JP2015517485A - 抗がん化合物としてのヘキサデプシペプチド類縁体 - Google Patents

Abstract

本発明は、単離された式（１）の化合物、その誘導体、又はその薬学的に許容される塩に関する。本発明は、式（１）の化合物又はその誘導体のすべての異性体及び互変異性体も含む。本発明は、更に、放線菌株（ＰＭ０８９５１７２／ＭＴＣＣ ５６８４）を発酵させることによって、式（１）の化合物を製造する方法と、式（１）の化合物を活性成分として含む医薬組成物と、前記化合物又は前記化合物を含有する組成物の、がんの治療への使用とに関する。

Description

本発明は、式（１）（後述）の化合物、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体に関する。本発明は、更に、放線菌株（ＰＭ０８９５１７２／ＭＴＣＣ ５６８４）に属する単離された微生物から、式（１）の化合物を製造する方法に関する。本発明は、式（１）の化合物、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体を活性成分として含む医薬組成物、及びこれの、がんの治療への使用にも関する。

がんは、体のいずれかの部分に影響を及ぼし得る、細胞の無制御な増殖及び転移に起因する多くの疾患群の総称である。現在、がんには、局部的な疾患に対する化学療法、手術、及び放射線治療、又は前記治療の組み合わせを含め、多くの治療選択肢がある。療法の選択は、がんの位置に加え、診断時点におけるがんの転移の程度に左右される。化学療法は、がんに対する最も一般的な治療形態の１つであり、この療法は、がん細胞を破壊できる抗がん薬の使用を伴う。がんに対する治療レジメンの継続的な進歩にもかかわらず、この疾患は依然として、世界における主な死因の１つである。その理由は、利用可能な治療の選択肢が、望ましくない副作用を伴い、効能が限定的である可能性が高いことである。したがって、がんを治療するための臨床効果を示す新たな抗がん剤／抗がん薬が必要とされている。

天然源由来のタキソール、ビンクリスチン、トレヤン酸、及びカンプトテシンなどの抗がん化合物に関する報告が存在する（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００９，４（１１），１５１３）。

地球の表面の７０％、かつ地球の熱帯生物圏の９５％を覆う海洋環境は、動物界の３６門中、３４門に相当し、陸環境の生物多様性を上回る魅力的な変化に富む生物多様性をもたらす（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，７８，４４２−４５３）。海洋天然物のバイオプロスペクティング（市販の遺伝及び生化学資源の生物多様性及び原住民の知識の探索、抽出、及びスクリーニング）によって、相当数の薬剤候補を得てきている（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２００３，８（１２），５３６−５４４）。

海洋生物及び微生物由来の天然物のスクリーニングに伴い、多くの医薬剤の発見に関する報告がなされてきた。海洋源に由来する抗がん剤の例としては、シタラビン、ブリオスタチン−１、アプリジン、ドラスタチン１０、及びＥＴ−７４３が挙げられる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１，１，３６４−３６９）。

当該技術分野では、多くのヘキサデプシペプチドが報告されている。例えば、特開平０９−０４０５５９号公報は、アレルギー性炎症及び非アレルギー性炎症の両方に対して有効である抗炎症活性を有するヘキサデプシペプチド類の化合物を開示している。

天然源から多くの治療有効化合物が得られていることを考慮すると、この研究分野を探究して、がんのような疾患の治療に効果的に用いることのできる新たな化合物を得るのが賢明であろう。本特許出願の発明者らは、がんの治療に用いることのできる新規化合物を提供すべく努力した。また、発酵によってこの化合物を製造する方法、及び、更に、式（１）の化合物の化学的修飾を行って、その誘導体を得ることも提供する。

本発明は、（本明細書に記載されているような）本明細書において式（１）の化合物と呼ぶ化合物に関する。

本発明は、式（１）の化合物の異性体、互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体に関する。

本発明によれば、式（１）の化合物は、式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物である。

本発明によれば、式（１）の化合物の誘導体は、式（１ｃ）の化合物に包含される。

本発明は、精製された式（１）の化合物であって、海洋放線菌株（ＰＭ０８９５１７２／ＭＴＣＣ ５６８４）、又はその多様体若しくは変異体の１つを発酵させることによって得た培養ブロスから単離された化合物にも関する。したがって、本発明の化合物は、単離された式（１）の化合物である。

本発明は、式（１）の化合物、及び／又はその異性体若しくは互変異性体を海洋放線菌株（ＰＭ０８９５１７２／ＭＴＣＣ ５６８４）から製造する方法にも関する。

本発明は、更に、培養したときに式（１）の化合物、又はその異性体若しくは互変異性体を産生する放線菌株（ＰＭ０８９５１７２／ＭＴＣＣ ５６８４）に属する微生物を単離する方法に関する。

式（１）の化合物、その異性体若しくは互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体は、がんの治療に有用である。

本発明は、治療対象動物のがんを治療する方法であって、その治療対象動物に、式（１）の化合物、その異性体若しくは互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体を治療有効量投与することを含む方法に関する。

本発明は、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、担体、又はビヒクルと併せて、活性成分として、式（１）の化合物、その異性体若しくは互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその誘導体を含む医薬組成物にも関する。

図１は、式（１ａ）の化合物の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、５００ＭＨｚ、装置：ブルカー(Bruker)）スペクトルを示す。 図２は、式（１ａ）の化合物の¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、７５ＭＨｚ、装置：ブルカー）スペクトルを示す。 図３は、式（１ｂ）の化合物の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、５００ＭＨｚ、装置：ブルカー）スペクトルを示す。 図４は、式（１ｂ）の化合物の¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、７５ＭＨｚ、装置：ブルカー）スペクトルを示す。 図５は、式（１ａ）の化合物が、ＨｅＬａがん細胞のアポトーシスに及ぼす作用を示す。

本発明は、以下のように表される式（１）の化合物を提供する。

式（１）の化合物において、

の結合が単結合を表し、Ｒ¹がＨであるときには、その化合物を式（１ａ）の化合物といい、

の結合が二重結合であり、Ｒ¹が存在しないときには、その化合物を式（１ｂ）の化合物という。従って、式（１）の化合物は、式（１ａ）の化合物（式中、

の結合は単結合を表し、Ｒ¹はＨである）、式（１ｂ）の化合物（式中、

の結合は二重結合であり、Ｒ¹は存在しない）、又はこれらの混合物である。

式（１）の化合物は、ヘキサデプシペプチド類の化合物に属する。

式（１ａ）の化合物及び式（１ｂ）の化合物は、物理化学的特性及びスペクトル特性（本明細書の後段で述べるような高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高分解能質量分析スペクトル（ＨＲＭＳ）、赤外（ＩＲ）分光データ、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光データなど）のいずれか１つ以上によって特徴付けることができる。

本発明の一態様によれば、式（１）の化合物は、分子式がＣ₃₇Ｈ₆₂Ｎ₈Ｏ₁₃、分子量が８２６．９である式（１ａ）の化合物である。

式（１ａ）の化合物は、以下のように表される。

式（１ａ）の化合物の化学名は、Ｎ−（６，１８−ジヒドロキシ−２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソテトラコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−２３−イル）−２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミドである。

本発明の一態様によれば、式（１）の化合物は、分子式がＣ₃₇Ｈ₆₀Ｎ₈Ｏ₁₃、分子量が８２４．４である式（１ｂ）の化合物である。

式（１ｂ）の化合物は、以下のように表される。

式（１ｂ）の化合物の化学名は、Ｎ−（６，１８−ジヒドロキシ−２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソ−３，４，４ａ，５，６，７，８，９，１０，１１，１３，１４，１５，１６，１６ａ，１７，１８，１９，２０，２２，２３，２４−ドコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−２３−イル）−２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミドである。

式（１）の化合物の製造に用いることができる微生物は、インド、マハーラーシュトラ州ムンバイの沖合領域から採取した深海底堆積物から単離された放線菌株（ＰＭ０８９５１７２／ＭＴＣＣ ５６８４）であり、以下では、培養物番号ＰＭ０８９５１７２と称する。

本発明の一態様は、式（１）の化合物を培養物番号ＰＭ０８９５１７２から製造する方法であって、
ａ）湛水好気条件下、１種以上の炭素源、１種以上の窒素源、栄養無機塩、及び／又は微量元素を含有する栄養培地中で、培養物番号ＰＭ０８９５１７２、又はその多様体若しくは変異体の１つを培養して、式（１）の化合物を含有する培養ブロスを得る工程と、
ｂ）式（１）の化合物を培養ブロスから単離する工程と、
ｃ）式（１）の化合物を精製する工程とを含む方法を提供する。

上記の方法に従って製造される式（１）の化合物は、式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物であり得る。

一実施形態では、上記工程（ａ）における上記培養ブロスは、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物を含有する。

一実施形態では、上記方法の工程（ｂ）において、式（１）の化合物が式（１ａ）の化合物である。

一実施形態では、上記方法の工程（ｂ）において、式（１）の化合物が式（１ｂ）の化合物である。

一実施形態では、上記方法の工程（ｃ）において、式（１）の化合物が式（１ａ）の化合物である。

一実施形態では、上記方法の工程（ｃ）において、式（１）の化合物が式（１ｂ）の化合物である。

一実施形態では、本発明は、式（１ａ）の化合物を培養物番号ＰＭ０８９５１７２から製造する方法であって、
ａ）湛水好気条件下、１種以上の炭素源、１種以上の窒素源、栄養無機塩、及び／又は微量元素を含有する栄養培地中で、培養物番号ＰＭ０８９５１７２、又はその多様体若しくは変異体の１つを培養して、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物を含有する培養ブロスを得る工程と、
ｂ）式（１ａ）の化合物を培養ブロスから単離する工程と、
ｃ）式（１ａ）の化合物を精製する工程とを含む方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、式（１ｂ）の化合物を培養物番号ＰＭ０８９５１７２から製造する方法であって、
ａ）湛水好気条件下、１種以上の炭素源、１種以上の窒素源、栄養無機塩、及び／又は微量元素を含有する栄養培地中で、培養物番号ＰＭ０８９５１７２、又はその多様体若しくは変異体の１つを培養して、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物を含有する培養ブロスを得る工程と、
ｂ）式（１ｂ）の化合物を培養ブロスから単離する工程と、
ｃ）式（１ｂ）の化合物を精製する工程とを含む方法を提供する。

上記方法のいずれか１つにおける工程（ｃ）は、式（１）の化合物の精製を含み、この工程（ｃ）は、関連技術分野において一般に用いられている精製手順を用いて行われる。

本発明の方法に従って製造される式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物及び式（１ｂ）の化合物は、実質的に純粋な化合物である。したがって、式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物は、単離された純粋化合物である。

典型的には、式（１ａ）の化合物及び式（１ｂ）の化合物は、カラムクロマトグラフィー法によって精製される。

本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、本発明に係る化合物を産生する能力を担うゲノム中の遺伝子が１つ以上改変されている生物又は細胞を指す。このような変異体は、物理的手段（例えば紫外線若しくはＸ線の照射）、又は化学的変異剤を用いる、それ自体は公知の方法で製造できる。

本明細書で使用する場合、「多様体」という用語は、その生物種における任意の標準型に対して認識可能な相違を有する個別の生物を指す。

「全ブロス」という用語を、「栄養ブロス」、「培養ブロス」、又は「発酵ブロス」という用語と同義に用いることがある。

「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト、及び非ヒト哺乳動物（ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、及びネコが挙げられるが、これらに限らない）を指す。「哺乳動物」という用語を、「患動物(patient)」又は「治療対象動物(subject)」という用語と同義に用いることがある。

「活性成分」又は「活性化合物」という用語を同義に用いることがあり、本明細書で使用する場合、前記用語は、式（１）の化合物、式（１ａ）の化合物、式（１ｂ）の化合物、これらの異性体、これらの互変異性体、これらの薬学的に許容される塩、又はこれらの誘導体を指す。本発明の文脈において、「活性成分」又は「活性化合物」という用語は、本明細書に記載されているような式（１）の化合物の誘導体を包含する式（１ｃ）の化合物も指す。

「式（１）の化合物」という用語は、式（１ａ）の化合物、式（１ｂ）の化合物、又はこれらの混合物と、これらの異性体、互変異性体、又は薬学的に許容される塩とを含む。

「式（１ｃ）の化合物」という用語は、式（１）の化合物の誘導体（式（１ａ）の化合物若しくは式（１ｂ）の化合物の誘導体を含む）、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩を含む。

「実質的に純粋な」という用語は、本明細書で使用する場合、式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物若しくは式（１ｂ）の化合物、又はこれらの異性体が、更に精製しても、その化合物の物理的特性、化学的特性、酵素活性、及び生物学的活性が、検出可能なほどには変化しない程度に、十分に純粋であることを意味する。式（１）の化合物は、当業者に知られている下記の方法によって実質的に純粋に精製できる。

本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物若しくは式（１ｂ）の化合物、又はこれらの薬学的に許容される塩若しくはこれらの誘導体（式（１ｃ）の化合物（本明細書に記載されているようなもの））を用いて、がん（本明細書に列挙されているようながん）を治療することに関しては、本発明の化合物を投与される治療対象動物において、（ｉ）腫瘍増殖のある程度の抑制（減速及び完全な増殖停止を含む）、（ii）腫瘍細胞数の減少、（iii）腫瘍の縮小、（iv）末梢器官への腫瘍細胞の浸潤の抑制（すなわち軽減、減速、若しくは完全な阻止）、（ｖ）転移の抑制（すなわち軽減、減速、若しくは完全な阻止）、（vi）抗腫瘍免疫反応の増強（必ずしもそうとは限らないが、腫瘍の退縮をもたらし得る）、及び／又は（vii）治療しているがんに伴う１つ以上の症状のある程度の緩和という作用のうちの１つ以上をもたらすことのできる量を指す。

「薬学的に許容される塩（単一又は複数）」という用語は、本明細書で使用する場合、式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物、及びこれらの誘導体（式（１ｃ）の化合物）を含む本発明の化合物（１種又は複数）の塩であって、哺乳動物において安全かつ有効であるとともに、所望の生物学的活性を有する塩を意味する。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、又はｐ−トルエンスルホン酸塩が挙げられるが、これらに限らない。好適な塩基付加塩としては、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、又は亜鉛塩が挙げられるが、これらに限らない。

式（１）の化合物の原料である培養物番号ＰＭ０８９５１７２の予備的同定は、そのコロニー性状を調べることによって行った。単離された培養物番号ＰＭ０８９５１７２の株を、改変放線菌単離用寒天培地上で、顕微鏡によって観察した。この観察は、２０〜２２日間、２０℃〜３０℃でインキュベートした後に、コロニーが観察されるまで行った。培養物番号ＰＭ０８９５１７２は、海洋放線菌株として同定されている。

培養物番号ＰＭ０８９５１７２は、微生物系統保存機関(Microbial Type Culture Collection)（ＭＴＣＣ）、（微生物工学研究所(Institute of Microbial Technology)、１６０ ０３６、インド、チャンディーガル、セクター３９−Ａ、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）公認の国際寄託当局（ＩＤＡ））に寄託されており、ＭＴＣＣ ５６８４という受託番号が付与されている。

本明細書に記載されている特定の微生物に加えて、ＰＭ０８９５１７２の変異体（Ｘ線、紫外線などの化学的又は物理的な変異源を用いて製造されたもの、及び、分子生物学的技法によって遺伝子構造が改変された生物など）を培養して、式（１）の化合物を製造してもよいことを理解すべきである。

本発明に係る化合物を産生できる好適な変異体及び多様体のスクリーニングは、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＩＲ、ＭＳ、及び／若しくは、例えば化合物の抗がん活性を試験することによって、培養ブロスに蓄積した活性化合物の生物学的活性を測定すること、又はこれらの組み合わせによって確認できる。

式（１）の化合物を産生する培養物番号ＰＭ０８９５１７２の単離及び培養のために用いる培地及び／又は栄養培地は、炭素源と、窒素源と、栄養無機塩とを含有するのが好ましい。この炭素源は、例えば、デンプン、グルコース、スクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ラクトース、又はガラクトースのうちの１つ以上である。好ましい炭素源はグルコースである。窒素源は、例えば、大豆ミール、ピーナッツミール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、麦芽エキス、コーンスティープリカー、ゼラチン、又はカザミノ酸のうちの１つ以上である。好ましい窒素源は、ペプトン及び酵母エキスである。栄養無機塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム、塩化コバルト、臭化カリウム、フッ化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ヘプタモリブデン酸アンモニウム、クエン酸第二鉄、硫酸銅、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、又はホウ酸のうちの１つ以上である。塩化ナトリウム及び塩化カルシウムが好ましい。

培養物番号ＰＭ０８９５１７２の維持は、２４℃〜３２℃の範囲の温度で行うことができる。典型的には、培養物番号ＰＭ０８９５１７２は、２７℃〜２９℃で維持される。十分に増殖した培養物は、冷蔵庫で４℃〜８℃にて保存することができる。

培養物番号ＰＭ０８９５１７２の種母培養は、２７℃〜３３℃の範囲の温度、ｐＨ約５．５〜８．５で６０〜８０時間、２１０〜２６０ｒｐｍ（１分当たりの回転数）で行うことができる。典型的には、培養物番号ＰＭ０８９５１７２の種母は、２９℃〜３１℃、ｐＨ約６．５〜７．５で７０〜７４時間、２３０〜２５０ｒｐｍで培養される。

式（１）の化合物の製造は、培養物番号ＰＭ０８９５１７２を振盪フラスコ中で、２７℃〜３３℃の範囲の温度、ｐＨ約５．５〜８．５で８０〜１１０時間、２００〜２５０ｒｐｍで発酵させることによって培養することによって行うことができる。典型的には、培養物番号ＰＭ０８９５１７２は、２９℃〜３１℃、ｐＨ６．５〜７．５で９０〜１００時間、２１０〜２３０ｒｐｍで培養される。

式（１）の化合物の製造は、培養物番号ＰＭ０８９５１７２を発酵槽中で、２７℃〜３３℃の範囲の温度、ｐＨ約５．５〜８．５で２０〜４０時間、４０〜７０ｒｐｍ、通気量２００〜３００ｌｐｍ（１分当たりのリットル数）で発酵させることによって培養することによって行うことができる。典型的には、培養物番号ＰＭ０８９５１７２は、２８℃〜３１℃、ｐＨ６．５〜７．５で２０〜３０時間、５０〜６０ｒｐｍ、通気量２４０〜２６０ｌｐｍで培養される。

式（１）の化合物の製造は、培養物番号ＰＭ０８９５１７２を好適な栄養ブロス中で、本明細書に記載されている条件下、好ましくは湛水好気条件下にて、例えば振とうフラスコ中で培養することによって行うことができる。発酵の進行、及び式（１）の化合物の産生は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、かつ、種々のがん細胞株に対する試験によって培養ブロスの生物活性を測定することによって検出できる。

発酵は、各種の化学化合物又は医薬化合物を産生させるために、微生物を培養するプロセスである。微生物は通常、特定の条件下、栄養源の存在下でインキュベートされる。発酵プロセスの完了後、全ブロスが得られる。この全ブロスを遠心分離にかけると、細胞塊及び培養濾液が形成され、これを更に、本明細書に記載されているプロセスによって処理することができる。

培養ブロス中に存在する式（１）の化合物は、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物の形であることができ、前記式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物は、種々の抽出方法及びクロマトグラフィー技法を用いて単離できる。

式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物は、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテル、若しくはブタノールなどの水非混和性溶媒での抽出によって、又は「Ｄｉａｉｏｎ（登録商標） ＨＰ−２０」（三菱化成工業株式会社、日本）、「Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＸＡＤ」（ローム・エンド・ハース・インダストリーズ(Rohm and Haas Industries)、米国）などのようなポリマー樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー、若しくは活性炭への吸着によって、培養濾液から回収できる。これらの技法は、繰り返し用いても、単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。

式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物は、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、若しくはイソプロパノールなどの水混和性溶媒、又は石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、若しくはブタノールなどの水非混和性溶媒で抽出することによって、細胞塊から回収できる。

あるいは、全ブロスは、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、又はブタノールから選択される溶媒で抽出される。

典型的には、式（１）の化合物は、全ブロス又は培養ブロスから、酢酸エチルを溶媒として用いて抽出される。抽出物の濃縮により、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物を含有する活性粗物質が得られる。

本発明による式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物は、順相クロマトグラフィー（アルミナ若しくはシリカゲルを固定相として用い、石油エーテル、酢酸エチル、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、メタノール、イソプロピルアルコール、若しくはこれらの組み合わせなどの溶離液を用いる）、逆相クロマトグラフィー（ジメチルオクタデシルシリルシリカゲル（ＲＰ−１８）若しくはジメチルオクチルシリルシリカゲル（ＲＰ−８）などの逆相シリカゲルを固定相として用い、水、緩衝液（例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩（ｐＨ２〜８））、及び有機溶媒（例えばメタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン、若しくはこれらの溶媒の組み合わせ）などの溶離液を用いる）、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（メタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、若しくはこれらの組み合わせなどの溶媒中で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標） ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、スウェーデン）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標） Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標） ＨＷ（ＴｏｓｏＨａａｓ、東ソー株式会社、日本）などの樹脂を用いる）、又は向流クロマトグラフィー（水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、石油エーテル、ベンゼン、及びトルエンなどの２種以上の溶媒から構成される二相溶離液系を用いる）という技法のいずれかを用いる分画によって、粗物質から回収できる。これらの技法は、繰り返し用いても、単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。典型的な方法は、順相シリカゲル及びＲＰ−１８などの逆相シリカゲルによるクロマトグラフィーである。

本明細書で使用する場合、「異性体」という用語は、それらの原子の空間配置のみが異なる、式（１）の化合物のすべての異性体に用いる総称である。異性体という用語は、鏡像異性体（エナンチオマー）、鏡像異性体の混合物（ラセミ化合物、ラセミ混合物）、及び、互いに鏡像関係ではない２つ以上のキラル中心を有する、化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。本発明の化合物は、不斉中心を有するとともに、ラセミ化合物、ラセミ混合物、個々のジアステレオマー、若しくはエナンチオマーとして存在しても、幾何異性体として存在してもよく、前記化合物のすべての異性体が本発明に含まれる。

本明細書で使用する場合、「互変異性体」という用語は、１つ（又は２つ以上）の移動可能な原子の位置及び電子配置のみが互いに異なる２つ（又は３つ以上）の化合物の共存（例えばケト−エノール互変異性体）を指す。

式（１）の化合物、その異性体又は互変異性体は、それらの薬学的に許容される塩、又は誘導体に変換でき、これらはいずれも、本発明によって想定されるものである。

式（１）の化合物の薬学的に許容される塩は、当業者に知られている標準的な手順によって調製でき、例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩のような塩は、式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその誘導体を、適切なナトリウム塩基又はカリウム塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどで処理することによって調製できる。同様に、塩酸塩及び硫酸塩のような塩は、式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその誘導体を、適切な酸、例えば塩酸、硫酸などで処理することによって調製できる。

式（１）の化合物、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物の誘導体はすべて、本発明の範囲に包含される。本発明に係る式（１）の化合物の誘導体、詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物の誘導体のうち、特に関心のある誘導体は、式（１）の化合物のアミノ基及びヒドロキシ基の１つ以上、詳細にはＮ−ヒドロキシ基、さらに詳細には式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物のＮ−ヒドロキシ基が誘導体化されているものである。

したがって、本発明の一態様では、下記の式（１ｃ）

（式中、
Ｒ¹及びＲ⁴は独立して、Ｈを表すか、又は存在せず、
Ｒ²及びＲ³は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、

は単結合又は二重結合を表し、
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルは、非置換であるか、又は、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ニトロ、シアノ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｎ［（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル］₂、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール、−ＮＨ−ＰＥＧ、若しくは（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールから独立して選択される１つ以上の基で置換されており、
（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールは、非置換であるか、又は、ハロゲン、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＣＯＯＨ、及び−ＮＨ₂から独立して選択される１つ以上の基で置換されており、
ＰＥＧは、Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−サクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール（α，ω−ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）、メチル−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ＭＳ（ＰＥＧ）ｎ、ｎ＝２４）、並びにポリエチレングリコールの分岐状のトリメチル及びスクシンイミドエステル誘導体（ＴＭＳ（ＰＥＧ）ｎ、ｎ＝１２）から選択されるポリエチレングリコールであり、
ただし、Ｒ²及びＲ³の両方がヒドロキシである場合には、Ｒ¹及びＲ⁴が存在せず、

が二重結合を表す）
によって表される、式（１）の化合物の誘導体と、そのすべての異性体及び互変異性体、又は薬学的に許容される塩とを提供する。

「置換」、「置換された」、又は「〜で置換されている」は、特定の部位の１つ以上の水素が、適切な置換基に置き換えられていることを意味し、暗黙の前提として、その置換が、置換される原子の許容される原子価と置換基とに従ったものであり、かつ、安定な化合物を生じることは分かるであろう。

「（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル」又は「アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、単独であるか、又は別の基の一部であるかにかかわらず、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、及びヘキシルなどのように、１〜６個の炭素を含有する非置換又は置換の直鎖又は分岐鎖の炭化水素を指す。置換アルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ニトロ、シアノ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｎ［（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル］₂、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール、−ＮＨ−ＰＥＧ、又は（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール（これらに限らない）から選択される１つ以上の基で置換された（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルを指す。

本明細書で使用する場合、「（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール」又は「アリール」という用語は、最大で１０個の環炭素原子を有する単環又は二環の炭化水素環系であって、少なくとも１つの炭素環がπ電子系を有する炭化水素環系を指す。（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール環系の例としては、フェニル又はナフチルが挙げられるが、これらに限らない。特に示されていない限り、アリール基は、非置換であっても、ハロゲン、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＣＯＯＨ、及び−ＮＨ₂（これらに限らない）から独立して選択される１つ以上の基で置換されていてもよい。

本明細書で使用する場合、「−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル」又は「アルコキシ」という用語は、酸素が結合している非置換又は置換の（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル基を指す。代表的なアルコキシ基として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ、ｎ−ブトキシ、１−メチルプロポキシ、２−メチルプロポキシ、又は１，１−ジメチルエトキシが挙げられるが、これらに限らない。置換アルコキシ基は、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ニトロ、シアノ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｎ［（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル］₂、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール、−ＮＨ−ＰＥＧ、又は（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール（これらに限らない）から選択される１つ以上の基でアルキルが置換されている−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル基を指す。

本明細書で使用する場合、「ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル」又は「ハロアルキル」という用語は、そのアルキル基の水素原子の１つ以上が、１つ以上のハロゲンで置換されている基を指す。モノハロアルキル基は、例えば１つの塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、又はフッ素原子を有し得る。ジハロアルキル基及びポリハロアルキル基は、同じ又は異なるハロゲン原子を２つ以上有し得る。「ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル」又は「ハロアルキル」の例としては、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、又はジフルオロプロピルが挙げられるが、これらに限らない。

本明細書で使用する場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。

本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ」という用語は、ポリエチレングリコールポリマーを指す。ＰＥＧは、無毒性、非免疫原性、非抗原性であり、水に対して高溶解性である。ＰＥＧは、その分子内におけるエチレンオキシド（すなわち−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−）の繰り返しサブユニットの数に基づき、様々に分子量を変化させた形で市販されている。例えば、ＰＥＧは、シグマ−アルドリッチ・カンパニー、エルエルシー(Sigma-Aldrich Co.LLC)又は日油株式会社などのような供給業者から入手可能である。ＰＥＧのいくつかの例は、（ａ）分子量が２０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲であり、下記の式によって構造が示されるＯ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−サクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール（α，ω−ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）、

（ｂ）分子量が１２１４．３９Ｄａであり、下記の式によって構造が示されるメチル−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ＭＳ（ＰＥＧ）ｎ、ｎ＝２４）、

及び
（ｃ）ポリエチレングリコールの分岐状のトリメチル及びスクシンイミドエステル誘導体（ＴＭＳ（ＰＥＧ）ｎ、ｎ＝１２、分子量２４２０．８０Ｄａであるが、これらに限らない。本明細書に記載されているような化合物のＰＥＧコンジュゲートの調製に用いるには、典型的には、分子量が１０００〜２０，０００Ｄａの範囲であるＰＥＧが好ましい。

本発明の文脈において、「式（１ｃ）の化合物」、「式（１）の化合物の誘導体」、又は「式（１ｃ）の誘導体」は同義的に用いられており、これらの各用語は、式（１ｃ）によって表される、式（１）の化合物の誘導体、及びその異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩を指す。

一実施形態によれば、本発明は、式（１ｃ）の化合物であって、
式中、
Ｒ¹及びＲ⁴が、Ｈであり、
Ｒ²が、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル又は−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、
Ｒ³が、ヒドロキシ又は−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、
（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルが、非置換であるか、又は、−ＮＨ₂、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール、若しくは−ＮＨ−ＰＥＧで置換されている化合物と、
そのすべての異性体及び互変異性体、又はその薬学的に許容される塩とを提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、式（１ｃ）の化合物であって、
式中、
Ｒ¹及びＲ⁴が独立して、Ｈを表すか、又は存在せず、
Ｒ²及びＲ³が独立して、Ｈ及びヒドロキシから選択され、

が単結合又は二重結合を表し、
ただし、Ｒ²及びＲ³の両方がヒドロキシである場合には、Ｒ¹とＲ⁴が存在せず、

が二重結合を表す化合物と、
そのすべての異性体及び互変異性体、又はその薬学的に許容される塩とを提供する。

本発明に従って包含される式（１ｃ）の代表的な化合物としては、

、並びにこれらのすべての異性体及び互変異性体、又はこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。

式（１ｃ）によって表される、式（１）の化合物の誘導体は、当該技術分野において知られている方法によって調製できる。式（１ｃ）の化合物を調製する方法に用いる試薬は、市販されているものであっても、当該技術分野において知られている方法によって調製してもよい。

式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ¹及びＲ⁴がＨであり、Ｒ²及びＲ³が独立してヒドロキシ及び−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、Ｒ²及びＲ³の少なくとも一方が−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである化合物は、メタノール、エタノール、プロパノール、又はブタノールから選択されるアルコールをトルエン又はベンゼンと組みわせたものに入れた式（１）の化合物（式（１ａ）の化合物）を、ヘキサン又はトルエンなどの有機溶媒中で、トリメチルシリルジアゾメタンなどのアルキル化試薬と、−５℃〜５℃の範囲の温度で１時間〜５時間反応させることによって調製できる。化合物１及び２は、この方法によって調製される。

式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ¹及びＲ⁴がＨであり、Ｒ²及びＲ³が独立してヒドロキシ及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、Ｒ²及びＲ³の少なくとも一方が−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルが、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールで置換されている化合物は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＰＯＰ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）などのようなカップリング剤と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、又は４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などのような塩基との存在下で、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのような溶媒中で、式（１）の化合物（式（１ａ）の化合物）を、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン（Ｃｂｚアラニン）又はＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン（Ｆｍｏｃアラニン）などのような試薬と、−５℃〜５℃の範囲の温度で１時間〜２０時間反応させることによって調製できる。化合物３は、この方法によって調製される。このようにして得られた化合物は、希ＨＣｌなどの酸を用いて作製される酸性条件で、メタノール、エタノール、酢酸エチル、又はＴＨＦなどのような溶媒中で、Ｐｄ／Ｃ又はＰｔ／Ｃなどのような触媒を用いる接触還元によって脱保護することができ、それにより、式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ²及びＲ³が独立して、ヒドロキシ及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、Ｒ²及びＲ³の少なくとも一方が−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルが−ＮＨ₂で置換されている化合物を得ることができる。化合物４は、この方法によって調製される。

式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ¹及びＲ⁴がＨであり、Ｒ²及びＲ³が独立してヒドロキシ及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、Ｒ²及びＲ³の少なくとも一方が−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルが−ＮＨ₂で置換されている化合物は、トリエチルアミン又はＤＩＰＥＡなどのような塩基の存在下で、ＤＣＭ、メタノール、又はＤＭＦなどのような有機溶媒に前記化合物を溶解させ、Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−サクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール（α，ω−ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）又はメチル−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルなどのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを加え、２５℃〜３５℃の範囲の温度で１０時間〜２０時間攪拌することによってＰＥＧ化に用いることができ、それによって、式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ²及びＲ³が独立してヒドロキシ及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、Ｒ²及びＲ³の少なくとも一方が−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルが−ＮＨ−ＰＥＧで置換されている化合物を得ることができる。化合物８は、この方法によって調製される。

式（１）の化合物は、２５℃〜３５℃の範囲の温度で１０〜２０時間、ジクロロメタン又はジクロロエタンから選択される有機溶媒中のｍ−クロロ過安息香酸などのような試薬を用いることによって、酸化してＲ¹及びＲ⁴の位置の水素を除去することができ、それによって、式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ¹及びＲ⁴が存在せず、Ｒ²及びＲ³がヒドロキシである化合物を得ることができる。化合物５は、この方法によって調製される。

式（１）の化合物のＮ−ヒドロキシ基は、ビス（シクロペンタジエニル）チタニウム（IV）ジクロライド及び活性化亜鉛などのような試薬をＴＨＦ、ＤＣＭ、又はＤＭＦなどのような溶媒に溶解させた溶液に、メタノール、エタノール、又はＤＭＦから選択される有機溶媒中の式（１）の化合物を加え、−５℃〜−５０℃の範囲の温度で０．１時間〜１時間攪拌することによって、ＮＨに変換（脱酸素）することができ、それによって、式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ¹及びＲ⁴がＨであるか、又は存在せず、Ｒ²及びＲ³がＨである化合物を得ることができる。化合物６は、この方法によって調製される。

式（１）の化合物のＮ−ヒドロキシ基のアシル誘導体は、ピリジン、ＴＥＡ、又はＤＭＡＰなどのような塩基の存在下で、ジクロロメタン、ピリジン、又はジクロロエタンなどのような溶媒中の式（１）の化合物を、塩化アセチル又は無水酢酸などのような試薬と−５℃〜３０℃の範囲の温度で１時間〜５時間反応させることによって、調製することができ、それによって、式（１ｃ）の化合物であって、式中のＲ²及びＲ³が独立してヒドロキシ及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、Ｒ²及びＲ³の少なくとも一方が−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである化合物を得ることができる。化合物７は、この方法によって調製される。

式（１）の化合物の誘導体である式（１ｃ）の化合物は、必要に応じて、その薬学的に許容される塩に変換できる。

式（１）の化合物、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体は、抗がん活性を有する。これは、それぞれ式（１）、式（１ａ）、式（１ｂ）、及び式（１ｃ）の化合物の試験を含む、本発明の代表的な化合物の、広範ながん細胞に対する試験によって示されている。

式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体は、その投与を必要とする治療対象動物に、医薬として、医薬組成物の形で投与できる。式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体は、がんと診断されている患動物に投与できる。

したがって、本発明は、がん治療薬の製造のための、式（１）の化合物（特に、式（１ａ）の化合物若しくは式（１ｂ）の化合物）、又はその異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、若しくは式（１ｃ）の誘導体の使用にも関する。

本発明は、更に、治療有効量の式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体と、薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、がんの治療に用いるために提供される。医薬製剤中における活性成分としての式（１）の化合物、その立体異性体、その互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体の治療有効量は、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲であっても、約０．１ｍｇ〜７５０ｍｇの範囲であっても、約０．５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であっても、約１ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲であってもよい。

式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体を含む本発明の化合物は、がんの治療に用いられる。本発明の化合物は、腫瘍細胞の増殖を減少させるか、抑制するか、又は弱めるのに用いられ、腫瘍を縮小させることができる。本発明の化合物によって治療できる代表的ながんとしては、白血病、肺がん、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、尿路がん、乳がん、頭頸部がん、子宮体がん、リンパ腫、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、胚細胞腫瘍、胆管癌、頭蓋外がん、肉腫、中皮腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽腫、食道がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、上衣腫、神経芽腫、皮膚がん、卵巣がん、再発卵巣がん、前立腺がん、睾丸がん、大腸がん、リンパ増殖症、難治性多発性骨髄腫、耐性多発性骨髄腫、又は骨髄増殖性疾患が挙げられるが、これらに限らない。

本発明の一実施形態によれば、がんは、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳幹神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫（小脳星状細胞腫及び大脳星状細胞腫を含む）、視路神経膠腫、視床下部神経膠腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体瘍、髄芽腫、中枢神経原発リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキン病、肝細胞癌、腎細胞癌、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、尿路がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、中皮腫、乳がん、子宮体がん、口腔がん、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、胚細胞腫瘍、胆管癌、頭蓋外がん、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽腫、食道がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、上衣腫、神経芽腫、皮膚がん、卵巣がん、再発卵巣がん、前立腺がん、睾丸がん、大腸がん、リンパ増殖症、難治性多発性骨髄腫、耐性多発性骨髄腫、又は骨髄増殖性疾患などから選択される。

本発明の別の実施形態によれば、がんは、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳幹神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫（小脳星状細胞腫及び大脳星状細胞腫を含む）、視路神経膠腫、松果体瘍、髄芽腫、中枢神経原発リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキン病、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱がん、尿路がん、骨肉腫、乳がん、子宮体がん、口腔がん、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽腫、食道がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、神経芽腫、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、睾丸がん、大腸がん、リンパ増殖症、又は骨髄増殖性疾患などから選択される。

本発明の更なる実施形態によれば、がんは、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳幹神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫（小脳星状細胞腫及び大脳星状細胞腫を含む）、髄芽腫、腎細胞癌、膀胱がん、尿路がん、乳がん、口腔がん、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、又は大腸がんなどから選択される。

一実施形態によれば、本発明は、治療有効量の式（１）の化合物、その式（１ｃ）の誘導体、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩を治療対象動物に投与することによって、その治療対象動物のがんを治療する方法を提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、治療有効量の式（１ａ）の化合物若しくは式（１ｂ）の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩を治療対象動物に投与することによって、その治療対象動物のがんを治療する方法を提供する。

更に別の実施形態によれば、本発明は、治療有効量の式（１ｃ）の誘導体、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩を治療対象動物に投与することによって、その治療対象動物のがんを治療する方法を提供する。

式（１）の化合物、その薬学的に許容される塩、若しくはその式（１ｃ）の誘導体、又はその異性体、その互変異性体、若しくはその薬学的に許容される塩は、経口投与、経鼻投与、局所投与、皮下投与、筋内投与、静脈内投与、又はその他の投与方法によって投与できる。

特定の症例に適する投与方法は、治療するがんの種類と、そのがんのステージとによって決まる。更に、投与方法は、当該技術分野において知られている方法を用いて、医師が最適化できる。

通例のように、特定の症例に適する投与量の範囲は、治療するがんの種類と、それぞれの病気又は疾患の状態とによって決まる。選択する投与量のレベルは、治療する病気（がん）と、個々の患動物の年齢、体重、身体的健康、反応、薬物動態、疾患の重症度などといった多くの因子に応じて選択された投与経路と、医療技術分野において知られている因子とを含む、関連する状況に鑑みて、熟練した医師が容易に決定することができる。本発明の医薬組成物中における活性成分の実際の投与量のレベルは、患動物に対して有毒になることなく、特定の患動物（治療を必要とする対象動物）にとって望ましい治療反応性、組成、及び投与方法を実現させるのに有効な活性成分量が得られるように変更できる。平均して、活性化合物（本発明の１つ以上の化合物）の、１患動物に対する１日当たりの投与量は、１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ、１ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜約２００ｍｇ、若しくは１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲、又は、本明細書に示されているような、もっと広い投与量範囲内に入るいずれかの投与量範囲とすることができる。治療を必要とする治療対象動物の体重が重めである場合、活性化合物の投与量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲とすることができる。活性化合物、すなわち本発明の化合物の望ましい投与量は、広範囲にわたって選択できる。１日当たりの投与量は、がん治療の対象の動物に所望の治療効果をもたらすように選択される。必要に応じて、多め又は少なめの１日当たりの投与量を投与することもできる。

式（１）の化合物、その異性体、その互変異性体、その薬学的に許容される塩、又はその式（１ｃ）の誘導体を、湿潤剤、界面活性剤などの溶解補助剤、ビヒクル、等張化剤、充填剤、着色剤、マスキングフレーバー、潤沢剤、崩壊剤、希釈剤、結合剤、可塑剤、乳化剤、軟膏基剤、軟化剤、増粘剤、ポリマー、脂質、油、共溶媒、錯化剤、又は緩衝物質などのようなその他の薬学的に許容される賦形剤とともに含有する医薬組成物は、錠剤、コーティング錠、カプセル、顆粒、粉末、クリーム、軟膏、ゲル、シロップ、乳剤、懸濁剤、又は非経口投与に適する溶液の形状である。

本発明の一実施形態では、式（１）の化合物、若しくは式（１ｃ）の誘導体、又はその異性体、その互変異性体、若しくはその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物は、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルオロウラシル、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、アミノグルテチミド、５−アザシチジン、クラドリビン、ブスルファン、ジエチルスチルベストロール、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン、ドセタキセル、エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン、エチニルエストラジオール、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロデオキシウリジンモノフォスフェート、フルダラビンフォスフェート、フルオキシメステロン、フルタミド、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、イダルビシン、インターフェロン、メドロキシプロゲステロンアセテート、メドロキシプロゲステロンアセテート、メルファラン、ミトタン、パクリタキセル、ペントスタチン、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、プリカマイシン、テニポシド、テストステロンプロピオネート、チオテパ、トリメチルメラミン、ウリジン、ビノレルビン、アルスターパウロン、ブチロラクトンＩ、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−（３−クロロアニリノ）−９−イソプロピルプリン、インジルビン−３’−モノオキシム、ケンパウロン、オロモウシン、イソ−オロモウシン、Ｎ⁹−イソプロピル−オロモウシン、プルバラノールＡ、ロスコビチン、（Ｓ）体のロスコビチン、及びＷＨＩ−Ｐ１８０［４−（３’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン］など、本明細書に記載されているようながんを治療するための１種以上の抗がん剤と併用できる。

本発明の各種実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない変更は、本明細書に開示されている本発明の範囲内に含まれることが分かる。したがって、下記の実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明の例を示すことを意図している。

下記の用語／符号／略語／化学式を実施例で用いる。

〔実施例１〕
培養物番号ＰＭ０８９５１７２の海洋源からの単離
ａ）単離用培地の組成：
１％ペプトン、２％グルコース、０．２％炭酸カルシウム、０．００１％塩化コバルト６Ｈ₂Ｏ、１．５％寒天、（２５℃における）ｐＨ７．５
人工海水（ＡＳＷ）の組成：２．４６％塩化ナトリウム、０．０６７％塩化カリウム、０．１３６％塩化カルシウム、０．６２９％硫酸マグネシウム、０．４６６％塩化マグネシウム、０．０１８％炭酸水素ナトリウム、水
ｂ）手順
深海底堆積物の試料をインド、マハーラーシュトラ州ムンバイの沖合領域から採取し、インド、ムンバイ、ゴーイーガアン（イースト）のピラマル・エンタープライジーズ・リミテッド(Piramal Enterprises Limited)（前・ピラマル・ヘルスケア・リミテッド(Piramal Healthcare Limited)）のＮＣＥ研究部門(NCE Research Division)（ピラマル・ライフ・サイエンシーズ部門(Piramal LifeSciences division））への移動中、−２０℃で保存した。

採取した堆積物試料から、未培養の海洋放線菌を単離するために、分子的アプローチを行った。このアプローチでは、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）及び非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の存在を確認するために、ゲノムＤＮＡを堆積物試料から単離して増幅した。続いて、ＮＲＰＳ経路を有する堆積物試料から、目的の培養物を単離した。

試料を、−２０℃〜−２２℃で保存し、その後、上記微生物を単離するために、室温（２５±２℃）まで解凍した。オートクレーブ滅菌された乳鉢及び乳棒で、堆積物試料（約２ｇ）を２５ｍｌの滅菌人工海水（ＡＳＷ）に懸濁させ、十分に粉砕した。この懸濁液１ｍｌを試験管に移し、３０秒ボルテックスした。この試験管を３０秒ボルテックスした。１０^-5倍までの段階希釈液を滅菌ＡＳＷで調製した。１０^-3倍希釈液１００μｌを、単離用培地の入ったプレートに表面塗抹した。コロニーが観察されるまで、このプレートを室温（２５±２℃）でインキュベートした。２０〜２２日間インキュベート後、この培地上に出現したコロニーを、上述のような単離用培地の入ったペトリプレート上に画線した。この単離株を精製し、ＰＭ０８９５１７２という培養物ＩＤ番号を付した。すなわち、培養物番号ＰＭ０８９５１７２は、増殖している微生物の中から、単一の単離株として単離されたものである。

〔実施例２〕
培養物番号ＰＭ０８９５１７２の精製
ａ）精製用培地の組成：
１％ペプトン、２％グルコース、０．２％炭酸カルシウム、０．００１％塩化コバルト６Ｈ₂Ｏ、１．５％寒天、（２５℃における）ｐＨ７．５
ｂ）手順：
培養物番号ＰＭ０８９５１７２を、精製用培地の入ったペトリプレート上に画線した。このペトリプレートを１０日間、２７℃でインキュベートした。ＩＳＰ４寒天（ハイメディア(HiMedia)、インド）を含有する新鮮な斜面培地に、ペトリプレートから単離したコロニーの１つを移した。この斜面培地を１０日間、２７℃でインキュベートした。

〔実施例３〕
産生株−培養物番号ＰＭ０８９５１７２の維持
ＩＳＰ４培地（ハイメディア、インド）を含有する斜面培地上で、この特定の株を維持した。この培地を加熱して完全に溶解させた後、得られた溶液を複数の試験管に分配し、１２１℃で３０分間滅菌した。これらの試験管を冷却し、傾けた状態で固化させた。寒天斜面培地に、十分増殖した培養物番号ＰＭ０８９５１７２を白金耳で画線し、良好な増殖が観察されるまで２７℃〜２９℃でインキュベートした。十分に増殖した培養物を、冷蔵庫で４℃〜８℃にて保存した。

〔実施例４〕
振盪フラスコ中での培養物番号ＰＭ０８９５１７２の発酵
ａ）種母培地の組成：
０．２％炭酸カルシウム、０．５％塩化ナトリウム、０．５％コーンスティープリカー、０．７５％ペプトン、１．５％グルコース、０．７５％酵母エキス、脱塩水、ｐＨ７
ｂ）手順：
上記の種母培地５０ｍｌを複数の容量５００ｍｌの三角フラスコに分配し、１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌した。それらのフラスコを室温（２５±２℃）まで冷却し、各フラスコに、斜面培地上の、十分に増殖した産生株（培養物番号ＰＭ８９５１７２）１白金耳分を植菌し、ロータリーシェーカーで７２時間、２３０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、３０℃（±１℃）で振盪して、種母培養液を得た。

ｃ）産生用培地の組成：
１％ペプトン、２％グルコース、０．２％炭酸カルシウム、０．００１％塩化コバルト６Ｈ₂Ｏ、１．５％寒天、（２５℃における）ｐＨ７．５
ｄ）手順：
容量５００ｍｌの各三角フラスコ内の産生用培地１００ｍｌを１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌し、２９℃〜３０℃まで冷却し、これに、実施例４ｂに記載の種母培養液を３％（ｖ／ｖ）播種した。

ｅ）発酵パラメーター：
上記の各産生用フラスコをシェーカー上で、３０℃、２２０ｒｐｍにて９６時間インキュベートした。各産生用フラスコを集菌し（集菌ｐＨ：７．０〜８．０）、各培地フラスコから得た全培養ブロスを等体積の溶媒混合物［メタノール：酢酸エチル（１：９）］で抽出した。抽出のために、集菌したこれらのフラスコを室温で４〜６時間保持してから、上清を分離した。この上清を抗がん活性試験に用いた。

〔実施例５〕
バッチ発酵槽用の振盪フラスコ中での種母培養液の調製
ａ）種母培地２７４（１）の組成：
グルコース１５ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、ペプトン７．５ｇ、酵母エキス７．５ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ６．５〜７．５（滅菌前）
ｂ）手順：
上記の培地２００ｍｌを複数の１０００ｍｌの三角フラスコに分配し、１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌した。それらのフラスコを室温まで冷却し、各フラスコに、斜面培地上の、十分に増殖した産生株（培養物番号ＰＭ８９５１７２）１白金耳を植菌し、ロータリーシェーカーで７０〜７４時間、２３０〜２５０ｒｐｍ、２９℃〜３０℃で振盪して、種母培養液を得た。

〔実施例６〕
発酵槽中での培養物番号ＰＭ０８９５１７２の培養
ａ）産生培地の組成：
大豆ペプトン１０ｇ、グルコース２０ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、塩化コバルト０．００１ｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ７．０（滅菌前）
ｂ）手順：
消泡剤としてのＤｅｓｍｏｐｈｅｎ（登録商標）２００ｍｌとともに、１０００Ｌの発酵槽内に入れた産生用培地５００Ｌをインサイチューで２０分間、１２１℃で滅菌し、２９℃〜３０℃まで冷却し、実施例５ｂで得た種母培養液を８〜１０Ｌ播種した。

ｃ）発酵パラメーター：
温度２９℃〜３０℃、先端速度０．９４ｍ／ｓ、通気量２５０ｌｐｍ、集菌時間２４時間とした。培養ブロスの集菌ｐＨは６．５〜７．５であった。発酵ブロス中の活性な式（１ａ）の化合物又は式（１ｂ）の化合物の産生をＨＰＬＣによって測定し、抗がん活性に関して、生物活性を試験した。

〔実施例７〕
式（１ａ）の化合物の単離及び特性評価
酢酸エチル（５００Ｌ）を用いて、実施例６の工程ｃ）で得た集菌済みの全ブロス（５００Ｌ）を抽出した。ディスク型遠心分離機［アルファ・ラバル(Alfa Laval)（米国）、型番ＬＡＰＸ４０４］を用いて有機層を分離し、濃縮して、粗抽出物（１５０ｇ）を得た。

この粗抽出物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶媒：イソプロピルアルコール／クロロホルム）によって処理した。活性化合物を１〜２％イソプロピルアルコール・クロロホルム溶液で溶離し、濃縮して、濃縮された化合物（３０ｇ）を得た。

この物質をカラムクロマトグラフィー（ＲＰ Ｃ−１８シリカゲル、溶媒：水／アセトニトリル）によって精製した。この活性化合物を４０％アセトニトリル水溶液で溶離し、蒸発乾固させて、所望の半純粋な式（１）の活性化合物［式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物］２ｇを得た。

以下のような逆相分取ＨＰＬＣによって、更なる精製を行った。

カラム：ウォーターズ(Water's) Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（２５０ｍｍ×１９ｍｍ、１０μ）
溶離液：アセトニトリル：水（５０：５０）
流速：２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長（ＵＶ）：２２０ｎｍ
採取した活性ピーク物を蒸発乾固させて、活性化合物（式（１ａ）の化合物）１ｇを得た。

以下のようなシリカゲル分取ＨＰＬＣによって、この活性化合物の最終精製を行った。

カラム：ウォーターズ ｓｕｎｆｉｒｅシリカ（１５０ｍｍ×１９ｍｍ、５μ）
溶離液：クロロホルム：メタノール（９８．５：１．５）
流速：１５ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長（ＵＶ）：２４０ｎｍ
保持時間：８〜９分
繰り返し注入によって得られた、活性化合物を含有する溶出液を濃縮して、純粋な式（１ａ）の化合物１４５ｍｇを得た。

式（１ａ）の化合物の物理的特性及びスペクトル特性を第１表に示す。

分析的ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。

カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標） ＲＰ−１８（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、３．５μ）
溶離液：グラジエント（水に対して２０分で１０％アセトニトリルから１００％アセトニトリルとなってから、更に５分間１００％アセトニトリルとなる）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長（ＵＶ）：２２０ｎｍ
保持時間：１７〜１８分（純度＞９９％）

〔実施例８〕
式（１ｂ）の化合物の単離及び特性評価
実施例７のＲＰ−１８分取ＨＰＬＣの後に得られた、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物を含有する半純粋な化合物をＲＰ−１８分取ＨＰＬＣにかけて、純粋な式（１ｂ）の化合物１５ｍｇを得た。

式（１ｂ）の化合物の物理的特性及びスペクトル特性を第２表に示す。

分析的ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。

カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ ＲＰ−１８（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、３．５μ）
溶離液：グラジエント（水に対して２０分で１０％アセトニトリルから１００％アセトニトリルとなってから、更に５分間１００％アセトニトリルとなる）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長（ＵＶ）：２２０ｎｍ
保持時間：１５〜１７ｍｉｎｓ（純度＞９９％）

〔実施例９〕
２−ヒドロキシ−Ｎ−（１８−ヒドロキシ−２２−イソプロピル−６−メトキシ−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソテトラコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−２３−イル）−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミド（化合物１）、及び
２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−Ｎ−（２２−イソプロピル−６，１８−ジメトキシ−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソテトラコサヒドロジジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデカン−２３−イル）プロパンアミド（化合物２）の調製
式（１ａ）の化合物［実施例７に記載されているもの、２０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ］をメタノール（１ｍｌ）及びトルエン（１ｍｌ）に溶解させた溶液に、ＴＭＳＣＨＮ₂（トリメチルシリルジアゾメタン）（４８μｌ、０．０９７ｍｍｏｌ、２Ｍヘキサン溶液）を滴下し、得られた反応混合物を０℃で３時間攪拌してから、室温まで昇温した。反応の終了後、溶媒を除去して固体を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１％メタノール・ジクロロメタン溶液）によって精製して、５ｍｇの化合物１及び３ｍｇの化合物２を得た。

化合物１：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、３００ＭＨｚ）：δ ７．９８、７．１０、６．９２、６．５４、６．２０、５．５２、５．５０、５．３０、５．１６、５．１４、５．０７、４．９６、４．５４、４．５１、４．１３、４．０５、３．８０、３．１８、３．１２、２．７９、２．１４、２．０４、１．９８、１．９５、１．７７、１．７１、１．６８、１．６０、１．５２、１．４５、１．１５、１．１０、１．０５、０．９８、０．９５、０．９０、０．８８、０．８５；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ ８３９（Ｍ−Ｈ）^-
化合物２：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、３００ＭＨｚ）：δ ７．８５、７．１５、７．１０、６．２０、５．８２、５．４２、５．３８、５．３０、５．１５、４．９８、４．８０、４．６０、４．１５、３．９５、３．８５、３．７０、３．２５、３．１５、２．８５、２．２３、２．１５、１．９８、１．９５、１．７７、１．７１、１．６８、１．６５、１．６０、１．５２、１．４４、１．１５、１．１０、１．０５、０．９８、０．９５、０．９０、０．８８、０．８５；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ ８５３（Ｍ−Ｈ）^-
〔実施例１０〕
１８−ヒドロキシ−２３−（２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミド）−２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソイコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−６（７Ｈ，１３Ｈ，２２Ｈ）−イル３−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）プロパノエート（化合物３）の調製
方法Ｉ：
式（１ａ）の化合物［実施例７に記載されているもの、４０ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ］をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解させた溶液に、Ｃｂｚアラニン（２７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びＰｙＢＯＰ（７５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を０℃で加えてから、ＤＩＰＥＡ（５１μｌ、０．２９ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた反応混合物を一晩、室温で攪拌した。続いて、この反応混合物を水（５ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃及び食塩水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して粗化合物を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１％メタノール・ジクロロメタン溶液）によって精製して、純粋な化合物３を得た。

収量：１２ｍｇ；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、３００ＭＨｚ）：δ ７．９０、７．３９、７．２、６．４５、６．３４、６．１５、５．６５、５．５０、５．３８、５．３０、５．１５、５．１０、４．９０、４．６０、４．５０、４．１０、３．８５、３．７、３．６５、３．５５、３．４、３．２、３．１５、２．７、２．６、２．５、２．３、２．１９、１．９８、１．９５、１．７７、１．７１、１．６８、１．６５、１．６０、１．５２、１．４４、１．１５、１．１０、１．０５、０．９８、０．９５、０．９０、０．８８、０．８５；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ １０３０（Ｍ−Ｈ）^-
方法II：
Ｃｂｚアラニン（６７．５ｍｇ、０．３０２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ、０．１２１ｍｍｏｌ）に溶解させて冷却した溶液に、Ｔ３Ｐ（０．２１６ｍｌ、０．３６３ｍｍｏｌ、５０重量％酢酸エチル溶液）を窒素雰囲気下で加え、１０分間攪拌した。上記の溶液に対して、式（１ａ）の化合物［実施例７に記載されているもの、１００ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ］をアセトニトリル（２０ｍｌ、０．１２１ｍｍｏｌ）に溶解させた溶液を加えてから、トリエチルアミン（０．０５１ｍｌ、０．３６３ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた反応混合物を４時間連続攪拌した。反応の終了後、水（１０ｍｌ）を反応混合物に加え、反応混合物を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃、食塩水、及び水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して粗化合物を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１〜２％メタノール・ジクロロメタン溶液）によって精製して、化合物３を得た。収量：３８ｍｇ
〔実施例１１〕
１８−ヒドロキシ−２３−（２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミド）−２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソイコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−６（７Ｈ，１３Ｈ，２２Ｈ）−イル３−アミノプロパノエート（化合物４）の調製
実施例１０で得たような化合物３（３０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍｌ）に溶解させた溶液に、１当量のＨＣｌと、触媒量の１０％Ｐｄ／Ｃとを加え、得られた反応混合物を２時間、室温で攪拌した。反応の終了後、この反応混合物をセライトで濾過し、濾液を濃縮して化合物４を得た。

収量：１５ｍｇ；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、３００ＭＨｚ）：δ ７．９２、７．３０、７．１０、６．７５、５．８５、５．４５、５．３５、５．１５、５．００、４．８５、４．１６、３．８６、３．４６、３．１０、２．８５、２．７３、２．５６、２．１５、１．８５、１．８０、１．７０、１．６８、１．６５、１．６０、１．５２、１．４４、１．１５、１．１０、１．０５、０．９８、０．９５、０．８８、０．８２、０．８０；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ ８９６（Ｍ−Ｈ）^-
〔実施例１２〕
Ｎ−（６，１８−ジヒドロキシ−２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソ−３，４，４ａ，５，６，７，８，９，１０，１１，１５，１６，１６ａ，１７，１８，１９，２０，２２，２３，２４−イコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−２３−イル）−２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミド（化合物５）の調製
実施例７で得たような式（１ａ）の化合物（３０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（６ｍｌ）に溶解させた溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（１８ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）を０℃で加え、得られた反応混合物を一晩、室温で攪拌した。この反応混合物を水（２０ｍｌ）で希釈し、ジクロロメタン（３×２５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水及び水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して粗化合物を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５％メタノール・ジクロロメタン溶液）によって精製して、化合物５を得た。

収量：２０ｍｇ；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、３００ＭＨｚ）：δ １０．３４、９．６２、７．８４、７．５２、７．４５、７．４３、７．０７、６．６８、６．１９、５．７７、５．６４、５．５１、５．４１、５．０４、５．０２、４．９４、４．１７、４．１２、２．２０、１．９８、１．９０、１．６０、１．５１、１．３３、１．２３、１．０４、０．９０、０．８７、０．８２；ＥＳＩ−ＭＳ：８４６（Ｍ＋Ｎａ）
〔実施例１３〕
２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−Ｎ−（２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソテトラコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−２３−イル）プロパンアミド（化合物６）の調製
攪拌子を備えた清浄な火炎乾燥した丸底フラスコを脱気し、Ａｒでパージした。Ｃｐ₂ＴｉＣｌ₂（１９３ｍｇ、０．７７４ｍｍｏｌ）及び活性化亜鉛（４１１ｍｇ、６．２９ｍｍｏｌ）の脱気ＴＨＦ溶液（３ｍｌ）を室温でＡｒ下にて４５分間攪拌した。反応混合物の色が、暗赤色からオリーブグリーン色に変化した。この反応混合物を−３０ ０℃まで冷却し、実施例７で得たような式（１ａ）の化合物（４０ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３ｍｌ）を３分かけて滴下した。バス温度を−３０℃〜−１０℃に維持しながら、この反応混合物を４５分間攪拌した。反応混合物を室温まで昇温し、飽和５％Ｋ₂ＣＯ₃（５ｍｌ）と酢酸エチル（２０ｍｌ）とに分液した。有機層をピペットで除去し、ｗｈａｔｍａｎ製ガラスマイクロファイバーフィルター（タイプＧＦ／Ｆ）で濾過して、不溶性チタニウム塩を除去した。水層を酢酸エチル（４×２０ｍｌ）で抽出し、抽出後毎回、有機層をワットマン(whatman)製ガラスマイクロファイバーフィルター（タイプＧＦ／Ｆ）で濾過した。合わせた有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して固体を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、７０％酢酸エチル・ヘキサン溶液）によって精製して、化合物６を得た。

収量：８ｍｇ；¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆、３００ＭＨｚ）：δ ８．３２、７．７８、６．８７、６．６５、６．２５、５．７５、５．５９、５．３２、５．２８、５．２１、５．１５、４．９５、４．７７、４．７３、４．４５、４．２３、４．１２、３．９４、３．３４、２．７３、２．２７、２．１８、２．０８、１．９９、１．８８、１．６３、１．３５、１．３０、１．２３、１．０４、０．９０、０．８７；ＥＳＩ−ＭＳ：８１７（Ｍ＋Ｎａ）
〔実施例１４〕
１８−ヒドロキシ−２３−（２−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシ−５−イソブチル−６−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）プロパンアミド）−２２−イソプロピル−７，１９−ジメチル−５，８，１１，１７，２０，２４−ヘキサオキソイコサヒドロジピリダジノ［６，１−ｆ：６’，１’−ｏ］［１，４，７，１０，１３，１６］オキサペンタアザシクロノナデシン−６（７Ｈ，１３Ｈ，２２Ｈ）−イルアセテート（化合物７）の調製
実施例７で得たような式（１ａ）の化合物（０．０５０ｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解させた溶液に、ピリジン（０．０２５５ｍｌ、０．３０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、１５分間攪拌してから、塩化アセチル（０．０４３ｍｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を２時間、室温で攪拌した。この反応混合物を酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を希１％ＨＣｌ（５ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％メタノール・ジクロロメタン溶液）によって精製して、化合物７を得た。

収量：１５ｍｇ；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、３００ＭＨｚ）：δ ７．９２、７．２８、６．８５、６．４５、６．１５、５．４５、５．３６、５．２０、５．１５、４．９０、４．８５、４．６５、４．２１、３．８０、３．１５、２．３５、２．２５、２．１２、１．９８、１．９５、１．７７、１．７１、１．６８、１．６０、１．５２、１．４０、１．１５、１．０５、０．９８、０．９５、０．９０、０．８８、０．８６；ＥＳＩ−ＭＳ：８９１（Ｍ＋Ｎａ）
〔実施例１５〕
ＰＥＧ化コンジュゲート（化合物８）の調製
実施例１１で得たような化合物４（２００ｍｇ、０．２２３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ、０．２２３ｍｍｏｌ）に溶解させた溶液に、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（１３５ｍｌ、０．７７９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−サクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール（７２２ｍｇ、１．４４８ｍｍｏｌ）を一気に加え、得られた反応混合物を一晩、室温で攪拌した。ＤＭＦを高速真空下で室温にて除去して固体を得、これをｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標） Ｇ−１５というサイズ排除クロマトグラフィーカラムで精製した。

ＤＭＦ及び水における遊離した式（１ａ）の化合物の一連の濃度と、２６９ｎｍにおけるそれらの吸光度との関係を用いて、検量線を作成した。式（１ａ）の化合物の含有率に基づき、下記の式を用いて、ＰＥＧ化コンジュゲートの濃度を算出した。

ＰＥＧコンジュゲートの濃度＝ＰＥＧ化コンジュゲートの吸光度−（切片／傾き）
ＰＥＧ化コンジュゲート形態（化合物８）における式（１ａ）の化合物の含有率は、１０％であることが分かった。

〔実施例１６〕
式（１ａ）の化合物の生物学的評価：
下記の用語／符号／略語／化学式を薬理学的アッセイで用いる。

インビトロアッセイ
このアッセイは、参考文献のＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，１０，６１０，１−１１（この文献のインビトロアッセイの教示に関する開示内容は、参照により組み込まれる）におけるものと同様に設計した。

単層アッセイ
工程１
細胞株の維持
ＡＭＩＭＥＤ（バイオコンセプト(BioConcept)−スイス）から得たイーグル基礎塩含有最小必須培地（ＭＥＭ−ＥＢＳ）中で、ヒト腫瘍細胞株Ｐａｎｃ−１（膵臓がん）、ＨＣＴ１１６（大腸がん）、ＡＣＨＮ（腎細胞癌）、Ｃａｌｕ−１（肺癌）、ＭｉａＰａｃａ２（膵臓がん）、ＦＡＤＵ（頭頸部がん）、ＰＣ３（前立腺がん）、Ｇ３６１（メラノーマ）、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ（メラノーマ）、ＨｅＬａ（子宮頸がん）を培養した。腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳がん）、ＪＵＲＫＡＴ（Ｔ細胞白血病）、Ｈ４６０（小細胞肺がん）をＲＰＭＩ１６４０（ＡＭＩＭＥＤ、バイオコンセプト、スイス）培地中で培養した。いずれの腫瘍細胞株にも、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ（登録商標））、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ(Sigma)）、及び１％Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ（ＧＩＢＣＯ）を添加し、組織培養用フラスコＴ−１７５（ヌンク(Nunc)）で培養した。標準的な添加剤をすべて含む乳房上皮細胞用基礎培地（ＭＥＢＭ）（ロンザ(Lonza)、カタログ番号ＣＣ−３１５０）中で、非造腫瘍細胞株のＭＣＦ−１０Ａを培養した。すべての細胞を３７℃の５％ＣＯ₂インキュベーターで培養した。細胞は、８０〜９０％コンフルエントになったら継代した。接着細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ（シグマ）を用いてトリプシン処理し、維持した。いずれの細胞株も、ＡＴＣＣ（米国メリーランド州ロックビル）から購入した。

工程２
試料調製
式（１ａ）の化合物［実施例７に記載されているもの］をＤＭＳＯに溶解させて、必要なストック溶液２０ｍＭを得た。最終的に（試験濃度と比べて）２００倍高い濃度が得られるように、ストック溶液を段階希釈することによって、８種類の濃度の式（１ａ）の化合物を調製した。式（１ａ）の化合物は、０．０００１μＭ、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、及び３μＭの濃度でそれぞれ試験した。各濃度について３回評価を行った。

工程３
アッセイ
式（１ａ）の化合物のＩＣ₅₀を測定する方法：
ａ）組織培養グレードの９６ウェルプレートに、種々のがん細胞／正常細胞を３０００細胞／２００μＬウェルの密度で播種し、３７±０．５℃で５±０．２％ＣＯ₂加湿インキュベーター中で２４時間回復させた。

ｂ）がん細胞／正常細胞を播種した上記の組織培養プレートに、２４時間後、２００×（必要濃度よりも２００倍高いことを２００×と称する）の式（１ａ）の化合物１μＬをＤＭＳＯに溶解させた溶液を加えた。ウェルにおけるＤＭＳＯの終濃度は０．５％であった。ＤＭＳＯをビヒクルコントロールとして用いた。

ｃ）２４時間後、培養プレートをＣＯ₂インキュベーターから取り出し、各ウェルにＣＣＫ−８（ドウジンドウ・モレキュラー・テクノロジーズ，インク(Dojindo Molecular Technologies,Inc.)、米国、カタログ番号ＣＫ０４−２０）５μＬを加えた。

ｄ）続いて、培養プレートを３７℃で２時間置いた。

ｅ）吸光度を４５０ｎｍで記録した。

ｆ）下記の式を用いてパーセント細胞毒性を算出した。

ＩＣ₅₀値は、濃度−作用曲線の目視確認によって推定した。試験した１４種の細胞株におけるＩＣ₅₀平均値の算出には、幾何平均を選択した。

結果を下記の第３表に示す。

結論
インビトロでの検討により、種々のがん細胞においては、式（１ａ）の化合物が０．００１３μＭ〜０．０２５μＭの範囲のＩＣ₅₀を示し、正常細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）においては、式（１ａ）の化合物が０．０１９μＭのＩＣ₅₀を示すことが明らかになった。このデータは、式（１ａ）の化合物が、高度に増殖するがん細胞株に対する活性を有することを示している。

〔実施例１７〕
アッセイ
ＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシスの検出：
アポトーシスを検出するための古典的技法であるアネキシンＶアッセイは、フローサイトメトリーによってアポトーシスを検出する方法として最も一般的なものである。アポトーシスの最も初期の特徴の１つは、ホスファチジルセリンが細胞膜の内葉から外葉にトランスロケーションすることによって、ホスファチジルセリンが外部環境に露出することである。

アネキシンＶ（カタログ番号５５６４２０、ＢＤバイオサイエンス(BD Biosciences)、米国）は、細胞表面に露出したホスファチジルセリンに結合し、アポトーシスの初期段階の細胞を認識する。

ａ）組織培養グレードの９６ウェルプレートに、ＨｅＬａがん細胞［実施例１６の工程１で言及したもの］を０．５×１０⁶細胞／２０００μＬウェルの密度で播種し、３７±０．５℃で５±０．２％ＣＯ₂加湿インキュベーター中で１２時間回復させた。

ｂ）ＨｅＬａがん細胞を播種した上記の組織培養プレートに、１２時間後、２００×（必要濃度よりも２００倍高いことを２００×と称する）の式（１ａ）の化合物５μＬをＤＭＳＯに溶解させた溶液［実施例１６、工程２］を加えた。式（１ａ）の化合物の最終試験濃度は、０．０００３μＭ、０．００３μＭ、及び０．０１μＭであった。ウェルにおけるＤＭＳＯの終濃度は０．５％であった。

ｃ）４８時間後、培養プレートをＣＯ₂インキュベーターから取り出し、アポトーシス検出キット（カタログ番号：５５６５４７、ＢＤバイオサイエンス、米国）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ＦＩＴＣアネキシンＶで染色した。

ｄ）アネキシンＶ検出のために、処理した細胞をＢＤ製フローサイトメーターで分析した。ＦＡＣＳ解析を用いて、Ｍ１及びＭ２に存在する個体数を測定した。

結果：ビヒクルコントロール細胞では、アネキシンＶ陽性細胞（Ｍ２）は２．０１％であり、式（１ａ）の化合物に１２時間曝露した細胞では、アネキシンＶ染色による陽性細胞（Ｍ２）は、０．０００３μＭの濃度で３３．８０％、０．００３μＭの濃度で４０．２７％、０．０１μＭの濃度で５９．０５％であった（図５に示す）。

結論：このデータは、式（１ａ）の化合物が、ＨｅＬａがん細胞中において、アポトーシスによって細胞死を誘発することを示している。

〔実施例１８〕
アッセイ
ハイコンテントスクリーニングによるタンパク質発現の検討
サイクリンＤ、核因子−κＢ（ｐ６５）［ＮＦκＢ（ｐ６５）］、リボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）、腫瘍タンパク質５３（ｐ５３）、タンパク質ｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ｐＪＮＫ）、切断カスパーゼ９、切断カスパーゼ３、及び切断ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のタンパク質発現を、ＨｅＬａ細胞［実施例１６の工程１で言及したもの］中でＣｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）のハイコンテントイメージングによって、行った。これらの一次抗体は、米国のサンタクルーズバイオテクノロジー(Santacruz Biotechnology)から購入した。簡潔に言えば、底面が透明な組織培養グレードの９６ウェルブラックプレート（ヌンク、米国）に、１×１０⁴個の細胞を播種し、２４時間接着させてから、新鮮な培地に交換し、濃度０．０１μＭ、０．００３μＭ、及び０．０００３μＭの式（１）の化合物［実施例１６の工程２で言及したもの］で細胞を処理し、それぞれ１時間、及び３時間インキュベートした。各時点で、細胞を３．７％ホルムアルデヒド（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で１０分間、ＲＴにて固定した後、０．１５％トリトンＸ−１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で１０分間透過処理した。続いて、細胞を５％ウシ血清アルブミンで２時間ブロックした。ブロック工程後、特異的一次抗体を１時間かけて加え、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４８（赤色）（サーモフィッシャー(Thermofisher)、米国）で標識した二次抗体によって、種々のタンパク質の一次抗体の位置を特定した。２回目のインキュベーションの後、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３４２（青色）（シグマ、米国）で染色した。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標） Ａｒｒａｙ ＳｃａｎＶＴＩ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック，インク(Thermo-Fisher Scientific Inc.)、マサチューセッツ州ウォルサム）でプレートを走査することによって、免疫蛍光を測定した。ＣｅｌｌｏｍｉｃｓのバイオアルゴリズムＣｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いてすべてのデータ点を解析し、未処理細胞と比べた場合のパーセント活性化として、定量的データを表した。各レプリケートウェルにおいて１０００個の細胞を計数し、結果を平均±Ｓ．Ｅ．として表した。

結果を第４表及び第５表にまとめて示す。

結論
式（１ａ）の化合物は、がん細胞におけるＮＦκＢ（ｐ６５）、ｐＳ６、及びサイクリンＤのタンパク質発現を有意にダウンレギュレートする。また、式（１ａ）の化合物は、ｐ５３、ｐＪＮＫ、切断カスパーゼ９の発現をアップレギュレートした後に、切断カスパーゼ３及び切断ＰＡＲＰの顕著なアップレギュレーションを誘発し、このアップレギュレーションは、がん細胞をアポトーシスへと導く。

〔実施例１９〕
式（１ｂ）の化合物及び化合物１〜８の生物学的評価
このアッセイは、上記の実施例１６に記載されているように設計した。インビトロアッセイ用の試料調製と、式（１ｂ）の化合物（実施例８に記載されているもの）及び実施例９〜１５で得たような化合物［化合物１〜８に対応するもの］のＩＣ₅₀値の測定とは、上記の実施例１６に記載されているように行った。

ＩＣ₅₀値は、濃度−作用曲線の目視確認によって推定した。試験した６種の細胞株（ＰＣ３、ＭＤＡ ＭＢ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、ＭＩＡＰａＣａ２、ＭＣＦ１０Ａ）におけるＩＣ₅₀平均値の算出には、幾何平均を選択した。

結果を下記の第６表に示す。

結論
インビトロでの研究により、（ｉ）種々のがん細胞では、式（１ｂ）の化合物が０．０１８μＭ〜０．０７１μＭの範囲のＩＣ₅₀を示し、正常細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）では、式（１ｂ）の化合物が０．０３０μＭのＩＣ₅₀を示すこと、ii）種々のがん細胞では、化合物１〜８が０．００９μＭ〜１．０４５μＭの範囲のＩＣ₅₀を示し、正常細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）では、化合物１〜８が＜０．０１０μＭ〜０．８３０μＭのＩＣ₅₀を示すことが明らかになった。

これらのデータは、式（１ｂ）の化合物、及び化合物１〜８が、高度に増殖するがん細胞株に対する活性を有することを示している。

Claims (22)

1. 式（１）
   

   

   （式中、式（１）の化合物において、
   

   

   の結合が単結合を表し、Ｒ¹がＨであるときには、前記化合物を式（１ａ）の化合物といい、
   

   

   の結合が二重結合であり、Ｒ¹が存在しないときには、前記化合物を式（１ｂ）の化合物という）
   の化合物、その異性体、その互変異性体、若しくはその混合物、誘導体、又はその薬学的に許容される塩。
2. 前記化合物が、
   ａ）分子量８２６．９、
   ｂ）分子式Ｃ₃₇Ｈ₆₂Ｎ₈Ｏ₁₃、
   ｃ）ＩＲ（ＫＢｒ）スペクトル ３３２５、２９６０、２８７２、１７５５、１６４１、１５２４、１４４５、１３３１、１３０６、１２８８、及び１２５４ｃｍ^-1、
   ｄ）¹Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：δ ９．２０、８．００、７．１０、６．９０、６．４０、６．１０、５．４０、５．３８、５．２９、５．１０、４．９０、４．８０、４．７０、４．６０、３．９０、３．７０、３．１５、２．７０、２．３０、２．１０、１．９８、１．９５、１．７７、１．７１、１．６８、１．６０、１．５２、１．４０、１．１５、１．１０、１．０５、０．９８、０．９５、０．９０、０．８８、及び０．８５（図１に示されている）、
   ｅ）¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：δ １７６．０、１７２．０（３）、１７１．０、１７０．０、１６９．０、９９．９、７８．９、７７．２、７１．７、５３．５、５２．９、４９．３、４９．０、４７．１、４６．７、４６．２、４２．２、４１．０、３９．８、２９．９、２７．４、２４．８、２４．６、２４．２、２４．１、２３．２、２１．７、２１．５（２）、２０．６、１９．９、１９．４、１８．１、１２．９、及び１１．７（図２に示されている）、
   によって特徴付けられる式（１ａ）の化合物である、請求項１に記載の化合物。
3. 前記化合物が、
   ａ）分子量８２４．４、
   ｂ）分子式Ｃ₃₇Ｈ₆₀Ｎ₈Ｏ₁₃、
   ｃ）ＩＲ（ＫＢｒ）：３３４２、３０３０、２９５３、１７５２、１６５０、１５２４、１４２１、１２９３、１２５５、及び１２３９ｃｍ^-1、
   ｄ）¹Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：δ ９．２０、８．００、７．１９、７．０、６．１８、６．１４、５．８０、５．４１、５．３９、５．３０、５．１０、４．８０（２）、４．２０、３．７０、３．１９、２．６２、２．２７、２．１０、２．０１、１．９８、１．７７、１．７１、１．６２、１．５８、１．４４、１．４０、１．３９、１．３７、１．２０、１．１０、１．０５、０．９６、０．９１、０．９０、０．８６、及び０．８５（図３に示されている）、
   ｅ）¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）：δ １７６．０、１７１．８、１７１．７、１７０．８、１７０．６、１７０．３、１６８．９、１４４．６、９８．８、７９．０、７７．２、７１．７、５３．６、５３．５、５０．６、４９．１、４７．１、４６．４、４２．６、４１．０、３９．８、２９．９、２７．４、２４．７、２４．６、２４．２、２４．０、２２．１、２１．５、２１．４、１９．８、１９．５、１９．４、１８．１、１７．２、１２．９、及び１１．８（図４に示されている）、
   によって特徴付けられる式（１ｂ）の化合物である、請求項１に記載の化合物。
4. 前記化合物が、式（１ｃ）
   

   

   （式中、
   Ｒ¹及びＲ⁴は独立して、Ｈを表すか、又は存在せず、
   Ｒ²及びＲ³は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、及び−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルから選択され、
   

   

   は単結合又は二重結合を表し、
   （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルは、非置換であるか、又は、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ニトロ、シアノ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｎ［（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル］₂、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール、−ＮＨ−ＰＥＧ、若しくは（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールから独立して選択される１つ以上の基で置換されており、
   （Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリールは、非置換であるか、又は、ハロゲン、ハロ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、−ＣＯＯＨ、及び−ＮＨ₂から独立して選択される１つ以上の基で置換されており、
   ＰＥＧは、Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−サクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール（α，ω−ビス−ＮＨＳ−ＰＥＧ）、メチル−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ＭＳ（ＰＥＧ）ｎ、ｎ＝２４）、並びにポリエチレングリコールの分岐状のトリメチル及びスクシンイミドエステル誘導体（ＴＭＳ（ＰＥＧ）ｎ、ｎ＝１２）から選択されるポリエチレングリコールであり、
   ただし、Ｒ²及びＲ³の両方がヒドロキシである場合には、Ｒ¹及びＲ⁴が存在せず、
   

   

   が二重結合を表す）
   によって表される、式（１）の化合物の誘導体、その異性体、その互変異性体、若しくはその混合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
5. 式（１ｃ）の化合物であって、
   Ｒ¹及びＲ⁴が、Ｈであり、
   Ｒ²が、−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル又は−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、
   Ｒ³が、ヒドロキシ又は−Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、
   （Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルが、非置換であるか、又は、−ＮＨ₂、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル（Ｃ₆−Ｃ₁₀）アリール、若しくは−ＮＨ−ＰＥＧで置換されている化合物、
   、その異性体、その互変異性体、若しくはその混合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項４に記載の化合物。
6. 式（１ｃ）の化合物であって、
   Ｒ¹及びＲ⁴が独立して、Ｈを表すか、又は存在せず、
   Ｒ²及びＲ³が独立して、Ｈ及びヒドロキシから選択され、
   

   

   が単結合又は二重結合を表し、
   ただし、Ｒ²及びＲ³の両方がヒドロキシである場合には、Ｒ¹及びＲ⁴が存在せず、
   

   

   が二重結合を表す化合物、
   、その異性体、その互変異性体、若しくはその混合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項４に記載の化合物。
7. 前記化合物が
   

   

   

   

   

   

   

   

   

   、その異性体、その互変異性体、若しくはその混合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の化合物。
8. 治療有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／又は担体とを含む医薬組成物。
9. がん治療に用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩。
10. 前記がんが、白血病、肺がん、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、尿路がん、乳がん、頭頸部がん、子宮体がん、リンパ腫、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、胚細胞腫瘍、胆管癌、頭蓋外がん、肉腫、中皮腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽腫、食道がん、多発性骨髄腫、頭頸部がん、膵臓がん、上衣腫、神経芽腫、皮膚がん、卵巣がん、再発卵巣がん、前立腺がん、睾丸がん、大腸がん、リンパ増殖症、難治性多発性骨髄腫、耐性多発性骨髄腫、又は骨髄増殖性疾患から選択される、請求項９に記載の用途の化合物。
11. 前記がんが、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳幹神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫（小脳星状細胞腫及び大脳星状細胞腫を含む）、視路神経膠腫、松果体瘍、髄芽腫、中枢神経原発リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキン病、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱がん、尿路がん、骨肉腫、乳がん、子宮体がん、口腔がん、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽腫、食道がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、神経芽腫、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がん、睾丸がん、大腸がん、リンパ増殖症、又は骨髄増殖性疾患から選択される、請求項９又は１０に記載の用途の化合物。
12. 前記がんが、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳幹神経膠腫、神経膠肉腫、星状細胞腫（小脳星状細胞腫及び大脳星状細胞腫を含む）、髄芽腫、腎細胞癌、膀胱がん、尿路がん、乳がん、口腔がん、メラノーマ、子宮頸がん、甲状腺がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、又は大腸がんから選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の用途の化合物。
13. がんの治療に用いられる、請求項８に記載の用途の医薬組成物。
14. がん治療薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩の使用。
15. 治療対象動物のがんを治療する方法であって、前記治療対象動物に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、その異性体、その互変異性体、又はその薬学的に許容される塩を治療有効量投与することを含む方法。
16. 請求項１に記載の化合物を調製する方法であって、
    ａ）湛水好気条件下、炭素源、炭素源、栄養無機塩、及び／又は微量元素を含有する栄養培地中で、培養物番号ＰＭ０８９５１７２、又はその多様体若しくは変異体の１つを培養して、式（１）の化合物を含有する培養ブロスを得る工程と、
    ｂ）式（１）の化合物を培養ブロスから単離する工程と、
    ｃ）式（１）の化合物を精製する工程とを含む方法。
17. 式（１）の化合物を、その薬学的に許容される塩に変換することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記工程（ａ）における前記培養ブロスが、式（１ａ）の化合物と式（１ｂ）の化合物との混合物を含有する、請求項１６に記載の方法。
19. 前記工程（ｂ）において、式（１）の化合物が式（１ａ）の化合物である、請求項１６に記載の方法。
20. 前記工程（ｂ）において、式（１）の化合物が式（１ｂ）の化合物である、請求項１６に記載の方法。
21. 前記工程（ｃ）において、式（１）の化合物が式（１ａ）の化合物である、請求項１６に記載の方法。
22. 前記工程（ｃ）において、式（１）の化合物が式（１ｂ）の化合物である、請求項１６に記載の方法。

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