KR20150014937A - Rna 완전성을 결정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

시료 내 RNA의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 방법으로, 상기 방법은: (i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고; (ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계; 및 (iii) 상기 목적 RNA의 완전성의 정량적 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 시료 내 목적 RNA의 사례들의 총 수를 결정하는 단계를 포함한다.

Description

RNA 완전성을 결정하는 방법{METHOD OF DETERMINING RNA INTEGRITY}
본 발명은 생물학적 시료에서 RNA 완전성을 정량하는 방법에 관한 것이고, 보다 특이적으로는, mRNA 완전성을 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 목적 시료에서 RNA 완전성의 정량을 용이하게 할 뿐 아니라, RNA 분해 정도를 설명하기 위해 mRNA 발현의 정량 결과들을 정정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 mRNA 레벨에서의 변화에 의해 특징화되는 상태들을 진단 또는 모니터링하는 맥락에서와 같이 mRNA 발현 레벨을 보다 정확하게 결정하는 방법을 제공하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 응용들(applications)에 유용하다.
어떠한 선행 공개문헌(또는 이로부터 유래되는 정보), 또는 알려진 어떠한 문제에 대한 명세서 내 레퍼런스는, 상기 선행 공개문헌(또는 이로부터 유래되는 정보) 또는 알려진 문제가 본 명세서와 관계되는 실시(endeavour) 분야에서 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인지 또는 승인 또는 어떠한 형태의 제시가 아니고, 상기 인지 또는 승인 또는 어떠한 형태로서 이해되지 않을 것이다.
유전자 발현 평가의 정확도는 시작 RNA의 양 및 질에 의해 영향받는다. RNA의 순도 및 완전성은 RNA-기반된 분석들의 전체적인 성공을 위해 중요한 엘리먼트들이다. 낮은 품질의 RNA를 가지고 시작하는 경우, 종종 노동-집약적, 시간-소모성 및 많은 비용이 드는 다운스트림 적용의 결과들을 심하게 손상시킬 수 있다. 따라서 분자 생물학적 적용들 뿐 아니라 진단 적용들에서 시작점으로서 고-품질의 온전한 RNA를 이용하는 것이 바람직하다. RNA의 완전성은 정량적 RT-PCR, RNA 시퀀싱, 마이크로-어레이들, 리보뉴클레아제-보호-어세이, 인 시튜 혼성화, 노던 블랏 분석, RNA 맵핑, 인 비트로 번역, cDNA 라이브러리 구축 및 어떠한 종류의 시퀀싱 또는 어레이 적용들 같은 응용들에서 확인되어야 할 것이다. 이러한 쟁점은 신뢰할만한 RNA 정량이 요구되는 독특하거나 또는 제한된 조직 물질(예를 들어, 수술 후 얻어진 조직)을 이용한 임상적 적용들에서 특히 중요하다.
현재까지, 분석 목적들에 사용하는 것이 충분한 품질을 가지는 지를 결정하기 위해 목적 RNA 개체군의 품질을 평가할 수 있도록 개발된 방법들이 있었다. 예를 들어, RNA의 순도를 결정하기 위해, OD260nm/OD280nm 비율은 오직 단백질 또는 페놀 오염물에 대한 정보만을 제공하고 RNA 완전성에 대한 적절하고 완전한 정보를 제공하지 않을 지라도, 상기 OD260nm/OD280nm 비율이 고려될 수 있다. 수십년 동안, RNA의 분해 레벨을 결정하는 유일한 방법은 아가로오스 젤-기반된 전기영동의 사용이었지만, 이러한 방법은 가변적, 부정확, 시간 소모적 및 비용 집약적이다.
RNA 완전성을 평가하기 위한 여러 방법들은 동일한 길이 또는 다른 길이의 다른 RNA 종들의 수, 또는 동일한 RNA 종들의 다른 절편들을 측정하고, RNA 완전성에 관계된 수를 추론하는 것에 기반되고 있다. 가장 좋은 예는 RNA 분자의 3' 및 5' 절편의 증폭으로부터 얻어지는 Cq 값들을 PCR에 의해 측정하고 그렇게 얻어지는 RNA 완전성의 측정치로서 앰플리콘 수들의 비율을 이용하는 3':5' 방법이다.
RNA 품질의 평가를 위한 자동화된 플랫폼들도 이용되고 있다. 현재, 2개의 자동화된 시스템들이 이러한 목적을 위해 이용가능하다: 엑스페리온(Experion)(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), 및 2100 바이오분석기(Bioanalyzer)(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). 양 시스템들은 자동화되고 소형화된 전기영동 시스템에 기반되어 있으며, 상기 시스템은 랩-온-칩 기술에 의해 실현된다. 양 플랫폼들은 리보좀 28S/18S 비율, 또는 RNA 완전성을 나타내는 수치 시스템(numerical system) 중 어느 하나를 이용하여 RNA 품질을 결정한다. 아길런트(Agilent) 기술들은 2100 바이오분석기 내 RIN 알고리즘(RNA 완전성 수)을 제공하며, 바이오-래드는 최근에 RNA 품질 지수(RNA quality index, RQI)를 계산하기 위한 알고리즘을 제공하는 새로운 엑스페리온 소프트웨어 버전을 개발하였다. 상기 RIN 및 RQI는 가장 많이 분해된 RNA 프로파일을 1 및 가장 온전한 RNA 프로파일을 10으로 나타내는 1부터 10까지의 수치 시스템에 기반된다.
하지만, RNA 완전성을 평가하는 상기 방법들 모두는 오직 순서 척도(ordinal scale)로 측정 결과를 제공한다; 비록 상기 방법들이 서로에 대해 또는 외부 표준에 대해 상대적인 다른 시료들의 완전성을 순위 매길 수 있을 지라도, 상기 방법들은 실제 정량적 측정치보다는 오히려 정성적 측정치를 제공한다. 상기 방법들이 제공하는 수치 또는 평가가 시료 내 RNA 완전성이 추가적인 분석을 허용할 정도로 충분한 지 아닌 지를 지시하기에 충분할 수 있지만, 이들의 유용성은 이러한 목적에 크게 제한된다. 요구되는 것은 비율 척도(ratio scale)로 RNA 완전성의 측정을 위한 방법이다; 즉, RNA의 구조에 관계되고, 목적 RNA 분자의 총 수에 대한 정량적 측정을 생산하기 위해 RNA 분해의 측정과 조합된 상기 목적 RNA 분자의 측정들을 가능하게 하는 방법인 진정한 정량적 방법. 현재까지, 이를 달성한 어떠한 방법도 없었다.
본 발명에 이르는 일에 있어서, RNA 시료의 완전성의 정도를 정량화하기 위한 방법이 개발되었다. 보다 특이적으로는, 시료 내 RNA의 완전성은 뉴클레오타이드가 손상되는 가능성의 측면에서 정량된다. 이러한 정량적 정보는 분해의 정도를 위해 정보 그 자체에서 유용하고, 이후에 얻어진 RNA 발현 결과들을 정정하는 데 이용하기 위해서도 유용하다.
따라서 본 발명의 방법은 생물학적 시료에서 RNA 완전성 그 자체를 정량하는 것 및 추가적으로 특이적 목적 RNA 속의 mRNA 발현 레벨들의 정정 및 이에 따른 정확한 정량을 가능하게 하는 것 모두의 측면에서 넓은 범위의 잠재적 적용성들을 가진다. RNA 레벨들, 예컨대 mRNA 레벨들에 대한 변화 분석에 의존하는 진단적 및 예후적 적용들의 측면에서, 본 발명의 방법의 개발은 당업자(one)가 이전에는 이용가능하지 않았던 정확도의 레벨을 달성할 수 있도록 하여 이전에 발생된 RNA 데이터의 유용성과 관련하여 현재까지 존재하는 진단적 및 예후적 한계들을 극복 가능하게 해 준다.
문맥이 특별하게 필요로 하지 않는 한 본 명세서 및 이어지는 청구항 전반에 걸쳐서, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)" 같은 변이형들은 지시된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 함유를 내포하는 것으로 이해될 것이지만, 다른 어떤 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 다른 어떤 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "로부터 유래된(derived from)"은 특정 정수 또는 정수들의 그룹이 명시된 종들로부터 유래하지만 반드시 상기 명시된 소스로부터 직접적으로 얻어지는 것일 필요는 없다는 것을 지시하는 것으로 받아들여질 것이다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "하나(a)", "및(and)" 및 "그(the)"의 단수 형태들은 문맥이 특별히 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상들(referents)을 포함한다.
다르게 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 하나의 양태는 시료 내 RNA 완전성(integrity)의 정량적 측정치(measure)를 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계(relationship)에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 방법은:
(iii) 목적 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편(또는 이의 유도체)의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 방법은:
(iii) 표준 유전자로부터 전사된 목적 유전자로부터 전사된 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 결정된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편(또는 이의 유도체)의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 추가적으로 포함한다.
관계된 양태에서, 목적 RNA를 정량하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계;
(iii) 목적 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 시료 내 mRNA의 완전성의 측정치를 정량하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계를 포함한다.
보다 다른 양태에서 목적 mRNA를 정량하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계.
(iii) 목적 mRNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 mRNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 mRNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 포함한다.
상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 수인 N, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 i 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들인 Ni, 상기 절편들의 길이들인 Li, 및 상기 RNA 분자의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들의 평균 수인 r 간의 관계는:
Figure pct00001
에 의해 제공된다.
상기 선형 관계는:
Figure pct00002
로 나타낼 수 있고; 상기 r의 값은 ln(N i )와 Li 간의 선형 관계의 기울기(gradient)로서 결정된다.
보다 다른 양태에서, 목적 유전자로부터 전사된 RNA를 정량하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계;
(iii) 표준 유전자로부터 전사된 목적 유전자로부터 전사된 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 포함한다.
목적 RNA 분자의 정량은 표준 RNA의 정량에 대해 상대적인 정도로, 상기 표준 RNA의 정량에 대해 상대적인 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 양은:
Figure pct00003
에 의해 제공되며, N 테스트 / N 표준 은 표준 RNA 분자의 양에 대한 목적 RNA 분자(테스트 분자)의 양의 비율이고, S 테스트 / S 표준 은 상기 시료에서 각각 테스트 절편 및 표준 절편의 측정된 양의 비율이며, L 테스트 및 L 표준 은 각각 상기 테스트 및 표준 분해-관련 절편들의 길이이고, r 테스트 및 r 표준 은 상기 RNA 분자들이 포함되어 있는 시료들에서 상기 테스트 RNA 분자 및 표준 RNA 분자들의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들(lesions)의 평균 수 r이다.
보다 다른 양태에서, 시료 내 RNA의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 데 사용하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 하나의 RNA 분자의 표준 정량을 나타내는 RNA 발현 프로파일링 데이터에 접근하는 단계;
(ii) 상기 RNA 분자 각각의 사례들의 완전성에 대한 정량적 측정치를 나타내는 RNA 완전성 데이터에 접근하는 단계;
(iii) 상기 RNA 분자의 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들) 각각의 하나 이상의 길이들을 나타내는 길이 데이터에 접근하는 단계; 및
(iv) 상기 RNA 발현 프로파일링 데이터, 상기 RNA 완전성 데이터 및 상기 길이 데이터를 프로세싱하여 상기 적어도 하나의 RNA 분자의 상기 정량의 정정된 값들을 나타내는 정정된 RNA 발현 프로파일링 데이터를 발생시키는 단계
를 포함한다.
보다 다른 양태에서, 시료 내 RNA의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 데 사용하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하여 상기 정량적 측정치들 및 길이들을 나타내는 어세이 데이터를 발생시키는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 어세이 데이터를 프로세싱하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 나타내는 완전성 데이터를 발생시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 방법은:
(iii) 목적 RNA를 정량하는 단계; 및
(iv) 단계 (ii)에서 결정된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편(또는 이의 유도체)의 길이를 이용하여 상기 정량 결과를 정정하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 RNA는 mRNA이다.
일부 구현예들에서, 각 길이는 일정한 구성요소와 가변적인 구성요소를 가진다. 일부 구현예들에서, 각 길이는 많은 수의 다른 길이들의 통계적 평균이다.
보다 다른 양태에서,
(i) 적어도 하나의 RNA 분자의 표준 정량을 나타내는 RNA 발현 프로파일링 데이터에 접근하고;
(ii) 상기 RNA 분자 각각의 사례들의 완전성에 대한 정량적 측정치를 나타내는 RNA 완전성 데이터에 접근하며;
(iii) 상기 RNA 분자의 상응하는 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들)의 하나 이상의 길이들을 나타내는 길이 데이터에 접근하고;
(iv) 상기 RNA 발현 프로파일링 데이터, 상기 RNA 완전성 데이터 및 상기 길이 데이터를 프로세싱하여 상기 적어도 하나의 RNA 분자의 상기 정량의 정정된 값들을 나타내는 정정된 RNA 발현 프로파일 데이터를 발생시키도록 설정된 하나 이상의 RNA 완전성 구성요소들을 포함하는 RNA 발현 프로파일링 시스템이 제공된다.
일부 구현예들에서, 상기 RNA 완전성 구성요소들은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 사례들을 포함하는 시료를 어세이하여 상기 정량적 측정치들 및 길이들을 나타내는 어세이 데이터를 발생시키는 단계로, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이를 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 나타내는 완전성 데이터를 발생시키기 위한 상기 어세이 데이터를 프로세싱하는 단계를 실행하도록 추가적으로 설정된다.
본 발명은 목적 생물학적 시료 내 RNA 염기가 손상되는 가능성을 결정하는 것에 기반되는 RNA 완전성을 정량하는 방법의 개발에 부분적으로 근거를 둔다. 따라서, 이러한 개발은 처음으로 목적 시료 내 RNA 완전성의 보다 더 정확한 정량 및 추가적으로 상기 동일한 시료로부터 목적 유전자에 대해 판독하는 정량적 RNA 발현 레벨을 분해 정도에 대해 정정하기 위한 이러한 정보를 이용하는 능력을 모두 가능하게 하였다. 이러한 방법의 개발은 보다 정보적이고 정확한 RNA 발현 데이터를 얻을 수 있게 해줘 RNA 발현 정보에 의존하는 진단적, 예후적 및 치료적 적용들의 유용성에 대한 유의한 개선을 수월하게 해 준다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태는 시료 내 RNA 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계를 포함한다.
관계된 양태에서, 목적 RNA를 정량하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계;
(iii) 목적 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 포함한다.
"RNA 분자"의 정량적 측정치를 정량하거나 또는 얻는 것에 대한 언급은 상기 RNA 분자의 정량적 측정치를 직접적으로 정량하거나 또는 얻는 것 또는 상기 RNA 분자의 유도체, 예컨대 cDNA의 정량적 측정치를 정량하거나 또는 얻는 것으로 이해될 것이다.
"상기 시료 내 상기 RNA(said RNA in said sample)"에 대해 얻어진 정량적 측정치가 상기 시료 내 RNA 분자들의 다른 종들에 대해서 동일하다는 것도 이해될 것이다.
상기 대상자 RNA의 "완전성의 측정치(measure of integrity)"에 대한 언급은 RNA 분해의 정도를 결정하는 것에 대한 언급이다. 상기 언급은 이의 보완(complement) 또는 반대(inverse)로서도 표현될 수 있다. 어떠한 하나의 이론 또는 활성 모드로 본 발명을 제한함이 없이, RNA는 이의 DNA 동등물과는 달리 매우 불안정한 분자이다. 시료 내 RNA 품질은 하나의 타입의 시료부터 다음 타입의 시료까지 폭넓게 다양할 수 있고, 열, 방사선, 화합물들 및 조직 리보뉴클레아제들 같은 많은 물리적 및 화학적 인자들에 의해 영향을 받는다. 따라서, RNA는 쉽게 분해될 수 있을 뿐 아니라, 분해 정도가 시료들 간에 크게 다양할 수 있어서 시료들이 동일한 환자로부터 수거될 지라도 시료들 간의 정량적 RNA 발현 데이터를 평가 및/또는 비교하는 것이 용이하지 않다.
"정량적 측정치를 정량하거나 또는 얻는 것(quantifying or obtaining a quantitative measure)"에 대한 언급은 비율 척도를 나타내는 측정치를 얻는 것으로 이해될 것이다. 비율 척도 상의 완전성의 측정치는 RNA 뉴클레오타이드 당 손상들의 수(r)로서 표현될 수 있는데, 이러한 수치는 테스트된 시료에서 RNA의 완전성의 지시인자로서 이용하는 것, 및 목적 개별 유전자와 관계되어 얻어질 수 있는 정량된 RNA 발현 결과들을 정정하는 데 이용하는 것 모두와 관련되어 있다. 완전성의 측정치는 또한 RNA 뉴클레오타이드 당 손상들의 수에 수학적으로 동등한 통계 자료로서 표현될 수 있다. 예를 들어, RNA 서열의 목적 부위가 고려되고 있고 상기 부위의 길이가 알려져 있는 경우, 상기 RNA의 완전성은 온전한 상기 서열의 사례들의 비율로서 표현될 수 있다.
"RNA"에 대한 언급은 리보핵산 또는 이의 유도체 또는 유사체에 대한 언급으로서 이해될 것이다. 이와 관련하여, mRNA, 일차 RNA, rRNA, tRNA, 마이크로RNA(microRNA) 및 이와 유사한 것을 포함하는 모든 형태의 RNA를 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 RNA는 천연(naturally occurring) 기원(예컨대, 환자로부터 수거된 생물학적 시료로부터 유래되는 것)이거나, 재조합적으로 생산된 기원(예컨대, 인 비트로 배양 시료로부터 수거된 시료)이거나, 또는 합성적으로 생산되는 기원을 포함하는 어떠한 기원에 속할 수 있다.
"유도체들(derivatives)"에 대한 언급은 천연, 합성 또는 재조합 소스들로부터 유래된 상기 RNA의 단편들, 상동체들 또는 오솔로그들(orthologs)에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 상기 RNA 서열들의 유도체들은 다른 단백질성 또는 비-단백질성 분자들과 융합되는 RNA 분자의 특정 부위들을 가지는 단편들을 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 "유사체들(analogues)"은 화학적 구조 또는 전체적인 형태에 대한 변형들 같은 뉴클레오타이드 또는 핵산 분자에 대한 변형을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이것은, 예를 들어 신규한 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기들의 삽입, 또는 백본 형성 또는 상보적 염기쌍 혼성화의 레벨 같은 뉴클레오타이드들 또는 핵산 분자들이 다른 뉴클레오타이드들 또는 핵산 분자들과의 상호작용하는 방식으로의 변형을 포함한다. 뉴클레오타이드 또는 핵산 분자들의 바이오틴화 또는 다른 형태의 표지는 본 명세서에 정의되는 대로 "유도체"의 예이다. 본 명세서에 기재된 유도체들 및 유사체들은 환자로부터 수득된 생물학적 시료들에서 관찰되지 않을 것 같지만, 완전성의 정도에 대해 테스트되는 재조합 또는 합성적으로 제조된 인 비트로 시료들에서는 빈번하게 발견될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 RNA의 "유도체"는 또한 상기 RNA의 cDNA를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
하나의 구현예에서, 상기 RNA는 mRNA이다.
이러한 구현예에 따르면, 시료 내 mRNA의 완전성의 측정치를 정량하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계를 포함한다.
관계된 구현예에서 목적 mRNA를 정량하는 방법이 제공되고, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 mRNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계; 및
(iii) 목적 mRNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 mRNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 mRNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 포함한다.
보다 다른 구현예에서, 당업자(one)는 목적 유전자의 일차 RNA 전사체들을 분석하기 위해 선택할 수 있다.
상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치는 상기 RNA 분자의 사례들의 뉴클레오타이드 당 손상들의 평균 수를 나타낼 수 있다.
상기 관계는 상기 절편들의 다른 길이들과 각각 결정된 정량적 측정치들의 대수 간의 선형 관계로서 제시될 수 있으며, 상기 완전성의 정량적 측정치는 상기 선형 관계의 기울기로부터 결정된다. 상기 기울기는 회귀(regression)에 의해 결정될 수 있다.
RNA 내 손상들이 독립적인 임의적 이벤트들의 분포가 포아송 통계학(Poisson statistics)을 이용하여 정확하게 제시될 수 있는 독립적인 임의적 이벤트들의 결과로서 임의적으로 분포된다는 것을 고려할 때, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 수인 N, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 수인 많은 수의 절편들 i 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들인 Ni, 상기 절편들의 길이들인 Li, 및 상기 RNA 분자의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들의 평균 수인 r 간의 관계는:
Figure pct00004
에 의해 제공된다.
따라서, 양 사이드의 자연적 대수를 이용하여, 상기 선형 관계는:
Figure pct00005
에 의해 제시될 수 있고, 상기 r의 값은 ln(Ni)와 Li 간의 선형 관계의 기울기로서 결정된다.
RNA 또는 이의 DNA 유도체의 "분해-관련 절편(degradation-relevant segment)"에 대한 언급은 RNA 또는 DNA 분자의 부위, 상기 RNA 또는 DNA 분자의 부위 내 어떠한 염기의 손상이 목적 RNA의 정량에 영향을 미칠 것이고, 상기 RNA 또는 DNA 분자의 부위가 없는(즉, 상기 부위 바깥쪽의) 어떠한 염기의 손상이 상기 정량에 영향을 미치지 않을 것인 특성으로 정의되는 RNA 또는 DNA 분자의 부위에 대한 언급으로서 이해될 것이다. 시료 내 RNA가 정량에 선행하는 캡쳐 또는 cDNA 형성 같은 많은 수의 프로세스들을 거칠 수 있고, 분해성 손상들이 그러한 프로세스들의 효율에 영향을 미쳐 정량의 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 최종 정량 과정의 방법에서 이용되는 상기 서열에 "상응하는" RNA의 부위가 이전에 본 명세서에서 정의되는 대로 상기 절편의 전체에 해당하지 않을 수 있다는 것이 이해될 것이다.
절편의 "길이"에 대한 언급은 그러한 절편을 포함하는 뉴클레오타이드들의 수에 대한 언급으로서 이해될 것이고, 상기 상징 "L"에 대한 언급은 상기 분해-관련 절편의 길이에 대한 언급으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 이전에 정의된 대로 "분해-관련" 절편은 이용될 수 있는 정량의 다른 방법들과 관련하여 도 1에 예시되어 있으며, 상기 방법들은 최종 단계의 측정 전에 다양한 프로세싱 기술들을 포함한다. 상기 상징 "L"은 상기 절편에서 염기들의 수를 의미하고, 도에서 수평 선들은 상기 절편의 정도를 예시한다. 또한 상기 도는 최종 정량 방법에서 이용되는 RNA 또는 이의 유도체의 부위를 예시하며, 이러한 부위가 본 명세서에 이전에 정의되는 절편과 어느 정도 상이하다는 것이 명백하다.
"RNA 분자의 사례들의 뉴클레오타이드 당 손상들의 평균 수 r(the mean number r of lesions per nucleotide of the instances of the RNA molecule)"에 대한 언급은 시료 수득 시에 RNA에 이미 존재하는 손상들, 및 RNA 추출, 이동(transport), 저장, 및 측정의 프로세스 동안 발생되는 손상들(간결하게는 프로세싱 손상들로서 언급됨) 모두를 의미하는 것으로 이해될 것이다. RNA는 DNA와 비교하여 상대적으로 불안정하기 때문에, 프로세싱 손상들은 RNA 어세이의 결과에 영향을 미치는 손상들의 유의한 비율을 포함할 것이다. RNA의 cDNA로의 역전사를 포함하는 측정 어세이들에 있어서, 프로세싱 손상들은 역전사효소의 리보뉴클레아제 활성에 의해 생산되는 손상들을 포함하지만, cDNA 불안정성으로부터 초래되는 손상들은 효과적으로 결여된다. 뉴클레오타이드 당 이미 존재하는 손상들의 수가 r a 이고 프로세싱 동안 발생된 뉴클레오타이드 당 손상들의 수가 r p 인 경우,
Figure pct00006
이고, r = r a + r p 이다.
본 명세서에서 이전에 상세히 기재된 대로, 본 발명의 방법은 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA의 많은 수의 다른 길이들을 어세이하는 것에 기반되어 온전한 RNA의 양을 결정하는 것으로 서술된다. 이와 관련하여, 대상체(subject) RNA는 직접적으로 어세이되거나, 또는 이러한 RNA의 cDNA 버전이 먼저 제조되어 목적 RNA에 대해 동등물인 상기 cDNA를 이용하여 모든 이후 어세이들이 실시될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에서 많은 수의 절편들을 "어세이하는 것(assaying)"에 대한 언급은 RNA를 직접적으로 어세이하는 것 또는 상기 RNA의 cDNA 카피를 어세이하는 것 모두를 포괄하는 것으로 이해될 것이다.
완전성의 측정치는 목적 시료에 존재하는 레퍼런스 유전자의 맥락에서 결정된다. 따라서, 구 "레퍼런스 유전자(reference gene)"는 완전성을 측정하는 목적을 위해 이용되고 다른 유전자들의 RNA의 완전성을 결정하는 데 적용될 수 있는 결과들에 이용되는 유전자 또는 유전자 부위를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 보다 특이적으로는, 상기 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA는 많은 수의 절편들을 정량하여 완전성을 측정하는 데 이용된다. 이를 위해, 상기 레퍼런스 유전자는 전사를 거치는 DNA 분자로서 이해될 것이다. 상기 전사 산물은 단백질 산물로의 번역을 거치거나 또는 거치지 않을 수도 있다. 모든 RNA 분자들이 단백질로 반드시 전사될 필요는 없다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명이 어떠한 타입의 RNA 분자의 완전성을 정량하는 것에만 관계되기 때문에 상기 RNA 분자가 단백질로의 번역을 거치는 RNA 분자인 지 아닌 지는 레퍼런스 유전자 또는 심지어 목적 유전자를 선택하는 측면과 무관하다. 일부 유전자들은 RNA 전사 산물을 생산하지만 단백질 번역 산물을 생산하지 않는 것으로 알려져 있다. 염색체성 DNA의 측면에서, 유전자는 인트론 및 엑손 부위들 모두를 포함할 수 있다. 하지만, 목적 DNA가 벡터 DNA인 경우 일어날 것 같은 목적 DNA가 cDNA인 경우에는, 인트론 부위들이 존재하지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고 그러한 DNA는 5' 또는 3' 비번역된 부위들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "유전자"에 대한 언급은, 예를 들어 게놈 DNA 및 cDNA를 포함하는 어떠한 형태의 DNA를 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 상기 대상체 "유전자"는 게놈 DNA의 두 개의 부위들 간의 또는 게놈 DNA의 하나의 부위와 바이러스 또는 도입된 서열 같은 외래 DNA의 부위 간의 재조합에 의해 생산되는 게놈 DNA의 어떠한 부위일 수도 있다. 상기 대상체 "유전자"는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적 또는 재조합적으로 발생되는 핵산 분자의 부위일 수 있다.
많은 수의 레퍼런스 유전자들이 이용될 수 있으며, 상기 정량된 모든 절편들로부터 얻어지는 정량 결과들 모두를 고려하여 완전성의 많은 수의 측정치들이 얻어지거나, 또는 완전성의 단일 측정치가 얻어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 하지만, 가장 간단한 접근방법은 하나의 레퍼런스 유전자를 이용하고 완전성의 하나의 측정치를 얻는 것이라는 것도 이해될 것이다.
어떠한 방식에서 본 발명을 제한함이 없이, 유전자가 전사를 거치는 유전자라면 어떠한 유전자가 레퍼런스 유전자로서 이용되기 위해 선택될 수 있다.
유전자는 조직에서 고-발현되는 유전자인 것이 선호되는데, 이는 이러한 유전자가 상기 방법의 민감성을 증가시키기 때문이다. 레퍼런스 유전자로서 사용되기에 적합한 유전자들의 예는 GAPDH, 베타-액틴, HPRT 및 β2 마이크로글로불린을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 레퍼런스 유전자의 RNA 전사체로부터 유래된 cDNA는 임의적 프라이밍, 폴리dT 프라이밍 또는 유전자-특이적 프라이밍 중 어느 하나에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 어세이하는 것은 전결정된 역치까지 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 서열의 cDNA 유도체의 주기적(cyclic) 증폭을 포함하고, 상기 시료에서 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정은 상기 절편들의 길이들 Li와 상기 전결정된 역치에 도달하는 데 필요한 증폭 사이클들의 각 숫자들 Cq i 간의 관계로부터 결정된다.
이러한 구현예의 맥락에서, 상기 관계는 상기 절편들의 다른 길이들과 상기 전결정된 역치에 도달하는 데 필요한 증폭 사이클들의 각각의 수들(Cq i ) 간의 선형 관계로서 제시될 수 있으며, 상기 완전성의 정량적 측정치는 상기 선형 관계의 기울기로부터 결정된다. 상기 기울기는 회귀에 의해 결정될 수 있다.
이러한 구현예에서 선형 관계는:
Cqi = 상수( constant ) + L i .r/ln( a i )
로서 제시될 수 있다.
상기 a i 는 i th 절편의 사이클 당 증폭 효율이다. 상기 a i 값은 상기 레퍼런스 RNA의 각 절편에 대해 결정될 수 있지만, 실제로 모든 a i 값이 알려져 있는 동일한 값을 가지도록 효과적인 증폭 시스템을 실행하는 것이 선호되고, 이에 따라 상기 관계는:
Cq i = 상수 + L i .r/ ln (a)
로 된다.
상기 방법은 상기 시료 내 RNA 분자의 사례들에 대한 완전성의 정량적 측정치, 상기 RNA 분자의 선택된 절편의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수의 정량적 측정치, 및 상기 선택된 절편의 길이에 기반되어 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 상대적 또는 절대적 수의 정량적 측정치를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 상대적 또는 절대적 수의 정량적 측정치 N은:
Figure pct00007
에 의해 제공될 수 있으며, 상기 N i 는 상기 RNA 분자에 대한 길이 L의 온전한 절편의 사례들의 수이다.
본 명세서에서 이전에 기재된 대로, 본 발명자들이 RNA 완전성을 정확하게 정량하는 방법을 개발하였다는 사실 외에도, 이러한 결정은 실제적으로 당업자(one)가 목적 유전자의 정량적 RNA 분석의 결과들을 조정하고 테스트되었던 상기 시료에 존재하는 RNA 분해의 정도를 설명하기 위한 정정으로서도 이러한 결과를 이용할 수 있게 해 준다. 이에 따라, 이러한 것은 당업자(one)가 보다 더 정확한 결과들을 얻을 수 있게 해 준다.
이를 위해, "목적 RNA 분자(RNA molecule of interest)"에 대한 언급은 DNA 분자로부터 전사되는 어떠한 RNA 분자 또는 예컨대, 그 자체로 정체성(즉, 단백질 산물에 대한 템플레이트로서만이 아닌)을 가지는 RNA 분자들, 예컨대, 마이크로RNA, tRNA, rRNA, siRNA, shRNA 및 이와 유사한 것 같은 어떠한 RNA 분자에 대한 레퍼런스로서 이해될 것이다. 따라서, 상기 목적 RNA 분자는 단백질 산물로도 번역되는 RNA 분자일 수 있거나 또는 RNA 분자가 아닐 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 대상체 RNA는 목적 유전자로부터 전사된 RNA이다.
이러한 구현예에 따라, 목적 유전자로부터 전사된 RNA를 정량하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계;
(iii) 목적 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 RNA는 mRNA이다.
어떠한 하나의 이론 또는 활성 모드로 본 발명을 제한함이 없이, 본 명세서에 기재된 본 발명에 따라 "정량하는(quantifying)", "정량(quantification)" 또는 "정량(quantitation)"은 절대적 정량 또는 상대적 정량 중 어느 하나에 대한 언급이다. 절대적 정량은 RNA 전사체 카피들의 절대적 수를 얻는 것을 의미하는 반면에, 상대적 정량은 "표준 유전자"로부터 전사된 RNA 레벨 또는 "RNA 표준" 레벨과 비교되어 정량된 목적 RNA 레벨을 의미한다. 상술한 두 용어들은 반드시 상반되지 않다.
일반적으로 목적 RNA의 정량은 두 단계를 포함한다:
1. 하나의 측정치는 시료에서 목적 RNA 전사체들의 절대적 수를 얻는 것이다;
1.1 상기 측정치가 고-속(high-throughput) RNA 시퀀싱 같은 직접적 방법 또는 목적 RNA 전사체의 길이 L의 온전한 절편의 사례들의 수(S테스트)를 직접적으로 결정하는 디지털 PCR에 의해 얻어지는 경우, 목적 RNA 전사체의 사례들의 수(N 테스트 )는:
N 테스트 = S 테스트 . e + Lr
에 의해 제공되고, r은 상기 테스트 시료에서 RNA의 완전성의 측정치이다.
1.2 상기 측정치가 별개의 시료에 포함된 알려진 양의 외부 RNA 표준(N 표준 )을 포함하는 상대적 정량을 이용하여 간접적으로 얻어지는 경우, 목적 RNA 전사체의 사례들의 수(N 테스트 )는
Figure pct00008

에 의해 제공되며, 상기 첨자들 "테스트(test)" 및 "표준(stan)"은 각각 테스트 RNA 및 표준 RNA에 대한 길이(L) 및 완전성(r)의 측정치를 의미한다. 질량이 알려진 외부 RNA 표준의 이용 예는 만성 골수성 백혈병에서 BCR-ABL 전사체들의 정량이다. 측정치는 테스트 시료 및 외부 RNA 표준 시료 모두에서 BCR 같은 다른 유전자들에 대해 얻어진다. 이것은 테스트 시료 내 BCR 전사체들의 절대적인 수의 결정을 가능하게 하여 상기 시료의 적합성에 대한 측정치 및 가능한 검출 레벨을 결정할 수 있게 해 준다.
외부 표준이 목적 유전자의 RNA 발현 레벨의 정량을 가능하게 하는 목적으로 이용된다면, 평가될 외부 시료의 RNA 완전성 뿐 아니라 목적 유전자의 전사 레벨이 분석되는 시료의 RNA 완전성에 대해 필요할 것이라는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 방식에서, 상기 표준 및 목적 유전자의 정량 결과 모두가 각 개별 시료의 RNA 분해의 정도를 반영하도록 정정될 수 있다. 때때로, 상기 외부 표준이 상기 테스트 시료에 첨가되어 목적 RNA와 함께 프로세싱되지만, 이의 완전성은 여전히 개별적으로 측정되어야만 한다.
실제로, DNA의 보다 나은 안정성으로 인해, 상기 "RNA" 표준은 목적 RNA의 부위로서 동일한 서열을 가지는 DNA 표준, 예를 들어 플라스미드 내 인서트(insert)의 형태로 대부분 빈번하게 대체된다. 이론적으로, DNA의 완전성이 평가될 것이지만, 실제적으로 상기 DNA는 보통 손상되지 않은 것으로 간주되는데, 다시 말하면, r 표준 의 값이 제로로 취해진다. 그러한 경우:
Figure pct00009

1.3 상기 측정치가 외부 표준을 이용하지 않고 간접적으로 얻어지고 모든 유전자들에 대한 상기 측정치(S테스트)가 동일하지만 목적 RNA의 온전한 절편의 사례들의 수에 대해 알려지지 않은 관계를 가진다고 가정하는 경우, 목적 RNA 전사체의 사례들의 수(N 테스트 )는:
Figure pct00010

에 의해 제공되며, k는 모든 유전자들에 대해 알려져 있지 않지만 동일한 값을 가지는 상수이고, L은 상기 절편의 길이이다. 어떠한 하나의 유전자에 대한 N 값이 알려져 있지 않을 지라도, 상수 k가 상쇄되고
Figure pct00011

이기 때문에 어떠한 2개의 유전자들(첨자 1 및 2)에 대한 전사체들의 수의 비율을 알 수 있다.
2. 상대적 정량을 실시함에 따라, 상기 1.1, 1.2, 또는 1.3에서 이전에 얻어진 시료 내 목적 RNA 전사체들의 절대적 수에 대한 측정치는 유사하게 얻어진 동일한 시료 내 내부 표준 RNA의 RNA 전사체들의 절대적 수에 대한 측정치에 대해 상대적으로 표현된다. 상대적 정량에 대한 이러한 과정은 때때로 표준화(normalisation)로서 언급된다. 시료 내 목적 RNA의 사례들의 절대적 수를 상기 시료의 기원인 조직에서 목적 RNA의 사례들의 절대적 수와 관계시키는 어려움을 극복하는 것이 하나의 시도로서 실시된다. 이러한 어려움은 RNA의 회수에서의 변이성들, 인 비트로 RNA 분해의 결과로서 생리학적 또는 병리학적 변화들에 대한 반응으로 기원 조직에서 일어날 수 있는 RNA 레벨에서의 폭넓은 변동들(fluctuations), 또는 정량이 상기 1c에서처럼 실시되었던 경우 개별 유전자에 대한 실제 값의 부재로부터 기인한다.
상대적 정량 또는 표준화는 종종 내부 표준에 대해 상대적인 목적 RNA의 발현에서의 배수 차이(fold difference)로 표현된다. RNA 발현 프로파일들이 제조되는 것과 같이 하나 이상의 목적 유전자가 주어진 시료 내에서 분석의 대상일 수 있고 상술한 개별 유전자 결과들 각각이 하나의 표준 결과에 대해 상대적으로 평가될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 발명의 이러한 양태의 방법도 또한 목적 유전자에 대해 얻어진 결과들을 정정하기 위해 상기 레퍼런스 유전자에 대해 계산된 완전성의 측정치를 이용하는 것에 근거를 두고 있다. 목적 유전자로부터 전사된 RNA의 정량이 표준 유전자의 전사 레벨에 대해 상대적으로 평가되기 때문에, 상기 정정은 상기 목적 유전자와 표준 유전자 모두에 대해 얻어진 결과들에 효과적으로 적용된다는 것이 이해될 것이다. 일반적으로, RNA 완전성을 결정하는 데 이용되는 상기 표준 유전자 및 레퍼런스 유전자는 2개의 개별 유전자들일 것이다. 하지만, 당업자(one)는 상기 표준 및 레퍼런스 모두에 대해 동일한 RNA 종을 이용할 수 있다는 것이 인지가능하다.
상기 섹션 1.1, 1.2, 및 1.3의 각 경우에서, 시료 내 목적 RNA의 양은
Figure pct00012

형태의 관계에 의해 제공된다.
시료 내 내부 표준 RNA 분자의 양에 대해 상대적인 시료 내 목적 RNA 분자의 양은,
Figure pct00013

에 의해 제공되며, N 테스트 / N 표준 은 표준 RNA 분자의 양에 대한 목적 RNA 분자(테스트 분자)의 양의 비율이고, S 테스트 / S 표준 은 상기 시료에서 각각 테스트 절편 및 표준 절편의 측정된 양의 비율이며, L 테스트 및 L 표준 은 각각 상기 테스트 및 표준 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들)의 길이이고, r 테스트 및 r 표준 은 상기 시료에서 상기 테스트 RNA 분자 및 표준 RNA 분자들의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들(lesions)의 평균 수 r이다.
"정정하는(correcting)"에 대한 언급은 온전한 RNA 분자의 사례들의 수를 상기 RNA 분자의 사례들의 총 수의 절대적 또는 상대적 측정으로 전환시키기 위해 RNA 완전성의 측정치의 이용에 대한 언급으로서 의도된다. 상기 RNA 분자의 사례들의 총 수의 절대적 또는 상대적 측정이 상기 RNA 분자의 절편의 사례들의 총 수의 절대적 또는 상대적 측정과 동일하다는 것이 이해될 것이다.
이를 위해, "표준 유전자"로부터 전사된 RNA 또는 "RNA 표준"에 대한 언급은 목적 RNA 레벨이 관계되고 정량에 이용되는 상기 전사된 유전자에 대한 언급으로서 의도된다. 목적 유전자의 RNA 또는 cDNA의 일부(portion)가 정량을 위해 직접적으로 이용되는 것처럼, 일부 정량의 환경 하에서 RNA 표준은 동일한 서열을 가지는 DNA 표준에 의해 대체될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 어떠한 하나의 이론 또는 활성 모드로 본 발명을 제한함이 없이, 상기 표준으로서 사용되기에 적합한 유전자들은 좋게는 높은 레벨에서 발현된다. 보다 더 좋게는, 발현의 레벨은 시료의 기원의 조직에 의해 영향을 받지 않는다. 하지만, 당업자에 의해 알려진 대로 상술한 기준들 모두를 갖춘 소수의 유전자들이 있다. 이를 위해, 택일적 접근방법은 표준 유전자들의 패널을 분석하는 것이다. 일반적으로, 상기 표준 유전자 및 레퍼런스 유전자는 2개의 별개의 유전자들일 것이다. 하지만, 당업자(one)는 상기 표준 및 레퍼런스 모두에 대해 동일한 RNA 종을 이용할 수 있다는 것이 인지가능하다.
"시료(sample)"에 대한 언급은 생물학적 시료 또는 비-생물학적 시료 중 어느 하나에 대한 언급으로서 이해될 것이다. 비-생물학적 시료의 예들은, 예를 들어 합성적으로 생산된 핵산 개체군들의 핵산 산물들을 포함한다. "생물학적 시료(biological sample)"에 대한 언급은 동물, 식물 또는 미생물(미생물 배양물을 포함함)로부터 유래된 생물학적 물질의 어떠한 시료, 예컨대 세포내 물질, 혈액, 점액, 대변, 소변, 조직 생검 표본들, 동물의 신체 내로 도입되었고 이후에 제거된 유체(예컨대, 폐 세척에 따라 폐로부터 추출된 염 용액 또는 관장 세척으로부터 수거된 용액 같은), 씨앗 또는 꽃 같은 식물 물질 또는 식물 번식 물질 또는 미생물 콜로니를 포함하지만 이에 한정되지 않는 생물학적 물질의 어떠한 시료에 대한 언급으로 이해될 것이다. 본 발명의 방법에 따라 테스트된 생물학적 시료는 직접적으로 테스트될 수 있거나 또는 테스팅 전에 처리의 어떤 형태를 요구할 수 있다. 예를 들어, 생검 시료는 테스팅 전에 균질화(homogenisation)를 필요로 할 수 있거나 또는 인 시튜 테스팅(in situ testing)을 위한 절편화(sectioning)를 필요로 할 수 있다. 나아가, 상기 생물학적 시료가 액체 형태가 아닌 정도에 따라(그러한 형태가 테스팅을 위해 요구되는 경우), 상기 시료를 준비하기 위해 완충액 같은 시약의 첨가를 필요로 할 수 있다.
타겟 RNA가 시료 내에 존재하는 정도에 따라, 상기 시료는 직접적으로 테스팅될 수 있거나, 또는 다르게는 상기 시료에 존재하는 핵산 물질의 전부 또는 일부가 테스팅 전에 분리될 수 있다. 상기 타겟 핵산 분자가 테스팅 전에 전-처리되는 것, 예를 들어 살아 있는 바이러스의 불활성화 또는 젤 상에서 영동(run)시키는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 또한 상기 시료가 신선하게 수득될 수 있거나, 또는 테스팅 전에 저장(예컨대, 동결에 의한 저장)될 수 있거나, 또는 테스팅 전에 다르게 처리되는 것(예컨대, 배양을 실시하는 것)이 이해될 것이다.
본 명세서에 개시되는 방법에 따라 테스팅되기에 무슨 타입의 시료가 가장 적합할 수 있는 지의 선택은 모니터링될 상태의 특성 같은 상황(situation)의 특성에 따라 의존적일 것이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 종양 상태(neoplastic condition)가 분석의 대상(subject)이다. 상기 종양 상태가 백혈병인 경우, 혈액 시료, 림프액 시료 또는 골수 흡인물(aspirate)이 적합한 테스팅 시료를 제공할 것이다. 상기 종양 상태가 림프종이라면, 림프절 생검 또는 혈액 또는 골수(marrow) 시료가 테스팅을 위해 조직의 적합한 소스를 제공할 것이다. 또한 실험자(one)가 종양 세포의 원래 소스를 모니터링하는 지, 또는 전이의 존재 또는 다른 형태의 상기 기원 포인트로부터 상기 종양(neoplasia)의 전파가 모니터링되는 지에 대한 고려가 요구될 것이다. 이러한 점에서, 어떠한 하나의 포유동물로부터 유래되는 많은 다른 시료들을 수거하고 테스팅하는 것이 바람직할 것이다. 어떠한 주어진 검출 시나리오를 위해 적합한 시료를 선택하는 것은 당업자의 기술 내에 속할 것이다.
본 명세서에서 이용되는 정도에 따라 상기 용어 "포유동물(mammal)"은 인간, 영장류, 가축류 동물들(예컨대, 말, 소, 양, 돼지, 당나귀), 실험실 테스트 동물들(예컨대, 마우스, 랫트, 래빗, 기니아 피그), 반려동물들(예컨대, 개, 고양이) 및 사로잡힌 야생 동물들(예컨대, 캥거루, 사슴, 여우)을 포함한다. 좋게는, 상기 포유동물은 인간 또는 실험실 테스트 동물이다. 보다 더 좋게는, 상기 포유동물은 인간이다.
본 발명은 현재의 방법들과 비교되는 경우 여러 장점들을 가진다. 정성적이기만 한 후자와 달리, 본 발명의 방법은 정량적이어서 시료 내 목적 RNA 분자들의 총 수가 정량되는 것을 가능하게 하고, 도 3에서 볼 수 있듯이 폭넓은 범위의 분해를 포괄한다. 매우 적은 양의 RNA만이 요구되는 것처럼 본 발명의 방법은 매우 민감하다. 민감성에 대한 데이터는 실시예 1에 제시된다.
본 발명의 다른 장점은 본 발명이 시료의 RNA 완전성의 정량적 측정치를 결정하기 위한 방법 및 이후에 증폭 프로토콜을 반드시 이용할 필요없이 목적 유전자의 RNA 발현 레벨들을 정확하게 정량하기 위한 벙법 모두를 제공한다는 것이다. 많은 RNA 분석 프로토콜들은 PCR 증폭에 기반될 지라도, 사실 RNA는 핵산 증폭을 포함하지 않는 다수의 방법들에 의해 정량될 수 있다. 본 발명의 방법은 어떠한 RNA 분석 프로토콜에 성공적으로 조정되어 분해에 대해 정정될 RNA의 상대적 또는 절대적 정량을 가능하게 한다는 사실은 이전에 이용가능하지 않았던 탁월하게 진보된 단계(step forward)이다. 어떠한 방식에서 본 발명을 제한함이 없이, RNA 절편의 '분해-관련(degradation-relevant)'에서의 변이성 또는 RNA 절편의 '중요한(critical)' 길이(L 값의), 결과에 영향을 미칠 RNA 절편의 분해는 혼성화가 RNA 가닥을 따라 하나의 포인트에서 일어나고 정량이 상기 RNA 가닥을 따라 가변적 거리의 다른 포인트를 포함하는 어떠한 방법, 예컨대 하기 기재된 방법들을 포함하는 방법에서 발견될 것이다.
1. 마이크로-어레이들
DNA 프로브들이 고체 표면에 스팟팅되고 형광적으로-표지된 RNA가 접촉된다. 이론적으로는, 분해는 마이크로-어레이, 레퍼런스 유전자를 따라 2개 이상의 서열에 상응하는 스팟들에서 형광을 정량하는 것에 의해 전체적으로 측정될 수 있지만, 이것은 매우 번거롭고 모호하다. 거의 확실하게, 분해는 최종적인 마이크로-어레이 연구 전에 독립적인 기술에 의해 정량될 것이다. 목적 RNA 및 내부 표준의 정량 상에 분해의 상대적 효과가 분해의 측정 방법 및 RNA가 분리 및 혼성화되는 방법 모두에 의해 결정될 것이다. 두 개의 RNA 종 각각에 대해 상기 RNA가 폴리T 캡쳐에 의해 분리되는 경우 상기 폴리A 서열과 프로브가 혼성화되는 서열 간의 거리가 정량에 영향을 미칠 것이다. RNA가 임의적 프라이밍에 의해 cDNA로 전환되는 경우, 상기 2개의 혼성화 서열들의 상대적 길이들이 정량의 길이에 영향을 미칠 것이다.
2. 나노스트링( Nanostrings )
각 RNA 종은 유전자-특이적 캡쳐 프로브에 의해 캡쳐되고, 형광적으로-표지된 리포터 프로브와 혼성화되며, 전기영동된다. 이론적으로, 분해는 여러 리포터 프로브들을 이용하여 이러한 기술에 의해 정량될 수 있고, 상기 리포터 프로브들 각각은 레퍼런스 RNA의 다른 서열과 혼성화한다. 하지만, 실제적으로 결정적인 나노스트링 연구 전에 독립적인 방법에 의해 분해를 결정하는 것이 보다 더 단순할 것이다. 목적 RNA 및 내부 표준의 정량 상에 분해의 상대적 효과는 분해의 측정치에 의해, 그리고 상기 캡쳐 프로브 및 상기 리포터 프로브에 대한 혼성화 서열을 각각 포함하는 상기 목적 RNA 및 상기 표준 RNA 각각에 대해 상기 혼성화 서열 사이에 존재하는 RNA의 길이에 의해 결정될 것이다.
3. SAGE
이러한 기술의 다수의 변이형들이 있다. RNA가 폴리T에 의해 캡쳐된 후 제한 효소에 의해 절단된다. 이후에 복잡한 조작의 순서들에 따라 상기 효소 절단 위치 다음의 서열이 시퀀싱에 의해 동정되는 최종 결과가 나온다. 정량은 이러한 서열이 분명한 횟수의 수치에 기반된다.
실제적으로, 레퍼런스 유전자의 연구에 의한 분해의 정량은 SAGE에 의해 실용적이지 않고 독립적인 기술이 요구된다. 목적 RNA와 내부 표준의 정량 상에 분해의 상대적 효과는 분해의 측정치에 의해, 그리고 상기 목적 RNA 및 표준 RNA 각각에 대해 상기 폴리A 서열과 제한 효소 절단 서열 간 및 이를 포함하는 RNA의 길이에 의해 결정될 것이다.
4. RNA 시퀀싱
수많은 수의 판독들(reads)이 얻어질 수 있는 고속 RNA 시퀀싱이 RNA 정량을 위해 점점 더 많이 이용되고 있다. 최종 정량은 온전한 RNA 및 분해된 RNA 모두를 인지하고, 외부 표준의 필요성 없이 절대적 수치를 제공한다. 하지만, 시퀀싱에 의한 정량까지 이르는 준비 조작은 분해에 의해 영향받는 폴리T 캡쳐에 의한 양성 선택 같은 길이-의존성 과정을 포함하는 경우, 분해는 다수의 RNA 분자들의 다수의 절편들에 대한 판독들의 수를 정량하거나, 또는 독립적 방법 및 레퍼런스 유전자를 포함하는 방법을 이용하는 것 중 어느 하나에 의해 측정될 필요가 있을 것이다.
5. 핵산 증폭(예컨대, qPCR)
분해의 정도는 레퍼런스 유전자에 대한 qPCR에 의해 단순하고 간편하게 측정되거나, 다른 길이의 두 개 이상의 앰플리콘들을 증폭시키거나 또는 RNA가 폴리T에 의해 캡쳐되는 경우 두 개 이상의 분리된 앰플리콘들을 증폭시키는 것 중 어느 하나에 의해 단순하고 간편하게 측정된다.
목적 RNA 및 내부 표준의 정량 상에 분해의 상대적 효과는 분해의 측정치 및 목적 RNA 및 표준 RNA 각각에 대해 cDNA가 생산되었던 방법에 의존하는 분해-관련 절편들의 길이 모두에 의해 결정될 것이다.
포아송 통계학( Poisson Statistics )
RNA에 대한 손상은 RNA 분자에 대한 훼손으로 정의되고 다운스트림 정량에 의해 그 분자의 검출을 방해하는 손상(lesion)을 이용하여 염기 당 손상들의 평균 수의 측면에서 정량될 수 있다. 기본 가정은 병소들이 임의적이고 독립적으로 일어난다는 것이다. 이러한 가정은 가수분해성, 인산화성 또는 열동력학적 절단, 또는 부가물(adduct)의 임의적 생산에 의해 RNA에 손상을 주는 외부 물리적 또는 화학적 제제들을 고려하는 경우 의심의 여지가 없는 것처럼 보인다. 하지만 RNA는 엔도-리보뉴클레아제들 또는 엑소리보뉴클레아제들 중 어느 하나인 많은 수의 리보뉴클레아제들의 활성에 의해 분해될 수도 있다. 엔도리보뉴클레아제들은 일부 염기 또는 서열 특이성을 보일 수 있다. 그러나, 총 RNA 가닥과 관련하여, 염기들 및/또는 짧은 서열들이 임의적으로 발생하니, 그러한 효소 활성도 임의적으로 간주될 수 있다. 엑소리보뉴클레아제들의 임의성(randomness) 또는 비-임의성은 많은 효소들 및 다양한 기작들이 있기 때문에 평가하기 어렵다. 하지만, 대부분의 엑소리보뉴클레아제들 및 대부분의 RNA 서열들에 있어서, 효소에 의해 분해되는 RNA 가닥은 완전히 분해되며, 본 발명자들은 이것이 비-임의적 양상으로 일어나는 확정적인 어떠한 증거도 확인하지 못 했다. 상기 고려들의 측면에서, 본 발명자들은 가장 많은 부분의 RNA 분해가 임의적으로 일어나는 것으로 간주한다.
정량만이 RNA 분자의 절편에 대한 연구를 포함하기 때문에, 손상되는 손상이 이러한 결정적인 절편 내 염기에 영향을 미치는 경우에 상기 손상은 또한 정량에 영향을 미칠 것이다. 이러한 결정적인 절편의 특성 및 L로 명명되는 수인 포함하는 염기들의 수가 RNA 분리 및 정량에 이용되는 기술에 의해 결정된다. 주어진 손상들의 수가 중요한 절편에 영향을 미칠 것이라는 가능성이 이항분포에 의해 기재된다. RNA에서 손상들/염기의 평균 수가 r인 경우, 길이 L의 RNA 절편에 영향을 미치지 않는 손상들이 존재할 가능성은 (1-r) L 이다. r이 매우 작은 경우, 포아송 분포는 이항 분포에 대해 우수한 근사치(approximation)를 제공한다. 상기 절편 내 어떠한 손상들도 없는 가능성 P(0)는 포아송 분포의 제로 점이고 상기 분포에서 예측된 값 μ는 상기 가닥에서 손상들의 평균 수이다.
따라서:
P(0) = e -μ = e -L r
N이 mRNA 분자들의 총 수이고 N i 가 온전하고 정량가능한 분자들의 수인 경우:
Figure pct00014

및
Figure pct00015
= 상수 - L i .r
따라서, RNA 분자들의 일정 수가 다르고 알려진 값의 L(하지만 동일한 값의 r)에 기반되는 두 개 이상의 정량들 각각에 의해 어세이되는 경우, r 값은 ln(N i ) 및 L 간의 회귀 선의 기울기와 동일한 것으로 결정될 수 있다. 디지털 PCR 및 RNA 시퀀싱 같은 일부 방법들은 N i 가 절대적인 수로서 결정되게 해 주지만, 대부분의 경우에서 N i 는 절대적인 수로서 결정되지 않을 것이고 오히려 마이크로-어레이 및 나노스트링의 경우 형광, SAGE의 경우 서열들의 수, 또는 증폭 방법들의 경우 Cq 값들 같은 단위들로 측정될 것이다. 하지만, 임의 단위와 정량되는 분자들의 수 간의 관계는 여전히 r이 결정되는 것을 가능하게 해 준다. 따라서, 형광의 강도가 혼성화하는 분자의 수에 비례하는 경우:
ln (형광) = 상수 - L.r
이고 r은 형광과 L 간의 회귀 선의 기울기의 음성 값과 동일하다.
주기적 증폭 방법들의 경우,
N t = N i . a Cq
이고, N t 는 역치 상의 분자들의 수이고, a는 각 증폭 사이클의 증폭 인자의 측면에서 증폭 효율이며, Cq는 역치에 이르는 사이클들의 수이다. Nt가 일정한 수이기 때문에:
ln ( N i ) = ln ( N t / a Cq )= 상수 - L.r
이고 재배열 시: ln ( N t ) - ln (a). Cq = 상수 - Lr
이므로: Cq = 상수' + L.r/ ln (a)
다른 값의 L에 있어서, 선택된 증폭 시스템이 효율적이라면 a는 상수로서 간주될 수 있다. Cq와 L 간의 회귀 선의 기울기의 결정은 r이
r = 기울기. ln (a)
로서 계산되는 것을 가능하게 한다.
도 1에 예시된 대로, L 값은 RNA 분리 및 증폭에 이용되는 기술에 의존한다. 나노스트링 기술에 의한 정량에 있어서, L은 상기 캡쳐 프로브와 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기와 상기 리포터 프로브와 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기 간의 염기들의 수이다. 유전자 발현의 연속 분석(SAGE)에 의한 정량에 있어서, L은 상기 폴리T 캡쳐 프로브와 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기와 상기 제한 효소 절단 위치에 매우 근접한 염기 간의 염기들의 수이다. 마이크로-어레이 기술에 의한 정량에 있어서, cDNA가 프라이머로서 폴리dT를 이용하여 표지되는 경우, L 값은 폴리dT 프라이머와 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기와 상기 마이크로-어레이 상의 DNA 프로브에 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기 간의 염기들의 수인 반면에, cDNA가 임의적 프라이밍을 이용하여 표지되는 경우 L 값은 상기 임의 프라이머들이 혼성화하는 평균 점에 의해 정의되는 서열의 가장 바깥쪽의 염기와 상기 마이크로-어레이 상의 DNA 프로브에 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기 간의 염기들의 수이다. RNA 시퀀싱에 의한 정량 및 폴리dT 프라이밍에 의한 cDNA 합성에 있어서, L 값은 상기 판독의 동일한 가닥 상에 가장 바깥쪽의 5' T 염기와 가장 바깥쪽의 3' 염기 간의 염기들의 수이다. 핵산 증폭 기술에 의한 정량에 있어서, cDNA가 폴리dT 또는 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 생산되는 경우, L 값은 폴리dT 프라이머 또는 유전자-특이적 프라이머에 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기와 상기 업스트림 DNA 프라이머에 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기 간의 염기들의 수인 반면에, cDNA가 임의적 프라이밍을 표지되는 경우, L 값은 상기 임의적 프라이머들이 혼성화하는 평균점에 의해 정의되는 서열의 가장 바깥쪽의 염기와 업스트림 DNA 증폭 프라이머에 혼성화하는 서열의 가장 바깥쪽의 염기 간의 염기들의 수이다.
일부 상황들에서, L 값은 일정한 구성요소 및 임의적 구성요소로 구성될 수 있다. RNA가 프로브 캡쳐에 의해 분리되거나 또는 cDNA가 폴리dT 또는 유전자-특이적 프라이밍에 의해 생산되는 경우 L 값이 알려져 있지만, cDNA가 임의적 프라이밍에 의해 생산되는 경우 L 값은 알려져 있지 않다. 하지만, 임의적 프라이밍을 이용하는 경우, 길이 L은 두 개의 구성요소들로 구성된 것으로 간주될 수 있다: 도 2에서 볼 수 있듯이, 임의적 프라이머부터 측정점까지 뻗어있는 cDNA의 평균 길이를 나타내는 일정한 구성요소, 및 측정에 이용되는 서열을 나타내는 (길이 l의) 가변성 구성요소. 마이크로-어레이 혼성화를 위해 cDNA가 임의적 프라이밍에 의해 제조되는 경우, 상기 가변성 구성요소는 상기 DNA 프로브와 혼성화하는 서열의 길이이다; PCR 또는 다른 형태의 핵산 증폭에 의한 정량을 위해 cDNA가 가변성 프라이밍에 의해 생산되는 경우, 상기 임의적 구성요소는 상기 앰플리콘의 길이이다. 폴리dT 또는 유전자-특이적 프라이밍에 있어서, L 값이 알려져 있을 지라도, 일부 경우들에서 L을 일정한 구성요소 및 가변성 구성요소를 가지는 것으로 유사하게 간주하는 것이 간편할 수 있다. 상기 cDNA의 일정한 구성요소는 가장 바깥쪽의 5' T 염기부터 증폭을 위한 타겟인 가장 중심부의 서열과 붙어있는 염기까지 이어진다; 각 절편에 있어서 말단 쪽의 서열이 상기 가변성 구성요소이다. 또한:
L = l + 상수
이고 l은 관련 방정식(들)에서 상수 값에서 변화를 포함하는 변화만으로 L을 대체할 수 있고,
Cq = 상수 + l.r/ ln (a)
이며, r은
r = 기울기. ln (a)
로서 Cq와 l 간의 회귀 선의 기울기로부터 여전히 계산될 수 있다.
일단 r 값이 알려져 있는 경우, RNA 정량의 결과들은 분해에 대해 정정될 수 있다.
상기 기재의 측면에서, 길이 l의 가변성 서열은 길이 L의 분해-관련 서열의 유도체로서 이해될 것이며, 이러한 유도체가 분해-관련 서열을 대체할 수 있고 이의 길이 l이 완전성과 관계된 관련 공식에서 L을 대신할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
가장 많은 경우들에서, 목적 RNA 종은 내부 표준 RNA에 대해 상대적으로 정량된다. N 테스트 가 상기 테스트 RNA 분자들의 총 수이고, N 표준 이 표준 RNA 분자들의 총 수인 경우, 테스트는 정량된 분자들의 수에 비례하는 수로서 표현되는 테스트 분자의 정량 결과이며, 표준은 정량된 분자들의 수에 대해 동일한 비례성을 가지는 수로서 표현되는 상기 표준 RNA의 정량 결과이고, 이에 따라:
테스트/표준 = N테스트. e -L테스트.r / N표준. e -L표준 .r
이며 따라서
N 테스트 / N 표준 = (테스트/표준). e (L테스트 - L표준). r
또는, l이 적용가능한 상황들에서,
N 테스트 / N 표준 = (테스트/표준). e (l테스트 - l표준). r
다수의 RNA 종은 때때로 표준에 대한 결과를 제공하는 데 이용된다. 이러한 상황에서, L 또는 l의 평균 길이가 이용될 것이다.
아주 적은 경우들에서, 목적 RNA는 동일한 RNA의 외부 표준에 상대적으로 정량된다. 이러한 경우에서, L 값과 r 값이 다를 것이다. 이에 따라:
N 테스트 / N 표준 = (테스트/표준). e (L테스트.r테스트 - L표준.r표준)
L 값들이 동일한 경우:
N 테스트 / N 표준 = (테스트/표준). e (r테스트 - r표준) L
본 발명의 방법은 폭넓게 다양한 임상적 및 연구 시나리오들에 적용성을 가진다. 예를 들어, RNA 발현 프로파일을 얻는 것(즉, 수백 또는 수천 개의 유전자들의 발현을 정량하는 것)은 단일 유전자의 발현을 정량하는 것보다 보다 더 일상적으로 실시된다. 연구 포인트의 관점으로부터, 본 발명의 방법은 세포내 조절성 네트워크들, 세포내 과정들에서 중요한 유전자들의 동정, 및 세포에 대한 외부 제제들의 효과들에 대한 정보를 제공할 수 있다. 그렇게 얻어진 정보는 치료적 중재에 민감할 수 있거나 또는 치료 약물들의 활성 모드를 설명할 수 있는 타겟들을 동정할 수 있다. 진단 포인트의 관점으로부터, RNA 발현 프로파일링으로부터, RNA 발현 프로파일링은 백혈병 또는 다른 형태들의 암의 신규한 서브그룹들을 동정할 수 있으며, 암의 일부 경우들의 기원 조직을 결정하는 유일한 방법일 수 있어 적절한 조직-특이적 치료를 적용가능하게 해 준다.
단일 유전자를 정량하는 것과 관련하여, 만성 골수성 백혈병은 특이적 RNA가 종양-특이적 마커를 제공하는 예이고, 이러한 질환에서 BCR-ABL의 정량이 치료를 안내하고 적응하며 예후를 결정하는 데 이용된다.
상기 기재된 방법들은, 일반적으로 수작업으로 또는 자동화된 또는 반-자동화된 시스템들에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 로보트 RNA 발현 프로파일링 시스템들은 RNA 발현 프로파일링을 실시하기 위해 상기 기재된 방법들을 실시하도록 설정될 수 있고 프로파일링의 결과들은 상기 기재된 대로 분해에 대해 자동적으로 정정된다. 택일적으로, 상기 정정(들)은 보다 초기에 획득되었던 RNA 발현 프로파일링 데이터를 정정하기 위한 분리된 단계로서 실시될 수 있다. 그러한 경우들에서, 정정되지 않은 RNA 발현 프로파일링 데이터는 동일 또는 다른 컴퓨터 시스템 상에 국소적으로 저장될 수 있거나, 또는 예컨대 인터넷일 수 있는 소통 네트워크를 통해 원격으로 위치된 시스템으로부터 회수될 수 있다.
RNA 발현 프로파일링 데이터의 정정(독립적으로, 또는 본질적으로 동시에 RNA 발현 프로파일링 데이터의 획득과 함께)은, 예컨대 복수의 유전자들로부터 다수의 전사체들을 프로파일링하는 경우 같이 큰 데이터 세트들에 대해 자동적으로 또는 '배치(batch)' 모드에서 실시되는 경우에 특히 유용하다.
따라서, 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법들은 시스템 사용자에 의해 제공되는 입력값들(input)에 따라 자동적으로 실시하는 어세이들에 대한 로보트 구성요소들을 포함하거나 또는 포함하지 않는 데이터 프로세싱 시스템에서 구체화될 수 있다. 실시예에 따라, 하나의 구현예에서, 상기 데이터 프로세싱 시스템은 도 6에서 보여지는 대로 32-비트 또는 64-비트 인텔 제조 컴퓨터 시스템 600 같은 표준 컴퓨터 시스템이며, 상기 시스템 600에 의해 실행되는 방법들은, 도 6에서 볼 수 있듯이 상기 시스템 600과 연관된 비-휘발성(예컨대, 고체-상태 또는 하드 디스크) 저장 604에 저장된 하나 이상의 소프트웨어 모듈들 또는 구성요소들 602의 프로그래밍 지시의 형태로 실시된다. 하지만, 상기 방법들은 택일적으로, 응용-특이적 통합된 회로들(ASICs) 같은 하나 이상의 전용 하드웨어 구성요소들의 형태, 및/또는 예컨대 필드 프로그램 가능 게이트 어레이들(FPGAs) 같은 설정가능한 하드웨어에 대한 설정 데이터의 형태에서 부분적으로 또는 전체적으로 중 어느 하나에 따라 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
도 6에서 보여지는 시스템 600은 임의 접근 기억장치(RAM) 606, 최소 하나의 프로세서 608, 및 버스(bus) 616에 의해 모두 서로 연결되어 있는 외부 인터페이스 610, 612, 614를 포함하는 표준 컴퓨터 구성요소들을 포함한다. 상기 외부 인터페이스는 유니버셜 시리얼 버스(USB) 인터페이스 610을 포함하고, 최소 하나 이상의 USB는 키보드 318 및 마우스 같은 지시 장치(pointing device), 상기 시스템 300을 인터넷 같은 소통 네트워크 620에 연결하는 네트워크 인터페이스 커넥너(NIC) 612에 연결되며, RNA 발현 프로파일 데이터는 상기 시스템 300을 통해 상기 시스템 600에 의해 접근될 수 있다. 상기 시스템 300은 또한 LCD 패널 디스플레이 322 같은 디스플레이 장치에 연결되는 디스플레이 어댑터 314, 및 리눅스 또는 마이크로소프트 윈도우즈 같은 오퍼레이팅 시스템 624를 포함하는 다수의 표준 소프트웨어 모듈 626 내지 630을 포함한다.
따라서 일부 구현예들에서, 상기 구성요소 602는:
(i) 최소 하나의 RNA 분자의 표준 정량을 나타내는 저장된 RNA 발현 프로파일링 데이터를 회수하거나 또는 그렇지 않으면 접근하고;
(ii) 상기 RNA 분자 각각의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 나타내는 저장된 RNA 완전성 데이터를 회수하거나 또는 그렇지 않으면 접근하며;
(iii) 상기 RNA 분자의 상응하는 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들)의 하나 이상의 길이들을 나타내는 저장된 길이 데이터를 회수하거나 또는 그렇지 않으면 접근하고;
(iv) 최소 하나의 RNA 분자의 상기 정량의 정정된 값들을 나타내는 정정된 RNA 발현 프로파일링 데이터를 발생시키기 위해 상기 RNA 발현 프로파일링 데이터, 상기 RNA 완전성 데이터 및 상기 길이 데이터를 프로세싱하도록 설정된다.
상기 RNA 발현 프로파일링 데이터 또는 RNA 완전성 데이터(또는 모두)가 상기 시스템 600 자체에 의해 발생될 수 있거나, 또는 다른 시스템으로부터 얻어질 수 있다. 상기 기재된 대로, RNA 분자의 분해-관련 절편(및 이에 따른 RNA의 길이)은 상기 RNA 발현 프로파일링 데이터를 발생시키는 데 이용되는 상기 발현 프로파일링 방법에 의해 결정되고, 이에 따라 길이 데이터가 반드시 필요하지 않을 지라도 후자는 보통 길이 데이터와 연관되어 저장될 것이다.
일부 구현예들에서, 상기 구성요소 602는 상기 시스템이:
(i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가져 상기 정량적 측정치들과 상기 길이들을 나타내는 어세이 데이터를 발생시키고;
(ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 나타내는 완전성 데이터를 발생시키기 위한 상기 어세이 데이터를 프로세싱하는 단계를 실시하도록 설정된다.
일부 구현예들에서, 상기 구성요소 602는 추가적으로 상기 시스템 600이:
(iii) 목적 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계를 실행하도록 설정된다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 예에 대한 언급에 의해 추가적으로 기재된다.
도 1. 분해성 손상이 목적 RNA의 정량에 영향을 미치는 중요한 분해-관련 절편의 길이 L과 분해성 손상이 상기 정량에 영향을 미치지 않을 분해-관련 절편이 없는(즉, 바깥쪽) 절편의 예시. 상기 중요한 절편은 정량 방법에 의존하고 나노스트링, 마이크로어레이, SAGE, PCR에 의해 예시되는 대로 핵산 증폭, 및 다음 세대 시퀀싱에 의한 정량에 대해 제시된다. 상기 중요한 절편의 길이는 L 염기들이다. 상기 중요한 절편은 개념적인 것으로 종종 정량의 최종 단계에서 이용되는 RNA 또는 이의 cDNA 유도체의 부위와 실제적으로 다르다는 것을 주목하라.
도 2. L과 l의 관계. 길이 L의 중요한 부위가 일정한 부위 및 길이 l의 가변적인 부위를 가지는 경우 l의 값이 L에 대한 대리체(surrogate)로서 이용될 수 있다. 이것은 마이크로어레이 또는 PCR에 의한 정량의 일부 상황에 대해 적용한다.
도 3. 본 발명의 방법에 의한 RNA 완전성을 측정하는 것과 ΔΔCq 방법에 의한 RNA 완전성을 측정하는 것 간의 비교. 후자는 본 발명에 평가되는 기준에 대해 독립적인 기준(benchmark)을 제공한다. 30개의 시료들 내 RNA가 열에 의해 분해되었다. 본 발명의 방법은 상기 분해된 시료만을 연구함으로써 분해를 정량하는 반면에, ΔΔCq 방법은 상기 분해된 시료와 동일한 RNA의 분해되지 않은 대조군 시료 간의 Cq 차이를 이용하여 분해를 정량하였다.
도 4. 염기 당 손상들(lesions/base)을 측정하는 본 발명의 방법과 자동화된 전기영동에 기반된 표준 RIN 스코어 간의 비교. 아홉 개의 RNA 시료들이 다양한 온도에서 30분 동안 가열시켜 부분적으로 분해된 후 분석되었다. 1000개의 염기 당 손상들과 0부터 10까지의 범위인 RIN 지수가 제시된다. 염기 당 병소들의 수는 가열 온도가 증가함에 따라 급격한 증가는 나타내는 반면에, RIN은 크게는 "모두-또는-전무(all-or-nothing)" 단계-유사 반응들을 보이고 명확하게 정량적이지 않다. 1000개의 염기 당 5-6 이상의 손상들이 존재하는 정도까지 분해된 RNA는 너무 분해되어 분석하기 어려운 것으로 RIN에 의해 결론지어진다. 하지만, 본 발명의 방법은 여전히 분해를 정량할 수 있어 RIN에 의해 너무 분해된 것으로 판단된 시료들 내 목적 RNA의 레벨을 결정할 수 있다.
도 5. 표준으로서 APC mRNA의 다른 길이들에 대해 상대적인 GAPDH mRNA의 다른 길이들의 상대적 정량. 상대적인 정량이 종래의 방법 또는 분해 정량 후 35 페이지의 5번째 줄의 방정식을 이용하여 종래의 비율을 정정하는 것 중 어느 하나에 의해 실시되었다. RNA는 91℃에서 30분 동안 가열시켜 분해된 대조군 RNA 또는 RNA 중 어느 하나였다. 종래의 상대적인 정량에 의해 얻어진 결과들은 테스트 앰플리콘의 길이, 표준 앰플리콘의 길이 및 분해의 존재에 의해 영향받는다. 상술한 효과들은 임의적 실험의 변이와 일치하는 어떠한 잔여 변이인 분해 및 길이에 대한 정정 후에 거의 보이지 않는다. 분해된 RNA에 대해서, 종래의 상대적인 정량의 결과들을 정정하는 각 실험에서 상기 분해된 RNA의 변이에서 크게 유의한 감소(p<0.0005)가 나타났다; 대조군 RNA에 대해서는 각 경우에서 정정이 변이의 감소를 생산하였지만, 상기 감소가 유의적이지 않았다.
도 6. 본 명세서에 기재된 대로 정량적 완전성 측정치들에 기반된 RNA 발현 프로파일링에 이용하기 위한 데이터 프로세싱 시스템의 도식적 블록 선도.
실시예
30분 동안 분해 온도
(℃)		 프라이밍 정량을 제공하는
최소 pg RNA		 손상들/1000개의 염기들
가장 좋은 추정치 한계 추정치
대조군 임의적 <16 1.1 -0.2
대조군 임의적 1 1.4 1.4
85 임의적 16 3.9 2.3
88 임의적 63 7.5 7.8
91 임의적 126 9.7 27.9
91 유전자-특이적 10 9.7 9.0
91 유전자-특이적 10 9.4 4.3
표 1. 분해의 정량을 위해 필요한 최소 양의 mRNA에 대한 조사. 실제적으로, 연구에 이용가능한 mRNA의 양은 종종 제한되고/제한되거나 상기 mRNA는 거의 분해될 수 있다. 상술한 인자들 모두가 상호작용하고 mRNA를 정량하는 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 연속적인 실험들에서, 상기 mRNA는 열에 의해 분해되는 대조군 mRNA 또는 mRNA였다. 완전성은 GAPDH 유전자를 이용하여 측정하였다. 완전성에 대한 상기 대조군 추정치(estimate)는 분석된 가장 큰 질량의 RNA의 분석으로부터 얻었으며, 한계 추정치(estimate at the limit)는 Cq와 앰플리콘 길이 간의 신뢰할만한 회귀 선을 제공하였던 최소 질량의 RNA 분석으로부터 얻었다. 분해를 평가하기 위한 종래의 RIN 방법은 분석에 적합하거나 부적합한 지에 대해 RNA 시료를 분류시키기만 하거나, 최소 50 pg의 RNA를 필요로 하고, 5-6개의 손상들/1000 염기들 이상을 가지는 본 발명의 방법으로 정량되는 RNA가 분석하기에 너무 분해되어 있다는 것으로 결론짓는다. 본 발명의 방법은 RIN의 결점들을 극복하였다. 전체적으로, RNA가 다소 약간 분해되었을 경우 미세하게 덜 민감할 지라도 유전자-특이적 프라이밍이 임의적 프라이밍보다 탁월한 것으로 나타났다.
당업자들은 본 명세서에 기재된 본 발명이 특이적으로 기재된 변이들 및 변형들 외의 변이들 및 변형들에 민감하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 그러한 모든 변이들 및 변형들을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 발명은 본 명세서에서 언급되거나 또는 지시된 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들 모두를 개별적으로 또는 전체적으로 포함하고, 상기 단계들 또는 특징들의 어떠한 두 개 이상의 어떠한 조합들 및 모든 조합들을 포함한다.

Claims (16)

  1. 시료 내 RNA 완전성(integrity)의 정량적 측정치(measure)를 결정하는 방법으로, 상기 방법은:
    (i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들(instances)을 포함하는 시료를 어세이하는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
    (ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계(relationship)에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은:
    (iii) 목적 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 계산된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편(또는 이의 유도체)의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계
    를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은:
    (iii) 표준 유전자로부터 전사된 목적 유전자로부터 전사된 RNA를 정량하고 단계 (ii)에서 결정된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편(또는 이의 유도체)의 길이를 이용하여 상기 결과를 정정하는 단계
    를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료에서 상기 RNA의 정량은 표준 RNA의 정량에 대해 상대적이고, 상기 표준 RNA의 정량에 대해 상대적인 상기 시료에서 상기 RNA 분자의 양은:
    Figure pct00016

    에 의해 제공되며, N 테스트 / N 표준 은 표준 RNA 분자의 양에 대한 목적 RNA 분자(테스트 분자)의 양의 비율이고, S 테스트 / S 표준 은 상기 시료에서 각각 테스트 절편 및 표준 절편의 측정된 양의 비율이며, L 테스트 및 L 표준 은 각각 상기 테스트 및 표준 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들)의 길이이고, r 테스트 및 r 표준 은 상기 RNA 분자들이 포함되어 있는 시료들에서 상기 테스트 RNA 분자 및 표준 RNA 분자의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들(lesions)의 평균 수 r인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 수(N), 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 i 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들(Ni)의 정량적 측정치들, 상기 절편들의 길이들(Li), 및 상기 RNA 분자의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들의 평균 수(r) 간의 관계는:
    Figure pct00017

    에 의해 제공되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 수(N), 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 i 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들(Ni)의 정량적 측정치들, 상기 절편들의 길이들(Li), 및 상기 RNA 분자의 사례들 중 뉴클레오타이드 당 손상들의 평균 수(r) 간의 관계는:
    Figure pct00018

    에 의해 제공되고; 상기 r의 값은 (Ni)와 Li의 대수값들 간의 선형 관계의 기울기(gradient)로서 결정되는 것인 방법.
  7. 시료 내 RNA 완전성의 정량적 측정치를 결정하는데 이용하는 방법으로, 상기 방법은:
    (i) 적어도 하나의 RNA 분자의 표준 정량을 나타내는 RNA 발현 프로파일링 데이터에 접근하는 단계;
    (ii) 상기 RNA 분자 각각의 사례들의 완전성에 대한 정량적 측정치를 나타내는 RNA 완전성 데이터에 접근하는 단계;
    (iii) 상기 RNA 분자의 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들) 각각의 하나 이상의 길이들을 나타내는 길이 데이터에 접근하는 단계; 및
    (iv) 상기 RNA 발현 프로파일링 데이터, 상기 RNA 완전성 데이터 및 상기 길이 데이터를 프로세싱하여 상기 적어도 하나의 RNA 분자의 상기 정량의 정정된 값들을 나타내는 정정된 RNA 발현 프로파일링 데이터를 발생시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  8. 시료 내 RNA 완전성의 정량적 측정치를 결정하는데 이용하는 방법으로, 상기 방법은:
    (i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 상기 사례들을 포함하는 시료를 어세이하여 상기 정량적 측정치들 및 길이들을 나타내는 어세이 데이터를 발생시키는 단계로, 상기 단계는 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이들을 가지고;
    (ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 어세이 데이터를 프로세싱하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 나타내는 완전성 데이터를 발생시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은:
    (iii) 목적 RNA를 정량하는 단계; 및
    (iv) 단계 (ii)에서 결정된 상기 목적 RNA의 완전성에 대한 측정치 및 상기 목적 RNA의 상응하는 분해-관련 절편(또는 이의 유도체)의 길이를 이용하여 상기 정량 결과를 정정하는 단계
    를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각 길이는 일정한 구성요소와 가변적인 구성요소를 가지는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각 길이는 많은 수의 다른 길이들의 통계적 평균인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 방법을 실행하도록 설정된 RNA 발현 프로파일링 시스템.
  14. 데이터 프로세싱 시스템의 적어도 하나의 프로세서에 의해 실시되는 경우, 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 방법을 실행하는 최소 하나의 프로세서를 초래하는 컴퓨터-판독가능한 저장 매체(storage medium) 상에 저장된 실행가능한 명령들(instructions)을 가지는 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
  15. (i) 적어도 하나의 RNA 분자의 표준 정량을 나타내는 RNA 발현 프로파일링 데이터에 접근하고;
    (ii) 상기 RNA 분자 각각의 사례들의 완전성에 대한 정량적 측정치를 나타내는 RNA 완전성 데이터에 접근하며;
    (iii) 상기 RNA 분자의 상응하는 분해-관련 절편들(또는 이의 유도체들)의 하나 이상의 길이들을 나타내는 길이 데이터에 접근하고;
    (iv) 상기 RNA 발현 프로파일링 데이터, 상기 RNA 완전성 데이터 및 상기 길이 데이터를 프로세싱하여 상기 적어도 하나의 RNA 분자의 상기 정량의 정정된 값들을 나타내는 정정된 RNA 발현 프로파일 데이터를 발생시키도록 설정된 하나 이상의 RNA 완전성 구성요소들을 포함하는 RNA 발현 프로파일링 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 RNA 완전성 구성요소들은:
    (i) 적어도 일부의 손상되는 사례들인 레퍼런스 유전자로부터 전사된 RNA 분자의 사례들을 포함하는 시료를 어세이하여 상기 정량적 측정치들 및 길이들을 나타내는 어세이 데이터를 발생시키는 단계로, 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 많은 수의 절편들 각각의 온전한 사례들의 상대적 또는 절대적 수들의 정량적 측정치들을 결정하며 상기 절편들은 각각 다른 길이를 가지고;
    (ii) 상기 절편들의 상기 결정된 정량적 측정치들과 상기 절편들의 각각의 다른 길이들 간의 관계에 기반하여 상기 시료 내 상기 RNA 분자의 사례들의 완전성의 정량적 측정치를 나타내는 완전성 데이터를 발생시키기 위해 상기 어세이 데이터를 프로세싱하는 단계
    를 실행하도록 추가적으로 설정되는 것인 RNA 발현 프로파일링 시스템.
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