KR20150008173A - 항암성 화합물로서 헥사뎁시펩타이드 유사체 - Google Patents

항암성 화합물로서 헥사뎁시펩타이드 유사체 Download PDF

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KR20150008173A
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스리쿠마 산카라나라야난 에이아마디치일
사지 데이비드 조지
샤일렌드라 소나웨인
나라얀 수바시 차콜
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Abstract

본 발명은 화학식(1)의 분리된 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학식(1)의 화합물의 모든 이성체 및 호변이성체 형태 또는 그의 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 방선균(Actinomycetes)(PM0895172/MTCC 5684)의 곰팡이 균주의 발효에 의한 화학식(1)의 화합물의 제조방법, 화학식(1)의 화합물을 활성성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 암의 치료에서 상기 화합물 또는 이들을 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

항암성 화합물로서 헥사뎁시펩타이드 유사체 {HEXADEPSIPEPTIDE ANALOGUES AS ANTICANCER COMPOUNDS}
본 발명은 화학식(1)의 화합물 (본 명세서에 기술된 바와 같음), 그의 약학적으로 허용가능한 염 도는 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 방선균(Actinomycetes)(PM0895172/MTCC 5684)에 속하는 분리된 미생물로부터 화학식(1)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학식(1)의 화합물, 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 활성성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 암의 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
암은 신체의 어느 일부에 영향을 미칠 수 있는 세포의 조절되지 않는 성장 및 확산에 의해 유발된 대그룹의 질환에 대한 관용명이다. 최근에 국소성 질환에 대한 화학요법, 수술 및 방사선 치료 또는 상기 치료의 조합을 포함하는 수 많은 암 치료법들이 이용가능하다. 치료법의 선택은 암의 위치 및 진단시에 암이 확산된 정도에 따라 달라진다. 화학요법은 암세포를 파괴할 수 있는 항암제의 사용을 포함하는 암의 치료의 가장 흔한 형태 중의 하나이다. 암 치료요법에서 계속적인 발달에도 불구하고, 이 질환은 아직도 세계에서 주요한 사망원인의 하나가 되고 있는데, 그 이유는 가장 가능성있게는 이용가능한 치료법들이 바람직하지 않은 부작용 및 제한된 효과와 관련되어 있기 때문이다. 따라서 암을 치료하기 위한 임상적 유익을 보여주는 새로운 항암제들/약제들이 필요하다.
천연자원으로부터 탁솔, 빈크리스틴, 토레이안산(torreyanic acid), 및 캄포테신과 같은 항암성 화합물에 대한 보고가 있다 (Natural Product Communications, 2009, 4 (11), 1513).
지구 표면의 70 퍼센트 및 열대 생물권의 95 퍼센트를 차지하는 해양환경은 36개 생명의 문중 34개를 나타내며 또한 육지환경의 것을 초과하는 매력적인 종류의 생물다양성을 제공한다 (Life Sciences, 2005, 78, 442-453). 상업적으로 가치있는 유전적 및 생화학적 자원에 대한 원주민 지식 및 생물학적 다양성의 탐색, 추출 및 스크리닝인 해양 천연산물 생물자원 조사는 상당수의 약물 후보를 생산하였다 (Drug Discovery Today, 2003, 8 (12), 536-544).
해양 유기물 및 미생물로부터 천연산물의 스크리닝을 포함하는 수 많은 의약의 개발에 대한 보고들이 있었다. 해양원으로부터 유래하는 항암제의 예는 시타라빈(citarabine), 브리오스타틴(bryostatin)-1, 아프리딘(aplidine), 도라스타틴 10 및 ET-743을 포함한다 (Current Opinion in Pharmacology, 2001, 1, 364-369).
다수개의 헥사뎁시펩타이드가 당해분야에서 보고되고 있다. 예를 들면, JP 09040559는 알러지 및 비알러지 염증에 대하여 효과가 있는 항염증 작용을 갖는 헥사뎁시펩타이드 부류의 화합물들을 기술하고 있다.
많은 치료학적 활성 화합물들이 천연근원으로부터 얻어졌다는 점을 고려하면, 암과 같은 질환의 치료에서 효과적으로 사용될 수 있는 새로운 화합물을 얻기 위해 이 분야의 연구를 탐구하는 것이 신중할 것이다. 본 특허출원의 발명자들은 암의 치료에서 활용되는 새로운 화합물을 제공하기 위하여 전심전력하였다. 또한 발효에 의해 이 화합물을 제공하는 방법 및 추가로 화학식(1)의 화합물의 화학적 변형을 수행하여 그의 유도체를 얻는 방법이 제공된다.
본 발명은 화학식(1)의 화합물(본 명세서에서 기술된 바와 같음)로서 본 명세서에 지정된 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 화학식(1)의 화합물의 이성체 형태, 호변이성체 형태 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 화학식(1)의 화합물은 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물이다.
본 발명에 따르면, 화학식(1)의 화합물의 유도체는 화학식(1c)의 화합물에 포함된다.
본 발명은 또한 해양 방선균(Actinomycetes)(PM0895172/MTCC 5684) 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체 중 하나의 발효에 의해 얻어진 배양 액체배지로부터 분리된 화학식(1)의 정제된 화합물에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 화합물은 화학식(1)의 분리된 화합물이다.
본 발명은 또한 해양 방선균(PM0895172/MTCC 5684)으로부터 화학식(1)의 화합물, 및/또는 그의 이성체 또는 호변이성체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 배양시 화학식(1)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체를 생산하는 방선균(Actinomycetes)(PM0895172/MTCC 5684)에 속하는 미생물의 분리방법에 관한 것이다.
화학식(1)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체는 암의 치료에 유용하다.
본 발명은 화학식(1)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체의 치료학적 유효량을 대상체에 투여함을 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 활성성분으로서 화학식(1)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 비히클과 함께, 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
도 1은 화학식(1a)의 화합물의 1H NMR (CDCl3; 500 MHz; Instrument: Bruker) 스펙트럼을 예시한다.
도 2는 화학식(1a)의 화합물의 13C NMR (CDCl3; 75 MHz; Instrument: Bruker) 스펙트럼을 예시한다.
도 3은 화학식(1b)의 화합물의 1H NMR (CDCl3; 500 MHz; Instrument: Bruker) 스펙트럼을 예시한다.
도 4는 화학식(1b)의 화합물의 13C NMR (CDCl3; 75 MHz; Instrument: Bruker) 스펙트럼을 예시한다.
도 5는 HeLa 암세포에서 세포자멸사에 대한 화학식(1a)의 화합물의 효과를 예시한다.
본 발명은 다음과 같이 표시되는 화학식 (1)의 화합물을 제공한다.
Figure pct00001
화학식 (1)
상기 화학식 (1)의 화합물에서,
결합
Figure pct00002
가 단일결합을 나타내고 R1이 H인 경우, 상기 화합물은 화학식(1a)의 화합물로 언급되며; 또한 결합
Figure pct00003
가 이중결합이고 R1이 존재하지 않는 경우, 상기 화합물은 화학식(1b)의 화합물로 언급된다. 따라서 화학식(1)의 화합물은 화학식(1a)의 화합물(여기서 결합
Figure pct00004
는 단일결합을 나타내고 R1이 H임) 또는 화학식(1b)의 화합물 (여기서 결합
Figure pct00005
는 이중결합이고 R1이 존재하지 않음) 또는 그의 혼합물이다.
화학식(1)의 화합물은 헥사뎁시펩타이드 부류의 화합물에 속한다.
화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물은 본 명세서에서 이하에 논의되는 바와 같은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고분해능 질량 스펙트럼(HR MS), 적외선(IR) 및 핵자기 공명(NMR)분광분석 데이터와 같은 물리화학적 스펙트럼 성질들 중의 어느 하나로 특징화될 수 있다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 화학식(1)의 화합물은 분자식 C37H62N8O13 및 분자량 826.9을 갖는 화학식(1a)의 화합물이다.
화학식(1a)의 화합물은 다음과 같이 표시된다:
Figure pct00006
화학식(1a)
화학식(1a)의 화합물의 화학명은 N-(6,18-디하이드록시-22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소테트라코사 하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-23-일)-2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미드이다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 화학식(1)의 화합물은 분자식 C37H60N8O13 및 분자량 824.4을 갖는 화학식(1b)의 화합물이다.
화학식(1b)의 화합물은 다음과 같이 표시된다:
Figure pct00007
화학식(1b)
화학식(1b)의 화합물의 화학명은 N-(6,18-디하이드록시-22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소-3,4,4a,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15,16,16a,17,18,19,20,22,23,24-도코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-23-일)-2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미드이다.
화학식(1)의 화합물의 제조를 위해 사용될 수 있는 미생물은 인도 마하라시트라 뭄바이의 연안 지역으로부터 수집된 심해 침전물로부터 분리된 배양 번호 PM0895172로 이후에 언급되는 방선균(PM0895172/MTCC 5684)이다.
본 발명의 한 양상은
a) 탄소의 하나 이상의 공급원 및 질소 및 영양 무기염 및/또는 미량원소의 하나 이상의 공급원을 함유하는 영양 배지에서 수중 호기성 조건하에 배양번호 PM0895172 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체 중의 하나를 성장시켜 화학식(1)의 화합물을 함유하는 배양 액체 배지를 얻는 단계;
b) 상기 배양 액체배지로부터 상기 화학식(1)의 화합물을 분리하는 단계; 및
c) 상기 화학식(1)의 화합물을 정제하는 단계
를 포함하는 배양번호 PM0895172로부터 화학식(1)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 따라 제조된 화학식(1)의 화합물은 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물일 수 있다.
한 실시형태에서, 단계(a)에서 배양 액체배지는 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물이다.
한 실시형태에서, 상기 방법의 단계(b)에서 화학식(1)의 화합물은 화학식(1a)의 화합물이다.
한 실시형태에서, 상기 방법의 단계(b)에서 화학식(1)의 화합물은 화학식(1b)의 화합물이다.
한 실시형태에서, 상기 방법의 단계(c)에서 화학식(1)의 화합물은 화학식(1a)의 화합물이다.
한 실시형태에서, 상기 방법의 단계(c)에서 화학식(1)의 화합물은 화학식(1b)의 화합물이다.
한 실시형태에서, 본 발명은
a) 탄소의 하나 이상의 공급원 및 질소 및 영양 무기염 및/또는 미량원소의 하나 이상의 공급원을 함유하는 영양 배지에서 수중 호기성 조건하에 배양번호 PM0895172 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체 중의 하나를 성장시켜 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물을 함유하는 배양 액체배지를 얻는 단계;
b) 상기 배양 액체 배지로부터 상기 화학식(1a)의 화합물을 분리하는 단계; 및
c) 상기 화학식(1a)의 화합물을 정제하는 단계
를 포함하는 배양번호 PM0895172로부터 화학식(1a)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은
a) 탄소의 하나 이상의 공급원 및 질소 및 영양 무기염 및/또는 미량원소의 하나 이상의 공급원을 함유하는 영양 배지에서 수중 호기성 조건하에 배양번호 PM0895172 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체 중의 하나를 성장시켜 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물을 함유하는 배양 액체배지를 얻는 단계;
b) 상기 배양 액체 배지로부터 상기 화학식(1b)의 화합물을 분리하는 단계; 및
c) 상기 화학식(1b)의 화합물을 정제하는 단계
를 포함하는 배양번호 PM0895172로부터 화학식(1b)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상술한 바와 같은 방법 중의 어느 하나에서 단계(c)는 화학식(1)의 화합물의 정제를 포함하며 또한 관련 분야에서 일반적으로 사용되는 정제 과정을 사용하여 수행한다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물은 실질적으로 순수한 화합물이다. 따라서 화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물은 분리된 순수한 화합물이다.
전형적으로, 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물은 칼럼 크로마토그래피 기술에 의해 정제된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "돌연변이체"는 본 발명에 따른 화합물을 생산할 수 있는 유기체의 능력과 관계하는 유전자 또는 유전자들로 유전체 내의 하나 이상의 유전자가 변형된 유기체 또는 세포를 언급한다. 이러한 돌연변이체는 물리적 수단, 예를 들면 자외선 또는 X-선과 같은 방사선 또는 화학적 돌연변이 유도물질을 사용하여 그 자체로 알려진 방법으로 제조할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 그러한 종에서 임의의 표준 유형과 식별가능하게 상이한 개개 유기체를 언급한다.
용어 "전체 액체 배지"(whole broth)는 용어 "영양 액체 배지", "배양 액체 배지" 또는 "발효된 액체배지"와 서로 교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포유류"는, 이들로 제한되지 않지만, 암소, 말, 돼지, 개 및 고양이를 포함하는 비인간 포유류는 물론 인간을 언급한다. 용어 "포유류"는 용어 "환자" 또는 "대상체"와 서로 교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "활성성분" 또는 "활성 화합물"은 서로 교환적으로 사용될 수 있으며 또한 본 명세서에서 사용되는 상기 용어(들)은 화학식(1)의 화합물 또는 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 언급한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "활성성분" 또는 "활성 화합물"은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 화학식(1)의 화합물의 유도체를 포함하는 화학식(1c)의 화합물을 언급한다.
용어 "화학식(1)의 화합물"은 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물 또는 그의 혼합물; 및 그의 이성체, 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
용어 "화학식(1c)의 화합물"은 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 유도체를 포함하는 화학식(1)의 화합물의 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 추가의 정제가 상기 화합물의 물리적 및 화학적 성질뿐만 아니라 효소적 및 생물학적 작용들을 검출가능하게 변화시키지 않도록 화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물 또는 그의 이성체가 충분히 순수하다는 것을 의미한다. 화학식(1)의 화합물은 실질적으로 당해 분야의 기술자에게 알려진 방법에 따라 정제할 수 있다.
화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체 (화학식(1c)의 화합물 (본 명세서에 기술된 바와 같음))를 사용하여 암 (본 명세서에 나열된 바와 같음)의 치료와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 화합물을 투여받은 대상체에서 다음과 같은 효과 중의 하나 이상을 유발할 수 있는 량을 의미한다: (i) 어느 정도까지 둔화(slowing down) 및 완전한 성장정지를 포함하는 종양 성장의 억제; (ii) 종양 세포의 수의 감소; (iii) 종양 크기의 감소; (iv) 말초기관 내에 종양세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 둔화 또는 완전한 정지); (v) 전이의 억제 (즉, 감소, 둔화 또는 완전한 정지); (vi) 종양의 후퇴를 초래할 수 있지만 초래해서는 아니되는 항종양 면역반응의 증진; 및/또는 (vii) 어느 정도까지 치료하려는 암과 관련된 하나 이상의 증상의 경감.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염(들)"은 포유류에 안전하고 효과적이고 또한 원하는 생물학적 작용을 가지는 화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물 및 그의 유도체 (화학식(1c)의 화합물)을 포함하는 본 발명의 화합물(들)의 염을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 산 부가염은 염화수소산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 니트레이트, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 타트레이트, 아스코베이트, 숙시네이트, 말리에이트, 푸마레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 벤젠설포네이트, 또는 p-톨루엔설포네이트 염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 적절한 염기 부가염은 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 또는 아연 염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
화학식(1)의 화합물이 생산되는 배양번호 PM0895172의 사전확인은 그의 콜로니 특성들을 조사하여 수행하였다. 분리된 배양번호 PM0895172의 균주에 대한 현미경적 연구는 변형된 방선균 분리 한천 배지상에서 수행하였다. 관찰은 20℃ 내지 30℃에서 20-22일 배양 후에 콜로니가 관찰될 때까지 행하였다. 배양 번호 PM0895172는 해양 방선균으로서 확인하였다.
배양번호 PM0895172는 인도 찬디가르-160 036 섹터 39-A 미생물 테크노로지 협회의 미생물보존기관(MTCC)에 기탁하였고, 세계지적재산권기구(WIPO)는 국제기탁기관(IDA)으로 승인하였고, 수탁번호 MTCC 5684를 부여하였다.
본 명세서에 기술된 구체적 미생물 외에도, X-선, 자외선 등을 포함하는 화학적 또는 물리적 돌연변이유도물질을 사용하여 생산된 것과 같은 PM0895172의 돌연변이체, 및 유전자 구조가 분자 생물학 기술에 의해 변형된 유기체도 또한 배양하여 화학식(1)의 화합물을 생산할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 화합물을 생산할 수 있는 적절한 돌연변이체 및 변이체의 스크리닝은 HPLC, NMR, IR, MS 및/또는 배양 액체 배지에 축적된 활성 화합물의 생물학적 활성의 결정에 의해, 예를 들면 항암작용을 위한 화합물을 시험으로써 또는 그의 조합에 의해 확인할 수 있다.
화학식(1)의 화합물을 생산하는 배양번호 PM0895172의 분리 및 배양을 위해 사용되는 배지 및/또는 영양 배지는 바람직하게는 탄소, 질소 및 영양 무기염의 공급원을 함유한다. 탄소 공급원은 예를 들면 전분, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 프룩토오스, 당밀, 글리세롤, 락토오스 또는 갈락토오스 중 하나 이상이다. 바람직한 탄소 공급원은 글루코오스이다. 질소의 공급원은 예를 들면 대두분, 땅콩분, 효모 추출물, 우육 추출물, 펩톤, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 젤라틴, 또는 카사미노산 중 하나 이상이다. 바람직한 질소 공급원은 펩톤 및 효모 추출물이다. 영양 무기염은 예를 들면 염화나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 염화 망간, 염화 마그네슘, 염화 스트론튬, 염화 코발트, 브롬화 칼륨, 플루오로화 나트륨, 인산수소 나트륨, 인산 수소 칼륨, 인산 수소 이칼륨, 인산 이나트륨, 탄산 칼슘, 중탄산 나트륨, 규산 나트륨, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 질산 칼륨, 황산 나트륨, 황산 암모늄, 헵타몰리브덴산 암모늄, 구연산 철, 황산 구리, 황산 마그네슘, 황산 제1철, 황산 아연 또는 붕산 중 하나 이상이다. 염화 나트륨 및 염화칼슘이 바람직하다.
배양번호 PM0895172의 유지는 24℃ 내지 32℃ 범위의 온도에서 수행할 수 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0895172는 27℃ 내지 29℃에서 유지된다. 잘 성장된 배양물은 4℃ 내지 -8℃에서 냉장고에 보존할 수 있다.
배양번호 PM0895172의 종배양은 210-260 rpm (분당 회전수)에서 27℃ 내지 33℃ 범위의 온도 및 약 5.5 내지 8.5의 pH에서 수행할 수 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0895172 종은 230-250 rpm에서 70-74 시간 동안 29℃ 내지 31℃ 및 약 6.5- 7.5의 pH에서 배양한다.
화학식(1)의 화합물의 생산은 200-250 rpm에서 80-110 시간 동안 27℃ 내지 33℃ 범위의 온도 및 약 5.5 내지 8.5의 pH에서 진탕 플라스크 속에서 발효에 의해 배양번호 PM0895172를 배양하여 수행할 수 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0895172는 210-230 rpm에서 90-100 시간 동안 29℃ 내지 31℃ 및 pH 6.5-7.5에서 배양한다.
화학식(1)의 화합물의 생산은 40-70 rpm 및 200-300 lpm (분당 리터) 에어레이션(aeration)에서 20-40 시간 동안 27℃ 내지 33℃ 범위의 온도 및 약 5.5 내지 8.5의 pH에서 발효기 속에서 발효에 의해 배양번호 PM0895172을 배양하여 수행할 수 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0895172는 50-60 rpm 및 240-260 lpm 에어레이션에서 20-30 시간 동안 28℃ 내지 31℃ 및 pH 6.5-7.5에서 배양한다.
화학식(1)의 화합물의 생산은 본 명세서에 기술된 조건 하에, 바람직하게는 수중 호기성 조건하에, 예를 들면 진탕 플라스크 속에서, 적절한 영양소 중에 배양번호 PM0895172을 배양하여 수행할 수 있다. 화학식(1)의 화합물을 발효 및 생산하는 진행은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 및 상이한 암세포주에 대하여 시험함으로써 배양 액체배지의 생물활성을 측정하여 검출할 수 있다.
발효는 다양한 화학적 또는 약학적 화합물의 생산을 위해 미생물을 성장시키는 공정이다. 미생물은 통상적으로 영양소의 존재하에 특이적 조건하에 배양한다. 전체 액체 배지는 발효 공정을 완료한 후에 얻어진다. 전체 액체 배지는 원심분리하여 세포 덩이 및 배양 여과액을 형성하게 하고 이것은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 추가로 가공처리할 수 있다.
배양 액체 배지에 존재하는 화학식(1)의 화합물은 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물 형태일 수 있으며 또한 상기 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물은 상이한 추출방법 및 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리할 수 있다.
화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물은 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디에틸에테르 또는 부탄올과 같은 수불혼화성 용매에 의한 추출에 의해, 또는 "Diaion HP-20®"(미쓰비시 화학공업사, 일본),"Amberlite XAD®" (롬 앤 하스 인더스트리즈, 미국)과 같은 고분자 수지를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 활성탄 흡착에 의해 배양 여과액으로부터 회수할 수 있다. 이들 기술은 단독으로 또는 조합하여 반복적으로 사용될 수 있다.
화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물은 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올, 또는 이소-프로판올과 같은 수혼화성 용매 또는 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올과 같은 수불혼화성 용매에 의한 추출에 의해 세포 덩이로부터 회수할 수 있다.
또는, 전체 액체 배지는 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 부탄올로부터 선택되는 용매로 추출한다.
전형적으로, 화학식(1)의 화합물은 용매로서 에틸 아세테이트를 사용하여 전체 액체 배지 또는 배양 액체 배지로부터 추출한다. 추출물의 농도는 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물을 함유하는 활성 조물질을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물은 다음 기술들 중의 어느 하나를 사용하는 분별법에 의해 조물질로부터 회수할 수 있다: 정상상 크로마토그래피 (정지 상과 같은 알루미나 또는 실리카겔; 석유 에테르, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 이소프로필 알코올, 또는 이의 조합과 같은 용리제를 사용함); 역상 크로마토그래피 (정지 상으로서 디메틸옥타데실실릴실리카 겔(RP-18) 또는 디메틸옥틸실릴 실리카 겔(RP-8)과 같은 역상 실리카 겔; 및 물, 완충제 (예를 들면, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트(pH 2-8)), 및 유기 용매 (예를 들면, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로푸란, 또는 이들 용매의 조합)과 같은 용리제를 사용함); 겔 투과 크로마토그래피(메탄올, 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트 또는 이들의 조합과 같은 용매 중에 Sephadex LH-20®(파마시아 케미칼 인더스트리즈, 스웨덴), TSKgel® Toyopearl HW (토소하스, 토소 코포레이션, 일본)과 같은 수지를 사용함); 또는 향류 크로마토그래피(물, 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, n-프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세톤, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸아세테이트, 석유 에테르, 벤젠 및 톨루엔과 같은 두 개 이상의 용매로 구성된 이상 용리제 시스템을 사용함). 이들 기술은 단독으로 또는 조합하여 반복적으로 사용할 수 있다. 전형적인 방법은 정상상 실리카겔 및 역상 상 실리카 겔 예를 들어 RP-18에 의한 크로마토그래피이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이성체"는 공간적으로 이들의 원자의 배향에서만 다른 화학식(1)의 화합물의 이성체 모두에 사용되는 일반 용어이다. 용어 "이성체"는 거울상 이성체(에난티오머), 거울상 이성체의 혼합물 (라세미체, 라세미 혼합물) 및 서로 거울상이 아닌 하나 이상의 키랄 중심을 갖는 화합물의 이성체(부분입체이성체)를 포함한다. 본 발명의 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있으며 또한 라세미체, 라세미 혼합물, 개개의 부분입체 이성체, 또는 에난티오머로서 발생할 수 있거나 또는 본 발명에 포함되는 상기 화합물의 모든 이성체 형태를 갖는 기하 이성체로서 존재할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "호변이성체"는 하나 (또는 그 이상)의 이동원자의 위치에서 및 전자 분포에서만 서로 상이한 두 개 (또는 그 이상)의 화합물, 예를 들면 케토-에놀 호변이성체의 공존을 언급한다.
화학식(1)의 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체는 본 발명에 의해 모두 고려되는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체로 전환될 수 있다.
화학식(1)의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 당해 분야의 기술자에게 알려진 표준 절차에 의해 제조할 수 있으며, 예를 들면, 나트륨 및 칼륨염 같은 염들은 화학식(1)의 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체를 적절한 나트륨 또는 칼륨 염기, 예를 들면, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 등으로 처리하여 제조할 수 있다. 유사하게, 하이드로클로라이드 및 설페이트 염 같은 염들은 화학식(1)의 화합물, 그의 이성체, 호변이성체 또는 유도체를 적절한 산, 예를 들면 염산, 황산 등으로 처리하여 제조할 수 있다.
화학식(1)의 화합물의 모든 유도체, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물의 유도체는 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에 따라 특별한 목적의 화학식(1)의 화합물의 유도체, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물의 유도체는 화학식(1)의 화합물의 아미노기 및 하이드록시기, 특히 N-하이드록시기 중 하나 이상이 유도체화되고, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물의 것이 유도체화된 것들이다.
따라서, 본 발명의 한 양상에서는 다음 화학식(1c)로 표시되는 화학식(1)의 화합물의 유도체 및 그의 모든 이성체 및 호변이성체 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:
Figure pct00008
화학식(1c)
상기 식에서,
R1 및 R4는 독립적으로 H를 나타내거나 존재하지 않고;
R2 및 R3 는 독립적으로 H, 하이드록시, -O(C1-C6)알킬 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고;
Figure pct00009
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내고,
여기서 (C1-C6)알킬은 비치환되거나 또는 할로겐, 하이드록시, -O(C1-C6)알킬, 니트로, 시아노, -COOH, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N[(C1-C6)알킬]2, -NHC(O)O(C1-C6)알킬, -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴, -NH-PEG 또는 (C6-C10)아릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
(C6-C10)아릴은 비치환되거나 또는 할로겐, 할로(C1-C6)알킬, 하이드록시, 시아노, 니트로, (C1-C6)알킬, -O(C1-C6)알킬, -COOH 및 -NH2로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
또한 PEG는 O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙신일아미노)에틸]폴리에틸렌글리콜(α,ω-비스-NHS-PEG), 메틸-PEG-NHS 에스테르 (MS(PEG)n (식 중, n은 24임), 및 폴리에틸렌글리콜의 분지형 트리메틸 및 숙신이미드 에스테르 유도체 (TMS(PEG)n (식 중, n은 12임)으로부터 선택되는 폴리에틸렌글리콜이고;
단 R2 및 R3 가 둘다 하이드록시인 경우, R1 및 R4는 존재하지 않으며
Figure pct00010
는 이중결합을 나타낸다.
"치환", "치환된" 또는 "~으로 치환된"은 특정 부분의 하나 이상의 수소가 적절한 치환기로 대체되어 있고 또한 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허용된 원자가에 따른다는 잠재적인 조건을 포함하고 그리하여 안정한 화합물을 생성한다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "(C1-C6)알킬" 또는 "알킬"은 단독으로 또는 또 다른 기의 일부로서 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실과 같은 1 내지 6개의 탄소를 함유하는 비치환되거나 또는 치환된 직선형 또는 분지형 탄화수소를 언급한다. 치환된 알킬은, 이들로 제한되지 않지만, 할로겐, 하이드록시, -O(C1-C6)알킬, 니트로, 시아노, -COOH, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N[(C1-C6)알킬]2, -NHC(O)O(C1-C6)알킬, -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴, -NH-PEG 또는 (C6-C10)아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 (C1-C6)알킬을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "(C6-C10)아릴" 또는 "아릴"은 최대 10개의 환 탄소원자를 갖는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 탄화수소를 언급하며, 여기서 적어도 하나의 카르복실 환은 π전자 시스템을 갖는다. (C6-C10)아릴 환 시스템의 예는 페닐 또는 나프틸을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 별도의 언급이 없는 한, 아릴 기는, 이들로 제한되지 않지만, 할로겐, 할로(C1-C6)알킬, 하이드록시, 시아노, 니트로, (C1-C6)알킬, -O(C1-C6)알킬, -COOH 및 -NH2로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상으로 치환되거나 또는 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "-O(C1-C6)알킬" 또는 "알콕시"는 여기에 부착된 산소를 갖는 비치환되거나 또는 치환된 (C1-C6)알킬 라디칼을 의미한다. 대표적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시, n-부톡시, 1-메틸프로폭시, 2-메틸프로폭시 또는 1,1-디메틸에톡시를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 치환된 알콕시기는 알킬이, 이들로 제한되지 않지만, 할로겐, 하이드록시, -O(C1-C6)알킬, 니트로, 시아노, -COOH, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N[(C1-C6)알킬]2, -NHC(O)O(C1-C6)알킬, -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴, -NH-PEG 또는 (C6-C10)아릴로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 -O(C1-C6)알킬기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "할로(C1-C6)알킬" 또는 "할로알킬"은 알킬기의 수소 원자 중의 하나 이상이 하나 이상의 할로겐으로 치환된 라디칼을 의미한다. 모노할로알킬 라디칼은 예를 들면 하나의 클로로, 브로모, 요오도 또는 플루오로 원자를 가질 수 있다. 디할로- 및 폴리할로알킬 라디칼은 동일 또는 상이한 할로겐 원자의 두 개 이상을 가질 수 있다. "할로(C1-C6)알킬" 또는 "할로알킬"의 예는 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 디클로로에틸, 디클로로프로필, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 디플루오로클로로메틸, 디클로로플루오로 메틸, 디플루오로에틸 또는 디플루오로프로필을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요도드를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 언급한다. PEG는 비독성, 비면역원성, 비항원성이고 또한 물에 매우 가용성이다. PEG는 분자 내에서 에틸렌 옥사이드(즉, -OCH2CH2-)의 반복 서브유닛 수에 기초하여 다양한 분자량으로 상업적으로 입수가능하다. 예를 들면, PEG는 시그마-알드리치 Co. LLC 또는 NOF 코포레이션과 같은 상업적 공급업자로부터 입수가능하다. PEG의 일부 예는, 이들로 제한되지 않지만, (a) 하기 구조식으로 나타내는 O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙신일 아미노)에틸]폴리에틸렌글리콜 (α,ω-비스-NHS-PEG), 분자량 2000 Da 내지 10,000 Da 범위:
Figure pct00011
(b) 하기 구조식으로 나타내는 메틸-PEG-NHS 에스테르 (MS(PEG)n (여기서 n은 24임), 분자량 1214.39 Da:
Figure pct00012
(c) 폴리에틸렌글리콜의 분지형 트리메틸 및 숙신이미드 에스테르 유도체 (TMS(PEG)n (여기서 n은 12임), 분자량 2420.80 Da. 전형적으로, 1000 내지 20,000 Da 범위의 분자량을 갖는 PEG는 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물의 PEG 접합체의 제조에서 사용하는데 바람직하다.
본 발명과 관련하여, 용어 "화학식(1c)의 화합물", "화학식(1)의 화합물의 유도체", 또는 "화학식(1c)의 유도체"는 서로 교환적으로 사용되며 또한 이들 용어의 각각은 화학식(1c)로 표시되는 화학식(1)의 화합물의 유도체, 및 그의 이성체, 호변이성체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 언급한다.
한 실시형태에 따르면, 본 발명은 R1 및 R4가 H이고; R2가 -O(C1-C6)알킬 또는 -OC(O)(C1-C6)알킬이고; R3가 하이드록시 또는 -O(C1-C6)알킬이고; 여기서 (C1-C6)알킬이 비치환되거나 또는 -NH2, -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴 또는 -NH-PEG로 치환된 화학식(1c)의 화합물, 및 그의 모든 이성체 및 호변이성체 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 R1 및 R4가 독립적으로 H를 나타내거나 존재하지 않고;
R2 및 R3가 독립적으로 H 및 하이드록시로부터 선택되고;
Figure pct00013
가 단일결합 또는 이중결합을 나타내고;
단 R2 및 R3가 둘다 하이드록시인 경우, R1 및 R4는 존재하지 않으며
Figure pct00014
는 이중결합을 나타내는 것인 화학식(1c)의 화합물, 및 그의 모든 이성체 및 호변이성체 형태 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명에 따라 포함되는 화학식(1c)의 화합물은 하기 화학식 1 내지 8의 화합물, 및 그의 모든 이성체 및 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
Figure pct00015
Figure pct00016
화합물 1 화학식 2
Figure pct00017
Figure pct00018
화합물 3 화합물 4
Figure pct00019
Figure pct00020
화합물 5 화합물 6
Figure pct00021
화합물 7
Figure pct00022
화합물 8
화학식(1c)으로 표시되는 화학식(1)의 화합물의 유도체는 당해분야에 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다. 화학식(1c)의 화합물의 제조방법에서 사용되는 시약은 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 당해 분야에 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다.
R1 및 R4가 H이고; 또한 R2 및 R3가 독립적으로 하이드록시 및 -O(C1-C6)알킬로부터 선택되고, 여기서 R2 및 R3 중 적어도 하나가 -O(C1-C6)알킬인 화학식(1c)의 화합물은 톨루엔 또는 벤젠과 함께 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올로부터 선택되는 알코올 중에 화학식(1a)의 화합물인 화학식(1)의 화합물을 -5℃ 내지 5℃ 범위의 온도에서 1 시간 내지 5 시간 동안 헥산 또는 톨루엔과 같은 유기 용매 중에 트리메틸실릴디아조메탄과 같은 알킬화제와 반응시켜 제조할 수 있다. 화합물 1 및 2는 이러한 방법에 의해 제조된다.
R1 및 R4가 H이고; 또한 R2 및 R3가 독립적으로 하이드록시 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고, 여기서 R2 및 R3 중 적어도 하나가 -OC(O)(C1-C6)알킬이고; (C1-C6)알킬이 -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴로 치환된 화학식(1c)의 화합물은 테트라하이드로푸란(THF), 디클로로메탄(DCM), 또는 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 용매 중에 화학식(1a)의 화합물인 화학식(1)의 화합물을, -5℃ 내지 5℃ 범위의 온도에서 1시간 내지 20시간 동안 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyPOP), (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플로오로포스페이트(BOP), N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 프로판 포스폰산 무수물(T3P)과 같은 커플링제, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA), 트리에틸아민 또는 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)와 같은 염기의 존재하에 N-벤질옥시카르보닐-L-알라닌(Cbz 알라닌) 또는 N-(9-플루오렌일메톡시카르보닐)-L-알라닌(Fmoc 알라닌)과 같은 시약과 반응시켜 제조할 수 있다. 화합물 3은 이러한 방법에 의해 제조된다. 이렇게 하여 얻어진 화합물은 묽은 HCl과 같은 산을 사용하여 생성된 산성조건에서 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트 또는 THF와 같은 용매 중에 Pd/C 또는 Pt/C와 같은 촉매를 사용하는 촉매적 환원에 의해 탈보호하여, R2 및 R3가 독립적으로 하이드록시 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고 여기서 R2 및 R3의 적어도 하나가 -OC(O)(C1-C6)알킬이고; 상기 (C1-C6)알킬이 -NH2로 치환된 화학식(1c)의 화합물을 얻을 수 있다. 화합물 4는 이러한 방법에 의해 제조된다.
R1 및 R4가 H이고; 또한 R2 및 R3가 독립적으로 하이드록시 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고, 여기서 R2 및 R3 중 적어도 하나가 -OC(O)(C1-C6)알킬이고; 상기(C1-C6)알킬이 -NH2로 치환된 화학식(1c)의 화합물은 페길화를 위해 사용할 수 있으며, 트리에틸아민 또는 DIPEA와 같은 염기의 존재하에 DCM, 메탄올 또는 DMF와 같은 유기용매 중에 상기 화합물을 용해시키고; O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙신일아미노)에틸]폴리에틸렌 글리콜(α,ω-비스-NHS-PEG) 또는 메틸-PEG-NHS 에스테르와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 첨가한 다음; 25℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 10 시간 내지 20시간 동안 교반하여, R2 및 R3가 독립적으로 하이드록시 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고, 여기서 R2 및 R3 의 적어도 하나가 -OC(O)(C1-C6)알킬이고; 상기 (C1-C6)알킬이 -NH-PEG로 치환된 화학식(1c)의 화합물을 얻을 수 있다. 화합물 8은 이러한 방법에 의해 제조된다.
화학식(1)의 화합물은 25℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 10 시간 내지 20시간 동안 디클로로메탄 또는 디클로로에탄으로부터 선택되는 유기 용매 중에 m-클로로퍼벤조산과 같은 시약을 사용하여 산화시켜 R1 및 R4 위치에서 수소를 제거하며, 따라서 R1 및 R4가 존재하지 않으며 또한 R2 및 R3가 하이드록시인 화학식(1c)의 화합물을 얻을 수 있다. 화합물 5는 이러한 방법에 의해 제조된다.
화학식(1)의 화합물의 N-하이드록시기는 THF, DCM 또는 DMF와 같은 용매 중에 비스(사이클로펜타디에닐)티타늄(IV) 디클로라이드 및 활성화 아연과 같은 시약의 용액에 메탄올, 에탄올 또는 DMF로부터 선택되는 유기 용매 중에 화학식(1)의 화합물을 첨가한 다음 -5℃ 내지 -50℃ 범위의 온도에서 0.1 시간 내지 1시간 동안 교반함으로써 NH(탈산소)로 전환시켜 R1 및 R4가 H이거나 또는 존재하지 않으며 또한 R2 및 R3이 H인 화학식(1c)의 화합물을 얻을 수 있다. 화합물 6은 이러한 방법에 의헤 제조된다.
화학식(1)의 화합물의 N-하이드록시기의 아실 유도체는 디클로로메탄, 피리딘 또는 디클로로에탄과 같은 용매 중에 화학식(1)의 화합물을 -5℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 1시간 내지 5시간 동안 피리딘, TEA 또는 DMAP와 같은 염기의 존재하에 염화 아세틸 또는 아세트산 무수물과 같은 시약과 반응시켜 R2 및 R3가 독립적으로 하이드록시 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고, 여기서 R2 및 R3 중 적어도 하나가 -OC(O)(C1-C6)알킬인 화학식(1c)의 화합물을 얻는 식으로 제조할 수 있다. 화합물 7은 이러한 방법에 의해 제조된다.
화학식(1)의 화합물의 유도체인 화학식(1c)의 화합물은 필요에 따라 이들이 약학적으로 허용가능한 염으로 전환될 수 있다.
화학식(1)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체는 항암작용을 갖는다. 이것은 광범위한 암세포에 대하여 화학식(1), 화학식(1a), 화학식(1b) 및 화학식(1c)의 화합물(들)을 각각 포함하는 본 발명의 대표적인 화합물들을 시험함으로써 입증되었다.
화학식(1)의 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체는 약제로서 및 약학적 조성물 형태로 치료가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. 화학식(1)의 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체는 암을 갖는 것으로 진단된 환자에게 투여될 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 암의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 화학식(1)의 화합물, 특히 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 화학식(1)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체의 치료학적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 약학적 조성물은 암의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 약학적 제제에서 활성성분으로서 화학식(1)의 화합물 또는 그의 입체이성체 또는 그의 호변이성체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체의 치료학적 유효량은 약 0.01 mg 내지 1000 mg 범위일 수 있거나, 또는 약 0.1 mg 내지 750 mg 범위일 수 있거나, 또는 약 0.5 mg 내지 500 mg 범위일 수 있거나, 또는 약 1 mg 내지 250 mg 범위일 수 있다.
화학식(1)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체를 포함하는 본 발명의 화합물들은 암의 치료에 활용된다. 본 발명의 화합물은 종양세포의 증식을 감소, 억제 또는 약화시키는데 사용할 수 있으며, 또한 종양의 크기를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있는 대표적인 암은 백혈병, 폐암, 뇌종양, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 간암, 신장암, 방광암, 요로암, 유방암, 두경부암, 자궁내막암, 림프종, 흑색종, 자궁경부암, 갑상선암, 위암, 생식세포종, 담관암, 두개외암, 육종, 중피종, 뼈의 악성섬유 조직구종, 망막모세포종, 식도암, 다발성 골수종, 두경부암, 췌장암, 뇌실막종, 신경모세포종, 피부암, 난소암, 재발난소암, 전립선암, 정소암, 대장암, 림프세포증식질환, 난치성 다발성 골수종, 저항성 다발성 골수종 또는 골수증식질환을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한 실시형태에 따르면, 암은 특히 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 비소세포폐암, 소세포폐암, 뇌줄기 신경아교종, 아교모세포종, 소뇌별아교세포종 및 대뇌별아교세포종을 포함하는 별아교세포종, 시각경로 신경아교종, 시상하부교종, 천막상 원시 신경외배엽성, 송과체 종양, 속질모세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 외투층 세포 림프종, 호지킨병, 간세포암종, 신장세포 암종, 윌름스종양, 방광암, 요로암, 종양의 유잉 육종 패미리, 골육종, 횡문근육종, 연조직 육종, 중피종, 유방암, 자궁내막암, 구강암, 흑색종, 자궁경부암, 갑상선암, 위암, 생식세포종, 담관암, 두개외암, 뼈의 악성섬유조직구종, 망막모세포종, 식도암, 다발성 골수종, 췌장암, 뇌실막세포종, 신경모세포종, 피부암, 난소암, 재발성 난소암, 전립선암, 정소암, 대장암, 림프세포증식질환, 난치성 다발성 골수종, 저항성 다발성 골수종, 또는 골수증식질환으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 암은 특히 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 비소세포폐암, 소세포폐암, 뇌줄기 신경아교종, 아교모세포종, 소뇌별아교세포종 및 대뇌별아교세포종을 포함하는 별아교세포종, 시각경로 신경아교종, 송과체 종양, 속질모세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 외투층 세포 림프종, 호지킨병, 간세포암종, 신장세포 암종, 방광암, 요로암, 골육종, 유방암, 자궁내막암, 구강암, 흑색종, 자궁경부암, 갑상선암, 위암, 뼈의 악성섬유조직구종, 망막모세포종, 식도암, 다발성 골수종, 췌장암, 신경모세포종, 피부암, 난소암, 전립선암, 정소암, 대장암, 림프세포증식질환 또는 골수증식질환으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 암은 특히 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 비소세포폐암, 소세포폐암, 뇌줄기 신경아교종, 아교모세포종, 소뇌별아교세포종 및 대뇌별아교세포종을 포함하는 별아교세포종, 속질모세포종, 신장세포 암종, 방광암, 요로암, 유방암, 구강암, 흑색종, 자궁경부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 전립선암 또는 대장암으로부터 선택된다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명은 화학식(1)의 화합물 또는 화학식(1c)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량을 대상체에 투여함으로써 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 화학식(1c)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
화학식(1)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체; 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염은 경구적으로, 비강으로, 국소적으로, 피하로, 근육내료, 정맥내로, 또는 다른 투여방식으로 투여할 수 있다.
특별한 경우에 적합한 투여방법은 치료하고자 하는 암의 종류 및 암의 단계에 따라 다르다. 또한 투여방법은 당해분야에 알려진 방법을 사용하여 개업의에 의해 최적화할 수 있다.
관례적으로, 특정한 경우에 적합한 투여량 범위는 치료하는려는 유형 및 각각의 증상 또는 질환의 상태에 따라 달라진다. 선택되는 투여량 수준은 개개 환자의 나이, 체중 및 신체 건강 및 반응, 약물동태, 질환의 중증도 등과 같은 다수의 인자들, 및 의학 분야에 알려진 인자들에 따라 선택되는 투여 경로, 치료하려는 증상(암)을 포함하는 관련 상황을 고려하여 숙련된 개업의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에서 활성성분의 실제 투여량 수준은 특수한 환자 (치료가 필요한 대상체)에게 원하는 치료 반응, 환자에게 독성이 없는 투여 조성 및 방식을 달성하는데 효과적인 활성성분의 량을 달성하기 위하여 변화할 수 있다. 평균하여, 환자를 위한 활성 화합물 (본 발명의 화합물의 하나 이상)의 일일 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 200 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 범위 또는 본 명세서에 지적된 바와 같은 더 넓은 투여량 범위의 범주내에 속하는 임의의 투여량 범위일 수 있다. 치료가 필요한 대상체의 더 높은 체중의 경우에, 활성 화합물의 투여량은 약 1 mg 내지 약 1000 mg 또는 약 5 mg 내지 약 500 mg 범위일 수 있다. 활성화합물, 즉 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 넓은 범위에 걸쳐 선택할 수 있다. 투여하고자 하는 일일 투여량은 암이 치료되는 대상체에서 원하는 치료효과를 달성하기 위해 선택할 수 있다. 필요에 따라, 더 높거나 더 낮은 일일 용량이 또한 투여될 수 있다.
화학식(1)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 화학식(1c)의 유도체를 다른 약학적으로 허용가능한 부형제 예를 들어 습윤제, 가용화제 예를 들어 계면활성제, 비히클, 등장화제, 충진제, 착색제, 마스킹 향미제, 윤활제, 붕괴제, 희석제, 결합제, 가소제, 유화제, 연고 베이스, 유연제, 증점제, 폴리머, 지질, 오일, 공용매, 복합체 형성제, 또는 완충체 물질과 함께 함유하는 약학적 조성물은 비경구 투여에 적합한 정제, 피복된 정제, 캡슐, 과립, 분말, 크림, 연고제 겔, 시럽, 유액, 현탁액, 또는 용액 형태이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 화학식(1)의 화합물 또는 화학식(1c)의 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 조성물은, 본 명세서에 기술된 바와 같은 암을 치료하기 위한, 아스파라기나제, 블레오마이신, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파제, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루오로우라실, 헥사메틸멜라민, 하이드록시우레아, 이포스파미드, 류코보린, 로무스틴, 메클로르에타민, 6-메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토산트론, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카르바진, 스트렙토조신, 타목시펜, 티오구아닌, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 아미노글루테티미드, 5-아자시티딘, 클라드리빈(cladribine), 부술판(busulfan), 디에틸스틸베스트롤, 2',2'-디플루오로데옥시시티딘, 도세탁셀, 에리스로-9-(2-하이드록시-3-노닐)아데닌, 에티닐 에스트라디올, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트, 플루다라빈 포스페이트, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 이다루비신, 인터페론, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스프롤 아세테이트, 멜팔란, 미토탄, 파클리탁셀, 펜토스타틴, N-포스포노아세틸-L-아스파테이트(PALA), 프리카마이신, 테니포시드, 테스토스테론 프로피오네이트, 티오테파, 트리메틸멜라민, 우리딘, 비노렐빈, 알스테르파울론, 부티로락톤 I, 2-(2-하이드록시에틸아미노)-6-(3-클로로아닐리노)-9-이소프로필 퓨린, 인디루빈-3'-모녹심, 켄파울론, 올로모우신, 이소-올로모우신, N9-이소프로필-올로모우신, 푸르발라놀 A, 로스코비틴, (S)-이성체 로스코비틴 및 WHI-P180 [4-(3'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린]과 같은 하나 이상의 항암제와 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시형태의 작용에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형은 본 명세서에 기술된 본 발명의 범위 내에 포함된는 것으로 이해된다. 따라서 다음 실시예들은 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예
다음 용어/부호/약자/화학식이 실시예에서 사용된다:
Figure pct00023
실시예 1
해양근원으로부터 배양번호 PM0895172의 분리
a) 분리 배지의 조성
1% 펩톤, 2% 글루코오스, 0.2% 탄산칼슘, 0.001% 염화 코발트.6H2O, 1.5% 한천; pH (25℃) 7.5.
인공해수(ASW)의 조성: 2.46% 염화 나트륨, 0.067% 염화 칼륨, 0.136% 염화 칼슘, 0.629% 황산 마그네슘, 0.466% 염화 마그네슘, 0.018% 중탄산 나트륨; 물.
b) 절차
심해 침전물 시료는 인도 마하라시트라 뭄바이의 연안 지역에서 수집하고 인도 고레가온(이스트) 피라말 엔터프라이스 리미티드 (전 피라말 헬스케어 리미티드)의 NCE 연구부 (피라말 라이프사이언스 부)에 여행을 통하여 -20℃에서 저장하였다.
분자 접급은 수집된 침전물 시료로부터 미배양된 해양 방선균의 분리를 위해 수행하였다. 이를 위해, 게놈 DNA는 침전물 시료로부터 분리하고 폴리케타이드 신타제 (PKS) 및 비-리보솜 펩타이드 합성효소(NRPS)의 존재하에 증폭시켰다. 다음에 목적한 배양물은 NRPS 경로를 갖는 침전물 시료로부터 분리하였다.
시료는 -20℃ 내지 -22℃에서 저장하고 나중에 미생물의 분리를 위해 실온 (25±2℃)에서 저장하였다. 토양시료(~2 g)는 오토클레이브 유발과 유봉 속에서 25ml의 멸균 인공해수(ASW) 중에 현탁하고 철저하게 분쇄하였다. 1 ml의 이 현탁액을 시험관에 옮기고 30초 동안 와류(vortex)시켰다. 시험관은 30초 동안 와류시켰다. 10-5까지 계단희석은 멸균 ASW에서 준비하였다. 100㎕의 10-3희석은 분리 배지를 함유하는 플레이트 상에 계면전개하였다. 플레이트는 콜로니가 관찰될 때까지 실온 (25±2℃)에서 배양하였다. 20-22일 동안 배양 후에, 이 배지상에 나타난 콜로니는 상기 언급한 바와 같이 분리 배지를 함유하는 페트리 플레이트에서 스트리킹(streak)하였다. 분리물을 정제하고 배양 식별번호 PM0895172를 부여하였다. 따라서 배양번호 PM0895172는 단일 분리물로서 성장하는 미생물 중에서부터 분리하였다.
실시예 2
배양번호 PM0895172의 정제
a) 정제 배지의 조성
1% 펩톤, 2% 글루코오스, 0.2% 탄산 칼슘, 0.001% 염화 코발트.6H2O, 1.5% 한천; pH (25℃) 7.5.
b) 절차
배양 번호 PM0895172는 정제 배지를 함유하는 페트리 플레이트 상에서 스트리킹하였다. 페트리 플레이트는 27℃에서 10일 동안 배양하였다. 페트리 플레이트로부터 분리된 콜로니의 하나는 새로운 경사면 ISP4 한천 배지(인도 히메디아)에 옮겼다. 경사면 배지는 27℃에서 10일 동안 배양하였다.
실시예 3
균주-배양번호 PM0895172의 유지
이러한 특별한 균주는 경사면 함유 ISP4 배지(인도 메디아)상에 유지시켰다. 가열에 의해 배지를 철저하게 용해한 후에, 수득된 용액은 시험관에 분배시키고 121℃에서 30분 동안 멸균시켰다. 시험관을 냉각하고 경사 위치에서 고화시켰다. 경사면 한천 배지를 와어어 루프에 의해 잘 성장된 배양 번호 PM0895172으로 스트리킹하고 양호한 성장이 관찰될 때까지 27℃ 내지 29℃에서 배양하였다. 잘 성장된 배양물은 4℃ 내지 8℃에서 냉장고에 저장하였다.
실시예 4
진탕 플라스크 속에서 배양번호 PM0895172의 발효
a) 종 배지의 조성
0.2% 탄산 칼슘, 0.5% 염화 나트륨, 0.5% 옥수수 침지액, 0.75% 펩톤, 1.5 % 글루코오스, 0.75% 효모 추출물; 탈광물수; pH 7.
b) 절차
50 ml의 상기 종배지는 500ml 용량 삼각 플라스크에 분배하고 121℃에서 30분 동안 가압 멸균시켰다. 플라스크를 실온 (25±2℃)으로 냉각하고 각각의 플라스크를 경사면 배지상에 루프 량의 잘 성장된 생산 균주 (배양번호 PM895172)로 배양하고 230rpm 내지 250 rpm에서 72시간 동안 30℃(±1℃)에서 회전식 진탕기에서 진탕시켜 종배양물을 생성시켰다.
c) 생산배지의 조성
1% 펩톤, 2% 글루코오스, 0.2 % 탄산 칼슘, 0.001% 염화 코발트.6H2O, 1.5 % 한천 및 pH ( 25℃) 7.5.
d) 절차
500 ml 용량 삼각 플라스크 중에 100 ml의 생산 배지를 121℃에서 30분 동안 가압 멸균하고 29℃ 내지 30℃로 냉각하고 실시예 4b에 언급된 3% (v/v)의 종배양으로 파종하였다.
e) 발효 파라미터
생산 플라스크는 30℃ 및 220rpm에서 96 시간 동안 진탕기 상에서 배양하였다. 생산 플라스크를 수집하고 (수집 pH: 7.0 내지 8.0) 및 각 배지 플라스크로부터 전체 배양 액체 배지를 동일 부피의 용매 혼합물(메탄올: 에틸 아세테이트(1:9)]로 추출하였다. 이들 수집된 플라스크를 실온에서 4-6시간 동안 추출을 위해 유지시킨 다음 상청액을 분리시켰다. 상청액을 항암활성을 시험하기 위해 사용하였다.
실시예 5
발효조 배치용 진탕 플라스크에서 종배양물의 제조
a) 종배지 274(1)의 조성:
글루코오스 15 g, 옥수수 침지액 5 g, 펩톤 7.5 g, 효모 추출물 7.5 g, 탄산 칼슘 2 g, 염화 나트륨 5 g, 탈광물수 1.0 L, pH 6.5-7.5(멸균 전).
b) 절차
200 ml의 상기 배지를 1000ml 삼각 플라스크에 분배하고 121℃에서 30 분 동안 가압 멸균시켰다. 플라스크를 실온으로 냉각하고 각각의 플라스크를 경사면 배지상에 루프량의 잘 성장된 생산 균주 (PM0895172)로 배양하고 230-250rpm 및 29℃ 내지 30℃에서 70-74 시간 동안 회전식 진탕기 상에서 진탕하여 종 배양물을 얻었다.
실시예 6
발효조에서 배양번호 PM0895172의 배양
a) 생산 배지의 조성
소야 펩톤 10 g, 글루코오스 20 g, 탄산 칼슘 2g, 염화 코발트 0.001 g, 탈광물수 1.0 L, pH 7.0 (멸균 전).
b) 절차
기포방지제로서 200 ml의 데스모펜(desmophen)과 함께 500 L의 생산 배지를 1000L 발효조에서 500mL의 생산 배지를 121℃에서 20분 동안 인사이투 살균처리하고, 29℃ 내지 30℃로 냉각하고 실시예 5b에서 얻어진 8-10 L의 종배양물로 파종하였다.
c) 발효 파라미터
온도 29℃ - 30℃, 선단 속도 0.94m/s, 에어레이션 250 lpm 및 수집시간 24 hrs. 배양 액체 배지의 수집 pH는 6.5-7.5이었다. 발효 액체 배지에서 화학식(1a)의 화합물 또는 화학식(1b)의 화합물의 생산은 HPLC로 결정하고 생물활성은 항암작용을 위해 시험하였다.
실시예 7
화학식(1a)의 화합물의 분리 및 특성화
실시예 6의 단계 c)에서 얻어진 수집된 전체 액체 배지(500 L)는 에틸아세테이트(500 L)을 사용하여 추출하였다. 유기 층은 디스크 스택 분리기 [Alfa Laval (USA), 모델 번호 LAPX404]를 사용하여 분리하고 농축시켜 조추출물(150 g)을 얻었다.
조 추출물은 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔, 용매: 이소프로필 알코올/클로로포름)으로 처리하였다. 활성 화합물은 클로로포름 중 1-2% 이소프로필 알코올로 용출시키고, 이를 농축시켜 농화 화합물(30g)을 얻었다.
이 물질은 칼럼 크로마토그래피 (RP C-18 실리카 겔, 용매: 물/아세토니트릴)로 정제하였다. 활성 화합물은 물 중에 40% 아세토니트릴로 용출시키고, 이를 증발시켜 2 g의 원하는 화학식(1)의 반 순수한 활성 화합물[화학식(1a) 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물]을 얻었다.
추가의 정제는 다음과 같이 역상 분취용 HPLC로 수행하였다:
칼럼 : 물의 X-Bridge RP-18 (250 mm X 19 mm, 10μ)
용리제 : 아세토니트릴 : 물 ( 50:50).
유속 : 25 ml/분
검출(UV) : 220 nm
수집된 활성 피크를 증발 건조시켜 1g의 활성 화합물 (화학식(1a)의 화합물)을 얻었다.
활성화합물의 최종 정제는 다음과 같이 실리카 겔 분취용 HPLC로 수행하였다:
칼럼 :물의 설파이어 실리카, (150 mm X 19 mm, 5μ)
용리제 : 클로로포름 : 메탄올 (98.5 : 1.5)
유속 : 15 ml/분
검출(UV) : 240 nm
Rt 시간 : 8-9 분.
반복된 주입으로부터 활성 화합물을 함유하는 용리제를 농축시켜 145ml의 화학식 (1a)의 순수한 화합물을 얻었다.
화학식(1a)의 화합물의 물리적 및 스펙트럼 특성은 표 1에 나타낸다.
분석적 HPLC 조건은 다음과 같다:
칼럼 : Kromasil RP-18 (150 mm X 4.6 mm, 3.5μ)
용리제 : 구배 (물에 대하여 20 분 내에 10% 아세토니트릴 내지 100% 아세토니트릴, 이어서 추가 5 분 동안 100% 아세토니트릴).
유속 : 1 ml/분
검출(UV) : 220 nm
보유시간 : 17-18 분 (순도 > 99 %)
화학식(1a)의 화합물의 물리적 및 스펙트럼 특성
외관 백색 비결정 분말
융점 175℃-177℃
용해성 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메탄올 중에 가용성; 물 중에 불용성
HR MS (m/z) 849.4287 (M + Na)
분자량 826.9
분자식 C37H62N8O13
IR (KBr) 3325, 2960, 2872, 1755, 1641, 1524, 1445, 1331, 1306,
1288 및 1254 cm-1
1H NMR
(500 MHz, CDCl3)
 δ 9.20, 8.00, 7.10, 6.90, 6.40, 6.10, 5.40, 5.38, 5.29, 5.10, 4.90, 4.80, 4.70, 4.60, 3.90, 3.70, 3.15, 2.70, 2.30, 2.10, 1.98, 1.95, 1.77, 1.71, 1.68, 1.60, 1.52, 1.40, 1.15, 1.10, 1.05, 0.98, 0.95, 0.90, 0.88 및 0.85 (도 1에 도시된 바와 같음)
13C NMR
(75 MHz, CDCl3)		 δ 176.0, 172.0 (3), 171.0, 170.0, 169.0, 99.9, 78.9, 77.2, 71.7, 53.5, 52.9, 49.3, 49.0, 47.1, 46.7, 46.2, 42.2, 41.0, 39.8, 29.9, 27.4, 24.8, 24.6, 24.2, 24.1, 23.2, 21.7, 21.5 (2), 20.6, 19.9, 19.4, 18.1, 12.9 및 11.7 (도 2에 도시된 바와 같음)
실시예 8
화학식(1b)의 화합물의 분리 및 특성화
화학식(1a)의 화합물과 화학식(1b)의 화합물의 혼합물을 함유하는 실시예 7에서 RP-18 분취용 HPLC 후 얻어진 반-순수한 화합물은 RP-18 분취용 HPLC로 적용시켜 15 mg의 순수한 화학식(1b)의 화합물을 얻었다. 화학식(1b)의 화합물의 물리적 및 스펙트럼 특성은 표 2에 제공된다.
분석적 HPLC 조건은 다음과 같다:
칼럼 : Kromasil RP-18 (150 mm X 4.6 mm, 3.5 μ)
용리제 : 구배 (물에 대하여 20 분 내에 10% 아세토니트릴 내지 100% 아세토니트릴, 이어서 추가 5 분 동안 100% 아세토니트릴).
유속 : 1 ml/분
검출 (UV) : 220 nm
보유 시간 : 15-17 분 (순도 > 99 %)
화학식(1b)의 화합물의 물리적 및 스펙트럼 특성
외관 백색 비결정 분말
융점 165℃-170℃
용해성 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메탄올 중에 가용성; 물 중에 불용성
HR MS (m/z) 849.4287 (M + Na)
분자량 824.4
분자식 C37H60N8O13
IR (KBr) 3342, 3030, 2953, 1752, 1650, 1524, 1421, 1293, 1255 및 1239 cm-1
1H NMR
(500 MHz, CDCl3)
 δ 9.20, 8.00, 7.19, 7.0, 6.18, 6.14, 5.80, 5.41, 5.39, 5.30, 5.10, 4.80 (2), 4.20, 3.70, 3.19, 2.62, 2.27, 2.10, 2.01, 1.98, 1.77, 1.71, 1.62, 1.58, 1.44, 1.40, 1.39, 1.37, 1.20, 1.10, 1.05, 0.96, 0.91, 0.90, 0.86, and 0.85 (도 3에 도시된 바와 같음)
13C NMR
(75 MHz, CDCl3)		 δ176.0, 171.8, 171.7, 170.8, 170.6, 170.3, 168.9, 144.6, 98.8, 79.0, 77.2, 71.7, 53.6, 53.5, 50.6, 49.1, 47.1, 46.4, 42.6, 41.0, 39.8, 29.9, 27.4, 24.7, 24.6, 24.2, 24.0, 22.1, 21.5, 21.4, 19.8, 19.5, 19.4, 18.1, 17.2, 12.9 and 11.8 (도 4에 도시된 바와 같음)
실시예 9
2-하이드록시-N-(18-하이드록시-22-이소프로폭시-6-메톡시-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소테트라코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자 사이클로노데신-23-일)-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미드(화합물 1) 및
2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)-N-(22-이소프로필-6,18-디메톡시-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소테트라코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-23-일)프로판아미드 (화합물 2)의 제조.
메탄올 (1 ml) 및 톨루엔 (1 ml) 중 화학식(1a)의 화합물(실시예 7에 기술됨, 20 mg, 0.024 mmol]의 용액에, TMSCHN2 (트리메틸실릴디아조메탄) (48 ㎕, 0.097 mmol, 핵산 중 2M 용액)을 적가하고 수득된 반응 혼합물을 0℃에서 3 시간 동안 교반한 다음 실온으로 가온하였다. 반응 완료 후에, 용매를 제거하여 고체를 얻고 이를 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 디클로로메탄 중 1% 메탄올)로 정제하여 5mg의 화합물 1 및 3mg의 화합물 2을 얻었다.
화합물 1: 1HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.98, 7.10, 6.92, 6.54, 6.20, 5.52, 5.50, 5.30, 5.16, 5.14, 5.07, 4.96, 4.54, 4.51, 4.13, 4.05, 3.80, 3.18, 3.12, 2.79, 2.14, 2.04, 1.98, 1.95, 1.77, 1.71, 1.68, 1.60, 1.52, 1.45, 1.15, 1.10, 1.05, 0.98, 0.95, 0.90, 0.88, 0.85; ESI-MS: m/e 839 (M-H)-.
화합물 2: 1HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.85, 7.15, 7.10, 6.20, 5.82, 5.42, 5.38, 5.30, 5.15, 4.98, 4.80, 4.60, 4.15, 3.95, 3.85, 3.70, 3.25, 3.15, 2.85, 2.23, 2.15, 1.98, 1.95, 1.77, 1.71, 1.68, 1.65, 1.60, 1.52, 1.44, 1.15, 1.10, 1.05, 0.98, 0.95, 0.90, 0.88, 0.85; ESI-MS: m/e 853 (M-H)-.
실시예 10
18-하이드록시-23-(2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미도)-22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소아이코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-6(7H,13H,22H)-일 3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)프로파노에이트(화합물 3)의 제조
방법 I:
THF (5 ml) 중 화학식(1a)의 화합물 [실시예 7에 기술됨, 40 mg, 0.048 mmol]의 용액에, Cbz 알라닌 (27 mg, 0.12 mmol) 및 PyBOP (75 mg, 0.14 mmol)을 0℃에서 첨가한 다음 DIPEA (51㎕, 0.29 mmol)을 적가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 물(5 ml)로 희석하고 에틸아세테이트(3 x 20 ml)로 추출하였다. 결합된 유기층을 포화된 NaHCO3, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고 원심분리하여 조화합물을 얻고 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 디클로로메탄 중 1 % 메탄올)로 정제하여 화합물 3을 얻었다.
수율: 12 mg; 1HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.90, 7.39, 7.2, 6.45, 6.34, 6.15, 5.65, 5.50, 5.38, 5.30, 5.15, 5.10, 4.90, 4.60, 4.50, 4.10, 3.85, 3.7, 3.65, 3.55, 3.4, 3.2, 3.15, 2.7, 2.6, 2.5, 2.3, 2.19, 1.98, 1.95, 1.77, 1.71, 1.68, 1.65, 1.60, 1.52, 1.44, 1.15, 1.10, 1.05, 0.98, 0.95, 0.90, 0.88, 0.85; ESI-MS: m/e 1030 (M-H)-.
방법 II:
아세토니트릴(20 ml, 0.121 mmol) 중 Cbz 알라닌(67.5 mg, 0.302 mmol)의 냉각 용액에, T3P (0.216 ml, 0.363 mmol, 에틸아세테이트 중 50 중량%)를 질소 분위기하에 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 아세토니트릴 (20 ml, 0.121 mmol) 중 화학식(1a)의 화합물[실시예 7에 기술됨, 100 mg, 0.121 mmol]을 상기 용액에 첨가한 다음 트리에틸아민(0.051 ml, 0.363 mmol)을 적가하였다. 수득된 반응 혼합물을 4시간 동안 연속적으로 교반하였다. 반응 완료 후에, 물 (10 ml)을 반응 혼합물에 첨가하고 반응 혼합물을 에틸아세테이트(3 x 20 ml)로 추출하였다. 결합된 유기층을 포화된 NaHCO3, 염수 및 물로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고 농축시켜 조 화합물을 얻고, 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔, 디클로로메탄 중 1-2 % 메탄올)로 정제하여 화합물 3을 얻었다. 수율: 38 mg.
실시예 11
18-하이드록시-23-(2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라 하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미도)-22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소아이코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아지사이클로노나데신-6(7H,13H,22H)-일 3-아미노프로파노에이트 (화합물 4)의 제조.
메탄올 (3 ml) 중 실시예 10에서 얻어진 화합물 3 (30 mg, 0.029 mmol)의 용액에, 1 당량 HCl, 및 촉매량의 10 % Pd/C를 첨가하고 수득된 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 셀라이트를 통하여 여과하고 여과액을 농축시켜 화합물 4를 얻었다.
수율: 15 mg; 1HNMR (DMSO-d6; 300 MHz): δ 7.92,7.30, 7.10, 6.75, 5.85, 5.45, 5.35, 5.15, 5.00, 4.85, 4.16, 3.86, 3.46, 3.10, 2.85, 2.73, 2.56, 2.15, 1.85, 1.80, 1.70, 1.68, 1.65, 1.60, 1.52, 1.44, 1.15, 1.10, 1.05, 0.98, 0.95, 0.88, 0.82, 0.80; ESI-MS: m/e 896 (M-H)-.
실시예 12
N-(6,18-디하이드록시-22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소-3,4,4a,5,6,7,8,9,10,11,15,16,16a,17,18,19,20,22,23,24-아이코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-23-일)-2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미드 (화합물 5)의 제조.
디클로로메탄 (6 ml) 중 실시예 7에서 얻어진 화학식(1a)의 화합물 (30 mg, 0.036 mmol)의 용액에, m-클로로퍼벤조산(18 mg, 0.104 mmol)을 0℃에서 첨가하고 수득된 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 물(20 ml)로 희석하고 디클로로메탄(3 x 25 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수, 물로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조하고 농축시켜 조 화합물을 얻고 칼럼 크로마토그래피(실리카겔, 디클로로메탄 중 5% 메탄올)으로 정제하여 화합물 5를 얻었다.
수율: 20 mg; 1HNMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 10.34, 9.62, 7.84, 7.52, 7.45, 7.43, 7.07, 6.68, 6.19, 5.77, 5.64, 5.51, 5.41, 5.04, 5.02, 4.94, 4.17, 4.12, 2.20, 1.98, 1.90, 1.60, 1.51, 1.33, 1.23, 1.04, 0.90, 0.87, 0.82; ESI-MS: 846(M+Na).
실시예 13
2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)-N-(22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소테트라코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-23-일)프로판아미드(화합물 6)의 제조.
교반 막대가 설치된 깨끗한 화염 건조 둥근 바닥 플라스크를 배기하고 Ar로 퍼징하였다. Cp2TiCl2(193 mg, 0.774 mmol)의 탈기된 THF 용액 (3 ml) 및 활성화 아연(411 mg, 6.29 mmol)을 Ar 하에 실온에서 45분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 색상은 어두운 적색에서 올리브 녹색으로 변하였다. 반응 혼합물을 -30 0℃로 냉각하고 3분에 걸쳐 적가된 실시예 7에서 얻은 화학식(1a)의 화합물 (40 mg, 0.048 mmol)의 메탄올 용액(3 ml)으로 충진하였다. 반응 혼합물을 -30℃ 내지 -10℃의 욕온도를 유지하면서 45분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 포화된 5% K2CO3 (5 ml) 및 에틸 아세테이트(20 ml)로 분할하였다. 유기층을 피펫을 통해 제거하고 와트만 글래스 마이크로파이버 필터 (타입 GF/F)을 통해 여과하여 불용성 티타늄 염을 제거하였다. 수성층을 에틸 아세테이트(4 x 20 ml)로 추출하고 유기층을 각각의 추출 후 와트만 글래스 마이크로파이버 필터(타입 GF/F)을 통해 여과하였다. 결합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 농축시켜 고체를 얻고, 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔, 핵산 중 70% 에틸아세테이트)로 정제하여 화합물 6을 얻었다.
수율: 8 mg; 1HNMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 8.32, 7.78, 6.87, 6.65, 6.25, 5.75, 5.59, 5.32, 5.28, 5.21, 5.15, 4.95, 4.77, 4.73, 4.45, 4.23, 4.12, 3.94, 3.34, 2.73, 2.27, 2.18, 2.08, 1.99, 1.88, 1.63, 1.35, 1.30, 1.23, 1.04, 0.90, 0.87; ESI-MS: 817(M+Na).
실시예 14
18-하이드록시-23-(2-하이드록시-2-(2-하이드록시-5-이소부틸-6-메틸테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판아미도)-22-이소프로필-7,19-디메틸-5,8,11,17,20,24-헥사옥소아이코사하이드로디피리다지노[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]옥사펜타아자사이클로노나데신-6(7H,13H,22H)-일 아세테이트(화합물 7)의 제조
디클로로메탄 (10 ml) 중 실시예 7에서 얻어진 화학식(1a)의 화합물 (0.050 g, 0.060 mmol)의 용액에, 피리딘 (0.0255 ml, 0.30 mmol)을 0℃에서 첨가하고 15분 동안 교반한 다음, 염화 아세틸(0.043 ml, 0.60 mmol)을 첨가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 30 ml)로 추출하였다. 결합된 유기층을 묽은 1% HCl (5 ml), 물 (10 ml)로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조하고 농축하였다. 조생성물을 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 2% 메탄올)로 정제하여 화합물 7을 얻었다.
수율: 15mg; 1HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.92, 7.28, 6.85, 6.45, 6.15, 5.45, 5.36, 5.20, 5.15, 4.90, 4.85, 4.65, 4.21, 3.80, 3.15, 2.35, 2.25, 2.12, 1.98, 1.95, 1.77, 1.71, 1.68, 1.60, 1.52, 1.40, 1.15, 1.05, 0.98, 0.95, 0.90, 0.88, 0.86; ESI-MS: 891(M+Na).
실시예 15
페길화된 접합체(화합물 8)의 제조
DMF (10 ml, 0.223 mmol) 중 실시예 11에서 얻어진 화합물 4 (200 mg, 0.223 mmol)의 용액에, 0℃에서 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(135 ml, 0.779 mmol)을 첨가하고 O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙신일 아미노)에틸]폴리에틸렌 글리콜 (722 mg, 1.448 mmol)을 한번에 첨가하고 수득된 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. DMF를 실온에서 고속 진공하에 제거하여 고체를 얻고, 세파덱스 G-15 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 통해 정제하였다.
검정 곡선은 269 nm의 흡광도에 대하여 DMF 및 물 중에 화학식(1a)의 유리 화합물의 일련의 농도를 사용하여 구축하였다. 페킬화 접합체의 농도는 다음과 같은 식을 사용하여 화학식(1a)의 화합물의 함량에 기초하여 측정하였다.
PEG 접합체의 농도 = 페길화된 접합체의 흡광도 - (절편 / 기울기)
페길화된 접합체 형태(화합물 8)에서 화학식(1a)의 화합물의 함량은 10%인 것으로 발견되었다.
실시예 16
화학식(1a)의 화합물의 생물학적 평가
다음과 같은 용어/부호/약자/화학식은 약리학적 평가에서 사용된다.
Figure pct00024
시험관내 분석
분석은 분석의 교시를 위해 참고로 도입되는 문헌 BMC Cancer, 2010, 10, 610, 1-11에서와 같이 설계하였다.
단층 분석
단계 1
세포주의 유지
인간 종양 세포주: Panc-1 (췌장암), HCT 116 (대장암), ACHN (신세포 암), Calu-1 (폐암), MiaPaca2 (췌장암), FADU (두경부암), PC3 (전립선암), G361 (흑색종), MDA-MB435S (흑색종), HeLa (자궁경부암)은 AMIMED (스위스 BioConcept)로부터 입수된 이글의 기초염(MEM - EBS)을 갖는 최소 기초 배지에서 성장시켰다. 종양 세포주: MDA-MB231 (유방암), JURKAT (T 세포 백혈병), H460 (소세포 폐암)은 RPMI 1640 (AMIMED, BioConcept, 스위스) 배지에서 배양하였다. 모든 종양 세포주는 10% 소태아혈청 (FBS) (GIBCO), 1% 페니실린/스트렙토마이신(시그마) 및 1% Anti-Anti (GIBCO)로 보충하고 T-175 조직배양 플라스크(Nunc)에서 성장시켰다. MCF-10A, 비종양형성성 세포주는 모든 표준 첨가물을 갖는 유방 상피 기초배지(MEBM)에서 배양하였다(Lonza, Catalog. No. CC-3150). 모든 세포들은 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포들은 80 - 90% 합류(confluence)에서 계대배양시켰다. 부착세포들은 트립신-EDTA (시그마)를 사용하여 트립신화하고 유지시켰다. 모든 세포주는 ATCC (Rockville, MD, 미국)으로부터 구입하였다.
단계 2
시료 제조
화학식(1a)의 화합물 (실시예 7에 기술됨)은 DMSO 중에 용해시켜 필요한 저장 용액 20 mM을 생성시켰다. 8개의 상이한 농도의 화학식(1a)의 화합물은 저장용액이 계단 희석에 의해 제조하며 최종적으로(시험 농도에 비하여) 200배 더 높은 농도를 생기게 하였다. 화학식(1a)의 화합물은 0.0001 μM, 0.001μM, 0.01 μM, 0.03 μM, 0.1 μM, 0.3μM, 1 μM 및 3 μM의 농도에서 각각 시험하였다. 각각의 농도는 3회 평가하였다.
단계 3
평가
화학식(1a)의 화합물의 IC50 의 측정방법
a) 상이한 암/정상 세포들은 조직배양 등급 96 웰 플레이트에서 3000 셀/200 μL웰의 밀도로 파종하고 이들을 37±0.5℃에서 가습된 5±0.2% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 회수하였다.
b) 24시간 후, DMSO 중에 용해된 1 μL의 200 X (필요한 농도보다 200 배 더 높은 농도는 200 X로 나타냄) 화학식 (1a)의 화합물을 암/정상 세포들로 파종된 상기 조직배양 플레이트에 첨가하였다. DMSO의 최종 농도는 웰 중에 0.5%이었다. DMSO는 비히클 대조군으로 사용하였다.
c) 24시간 후 플레이트는 CO2 인큐베이터로부터 제거하고 웰당 5 μL의 CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc. 미국, 카탈로그 번호 CK04-20)를 첨가하였다.
d) 이어서 플레이트는 37℃에서 2 시간 동안 방치하였다.
e) 흡광도는 450nm에서 기록하였다.
f) 세포독성율은 다음 식을 이용하여 계산하였다:
세포독성율 = (비히클 대조군의 판독 - 처리된 세포의 판독) / 비히클 대조군의 판독 X 100
IC50 값은 농도 농도효과 곡선의 시각검사에 의해 평가하였다. 시험된 14개 세포주에 대한 평균 IC50 값이 계산을 위해, 기하평균을 선택하였다.
결과는 하기에 나타낸 표 3에 나타낸다.
상이한 암세포주 및 정상세포에서 화학식(1a)의 화합물의 IC50 값
일련번호 암세포주 암의 종류 IC 50 (μM)
1 Panc-1 췌장 0.0013 ± 0.00032
2 H460 비소세포폐 0.0092 ± 0.00076
3 ACHN 신장 0.0071 ±0.00064
4 HCT116 결장 0.0151 ± 0.0023
5 Calu 1 폐 0.0252 ± 0.0035
6 MiaPaca 2 췌장 0.0253 ± 0.0046
7 FADU 두경부 0.0224 ± 0.0012
8 PC3 전립선 0.0052 ± 0.00041
9 G361 흑색종 0.0241 ± 0.0043
10 MDAMB435S 흑색종 0.0029 ± 0.00048
11 MDAMB231 유방 0.0061 ± 0.00052
12 HeLa 자궁경부 0.0101 ± 0.0031
13 Jurkat T세포 백혈병 0.0159 ± 0.0026
14 MCF10A 정상유방상피 0.0197 ± 0.0031
결론
시험관내 연구는 화학식(1a)의 화합물이 상이한 암세포에서 0.0013 μM 내지 0.025 μM 범위의 IC50을 보여준 반면, 정상세포 (MCF-10A)에서는 0.019 μM의 IC50 를 보여준 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 화학식(1a)의 화합합이 고도로 증식성인 암세포주에 대하여 활성이 있다는 것을 보여준다.
실시예 17
분석
FITC 아넥신 V 세포자멸사의 검출:
아넥신(annexin) V 분석, 즉 세포자멸사를 검출하는 전통적인 기술은 흐름 세포측정에 의해 세포자멸사를 검출하는 가장 흔하게 사용되는 방법이다. 세포자멸사의 가장 초기의 특징 중의 하나는 원형질막의 내엽을 외엽으로 포스파티딜세린을 전위하여 포스파티딜세린을 외부 환경으로 노출시키는 것이다.
아넥신 V (카탈로그 번호 556420, BD 바이오사이언스, 미국)은 세포 표면상에 노출된 포스파티딜세린에 결합하여 세포자멸사의 가장 초기 단계에서 세포들을 확인한다.
a) HeLa 암세포[실시예 16의 단계 1에서 언급됨]는 조직 배양 등급 96 웰 플레이트에서 0.5 x 106 세포/2000μL웰의 밀도로 파종하고 이들을 37 ± 0.5℃에서 가습된 5±0.2% CO2 인큐베이터에서 12 시간 동안 회수시켰다.
b) 12 시간 후에, DMSO 중에 용해된 5μL의 200 X (필요한 농도보다 200배 더 높은 농도는 200 X로 나타냄) 화학식(1a)의 화합물은 HeLa 암세포로 파종된 상기 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 화학식(1a)의 화합물의 최종 시험 농도는 0.0003 μM, 0.003 μM 및 0.01 μM이었다, 웰에서 DMSO의 최종 농도는 0.5%이었다.
c) 48 시간 후에, 플레이트는 CO2 인큐베이터에서 제거하고 제조업자의 설명서에 따라 세포자멸사 검출 키트를 사용하여 FITC 아넥신 V를 위해 염색하였다. (카탈로그 번호: 556547, BD 바이오사이언스, 미국).
d) 처리된 세포는 아넥신 V 검출을 위한 BD 세포흐름법으로 분석하였다. M1 및 M2에 존재하는 집단은 FACS 분석을 사용하여 결정하였다.
결과: 비히클 대조 세포는 2.01% 아넥신 V 양성 세포(M2)를 나타낸 반면, 0.0003μM, 0.003μM 및 0.01μM 농도로 각각 12 시간 동안 화학식(1a)의 화합물에 노출된 세포는 아넥신 V 염색 (M2)에 대해 각각 33.80%, 40.27% 및 59.05% 세포 양성을 나타냈다 (도 5에 나타낸 바와 같음).
결론: 이 데이터는 화학식(1a)의 화합물이 HeLa 암세포에서 세포자멸사를 통해 세포 사멸을 유발한다는 것을 나타낸다.
실시예 18
분석
고농도 스크리닝에 의한 단백질 발현의 연구
사이클린 D, 핵인자-카파 B (p65) [NFkB (p65)], 리보솜 단백질 S6 (pS6), 종양 단백질 53 (p53), 단백질 c-jun N-말단 키나제 (pJNK), 절단 카스파제 9, 절단 카스파제 3 및 절단 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP)의 단백질 발현은 Cellomics 고함량 이미지에 의해 HeLa 세포 [실시예 16의 단계 1에서 언급됨]에서 수행하였다. 이들 일차 항체는 미국 Santacruz Biotechnology에서 구입하였다. 간략하게, 1 X 104 세포는 투명한 바닥을 갖는 96웰 조직 배양 등급 블랙 플레이트 (미국 Nunc)로 파종하고 24 시간 동안 접착시킨 다음 새로운 배지로 대체하고 세포를 화학식(1)의 화합물(실시예 16의 단계 2에서 언급됨)의 0.01μM, 0.003μM 및 0.0003μM 농도로 처리하고 1시간 및 3시간 동안 각각 배양하였다. 각각의 시점 후에, 세포들은 실온에서 10분 동안 3.7% 포름알데히드 (Sigma St. Louis, MO)로 고정한 다음, 0.15% 트리톤 X-100 (Sigma St. Louis, MO)으로 10 분 동안 투과처리하였다. 다음에 세포들은 5% 소혈청 알부민으로 2 시간 동안 블로킹하였다. 블로킬 단계 후에, 특이적 일차 항체는 1시간 동안 첨가하고 상이한 단백질의 일차 항체는 Dylight548 (적색) (Thermofisher, 미국)으로 표지된 이차 항체 의해 국소화하였다. 이차 배양 후에, 핵은 Hoechst 3342 (청색) (Sigma, 미국)으로 염색하였다. 면역형광은 Cellomics Array Scan® VTI HCS 판독기 (Thermo-Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)상에 플레이트를 스캐닝하여 측정하였다. 모든 데이터 점들은 Cellomics의 컴파트먼트 분석 바이오 알고리즘을 사용하여 분석하고, 정량적 데이터는 미처리된 세포에 비하여 활성화율로 표현하였다. 1000 셀은 각각의 반복시험 웰에 대해 카운트하고 결과들은 평균 ±S.E.로 나타냈다.
결과들은 표 4 및 표 5에 요약된다.
3시간 후 HeLa 세포에서 p53, pJNK, 절단 카스파제 9, 절단 카스파제 3 및 절단 PARP 발현에 대한 화학식(1a)의 효과
대조 세포에 대한 폴드 활성화(fold activation)
화학식(1a)의 농도 P53 pJNK 절단 카스파제 9 절단카스파제 3 절단 PARP
0.0003μM -0.15 0.55 -0.04 -0.04 0.52
0.003μM 0.55 0.85 0.53 0.53 1.09
0.01μM 2.27 2.42 2.22 1.62 1.51
3시간 후 HeLa 세포에서 사이클린 D, NFkB (p65) 및 pS6 단백질 발현에 대한 화학식(1a)의 화합물의 효과
대조 세포에 대한 폴드 활성화(fold activation)
화학식(1a)의 농도 사이클린 D NFkB (p65) pS6
0.0003μM -0.57 -0.46 -0.42
0.003μM -0.89 -0.80 -0.56
0.01μM -3.81 -1.86 -1.97
결론
화학식(1a)의 화합물은 암세포에서 NFkB (p65), pS6 및 사이클린 D의 단백질 발현 현저하게 하향 조절한다. 이것은 또한 p53, pJNK, 절단 카스파제 9 발현을 상향 조절하며, 다음에 세포자멸사을 향해 암세포를 구동하는 절단 카스파제 3 및 절단 PARP의 주요한 상향 조절을 유발한다.
실시예 19
화학식(1b)의 화합물 및 화합물 1 내지 8의 생물학적 평가
평가는 실시예 16에서 상술한 바와 같이 설계하였다. 화학식(1b)의 화합물 (실시예 8에 기술됨) 및 실시예 9 내지 15에서 얻어진 화합물들 (화합물 1 내지 8에 해당함)의 IC50값의 시험관내 분석 및 결정을 위한 시료준비는 실시예 16에서 상술한 바와 같이 수행하였다.
IC50값은 농도 효과 곡선의 육안 검사에 의해 평가하였다. 시험된 6개의 세포주 (PC3, MDA MB, HCT116, MCF7, MIAPaCa2, MCF10A)에 대한 평균 IC50 값의 계산을 위해, 기하 평균을 선택하였다.
결과들은 하기에 제공된 표 6에 나타낸다.
상이한 세포주 및 정상 세포에서 화합물 (1b)의 화합물 및 화합물 2 내지 9의 IC50 값
화합물 상이한 암세포주에서 IC50(μM)
PC3 MDA
MB-231		 HCT116 MCF7 MIA
PaCa2		 MCF10A
화학식(1b) 0.035 0.018 0.032 0.071 - 0.03
화합물 1 0.502 0.293 0.287 0.355 - 0.247
화합물 2 1.045 0.800 0.635 0.826 - 0.691
화합물 3 0.044 0.030 0.009 0.025 - 0.031
화합물 4 - 0.2 0.170 0.030 - ＜0.3
화합물 5 - 0.012 ＜0.01 0.018 - ＜0.01
화합물 6 0.998 0.343 0.284 0.977 - 0.819
화합물 7 0.360 0.320 0.257 0.843 - 0.83
화합물 8 - - - - 0.043 0.045
- 시험하지 않음
결론
시험관 연구는 (i) 화학식(1b)의 화합물이 상이한 암세포에서 0.018μM 내지 0.071μM 범위의 IC50을 보여주는 반면 정상 세포(MCF-10A)에서는 0.030μM의 IC50 를 보여주며; (ii) 화합물 1 내지 8은 상이한 암세포에서 0.009μM 내지 1.045μM 범위의 IC50을 보여주는 반면 정상 세포(MCF-10A)에서는 ＜0.010μM 내지 0.830μM 범위의 IC50를 보여주는 것으로 나타났다.
이들 데이터는 화학식 (1b)의 화합물 및 화합물 1 내지 8이 고도로 증식성인 암세포주에 대해 활성이 있다는 것을 보여준다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식 (1)의 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 혼합물, 또는 그의 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00025
    화학식 (1)
    상기 화학식 (1)의 화합물에서,
    결합
    Figure pct00026
    가 단일결합을 나타내고 R1이 H인 경우, 상기 화합물은 화학식(1a)의 화합물로 언급되며; 또한
    결합
    Figure pct00027
    가 이중결합이고 R1이 존재하지 않는 경우, 상기 화합물은 화학식(1b)의 화합물로 언급된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이
    a) 분자량 826.9,
    b) 분자식 C37H62N8O13,
    c) IR (KBr) 스펙트럼 3325, 2960, 2872, 1755, 1641, 1524, 1445, 1331, 1306, 1288 및 1254 cm-1,
    d) 1H NMR 스펙트럼 (500 MHz, CDCl3): δ 9.20, 8.00, 7.10, 6.90, 6.40, 6.10, 5.40, 5.38, 5.29, 5.10, 4.90, 4.80, 4.70, 4.60, 3.90, 3.70, 3.15, 2.70, 2.30, 2.10, 1.98, 1.95, 1.77, 1.71, 1.68, 1.60, 1.52, 1.40, 1.15, 1.10, 1.05, 0.98, 0.95, 0.90, 0.88 및 0.85 (도 1에 도시된 바와 같음),
    e) 13C NMR 스펙트럼 (75 MHz, CDCl3): δ 176.0, 172.0 (3), 171.0, 170.0, 169.0, 99.9, 78.9, 77.2, 71.7, 53.5, 52.9, 49.3, 49.0, 47.1, 46.7, 46.2, 42.2, 41.0, 39.8, 29.9, 27.4, 24.8, 24.6, 24.2, 24.1, 23.2, 21.7, 21.5 (2), 20.6, 19.9, 19.4, 18.1, 12.9 및 11.7 (도 2에 도시된 바와 같음)
    을 특징으로 하는 화학식(1a)의 화합물인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물이
    a) 분자량 824.4,
    b) 분자식 C37H60N8O13,
    c) IR (KBr): 3342, 3030, 2953, 1752, 1650, 1524, 1421, 1293, 1255 및 1239 cm-1,
    d) 1H NMR 스펙트럼 (500 MHz, CDCl3): δ 9.20, 8.00, 7.19, 7.0, 6.18, 6.14, 5.80, 5.41, 5.39, 5.30, 5.10, 4.80 (2), 4.20, 3.70, 3.19, 2.62, 2.27, 2.10, 2.01, 1.98, 1.77, 1.71, 1.62, 1.58, 1.44, 1.40, 1.39, 1.37, 1.20, 1.10, 1.05, 0.96, 0.91, 0.90, 0.86, 및 0.85 (도 3에 도시된 바와 같음),
    e) 13C NMR 스펙트럼 (75 MHz, CDCl3): δ 176.0, 171.8, 171.7, 170.8, 170.6, 170.3, 168.9, 144.6, 98.8, 79.0, 77.2, 71.7, 53.6, 53.5, 50.6, 49.1, 47.1, 46.4, 42.6, 41.0, 39.8, 29.9, 27.4, 24.7, 24.6, 24.2, 24.0, 22.1, 21.5, 21.4, 19.8, 19.5, 19.4, 18.1, 17.2, 12.9 및 11.8 (도 4에 도시된 바와 같음)
    을 특징으로 하는 화학식(1b)의 화합물인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식(1c)로 표시되는 화학식(1)의 화합물의 유도체인 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 혼합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00028

    상기식에서,
    R1 및 R4는 독립적으로 H를 나타내거나 존재하지 않고;
    R2 및 R3 는 독립적으로 H, 하이드록시, -O(C1-C6)알킬 및 -OC(O)(C1-C6)알킬로부터 선택되고;
    Figure pct00029
    는 단일결합 또는 이중결합을 나타내고,
    여기서 (C1-C6)알킬은 비치환되거나 또는 할로겐, 하이드록시, -O(C1-C6)알킬, 니트로, 시아노, -COOH, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N[(C1-C6)알킬]2, -NHC(O)O(C1-C6)알킬, -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴, -NH-PEG 또는 (C6-C10)아릴로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
    (C6-C10)아릴은 비치환되거나 또는 할로겐, 할로(C1-C6)알킬, 하이드록시, 시아노, 니트로, (C1-C6)알킬, -O(C1-C6)알킬, -COOH 및 -NH2로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
    또한 PEG는 O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙신일아미노)에틸]폴리에틸렌글리콜(α,ω-비스-NHS-PEG), 메틸-PEG-NHS 에스테르 (MS(PEG)n (식 중, n은 24임), 및 폴리에틸렌글리콜의 분지형 트리메틸 및 숙신이미드 에스테르 유도체 (TMS(PEG)n (식 중, n은 12임)으로부터 선택되는 폴리에틸렌글리콜이고;
    단 R2 및 R3 가 둘다 하이드록시인 경우, R1 및 R4는 존재하지 않고
    Figure pct00030
    는 이중결합을 나타낸다.
  5. 제4항에 있어서, R1 및 R4는 H이고; R2는 -O(C1-C6)알킬 또는 -OC(O)(C1-C6)알킬이고; R3 는 하이드록시 또는 -O(C1-C6)알킬이고; 여기서 (C1-C6)알킬은 비치환되거나 또는 -NH2, -NHC(O)O(C1-C6)알킬(C6-C10)아릴 또는 -NH-PEG로 치환된 화학식(1c)의 화합물인 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 혼합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제4항에 있어서, R1 및 R4는 독립적으로 H를 나타내거나 존재하지 않고;
    R2 및 R3 는 독립적으로 H 및 하이드록시로부터 선택되고;
    Figure pct00031
    는 단일결합 또는 이중결합을 나타내고;
    단 R2 및 R3 가 둘다 하이드록시인 경우, R1 및 R4는 존재하지 않으며
    Figure pct00032
    는 이중결합을 나타내는 것인 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 혼합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화합물 1 내지 8인 화합물, 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 혼합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
    Figure pct00033
    Figure pct00034

    화합물 1 화학식 2
    Figure pct00035
    Figure pct00036

    화합물 3 화합물 4
    Figure pct00037
    Figure pct00038

    화합물 5 화합물 6
    Figure pct00039

    화합물 7
    Figure pct00040

    화합물 8
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적 유효량; 및 약학적으로허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  9. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 화합물 또는 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 폐암, 뇌종양, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 간암, 신장암, 방광암, 요로암, 유방암, 두경부암, 자궁내막암, 림프종, 흑색종, 자궁경부암, 갑상선암, 위암, 생식세포종, 담관암, 두개외암, 육종, 중피종, 뼈의 악성섬유 조직구종, 망막모세포종, 식도암, 다발성 골수종, 두경부암, 췌장암, 뇌실막종, 신경모세포종, 피부암, 난소암, 재발성 난소암, 전립선암, 정소암, 대장암, 림프세포증식질환, 난치성 다발성 골수종, 저항성 다발성 골수종 또는 골수증식질환으로부터 선택되는 것인 사용하기 위한 화합물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 암이 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 비소세포폐암, 소세포폐암, 뇌줄기 신경아교종, 아교모세포종, 소뇌별아교세포종 및 대뇌별아교세포종을 포함하는 별아교세포종, 시각경로 신경아교종, 송과체 종양, 속질모세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 외투층 세포 림프종, 호지킨병, 간세포암종, 신장세포 암종, 방광암, 요로암, 골육종, 유방암, 자궁내막암, 구강암, 흑색종, 자궁경부암, 갑성선암, 위암, 뼈의 악성섬유조직구종, 망막모세포종, 식도암, 다발성 골수종, 췌장암, 신경모세포종, 피부암, 난소암, 전립선암, 정소암, 대장암, 림프세포증식질환 또는 골수증식질환으로부터 선택되는 것인 사용하기 위한 화합물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 비소세포폐암, 소세포폐암, 뇌줄기 신경아교종, 아교모세포종, 소뇌별아교세포종 및 대뇌별아교세포종을 포함하는 별아교세포종, 속질모세포종, 신장세포 암종, 방광암, 요로암, 유방암, 구강암, 흑색종, 자궁경부암, 갑성선암, 위암, 췌장암, 전립선암 또는 대장암으로부터 선택되는 것인 사용하기 위한 화합물.
  13. 제8항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  14. 암의 치료를 위한 약물의 제조에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 화합물, 그의 이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체의 암의 치료방법.
  16. a) 탄소, 질소 및 영양 무기염 및/또는 미량원소의 공급원을 함유하는 영양배지에서 수중 호기성 조건하에 배양번호 PM0895172 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체 중의 하나를 성장시켜 화학식(1)의 화합물을 함유하는 배양 액체배지를 얻는 단계;
    b) 상기 배양 액체배지로부터 상기 화학식(1)의 화합물을 분리하는 단계; 및
    c) 상기 화학식(1)의 화합물을 정제하는 단계
    를 포함하는 제1항에 정의된 화합물의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 화학식(1)의 화합물을 그의 약학적으로 허용가능한 염으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 단계(a)에서 배양 액체배지가 화학식(1a)의 화합물 및 화학식(1b)의 화합물의 혼합물을 함유하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 단계(b)에서 화학식(1)의 화합물이 화학식(1a)의 화합물인 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 단계(b)에서 화학식(1)의 화합물이 화학식(1b)의 화합물인 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 단계(c)에서 화학식(1)의 화합물이 화학식(1a)의 화합물인 것인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 단계(c)에서 화학식(1)의 화합물이 화학식(1b)의 화합물인 것인 방법.

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