KR20150027752A - 인간화된 il-7 설치류 - Google Patents
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Abstract
인간 또는 인간화된 인터루킨-7(IL-7) 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물. 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자를 포함하는 세포, 배아, 및 비-인간 동물. 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 설치류. 생식세포계열에 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스, 이때 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 내인성 마우스 IL-7 조절 서열의 제어하에 있다.
Description
본 발명은 내인성 자리에서 인간 IL-7 유전자 서열과 비-인간 IL-7 유전자 서열의 치환을 포함하는 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물(예를들어 포유류, 예컨대 마우스, 래트 및 햄스터같은 설치류)에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 내인성 비-인간 조절 서열의 제어하에 있는 자리로부터, 또는 내인성 비-인간 조절 서열들을 포함하는 내인성 비-인간 IL-7 자리로부터 인간 IL-7 또는 인간화된 IL-7을 발현하는 설치류 및 다른 비-인간 동물에 관련된다.
인간 IL-7 서열을 함유하고 무작위적으로 삽입된 형질전환 유전자를 갖는 형질전환 마우스들은 본 기술분야에서 알려져 있다. 그러나, 다는 아니지만 대부분의 형질전환 마우스는 한 가지 면 또는 또 다른 면에 있어 최적은 아니다. 예를 들어, 대부분의 인간 IL-7으로 형질전환된 마우스들은 면역세포의 발달, 예를 들어 T 세포 발달의 조절장애 때문인 것으로 보이는 T 세포를 포함하는 특정 세포의 비정상적인 수준 및/또는 비율을 나타낸다.
인간 IL-7-암호화 서열을 포함하고, 그 인간 IL-7 암호화 배열이 내인성 비-인간 IL-7 자리에 있는 비-인간 동물과, 내인성 비-인간 조절 요소의 제어하에 인간 IL-7을 발현하는 비-인간 동물들에 대한 필요가 본 기술분야에 여전히 존재한다. 가능한한 비-인간 동물에서 생리적으로 관련되는 것과 같은 방식으로 인간 IL-7 을 발현하는 비-인간 동물들에 대한 필요가 본 기술분야에 있다. 말초 T 세포에서, 및/또는 T 세포의 하위유형의 비율에서 유의미한 이상이 없는, 인간 IL-7을 발현하는 비-인간 동물들에 대한 필요가 본 기술분야에 존재한다.
내인성 비-인간 IL-7 자리에서 인간 IL-7 게놈 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 세포, 조직, 및 핵산이 제공된다. 비-인간 동물은 변형된 내인성 IL-7 자리의 하나 또는 그 이상의 내인성 비-인간 조절 서열에 의해 조절된 변형된 자리로부터 인간화된 IL-7 단백질을 발현한다. 다양한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터 등이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다.
다양한 구체예 및 양태에서, 비-인간 동물은 변형된 내인성 IL-7 자리에서 비-인간 동물의 생식세포 계열에서 변형된 IL-7 유전자를 포함하는데, 이때 변형된 내인성 IL-7 자리는 내인성 IL-7 유전자의 적어도 일부의 인간화를 포함한다. 다양한 구체예에서, 마우스는 변형된 IL-7 자리에 대하여 이형 접합성 또는 동형 접합성이다. 한 구체예에서, 첫번째 내인성 IL-7 대립유전자의 결핍 및 두번째 내인성의 IL-7 대립유전자의 인간화를 포함하는 비-인간 동물이 제공된다. 다양한 구체예 및 양태에서, 인간화는 하나 또는 그 이상의 엑손 및/또는 인트론의 인간화이다. 다양한 구체예 및 양태에서, 내인성 비-인간 5'-비번역 영역 및 내인성 비-인간 3'-비번역 영역의 하나 또는 둘 모두가 변형된 동물에 보유된 변형된 IL-7 자리를 가진 비-인간 동물이 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SEQ ID NO:1 내에 함유된 5'-비번역 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SEQ ID NO:2 내에 함유된 3'-비번역 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SEQ ID NO:1 내에 함유된 5'-비번역 영역 및 SEQ ID NO:2 내에 함유된 3'-비번역 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SEQ ID NO:1 인 5'-비번역 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SEQ ID NO:2 인 3'-비번역 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 비-인간 동물은 SEQ ID NO:1 인 5'-비번역 영역 및 SEQ ID NO:2 인 3'-비번역 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 유전자는 인간 IL-7 유전자의 엑손 2-6을 포함하는 연속적인 서열에 대해 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 가진다. 일부 특정한 양태에서, 본 발명의 인간 IL-7 유전자는 SEQ ID NO:3 을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 유전자는 도1에서 제시된 인간화를 반영하는 서열을 가진다.
한 양태에서, 내인성 설치류 IL-7 게놈 서열의 내인성 설치류 IL-7 자리를 인간 IL-7 게놈 서열로의 치환을 포함하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 인간 IL-7의 게놈 서열의 상류에(IL-7 유전자의 전사의 방향에 대해) 첫번째 설치류 조절 서열 및 인간 IL-7 게놈 서열의 하류에 두번째 설치류 조절 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 첫번째 설치류 조절 서열은 설치류 프로모터 및/또는 인헨서를 포함하고, 그리고 두번째 설치류 조절 서열은 3'-UTR을 포함한다.
한 구체예에서, 설치류는 마우스이고 마우스 엑손 1과 인간 엑손 2,3,4,5 및 6을 가지는 내인성 마우스 IL-7 유전자 자리를 포함한다. 한 구체예에서, 내인성 마우스 IL-7 유전자 자리는 전사 방향에 대하여 상류에서 하류로 첫번째 마우스 인트론의 적어도 일부인 마우스 엑손 1과, 인간 엑손 2부터 인간 엑손 6을 포함하는 인접한 인간 게놈 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 완전한 내인성 마우스 IL-7 상류(IL-7 유전자의 전사 방향에 대하여) 프로모터 및 조절 영역을 포함하는 내인성 마우스 DNA의 연속 서열을 더 포함하고, 이때 인접한 마우스 DNA는 인간 게놈 단편의 상류에 있고; 그리고 인간 게놈 단편의 하류에 내인성 마우스 DNA 3'-UTR 의 연속 서열을 더 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 마우스 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 로부터 선택된 마우스 서열을 포함한다.
한 양태에서, 변형된 자리를 형성하기 위하여 내인성 마우스 IL-7 게놈 서열의 내인성 마우스 IL-7 자리에서 인간 IL-7 게놈 서열로의 치환를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 인간 IL-7 게놈 서열은 적어도 하나의 인간 엑손을 포함하고, 변형된 자리는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2의 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 마우스 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 치환은 엑손 2부터 6을 포함하는 인간 게놈 단편을 포함하고 인간 게놈 단편은 변형된 내인성 마우스 IL-7 자리를 형성하기 위하여 마우스 엑손 1에 연결되는데, 이때 변형된 마우스 IL-7 자리는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 그것들의 조합으로부터 선택된 마우스 서열을 포함한다.
한 양태에서, 설치류 엑손 1 및 설치류 인트론 1의 적어도 일부, 및 인간 IL-7 엑손 2,3,4,5, 및 6의 인간 IL-7 유전자 서열을 포함하는 IL-7 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 이때 설치류는 설치류 상류 IL-7 조절 서열, 설치류 IL-7 3'-UTR, 및 그것들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함한다.
한 양태에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 및 그것들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 이때 마우스는 마우스 IL-7 단백질의 엑손 2에서 5를 암호화하는 내인성 서열을 결핍하고, 마우스는 핵산 서열이 인간 IL-7 엑손 2,3,4,5, 및 6을 암호화하는 핵산 서열을 내인성 마우스 IL-7 자리에서 포함한다.
한 양태에서, 적어도 하나의 인간 IL-7 엑손을 발현시키기 위해 변형된 내인성 설치류 IL-7 자리로부터 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다. 한 구체예에서, 설치류 IL-7 자리는 적어도 두 개의 인간 IL-7 엑손을 포함하는 서열에 의해 암호화된 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하도록 변형된다. 한 구체예에서, 설치류 IL-7 자리는 적어도 세 개의 인간 IL-7 엑손을 포함하는 서열에 의해 암호화된 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하기 위해 변형된다. 한 구체예에서, 설치류 IL-7 자리는 적어도 인간 IL-7 엑손 2,3,4,5, 및 6(즉, 2부터 6)을 포함하는 서열에 의해 암호화된 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하도록 변형된다. 한 구체예에서, 설치류 IL-7 자리는 인간 IL-7 단백질을 발현하도록 변형된다. 일부 특정 구체예에서, 설치류 IL-7 자리는 서열이 도 1에서 도시된 것과 같은 자리에 의해 암호화된 단백질을 반영하는 인간 IL-7 단백질을 발현하도록 변형된다. 일부 특정 양태에서, 설치류 IL-7 자리는 인간 IL-7 유전자의 엑손 2 내지 6에 의해 암호화된 서열을 포함하는 인간 IL-7 단백질을 발현하도록 변형된다. 일부 특정 양태에서, 설치류 IL-7 자리는 SEQ ID NO:3에 제시된 인간 IL-7 유전자의 엑손 2 내지 6에 의해 암호화되는 서열을 포함하는 인간 IL-7 단백질을 발현하도록 변형된다.
한 양태에서, 설치류 IL-7 엑손 2 내지 5 대신에 적어도 인간 IL-7 엑손 2 내지 6을 포함하도록 변형된 내인성 설치류 IL-7 자리로부터 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간화된 내인성 설치류 IL-7 암호화 영역을 포함하는 인간화된 내인성 설치류 IL-7 자리로부터 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 이때 인간화된 내인성 설치류 IL-7 자리는 야생형 설치류 IL-7 암호화 영역의 상류에서 야생형 설치류에 존재하고 야생형 설치류 IL-7 암호화 영역의 하류에 존재하는 모든 내인성 설치류 조절 요소를 포함한다.
한 양태에서, 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 상류 및 하류에서 설치류 조절 영역을 포함하는 인간화된 설치류 IL-7 자리로부터 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 이때 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질은 야생형 설치류에서 설치류 IL-7 단백질의 발현 패턴과 거의 같은 발현패턴으로 발현된다. 한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 IL-7 의 혈청 발현의 수준은 야생형 설치류에서 설치류 IL-7 단백질의 혈청 발현의 수준과 거의 같다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 이때 설치류의 림프구 집단은 연령 맞춤 야생형 마우스의 B 세포 집단과 수가 거의 같은 B 세포 집단을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 변형된 설치류는 연령 맞춤 야생형 마우스의 성숙한 B 세포의 집단과 수가 거의 같은 성숙한 B 세포의 집단으로 특성화된다. 한 구체예에서, 인간화된 IL-7 단백질은 인간 IL-7 단백질과 동일하다. 한 구체예에서, 인간화된 IL-7 단백질은 인간 IL-7 유전자의 적어도 엑손 2 내지 6에 의해 암호화된 인간 서열을 포함한다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 이때 설치류의 림프구 집단은 연령 맞춤 야생형 마우스의 T 세포의 집단과 수가 거의 같은 T 세포의 집단을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 변형된 설치류는 연령 맞춤 야생형 마우스의 성숙한 T 세포의 집단과 수가 거의 같은 성숙한 T 세포 집단을 나타낸다. 한 구체예에서, 변형된 설치류는 연령 맞춤된 야생형 마우스의 말초 T 세포의 집단과 수가 거의 같은 말초 T 세포의 집단을 나타낸다. 한 구체예에서, 인간화된 IL-7 단백질은 인간 IL-7 단백질과 동일하다. 한 구체예에서, 인간화된 IL-7 단백질은 인간 IL-7 유전자의 적어도 엑손 2 내지 6에 의해 암호화된 인간 서열을 포함한다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공된는데, 이때 설치류의 림프구 집단은 연령 맞춤 야생형 마우스의 T 세포 집단의 CD4:CD8 비율과 거의 같은 CD4:CD8의 비율을 나타내는 T 세포 집단을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 인간화된 IL-7 단백질은 인간 IL-7 단백질과 동일하다. 한 구체예에서, 인간화된 IL-7 단백질은 인간 IL-7 유전자의 적어도 엑손 2 내지 6에 의해 암호화된 인간 서열을 포함한다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 이때 그 설치류는 만성 대장염으로 발전하려는 경향의 결핍; 결장 점막 림프구 에서 IL-7의 과발현의 결핍; 결장 점막 림프구에서 IL-7의 정상, 또는 야생형 발현; 심각한 피부염의 결핍; 단핵세포의 큰 피부침투를 특징으로하는 피부염의 결핍; 연령 맞춤된 야생형 마우스의 CD4:CD8 비율과 거의 같은 T 세포 집단의 CD4:CD8의 비율을 나타냄; 야생형 마우스의 마우스 IL-7의 발현 패턴과 거의 같은 인간 IL-7의 발현 패턴을 나타냄; 그리고 이것들의 조합으로부터 선택된 특성을 포함한다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하고 만성 대장염으로 발전하려는 경향이 결핍된, 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하고, 결장 점막 림프구에서 IL-7의 과발현을 나타내지 않는, 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하고, 단핵세포의 큰 피부침부를 특징으로하는 피부염을 나타내지 않는 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하고, 진피로의 림프증식을 나타내지 않는, 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질을 발현하고, 연령 맞춤 야생형 마우스보다 더 높은 빈도로 B 및/또는 T 세포 림프종을 나타내지 않는, 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간화된 IL-7 단백질 또는 인간 IL-7 단백질을 발현하고, 대장염, 만성 대장염, 심각한 피부염, 단핵세포에 의한 진피의 병리적인 및/또는 큰 침투, 진피의 림프증식, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 성숙한 B 및/또는 T 세포 수의 감소, 말초 B 및/또는 T 세포 수의 감소, CD4+ T 세포의 비정상적인 수, CD8+ T 세포의 비정상적인 수, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 병리학의 발달이 야생형 마우스보다 쉽지 않은 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다.
일부 양태에서, 서열이 마우스 IL-7 유전자 서열의 인간 IL-7 유전자 서열로의 치환된 것을 반영하는 인간 IL-7 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 이때 인간 IL-7 유전자 서열은 인간 IL-7 유전자의 엑손 2 내지 6을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 치환은 마우스 IL-7 유전자의 엑손 2 내지 5를 포함하는 서열의 치환이다. 일부 양태에서, 인간 IL-7 유전자는 SEQ ID NO:3 을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 인간 IL-7 단백질의 발현은 마우스 조절 요소의 제어하에 있다.
일부 양태에서, 마우스 IL-7 단백질을 검출 가능하게 발현하지 않는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 일부 특정 양태에서, 본원에서 기술된 것과 같은 마우스의 게놈은 마우스 IL-7 유전자의 전부 또는 일부에서 결실을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 본원에서 기술된 것과 같은 마우스의 게놈은 엑손 2 내지 5에 대응하는 내인성 IL-7 유전자 서열의 결실을 포함한다.
한 양태에서, 생식세포 계열에서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자를 형성하기 위하여 적어도 하나의 인간 IL-7 엑손으로 적어도 하나의 비-인간 IL-7 엑손의 치환을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공되는데, 그 치환은 내인성 비-인간 IL-7 자리에서 일어나고, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 내인성 비-인간 조절 요소의 제어하에 있다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트 및 마우스로부터 선택된다.
한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 인간 엑손 1, 인간 엑손 2, 인간 엑손 3, 인간 엑손 4, 인간 엑손 5, 인간 엑손 6, 및 이것들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인간 엑손을 포함한다.한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 5개 이하의 인간 엑손을 포함한다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 마우스인 설치류이고 변형된 자리는 인간 IL-7 엑손 2,3,4,5, 및 6을 포함하는 인간 게놈 절편으로의 마우스 엑손 2,3,4, 및 5의 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함한다.
한 양태에서, 생식세포 계열에서, 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스 유전자를 포함하는, 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공되며, 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자는 내인성 비-인간 조절 서열이 상류와 하류 양쪽에 있다.
한 구체예에서 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 인간 엑손 1, 인간 엑손 2, 인간 엑손 3, 인간 엑손 4, 인간 엑손 5, 인간 엑손 6, 및 이것들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 엑손을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 및 인간화된 IL-7 유전자는 적어도 5개의 인간 엑손을 포함한다.
한 양태에서, 비-인간 엑손 1, 인간 엑손 2, 인간 엑손 3, 인간 엑손 4, 인간 엑손 5, 및 인간 엑손 6을 포함하는 인간화된 IL-7 자리가 제공된다. 일부 특정 양태에서 인간화된 IL-7 자리는 비-인간 엑손 1과 인간 엑손 6을 양 옆으로 하는 5' 및 3' 비-인간 비번역 영역을 추가로 포함한다. 일부 특정 구체예에서, 인간화된 IL-7 자리는 비-인간 3' 비번역 영역과 인접한 3' 인간 비번역 영역, 또는 그것의 일부를 포함한다. 일부 특정 양태에서, 인간화된 IL-7 자리는 5' 비-인간 비번역 영역, 또는 그것의 일부, 및 인간 엑손 2와 인접한 비-인간 엑손 1을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 인간화된 IL-7 자리는 도 1에 제시된 구조를 포함한다.
한 양태에서, 비-인간 IL-7 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 IL-7 유전자의 인간 엑손 2 내지 6을 포함하는 인간화된 IL-7 자리가 제공된다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 자리는 비-인간 IL-7 엑손 1을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 자리는 비-인간 IL-7 엑손 1 및 비-인간 IL-7 인트론 1을 포함한다. 일부 특정 구체예에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 자리는 비-인간 IL-7 3' 비번역 영역, 또는 그것의 일부에 인접한 3' 인간 IL-7 비번역 영역, 또는 그것의 일부를 포함한다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 자리는 5' 비-인간 비번역 영역, 또는 그것의 일부, 및 인간 IL-7 엑손 2에 인접한 비-인간 엑손 1을 포함한다.
한 양태에서, 실질적으로 인간인 IL-7 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 인간화된 IL-7 자리가 제공된다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 자리는 SEQ ID NO:3 과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 인간화된 IL-7 자리는 SEQ ID NO:3 을 포함한다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 IL-7 단백질은 SEQ ID NO:3 과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 서열에 의해 암호화된다. 일부 특정 양태에서, 본 발명의 IL-7 단백질은 SEQ ID NO:3 에 의해 암호화된다.
한 양태에서, 내인성 비-인간 IL-7 조절 서열과 상류와 하류에 플랭킹되어 있는 인간 또는 인간화된 IL-7 암호화 유전자를 포함하도록 비-인간 동물의 생식세포 계열을 변형하는 것을 포함하는, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자를 가지는 비-인간 동물의 제조 방법이 제공된다.
본 방법의 한 구체예에서, 변형은 내인성 비-인간 IL-7 자리에서 일어난다.
본 방법의 한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 같은 속과 종의 야생형 비-인간 동물에서 관찰되는 것과 동일한 발현 패턴으로 인간 IL-7을 발현하도록 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스 및 래트로 부터 선택된다.
한 구체예에서 비-인간 동물에서 발현된 인간 IL-7의 대응하는 수준은 야생형 마우스에서 비-인간 IL-7의 수준과 거의 같다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다.
한 양태에서, 전사의 방향에 대하여 5'부터 3'으로, 마우스 IL-7 5' 비 암호화 서열과 상동성인 핵산 서열, 인간 IL-7 단백질을 암호화하지만 인간 IL-7 단백질을 암호화하는 서열의 상류 또는 하류에 인간 조절 서열을 포함하지 않는인간 게놈 단편, 및 마우스 IL-7 3' 비 암호화 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하는 DNA 구성물이 제공된다.
한 양태에서, 전사의 방향에 대하여 5'부터 3'으로, 마우스 IL-7 엑손 1 서열에 상동성인 영역을 포함하는 핵산 서열, 인간 IL-7 단백질을 암호화하지만 인간 IL-7 단백질을 암호화하는 서열의 상류나 하류에서 인간 조절 서열을 포함하지 않는 인간 게놈 단편, 마우스 IL-7 3' 비 암호화 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함하는 DNA 구성물이 제공된다.
한 양태에서, 여기에 기술된 것과 같은 DNA 구성물을 포함하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공된다.
한 양태에서, 인간 IL-7 단백질을 발현하는 설치류 또는 설치류 세포를 만들기 위해 여기에 기술된 것과 같은 DNA 구성물의 사용이 제공된다. 일부 특정 양태에서, 설치류 또는 설치류 세포는 설치류 IL-7 단백질을 검출할 수 있을 정도로 발현하지 않는다.
한 양태에서, 인간 IL-7을 암호화하는 인간 게놈 서열로 설치류 IL-7을 암호화하는 유전자 서열의 내인성 설치류 IL-7 자리에서의 치환를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류 세포가 제공된다. 일부 특정 양태에서, 치환은 여기에 기술된 것과 같은 DNA 구성물로 만들어진다. 일부 특정 양태에서, 설치류 세포는 래트 세포이다. 일부 특정 양태에서, 설치류 세포는 마우스 세포이다.
한 구체예에서, 인간 게놈 서열은 인간 IL-7 엑손 2 내지 인간 IL-7 엑손 6에 이르는 인접한 인간 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 내인성 설치류 IL-7 자리에서 마우스 IL-7 프로모터를 포함한다.
한 구체예에서, 세포는 만능세포(Pluripotent cell), 유도된 만능 세포,전분화능 세포(totipotent cell), ES 세포, 및 난자로부터 선택된다.
한 구체예에서, 세포는 인간 IL-7을 분비한다. 한 구체예에서, 인간 IL-7을 분비하는 세포는 상피세포(예를 들어, 장상피세포), 간세포, 각질세포, 수지상 세포, 및 모낭수지상 세포로부터 선택된다. 한 구체예에서, 설치류 세포는 골수 수지상 세포이다. 한 구체예에서, 인간 IL-7을 분비하는 세포는 흉선 간질 세포이고; 특정 구체예에서, 흉선 간질 세포는 피질 상피 세포이다.
한 양태에서, 적어도 한 개의 내인성 설치류 IL-7 자리에서 인간 IL-7을 암호화하는 핵산 서열로 내인성 설치류 IL-7-암호화 핵산 서열의 치환를 포함하는, 적어도 하나의 설치류 공여자 세포(예를 들면, ES 세포, 만능세, 전분화능 세포, 등)를 포함하는 설치류 배아가 제공된다. 한 구체예에서, 공여자 세포는 마우스 ES 세포이고 배아는 전-상실배(pre-morula), 상실배, 또는 배반포인 숙주 마우스 배아이다.
한 양태에서, 흉선, 비장, 상피, 및 장으로부터 선택되고, 내인성 설치류 IL-7 자리에서 인간화된 IL-7 유전자를 포함하는 설치류 조직이 제공된다.
한 양태에서, 마우스 IL-7을 발현하지 않고, 야생형 마우스의 T 세포 집단과 거의 같은 크기인 T 세포 집단을 나타내는, 인간 IL-7을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 마우스는 야생형 마우스의 말초 T 세포 집단과 거의 같은 크기인 말초 T 세포 집단을 나타낸다.
한 구체예에서, T 세포 집단은 마우스 T 세포 집단이다.
한 구체예에서, 마우스는 야생형 마우스보다 pro-B 또는 pre-B 세포를 포함하는 B 세포 종양으로 발달하기가 쉽지 않다.
한 구체예에서, 마우스는 야생형 마우스보다 림프모양의 종양으로 발달하기 쉽지 않다.
한 구체예에서, 마우스는 공지의 림포증식 원인 물질의 부재하에 림프증식 장애를 나타내지 않는다.
한 구체예에서, 마우스는 피부층에서 T 세포의 병리적 침투를 나타내지 않는다. 한 구체예에서, 마우스는 탈모 증상을 나타내지 않는다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스의 T 세포의 대부분은 연령 맞춤된 야생형 마우스와 크기 분포가 거의 같다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 T 세포의 확대를 나타내지 않는다.
한 양태에서, 내인성 변형된 설치류 IL-7 자리로부터 인간화된 또는 인간 IL-7 단백질을 발현하는 설치류가 제공되는데, 이때 설치류에서 인간 IL-7의 혈청 농도가 생리적으로 정상이다.
한 양태에서, 생리적으로 정상 농도에서 설치류의 혈청에서 인간화된 IL-7 유전자를 발현하는 인간화된 설치류가 제공된다.
한 구체예에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다.
한 구체예에서, 인간 IL-7의 생리적으로 정상 혈청 농도는 10 피코그램/mL 미만이다. 한 구체예에서, 인간 IL-7의 생리적으로 정상 혈청 농도는 5 피코그램/mL 미만이다. 한 구체예에서, 설치류에서 인간 IL-7의 생리적인 정상 혈청 농도는 약 2 피코그램/mL 내지 약 4 피코그램/mL이다. 한 구체예에서, 설치류 혈청에서 인간 IL-7의 생리적으로 정상 혈청 농도는 약 2.4 피코그램/mL에서 약 3.2 피코그램/mL이다.
한 양태에서, 비-인간 동물의 생식 세포 계열 안으로 내인성 조절 요소의 제어 하에 인간 또는 인간화된 IL-7 암호화 유전자를 삽입하는 단계, 비-인간 동물에게 인간 또는 인간화된 IL-7을 만드는 것을 허용하는 단계, 및 비-인간 동물(예를 들어, 포유류, 마우스 또는 래트 또는 햄스터같은 설치류)로 부터 인간 또는 인간화된 IL-7을 분리하는 단계를 포함하는 인간 IL-7 단백질을 만드는 방법이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 기술된 것과 같은 비-인간 동물(예를 들면, 포유류, 예컨대, 마우스 또는 래트 또는 햄스터같은 설치류)로부터 분리하는 것을 포함하는 인간 IL-7 단백질의 제조 방법이 제공된다.
한 양태에서, 비-인간 동물의 생식 세포 계열 안으로 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 핵산 서열 또는 그것의 단편을 삽입하는 단계를 포함하는, 생식 세포 계열에서 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자를 포함하는 비-인간 동물의 제조 방법이 제공되는데, 이때 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 핵산 서열 또는 그것의 단편은 내인성 비-인간 조절 요소의 제어하에 있다. 한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자는 내인성 비-인간 IL-7 유전자에 있다(즉, 내인성 비-인간 IL-7 자리에서 상류 및 하류의 비-인간 조절 요소들 사이에 삽입되고, 이때 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 핵산 서열은 비-인간 IL-7 암호화 서열이 존재하는 야생형으로 전체 또는 부분적으로 치환된다). 한 구체예에서, 비-인간 동물은 포유류로, 예컨대, 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다.
한 양태에서, 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자를 포함하는 비-인간 동물을 만드는 방법이 제공되는데, 비-인간 세포의 내인성 비-인간 IL-7 유전자 안으로 인간 IL-7 유전자의 엑손 2 내지 6을 포함하는 DNA 구조물를 삽입하는 것을 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 기술된 것처럼 비-인간 동물로부터 T 세포 분리하는 단계를 포함하는 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질에 노출된 비-인간 T 세포를 동물로부터 분리하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스 또는 래트이다. 한 구체예에서, T 세포는 비-인간 T 세포, 예컨대, 설치류 T 세포, 예컨대, 마우스 또는 래트의 T 세포이다. 한 구체예에서, T 세포는 흉선 및 말초 T 세포의 T 세포로부터 선택된다.
한 양태에서, 본원에서 기술된 것과 같은 유전적으로 변형된 설치류에 물질을 투여하는 단계, 설치류에서 인간 IL-7-중재된 기능에 대한 물질의 영향을 결정하는 단계, 그리고 물질이 유전적으로 변형된 설치류에서 인간 IL-7의 기능에 길항작용한다면 IL-7의 길항제로서 그 물질을 확인하는 단계를 포함하는 인간 IL-7의 길항제인 물질을 확인하는 방법이 제공된다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 설치류에 물질을 투여하는 단계, 설치류에서 인간 IL-7-중재된 기능에 대한 물질의 영향을 결정하는 단계, 그리고 물질이 유전적으로 변형된 설치류에서 인간 IL-7의 기능에 길항작용한다면 IL-7의 길항제로서 그 물질을 확인하는 단계를 포함하는 인간 IL-7의 길항제인 물질을 확인하기 위해 본원에서 기술된 것과 같은 유전적으로 변형된 설치류의 사용이 제공된다.
한 구체예에서, 물질은 IL-7에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 물질은 인간 IL-7에 특이적으로 결합하지만 설치류 IL-7에는 그렇지 않다. 한 구체예에서, 물질은 항체이다.
한 양태에서, 본원에서 기술된 것과 같은 유전적으로 변형된 설치류에 일정 기간동안 IL-7 길항제를 투여하는 단계, 투여 다음에 일회 또는 수회의 시간간격에서 설치류의 말초 T 세포 집단 수를 측정하는 단계, 그리고 IL-7 길항제가 말초 T 세포 집단을 줄이는지를 결정하는 단계를 포함하는 물질이 IL-7-중재된 말초 T 세포 집단을 줄이는지를 결정하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 설치류에 일정 기간동안 IL-7 길항제를 투여하는 단계, 투여 다음 일회 또는 수회의 시간간격에서 설치류의 말초 T 세포 집단 수를 측정하는 단계, IL-7 길항제가 말초 T 세포 집단을 줄이는지를 결정하는 것을 포함하는, 물질이 IL-7-중재된 말초 T 세포 집단을 줄이는지를 결정하기 위해 본원에서 기술된 것같은 유전적으로 변형된 설치류의 사용이 제공된다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 인간 또는 인간화된 IL-70암호화 유전자에 대해 이형접합성이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 내인성 IL-7 단백질을 발현할 수 없다. 특정 구체예에서, 비-인간 동물은 내인성 IL-7 대립유전자 둘다의 넉아웃(knockout)을 포함한다.
상기 및 이하 기술된 각각의 양태 및 구체예는 본문에서 달리 언급하고 밝히지 않은 한 함께 사용될 수도 있다.
도 1은 야생형 마우스 IL-7 유전자 자리(상단) 및 인간화된 내인성 마우스 IL-7 자리(하단)의 개략도를 묘사한다(스케일 없음). 흰색 표시는 사람 서열을 가리키고; 흑색 표시는 마우스 서열을 가리키며; 회색 표시부분(shaded items)은 비번역 영역을 가리킨다; 점묘된 영역(stippled region)은 다른 서열을 가리킨다.
도 2는 75% C57B6 및 25% 129/SvJ(75/25 WT)의 유전자 배경을 가지는 야생형 마우스 및 본원에 기술된 것과 같은 인간화된 내인성 IL-7 자리에 대해 이형접합성인 마우스(5148 Het)의 혈청에서 인간 IL-7 농도를 묘사한다.
도 2는 75% C57B6 및 25% 129/SvJ(75/25 WT)의 유전자 배경을 가지는 야생형 마우스 및 본원에 기술된 것과 같은 인간화된 내인성 IL-7 자리에 대해 이형접합성인 마우스(5148 Het)의 혈청에서 인간 IL-7 농도를 묘사한다.
다양한 구체예에서, 본원에서 기술된 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물을 기술한다. 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 패릿, 영장류(예를 들어, 마모셋(mamoset), 붉은털 원숭이(rhesus monkey))로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 적당한 유전적으로 변형가능한 ES 세포를 쉽게 이용할 수 없는 비-인간 동물에 대해서는, 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물을 만들기 위해 다른 방법이 사용된다. 그런 방법은 예를 들어,비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도된 만능세포)을 변형하는 단계 및 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포에 전달하기 위해 핵전달을 이용하는 단계, 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모 세포)를 배아를 형성하기 위한 적합한 조건에서 비-인간 동물에서 발달시키는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 비-인간 동물은 포유류이다. 한 양태에서, 비-인간 동물은 예를 들어, 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 작은 포유류이다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 설치류는 쥐상과(Muroidea)로부터 선택된다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스(Calomyscidae)(예를 들어, 생쥐같은 햄스터)비단털쥐(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐(Muridae)(예를 들어, 트루 마우스 및 래트, 저빌, 아프리카가시쥐, 벼슬 래트), 네소미이대(Nesomyidae)(글라이밍 마우스, 락 마우스, 흰 꼬리 래트, 마다가스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐(Spalacidae)(예를 들어, 뒤쥐, 밤부 래트, 및 조코르)로부터 선택된 과의 것이다. 한 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트(쥐(Muridae)), 저빌, 아프리카가시쥐, 및 벼슬 래트로부터 선택된다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 쥐의 것이다. 한 구체예에서, 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
다양한 구체예에서, 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/01a 로부터 선택된 C57BL 품종의 마우스인 설치류이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129Sl/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 품종으로 구성된 그룹으로부터 선택된 129 품종(예를 들어, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, see also, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines 참조)이다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129 품종과 상기 언급된 C57BL/6 품종의 혼합이다. 또 다른 특정 구체예에서, 마우스는 상기 언급된 129 품종의 혼합, 또는 상기 언급된 BL/6 품종의 혼합이다. 특정 구체예에서, 혼합의 129 품종은 129S6(129/SvEv Tac)품종이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 예를 들어, BALB/c 품종같은 BALB 품종이다. 한 구체예에서, 마우스는 BALB 품종 및 또 다른 상기 언급된 품종의 혼합이다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 래트이다. 한 구체예에서, 래트는 Wistar 래트, LEA 품종, Sprague Dawley 품종, Fisher 품종, F344, F6, Dark Agouti 로부터 선택된다.한 구체예에서, 래트 품종은 Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fisher, F344, F6, 및 Dark Agouti로 구성된 그룹으로부터 선택된 둘 또는 그 이상의 품종의 혼합이다.
인간 IL-7 유전자 서열로 비-인간 IL-7 유전자 서열의 치환을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다.내인성 설치류 IL-7 자리에서 IL-7 유전자의 인간화를 포함하는 설치류가 제공된다. 예를 들어, 마우스같은 설치류를 만들기 위한 방법은 내인성 IL-7 자리에서 인간화된 IL-7 유전자, 또는 그것의 단편(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 엑손을 포함하는 단편)으로 내인성 IL-7 유전자 또는 그것의 단편(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 엑손을 포함하는 단편)의 치환을 포함한다. 내인성 비-인간 IL-7 자리로부터 인간 IL-7을 발현하는 세포, 조직, 및 마우스뿐만 아니라 인간화된 유전자를 포함하는 세포, 조직, 및 마우스가 제공된다. 본 발명의 인간화된 IL-7 유전자의 예시적 플랭킹 게놈 서열이 SEQ ID NO: 1(5' 플랭킹 서열) 및 SEQ ID NO: 2(3' 플랭킹 서열)인 제공된다. 본 발명의 예시적 인간 IL-7 유전자가 SEQ ID NO: 3 에 제공된다.
IL-7은 미성숙한 B 및 T, 및 어느 정도는 성숙한 T 세포의 발달에 필수적인 사이토킨이다; IL-7 넉아웃 마우스는 성숙한 B 및 T 세포의 심각한 결핍이 나타난다(von Freeden-Jeffry U. et al. (1995) Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine, J. Exp. Med. 181 : 1519-1526). 결핍은 명백히, T 세포 및 성숙한 B 세포의 감소된 집단을 가져오는 pro-B 및 pre-B 세포 사이의 차단, 및 (T 세포 분화에서 차단이라기 보다는)T 세포 증식 차단 때문이다;(IL-7 KO 마우스에서 T 세포 타입의 비율은 대략 정상임)(상기 참조) IL-7은 정상 림프구로부터가 아닌 흉선 및 장, 각질, 간, 및 수지상 세포 에서 상피세포에 의해 생산된다(예를 들어, in Fry T.J. and Mackall, C.L. (2002) Interleukin-7: from bench to clinic, Blood 99(1 1):3892-3904 참조).
간단히 설명하면, IL-7은 T 세포의 수를 늘리고 T 세포 기능을 향상시킨다. (예를 들어, Morrissey, J.J. (1991) Administration of IL-7 to normal mice stimulates B-lymphopoiesis and peripheral lymphadenopathy, J. Immunol. 147:561-568; Faltynek, C.R. et al. (1992)Administration of human recombinant IL-7 to normal and irradiated mice increases the numbers of lymphocytes and some immature cells of the myeloid lineage, J. Immunol. 149: 1276-1282; Risdon, G.J. et al. (1994) Proliferative and cytotoxic responses of human cord blood T lymphocytes following allegenic stimulation, Cell. Immunol. 154: 14-24 참조). T 세포의 기능적 향상은 IL-7 노출의 짧은 지속기간에 의해 달성될 수 있는 반면, T 세포 수의 증가는 장기간 노출로 달성되는 증식효과를 반영한다 (Geiselhart, L.A. et al. (2001) IL-7 Administration Alters the CD4:CD8 Ratio Increases T Cell Numbers, and Increases T Cell Function in the Absence of Activation, J. Immunol. 166:3019-3027; 또한, Tan J.T. et al. (2001) IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(15):8732-8737 참조).
IL-7은 T 세포 조절 초기단계와 후기단계 둘다에서 필수적이다. IL-7은 말초 T 세포 증식 및 유지에 책임이 있다고 믿어지는 주변 비-흉선 세포에 의해 분비되는 IL-7과 만나야 하는 T 세포에 의해 발현되지 않는다(reviewed, e.g., in Guimond, M (2005) Cytokine Signals in T-Cell Homeostasis, J. Immunother. 28(4):289-294). IL-7 고갈은 심각하게 손상된 T 세포 발달과 미접촉(naive) T 세포의 생존을 초래한다. IL-7은 또한 성숙한 T 세포의 생존에 필요한 것으로 보이고;IL-7 결핍 마우스로의 아답티브 전달을 통해 획득된 성숙한 T 세포는 아폽토시스에 돌입하고, 그때에 마우스는 IL-7 유전자를 결핍하지만, IL-7R 유전자를 결핍하는 IL-7 유전자를 발현하는 마우스에서는 그렇지 않다 (Schluns, K.S. et al. (2000) Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo, Nat. Immunol. l(5):426-432). IL-7 기능의 상실은 마우스에서 SCID-유사 표현형을 가져오는데uel, A. and Leonard, W.J. (2000) Mutations in the gene for the IL-7 receptor result in T(-)B(+)NK(+) severe combined immunodeficiency disease, Curr. Opin. Immunol. 12:468-473), 그것은 추정상 IL-7 자극의 부재시에 당분해 부전에 의해 중재되는 것 같은 감소된 성장 속도에 의해 야기된 T 세포축위치 및 사멸에 기인한다 (Jacobs, S.R. et al. (2010) IL-7 Is Essential for Homeostatic Control of T Cell Metabolism In Vivo, J. Immunol. 184:3461-3469).
인간 IL-7 유전자는 33kb에 걸쳐 연장되고 8q12-13에서 염색체 8에 위치된 6개의 엑손을 포함한다. 마우스 IL-7 은 5개의 엑손을 포함하고(마우스에서 인간 엑손5에 대한 대응물이 없다) 인간 유전자에 대해 80% 상동성이다; 인간 및 마우스 유전자의 비-암호화 서열의 분석은 유전자 발현의 전사 및 조절에 책임있는 인식가능한 조절 모티프(motif)의 결핍을 나타냈는데(Lupton, S.D. et al. (1990) Characterization of the Human and Murine IL-7 Genes, J. Immunol. 144(9):3592-3601), IL-7 발현의 조절이 복합적이라는 것을 시사한다. 그러나, hIL-7 자리에서 리포터 유전자를 포함하는 마우스 BAC 단편은 마우스에서 발현되어 마우스에서 IL-7의 발현 패턴을 성공적으로 알아내기 위하여 마우스 안에서 발현되었다(예를 들어, Avles, N.L. et al. (2009) Characterization of the thymic IL-7 niche in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(5): 1512-1517; Mazzucchelli, R.I. (2009) Visualization and Identification of IL-7 Producing Cells in Reporter Mice, PLoS ONE 4(l l):e7637; Repas, J.F. et al. (2009) IL7-hCD25 and IL7-Cre BAC transgenic mouse lines: new tools for analysis of IL-7 expressing cells, Genesis 47:281-287 참조). 적어도 한 경우에서, 리포터로 IL-7 엑손의 BAC 기반한 치환은 야생형 마우스의 신뢰성 있게 재현되는 정확한 IL-7 발현을 희망하여 96kb의 5' 플랭킹 서열 및 17kb의 3' 플랭킹 서열 뿐만 아니라 전체 43kb IL-7 자리를 필요로 했다(Repass, J.F. et al. (2009)). 어떤 경우든지, 추정되는 IL-7 조절 요소에 의해 구동된 리포터 발현에 대한 다른 연구로부터의 데이터는 다소 서로서로 그리고 이전 관측으로부터 변화되어, IL-7 조절이 이들 리포터 마우스에서 신뢰성 있게 재현되지 못하였다는 추론을 지지한다 (IL-7 reporter transgenic mice are reviewed in Kim, G.Y. et al. (2011) Seeing Is Believing: Illuminating the Source Vivo Interleukin-7, Immune Network 1 1(1): 1-10). 인간 IL-7은 마우스 세포에서 기능적이지만, 마우스 IL-7은 인간 세포에서 기능적이지 않다.
비정상적으로 또는 빈약하게조절된 인간 IL-7이 발현하는 형질전환 마우스는 일단의 병적 상태 또는 증후군을 나타낸다. 림프구 구획 안에서 발현을 목표로 하기 위한 마우스 Ig 중쇄 인핸서, κ 경쇄 인핸서, 및 경쇄 프로모터의 제어하에 쥐 IL-7 cDNA에 대한 형질전환 마우스는 B 세포 전구체의 상당히 향상된 수와 흉선에서 흉선세포와 말초 T 세포의 모든 서브세트의 전반적인 확장을 나타낸다(Samaridis, J. et al. (1991) Development of lymphocytes in interleukin 7-transgenic mice, Eur. J. Immunol. 21 :453-460).
SRα 프로모터의 제어하에 마우스 cDNA로부터 IL-7을 발현하는 형질전환 마우스는 조직병리학적으로 사람의 만성대장염을 모사하는 만성대장염을 포함하는 일단의 병적 상태를 발달시키고, 적어도 결장 점막 림프구(결장의 상피세포가 아닌)의 IL-7의 일시적인 과발현과 그것의 결장 점막의 배상세포의 점액에서의 명백한 축적을 특징으로 한다(Watanabe, M. et al. (1998) Interleukin 7 Transgenic Mice Develop Chronic Colitis with Decreased Interleukin 7 Protein Accumulation in the Colonic Mucosa, J. Exp Med. 187(3):389-402; Takebe, Y. et al. (1988) sR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat, Mol. Cell Biol. 8(l):466-472). 형질전환 마우스에서 같은 프로모터에 의해 구동되는 마우스 IL-7의 구성적인 발현은 또한 총 기형 및 대부분 TCRγ∂세포인 단핵세포의 거대한 피부 침투를 특징으로 하는 심각한 피부염을 발달시킨다(Uehira, M. et al. The development of dermatitis infiltrated by yd T cells in IL-7 transgenic mice, Intl. Immunol. 5(12): 1619-1627). 쥐의 중쇄 프로모터 및 인핸서에 의해 구동되는 쥐의 IL-7 cDNA를 발현하는 형질전환 마우스는 또한 피부에서 피부염 및 림프증식을 나타냈으나, Thy-1, CD3, 및 CD5를 발현하나 CD4, 및 CD8(CD4+/CD8+ 흉선세포는 이들 형질전환 마우스에 거의 없다)을 결핍한 TCRαβ세포 및 세포가 보고되었고; 이들 마우스에는 또한 추정상 이들 마우스에서 관찰된 연장된 림프증식과 관련있는 B 및 T 세포 림프종이 발달했다(Rich, B.E. et al. (1993) Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin 7 transgenic mice, J. Exp. Med. 177:305-316 참조).
IL-7 유전자의 조절장애는 여러 가지의 병리학적 상태와 관련이 있다. MHC class Ⅱ Eα프로모터의 제어하 형질전환 마우스 IL-7을 발현하는 마우스는 매우 림프구 종양이 발생하기 쉽다(예를 들어, Fisher, A.G. et al. (1995) Lymphoproliferative disorders in IL-7 transgenic mice: expansion of immature B cells which retain macrophage potential, Int. Immunol. 7(3):414-423 참조; Ceredig, R. et al. (1999) Effect of deregulated IL-7 transgene expression on B lymphocyte development in mice expressing mutated pre-B cell receptors, Eur. J. Immunol. 29(9):2797-2807 참조). T 세포의 크기는 또한 형질전환 마우스에서 더 크고, 다클론성 T 세포의 확장이 관찰된다(대개 CD8+, 이들 마우스에서 불안한 조절을 가리킨다)(Mertsching, E. et al. IL-7 transgenic mice: analysis of the role of IL-7 in the differentiation of thymocytes in vivo and in vitro, Intl. Immunol. 7(3):401-414). MHC class Ⅱ Eα 프로모터를 통하여 mIL-7 과발현(약 25-50배)하는 다른 형질전환 마우스는 극도로 건강하고(B 세포 종양의 적은 발생) 야생형 마우스보다 T 세포수에서 10-20배 증가를 나타냈고, 또한 CD44hi 및 CD122hi인 많은 수의 CD8+세포를 특징으로 한다(Kieper W.C. et al. (2002) Overexpression of Interleukin (IL)-7 Leads to IL- 15 -independent Generation of Memory Phenotype CD8+ T Cells, J. Exp. Med. 195(12): 1533-1539).
MHC class Ⅱ Eα 프로모터의 제어하에 cDNA로부터 마우스 IL-7을 구성적으로 발현하는 마우스는 IL-7-반응성 초기 B 세포를 선택적으로 확장하고, pro-B 및 pre-B 세포를 포함하는 종양의 좋은 공급원이다. 인간 K14 프로모터에 의해 구동되는 IL-7을 발현하는 마우스에는 탈모증과 유사한 피부의 T 세포 침투를 가져오는 림프증식 반응이 발달한다.
IL-7R에 대해 형질전환한 마우스는 흉선의 이중 음성(CD4- CD8-)전구체 세포에서 큰 감소를 나타내는데, 추정상 형질전환 마우스의 이중 양성 흉선 세포 상당수에 의한 IL-7의 고갈에 기인하며, IL-7의 수준이 정상 흉선세포 발달을 촉진하기 위하여 정교하게 제어되어야 한다는 것을 시사한다(예를 들어, Malek, T.R. (2004) IL-7: a limited resource during thymopoiesis, Blood, 104(13):2842 참조).
인간 IL-7의 클로닝은 일찍이 쥐 pre-B 세포의 증식을 유도할 수 있다고 알려졌다(Goodwin, R.G. et al. (1989) Human interleukin 7: Molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage lines, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 302-306). 비록 특정 만성 림프구 백혈병 세포에서 발현될지라도, 마우스에 이식된 종양 세포에서 마우스 IL-7의 발현은 염증 및 감소된 종양 형성을 유발하지만, 역설적으로 IL-7에 대해 형질전환 마우스는 림프종이 발생하기 쉽다(Foss, H.-D. et al. (1995) Frequent Expression of IL-7 Gene Transcripts in Tumor Cells of Classical Hodgkin's Disease, Am. J. Pathol. 146(l):33-39 참조). 그러므로, 내인성 마우스 IL-7 자리로부터 인간 IL-7(마우스 IL-7이 아님)을, 특히 예를 들어 림프구 종양처럼 인간 또는 마우스 종양을 포함하는 마우스에 제한되지 않는 생리적으로 관련된 방식으로 발현하는 마우스를 얻는 것이 바람직하다.
생리적으로 관련된 방법으로 인간 IL-7을 발현하는 마우스는 또한 마우스에서 인간 고형 종양의 이종이식 모델에서 추정되는 치료법(인간 IL-7과 그것의 유사체를 포함함)의 항종양 속성을 평가하기 위해 유용하다. 예를 들어, SCID 마우스에 HT29 인간 결장 선암이 이식되었고 다양한 조건에서 테스트하였다(예를 들어, ablation of native T cells and addition of human T cells; addition of recombinant human IL-7, etc.) (Murphy, W.J. et al. (1993) Antitumor Effects of Interleukin-7 and Adoptive Immunotherapy on Human Colon Carcinoma Xenografts, J. Clin. Invest. 92: 1918-1924 참조). 그 연구는 인간 T 세포가 투여될 때 인간 IL-7은 인간 IL-7의 부재에서보다 상당히 지연된 생존을 가져왔다는 것을 발견하였다.(상기 참조)
그러므로, 인간 IL-7을 발현하는 마우스, 특히 이종이식편(예를 들어, 인간 종양)을 지지할 수 있는 마우스, 예컨대, 면역결핍 마우스는 특정한 안정된 이용성을 가진다. IL-7 신호전달은 시험관 내에서 및 생체 내에서 인간 T-세포 급성 림포아세포 백혈병(T-ALL)의 발달과 생존에 필요한 것으로 나타났다(Touw, I. et al. (1990) Interleukin-7 is a growth factor of precursor B and T acute lymphoblastic leukemia. Blood 75, 2097-2101). T-ALL은 나쁜 예후를 가진 공격적인 조직상의 암이고; T-ALL 세포의 증식 및 생존을 구동하는 메카니즘에 대한 이해는 생체 내에서 종양이 파생된 환자의 성장을 지지할 수 있는 이종이식편 모델의 결핍으로 인해 비교적 빈약하게 남아있다. 그러므로, 인간 IL-7을 발현하는 면역결핍 동물은 생체 내에서 그러한 T 세포 연관된 악성종양에 대비하는 약학적 조성물을 시험하기 위해, 예를 들어, 종양이 발달과 생존을 위해 IL-7 신호전달을 요구하는, 인간 IL-7을 발현하고 이식된 T 세포 유도된 종양을 갖는 마우스에서 IL-7 매재된 신호전달을 목표로 하는 약학적 조성물의 효험을 시험하기 위해 귀중한 생체 내 시스템으로서 역할을 할 수 있다.
실시예
실시예1. 마우스 IL-7 자리 인간화
도 1에서 보여지는 것처럼 인간화된 자리를 제조하기 위하여 마우스 ES 세포를 VELOCIGENE® 유전공학기술을 사용하여, 마우스 IL-7 조절요소의 제어하에 내인성 마우스 IL-7 자리에서 인간 IL-7 유전자 서열로 마우스 IL-7 유전자 서열을 치환하기 위하여 변형시켰다.
표적화 구성물. 표준 박테리아 상동 재조합(BHR) 기술을 사용하여 마우스 IL-7 자리에 표적화하기 위하여 인간 IL-7 유전자를 함유하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)를 구성하기 위해 BHR을 수행한다(예를 들어, Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조). PCR-발생된 상동성 상자를 클론된 카세트에 결찰하고 결찰 생성물의 겔 분리 및 표적 박테리아 인공 염색체(BAC)가 잠복하는 BHR-경합 박테리아 안으로 일렉트로포레이션함으로써 선형 단편을 발생시킨다. 마우스 BAC bMQ-271g18은 마우스 서열의 공급원으로 사용되고; 인간 BAC RP11-625K1은 인간 서열의 공급원으로 사용된다. 선별 단계에 이어서 올바르게 재조합된 클론은 새로운 연결 지점을 가로지르는 PCR에 의해서, 및 제한 분석에 의해 확인된다. 상동성 아암(arm)과 인간 IL-7 유전자 서열을 함유하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)가 만들어졌다. 마우스 ES 세포는 LTVEC 구성물과 함께 일렉트로포레이션되고 선택 배지에서 성장시키고 인간화된 IL-7 마우스을 만들기 위한 공여자 ES 세포로서 사용되었다.
마우스 IL-7 유전자(마우스 Gene ID: 96561 ; Ref Seq transcript: NM_008371.4)는 엑손 2 내지 5를 결실시키고(결실 코디네이트 NCBIM37:ch3 :7604650-7573021 ; 마이너스 스트랜드) 그것들을 인간 IL-7(Entrez Gene ID: 6023; Ref Seq transcript NM_000880.3) 엑손 2에서 6(치환 코디네이트 GRCh37Lch*:7971 1168-79644608; 마이너스 스트랜드)로 치환함으로써 변형시킨다. 인간 게놈 IL-7 서열이 SEQ ID NO:3 (NC#166E2F2)에 제공된다. 마우스 게놈 IL-7 서열은 공지이고 수탁번호 NC0000696(참고 문헌으로 여기 포함됨)에 41,351 nt 서열로서 보고되어있고; 마우스 IL-7 게놈 자리의 관련한 5' 및 3' 서열은 SEQ ID NO:1(5' 플랭킹) 및 SEQ ID NO:2(3' 플랭킹)에 제공된다.
인간화된 IL-7 유전자를 포함하는 LTVEC는 NotⅠ 부위로 상류에 있는 48kb 상류 마우스 표적화 아암, 및 NotⅠ 부위가 하류에 있는 77kb 하류 마우스 표적화 아암을 가졌다. LTVEC를 일렉트로포레이션을 위하여 NotⅠ으로 선형화하였다.
LTVEC를 구성한 후에, LTVEC의 뉴클레오티드 서열을 마우스/인간 5' 접합을 가로질러 얻었고, 그것은 5'(마우스)부터 3'(인간) 방향으로 괄호 안은 마우스/인간 접합 뉴클레오티드를 갖는 다음의 서열:5' -TGCAAGCACC AAAAAGGTGA CCACACTTCA CATTGGCGAT CGC(GG)GTTTC TATCTGAGGA TGTGAATTTA TTTACAGA - 3' (SED ID NO: 4)을 포함하였다.
인간 삽입 및 카세트의 5' 단부(도 1 참조)의 접합을 가로지르는 LTVEC의 뉴클레오티드 서열을 결정하였고, 5'에서 3'으로, 괄호 안에 인간 서열/제한 부위 접합 뉴클레오티드를 갖는 인간 서열/제한 부위/카세트 서열을 가지는 다음 서열:5' - GTTATGTGCT GATGGGCTTT ATTTGATCTA CAGAAGATGC TCTGGTGACA CCCTCAGTGT GTGTTGGTAA CACCTTCCTG (CC)TCGAGATA ACTTCGTATA ATGTATGCTA TACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG CC - 3 ' (SEQ ID NO: 5)을 포함하였다.
카세트의 끝과 마우스 서열의 시작의 연결지점을 가로지르는 LTVEC의 뉴클레오티드 서열을 결정하였고, 5'부터 3'로, 괄호 안에 연결지점 뉴클레오티드를 가진 카세트 서열/제한 자리/마우스 서열을 가진 다음 서열: 5' - GTATGCTATA CGAAGTTATG CTAGTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA GCTAG(CC)CAA TTGCGTACTT TGGATAGTGT CTCTTTTTAA CCTAAATGAC CTTTATTAAC ACTGTCAGGT TCCCTTACTC TCGAGAGTGT TCATTGCTGC ACT - 3 ' (SEQ ID NO: 6)을 포함하였다.
ES 세포의 일렉트로포레이션 후에, 천연 대립유전자의 손실 분석(예를 들어, Valenzuela et al. (2003) 참조)을 수항하여 표적화로 인해 내인성 IL-7 서열의 손실을 검출하였다. 프라이머 쌍, 단편 크기, 및 TAQMANTM 프로브는 표 1에 나타난다. C1 프로브는 nts 9,635-9,664에서 마우스 IL-7 게놈서열(NC0000696)에 결합하고; C2 프로브는 nts 39,793-39,825에서 마우스 IL-7 게놈 서열(NC0000696)에 결합한다. 대립유전자의 이들 분석을 위해, C3 프로브는 nts 29,214-29,242에서 인간 IL-7 게놈 서열(NC#166E2F2)에 결합한다.
실시예2. 인간화된 IL-7 마우스
인간화된 IL-7 마우스의 생산. 인간화된 IL-7 자리를 포함하는 공여자 마우스 ES 세포는 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 초기 단계 마우스 배아 안으로 ㄷ도이입ouey된mirou et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99). 내인성 마우스 IL-7 자리의 인간화에 대해 이형접합자인, 공여자 ES 세포로부터 충분히 유도된 네 마리 F0 마우스가 얻어졌다. F0 마우스는 인간화에 대하여 동형접합으로 길러진다. 동형접합자 마우스는 동형접합을 확인하기 위해 유전자형이 분석된다. 모든 마우스 연구는 Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의해 감독되고 증명되었다.
실시예3. 마우스에서 인간 IL-7의 발현
IL-7 유전자에 대해 인간화된 마우스 및 그것들의 비-인간화된 한배 새끼 대조군이 사육되었고 인간 IL-7의 혈청농도를 R&A SystemI,Inc.부터의 QuantikineHS 인간 IL-7 면역분석 키트를 사용하여 측정하였다. 데이타는 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 분석하고 프리즘(Prism) 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다. 인간화된 IL-7 자리(MAID 5148 het 로 칭함)에 대한 이형접합자 마우스는 생리적으로 관련된 농도에서 혈청에서 생리적으로 관련된 농도에서 인간 IL-7을 발현했다. 이것은 어쩌면 혈청 중에 인간 IL-7의 비생리적으로 잠재적으로 심각하게 해로운 고수준(10 내지 100 pg/mL)을 나타내는 이중 넉아웃(knockout) 마우스에서 렌티바이러스(lentivirus)를 갖도록 형질도입된 인간 IL-7을 지니는 형질전환 인간 IL-7 마우스와는 반대이다 (O'Connell, R.M. et al. (2010) Lentiviral Vector Delivery of Human Interleukin-7 (hIL-7) to Human Immune System (HIS) Mice Expands T Lymphocyte Populations, PLoS ONE 5(8):el2009). 반대로, 인간화된 내인성 IL-7 자리에 대해 이형접합자인 마우스는 정상 또는 생리적으로 적당한 수준의 IL-7을 반영한, 혈청 중 약 2.4 내지 약 3.2 pg/mL(도 2)를 나타냈다.
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Humanized IL-7 Rodents
<130> 2010794-0291
<150> US 61/660,976
<151> 2012-06-18
<150> US 61/740,074
<151> 2012-12-20
<150> US 13/795,765
<151> 2013-03-12
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8777
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8777)
<223> Mouse 5' genomic sequence present in humanized IL-7 mouse (from
NC0000696)
<400> 1
ggcagatcct acggaagtta tggcaaagcc agagcgcctg ggtggccggt gatgcatgcg 60
gcccctcttg ggatggatgg accaggcgtg gcgtgggtga gaggagtcag ctgcctgaac 120
tgccctgccc agcaccggtt tgcggccacc cggtggatga ccggggtcct gggagtgatt 180
atgggtggtg agagccggct cctgctgcag tcccagtcat catgactaca cccacctccc 240
gcagaccatg ttccatggta agcgctgctc tctggtgcgc acaagtaggt gcgcctagcg 300
cgccggggac tctgggacag tccgggaggt gccacccgcc cccgcgcctc cgcacgtccg 360
ggaatagccc ggccttgcac tttggacagg ctgagagctt ggcctctccc atggtcagcc 420
actacccgcg ctgagctcgg ttgcccagaa ccattggcac ctgggcgtac aaccctggcg 480
ggcggggagg aacagttccc gaggcggttt tcagatcccc agacccagag cttcagtgcg 540
ggagccgcga cgcggtggcc ccctgcagtc aagactcagt agtcagtggt tttcagccac 600
tttgtcccta gccagtacct cttcaatgca gcccttcctg gcttcctggc tgtgcagtta 660
ctcacaggct gcctgggttc agggcgttgc tgggctctcg cagctcagaa cttcatggag 720
aatgaaagag tcgctcccag gatgcgcttt taaaccctaa aggacagatc attggaaaac 780
cccctcttct ccccgcagta agtctgggag tttccgatcc aggctgtaag ttgacttgtt 840
tgctgggaac ccaagtcctg cggctgagat tgcaaaaggc cagattttat tttccttcta 900
tatatttgct acttaaggga ggcagaactt taagtaccca tgagtacaaa ttcttagctc 960
cctgatcaaa tctaataggc ttgcattagt tttaaataag taaggattta aagtggacaa 1020
gaacagaatt gacagaggct ggaatccatt tgtagctaga actaatagag atgagaacag 1080
aatggagtgt gaggaggtct acctaaggga atgcaggtgt tttaaatact tcctcaagca 1140
agagaaccta tggaggtgca ggatctagcc taaggctctt tccttttgca accccattgc 1200
aaaccattgt attggtttcc ggcccactgt tttaggtaca attacttccc ctctcttagg 1260
tactagcgaa ccaaaaacat ttgagggagt acttatcaga aaccaaataa aagatgtgga 1320
gacctgagag actgcccaag aaaatgatgg aaggctgcca aggtgcccct gcaggagctc 1380
actgtacagc tagagacacc gcatccctgt cttctttgca atgccctggg ttctgaaatt 1440
gcctttcact ttaacccttg gattacctac aacctggaga gataaaagga caaaggaaaa 1500
gcaaaggtgt aatttaaacg aggaggcttt tcccattgag atacatccat atcggacatg 1560
ccttattttc ttagtaaaga aaatatgaaa atattaaact cacgggagtt aaagtaagtg 1620
gctttttttt tttctttcat tttcggtcca aaatttacta gaggcgtggg taaactccat 1680
caaggctgtg tgctgtgttt ccactttgtt atgtcgggac accaagtaaa caaggattca 1740
ctcgctgacg ctcaattgtg ctgcctcatt atgaatcagc atacatttta tttgtatact 1800
aataaaagga aacaatgaga aacatagagc cttgggaata tggaggaagc ctgaagatct 1860
atctgtaaag gagaattaga aatttcatct cagtgtgtat acttcttgaa caaaaatgga 1920
aagttctttt ataaaaccaa tctcatggcc catgggtatg aagtactgtt atcctgactc 1980
ttgacagata attttgtttt ttaattaatt tatttttatt ccttaatctt tttttttaca 2040
gtacagactt tatacctctc ctgttctgcc cccccccact gctctcctcc ccatacctcc 2100
tccccagccc ccaccccacc cctgactcca agagaatgcc ctcatccccc atgccactag 2160
gcctccccac tccctggggc ttcaagtttc tcaacagtta ggtgcctctt ctctcactga 2220
ggccagacca ggcagtcctc tgctctatat gtgttgggga cagacaactt tataatatgt 2280
agaaatattt actttttccc ttgaaatagg agcatacgct gtagtttcag agcttggcca 2340
agaagcccct tcatgtagaa gacaatgaat atttgtactt cctctcacta tctgtgcatg 2400
cagttatgtt gtaggaagtg taattcagta gctaatagcg gattccctag acacctcaac 2460
ccgaacatca aatgcagctc ctgaatccct agaaaaattg ttttggagaa ttgttctttg 2520
ggctccagat tctctactgt aaactgctag tgacctgtat atatatatat atatatatat 2580
atatgtatca tgaaatggct ataaaattga attatttgtt gaaatagact tgggaaagga 2640
cattgaaaga acacttctca aggaggatgg gaaagtcctc aaggtctcaa ccctagacaa 2700
actgttcagg ccacgaagaa atgctgactg acagtggaga aatagacatc cccagagagg 2760
agcatacaaa ttgtttatcc aaacagccag ccctgaagac atatgtgcaa gtaaggttat 2820
acagactggg caggttgact ttatgtattt agggagatag atggatgata gctagctagc 2880
tagctagagc acaacactta atgaaataaa aggtcatgaa tttgaaatag agcaagaaag 2940
gatatatatg agagtttagg ggaagaaatt gattgaggaa ataaaataat gatgttgtaa 3000
tctcaaaaac taaaagaaac tgatagatga caggatatga tggactgagg aatccaattt 3060
tattatgtcc actttgacct cataacttaa gcagttgaag attgtatgta ttatttggct 3120
tacatttaaa accaacaaga atttttagac agctatcatt ctggtttaac caaattcccc 3180
actgaaaaca aattctccag tttcaaaccc tgtaagcgat ttaaagacaa tactacaagc 3240
caacacttgt cttgtaatgc ttctacagtt tgttttatct gtgacctaat gaaaagttca 3300
gtggaggctg aggagtgagc tataaatcaa aagtaacaaa atatggtaag tgctgaattc 3360
ggatgccatt gggacaaaag tgttaaataa actttcaaac cagaaaaata ttaacttgtt 3420
acggtgcttg tatgtggaag aaataactgt aaccacagaa caaaggtcac actcctgatg 3480
gtggagccag aaacccatgg gatcatacat tatcatacat atcatacatt agagagcctg 3540
gaaggttttc attttagaaa tcagggccag gaagctgaaa tgaaactcag ctatttagtc 3600
agttacacaa aatcctaaat tctctatgct ctaaatctcc ttgtttataa tatatatact 3660
atttatatgt attataaaat attaagtata tattataata tattaaaata tgtatggtac 3720
tgctctggtc tgtcagcagc tactttactt gattgaaata gtctacaaat gaagggctgt 3780
attgtaaaaa tagtatagaa ttgaaaattt cacgtaacac acacatgtat tatcaaagca 3840
agtgtgaagc aatgaaaaag tgctgcccgg tgaggtgtaa ggtcacatca ttctgggaag 3900
cacatatctc agaagaaaac tggcaatctt ggaaagtatg gcaaatgaac ttattgaaac 3960
aggaaatgga ctttgaaatg acttttagat ataggtgcga attaatctct tttcactaac 4020
catcataact ttctcctttg agttcaagtc acattccctg tctctttcat ttgcctggtc 4080
cccccaaaaa cataattttt agggacctat aaggcaaaag atgaaataaa aagccagttt 4140
ctacaaaaaa tgtagatggc tataatccaa ttgagtagta attgatacct gtgtatccca 4200
gtgaagggca gtcataggag aaggctgatg aatggtatta tgagaaggtg cctttcaaac 4260
agaatagcag cagataagat gttatcaatt gattatgggt atttaaaagt gattgtcatt 4320
ttctccccct cttgaagcag atatagatca gattaggcca gattaaaagt agataaaggc 4380
agttttgtta ggaatcccct ctctggtggg ttcatccatc tcacaggtgg aagtcagtga 4440
agtcacacag ccaggctaaa gcatgggggt tttatagagc ttaagcaggg agtagtgatg 4500
tgccagaagg agctaggatg gtgtccatac gtggtcaaaa actgagcccc tggtgggcac 4560
tctggggtgt gttgcaggaa cccagggatg agacatggcg acttattggc ctagagtttt 4620
ttgtttttgt ttttgttttt cccaagcagg ggttccgggt gcaggcaggg ttggggaaag 4680
gagggtagct tccaagtggg gtttccctgc ttgttcagaa tatgagcagg agttccagcc 4740
taacaccccg acctcttggg gtatagatac agccacactc tgctgaagag ggacgggaga 4800
gttgggagcg ggtgggatca tactcatctg caggcatgct gtaggaccat tcggtggtgt 4860
gttacttaga aacttttatg aatccgttcc tggatgaaga gaaggtagca aggtgctagg 4920
aagatgtgca tgtgcaaggt gctaggaaga ctgaggctag ccatgtgaag agtaacactg 4980
ctagagagaa ttgaatgtgt cttggttgtg ttgtgggaac tctttagaca atttgcggag 5040
tgactctgtc caggtctcca caaggccaga ctcactgatg taagagtggc agggacatgc 5100
agatgccgcc cttaccagtc atgaggatac ttttagggcc attgaagcct ataagaatct 5160
tattaagttt acagagagag agagagagag agagagagag acagacagac agacagacag 5220
acagacacag agacagacag agacagagat tttagacatg ttagacagta gacttatacc 5280
tttttgtcat agtacaggct tcggaaacat taaaatttga ttattattaa agctttgaat 5340
tttgaattct taatataaca gaaacatagc taggggaaga atctgaagca tttttttaaa 5400
aaaatatatt ttatgtcatt ttttctcttt tgtcttttaa cctttataac ttgcatttat 5460
taactttaaa catcttttat actatgaaag aactttctta catcctttga atttaaactt 5520
ttatatactc agaccaccta tgggtttttc tctcttttta tccagatatt gaccatgact 5580
cgtaggtagc tgatcattga gagcagttat tgcaaagtga gttcctttag ataaaggaat 5640
attgaaaatt ttatattgaa tttttcagtc taataatgag ataaattgta tctagccaaa 5700
gtagtggcat gtcttggaga gtgtcgtttg aggactgatt tttacacatg aagaggactg 5760
ggaaggtagc tgaagtcttg gatcctgatg ttaaatgaat cctcaaaccc accagagtcc 5820
tgagaaggat caattttatc tgagtaagga gggaactgca agagcaagca gtttctgagt 5880
ctattaaaaa tgacacagac ttacaggact ccctggacag tcagtcatcc aggaattctc 5940
tgtggtcagt ggggcatcca ttttggctat caggccaaga aaatctggca gactttgtgt 6000
gtgtgtgtga atcaagacta tgagaaaaag actgccctac cttgtctagg caagtgaatc 6060
agtcaacttc ccagtgtcct acctgtccac agtgtggccc atgtgctgtc aacagtcgca 6120
gcaaagggct ctttatagcg agcaagcttc aggcagaagt tcttctgggc tgtgttcttt 6180
ggaggagatc aggggtgctg tcaagagctg gtgtgtctct gttatgaaaa gctttttcat 6240
tagccatttt aaatgccata ttttatagac ctctgaagcg tctgaggacc atttgtgtct 6300
ctacagtata tctaaataga caaacgtttg ttttttggct attcaatttt tatttaactt 6360
tgaaaatata gataggaggc taagtaaaac ttattttggt aattaatcat aattataagt 6420
gtagttatga acatattaaa gaatgtgatt atttttgagg taactgataa ctaacttgta 6480
tgttttaata atgtttaaca gcttataata aatgctgtat gttatattta acctgaaggc 6540
agtgttagga cagaaaaggc ttaataagtt ggaaaaatgt ctcagtagcc cttcatgggc 6600
ctaaggaaaa agagtcgctg tggcccaggc ataggtttaa ggaagctgta gttactggag 6660
gaaatggagt gaccattaag ttaaggggtg tgggagaggc tgatgtgctc agtgtatgag 6720
caatgaggtc tcctcacagg acaggctgga ctgtgcagag tggatagggt ggacatggga 6780
gtgagtgtag ccttgcccca ttggcgagga gaaaagccag gttaccagga ggaagaggag 6840
gaggaggggg gggggaagtg gggggaggag gagggctgct gaagctttaa cagagtgcag 6900
gcgaactgaa aggaaggaat cctgcggggt tacaagaacc agagccatgt ggaacacata 6960
gcaggctaaa gaatcggact tcagaattta gaatcaaatt tccagacaag taagtgatcc 7020
atacacactt tgggaggatt agcatggttt ggagcaacca ttgcagttac aaaaggttga 7080
gtgtgtcaaa gagaagaagt gggaagagtc tgggctctgt caatacaggg gtttggggtt 7140
tgggatccag gtccttggag gcaaggggtc ttttggagtg aacatccttg ctagtaggac 7200
gtgagcctta gaacattggc tacagaggaa gggacagggt gtggttccca acaaacctgg 7260
ccagaaggga ttcaggccat ttgcccgcat accaaaagaa atgttaagct taagatccgt 7320
ggagaatttt aacatcaaga atgctctctt gtggccgttt actgaagcga ggccatagaa 7380
caaagtctga gacagtccta atttggacaa cttttgtagc agtcacccca ggaatgtctg 7440
aggatcaggt ttagactccg tgttgcccat ctcctagact tgtggcgacc tatgatacag 7500
tgtcccactt ggtagcctgg ggtaaaacag tgaggagtaa agaaaccttg taaaggatat 7560
ctcagaatcc aaatactagg ccatggcttg gcagaggatc ttggtaagtt caaagttgat 7620
ccttcagatg aagagagaaa gggagagaaa ggagcagacc ccatgcagcc atggtccctg 7680
cccgctgggc tgcaggctca acttctcccg cattttgaac caagatgata ggaattttct 7740
ctccatccat gaagcagatc tagggcagat ttgatgagat aaaaagtaga tacaggcagg 7800
tttattagaa gacaactctc aagtgggttc accgatctta cacatggaag tcagtcaagt 7860
cctatatctg ggctaaaaag caagggaggt tttatagagt ttaggtgagg aatgatgcca 7920
tgccagctag gaactgggat ggtgtgcata catggtcaaa aaatgagaaa aaaggagtga 7980
tagctctttc ctgtgcttag cacgatttag ttgcctgtag ttcttttgtc tatagttgta 8040
gctctgtgag attctgtaat ttcgaccaag catactttct ttacatatat atatatatac 8100
actcagctgc taatttatgg tggatttata aataaattta tttataaatt tataatttat 8160
tgccttttta ataccatgta taatagtatg atatattgca tcctatgata tccttacatt 8220
ctttaagttg tttccaatgt caattccttg ggtttagaga aatattgttt agacttttaa 8280
atagagaaga tgcacataaa atgctgaaca ctgggatttt ataacgttaa tttgggaaaa 8340
tcatggtaag tatattttca acataactga gttcagggaa aaatgaaagc aagattcatg 8400
aagatatagg tggcttaacg tttttatgta ccagaagttt ccatcttaat tatttactcc 8460
aagtgatgat tccatttaaa atctccttcc ttttaattaa acagttcact ctgattggca 8520
tgacttactt gatgtagtca taaacaccag ctgagaggtc tcgagtctat tgtgtgaact 8580
ttgcctaaca gggaaggaat ttaaagagag ctatgcttga acagaatcta ggtctttggg 8640
aaaatagata cacaaaataa tgacataagg gaaagagttt gcgaacatga tttagggggc 8700
aaagtaaaac tctgtaaagt ccatcacaaa gaatcgccat agtgcaagca ccaaaaaggt 8760
gaccacactt cacattg 8777
<210> 2
<211> 944
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(944)
<223> Mouse IL-7 downstream (3') genomic sequence from the humanized
IL_7 mouse (from NC00000696)
<400> 2
ccaattgcgt actttggata gtgtctcttt ttaacctaaa tgacctttat taacactgtc 60
aggttccctt actctcgaga gtgttcattg ctgcactgtc atttgatccc agttttattg 120
aacacatatc ctttaacaca ctcacgtcca gatttagcag gagactagga ccctataact 180
ttgttaagag agaaaacact aatttcttgt tttatagtag ggtcttattc gtatctaagg 240
caggctagga ttgcagacat gagccaatat gcttaattag aaacattctt tttatgttaa 300
actcatgtct tttacaagat gcctacatat atcctatgta tatgcctgtt taaatccttt 360
tttgtaaggt ctgctgtctt ccttcagttg taatggaaag aaacactatg ttgtagaggc 420
caaatttctg aaagtgataa gggtttgctt gtactgaatt ctcattctcc ttgctttttc 480
cagccacgtg agcatctagc tatctatacg ctggatgtat ttgaccgatg cctgctccac 540
tggcacattg catgtgtggt agccatgcct tcttgcttct ccttttcccc aacccctata 600
atgctctact cagtggtaca gatagctggg attatcacaa ttttgagaga aacaccaatt 660
gtttaaagtt tgtttcataa tcaccatttg cccagaaaac agttctctca acttgtttgc 720
aacatgtaat aatttaagaa actcaatttt gttaatggac tttcgataac ttccttagat 780
atcccacatc tcctacgtgt cagtcctttg tcctgaggaa ctggtaaaat gggtaagccc 840
ttagctagcg aactgaaggc attcgcatgt gtaagataat ctctatacct gcaaggctgt 900
ctggatggct ccctaccaat attgaacaat attctgattt tggc 944
<210> 3
<211> 72752
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72752)
<223> The human genomic IL-7 sequence (NC#166E2F2)
<400> 3
acatccgcgg caacgcctcc ttggtgtcgt ccgcttccaa taacccagct tgcgtcctgc 60
acacttgtgg cttccgtgca cacattaaca actcatggtt ctagctccca gtcgccaagc 120
gttgccaagg cgttgagaga tcatctggga agtcttttac ccagaattgc tttgattcag 180
gccagctggt ttttcctgcg gtgattcgga aattcgcgaa ttcctctggt cctcatccag 240
gtgcgcggga agcaggtgcc caggagagag gggataatga agattccatg ctgatgatcc 300
caaagattga acctgcagac caagcgcaaa gtagaaactg aaagtacact gctggcggat 360
cctacggaag ttatggaaaa ggcaaagcgc agagccacgc cgtagtgtgt gccgcccccc 420
ttgggatgga tgaaactgca gtcgcggcgt gggtaagagg aaccagctgc agagatcacc 480
ctgcccaaca cagactcggc aactccgcgg aagaccaggg tcctgggagt gactatgggc 540
ggtgagagct tgctcctgct ccagttgcgg tcatcatgac tacgcccgcc tcccgcagac 600
catgttccat ggtaagcgct cttctccctt gcgcacaagt tcgcgcgccc gacgcgccgg 660
ggcaatccca gacgcgctgg gggcccctgc tcctaggcaa gtccgggaat agcccggcct 720
tgcactttgg acctgcggag agcactggct ctcccatggg cagccaacag ccgcgcctga 780
gtatcctggc acatagccac ttgaacctgg ggcggctgct gcccctggca ggctgcgagt 840
aacagtcccc aacgcctgct ttctgtcctg agagggaacg ctgcagcctc cgcgccgctc 900
agcggtggca gcccacagcc ggtctcagaa gcagccaaag gctctctgtc tggcgccctt 960
cccgtgctcc tggccgcccc aagttactca cgcaggcggc ccgggttcgg cgagtagctg 1020
ggctcttgca gctcagaact ccctagagaa gtgaaagcga agctcccacg ggacgcgctt 1080
ttaaacccta ggggaacagg tctccggaaa accccatttt tcccccctga gtaagactgg 1140
gagtttccgg caagggctgt accttgcgcc tattgctggg aaaccagtcc tggggctggc 1200
gctgaggaag gccagcttct gggttttttt gtttttgttt ttgtttttgt tgttattttt 1260
tcctacgggc gcttcttgat ggaggcagaa tgaaataggc gtgactctaa cttccagacc 1320
agtattgaga cctaatatat cttatttgtg cagaatacgg atttagaatg gacagggaca 1380
gaattcagga gggttggatt cggatggcag tcatatatga ccaatgaaag agccaaaaaa 1440
cttactggaa ttaaaaaaga ggaaaaagga ttgtgagggg aaaagatctg cttaggaaaa 1500
ttggaatgct ttacagtaag tacttcctca agcaagaaga cagctggggg gagggtgcgg 1560
gaataggaaa ctgactgctc tttcttttga tggctactcc gttagatcaa gacttctttc 1620
cactctcgtg ggtaaagaat caagaattga cacaaccaag gagtgccagc tcagtaacaa 1680
aacaaagata gagagagcgg aaagaatagc caacgtaatt atggaggact tctaaggaat 1740
gtcctcccgg agcttaatac aaaactaaaa attgagcaca accctatttt ccttgcaatg 1800
cccatagttc tgcagtttct tcttctggat cacccttggt tctaatcctt gcaacacctc 1860
tgctctaaag tagaaaggta aactgagaaa aggaagctag cgtgtgcatt tttcagaaaa 1920
agcctttact tcctgaagca cagttatatg aatcatgggc tataagtttt cattagcaga 1980
caaaatatta aaattctaat aataatgatt ataatgcatg gcttcctgaa gtttgtttca 2040
agaaatttca ctagaagctt gttccattaa gagtgcacat aatgttactc tttacccttt 2100
gtctttgcca tttcttttga gagttgaagt agttgaggat ctactatgtg gtctccaact 2160
gtcttatctg gtttgggtaa tttcatcata tttgaggacc aaaaagttga atagcaataa 2220
aaatagactc tactcgggag gctgaggcag gaggattgct tgagcctgga agtcaaggct 2280
gccgtgagcc atgatcttac cactgtcctc cagcctaggc aacagagtga tgccctgtct 2340
caaaaaataa taatagagaa ctaatattag aaaccctgaa caagcataaa ggagaattac 2400
aaactgcatc acgttagtgt ttgaatattt ttttaaaaaa tggaaaaggc catttcatag 2460
aacgaactta cgtgtcatat tcacactcat ctatgtgact tttttttctg cttttaaccc 2520
tgacacataa cctactgtaa caagaacaaa tatttagtct ctttttctga aataaaagca 2580
tatgatgcag tttcacagtt tggccaggaa gtaccttagt gaggttcatg cacaggaaga 2640
tgggttttta tgcaatcccc ttgactacac atatatggtt attttttaag gaagcaatgt 2700
agttcagtgc ctaaaagctg aggttctaga ctcttcaatg tgacagtctt ggatttgaat 2760
tccatatcta tattatgtac aggaattttc tgactaggca tggtggctca agcctgtaat 2820
cccaacactt ggggaggctg aggtgggcag atcaccttag gtcaggagtt cgagaccagg 2880
ctggccaaca tggtgaaacc tcgtctcaac taaaaataca aaaaaatttg ccaggcgttg 2940
tggtgggcac ctataatccc agctactcag gaggctgagg gaggagaatc acttgaacct 3000
gggaggctga ggttgcagtg agccgtgatc gcaccattgc actccagcct agatgataga 3060
atgagactcc atatcaaaaa aaaaaaaaag agagagaaaa atacgaaagg aattttccta 3120
catgactgtc tttgtgcccc agattctcca tctataaatg tgaataactt gtagtactta 3180
cctacttctt catgaagtgg ttatggaatt aaattatcag tgaaaatagg tctatgcaat 3240
ggacattcag taaacactgg ttttaaagac tgataaagac tggagttgat ggattgtaga 3300
aaactattta tgttaacttt gacccccata acttaagcag ctgaggattg aatgtattat 3360
ttggcttaca ttaaaaacca acaagaattt ttagacagac ctccttctgg tttaaccaaa 3420
ttccctactg aaaacaaatt ctccaatttc agcctcttca ggggaagtaa gggcaatccc 3480
acaagccacg cttgccttgc gttattccta tggtttatct tttcggtaac ctaatgaaaa 3540
gttcaggatg gtggggagtg tgggtgtgac aacaatgcca aaagcactct caaaccagcc 3600
attcttaata tgttactctc tatgtgatgt aggagaaagg tcttcaatta tggaccaaac 3660
taccaagcta catcattaat gggagagctg ggaacctatg agatgtgggt ccaaggccct 3720
aggtatgttt gcagcattgt ccgtgaggca atttcagatc taaagagttt ctgcatttgg 3780
aggaccaggt agattcttag aataaggtgt ctgcaagatg aaaaagatca tttagtctga 3840
agttttcatt ttagaaatca ggtaagtgac cttaagagat gctgtgtcat ttacacagtc 3900
acacaaacca ttgtcttggc aagtcaaaag tctcaagttt tgacttgact actcagccta 3960
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agtctgtttt tattgctatt caactttttg gtcctcaaat atgatgaaat tacccaaacc 4140
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ggcatagaca aagggtaaag agtaacatta tgtgcactct taatggaaca agcttctagt 4260
gaaatctctt gaaacaaact gcaggaagcc atgcattata attattatta tgagaatttt 4320
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caacaatggc aacagaaaac actcttaaca ggcaaggcaa attatgtttt aaaattgaga 4440
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caaaatgcca tccggtgaat aaataggttg atttaaattt gaggagcact taactactga 4560
aaattgaggt gaagaagaca gctaatgctc atagcaagta aaacaacctc atgtattaaa 4620
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atttaattat tttattatat tctcctttaa gctcatttca agttatatgt tatataattt 4740
ttcctctatc atctactcct cccgaagtat accttttgga cccctgtaag atgacagaga 4800
aaataaaaag tatgatttca tacaatctat acaaatctga ttacaaggtc agaatctggt 4860
gaataattag caattgatca tccaaatgtc catcagcaga ggtttggata aagaaaatgt 4920
ggtatggccg ggcttgtaat tacagcttgt aattctgaca cttaaggagg ctgaggcagg 4980
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taaaaacaaa ttttaaaaaa ttagctgggc atggtggggc accctgtagt cctagctact 5100
cagaacgctg aggtaggagg atcgcttgaa cctaggaatt tgaggcttca gtgagctatg 5160
atcatgccac tgcactccag cctgggcagc agagtgaaac cctgtctcaa aaagagaggg 5220
agaaaaaaag aaaatgtggt atatgtatac catggaatac tactcagcca taagagttaa 5280
gtcgtctttt gcagcaaaat ggatgaaact tgaggccatt atctaagtga aatgactcag 5340
aaagtcaaat gctgcatgtt tttacttata actgggagct aaacagtggt acagatggac 5400
atacagggtg gaataatagg cattggagac tttgaaaggt gggagagtag gagggggata 5460
aggattgaaa aattacctat tgggtaccat gttcactatt caggtgatag atacactaaa 5520
gcccagactt caccactgta cagtatatta aatatgtatt agtaagaaat ctgctctggt 5580
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cattcagaag acaaatgtga ttacatgtta tcaatagatt atggccattt ctaatcgaat 5760
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cagaaagact aacttgcaga actttttgga tatttataaa tcatatatat atatatgaga 5880
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atcattatct gtctcctaag ttaattcatg ctcatcatgc atataggcac ttagtggcag 6000
agttattaat atatttgtat aaataaaatt atcaattttt gtttctctta ctatgttgtc 6060
acatatgcag atgagaagtt agatttatgt ttgttttcat aattgctacc cagaaaattt 6120
tctctatttg taacaacatg ggtcacttga tttattggga ggtgttattg attgttttat 6180
atgacagatc atgatataat agatgacaat gttactggaa actttatgat atccctaaca 6240
gtcttcaggc tgtcacaata ttagttcctt gggtttgaag gagtgttgct tgtactctta 6300
atcagagaag gcacacaagt gaaatatctt gcattcaagt acaattgaag ttcatttggg 6360
aaattcacag gaaatacatt gtcaacatgc ctcagagttt acaaaaagat acaaataaga 6420
cactatggca ggtttatgaa gaaataggtc cctgtatgat cagattttaa tgtttgtggg 6480
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tgaggatgtg aatttattta cagagttttt ctaacatgac aagaagctgg atagcgctgt 6660
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agtagtccca aaatacaaac ataaactttg taagactttt gggaatgtaa acccttcagg 6780
gttcattatt aaaaagaaag agtgcactta cagtagttac agtgcaatcc cagggagatt 6840
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attgattaac accctggagt gtttttcaga agcagtctat gatttcatca cccttgtttt 7080
gcactttcct aaagagtaat tgcaaaataa aaaagtgaaa ggacgctata ctccaaaatg 7140
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aaccaagatg tatttttaaa attattagaa attagtggtc cagtccattg aaaccccaca 7260
atcaaatgca atacgatata acatttagct cattcttatt tactgtcaaa tttagtttct 7320
tttaggtata tctttggact tcctcccctg atccttgttc tgttgccagt agcatcatct 7380
gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 7440
gatcaattat tggtatgtga ttattttgtt ttactcacat tttcatgcat tgggaaaatt 7500
tgaacctttt tggtatgcag ttttataatc aagtattcat ctttcttgac aagaaagtga 7560
agtaactata gaataaaatt taatgagcta ctaactgtat atttttatag ctgacataat 7620
tatgtagctt aaaaataatt ctttcctcga ctctaagatt ctcacaacta ttcatttcag 7680
tcctatttcc cttttagtaa atttcttgta agcataattc agtatcactg cctaaatttc 7740
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atgcatagtt atttatatgt gtgtatttta tatctatgtg taatcaataa tttgttatga 7920
gttaaatttt ctatttttga tggttaaagc ttttctaatt aatagatttt ataccttaga 7980
gccaacttag gtttctagaa aattcgagca gaaagtagaa aattcccata tgctctctct 8040
ctctctgcac tgtttccctt attatcttac atcagtatgg cacatttatt acaattgatg 8100
agccagcatt gatacattac ataagtgcat agttaacatt aggattcatt ctttatgttt 8160
tatagtttta tgggttttga taaatgtata ccatcacata tccgtgatta catatcatac 8220
aaatcatatg gtaaaaatct cctatccacc gactcatcct tctctttctt cccctgaact 8280
cctagtaacc actgatttgt ttatgtctct gtagttttgc cttctttaga atgtcatata 8340
gttagaatca tgcggtctgt atgtggcctc tttagactgg attctttcac ttagcaatgt 8400
gaatcaaagc atcccccatg attttttgtg gtttgatatt tcattttttc ttattgctgg 8460
ataacagtct attgaatgga tataccacaa cttgtttatt ttttcactga ttgaaaaatg 8520
tgtcacagtt gcttccaata tttggaaatt atgaataaaa cttctataaa catatacgtg 8580
cagggttttg tgtggacata agttttcaac tcaggtaaat acctacaagc atgactgctg 8640
gatcatatgg taagactgtg tttagctctg tacaaaactg ccaaactttc ttccaaagtg 8700
gctgtaatat tttgcattct taccagcaat gaatgagatc ctaatgcctt ccatcttcgc 8760
cagcctttgg tattatcagt tttgcagatt ttaaccattt taataggctt gtcatagtat 8820
ctcagtgttg tttcaatttt ccattccata atgacataca atgttgacca tcttttcaga 8880
tactttttgc catttgtata tctgctttgc tgaggtgtct gaactcacat ttttactgaa 8940
atcttaacaa tattgagtct tcttagccat tatcatgcac tatctctttt ttaatttttt 9000
tcatcattta attgtattat ctggacagag aacaaatgag tattactgtg acaacatttg 9060
taaataatta tatgtgtgta aaactctgca aaagaagatg caattgaaaa tgcaaacttt 9120
catcagagct ttgttctttt cagcatataa atcctgtaaa tattttatta gacttatacc 9180
taaatatttc atattttagt gctattttaa atggtgtgtt tctaatttca aattttagtt 9240
gtttattgct ggtacatagg aaagcaattg atttttgtat attaacctat gtcctgcaac 9300
cttactataa tcacttgttt gttctagaag tctgttgttg attattagga attttctaca 9360
tagacaatca tgtcatctgc aagagttaat tttttccaag gtttcagagc tgtatcaata 9420
caatgtgatt gatttattgt tttaacagat aattagtctc ttttcaatca gattgaaact 9480
gaatagcaaa ggaaaactct ctcaaatgtt cataagatgg gagaaattgt ctaatctgtc 9540
ccccgacttt tactccactg tctcttccac atactcatac tgaagtggca tgatgccttg 9600
aggaatttag tgttatacct cttgtaggaa tatggaaact aaaaagagat actgtgctac 9660
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acagtaaatg gcaattgctc catttagatt tcttgctaat ttggacattg catttgatga 9780
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cagagaacaa actagtgcta gttcaacatt tataaataac tatatgtgta taaaagtgca 9900
aaataatatg ctattaaaaa ttcagtaaaa ggagagtttc atccaacaga ctcatgacac 9960
atttttttgg tgggagaata tagaggagct tatctcatta acacacaaaa caagaacaag 10020
tacatcagca gcaataatta tattattttc aaaaaacaaa acatggctac tcttcttaag 10080
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caaactaact ctcttgttag ggacaaatgc agctggtgac tttaagtttt agcaaaatat 11100
tactgctcat tgacaatgca aaactagtca cccaagagtg ctgatggata ttaatgtttt 11160
cataactgct aatataacat ctgtttttca gcccgtgaat caaagagtag tttcaacctt 11220
caagccttat tttttaagcc atgtattttt gaggctatgg ctgccagaga taatgattca 11280
tctaatagat ctgggcaaag aattgaaacc ttgtgaacag cattcattgt tctgtagtag 11340
atgtccttaa aaacatttgt gattcatggg aggaggtcaa aatatccaca ttaacaggag 11400
ttcggaagaa gttgattcca actgtcatag atgactttga ggggttcaag acttcaatag 11460
agaaagtaaa tgcagatatg gtagaaatag caagagaatt agaattagaa gtggagcctg 11520
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tgttcctagt agtcaaattg ttggattata tggtcactct gttaaacttt ttgagaaact 12660
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tattatagtt ggaaacttca cagccttctg tcagtaattg acagattcag cagggaggaa 16740
atcagtaagg ttacagatga acttgaaagc accataaatc aactggatct aattgacagt 16800
tataaaatac ttcatcaaac aacagcataa tacacatttt tctcagactc acatggaata 16860
ttccccaaaa ttgaacatgt actgagccgt aaaacacacc ttaacaaatt tttataaagt 16920
acaagtcatg cacaacatgc tctcaaccaa aatgtaattg aagtagaaat caataaaata 16980
agaaaaatag gtggaaaatt cccaaatatt tggaaattaa aaacacaatt tttgataaca 17040
tatgggtcaa acaaaatgtc tcaaaagaaa ttttaaaata ttttgaatta aatgaaaaga 17100
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ttctttctag ccacatacag gccatgatcc ctctctcttc aaagtagtca cctatactat 57540
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aatggccacc cagataaaaa aattctaatc tgaaaatgta taaggtaaag gaatctacag 59460
atgtgattga attaagaatg ttggtgtgat aagtttattt tggattatct tggtgggccc 59520
taaatgctat cacaagttcc ttctaagaga aaagcaggag aagacttgac acccacacaa 59580
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atgtgaagtc tctaagaaac caatgtaaaa agagctaaaa acaatatagt atgaaagaaa 60060
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ttcaataaat ggtatagcaa atgttttgac atgaaaaaag gacaatttca aaaaaataaa 72480
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agataataat atatgtttac cttttaatta atgaaatatc tgtatttaat tttgacacta 72660
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<210> 4
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> synthetic
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<220>
<223> synthetic
<220>
<221> synthetic
<222> (1)..(152)
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gttatgtgct gatgggcttt atttgatcta cagaagatgc tctggtgaca ccctcagtgt 60
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<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<220>
<221> synthetic
<222> (1)..(153)
<400> 6
gtatgctata cgaagttatg ctagtaacta taacggtcct aaggtagcga gctagcccaa 60
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<210> 7
<211> 24
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- 인간 또는 인간화된 IL-7 암호화 유전자를 형성하도록 생식세포 계열에서 적어도 하나의 비-인간 IL-7 엑손을 적어도 하나의 인간 IL-7 엑손으로의 치환을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물로서, 상기 치환은 내인성 비-인간 IL-7 자리에 있고, 상기 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 내인성 비-인간 조절 요소에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제1 항에 있어서, 설치류인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제2 항에 있어서, 설치류는 래트 및 마우스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 설치류.
- 제2 항에 있어서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 인간 엑손 1, 인간 엑손 2, 인간 엑손 3, 인간 엑손 4, 인간 엑손 5, 인간 엑손 6, 및 이것들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 설치류.
- 제4 항에 있어서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 5개 이하의 인간 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 설치류.
- 제3 항에 있어서, 설치류는 마우스이고, 변형된 자리는 마우스 엑손 2, 3, 4, 및 5를 인간 IL-7 엑손 2, 3, 4, 5, 및 6을 포함하는 인간 게놈 세그먼트로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 설치류.
- 제1 항에 있어서, 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자는 인간 또는 인간화된 IL-7 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 생식세포 계열에서 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스 유전자를 포함하며, 상기 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자는 내인성 비-인간 조절 서열과 상류 및 하류에 플랭크되어 있는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제8 항에 있어서, 설치류인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 마우스, 래트, 및 햄스터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 제9 항에 따른 설치류.
- 제8 항에 있어서, 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자는 인간 엑손 1, 인간 엑손 2, 인간 엑손 3, 인간 엑손 4, 인간 엑손 5, 인간 엑손 6, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제11 항에 있어서, 인간 또는 인간화된 IL-7 유전자는 적어도 다섯 개의 인간 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자를 갖는 비-인간 동물의 제조 방법으로서, 내인성 비-인간 IL-7 조절 서열과 상류 및 하류에 플랭크된 인간 또는 인간화된 IL-7-암호화 유전자를 포함하도록 비-인간 동물의 생식세포 계열을 변형시키는 단계를 포함하는 방법
- 제13 항에 있어서, 변형은 내인성 비-인간 IL-7 자리에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13 항에 있어서, 비-인간 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15 항에 있어서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로 구성된 그룹으로부터 선택된 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 유전적으로 변형된 비-인간 동물로서, 같은 속과 종의 야생형 비-인간 동물에서 관찰되는 것과 동일한 발현 패턴으로 인간 IL-7을 발현하도록 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제17 항에 있어서, 비-인간 동물에서 발현된 인간 IL-7의 수준은 대응하는 야생형 마우스에서의 비-인간 IL-7의 수준과 거의 같은 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제17 항에 있어서, 설치류인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 제18 항에 있어서, 설치류인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물.
- 비-인간 IL-7 엑손 1, 인간 IL-7 엑손 2, 인간 IL-7 엑손 3, 인간 IL-7 엑손 4, 인간 IL-7 엑손 5, 및 인간 IL-7 엑손 6을 포함하는 인간화된 IL-7 유전자위.
- 제21 항에 있어서, 인간화된 IL-7 유전자위는 비-인간 IL-7 엑손 1 및 인간 IL-7 엑손 6를 플랭크하는 5' 및 3' 비-인간 IL-7 비번역 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 IL-7 유전자위.
- 제21 항 또는 제22 항에 있어서, 인간화된 IL-7 유전자위는 비-인간 3' 비번역 영역과 인접한 3' 인간 비번역 영역 또는 그것의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 IL-7 유전자위.
- 제21 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 IL-7 유전자위는 5' 비-인간 IL-7 비번역 영역, 또는 그것의 일부와 인간 IL-7 엑손 2에 인접한 비-인간 IL-7 엑손 1을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 IL-7 유전자위.
- 제21 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 IL-7 유전자위는 도 1에 제시된 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화된 IL-7 유전자위.
- 제21 항 내지 제25 항 중 어느 한 항의 인간화된 IL-7 유전자위를 포함하는 세포.
- 제26 항에 있어서, 세포는 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제1 항 내지 제12 항 및 제17 항 내지 제20 항 중 어느 한 항의 비-인간 동물로부터 분리된 세포 또는 조직.
- 제28 항에 있어서, 조직은 흉선, 비장, 상피, 및 장으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직.
- 제29 항에 있어서, 조직은 흉선 조직인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직.
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Cited By (1)
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KR20210108828A (ko) | 2020-02-26 | 2021-09-03 | 차의과학대학교 산학협력단 | 동물 면역계의 인간화 활성을 촉진하는 방법 |
Families Citing this family (29)
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MX2016014504A (es) * | 2014-05-05 | 2017-05-23 | Regeneron Pharma | Animales c5 y c3 humanizados. |
NO2785538T3 (ko) * | 2014-05-07 | 2018-08-04 | ||
NZ731471A (en) | 2014-12-05 | 2021-12-24 | Regeneron Pharma | Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene |
RU2730599C2 (ru) * | 2015-04-13 | 2020-08-24 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Гуманизированные мыши с нокином sirpa-il15 и способы их использования |
CN108779159B (zh) | 2016-02-04 | 2022-12-30 | 瑞泽恩制药公司 | 具有经改造的angptl8基因的非人动物 |
US10070632B2 (en) | 2016-02-29 | 2018-09-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents having a humanized TMPRSS gene |
AU2018338790B2 (en) | 2017-09-29 | 2022-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized TTR locus and methods of use |
WO2020018511A1 (en) | 2018-07-16 | 2020-01-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal models of ditra disease and uses thereof |
CN114107385A (zh) * | 2019-01-17 | 2022-03-01 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化转基因动物 |
SG11202108454RA (en) | 2019-04-04 | 2021-09-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
KR20220016869A (ko) | 2019-06-04 | 2022-02-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 베타-슬립 돌연변이를 갖는 인간화 ttr 좌위를 포함하는 비-인간 동물 및 사용 방법 |
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US20220312749A1 (en) * | 2019-08-09 | 2022-10-06 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric il2ra |
US20210227812A1 (en) * | 2020-01-28 | 2021-07-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use |
CN111926039B (zh) * | 2020-09-23 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | Il-13基因人源化的非人动物的构建方法和应用 |
WO2022140221A1 (en) * | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized tslp gene, a humanized tslp receptor gene, and/or a humanized il7ra gene |
CN114835798B (zh) * | 2021-05-28 | 2024-02-23 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | Cd36基因人源化非人动物的构建方法及应用 |
WO2024054904A1 (en) * | 2022-09-08 | 2024-03-14 | The Jackson Laboratory | Humanized immunodeficient mouse models |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA887773B (en) * | 1987-10-26 | 1989-07-26 | Immunex Corp | Interleukin-7 |
WO2001015521A1 (en) | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Genencor International, Inc. | Transgenic mammal capable of facilitating production of donor-specific functional immunity |
US7759541B2 (en) | 2004-12-13 | 2010-07-20 | Iti Life Sciences | Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity |
GB2434578A (en) | 2006-01-26 | 2007-08-01 | Univ Basel | Transgenic animals |
CN101302517B (zh) * | 2008-02-03 | 2010-11-03 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法 |
EP3056082B1 (en) * | 2009-10-06 | 2018-09-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice and engraftment |
ES2948210T3 (es) | 2011-02-15 | 2023-09-06 | Regeneron Pharma | Ratones humanizados con M-CSF y uso de los mismos |
EP2818478B1 (en) | 2011-10-28 | 2017-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized IL-6 and IL-6 receptor |
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- 2019-05-01 US US16/400,074 patent/US20190343093A1/en not_active Abandoned
- 2019-08-13 IL IL26867419A patent/IL268674A/en unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR20210108828A (ko) | 2020-02-26 | 2021-09-03 | 차의과학대학교 산학협력단 | 동물 면역계의 인간화 활성을 촉진하는 방법 |
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Class et al. | Patent application title: TRANSGENIC RODENT EXPRESSING TRUNCATED DISC1 Inventors: Sanbing Shen (Aberdeen, GB) Gernot Riedel (Aberdeen, GB) David St. Clair (Aberdeen, GB) Assignees: THE UNIVERSITY COURT OF THE UNIVERSITY OF ABERDEEN WYETH PHARMACEUTICALS INC. TMRI LIMITED |
Legal Events
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E601 | Decision to refuse application |