGGACAGGGAACTCTAGTGACCGTGTCCAGC (서열번호 187) CAGTCAGTGCTGACACAGCCTCCAAGCGCTTCCGGGACACCTGGACAAAGAGTTACCATTTCGTGCACCGGATCCTCCTCAAACATCGGTAGCAATTATGTGTCTTGGTACCAGCAGCTCCCCGGGACTGCCCCCAAACTCTTGATCTACAGCGACAACAAGAGACCATCTGGTGTGCCTGATAGATTCAGTGGGAGTAAGTCAGGAACGAGTGCCTCTCTGGCTATTTCTGGCCTGAGAAGCGAAGATGAGGCAGACTATTATTGTGGCACCTGGGATGACTCCCTGAATGGCTACGTCTTTGGCGGCGGAACAAAACTTACTGTCCTAGGC(서열번호 188)
2.8. Ang2 : Tie -2 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )
결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 4　ug/ul의　인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.
Ang2:Tie-2 neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 2에서 정제된 각각의 IgG 형태의 항-Ang2 항체(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 100 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 400 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hAng2와 함께 상기 hTie2-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul의 양으로 넣어주고 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온 ℃에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H2SO4 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 Ang2:Tie-2의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 14에 나타내었다.
항체 명칭 Ang2:Tie-2 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 0.605
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 0.417
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 0.341
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 0.392
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 0.44
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 0.421
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 1.525
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 0.37
상기 표 14에서와 같이,　항-Ang2 항체가 Ang2와 Tie-2수용체 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.
2.9. mAng2 의 결합 ELISA
상기 제작된 항체의 각각의 항원들에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 5~20　ug/ml의　인간 Ang2, 마우스 Ang2(Mouse Ang2; Accession # NP_031452) (이상, R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 상기 제작된 각각의 IgG 형태의 항-Ang2 항체(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 100 nM)를 상기 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다.
그런 다음, 0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-human FC(Anti-hFc-HRP conjugated)　항체 (SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 양으로 넣어주고, 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 이후, 5N H2SO4 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 인간 Ang2 및 마우스 Ang2 단백질에 대한 50% 결합　농도(Kd)를 구함으로써 항-Ang2 항체가 각각의 단백질에 대한 결합력 정도를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 15에 나타내었다:
항체 명칭 마우스 Ang2 (Kd, nM)
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 0.35
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 0.21
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 0.19
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 0.30
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 0.28
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 0.36
2.10. 표면 플라즈몬 공명( Surface Plasmon Resonance , SPR ) 방식을 이용한 항원 친화도 ( Kd values ) 측정
항 Ang2 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리면 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 Kd 값을 계산한다.
먼저 pH 5.0 아세테이트 용액과 아민 커플링 키트(amine coupling kit; GE Healthcare)를 이용하여 anti-His 항체를 8,000 RU 레벨까지 CM5 센서칩(GE Healthcare)에 고정화시켰다. 여기에 6 ug/ml 농도의 재조합 hAng2(C-His, R&D Systems) 단백질을 흘려 보내 100 ~ 200 RU 레벨로 capture시켰다. 여기에 상기 실시예 2에서 얻어진 항체를 100 nM 농도로부터 순차적으로 2배씩 희석시킨 후, 각각 흘려 보내는 방법으로 센서칩에 capture된 항원과 결합 (on), 분리 (off), 해리 (regeneration, 10 mM NaOH 용액 사용)시키며 항원-항체간 친화도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 16과 같다.
항체 명칭 온 레이트(On rate) (1/Ms) 오프 레이트(Off Rate) (1/s) 친화도(Affinity) (Kd, nM)
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 1.220 x 106 7.950 x 10-4 0.65
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 2.812 x 106 3.328 x 10-4 0.118
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 4.396 x 106 3.266 x 10-4 0.074
SAIT-ANG-2-AB-7-C9 1.785 x 106 3.661 x 10-4 0.205
SAIT-ANG-2-AB-3-D3 1.162 x 106 5.461 x 10-4 0.47
SAIT-ANG-2-AB-4-C11 8.327 x 105 4.899 x 10-4 0.588
SAIT-ANG-2-AB-4-F5 1.895 x 106 0.001117 0.589
SAIT-ANG-2-AB-4-F11 1.765 x 106 7.774 x 10-4 0.44
　2.11. Ang2 항체의 Ang2 수용체 활성 저해 시험
Ang2는 혈관내피세포에 발현된 Tie-2 수용체와 결합하여 수용체의 인산화를 유도하여 활성화함으로써 혈관내피세포의 변화를 유도하는 작용을 하므로, 세포기반 분석법을 이용한 항 Ang2 항체의 기능성 분석을 통하여 상기 항체의 Ang2 저해 활성을 검정하였다.
이를 위하여, 60mm culture dish에서, HUVEC (ATCC) 세포 (Kim et al., Biochim Bioohys Acta ., 2009) 1X106개를 5%(v/v) FBS (Gibco)가 첨가된 EGM-2 (Endothelial growth media) 배지 (Lonza)를 이용하여 37℃에서 배양 후, 80~90% confluency를 보이면, 무혈청 EGM-2 배지로 바꾸어 16시간 37℃에서 배양한다. PBS로 한 번 세척한 뒤, 0.1nM의 sodium orthovanadate 가 혼합된 EGM-2 배지로 바꾸어 10분간 더 배양하였다. PBS로 한 번 세척한 뒤, 상기 실시예 2에서 제작된 항 Ang2 항체를 10 ug/ml농도로 2 ug/ml human Ang2 단백질(R&D systems)과 혼합하여 20분간 둔 뒤, 상기 배양된 세포에 처리하고 10분간 더 배양하였다.
차가운 PBS를 이용하여 상기 세포를 세척한 뒤, 300ul의 lysis buffer (Roche) 를 처리한 후, 세포를 tube에 모으고, 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상층액을 정량하였다. 세포용해물0.5mg 에 2ug의 항 Tie-2 항체 (R&D system)를 넣고 4℃에서 밤새도록(overnight) 반응 시킨 후, protein A bead (GE Healthcare)를 넣어 면역침강(immunoprecipitation)시켰다.
상기 얻어진 반응물을 13,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 펠렛을 얻은 후, lysis buffer (Roche)로 2 내지 3회 세척하고, reducing agent가 혼합된 sample buffer (Invitrogen) 를 넣고 95℃에서 5분간 끓인 뒤, NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel(Invitrogen) running하고, Nitrocellulose membrane (Invitrogen)에 transfer하였다.
Tie-2 인산화 여부의 확인을 위하여, 위의blot을 3%(v/v) skim milk (Sigma)가 혼합된 PBST로 30분간 blocking 한 뒤, HRP-conjugated anti-phospho tyrosine 항체 (Millipore)를 이용하여 확인하였다. Tie-2 확인을 위하여, blot을 stripping buffer (Thermo)에 15분간 반응시킨 뒤, 다시 blocking하여 항 Tie-2 항체 (Santa cruz)를 이용하여 확인하였다. Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html) 를 이용하여 band intensity를 측정 후, Ang2 단독 처리군 대비 anti-Ang2 항체 처리후 Tie2 인산화의 저해 정도를 %로 나타내었으며, 결과는 하기 표 17에 나타내었다.
항체 명칭 및 처리량(50nM) Tie2 인산화 저해정도 (%)
SAIT-ANG-2-AB-4-H10 69 %
SAIT-ANG-2-AB-8-A5 60 %
SAIT-ANG-2-AB-2-E6 62 %
2.12. Ang2 와 인테그린 간 결합 저해 시험
인테그린(integrin; alpha5beta1(α5β1 (α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556); R&D systems) 단백질을 5 ug/ml의 농도로 PBS에 희석한 희석액을 ELISA 플레이트에 코팅한 후 (18시간, 4℃), 1%(v/v) BSA로 상온에서 2시간동안 블라킹하였다. 이후, FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang2 단백질 (FLAG-Ang2, PBS에 10 ug/ml의 농도로 희석된 Ang2 단백질 용액 0.05 ml)과 항체(PBS에 10 ug/ml의 농도로 희석된 항체 용액 0.05 ml)를 동시에 처리하여 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBS-t (0.1%(v/v) triton X-100 in PBS)로 5회 세척하였다. 그 후, horse radish peroxidase (HRP)가 접합(conjugation)되어 있는 항-FLAG 항체(Sigma)를 첨가하여 반응시키고, 다시 PBS-t로 5회 세척하였다. TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine)를 HRP의 기질로 사용한 발색반응을 통해 ELISA 플레이트내 남아있는 항-FLAG 항체의 양을 측정함으로써 간접적으로 Ang2와 상기 3종의 인테그린 간의 결합을 확인하였다. 음성 대조군으로 Ang2 단백질 처리 없이 블라킹(PBS만 처리)만 된 것을 사용하였다. 또한 양성 대조군으로 대조항체 1 (Regeneron Ang2 항체)과, 대조항체 2 (Astra Zeneca Ang2 항체)를 사용하였다. 또한 background를 나타내기 위하여, 인테그린 대신 BSA를 코팅한 군을 사용하였다.
상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 항 Ang2 항체는 인테그린과 Ang2 간 결합을 현저하게 억제함을 알 수 있다.
실시예 1: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 제작
상기 참고예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 Fc의 c-말단에 상기 참교예 2에서 제작된 항 Ang2 scFv를 융합한 이중 특이 항체를 제작하였다. 그 제작 과정은 아래와 같다.
우선, 상기 이중 특이 항체 클로닝에 이용된 L3-1Y-IgG2 항체의 중쇄 부분은 다음과 같이 제작하였다. 항 c-Met 항체의 중쇄 코딩 염기서열은 서열번호 67의 position 1393부터의 C-terminal 쪽 서열을 삭제하고, 그 대신 ggcggtggtggttccggaggcggcggatcc을 삽입하여 합성하였다 (바이오니아). 이후, Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVECTM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 DNA 절편을 ligate하였다.
한편, 항 Ang2 항체 4-H10의 중쇄 가변 영역(서열번호 162) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 170)가 펩타이드 링커 (G4S)2로 연결된 항 Ang2 scFv를 제작하였다. 구체적으로, 항 Ang2 항체 4-H10의 중쇄 가변 영역 코딩 염기서열 (서열번호 185; 바이오니아에 의뢰하여 합성), 경쇄 가변 영역 코딩 염기서열 (서열번호 186; 바이오니아에 의뢰하여 합성), 및 상기 펩타이드 링커의 코딩 염기서열을 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다 (N-terminal BamHI 제한 효소 인식부위 및 C-terminal XhoI 제한 효소 인식 부위 포함 형태).
그 후, BamHI 제한 효소와 XhoI 제한 효소를 사용하여 상기 제작된 항 Ang2 scFv을 앞서 준비된 L3-1Y-IgG2 부분이 포함되어 있는 벡터에 클로닝하여, 상기 이중 특이 항체의 중쇄를 포함하는 발현 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 이중 특이 항체의 중쇄(c-Met 항체의 중쇄부분과 anti-Ang2 scFv이 펩타이드 링커로 연결됨)의 아미노산 서열 (서열번호 189)의 각 부위를 아래의 표 18에 정리하였다:
서열번호 189
N-말단 --> C-말단
Signal peptide MEWSWVFLVTLLNGIQC
항 c-Met 항체의 중쇄 가변부위 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWLGFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWFAYWGQGTLVTVSS
Fc (IgG2) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
링커 (Fc의 C-말단과 항-Ang2 scFv 연결) GGGGSGGGGS
항-Ang2 scFv의 중쇄 가변부위 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRLAPGKGLEWVSLISPDSSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLISFWRGGFDYWGQGTLVTVSS
링커 (항-Ang2 scFv의 중쇄가변부위와 경쇄가변부위 연결) GGGGSGGGGS
항-Ang2 scFv의 경쇄가변부위 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDDSLSGYVFGGGTKLTVLGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS
(밑줄 그은 부분은 CDR을 나타냄)
또한, 항 c-Met 항체의 경쇄 코딩 염기서열은 서열번호 69의 염기서열을 갖도록 합성하였다 (바이오니아). Invitrogen 사의 OptiCHOTM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 포함하는 DNA 절편을 삽입하여, 상기 이중 특이 항체의 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하였다. 상기 염기서열에 의하여 합성되는 항 c-Met 항체의 경쇄의 아미노산 서열 (서열번호 68)의 각 부위를 아래의 표 19에 정리하였다:
서열번호 68
N-말단 --> C-말단
Signal peptide MDSQAQVLMLLLLSVSGTCG
항 c-Met 항체의 중쇄 가변부위 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLASGNQNNYLAWYQQKPGKAPKMLIIWASTRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSRPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(밑줄 그은 부분은 CDR을 나타냄)
상기 구축된 중쇄 발현 벡터와 경쇄 발현 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 임시발현은 FreestyleTM MAX 293 Expression System (invitrogen)을 이용하여 진행 되었다. 사용된 세포주는 293F cell 이며, FreeStyle™ 293 Expression Medium를 배지로 사용하여 부유배양방식으로 배양되었다. 임시발현 하루 전 세포를 5x105cells/ml의 농도로 준비한 후, 24시간이 지난 뒤 cell수가 1x106cells/ml이 되었을 때 임시발현을 진행하였다. FreestyleTM MAX reagent (invitrogen)을 사용한 liposomal reagent법으로 형질도입(transfection)을 진행 하였으며, 15ml tube에 중쇄 DNA: 경쇄 DNA=1:1 의 비율로 DNA를 준비하여 OptiPro™ SFM (invtrogen) 2ml과 mix하고(A), 또 다른 15ml tube에 FreestyleTM MAX reagent 100㎕와 OptiPro™ SFM 2ml을 mix(B)한 후, (A)와 (B)을 mix하여 15분간 incubation 한 후, 하루 전에 준비한 세포에 혼합액을 천천히 섞어주었다. 형질도입 완료 후, 37 ℃, 80% humidity, 8% CO2, 130 rpm incubator에서 4일간 배양하였다.
상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 각각 100 ml 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(GE healthcare, 11-0034-95)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출시킨 다음, 얻어진 용출물을 PBS 버퍼로 교환하였다.
상기 제작된 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2의 c-말단에 항 Ang2 scFv가 융합된 항체를 항 c-Met/항 Ang2 이중항체 (BS ab)로 명명하였다.
실시예 2: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 c- Met 에 대한 결합 친화도
상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 c-Met에 대한 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. 이를 위하여, 인간 Fab 결합제(GE Healthcare)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90~120 RU의 ME22S를 포획하고, 다양한 농도의 c-Met-Fc(#358-MT/CF, R&D Systems) 또는 를 상기 포획된 항체에 주입하였다. 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.
상기 얻어진 결과를 아래의 표 20 및 도 3에 나타내었다:
Rmax (RU) KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) Chi2 U-Value T(ka) T(kd)
65.40 0.09 8.5x105 8.2x10-5 4.04 15 9.1x102 54
표 20 및 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체는 c-Met에 대하여 0.09nM 정도의 높은 친화력을 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 3: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 Ang2 에 대한 결합력
상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중항체의 Ang2에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰 MaxiSorpTM flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 1ug(microgram)/ul(microliter)의 인간 Ang2 (R&D Systems)를 50ul/well 양으로 사용하여 코팅하였다. 그런 다음, 0.05% Tween-20이 포함된 PBS (Phosphate Buffer Saline)로 플레이트를 5회 씻은 후, 1% BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중항체를 상기 Ang2 코팅된 웰에 넣어 준 후, 플레이트를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이 때 항 c-Met/항 Ang2 이중항체는 104 nM부터 연속희석하여 사용하였다 (도 4 참조). 그런 다음, 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-Human Fc 항체 (Sigma)를 1%의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.1%의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 플레이트 각 웰에 100ul의 TMB 기질 (SIGMA)을 첨가하여 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H2SO4용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통해 인간 Ang2 단백질에 대한 50% 결합 농도 (Kd)를 구함으로써 결합력 정도를 측정할 수 있었다.
상기 얻어진 결과를 표 21 및 도 4에 나타내었다:
Kd (nM)
BS Ab 31
Anti-Ang2 Ab (4-H10) 0.035
(BS ab: 실시예 1의 항 c-Met/항 Ang2 이중항체)
표 21 및 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작된 이중 특이 항체는 Ang2에 대하여 약 31 nM 정도의 친화력을 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체의 암혈관 세포의 증식 억제 시험
상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중항체의 혈관세포 성장에 대한 효과를 확인하기 위하여, Cell Counting Kit-8 (CCK-8, supplied by Dojinho Molecular Technologies, Inc. Cat. # CK04-01)를 사용하였다.
CCK-8는 민감한 colorimetric assay를 가능하게 하여, 세포 증식 및 세포 독성 에세이에 있어서 세포 생존률을 정확하게 측정할 수 있도록 한다. 높은 수용성을 갖는 테라졸륨염인 WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt; 아래의 화학식 참조]은 세포 내에서 탈수소효소(dehydrogenase) 활성에 의하여 환원되어 조직 배양 배지에 용해되는 노란색 포르마잔 (formazan) 염료로 된다.
Figure pat00001
세포 내에서 탈수소효소 활성에 의하여 생성되는 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수와 정비례하므로, 포르마잔 염료의 양을 측정하여 세포의 생존률을 측정할 수 있다. 본 실시예에서는 Ang2와 c-Met의 ligand인 HGF/SF를 처리하여 증진된 세포의 성장을 각각의 저해제가 또는 상기 이중특이항체가 얼마나 저해할 수 있는지를 알아보았다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체의 혈관세포의 증식 억제 효과를 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)와 lymphatic endothelial cells (LEC) 세포주에서 확인하였다. 상기 HUVEC 세포주는 ATCC에서 입수하였고, LEC 세포주는 Lonza에서 입수하였다.
상기 세포주는 EGM-2 배지 (Lonza) 를 이용하여 5% CO2 및 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 증식 분석(Cell proliferation assay)을 위하여, 상기 세포주(5000 cells/well, 0.5% FBS in EBM2)를 96 웰 플레이트에서 계대배양하면서, 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 상기 세포주에 2ug/ml(40nM)의 양으로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 상기 배양물에 HGF (#294-HG/CF, R&D SYSTEMS, Minneapolis, MN) 100ug/ml를 함께 처리하였다. 음성 대조군(control)으로 항체를 첨가하지 않은 배지를 사용하고, 양성 대조군으로 참고예 2에서 제작된 4-H10 항 Ang2 항체 처리군, 참고예 1에서 제작된 L3-1Y-IgG2 항체 처리군, 및 L3-1Y-IgG2 항체와 4-H10 항체의 병용 처리군을 사용하였으며, 각 항체는 60nM 의 양으로 사용하였다 (병용 투여시 각각 60nM 의 양으로 투여).
배양 후 Cell Counting Kit-8 assay (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포 증식 정도를 분석하였다. 간략하게 설명하면, 72시간 배양 후 CCK8 solution을 10 ul(microliter)씩 각 well에 첨가하여 2.5시간을 추가 배양한 후, microplate reader로 450 nm에서의 흡광도를 읽었다.
상기 얻어진 결과를 도 5 (HUVEC) 및 도 6 (LEC)에 나타내었다. 도 5 및 도 6에서 보여지는 바와 같이, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2와 항 Ang2 항체 4-H10을 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여 세포 증식 억제 효과에 있어서 현저한 상승을 보였으며, 항 c-Met 항체 L3-1Y-IgG2와 항 Ang2 항체 4-H10을 병용 처방한 경우와 비교하여 동등 이상의 세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
실시예 5: 항 c- Met /항 Ang2 이중 특이 항체에 의한 세포 이동 억제
Ang2와 c-Met은 모두 암세포 성장뿐 아니라 암의 전이에도 관련된 인자이므로, 실시예 1에서 제작된 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체가 세포 움직임 (motility)에 주는 영향을 관찰하였다. 상기 이중특이항체의 Ang2+HGF에 의한 HUVEC migration에 대한 억제 효과를 다음과 같이 시험하였다.
혈관내피세포의 이동성의 측정은 GE Healthcare의 xCelligence RTCA (Realtime cell analyzer)를 이용하여 측정하였다. RTCA는 realtime으로 impedance를 측정함으로써 세포의 변화를 확인할 수 있는 non-invasive한 cell monitoring system이다. Cell migration assay 수행을 위해 lower chamber와 upper chamber로 구성된 CIM-plate16 (GE Healthcare)을 사용하는데, upper chamber에 impedance를 측정하는 미세전극이 배열되어 있어 chamber에 seeding된 세포가 미세구멍을 통해 이동하면 미세 전극에 부착되어 세포의 이동 정도를 확인할 수 있고, 이를 migration index로 나타내었다. EGM-2 배지 (Lonza)에서 자란 혈관내피세포((HUVEC, P3-6, ATCC)를 1% FBS가 첨가된 EBM 배지에서 6시간 동안 배양하였다.
CIM-plate16의 lower chamber 각 well에 2% FBS가 첨가된 EBM 배지에 HGF 100 ng/ml 및 Ang2 2ug/ml와, 4H10 항체(참고예 2), L3-1Y-IgG1 항체(참고예 1), 4H10과 L3-1Y-IgG1 의 병용(combi) 또는 상항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체(실시예 1)를 각각 100nM의 양으로 넣은 뒤(병용의 경우 각각 100nM의 양으로 넣음), fibronectin (Sigma) coating된 upper chamber와 assembly 하였다. Upper chamber에 serum free EBM 배지를 30 ul씩 넣어준 뒤, plate와 배지간의 equilibration을 위해 1시간 동안 incubator에 두고 CIM-plate를 incubator내의 device station에 장착한 후 background value 측정하였다.
상기 배양된 혈관 내피세포를 EBM-2 Serum-free media (Lonza)로 재현탁한 후, 60,000 cells/well의 양으로 seeding하고, 15분간 settle down하도록 방치한 뒤, device에 장착하여 세포 이동을 실시간으로 측정하였다. 세포 이동 정도는 Slope (1/hr) 로 나타내었다.
상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보여지는 바와 같이, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체는 L3-1Y-IgG2와 4-H10을 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여, Ang2+HGF에 의한 HUVEC 이동(migration) 억제 효과에 있어서 현저한 상승을 보였으며, L3-1Y-IgG2와 4-H10의 병용 처방한 경우와 비교하여 동등 이상의 세포 이동 억제 효과를 나타내었다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00220 20091006
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Bispecific anti-c-Met/anti-Ang2 antibody <130> DPP20133373KR <160> 191 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> UNSURE <222> (4) <223> 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<222> (1008)..(1349) <223> huAbF46 VL <220> <221> misc_difference <222> (1350)..(1355) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (1356)..(1397) <223> V5 epitope <220> <221> misc_difference <222> (1398)..(1442) <223> (G4S)3 linker <220> <221> misc_difference <222> (1443)..(1649) <223> Aga2 <220> <221> misc_difference <222> (1650)..(1652) <223> TGA(stop codon) <220> <221> misc_difference <222> (1653)..(1660) <223> PmeI restriction site <400> 56 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg 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ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 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agcagagcgc 4680 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4740 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4800 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4860 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4920 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4980 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5040 ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5100 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5160 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5220 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5280 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5340 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5400 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5460 ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5520 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5580 aacaaaagct ggctagt 5597 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-HC7 hinge <400> 57 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 58 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-1 clone <400> 58 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtacacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 59 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 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tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgcacagtc ctacagccat ccgttctctt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 61 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 61 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtttacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 62 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly 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ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 agctgcgatt gccactgtcc tccatgtcca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 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caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg actcgag 1407 <210> 66 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, human IgG2 hinge and constant region of human IgG2 <400> 66 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 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<222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680 tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740 ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800 actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860 acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920 tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980 agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040 tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100 agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160 gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220 gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280 acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340 gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400 tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca gaatcactga cataggagaa 3360 gtttcccaat ttctgaccga gggaatcatc atgaaagatt ttagtcatcc caatgtcctc 3420 tcgctcctgg gaatctgcct gcgaagtgaa gggtctccgc tggtggtcct accatacatg 3480 aaacatggag atcttcgaaa tttcattcga aatgagactc ataatccaac tgtaaaagat 3540 cttattggct ttggtcttca agtagccaaa ggcatgaaat atcttgcaag caaaaagttt 3600 gtccacagag acttggctgc aagaaactgt atgctggatg aaaaattcac agtcaaggtt 3660 gctgattttg gtcttgccag agacatgtat gataaagaat actatagtgt acacaacaaa 3720 acaggtgcaa agctgccagt gaagtggatg gctttggaaa gtctgcaaac tcaaaagttt 3780 accaccaagt cagatgtgtg gtcctttggc gtgctcctct gggagctgat gacaagagga 3840 gccccacctt atcctgacgt aaacaccttt gatataactg tttacttgtt gcaagggaga 3900 agactcctac aacccgaata ctgcccagac cccttatatg aagtaatgct aaaatgctgg 3960 caccctaaag ccgaaatgcg cccatccttt tctgaactgg tgtcccggat atcagcgatc 4020 ttctctactt tcattgggga gcactatgtc catgtgaacg ctacttatgt gaacgtaaaa 4080 tgtgtcgctc cgtatccttc tctgttgtca tcagaagata acgctgatga tgaggtggac 4140 acacgaccag cctccttctg ggagacatca 4170 <210> 79 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEMA domain of c-Met <400> 79 Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro 20 25 30 Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu 50 55 60 Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val 65 70 75 80 Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val 115 120 125 Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr 130 135 140 Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln 165 170 175 Ser Tyr Ile 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agaataatca ggttctgttc cataaactct ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg 720 gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag agatccacaa agaaggaagt gtttaatata 780 cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc 840 ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc gcacaaagca agccagattc tgccgaacca 900 atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag 960 atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc cagcattttt acggacccaa tcatgagcac 1020 tgctttaata ggacacttct gagaaattca tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat 1080 cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa 1140 gtcctcttaa catctatatc caccttcatt aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg 1200 acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg gtttctcgat caggaccatc aacccctcat 1260 gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg tctccagaag tgattgtgga gcatacatta 1320 aaccaaaatg gc 1332 <210> 83 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding PSI-IPT domain of c-Met <400> 83 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 60 agacatttcc 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acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 960 ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 1020 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 1080 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 1140 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 1200 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 1260 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagga 1299 <210> 84 <211> 939 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding TyrKc domain of c-Met <400> 84 gtgcatttca atgaagtcat aggaagaggg cattttggtt gtgtatatca tgggactttg 60 ttggacaatg atggcaagaa aattcactgt gctgtgaaat ccttgaacag aatcactgac 120 ataggagaag tttcccaatt tctgaccgag ggaatcatca tgaaagattt tagtcatccc 180 aatgtcctct cgctcctggg aatctgcctg cgaagtgaag ggtctccgct ggtggtccta 240 ccatacatga aacatggaga tcttcgaaat ttcattcgaa atgagactca taatccaact 300 gtaaaagatc ttattggctt tggtcttcaa gtagccaaag gcatgaaata tcttgcaagc 360 aaaaagtttg tccacagaga cttggctgca agaaactgta tgctggatga aaaattcaca 420 gtcaaggttg ctgattttgg tcttgccaga gacatgtatg ataaagaata ctatagtgta 480 cacaacaaaa caggtgcaaa gctgccagtg aagtggatgg ctttggaaag tctgcaaact 540 caaaagttta ccaccaagtc agatgtgtgg tcctttggcg tgctcctctg ggagctgatg 600 acaagaggag ccccacctta tcctgacgta aacacctttg atataactgt ttacttgttg 660 caagggagaa gactcctaca acccgaatac tgcccagacc ccttatatga agtaatgcta 720 aaatgctggc accctaaagc cgaaatgcgc ccatcctttt ctgaactggt gtcccggata 780 tcagcgatct tctctacttt cattggggag cactatgtcc atgtgaacgc tacttatgtg 840 aacgtaaaat gtgtcgctcc gtatccttct ctgttgtcat cagaagataa cgctgatgat 900 gaggtggaca cacgaccagc ctccttctgg gagacatca 939 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 85 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of anti-c-Met antibody <400> 86 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 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Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 <210> 173 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 2-E6 <400> 173 gaagtgcagc ttctggaatc aggcggtgga ctggtgcagc caggaggcag cctcaggctg 60 tcttgcgcag ccagcggatt taccttctcc gattacgcca tgagctgggt tagacaggcc 120 cctggcaagg ggctggagtg ggtcagtgcc atttaccccg actccgggaa taagtattac 180 gctgactctg tgaaaggtag attcactatc tcaagagaca actccaaaaa tacattgtac 240 ttacagatga actcactgcg cgctgaggat acagcagtgt attattgtgc gcggcactcg 300 agtgatccta aggtcaaaag cggatactat gacgacggca tggatgtttg gggccaaggg 360 actctcgtaa ccgtgtcttc t 381 <210> 174 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 2-E6 <400> 174 cagtcagtcc tgacacagcc ccctagtgct tccggaaccc ctgggcagag ggtgaccatc 60 tcatgctcag gtagctccag caacattgga aacaatgcag ttaattggta tcagcaactg 120 cccgggaccg ccccaaagct tctgatctac gctgatagta atagaccatc tggagtgcct 180 gacagattca gtggttcgaa aagcggcact tctgcatcct tggccatttc tggcttaaga 240 tctgaagatg aggccgacta ttactgtggc tcttgggact actccctgag cggatatgtg 300 tttgggggcg gaactaagct cacagtccta ggc 333 <210> 175 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 8-A5 <400> 175 gaggtccagc tgctcgaatc aggcggtggg ctggtgcagc caggcggctc cctgaggtta 60 agttgcgccg cttctggctt tacatttagc gattattaca tgtcctgggt ccgccaggcc 120 cccgggaaag gtctggagtg ggtgagcgga atttaccctt ccgggggaag cacctattac 180 gcggattctg taaagggtag attcactatc tcaagagaca attctaagaa taccctgtat 240 ttgcagatga acagtcttag agccgaagac acagcagttt attattgtgc aagagacccc 300 agtactctaa cctacgctgg cttcgattac tggggacaag gaacgctcgt gacagtgtca 360 agc 363 <210> 176 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 8-A5 <400> 176 caaagtgttc tcacacagcc gccatccgct tccgggaccc ctggacagag agtgaccatc 60 agttgtagtg gctcttcgag caatattggc aataactatg tgacatggta tcagcagctt 120 cctggaacag cccccaaact gctcatctat gccgacagcc acagaccatc aggtgtcccc 180 gatagatttt ctgggtcaaa gtcaggaact agcgcaagcc tggccatttc tggattaagg 240 tccgaggacg aagctgatta ctattgcgca acttgggact actctctgtc tggttacgtg 300 ttcggcggcg gaaccaagtt gacggtccta ggc 333 <210> 177 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 7-C9 <400> 177 gaggtgcaac tcctggagtc aggaggcggc ctggtccagc ccggcgggag tcttagactc 60 tcgtgtgccg caagcgggtt tacattcagt aactacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120 cctggaaagg gactggaatg ggtttctgcc attagctccg gcggaggtaa tatctattac 180 gctgattccg ttaaagggag gtttacaatc tctcgggata acagcaaaaa tactttgtat 240 ctgcagatga atagcttaag agccgaagac actgcagtgt actactgcgc gaagagcggt 300 attcaaccct ctccaccatc catgtcatca gcttatgcaa tggacgtatg ggggcagggc 360 accctggtga ccgtgagttc t 381 <210> 178 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 7-C9 <400> 178 cagagcgtcc tgacacaacc tccatccgct tctgggacgc ctggacagag agtgacaatt 60 tcttgcagcg gctcatcttc aaatattgga aacaatgacg tttattggta ccagcagctc 120 ccagggaccg ccccaaagct gctgatctat gcaaactcac acagacccag cggagtgccc 180 gatagattca gtggatccaa atccggcact agtgccagct tggcaatctc ggggctgaga 240 tctgaagacg aggctgatta ctattgtggt acctgggatt actccttaag tggttacgtg 300 tttggcgggg gcactaagct taccgtccta ggc 333 <210> 179 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-C11 <400> 179 gaagtacagc tgctggagtc gggtggtgga ctggttcagc caggaggctc attaaggctg 60 agctgcgccg caagcggttt cactttttct gattatgcta tgtcctgggt cagacaggcc 120 cctgggaagg gactcgagtg ggtctcaagt atttaccccg acgatggaaa tacctactat 180 gccgatagcg tgaaggggcg ctttacaatc tctagagata attctaaaaa caccctgtac 240 cttcaaatga actcattgcg ggcagaagac acagcggtgt actattgtgc tagacacacg 300 tcccaccata ccagcatcga cggctactat tattacggga tggacggctg gggccagggc 360 actctcgtga cagtgtccag t 381 <210> 180 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-C11 <400> 180 cagtcagtcc tgactcagcc accctccgca agcgggacac ctggacaaag agttactatc 60 tcttgcaccg ggtcaagctc caatatcggt aacaatgatg tgagttggta ccagcagtta 120 ccaggcaccg ccccgaaact gcttatttac tcagacagca aaagaccctc tggcgtgcct 180 gacagattct caggaagcaa gagtggcacg tctgcttcct tggccatttc gggtctgaga 240 tccgaggacg aagctgatta ttattgtgga agctgggatt atagtctgtc tggctacgtg 300 tttgggggcg gaaccaagct cacagtccta ggc 333 <210> 181 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-F5 <400> 181 gaggtgcagt tgctcgagtc cgggggtggc ctggtgcagc caggaggaag cctgagactg 60 agctgcgcag cctcaggttt cacattctcc gattacgaca tgtcctgggt taggcaagcc 120 cccggcaagg ggctggaatg ggtaagctct atcagccacg gcgacagtaa caaatattat 180 gcagactctg ttaagggacg gtttaccatt tcacgcgata actcaaagaa tacactgtac 240 cttcaaatga atagtctcag agctgaagat accgccgtgt attactgtgc taaatcgtcc 300 ggaatccagg agagtccccc tacttattac tactatggga tggatgtgtg gggccagggc 360 accctggtca ctgtctcttc tgctagc 387 <210> 182 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-F5 <400> 182 cagtctgtgt tgacccagcc cccttctgca tctggcaccc ccggacagag agtcactata 60 agttgttctg gtagctcctc aaatatcggc tcaaacgccg tgaattggta ccagcaatta 120 ccaggaacag ctcctaagct gcttatctat gcagacagta acagaccaag cggcgttcct 180 gatagattct caggctccaa gtccgggact agtgcctcgc tggctattag cggtctcaga 240 agtgaagatg aggccgatta ctattgcgga agctgggact actccctgag cggctatgtg 300 tttggaggag ggacaaaact caccgtccta ggc 333 <210> 183 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-F11 <400> 183 gaggtgcaac tgctggagag tggtgggggc cttgttcagc ccggcggatc cttgaggctg 60 tcatgcgctg cgtctggctt tactttcagc gattacgcaa tgagttgggt gagacaggct 120 ccaggaaaag gcctggaatg ggtcagctcc atttatcctg acgatggtaa cacatattac 180 gccgacagcg taaaaggacg gttcaccatc tctcgcgata attctaagaa caccctgtat 240 ctccagatga atagcctgag agcagaagac accgccgtgt actactgtgc caagcatcct 300 gtgagattaa acctgcaccc aatgtactat tattacggca tggacgtttg ggggcagggg 360 acactcgtga ctgtctcctc a 381 <210> 184 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-F11 <400> 184 cagtctgtgt taacacaacc tccaagtgca tccggaacgc cgggccagag agtgactatc 60 agctgcaccg gcagctcgtc caatatcggt aacaacgcag ttagttggta ccagcagctt 120 cccggcacag ctccaaagct cttgatttac agcgattcac aaagacctag tggtgtcccc 180 gatagatttt ctgggagtaa gagcgggacc agtgcctccc tggctatatc aggactgaga 240 tctgaagatg aggctgacta ttactgtgcc acttgggact attcactctc tgcctatgtg 300 ttcgggggcg gaaccaaact gacagtccta ggc 333 <210> 185 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-H10 <400> 185 gaggttcagt tgctggagag tggcggcggc ttagtgcagc caggtggcag cctgcgcctt 60 tcttgtgccg ccagtgggtt taccttctcc tcctacgaca tgagctgggt gcggcaggct 120 cccggcaaag gtcttgaatg ggtgtcactg atcagccctg acagttcctc aatctattat 180 gcagattcag tcaagggaag atttaccata agcagagata attccaagaa tactctgtac 240 ctacagatga actcgctcag agccgaagat accgcagtct actactgcgc taaagacctg 300 atttctttct ggaggggggg attcgactat tgggggcaag gaacactcgt aacagtgtct 360 agc 363 <210> 186 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-H10 <400> 186 cagagcgtgc tcacccaacc tcccagtgca tccggaacgc ctggtcagag agtgacaatt 60 agctgctcag ggtcttcctc taacatcggg tccaattatg tcaattggta tcagcagttg 120 ccaggtacag ctcccaaact gctgatctac agtgattccc acagacctag cggcgttcca 180 gacagattta gcggatccaa gtcgggaact tctgcaagcc tcgctatttc tggcctgaga 240 agtgaggacg aagccgatta ttactgtggg gcctgggacg attcattatc aggatacgtg 300 ttcggaggcg gcaccaagct tactgtccta ggc 333 <210> 187 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 3-D3 <400> 187 gaggtacagc tgctggaaag tgggggcggt ctggtgcagc cagggggaag cctccggctt 60 tcatgcgccg caagcggctt tacattcagt gactatgaca tgagttgggt ccgacaagcc 120 cccggaaagg gcctggagtg ggtgtctgga atctcctccg atgacggcaa tacttattac 180 gctgactccg ttaaaggtag gttcaccatc tctcgcgata actctaaaaa caccctctac 240 ctgcagatga atagcttgag ggcagaagat acggctgtct actattgtgc cagacctaca 300 attgacaagt acacattaag agggtattat tcatacggca tggatgtttg gggacaggga 360 actctagtga ccgtgtccag c 381 <210> 188 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 3-D3 <400> 188 cagtcagtgc tgacacagcc tccaagcgct tccgggacac ctggacaaag agttaccatt 60 tcgtgcaccg gatcctcctc aaacatcggt agcaattatg tgtcttggta ccagcagctc 120 cccgggactg cccccaaact cttgatctac agcgacaaca agagaccatc tggtgtgcct 180 gatagattca gtgggagtaa gtcaggaacg agtgcctctc tggctatttc tggcctgaga 240 agcgaagatg aggcagacta ttattgtggc acctgggatg actccctgaa tggctacgtc 300 tttggcggcg gaacaaaact tactgtccta ggc 333 <210> 189 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-c-Met antibody and anti-Ang2 scFv linked to c-terminus of the heavy chain, in bispecific anti-c-Met/anti-Ang2 antibody <400> 189 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 225 230 235 240 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 465 470 475 480 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 485 490 495 Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys 500 505 510 Gly Leu Glu Trp Val Ser Leu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Ser Ile Tyr 515 520 525 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 530 535 540 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 545 550 555 560 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Ile Ser Phe Trp Arg Gly Gly 565 570 575 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Val 595 600 605 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr 610 615 620 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn 625 630 635 640 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser 645 650 655 Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 660 665 670 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp 675 680 685 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr 690 695 700 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Ala Gly Gln 705 710 715 720 His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr 725 730 735 Ala Ser <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pC3X-f primer <400> 190 gcacgacagg tttcccgac 19 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pC3X-b primer <400> 191 aaccatcgat agcagcaccg 20

Claims (20)

  1. 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고,
    상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 172의 인간 Ang2의 아미노산의 3차 구조에서, 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 루프 1의 외부 노출 아미노산 잔기, 447번째 아미노산부터 454번째 아미노산까지의 루프 2의 외부 노출 아미노산 잔기, 및 460번째 아미노산부터 468번째 아미노산까지의 루프 3의 외부 노출 아미노산 잔기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 또는 상기 외부 노출 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 3차 구조상 연속하는 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체와 경쟁적으로 인간 Ang2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 172의 Ang2의 아미노산 서열 중 I434, A449, P452, 및 N467 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 결합하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2) 및 서열번호 122 내지 127로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2) 및 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체:
    X1-Y-X2-M-S (서열번호 151)
    X3-I-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Y-Y-A-D-S-V-K-G(서열번호 152)
    X11-G-S-S-S-N-I-G-X12-N-X13-V-X14 (서열번호 153)
    X15-X16-X17-X18-R-P-S (서열번호 154)
    X19-X20-W-D-X21-S-L-X22-X23 (서열번호 155)
    상기 서열번호 151에서,
    X1은 아스파르트산 (D), 세린(S), 또는 아스파라진(N)이고,
    X2는 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 타이로신(Y)이며,
    상기 서열번호 152에서,
    X3은 알라닌(A), 글라이신(G), 류신(L), 또는 세린(S)이고,
    X4는 타이로신(Y) 또는 세린(S)이며,
    X5는 프롤린(P), 히스티딘(H), 또는 세린(S)이고,
    X6는 아스파르트산 (D), 글라이신(G), 또는 세린(S)이며,
    X7는 세린(S), 글라이신(G), 또는 아스파르트산(D)이며,
    X8은 글라이신(G) 또는 세린(S)이고,
    X9는 아스파라진(N) 또는 세린(S)이며,
    X10은 라이신(K), 이소류신(I), 트레오닌(T)이고,
    상기 서열번호 153에서,
    X11은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,
    X12는 아스파라진(N) 또는 세린(S)이며,
    X13은 알라닌(A), 타이로신(Y), 아스파르트산(D)이고,
    X14는 아스파라진(N), 세린(S), 트레오닌(T), 타이로신(Y)이며,
    상기 서열번호 154에서,
    X15는 알라닌(A), 또는 세린(S)이고,
    X16은 아스파르트산(D) 또는 아스파라진(N)이며,
    X17은 세린(S)이고,
    X18은 아스파라진(N), 라이신(K), 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이며,
    상기 서열번호 155에서,
    X19는 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,
    X20은 세린(S), 알라닌(A), 또는 트레오닌(T)이며,
    X21은 타이로신(Y) 또는 아스파르트산(D)이고,
    X22는 세린(S) 또는 아스파라진(N)이며,
    X23은 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 109 내지 112로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 115 내지 119로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 122 내지 127로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 130 내지 135로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 138 내지 142로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 145 내지 148로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 156 내지 161으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 164 내지 169로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체:
  8. 제7항에 있어서,
    상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이며,
    상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이며,
    상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    상기 CDR-L3는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  11. 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고,
    상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 113 또는 114의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 120 또는 121의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 128 또는 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 136 또는 137의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 143 또는 144의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 149 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 162 또는 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 170 또는 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열 내의 서열번호 73의 아미노산 서열(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  14. 제11항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체:
  15. 제14항에 있어서,
    상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이며,
    상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이며,
    상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    상기 CDR-L3는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체는 각각 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인,
    항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는, 암, 암전이, 안구혈관질환, 염증 질환, 감염, 심혈관질환, 신장질환, 패혈증, 천식, 부종, 및 유전성 출혈성 모세혈관 확장증으로 이루어진 군에서 선택된 c-Met 또는 Ang2 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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