KR20150013236A

KR20150013236A - 수면 장애의 치료를 위한 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 용도

Info

Publication number: KR20150013236A
Application number: KR1020147034009A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 에스 덴니; 마가렛 잭슨; 가브리엘 존넨베르그
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2015-02-04
Also published as: CA2874196A1; AU2013273263A1; US9370516B2; WO2013182933A1; ES2716303T3; CN104334193A; HK1202459A1; KR101708989B1; EP2854856A1; RU2014146109A; ZA201408672B; BR112014029577A2; CA2874196C; SG11201407387UA; JP6165852B2; EP2854856B1; JP2015518876A; RU2600895C2; MX2014014813A; AU2013273263B2

Abstract

본 발명은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 수면 장애의 치료 방법을 포함한다.

Description

수면 장애의 치료를 위한 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 용도{USE OF GHRELIN RECEPTOR INVERSE AGONISTS OR ANTAGONISTS FOR TREATING SLEEP DISORDERS}

본 발명은 수면 장애 치료에 유용한, 그렐린 수용체 역작용제/길항제인 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그와 같은 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

불면증은 가장 흔한 수면 장애로서, 약 5천만 내지 7천만 명의 미국 성인들에게 영향을 미친다. 불면증은 잠들기 어렵거나, 밤에 자주 깨거나, 지나치게 일찍 깨고 다시 잠들지 못하거나, 깨어나고 개운함을 느끼지 못하는 것을 특징으로 한다.

불면증의 초기 치료는 일반적으로 바비튜레이트(barbiturate)와 같은 중추신경계(CNS) 억제제를 사용하였다. 이 화합물들은 전형적으로 긴 반감기를 가지며, 무기력함, 혼란, 우울감 및 숙취 효과(next day hangover effect)를 비롯한, 잘 알려진 범위의 부작용을 갖는다. 또한, 만성적 사용은 신체적 및 정신적 의존 모두를 포함한 중독에 대한 높은 가능성과 관련되어 왔다. 치료 방법은 바비튜레이트 및 다른 CNS 억제제에서 벤조다이아제핀류의 진정-최면제(sedative-hypnotic agent)로 변화하였다. 이 부류의 화합물들은 종래 최면제에 비해 보다 넓은 안전성 범위를 가지며, 환자 및 동물에서 수면-유사 상태를 초래하는 진정 효과를 유발한다. 그러나, 다수의 벤조다이아제핀 화합물들은 특정 환자군에서의 유용성을 제한하는 부작용들을 갖는다. 이러한 문제점들로는, 다른 CNS 억제제(특히, 알코올)와의 상승작용, 반복 투여후 내성의 발생, 투약 중단에 따른 보상성 불면증, 투약 다음 날의 숙취 효과 및 정신운동성 기능 및 기억력의 손상이 포함된다. 보다 최근의 불면증 치료방법은 비-벤조다이아제핀 화합물을 사용하였다. 암비엔(졸피뎀), 소나타(잘레플론)가 승인된 의약품의 예이다. 수면 장애를 치료하기 위한 안전하고 치료적으로 유효한 비-벤조다이아제핀 제제에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.

야식 증후군(NES)은 일반적으로 하루 중 처음 반나절 동안의 불충분한 음식 섭취, 야식 경향(evening hyperphagia) 및 불면증, 그리고 수면 각성(sleep awakening)과 관련이 있다. 예컨대, 문헌[Vander Wal, Jillon S., Clinical Psychology Review (2012) 32(1), 49-59]을 참조한다. 야식 증후군에 대한 인지도가 증가했음에도 불구하고, 야식 증후군은 여전히 인정받지 못하고 있으며, 보다 중요하게는 치료 방법이 지속적으로 연구되고 있으나 성공적이지 않았다.

본 발명은 수면 장애 치료를 위한 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 경구용 위관 삽입 튜브(gavage)를 통한 투여 후 35 내지 65분 경과시 수컷 위스타 한(Wistar Han) 랫트의 보행성 활동량 감소에 대한 실시예 1의 효과를 도시한 그래프이다.
도 2는 인간에서 실시예 1의 경면(somnolence) 효과를 도시한 그래프이다.
도 3은 실시예 1 또는 비히클의 1일 1회(QD) 투여 후 동물의 개별 활동 패턴의 한 예이다.
도 4는 실시예 1 또는 비히클의 QD 투여 후 동물의 개별 섭식 패턴의 한 예이다.
도 5는 실시예 1의 야간 투여 후 3시간 이내의 수면 지속의 변화를 보여준다.
도 6은 실시예 1의 야간 투여 후 3시간 이내의 섭식 변화를 보여준다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 일차성 불면증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 과도한 주간 졸림의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 프래더-윌리(Prader-Willi) 증후군으로 진단받은 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 야식 증후군(NES)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 일차성 불면증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 프래더-윌리 증후군으로 진단받은 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 치료적 유효량 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 야식 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 일차성 불면증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 프래더-윌리 증후군으로 진단받은 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는데 유용하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 야식 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 일차성 불면증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 프래더-윌리 증후군으로 진단받은 환자의 과도한 주간 졸림을 치료하는데 유용하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 야식 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

수면 장애, 특히 일차성 불면증, 과도한 주간 졸림 또는 야식 증후군을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 용도;

의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제;

수면 장애, 특히 일차성 불면증, 과도한 주간 졸림 또는 야식 증후군의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제;

본원에 기술된 바와 같은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물; 및

본원에 기술된 바와 같은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제를 포함하는, 수면 장애, 특히 일차성 불면증, 과도한 주간 졸림 또는 야식 증후군의 치료용 약학 조성물을 또한 제공하며,

특히 상기 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제는 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.

(R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 본원에서 간단히, 실시예 1로서 일반적으로 지칭될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 또한, 상기 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 다른 약리학적 활성제와 조합되어 투여되는, 본원에서 논의되는 임의의 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 상기 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히, 실시예 1은, 별개로 투여되거나 동일한 약학 조성물로 투여되는, 당업계에 공지된, 화합물로도 지칭되는 다른 약리학적 활성제와 조합되어 사용될 수 있다. 상기 약리학적 활성제로는 (a) (i) PPAR 감마 길항제, 예컨대 글리타존(예를 들어, 시글리타존; 다르글리타존; 엔글리타존; 이사글리타존(MCC-555); 피오글리타존; 로지글리타존; 트로글리타존; 툴라릭; BRL49653; CLX-0921; 5-BTZD, GW-0207, LG-100641 및 LY-300512 등); (iii) 바이구아나이드, 예컨대 메트포르민 및 펜포르민을 비롯한, 인슐린 감작제; (b) 인슐린 또는 인슐린 모방제, 예컨대, 바이오타, LP-100, 노바라피드, 인슐린 디터머, 인슐린 리스프로, 인슐린 글라진, 인슐린 아연 현탁액(렌테 및 울트라렌테), Lys-Pro 인슐린, GLP-1(73-7)(인슐린트로핀) 및 GLP-1(7-36)-NH₂); (c) 설포닐우레아, 예컨대, 아세토헥사마이드, 클로르프로파미드, 다이아비네즈, 글리벤클라마이드, 글리피자이드, 글리뷰라이드, 글리메피라이드, 글리클라자이드, 글리펜타이드, 글리퀴돈, 글리솔아마이드, 톨라자마이드 및 톨부타아마이드; (d) 알파-글루코시다제 억제제, 예컨대, 아카르보스, 아디포신, 카미글리보스, 에미글리테이트, 미글리톨, 보글리보스, 프라디미신-Q, 살보스타틴, CKD-711, MDL-25,637, MDL-73,945 및 MOR 14 등; (e) 콜레스테롤 저하제, 예컨대, (i) HMG-CoA 환원효소 억제제(아토르바스타틴, 이타바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴, 리바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 및 기타 스타틴); (ii) 담즙산 흡수제/격리제, 예컨대, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 가교결합된 덱스트란의 다이알킬아미노알킬 유도체, 콜레스티드.RTM, 로콜레스트.RTM 등; (ii) 니코티닐 알코올, 니코틴산 또는 그의 염; (iii) 증식자-활성화 수용체 알파 작용제, 예컨대, 페노피브르산 유도체(젬피브로질, 클로피브레이트, 페노피브레이트 및 벤자피브레이트); (iv) 콜레스테롤 흡수 억제제, 예컨대, 스타놀 에스터, 베타-시토스테롤, 티퀘사이드와 같은 스테롤 글라이코사이드, 에제티마이브 등과 같은 아제티디논, 및 아바시마이브 및 멜린아마이드와 같은 아실 CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(ACAT) 억제제; (v) 항산화제, 예컨대 프로부콜; (vi) 비타민 E; 및 (vii) 갑상선호르몬 모방약(thyromimetic); (f) PPAR 알파 작용제, 예컨대, 베클로피브레이트, 벤자피브레이트, 시프로피브레이트, 클로피브레이트, 에토피브레이트, 페노피브레이트 및 젬피브로질, 및 기타 피브르산 유도체, 예컨대 아트로미드.RTM, 로피드.RTM 및 트리코르.RTM 등, 및 글락소에 의한 국제특허공개 제WO 97/36579호에 기술되어 있는 PPAR 알파 작용제; (g) PPAR 델타 작용제; (h) PPAR 알파/델타 작용제, 예컨대, 무라글리타자르 및 미국 특허 제6,414,002호에 개시되어 있는 화합물들; 및 (i) 항비만제, 예컨대, (1) 성장호르몬 분비 촉진제, 성장호르몬 분비촉진제 수용체 작용제/길항제, 예컨대, NN703, 헥사렐린, MK-0677, SM-130686, CP-424,391, L-692,429 및 L-163,255; (2) 단백질 티로신 포스파타제-1B(PTP-1B) 억제제; (3) 칸나비노이드 수용체 리간드, 예컨대 칸나비노이드 CB 아형 1 수용체 길항제 또는 역작용제, 예컨대 리모나반트(사노피 신텔라보(Sanofi Synthelabo)), AMT-251 및 SR-14778 및 SR 141716A(사노피 신텔라보), SLV-319(솔베이), BAY 65-2520(바이엘); (4) 항비만 세로토닌 작용성 약물, 예컨대, 펜플루라민, 덱스펜플루라민, 펜테르민 및 시부트라민; (5) 베타 3-아드레노수용체 작용제, 예컨대 AD9677/TAK677(다이니폰/타케다), CL-316,243, SB 418790, BRL-37344, L-796568, BMS-196085, BRL-35135A, CGP12177A, BTA-243, 트레카드린, 제네카 D7114, SR 59119A; (6) 췌장 리파아제 억제제, 예컨대 오를리스타트(제니칼 RTM), 트리톤WR1339, RHC80267, 립스타틴, 테트라하이드로립스타틴, 티사포닌, 다이에틸움벨리페릴 포스페이트; (7) 뉴로펩타이드 Y1 길항제, 예컨대 BIBP3226, J-115814, BIBO 3304, LY-357897, CP-671906, GI-264879A; (8) 뉴로펩타이드 Y5 길항제, 예컨대 GW-569180A, GW-594884A, GW-587081X, GW-548118X, FR226928, FR240662, FR252384, 1229U91, GI-264879A, CGP71683A, LY-377897, PD-160170, SR-120562A, SR-120819A 및 JCF-104; (9) 멜라닌-농축 호르몬(MCH) 수용체 길항제; (10) 멜라닌-농축 호르몬 1 수용체(MCH1R) 길항제, 예컨대 T-226296(타케다); (11) 멜라닌-농축 호르몬 2 수용체(MCH2R) 작용제/길항제; (12) 오렉신 수용체 길항제, 예컨대 SB-334867-A, 및 본원에서 특허문헌에 개시된 것들; (13) 세로토닌 재흡수 억제제, 예컨대 플루옥세틴, 파록세틴 및 세르트랄린; (14) 멜라노코르틴 작용제, 예컨대 멜라노탄 II; (15) 기타 Mc4r(멜라노코르틴 4 수용체) 작용제, 예컨대 CHIR86036(카이론), ME-10142 및 ME-10145(멜라큐어), CHIR86036(카이론), PT-141 및 PT-14(팔라틴); (16) 5HT-2 작용제; (17) 5HT2C(세로토닌 수용체 2C) 작용제, 예컨대 BVT933, DPCA37215, WAY161503, R-1065; (18) 갈라닌 길항제; (19) CCK 작용제; (20) CCK-A(콜레시스토키닌-A) 작용제, 예컨대 AR-R 15849, GI 181771, JMV-180, A-71378, A-71623 및 SR14613; (22) 코르티코트로핀-방출 호르몬 작용제; (23) 히스타민 수용체-3(H3) 조절제; (24) 히스타민 수용체-3(H3) 길항제/역작용제, 예컨대 히오페라마이드, 3-(1H-이미다졸-4-일)프로필 N-(4-펜테닐)카르바메이트, 클로벤프로피트, 요오도펜프로피트, 이모프록시판, GT2394(글리아테크) 및 O-[3-(1H-이미다졸-4-일)프로판올]카르바메이트; (25) 베타-하이드록시 스테로이드 데하이드로게나제-1 억제제(베타-HSD-1); (26) PDE(포스포다이에스테라제) 억제제, 예컨대 테오필린, 펜톡시필린, 자프리나스트, 실데나필, 아미논, 밀리논, 실로스타마이드, 롤리프람 및 실로밀라스트; (27) 포스포다이에스테라제-3B(PDE3B) 억제제; (28) NE(노르에피네프린) 수송 억제제, 예컨대 GW 320659, 데스피라민, 탈수프람 및 노미펜신; (29) 제2 또는 제3 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제; (30) 재조합 환자 렙틴(PEG-OB, 호프만 라 로슈) 및 재조합 메티오닐 환자 렙틴(암젠)을 비롯한, 렙틴; (31) 렙틴 유도체; (32) BRS3(봄베신 수용체 아형 3) 작용제, 예컨대 [D-Phe6,beta-Ala11,Phe13,Nle14]Bn(6-14) 및 [D-Phe6,Phe13]Bn(6-13)프로필아마이드, 및 문헌[Pept. Sci. 2002년 8월; 8(8): 461-75)]에 개시되어 있는 화합물들; (33) CNTF(섬모 향신경성 인자), 예컨대 GI-181771(글락소스미스클라인), SR146131 (사노피 신텔라보), 부타빈다이드, PD170,292 및 PD 149164(화이자); (34) CNTF 유도체, 예컨대 악소카인(레제네론); (35) 모노아민 재흡수 억제제, 예컨대 시부트라민; (36) UCP-1(비커플링 단백질-1), 2 또는 3 활성화제, 예컨대 피탄산(phytanic acid), 4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈렌일)-1-프로펜일]벤조산(TTNPB), 레티노산; (37) 갑상선 호르몬 베타 작용제, 예컨대 KB-2611(카로바이오BMS); (38) FAS(지방산 합성효소) 억제제, 예컨대 세룰레닌 및 C75; (39) DGAT1(다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1) 억제제; (40) DGAT2(다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 2) 억제제; (41) ACC2(아세틸-CoA 카르복실라제-2) 억제제; (42) 글루코코르티코이드 길항제; (43) 아실-에스트로겐, 예컨대 문헌[del Mar-Grasa, M. et al., Obesity Research, 9:202-9 (2001)]에 개시되어 있는 올레오일-에스트론; (44) 다이펩티딜 펩티아제 IV(DP-IV) 억제제, 예컨대 이소루신 싸이아졸리다이드, 발린 피롤리다이드, NVP-DPP728, LAF237, MK-431, P93/01, TSL 225, TMC-2A/2B/2C, FE 999011, P9310/K364, VIP 0177, SDZ 274-444; (46) 다이카르복실레이트 수송체 억제제; (47) 글루코스 수송체 억제제; (48) 포스페이트 수송체 억제제; (49) 메트포르민(글루코파지 RTM); 및 (50) 토피라메이트(토피맥스 RTM); 및 (50) 펩타이드 YY, PYY 3-36, 펩타이드 YY 유사체, 유도체 및 단편, 예컨대 BIM-43073D, BIM-43004C(문헌[Olitvak, D. A. et al., Dig. Dis. Sci. 44(3):643-48 (1999)]); (51) 뉴로펩타이드 Y2(NPY2) 수용체 작용제, 예컨대 NPY3-36, N 아세틸[Leu(28,31)] NPY 24-36, TASP-V, 및 사이클로-(28/32)-Ac-[Lys28-Glu32]-(25-36)-pNPY; (52) 뉴로펩타이드 Y4(NPY4) 작용제, 예컨대 췌장 펩타이드(PP) 및 기타 Y4 작용제, 예컨대 1229U91; (54) 사이클로옥시게나제-2 억제제, 예컨대 에토리콕시브, 셀레콕시브, 발데콕시브, 파레콕시브, 루미라콕시브, BMS347070, 티라콕시브 또는 JTE522, ABT963, CS502 및 GW406381, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염; (55) 뉴로펩타이드 Y1(NPY1) 길항제, 예컨대 BIBP3226, J-115814, BIBO 3304, LY-357897, CP-671906, GI-264879A; (56) 오피오이드 길항제, 예컨대 날메펜(레벡스 RTM), 3-메톡시날트렉손, 날록손, 날트렉손; (57) 11 베타 HSD-1(11-베타 하이드록시 스테로이드 데하이드로게나제 1형) 억제제, 예컨대 BVT 3498, BVT 2733; (58) 미노렉스; (59) 암페클로랄; (60) 암페타민; (61) 벤즈페타민; (62) 클로르펜테르민; (63) 클로벤조렉스; (64) 클로포렉스; (65) 클로미노렉스; (66) 클로르테르민; (67) 사이클렉세드린; (68) 덱스트로암페타민; (69) 다이페메톡시딘; (70) N-에틸암페타민; (71) 펜부트라제이트; (72) 페니소렉스; (73) 펜프로포렉스; (74) 플루도렉스; (75) 플루미노렉스; (76) 푸르푸릴메틸암페타민; (77) 레밤페타민; (78) 레보파세토페란; (79) 메페노렉스; (80) 메트암페프라몬; (81) 메트암페타민; (82) 노르슈도에페드린; (83) 펜토렉스; (84) 펜다이메트라진; (85) 펜메트라진; (86) 피실로렉스; (87) 파이토팜 57; 및 (88) 조니사마이드가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 환자 또는 그보다 하등인 동물의 조직과 접촉하여 사용되기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율을 충족하는 염을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 에스 엠 베르쥬 등은 문헌[Berge et al., J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1-19]에서 약학적으로 허용가능한 염을 상세히 기술하고 있다. 상기 염들은 본 발명의 실시예 1의 최종 단리 및 정제 동안 동소(in situ) 제조되거나, 실시예 1의 유리 염기를 적절한 유기 또는 무기 산과 반응시킴으로써 별개로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가 염들로는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이카르보네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 다이글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 싸이오사이아네이트, 및 p-톨루엔설포네이트가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "그렐린 수용체"는 성장 호르몬 분비촉진제 수용체(GHSR1a 또는 GHS-1aR)로 알려진, G 단백질-결합 수용체이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "수면 장애"는 환자의 수면 양, 수면의 질 또는 시기, 또는 수면과 연관된 행동 또는 생리학적 상태의 방해를 특징으로 하는 70여개의 증후군을 포함한다. 수면 장애 증후군의 대표적인 예로는 불면증, 일차성 불면증, 수면 무호흡증, 기면증, 하지불안증후군, 일주기 리듬수면 장애, 렘 수면 행동 장애, 수면보행증(몽유병), 수면 중 이갈이, 과수면, 폭발성 머리 증후군(exploding head syndrome), 수면 마비 및 과도한 주간 졸림(EDS)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

EDS는 프래더-윌리 증후군(PWS)을 앓는 환자의 전형적인 특징 중 하나이다; 간병인들은 PWS를 앓는 소아들이 졸음이 많고 매우 빈번한 주간 낮잠을 갖는다고 설명한다. EDS는 다중 수면 잠복기 검사시, 야간 및 주간 동안 모두 수면 개시 잠복기의 감소를 보인다. 부모를 대상으로 한 보고서 및 설문지는 PWS를 앓는 성인의 90 내지 100%에서 EDS가 존재한다는 것을 보여준다. 또한, PWS 환자들은 다른 지적 장애군 및 비-PWS 대조군에 비해 보다 높은 자가-보고된 EDS 수준을 갖는다.

문헌[Vander Wal의 상기 문헌] 50쪽의 표를 참조하면(인용은 생략함), 야식 증후군은 섭식 패턴, 수면 장애, 임상 과정 및 가족 집적성의 측면에서 그 특징이 규명되어 왔다. 건강한 대조군과 비교하여, 야식 증후군을 앓는 인간은 열량의 상당히 큰 비율을 저녁 식사 후에 소비하고, 밤에 보다 자주 깨며, 대조군에 비해 눈뜬 후 식사하는 경향이 높다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 무독성 담체와 함께 제제화된 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 고체 또는 액체 제형의 경구 투여용, 비경구 주사용 또는 직장 투여용으로 특별히 제제화될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 무독성의 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제제 보조제를 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있는 일부 물질의 예로는, 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아버터 및 좌제용 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스터, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열성 물질-제거 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알코올 및 인산 완충 용액이 있으며, 또한 기타 무독성의 상용가능한 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트; 및 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향제, 방향제, 보존제 및 항산화제가 조제자의 판단에 따라 상기 조성물 중에 존재할 수 있다. 본 발명은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 무독성 담체와 함께 제제화된 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 고체 또는 액체 제형의 경구 투여용, 비경구 주사용, 또는 직장 투여용으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 환자들에게 경구, 비경구, 복강내, 국소(분말, 연고 또는 점적제에 의해), 구강내 투여되거나, 경구 또는 비강 분무제로서 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하, 관절내 주사 및 주입을 포함한 투여 방식을 지칭한다.

비경구 주사를 위한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유) 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스터가 포함된다. 예컨대, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다.

이 조성물들은 또한, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제들을 함유할 수 있다. 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 미생물의 활동을 예방할 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 주사용 약학 제형의 연장된 흡수를 초래할 수 있다.

일부의 경우, 약물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터의 약물 흡수를 둔화시키는 것이 종종 바람직하다. 이는 불량한 수용성을 갖는 결정형 또는 무정형 물질의 액상 현탁액을 이용함으로써 달성될 수 있다. 이 경우 약물의 흡수 속도는, 결정 크기 및 결정형에 따라 좌우되는 용출 속도에 의존한다. 대안적으로, 비경구 투여되는 약물 제형의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.

현탁액은, 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1 외에도, 예컨대 에톡시화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스터, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 트라가칸트 및 이들의 혼합물과 같은, 현탁화제를 함유할 수 있다.

바람직한 경우, 보다 효과적인 분포를 위해, 본 발명의 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1은, 중합체 매트릭스, 리포좀 및 마이크로스피어와 같은 서방형 시스템 또는 표적-전달 시스템 내에 혼입될 수 있다. 이들은 예컨대, 박테리아-보유 필터를 통한 여과, 또는 사용 직전에 멸균수 또는 일부 다른 멸균 주사용 매질에 용해시킬 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균제 혼입에 의해 멸균될 수 있다.

그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1은, 적절한 경우 앞서 언급된 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 마이크로캡슐화된 제형일 수 있다. 정제, 당의정(dragee), 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여 제형은 장용성 코팅, 방출 제어형 코팅 및 의약 제제 분야에 잘 알려진 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘(shell)을 사용하여 제조될 수 있다. 이와 같은 고체 투여 제형에서, 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1은, 1종 이상의 불활성 희석제, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합될 수 있다. 이러한 투여 제형은 또한, 통상의 경우에서처럼, 불활성 희석제 이외의 추가 물질, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 및 미정질 셀룰로스와 같은, 타정 윤활제 및 기타 타정 보조제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 상기 투여 제형들은 완충제를 또한 포함할 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 또한 지연된 방식으로 장관의 특정 부위에서 활성 성분(들)만을 방출하거나, 활성 성분(들)을 우선적으로 방출하는 조성물로 이루어질 수 있다. 사용될 수 있는 포매용(embedding) 조성물은 중합체 물질 및 왁스를 포함한다.

주사용 저장(depot) 제형은 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체 내에 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 기타 생분해성 중합체의 예로는 폴리(오르쏘에스터) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 또한, 주사용 저장 제제는 약물을 신체 조직과 적합성을 갖는 리포솜 또는 마이크로에멀젼 내에 포획시킴으로써 제조될 수 있다.

주사용 제제는 예컨대, 박테리아-보유 필터를 통한 여과, 또는 사용 직전에 멸균수 또는 기타 멸균 주사용 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물 형태인 멸균제의 혼입에 의해 멸균시킬 수 있다.

주사용 제제, 예컨대 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은, 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한, 비경구용으로 허용가능한 무독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예컨대 1,3-부탄다이올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적으로, 합성 모노- 또는 다이글라이세라이드를 포함한 임의의 무자극, 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사 제제의 제조에 사용된다.

경구 투여용 고체 투여 제형으로는 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립이 포함된다. 이러한 고체 투여 제형에서, 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1은, 나트륨 시트레이트 또는 칼슘 포스페이트와 같은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체 및/또는 a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 살리실산; b) 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스 및 아카시아; c) 보습제, 예컨대 글리세롤; d) 붕해제, 예컨대 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨; e) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; f) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; g) 습윤제, 예컨대 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; 및 i) 윤활제, 예컨대 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물과 함께 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 상기 투여 제형은 완충제를 또한 포함할 수 있다.

또한, 락토스 또는 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용한 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서, 유사한 종류의 고체 조성물이 충전제로서 사용될 수 있다.

정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여 제형은 장용성 코팅 및 의약 제제 분야에 잘 알려진 기타의 코팅과 같은 코팅 및 쉘을 사용하여 제조될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있고, 또한 지연된 방식으로 장관의 특정 부위에서 활성 성분(들)만을 방출하거나, 활성 성분(들)을 우선적으로 방출하는 조성물로 이루어질 수 있다. 사용될 수 있는 포매용 조성물은 중합체 물질 및 왁스를 포함한다.

경구 투여용 액체 투여 제형으로는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제가 포함된다. 액체 투여 제형은 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1 외에, 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 다이메틸포름아마이드, 오일(특히, 면실유, 땅콩 기름, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.

불활성 희석제 이외에, 경구용 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 현탁화제, 감미제, 착향제 및 방향제와 같은 보조제들을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물 중의 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1의 실제 투여량 수준은, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료적 반응을 달성하는데 효과적인 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1의 양을 얻기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 특정 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제의 활성, 투여 경로, 치료받는 상태의 중증도 및 치료 대상 환자의 상태 및 과거 병력에 따라 좌우될 것이다.

환자에게 투여되는 본 발명의 그렐린 수용체 역작용제 또는 길항제, 특히 실시예 1의 총 1일 투여량은 약 0.003 mg/kg/일 내지 약 10 mg/kg/일이다. 경구 투여 목적으로 보다 바람직한 투여량은 약 0.01 mg/kg/일 내지 약 5 mg/kg/일의 범위일 수 있다. 바람직한 투여량은 25 mgs/일 내지 300 mgs/일이다. 가장 바람직하게는 75 mgs/일 내지 200 mgs/일이다. 바람직한 경우, 상기 1일 유효 투여량은 투여 목적으로 복수의 투여량, 예컨대 1일당 2회 내지 4회의 개별 투여량으로 나뉠 수 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 참조 문헌들은 참조에 의해 본원에 전체로서 통합된다.

(R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온은 본 명세서 또는 미국 특허공개 제2011/0230461호에 개시되어 있는 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

실시예 1

(R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온

2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)아세트산 하이드로클로라이드

아세트산(1000 mL) 중 에틸 3-옥소부타노에이트(355 g, 2.73 mol)의 용액에 아세트산(750 mL) 중 브롬(436 g, 2.73 mol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하고, 45℃에서 감압 하에 농축시켜 아세트산을 제거하였다. 잔여물을 메틸렌 클로라이드(400 mL)와 물(250 mL) 사이에서 분배시켰다. 유기층을 포화 중탄산나트륨(2 x 300 mL), 물(300 mL), 염수(125 mL)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고 농축시켜 황색 오일로서 에틸 4-브로모-3-옥소부타노에이트(421 g)를 수득하였다.

아세톤(1500 mL) 중 2-아미노-5-메틸싸이아졸(150 g, 1.31 mol)의 용액에 에틸 4-브로모-3-옥소부타노에이트(345 g, 1.65 mol)를 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물의 온도를 22 내지 40℃ 사이로 유지시켰다. 혼합물이 농후한 페이스트 상태로 되었고, 교반을 촉진하기 위해 아세톤(300 mL)을 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과 케이크를 아세톤으로 세척하여 백색 고체를 수득하였다. 상기 고체를 헥산으로 세척하고, 40℃에서 4시간 동안 진공 오븐에서 건조시켜 4-(2-아미노-5-메틸-싸이아졸)-3-옥소부티르산 에틸 에스터 하이드로브로마이드(272 g)를 수득하였다.

4-(2-아미노-5-메틸-싸이아졸)-3-옥소부티르산 에틸 에스터 하이드로브로마이드(272 g, 0.84 mol)에 무수 에탄올(675 mL)을 첨가하고, 농후한 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 가열하였다. 이 시간 동안, 고체가 용액 상태가 되었다. 반응 혼합물을 농축시켜 갈색의 반고체를 얻었으며, 이를 에탄올로 마쇄(trituration)하여 백색의 부드러운 고체를 수득하고, 이를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 Et₂O로 세척하고 40℃에서 진공하에 4시간 동안 건조시켜 에틸-(2-메틸이미다조[2,1-b][1,3]싸이아졸-6-일)아세테이트 하이드로브로마이드(226 g)를 수득하였다.

에틸-(2-메틸이미다조[2,1-b][1,3]싸이아졸-6-일)아세테이트 하이드로브로마이드(226 g, 0.74 mol)를 물(350 mL)에 용해시키고, 탄산칼륨(51.0 g, 0.37 mol)을 첨가하여 상기 용액을 pH 7로 조정하였다. 상기 수용액을 메틸렌 클로라이드(300 mL)로 추출하고, 유기상을 염수(150 mL)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 갈색 오일로서 에틸-(2-메틸이미다조[2,1-b][1,3]싸이아졸-6-일)아세테이트(151.3 g)를 수득하였다.

에틸-(2-메틸이미다조[2,1-b][1,3]싸이아졸-6-일)아세테이트(151.3 g, 0.67 mol)를 10% HCl 수용액(435 mL)에 용해시키고, 혼합물을 2시간 동안 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 진공에서 농축하여 황색 오일을 얻었다. 에탄올(100 mL) 및 다이에틸에테르(200 mL)를 첨가하고, 얻어진 백색 침전물을 여과에 의해 수집하고, 밤새 진공 오븐에서 건조시켜 144.3 g(93%)의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ES+) 197.1 (M+H)⁺. ¹H NMR (CD₃OD) δ 2.48 (s, 3H), 3.88 (s, 2H), 7.81 (s, 1H), 7.85 (s, 1H).

(R)-5-브로모-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민

22 L 5목 둥근바닥 플라스크에 5-브로모-1-인단온(1.0 kg, 4.72 mol), 무수 THF(8 L) 및 (R)-메틸-CBS-옥사자보롤리딘(730 mL, 0.73 mol)을 넣고, N₂ 하에서 -10℃까지 냉각시켰다. 온도를 -5℃ 미만으로 유지하면서 보레인-메틸설파이드(10.0 M, 650 mL, 6.5 mol)를 1시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 -10℃ 내지 0℃에서 3시간 동안 교반하고, 반응 온도를 5℃ 미만으로 유지하기 위한 속도로 물(4 L)로 퀀칭(quenching)하였다. 혼합물을 EtOAc(3 x 3 L)로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 염수(2 L)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 황색 고체를 얻었다. 조 생성물을 짧은 실리카겔 컬럼(헥산 중 1% Et₃N으로 충전된 3 L 실리카겔)을 통과시키고, EtOAc/헥산(1/3)으로 용리시켰다. 여과물을 농축하고, 잔여물을 헥산 중 10% EtOAc를 사용하여 슬러리 상태로 만들고, 여과하고, 건조시켜 (S)-5-브로모-인단-1-올로서 585 g의 황백색 고체를 얻었다. 모액을 재농축시키고, 헥산 중 10% EtOAc를 사용하여 슬러리 상태로 만들고, 여과하여 (S)-5-브로모-인단-1-올로서 200 g의 황색 고체를 추가로 얻었다. 추가의 정제 없이, 모은 로트(785 g, 78%)에 대해 후속 단계를 수행하였다.

톨루엔(2 L) 중 (S)-5-브로모-인단-1-올(288 g, 1.35 mol)의 용액을 질소 하에 빙욕에서 냉각시키고, 하나의 분획을 다이페닐포스포릭 아자이드(DPPA, 400 mL, 1.85 mol)로 처리한 후에, 톨루엔(600 mL) 중 1,8-다이아자바이사이클로[5,4,0]운데크-7-엔(300 mL, 2.01 mol)의 용액으로 처리하였다. 3시간의 첨가 동안 반응 온도를 3 내지 10℃로 유지시키고, 혼합물을 3시간에 걸쳐 15℃로 가온하였다(TLC가 출발 물질을 나타내지 않음). 혼합물을 EtOAc(1 L)로 희석시키고, 물(3 x 2 L)로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 어두운 색의 오일 516 g을 수득하였다. 조 생성물을 실리카겔 컬럼(헥산 중 1% Et₃N으로 충전됨, 헥산 용리액)에 의해 정제하여 오일로서 (R)-1-아지도-5-브로모-인단(291 g, 90%)을 수득하여, 후속 단계에 바로 사용하였다.

(R)-1-아지도-5-브로모-인단(154 g, 0.645 mol) 용액을 메탄올(2.4 L)에 용해시키고, SnCl₂·2H₂O(265 g, 1.18 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고(TLC가 출발물질을 나타내지 않음), 건조 상태까지 농축시켰다. 얻어진 잔여물을 2N NaOH 수용액(2.5 L) 및 EtOAc(1.5 L)로 처리하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, EtOAc(3 x 250 mL)를 사용하여 셀라이트(등록상표)를 통해 여과시켰다. 유기 용액을 분리하고, 수성층을 EtOAc(3 x 2 L)로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 1N HCl(2 x 2 L)로 세척한 후 물(2 L)로 세척하였다. 모은 수성층의 pH는 차가운 포화 NaOH 수용액을 사용하여 11로 조정하였고, 혼합물을 EtOAc(3 x 2 L)로 추출하였다. 모은 유기 추출물을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 짙은 황색 오일로서 (R)-5-브로모-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민(87.5 g, 64.0%)을 수득하였으며, 이를 냉장하여 응고시켰다. MS (ES+) 213.9 (M+H)⁺. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.70-1.75 (m, 1 H), 2.40-2.45 (m, 1 H), 2.77-2.82 (m, 1 H), 2.93-2.97 (m, 1 H), 4.28-4.33 (m, 1 H), 7.18-7.23 (m, 1 H), 7.36-7.41 (m, 2 H).

tert-부틸 4-(클로로메틸)-4-포르밀피페리딘-1-카르복실레이트

오븐-건조시킨 둥근바닥 플라스크 내의 무수 THF(140 mL) 중 다이이소프로필아민(22.6 mL, 159 mmol)의 용액에, 0℃에서 n-BuLi(65.4 mL, 163 mmol, 헥산 중 2.50 M)를 적가하였다. 용액을 45분 동안 교반하고, 0℃에서 THF(60 mL) 중 1-tert-부틸 4-메틸피페리딘-1,4-다이카르복실레이트(20 g, 80 mmol)를 적가하고, 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하였다. 클로로요오도메탄(17.9 mL, 239 mmol)을 적가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 250 mL의 포화 NaHCO₃ 수용액으로 퀀칭한 후, 에틸 아세테이트(3 x 250 mL)로 추출하였다. 모은 유기층을 세척하고(염수, 250 mL), 건조시키고(Na₂SO₄), 감압 하에 농축하여 황색 오일을 얻었으며, 이를 콤비플래시(Combiflash) ISCO 정제 시스템(텔레다인 이스코 인코포레이티드, 링컨, NE)을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 1-tert-부틸 4-메틸 4-(클로로메틸)피페리딘-1,4-다이카르복실레이트(12 g, 52%)를 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.43 (s, 9H), 2.10-2.17 (m, 4H), 2.97 (br s, 2H), 3.56 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.83 (br s, 2H).

무수 THF(100 mL) 중 1-tert-부틸 4-메틸 4-(클로로메틸)피페리딘-1,4-다이카르복실레이트(11.7 g, 40.2 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 리튬 알루미늄 하이드라이드(THF 중 1N, 44.3 mL, 44.3 mmol)를 서서히 첨가하고(15 내지 20분), 용액을 0℃에서 25분 동안 교반하였다. 물(1.8 mL)을 매우 조심스럽게 적가하여 혼합물을 퀀칭하였다. 1N NaOH 수용액(1.8 mL)을 적가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 냉각조를 제거하고, 고체를 여과해내고, 케이크를 Et₂O(2 x 100 mL)로 세척하였다. 여과물을 물(2 x 100 mL), 염수(100 mL)로 세척하고, 건조시키고(NaSO₄) 감압 하에 농축시켜 고체 상태의 tert-부틸 4-(클로로메틸)-4-(하이드록시메틸)피페리딘-1-카르복실레이트(9.96 g, 93.8%)를 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.43 (s, 9H), 1.48-1.55 (m, 4H), 3.36-3.41 (m, 4H), 3.57 (s, 2H), 3.59 (br s, 2H).

오븐-건조시킨 둥근바닥 플라스크 내의 다이클로로메탄(100 mL) 중 옥살릴 클로라이드(5.1 mL, 57 mmol)의 -78℃ 용액에, 다이클로로메탄(17 mL) 중 다이메틸설폭사이드(8.2 mL, 114 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2분 동안 교반하고, 다이클로로메탄(50 mL) 중 tert-부틸 4-(클로로메틸)-4-(하이드록시메틸)피페리딘-1-카르복실레이트(13.7 g, 52 mmol)를 10분에 걸쳐 첨가하였다. 용액을 -78℃에서 15분 동안 교반하고, 트라이에틸아민(36 mL, 260 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반하고, 실온으로 가온시켰다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, NaHCO₃ 포화 수용액(200 mL)으로 퀀칭시켰다. 수용액을 Et₂O(2 x 300 mL)로 세척하였다. 모은 유기층을 염수로 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄), 감압 하에 농축하여 황색 오일로서 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 실온에서 질소 대기하에 정치시켜 응고시켰다(13.7 g, 99%). ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.43 (s, 9H), 1.48-1.60 (m, 2H), 2.00-2.07 (m, 2H), 3.07 (t, 2H), 3.57 (s, 2H), 3.69-3.79 (m, 2H), 9.55 (s, 1H).

(R)-tert-부틸 2-(5-브로모-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-카르복실레이트

무수 메탄올(24 L) 중 (R)-5-브로모-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민(1835 g, 8.66 mol)의 용액에 tert-부틸 4-(클로로메틸)-4-포르밀피페리딘-1-카르복실레이트(2310 g, 8.83 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 16시간 동안 교반하고, 실온까지 냉각시켰다. 시린지 펌프를 통해 THF(15 L) 중 나트륨 사이아노보로하이드라이드(1000 g, 15.9 mol)를 2시간에 걸쳐 첨가하였다. 상기 혼합물을, 표백조로 통하는 환풍구를 사용하여 질소 하에 24시간 동안 60℃에서 교반하였다. 반응물을 20℃로 냉각시키고, 캐뉼라를 통하여 2.5 M 수산화나트륨 24 L 및 DCM 30 L를 함유하는 용기 내로 옮겼다. 층을 분리하고, 수성층을 DCM(2 x 5 L)으로 추출하였다. 수성층을 처리하여 잔여 나트륨 사이아노보로하이드라이드를 분해시켰다. 모은 유기층을 건조시키고(MgSO₄) 감압 하에 농축하였다. 40℃에서 1시간, 및 실온에서 1시간 동안 교반함으로써 조 물질을 MTBE(7 L) 중에 슬러리화하였다. 고체를 여과하고, MTBE(2 x 500 mL)로 세척하고, 50℃에서 진공 오븐하에 건조시켜 표제 생성물을 백색 결정(3657 g, 90%)으로서 수득하였다. MS (ES+) 422.3 (M+H)⁺. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.44 (s, 9H), 1.67 (dd, 4H), 1.84-1.93 (m, 1H), 2.07-2.16 (m, 1H), 2.72-2.81 (m,1 H), 2.95-3.15 (m, 5H), 3.31 (dd, 4H), 3.85 (br s, 1H), 7.12 (d, 1H), 7.28 (br s, 1H), 7.35 (br s, 1H).

= +39.6 deg (c = 1.06 mg/mL, MeOH).

(R)-tert-부틸 2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-카르복실레이트

(R)-tert-부틸 2-(5-브로모-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-카르복실레이트(4.0 g, 9.49 mmol)가 담긴 50 mL 플라스크에, 비스(트라이페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드(0.17 g, 0.24 mmol), 칼륨 아세테이트(3.73 g, 37.97 mmol), 비스(피나콜라토)다이보론(2.65 g, 10.44 mmol)을 첨가한 후, 진공을 통해 탈기시키고, 질소로 5회 재충전시켰다. 상기 혼합물에 탈산소화된(첨가 전 30분의 질소 스트림) 톨루엔(40 mL)을 첨가하고, 반응물을 100℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. HPLC에 의해 반응의 종료여부를 모니터링하였다. 보론산 에스터 반응중간체가 생성된 후, 반응물을 40℃로 냉각시키고, 4 M 수산화나트륨(11.87 mL, 47.46 mmol)의 탈기된 용액을 넣은 후 4-클로로-6-메틸피리미딘(1.53 g, 11.87 mmol)을 첨가하였다. 그 다음, 얻어진 혼합물을 질소 하에 5시간 동안 90℃에서 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 물(25 mL)을 채웠다. 20분 동안 교반한 후에, 혼합물을 여과하여 흑색 고체를 제거하였다. 유기층을 추출하여 1.5 당량의 HCl(40 mL)을 함유하는 수용액을 얻었다. 유기층을 제거하고, 얻어진 용액을 (4 g) ISOLUTE(등록상표) 울트라퓨어 Si-싸이올 실리카겔로 1.5시간 동안 처리하고 여과하였다. 4N NaOH를 사용하여 수용액을 pH 7.8로 조정하고, 톨루엔(40 mL)으로 추출하였다. 톨루엔 층을 45℃에서 진공하에 약 15 mL로 농축하고, 헵탄(75 mL)을 서서히 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성물을 여과하고, 45℃에서 8시간 동안 진공하에 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물(3.56 g, 86%)을 수득하였다. MS (ES+) 435.5 (M+H)⁺. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.46 (s, 9 H), 1.70-1.74 (m, 4 H), 1.90-2.01 (m, 1 H), 2.13-2.26 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.84-2.93 (m, 1 H), 3.04-3.21 (m, 5 H), 3.30-3.38 (m, 4 H), 3.95-4.02 (m, 1 H), 7.40 (d, 1 H), 7.56 (s, 1 H), 7.87 (d, 1 H), 7.95 (s, 1 H), 9.12 (s, 1 H).

2-[(R)-5-(6-메틸-피리미딘-4-일)-인단-1-일]-2,7-다이아자-스피로[3.5]노난 다이하이드로클로라이드

(R)-tert-부틸 2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-카르복실레이트(72.6 g, 167 mmol)를 메탄올(363 mL) 중에 현탁시키고, 1,4-다이옥산(251 mL) 중 4 M HCl을 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 슬러리를 건조 상태로 농축시켰다. 조 물질을 MeOH(500 mL) 중에 재현탁시키고, 농축시켰다(3x). 얻어진 고체를 진공 하에 45℃에서 추가로 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다(74.1 g, 99.9%). MS (ES+) 335.2 (M+H)⁺. ¹H NMR (CD₃OD) δ 2.16-2.23 (m, 5H), 2.59 (br s, 1 H), 2.78-2.80 (m, 3H), 3.12 (br s, 1H), 3.19-3.24 (m, 4H), 3.37-3.49 (m, 1H), 4.14-4.23 (m, 3H), 4.49 (br s, 1H), 5.11 (br s, 1 H), 7.84 (d, 1H), 8.30-8.34 (m, 2H), 8.46 (s, 1H), 9.36 (s, 1H).

10 mL 다이클로로메탄 중 2-[(R)-5-(6-메틸-피리미딘-4-일)-인단-1-일]-2,7-다이아자-스피로[3.5]노난 다이하이드로클로라이드(540 mg, 1.22 mmol)의 현탁액에 트라이에틸아민(492 mg, 4.90 mmol)을 첨가하였다. 혼합물이 균일한 용액이 된 후, 이를 3 mL 다이클로로메탄 중 2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)아세트산 하이드로클로라이드(251 mg, 1.28 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하고, 2 mL의 DMF 중 HBTU(462 mg, 1.22 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 10 mL의 NaHCO₃을 첨가하여 반응을 퀀칭시키고, 50 mL의 다이클로로메탄으로 희석시켰다. 유기층을 포화 염수로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔여물을 5 mL CH₃CN에 용해시키고, 용액을 교반하면서 1시간 동안 100℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 얻어진 고체를 진공 여과하여 황백색 분말로서 원하는 생성물(428 mg, 69%)을 수득하였다. MS (ES+) 513.5 (M+H)⁺. ¹H NMR (CD₃OD) δ 1.70-1.74 (m, 4 H), 1.88-1.96 (m, 1 H), 2.27-2.34 (m, 2 H), 2.40 (s, 3H), 2.58 (s, 3 H), 2.86-2.97 (m, 1 H), 3.11-3.15 (m, 1 H), 3.31-3.34 (m, 3 H), 3.52-3.55 (m, 4 H), 3.78 (s, 2 H), 4.05-4.09 (m, 1 H), 7.33 (s, 2 H), 7.55 (d, 1 H), 7.78-7.79 (m, 1 H), 7.94-8.03 (m, 2 H), 8.93 (s, 1 H).

= +45.3 deg (c = 2.5 mg/mL, MeOH).

시험관내 ( in vitro ) 분석

방사성 리간드 결합 분석

시험 화합물이 그렐린 수용체에 결합하는 능력 및 그에 따라 그렐린 활성을 조절하는 능력을 갖는지 여부를 측정하기 위해, 방사성 리간드 이동 분석을 수행하였다. 시험 화합물의 고효율 스크리닝을 위해 SPA 포맷을 사용하였고, 보다 종합적인 결합 특성분석을 위해 필터 결합이 사용되었다. 두 포맷 모두에서, 시험 화합물 친화성을, 방사성 리간드의 주어진 농도에서 특정 막 배치에 대한 [¹²⁵I] 그렐린 결합을 50% 감소시키기 위해 요구되는 화합물의 농도로서 정의되는 K_i 값으로 표시한다.

환자 그렐린 SPA 결합 분석

0.5 mg SPA 비드(소맥배아응집소 코팅, GE 헬스케어, RPNQ0060)에 결합된 250 ng의 환자 GHSR1a(환자 성장 분비촉진제 수용체 1a를 발현하는 HEK293 테트라사이클린-유도성 세포주; 막으로서 제조됨) 및 50 pM [¹²⁵I] 그렐린(퍼킨 엘머 라이프 사이언스, NEX-388), 그리고 다양한 농도의 시험 화합물 또는 비히클을 포함하는 90 ㎕의 최종 부피로 그렐린 SPA 결합 분석을 수행하였다.

간단하게는, 실온에서 DMSO 중 시험 화합물(또는 비히클로서 DMSO) 2 ㎕를 함유하는 384-웰 플레이트(매트릭스, 4322)에서 분석을 준비하였다. 28 ㎕의 분석 완충액(50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 0.2% BSA, EDTA-제거된 프로테아제 억제제 -- 1 정제/50 mL 완충액, pH 7.4), 분석 완충액 중에 존재하는 30 ㎕의 8.3 ㎍/mL hGHSR1a 막 및 30 ㎕의 150 pM [¹²⁵I] 그렐린을 첨가함으로써 분석을 시작하였다.

혼합물을 8시간 동안 인큐베이션시켜 결합이 평형 상태에 도달하도록 하고, 1450 마이크로베타 트릴럭스(Microbeta Trilux)(왈락)를 사용한 액체 섬광 계수에 의해 수용체-리간드 복합체의 양을 측정하였다.

환자 그렐린 필터 결합 분석

100 ng의 환자 GHSR1a(환자 성장 분비촉진제 수용체 1a를 발현하는 HEK293 테트라사이클린-유도성 세포주; 막으로서 제조됨) 및 50 pM [¹²⁵I] 그렐린(퍼킨 엘머 라이프 사이언스, NEX-388), 그리고 다양한 농도의 시험 화합물 또는 비히클을 포함하는 100 ㎕의 최종 부피로 그렐린 결합 분석을 수행하였다.

간단하게는, 실온에서 DMSO 중 시험 화합물(또는 비히클로서 DMSO) 2 ㎕를 함유하는 96-웰 플레이트(코스타, 3357)에서 분석을 준비하였다. 23 ㎕의 분석 완충액(50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 0.2% BSA, EDTA-제거된 프로테아제 억제제 정제 -- 1 정제/50 mL 완충액, pH 7.4), 분석 완충액 중에 존재하는 25 ㎕의 4 ㎍/mL hGHSR1a 막 및 50 ㎕의 100 pM [¹²⁵I] 그렐린을 첨가함으로써 분석을 시작하였다.

혼합물을 실온에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 0.3% PEI-처리된 96-웰 유리 섬유 여과 플레이트(퍼킨 엘커, 6005174)로 옮겼다. 혼합물을 진공으로 흡인 건조시키고, 즉시 200 ㎕의 얼음처럼 찬 50 mM 트리스 pH 7.5로 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 밤새 건조시키고, 각각의 웰에 30 ㎕의 수퍼믹스 섬광제(퍼킨 엘머, 1200-439)를 첨가하였다. 1450 마이크로베타 트릴럭스(왈락)를 사용한 액체 섬광 계수에 의해 수용체-리간드 복합체의 양을 측정하였다.

사용된 막의 최종량이 하기와 같았다는 점을 제외하고는, 환자 GHSR1a에 대해 기술된 것과 동일한 방식으로 개(NM_001099945.1), 원숭이(XM_001084886.1), 마우스(NM_177330) 및 랫트(NM_032075) GHSR1a(모두 고유의 HEK293 테트라사이클린-유도성 세포주에서 발현됨)에 대한 방사성 리간드 결합 여과 포맷 분석을 수행하였다: 2 ㎍ 개 GHSR, 250 ng 원숭이 GHSR, 200 ng 마우스 GHSR, 또는 125 ng 랫트 GHSR.

환자 그렐린 기능 분석

환자 GHSR1a의 활성을 조절하는(작용성, 길항성, 부분작용성, 역작용성) 시험 화합물의 능력을 측정하기 위해, DELFIA GTP-결합 분석(퍼킨 엘머, AD0260 및 AD0261)을 수행하였다. 분석은 GDP의 GTP로의 리간드-의존성 교환을 모니터링한다. GPCR 활성화는 수용체-결합된 GDP가 유로피움-표지된 GTP로 대체됨에 따라 형광의 증가를 초래한다. 길항제 결합은 GDP-GTP 교환을 방지하는 반면, 역작용제의 결합은 수용체를 GDP 결합(불활성) 상태로 만들며, 이들 모두는 형광의 감소를 초래한다.

720 ng의 환자 GHSR1a(환자 성장 분비촉진제 수용체 1a를 발현하는 HEK293 테트라사이클린-유도성 세포주; 막으로서 제조됨), 9 nM의 GTP-유로피움 및 다양한 농도의 시험 화합물 또는 비히클을 포함하는 39.5 ㎕의 최종 부피로 그렐린 기능 분석을 수행하였다. 수용체 길항작용을 시험하기 위해, EC₅₀농도의 작용제 그렐린(아나스펙, 24158) 및 시험 화합물 또는 비히클의 존재 하에 막을 인큐베이션시켰다.

간단하게는, 시험 화합물을 실온에서 384-웰 플레이트(매트릭스, 4340)에 준비하였다. 시험 화합물을 먼저 DSMO에 희석시킨 다음, 9 nM 그렐린 펩타이드를 포함하거나 포함하지 않는 10 ㎕의 기초 완충액(50 mM HEPES pH 7.4, 3.7 mM MgCl₂, 250 μM EGTA, 125 nM GDP)에 15 ㎕ 첨가하였다. 그 다음, 샘플 6 ㎕를, 기초 완충액 중 30 ㎕의 24 ㎍/mL hGHSR1a 막 및 0.35 mg/mL 사포닌(퍼킨 엘머, AD0261)을 함유하는 384-웰 필터 플레이트(팔, 5071)로 옮겼다.

혼합물을 약하게 진탕하면서 실온에서 24분 동안 인큐베이션시킨 후, 50 mM HEPES, pH 7.4 중의 100 nM GTP-유로피움 3.5 ㎕를 첨가하였다. 샘플을 빛으로부터 차단시키고, 가볍게 진탕하면서 실온에서 90분 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 반응물을 진공으로 흡인 건조시키고, 75 ㎕의 얼음처럼 찬 1x GTP 워시 용액(퍼킨 엘머, AD0261)으로 3회 세척하고, 즉시 여기 필터 320 nm 및 방출 필터 615 nm를 사용한 인비젼 2101 멀티라벨 리더(퍼킨 엘머) 상에서 판독하였다.

환자 분산된 췌도(Islet) 세포 분석

1일차: 정맥(iv) 백 내의 환자 췌도 세포를 수득하였다. iv 백에 커플러를 부착하여 췌도 세포를 경사분리시키고, 50 mL 원뿔형 관으로 액체를 따라내었다. 백을 20 mL의 매질로 세정하고, 풀링(pooling)하였다. 세포들을 1000 회전수/분(rpm)으로 1분간 회전시켰다. 그 다음, 세포를 37℃, 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션시켰다(10 cm² 현탁 디쉬, 10 mL 매질/플레이트).

2일차: 췌도 세포를 50 mL 원뿔형 관으로 옮기고, 칼슘을 포함하지 않는 행크 워킹 완충액을 첨가하여 혼합한 다음, 혼합물을 1000 rpm으로 1분 동안 회전시켰다. 그 다음, 췌도 세포들을 칼슘을 포함하지 않는 행크 워킹 완충액으로 세척하고, 혼합한 다음 1분 동안 1000 rpm으로 회전시켰다. 15 mL를 제외한 모든 완충액을 피펫으로 제거하였다. 그 다음, 30 ㎕의 500 mM EDTA[1 mM]를 첨가한 후, 실온에서 8분 동안 인큐베이션시켰다. 여기에 75 ㎕의 0.25 % 트립신-EDTA 및 15 ㎕의 2mg/mL DNAse I[2 ㎍/mL]을 첨가하였다. 혼합물을 60 rpm으로 진탕하면서, 30℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 덩어리는 1 mL 피펫으로 마쇄(50회)하여 분산시켰다. 50 mL의 배양 매질을 첨가하고, 각각을 63 μM 나일론 막 상에 통과시켰다. 혼합물을 1000 rpm으로 1분 동안 회전시킨 후, 피펫으로 매질을 제거하였다. 펠렛을 재현탁시키고, 세포를 약 25 mL의 배양 매질로 다시 세척하고 1분 동안 1000 rpm으로 회전시켰다. 그 다음, 상청액을 제거하고, 펠렛을 약 5 mL의 배양 매질로 재현탁시키고, 세포를 계수하였다. "V"자 바닥 플레이트에 5000 세포/웰(200 ㎕/웰)을 접종하였다. 플레이트를 1000 rpm으로 5분 동안 회전시키고, 세포 배양 인큐베이션에 두었다. 칼슘 영상을 위해 600,000개의 세포를 제거하였다.

3일차: 분산된 췌도 세포 분석

배양 매질을 3 mM 글루코스를 함유하는 100 ㎕의 인큐베이션 완충액으로 교체하였다. 플레이트를 1000 rpm으로 5분 동안 회전시켜 췌도 세포를 다시 펠렛화하였다. 플레이트를 95% O₂/5% CO₂를 계속적으로 공급한 37℃ 수조에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 예비-인큐베이션 완충액을, 적절한 농도의 글루코스 (각 샘플에 대해 n = 4) 중 다양한 시험 화합물을 함유하는 50 ㎕의 인큐베이션 완충액으로 교체하였다. 플레이트를 1000 rpm으로 5분 동안 회전시켜 세포를 다시 펠렛화하였다. 플레이트를 95% O₂/5% CO₂를 계속적으로 공급한 수조 내에서 60분 동안 다시 두었다. 40 ㎕를 다른 플레이트로 옮기고, ELISA 환자 인슐린 분석(ALPCO 환자 인슐린 ELISA; ALPCO(미국 뉴 햄프셔 살렘)에서 시판되는 주문번호 80-INSHU-E10)을 사용하여 인슐린 분석을 수행하였다.

실시예 1에 대해, 표 1에 제시된 약리 데이터를 얻었다. 환자 그렐린 SPA 결합 분석으로부터 IC₅₀(5.02 nM) 및 K_i 데이터(4.37 nM)를 얻었다. "n"으로 표시된 컬럼은 시험 화합물의 분석 횟수이다. 환자 그렐린 기능 분석을 사용하여 시험 화합물의 기능이 역작용제인 것으로 결정하였다.

시험관내 분석	실시예 1 예비-인큐베이션	K _d / K _i / EC50 / IC50 ( nM )	K _i / EC50 / IC50 ng / mL	n
인간 결합
인간 GHS-1aR SPA	8 시간	4.37	2.24	10
인간 GHS-1aR 필터	90 분	2.49	1.28	52
인간 GHS-1aR 필터	24 시간	1.42	0.728	44
인간 GHS-1aR 필터 모툴스키	평형 4.07 시간	3.04	1.56	8
전임상 종 결합
랫트 GHS-1aR 필터	90 분	3.19	1.64	49
마우스 GHS-1aR 필터	90 분	7.70	3.95	15
개 GHS-1aR 필터	90 분	3.56	1.83	9
영장류 GHS-1aR 필터	90 분	1.83	0.938	8
인간 기능
Eu-GTP 역작용제	114 분	4.85	2.49	16
Eu-GTP 길항제	114 분	6.57	3.37	16
Eu-GTP 경쟁적 길항제	120 분	1.75	0.90	10

GHS-1aR = 성장 호르몬 분비촉진제 수용체; Eu-GTP = 유로피움-구아노신-5'-트라이포스페이트; GH = 성장 호르몬

실시예 1은 강력하고(환자 그렐린 필터 결합 분석에 의한 인간 K_d = 3 nM; 종별로 유사함), 선택적이며(광범위한 패널의 수용체, 수송체, 이온 채널 및 효소에 대해 IC₅₀ > 1 μM), 성장 호르몬 분비촉진제 수용체(GHS-1aR)의 중등도의 온/오프 역작용제, 경쟁적 길항제이다.

생체내 분석

보행성 활동량에 대한 실시예 1의 효과를 평가하기 위해, 21시간에 걸쳐 수컷 위스타 한 랫트에 단일 투여량(1, 10, 50 또는 150 mg/kg)의 (R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온(실시예 1)을 경구용 위관 삽입 튜브를 통해 투여하였다(도 1). 투약 1시간 전에 동물들을 보행 기구에 길들였다. 오후 4시에 소등하고, 오전 4시에 점등하였다. 동물들에게 오후 4시에 투약하였다. 투약 후 20시간 동안 활동량을 모니터링하였다. T_max(투약 30분 후)에, 동물들의 위성군(satellite group)으로부터 혈장, 뇌 및 뇌척수액을 채취하였다.

투약 35 내지 65분 후, 비히클 처리 동물과 비교하여 1 mg/kg 투여군에서 생물학적 또는 통계학적으로 유의한 효과는 관찰되지 않았다. 10 mg/kg에서, 실시예 1은 투약 35 내지 65분 후에 상동성 행동량(rearing)을 56% 감소시켰으며, 총 보행성 활동량을 60% 감소시켰다. 50 mg/kg에서, 실시예 1은 상동성 행동량을 43%, 총 보행성 활동량을 48% 감소시켰다. 150 mg/kg의 실시예 1은 투약 35 내지 65분 후 비히클 대조군 랫트에 비해 통계적으로 유의한(P<0.5) 총 활동량의 감소를 나타내었다. 실시예 1은 투약 20시간 후 총 활동량에서 통계적 또는 생물학적으로 유의한 감소를 나타내지 않았다. 실시예 1은 어떠한 투여량에서도 과잉 활동을 유도하지 않았다.

투약 30분 후 실시예 1의 혈장 및 뇌 수준을 측정하여 표 2에 나타내었다.

투여량	혈장( nM 유리형)	뇌( nM 유리형)
비히클	0	0
1 mg/kg 실시예1	18	1.6
10 mg/kg 실시예 1	184	16
50 mg/kg 실시예 1	856	80
150 mg/kg 실시예 1	1704	148

3가지 임상 연구에서(도 2), 인간의 경면에 있어서의 투여량-반응 관련성이 관찰되었으며, 14일 동안의 100 mg 1일 2회 및 300 mg 단일 투여량의 최대 투여량에서 75 내지 100%의 대상이 경면 또는 수면 관련 효과를 보였다. 환자들에게, B3301001, B3301002의 경우 즉석 조제된 현탁액 및 B3301007의 경우 IR로서, 그리고 B3301007의 경우 즉석 조제된 삼투 캡슐(EPOC)로서 실시예 1을 투여하였다. 실시예 1은 최대 14일간의 100 mg 1일 2회 투여까지 안전하고 대체로 우수한 내약성을 보였는데, 이는 20시간 동안의 80% 전신 수용체 점유율 및 약 3시간 동안의 70% 추정 중추 수용체 점유율에 상응한다. 급성 투약 후, 투여량 관련된 심박수 증가(최대 분당 약 10회까지) 및 그렐린-유도된 성장 호르몬 분비 및 식후 글루코스의 감소가 관찰되었다. 이 3가지 효과는 모두 1일 2회 투약 14일차까지 완전히 속성내성(tachyphylaxis)을 보이는 것으로 나타났다.

영장류 실험에서, 1일 1회(QD) 또는 1일 2회(BID) 투약으로, 야간 투약 3시간 후 수면 지속 및 섭식에 대한 실시예 1의 효과를 연구하였다. 8명의 건강한 성년(5.8 내지 9.7 연령) 수컷 레서스 원숭이(인도 기원의 마카카 물라타(Macaca mulatta))를 사용하였다.

동물들을 병행 연구하였다. 교차 설계에 따라, 동물 중 4마리는 연구의 제1단계 동안 실시예 1(또는, 대조군으로서 비히클)을 1일 1회, 연구의 제2단계 동안 1일 2회 투여받았다. 나머지 4마리의 동물에 대해서는 반대의 치료 계획을 사용하였다. 실시예 1을 1일 1회 투여한 경우, 단일 투여량을 야간에 투여하였다. 각각의 치료 기간은 연속적으로 28 내지 30일 동안 지속하였다. 실시예 1을 투여한 단계 직전에, 비히클 처리는 10 내지 14일 지속하였다. 또한, 동물들이 익숙해지도록, 수면/일주기 챔버 내에 유지시켰다. 치료는 타이머-제어된 펌프를 사용하여 자동적으로 제공되는, 액상 용액으로서 투여되었다.

치료 기간 전체에 걸쳐, 수면/활동의 고유 리듬 및 자가-투여되는 섭식을 측정하기 위해, 동물들을 흐릿한 빛의 일정한 조건 하에, 빛이 제어되고 감음된 수면/일주기 챔버 내에 유지시켰다.

데이터 수집:

문헌[Masuda et al., J Biol Rhythms. 2010년 10월; 25(5):361-71, Intrinsic activity rhythms in Macaca mulatta: their entrainment to light and melatonin]에 기술된 바와 같은, 연속적 온라인 액티그래프(actigraphic) 영상 분석 기술을 사용하여 수면/활동 주기 및 수면 지속을 기록하였다. 레서스 원숭이의 수면 대 각성의 액티그래프 데이터 분석을 위한 소프트웨어 알고리즘이 문헌[Zhdanova et al., J Biol Rhythms. 2011년 4월; 26(2):149-59, Aging of intrinsic circadian rhythms and sleep in a diurnal nonhuman primate, Macaca mulatta]에 설명되어 있다. 수면 개시 및 지속 평가는 이 종들에서의 수면다원검사(polysomnographic) 및 액티그래프 수면 간의 비교에 기초하였다.

각각의 일주기 챔버는 자동 펠렛 공급장치(ENV-203-1000, 메드 어소시에이츠 인코포레이티드, 미국 버몬트주 세인트 알반스)와 연결된 개별 터치-스크린 모니터를 구비하였다. 이는 움직이는 온-스크린 표적을 누름으로써 1 g의 먹이 펠렛(영양적으로 완전한 제진 정밀 펠렛, 바이오-서브, 미국 뉴저지주 프렌치타운)의 24시간 임의적 자가-투여를 가능하게 하였다. 각각의 펠렛이 제공되는 시간을 기록하였다.

p<0.05의 유의성 수준으로 선형 혼합 모델(SPSS)을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 각각의 처리 조건(비히클 또는 실시예 1의 1일 1회 또는 1일 2회 투여)에 대한 군 평균(평균의 표준 편차(SEM))으로서 데이터를 제시하였다.

도 3 및 4는 야간 1일 1회 비히클 또는 실시예 1을 투여받은 개별 동물의 활동 패턴(도 3) 또는 섭식 패턴(도 4)에 대한 데이터를 제공한다. 12:12시간 명암 사이클(LD) 동안, 그후 일정한 흐린 빛 조건에서 동물로부터 액티그래프 기록을 취하였다(그래프 우측을 따라 표시된 화살표). 이 개체는, 시간에 따라 지연되는 전체 활동 패턴에 의해 설명되는(우측으로의 점진적 이동), 24시간보다 긴 고유 일주기를 가졌다. 비히클 또는 실시예 1을 동일한 시계 시간(17:00)에 투여하였다. 비히클 처리 기간의 초기에(그래프 우측을 따라 표시된 점선), 이는 예상 수면 개시-2시간 전(주관적 밤의 시작)에 해당하였다. 실시예 1 처리가 시작되는 시간에(그래프 우측을 따라 표시된 실선), 이 시계 시간은 예상 수면 개시-약 3.5시간 전에 해당하였다.

실시예 1의 처리는 수면 잠복기를 현저하게 감소시켰으며, 수면 개시를 촉진하였고, 이러한 효과는 처리 기간 내내 지속되었다. 상기 효과는 또한 보다 이른 수면 개시 시간이 주관적 아침에 유사하게 보다 이른 기상 시간을 초래하면서, 좌측으로의 활동 패턴의 전반적 이동(기상 시간의 당겨짐)을 초래하였다.

실시예 1 처리는 투여 후 곧 섭식을 현저하게 감소시켰으며, 이러한 효과는 처리 기간 내내 지속되었다. 상기 효과는 또한 좌측으로의 섭식 패턴의 전반적 이동(아침 식이 시간의 당겨짐)을 초래하였다. 상기 동물에서의 섭식 패턴은 활동 패턴을 따랐다. 도 3 및 도 4를 비교한다.

도 5는 비히클 대비 실시예 1의 야간 처리 후 3시간 내의 수면 지속의 변화를 제공한다(군 당 N = 8(1일 1회 투여 대 1일 2회 투여)). 두 군 모두에서, 비히클만을 투여한 경우에 비해 실시예 1의 처리 3시간 내에 수면 지속의 현저한 증가가 기록되었다. 동일한 군 내에서 실시예 1을 투여받은 군의 나머지 동물들 대비 비히클을 투여받은 동물들에서 수면 지속의 백분율 변화로서 데이터를 나타내었다(오차 막대는 SEM을 나타냄; p<0.01 대 대조군).

도 6은 실시예 1 또는 비히클의 야간 투여 후 3시간 내의 야간 섭식의 변화를 제공한다. 도 6은 실시예 1을 1일 1회 또는 1일 2회 투여받은 동물(군 당 N = 8(1일 1회 투여 대 1일 2회 투여))의 변화를 제공하며, 비히클만을 투여한 경우에 비해, 실시예 1의 투여 3시간 내에 두 군 모두에서 섭식의 현저한 감소가 기록되었다. 데이터를 비히클 또는 실시예 1의 투여 후 3시간 내의 섭식의 백분율로서 표시하였다(오차 막대는 SEM을 나타냄; p<0.01 대 비히클).

Claims

(R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법.
제1항에 있어서,
수면 장애가 일차성 불면증인, 방법.
제1항에 있어서,
수면 장애가 과도한 주간 졸림인, 방법.
제3항에 있어서,
환자가 프래더-윌리(Prader-Willi) 증후군을 갖는, 방법.
제1항에 있어서,
수면 장애가 야식 증후군인, 방법.
(R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 수면 장애를 치료하는 방법.
제6항에 있어서,
수면 장애가 일차성 불면증인, 방법.
제6항에 있어서,
수면 장애가 과도한 주간 졸림인, 방법.
제8항에 있어서,
환자가 프래더-윌리 증후군을 갖는, 방법.
제6항에 있어서,
수면 장애가 야식 증후군인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
(R)-2-(2-메틸이미다조[2,1-b]싸이아졸-6-일)-1-(2-(5-(6-메틸피리미딘-4-일)-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일)-2,7-다이아자스피로[3.5]노난-7-일)에탄온 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 다른 약리학적 활성제와 조합되어 투여되는, 방법.