CN104603147A - 六酯肽类似物作为抗癌化合物 - Google Patents

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斯瑞库马尔·桑卡兰纳拉亚南·依雅曼迪琪伊奥
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沙伦答腊·索纳韦恩
纳拉亚南·苏巴什·查克罗
阿伯吉特·罗伊乔杜里
拉吉夫·夏尔马
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Abstract

此发明涉及一种分离的式(1)的化合物或其衍生物或药学上可接受的盐类。本发明还包括式(1)的化合物或其衍生物的所有同分异构和互变异构形式。本发明进一步涉及通过放射菌(PM0895172/MTCC 5684)的真菌菌株发酵作用生产式(1)的化合物的方法、包含该式(1)的化合物作为活性成分的药物组合物；以及包含它们的所述化合物或组合物在癌症治疗的用途。

Description

六酯肽类似物作为抗癌化合物
技术领域
本发明涉及一种式(1)的化合物(如同本文中描述的)、药学上可接受的盐类或其衍生物。本发明进一步涉及来自分离的属于放线菌菌株(PM0895172/MTCC 5684)的微生物的式(1)的化合物的生产方法。本发明还涉及包含式(1)的化合物、其药学上可接受的盐类或衍生物作为活性成分的药物组合物；以及其治疗癌症的用途。
背景技术
癌症是一个大群组疾病的总称，其由不受控制的可以影响身体的任何部分的细胞生长和扩散导致。目前对癌症，可以得到有很多治疗选择，包括化疗、外科手术和对局部疾病处的放射或所述治疗的组合。疗法的选择取决于癌症的位置且还取决于癌症在诊断时扩散的程度。化疗为癌症治疗的最常见的形式的一种，其涉及使用可消灭癌症细胞的抗癌药物。仅管癌症的治疗方案持续进步，此疾病仍然是世界上主要的死亡原因之一，最可能的理由是可得的治疗选择与不良的副作用和有限的效果相关。因此，需要用于治疗癌症的表现临床获益的新抗癌剂/药物。
有来自天然资源的抗癌化合物的报道，诸如紫杉酚(taxol)、长春新碱(vincristine)、苯醌二聚体粗榧酸(torreyanic acid)和喜树碱(camptothecin)(Natural Product Communications,2009,4(11),1513)。
海生环境，覆盖了百分之七十的地球表面和百分之九十五的热带生物，其表现生命的三十六门中的三十四门，且提供了超过陆地环境的各种迷人的生物多样性(Life Sciences,2005,78,442-453)。海生天然产物生物勘探(用于有商业价值的遗传和生物化学资源的生物多样性和内在知识的探索、提炼和筛选)，已产生了相当多的药物候选者(Drug Discovery Today,2003,8(12),536-544)。
已有发现很多药剂的报导，其涉及来自海生生物与微生物的天然产物的筛选。源自海生源的抗癌剂的示例包括阿糖胞苷(cytarabine)、苔藓抑素(bryostatin-1)、阿普立定(Aplidine)、多拉司他汀10(dolastatin)和ET-743(Current Opinion in Pharmacology,2001,1,364-369)。
本领域报导了一些六酯肽(hexadepsipeptides)。例如，JP09040559揭露具有抗发炎活性的六酯肽类化合物，其对过敏性和非过敏性发炎有效。
考虑到许多具有治疗活性的化合物已经从天然源获得，应要审慎的是探索此研究领域以获得可有效用于治疗如癌症的疾病的新化合物。本专利说明书的发明人将他们的努力定向为提供一种在治疗癌症中发现用途的新颖化合物。还提供生产此化合物的方法，其通过发酵作用以及进一步地，影响式(1)的化合物的化学修饰，以获得其衍生物。
发明内容
本发明涉及一种在本文中指定为式(1)的化合物(如同本文所描述的)的化合物。 
本发明涉及式(1)的化合物或其药学上可接受的盐类或其衍生物的同分异构体形式、互变异构体形式。
根据本发明，式(1)的化合物为式(1a)的化合物或式(1b)的化合物。 
根据本发明，式(1)的化合物的衍生物包含在式(1c)的化合物。 
本发还涉及一种纯化的式(1)的化合物，其从通过海生放线菌菌株(PM0895172/MTCC5684)或其变异体或突变体中的一种的发酵作用获得的培养液分离出。于是，本发明的化合物为式(1)的分离的化合物。
本发明还涉及用于生产来自海生放射菌株的式(1)的化合物及/或其同分异构体或其互变异构体(PM0895172/MTCC 5684)的工艺。
本发明进一步涉及一种属于放线菌菌株(PM0895172/MTCC 5684)的微生物的分离工艺，培养其来生产式(1)的化合物，或其同分异构体或互变异构体。
式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或其药学上可接受的盐类或衍生物对癌症的治疗有用。
本发明涉及用于在受试者中治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或衍生物给药至受试者。
本发明还涉及药物组合物，其包含式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或其衍生物作为活性成分，以及至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物。
附图说明
图1说明式(1a)的化合物的1H NMR(CDCl3；500MHz；仪器：Bruker)光谱。
图2说明式(1a)的化合物的13C NMR(CDCl3；75MHz；仪器：Bruker)光谱。
图3说明式(1b)的化合物的1H NMR(CDCl3；500MHz；仪器：Bruker)光谱。
图4说明式(1b)的化合物的13C NMR(CDCl3；75MHz；仪器：Bruker)光谱。
图5说明式(1a)的化合物对在HeLa癌细胞中的细胞凋亡的影响。
具体实施方式
本发明提供一种如下表示的式(1)的化合物： 
其中，在式(1)的化合物中，当键代表单键且R1为H时；将化合物称作式(1a)的化合物；以及
当键为双键且R1不存在时，将化合物称作式(1b)的化合物。于是，式(1)的化合物为式(1a)的化合物(其中，键代表单键且R1为H)或式(1b)的化合物(其中，键为双键且R1不存在)或其混合物。
式(1)的化合物属于六酯肽类化合物。
式(1a)的化合物和式(1b)的化合物可以通过任何一个或更多的物理-化学和光谱性质来表征，诸如如同本文下面讨论的高效液相色谱法(HPLC)、高分辨质谱(HR MS)、红外(IR)和核磁共振(NMR)光谱数据。
根据本发明的一个方面，式(1)的化合物为式(1a)的化合物，其具有分子式C37H62N8O13和分子量826.9。
式(1a)的化合物表示如下：
式(1a)的化合物的化学名称为N-(6,18-二羟基-22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六 氧二十四氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-23-基)-2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺。
根据本发明的一方面，式(1)的化合物为式(1b)的化合物，其具有分子式C37H60N8O13，和824.4的分子量。
式(1b)的化合物表示如下：
式(1b)的化合物的化学名称为N-(6,18-二羟基-22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧-3,4,4a,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15,16,16a,17,18,19,20,22,23,24-二十二氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-23-基)-2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺。
可使用于生产式(1)的化合物的微生物为放线菌菌株(PM0895172/MTCC 5684)，本文以下称作培养编号PM0895172，其从由印度马哈拉施特拉邦，孟买的近海区域收集的深海沉积物中分离。
本发明的一个方面提供用于生产来自培养编号PM0895172的式(1)的化合物的工艺，其步骤包括：
a)使培养编号PM0895172或其变异体或突变体中的一种生长在包含一种或更多种源的碳与一种或更多种源的氮以及营养无机盐及/或微量元素的营养培养基中的水下需氧条件下，以获得包含式(1)的化合物的培养液；
b)从培养液中分离式(1)的化合物；以及
c)纯化式(1)的化合物。 
根据上述工艺生产的式(1)的化合物可以为式(1a)的化合物或式(1b)的化合物。 
在一个实施例中，在步骤(a)中的培养液含有式(1a)的化合物和式(1b)的化合物的混合物。
在一实施例中，在工艺的步骤(b)中，式(1)的化合物为式(1a)的化合物。 
在一实施例中，在工艺的步骤(b)中，式(1)的化合物为式(1b)的化合物。 
在一实施例中，在工艺的步骤(c)中，式(1)的化合物为式(1a)的化合物。 
在一实施例中，在工艺的步骤(c)中，式(1)的化合物为式(1b)的化合物。 
在一实施例中，本发明提供一种用于生产来自培养编号PM0895172的式(1a)的化合物的工艺，其步骤包括：
a)使培养编号PM0895172或其变异体或突变体中的一种生长在包含一种或更多种源的碳与一种或更多种源的氮以及营养无机盐及/或微量元素的营养培养基中的水下需氧条件下，以获得包含式(1a)的化合物和式(1b)的化合物的混合物培养液；
b)从培养液中分离式(1a)的化合物；以及
c)纯化式(1a)的化合物。 
在另一个实施例中，本发明提供用于生产来自培养编号PM0895172的式(1b)的化合物的工艺，其步骤包括：
a)使培养编号PM0895172或其变异体或突变体中的一种生长在包含一种或更多种源的碳和一种或更多种源的氮以及营养无机盐及/或微量元素的营养培养基中的水下需氧条件下，以获得包含式(1a)的化合物和式(1b)的化合物的混合物培养液；
b)从培养液中分离式(1b)的化合物；以及
c)纯化式(1b)的化合物。 
如上述任何一个工艺的步骤(c)涉及式(1)的化合物的纯化，并且纯化是通过使用相关领域中通常使用的纯化工艺来进行的。
式(1)的化合物，特别是根据本发明的工艺产生的式(1a)的化合物和式(1b)的化合物为大体上纯的化合物。因此，式(1)的化合物，特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物为分离的纯化合物。
典型地，通过柱色谱技术纯化式(1a)的化合物和式(1b)的化合物。 
如同本文使用，术语“突变体(mutant)”意指生物体或细胞，其中基因组中的一个或更多个基因已被一个或多个基因修改，用负责生物体的能力的基因生产根据本发明的化合物。可以本身已知的方式，使用物理手段诸如用紫外线或X光照射或化学诱突变剂的方式产生这样的突变体。
如同本文使用，术语“变异体(variant)”意指在可辨别地不同于该物种的任意标准类型的个别生物体。
术语“整个培养液(whole broth)”可与术语“营养培养液(nutrient broth)”、“培养液(culture broth)”或“发酵培养液(fermented broth)”可互换地使用。
如同本文使用，术语“哺乳动物”意指人类以及非人类哺乳动物，其包括但不限于牛、马、猪、狗与猫。该术语“哺乳动物”可与该术语“患者(patient)”或“受试者(subject)”可互换地使用。
术语“活性成分(active ingredient)”或“活性化合物(active compound)”可互换地使用，且如同本文使用，所述术语意指式(1)的化合物或式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其同分异构体或互变异构体或其药学上可接受的盐类或衍生物。在本发明的上下文中，术语“活性成分”或“活性化合物”亦意指式(1c)的化合物，其包含如同本文描述的式(1)的化合物的衍生物。
术语“式(1)的化合物”包括式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其混合物；以及其同分异构体、互变异构体或药学上可接受的盐类。
术语“式(1c)的化合物”包括式(1)的化合物的衍生物，其包括式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其同分异构体、互变异构体或药学上可接受的盐类的衍生物。
如同本文中使用，术语“大体上纯(substantially pure)”意指式(1)的化合物，特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其同分异构体是足够纯的，使得进一步的纯化不会可察觉地改变其物理与化学性能和化合物的酶和生物活性。按照下列本领域的技术人员所知的方法能够大幅纯化式(1)的化合物。
如同本文中使用，关于使用式(1)的化合物特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其药学上可接受的盐类或衍生物(式(1c)的化合物(如同本文所描述))治疗癌症(如同本文列举)中的术语“治疗有效量(therapeutically effective amount)”意指能够在接受本发明的化合物的受试者中引起一种或更多种个下列作用的量：(i)在某种程度上，抑制肿瘤生长作用，其包括减缓和完全的生长停止；(ii)肿瘤细胞的数目减少；(iii)肿瘤大小的缩小；(iv)抑制肿瘤细胞渗透到周围器官的作用(即，减少、减缓或完全停止)；(v)抑制转移的作用(即，减少、减缓或完全停止)；(vi)抗肿瘤免疫反应的增强作用，其可能但不一定导致肿瘤的复原；及/或(vii)在某种程度上，缓解与所治疗的癌症相关的一种或更多种症状作用。
如同本文中使用，术语“药学上可接受的盐类”意指包括式(1)的化合物特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物，以及其衍生物(式(1c)的化合物)的本发明化合物的那些盐类，其在哺乳动物中安全且有效并且拥有所需的生物活性。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、蚁酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、或对甲苯磺酸盐。合适的碱加成盐包括但不限于钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠或锌盐。
通过其菌落特征的检查进行培养编号PM0895172(由其产生式(1)的化合物)的早期鉴定。对修改过的放线菌分离琼脂培养基实行对分离的培养编号PM0895172菌株的微观研究。在20℃至30℃中培养20-22日之后作观察，直至观察到菌落。已将培养编号PM0895172鉴定为海生放射菌菌株。
培养编号PM0895172已在2012年2月27日存放于微生物菌种保存中心(Microbial Type Culture Collection，MTCC，在微生物科技学院(Sector 39-A,Chandigarh-160036，印度))(世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization，WIPO)认可的国际寄存管理局(International Depository Authority，IDA))并且已被提供登录号MTCC 5684。
除了本文中描述的特定微生物，还应理解为还可以培养诸如那些通过化学或物理诱突变剂(包括X光、U.V.光等)生产的PM0895172的突变体和已通过分子生物技术修改基因构成的生物体，以生产式(1)的化合物。
通过HPLC、NMR、IR、MS及/或诸如通过通过用于化合物抗癌活性的累积在培养液中的活性化合物的生物活性的测试确定或通过其组合，能够确认用于可以生产根据本发明的化合物的合适突变体和变异体的筛选。
使用于生产式(1)的化合物的培养编号PM0895172分离和培养的培养基及/或营养培养基，优选包含碳、氮和营养无机盐的源。碳源为，例如，淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、果糖、糖浆、甘油、乳糖或半乳糖中的一种或更多种。优选的碳源为葡萄糖。氮源为，例如大豆粉、花生粉、酵母萃取物、牛肉萃取物、胨、麦芽萃取物、玉米浸液、明胶或酪蛋白胺基酸中的一种或更多种。优选的氮源为胨和酵母萃取物。营养无机盐为，例如，氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锰、氯化镁、氯化锶、氯化钴、溴化钾、氟化钠、磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、碳酸钙、碳酸氢钠、硅酸钠、硝酸钠、硝酸铵、硝酸钾、硫酸钠、硫酸铵、七钼酸铵、柠檬酸铁、硫酸铜、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌或硼酸中的一种或更多种，优选氯化钠和氯化钙。
培养编号PM0895172的维持可以在24℃至32℃范围的温度下实行。典型地，培养编号PM0895172维持在27℃-29℃。可以将生长良好的培养物保存在4℃-8℃的冰箱中。
可以在27℃至33℃范围的温度和约5.5至8.5的pH下，在210-260rpm(每分钟转数)下实行培养编号PM0895172的种子培养物培养60-80小时。典型地，将培养编号PM0895172种子在29℃-31℃和约6.5-7.5的pH下，在230-250rpm下培养70-74小时。
可以通过将培养编号PM0895172在摇晃的烧瓶中的发酵作用，在27℃至33℃范围的温度和约5.5至8.5的pH下，在200-250rpm下培养80-110小时来实行式(1)的化合物的生产。典型地，将培养编号PM0895172在29℃-31℃和pH约6.5-7.5下，在210-230rpm下培养90-100小时。
可以通过将培养编号PM0895172在发酵罐的发酵作用，在27℃至33℃范围的温度和约5.5至8.5的pH下，在40-70rpm和200-300lpm(每分钟公升数)充气下培养20-40小时来实行式(1)的化合物的生产。典型地，将培养编号PM0895172在28℃-31℃和约6.5-7.5的pH下，在50-60rpm和240-260lpm充气下培养20-30小时。
可以通过将培养编号PM0895172在合适的营养培养液中在本文描述的条件下，优选在水下含氧的条件下，例如在摇晃的烧瓶中实行式(1)的化合物的生产。可以通过高效液相色谱法(HPLC)和通过对不同癌症细胞株测试来测量培养液的生物活性而检测发酵作用的进展和式(1)的化合物的产生。
发酵作用是用于生产各种化学或药学化合物的微生物生长的过程。将微生物在营养素存在的特定条件下正常培养。在发酵工艺完成后获得整个培养液。将整个培养液经受离心，其导致细胞团块与培养物滤液的生成，可以通过本文描述的工艺将其进一步地处理。
在培养液中存在的式(1)的化合物，可以以式(1a)的化合物和式(1b)的化合物的混合物的形式存在，且可以将所述式(1a)的化合物或式(1b)的化合物使用不同萃取方法和色谱技术分离。
可以从培养滤液中通过用水不互溶的溶剂诸如石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二乙基醚或丁醇的萃取或通过使用聚合树脂诸如Diaion(Mitsubishi Chemical Industries Limited,Japan)、Amberlite(Rohm and Haas Industries,USA)或活性碳吸附作用的疏水性交互作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography)回收式(1)的化合物特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物。这些技术可以重复地、单独地或组合使用。
可以从细胞团块通过用水互溶的溶剂诸如甲醇、丙酮、乙腈、正丙醇或异丙醇或用水不混溶的溶剂诸如石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或丁醇的萃取作用回收式(1)的化合物特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物。
可选择地，用选自石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、正丙醇或异丙醇或丁醇的溶剂萃取的整个培养液。
典型地，使用乙酸乙酯作为溶剂从整个培养液中萃取式(1)的化合物。萃取物的浓度提供含有式(1a)的化合物与式(1b)的化合物的混合物的活性粗制材料。
能够使用下列技术的任何一种的分馏作用从粗制材料中回收根据本发明的式(1)的化合物特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物：正相色谱法(使用氧化铝或硅胶作为固定相；洗提液，诸如石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、氯仿、甲醇、异丙醇或其组合)；反相色谱法(使用反相硅胶诸如二甲基十八烷基甲硅烷基硅胶(RP-18)或二甲基辛烷基甲硅烷基硅胶(RP-8)作为固定相；以及洗提液，诸如水、缓冲液(例如，磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸 盐(pH 2-8))，以及有机溶剂(例如甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃或这些溶剂的组合)；凝胶渗透色谱法(使用在诸如甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯或其组合的溶剂中的树脂诸如Sephadex(Pharmacia Chemical Industries,Sweden)、Toyopearl HW(TosoHaas,Tosoh Corporation,Japan))；或通过反向色谱法(使用由二种或更多种溶剂，诸如水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、苯以及甲苯制作的双相洗提液系统)。这些技术可重复地、单独地或组合使用。典型的方法为通过正相硅胶和反相硅胶诸如RP-18的色谱法。
如同本文中使用，术语“同分异构体”为对式(1)的化合物的所有同分异构体的通称，其仅在它们的原子空间方位不同。术语同分异构体包括镜像异构体(enantiomer，对映异构体)、镜像异构体的混合物(消旋物、消旋混合物)以及带有多于一个的手性中心，其彼此互相不为镜像的化合物同分异构体(非对映异构体)。本发明的化合物可以具有不对称中心并且以消旋物、消旋混合物、个别非对映异构体或对映异构体发生，或是可以以几何异构物存在，所述化合物的所有同分异构形式包含于本发明中。
如同本文中使用，术语“互变异构体”意指仅在一个(或更多个)移动原子的位置以及电子分布与彼此不同的二个(或更多个)化合物的共同存在，例如，酮-烯醇互变异构体(keto-enol tautomer)。
式(1)的化合物、其同分异构体或互变异构体能够转变为它们的全被考虑在本发明中的药学上可接受的盐类或衍生物。
式(1)的化合物的药学上可接受的盐类能够通过本领域技术人员所知的标准工艺来制备，例如，能够通过用合适的钠或钾碱类，例如氢氧化钠、氢氧化钾等等处理式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或衍生物来制备盐类诸如钠与钾盐。类似地，能够通过用合适的酸类，例如以盐酸、硫酸等等处理式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或衍生物来制备盐类诸如盐酸盐与硫酸盐。
所有的式(1)的化合物的衍生物，特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物的衍生物，包含在本发明的范围内。根据本发明特别受关注的式(1)的化合物的衍生物，特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物的衍生物为其中一个或更多个胺基基团和羟基基团，特别是式(1)的化合物的N-羟基基团，特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物的N-羟基基团是被衍生的那些。
因此，在本发明的一个方面提供式(1)的化合物的衍生物，其以下列式(1c)表示，
其中，
R1和R4独立地代表H或不存在； 
R2和R3独立地选自H、羟基、-O(C1-C6)烷基和-OC(O)(C1-C6)烷基；
表示单键或双键；
其中，
(C1-C6)烷基未被取代或被用一种或更多种基团取代，该一种或更多种基团独立地选自卤素、羟基、-O(C1-C6)烷基、硝基、氰基、-COOH、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、-NHC(O)O(C1-C6)烷基、-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基、-NH-PEG或(C6-C10)芳基；
(C6-C10)芳基未被取代或被用一种或更多种基团取代，该一种或更多种基团系独立地选自卤素、卤(C1-C6)烷基、羟基、氰基、硝基、(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-COOH和-NH2；
以及PEG为聚乙二醇，其选自O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺-琥珀酰胺基)乙基]聚乙二醇(α,ω-双-NHS-PEG)、甲基-PEG-NHS酯(MS(PEG)n，其中n为24)，以及聚乙二醇的分枝的三甲基和琥珀酰亚胺酯衍生物(TMS(PEG)n，其中n为12)；
并规定若R2与R3两者为羟基，那么R1与R4不存在并且表示双键； 
以及其所有同分异构和互变异构的形式或药学上可接受的盐类。
“取代(substitution)”、“被取代(substituted)”或“以…取代(substituted with)”应被理解为，表示指定部分的一个或更多个氢原子以合适的取代基被取代且包括这样的取代是根据被取代原子与取代基的允许的化合价，并且生成稳定的化合物的隐含条件。
如同本文中单独或为另一个基团的部分使用，术语“(C1-C6)烷基”或“烷基”，意指包含1至6碳，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基和己基的未被取代的或被取代的直链或分枝链碳氢化合物。被取代的烷基意指被一种或更多种基团取代的(C1-C6)烷基，该基团选自但不限于卤素、羟基、-O(C1-C6)烷基、硝基、氰基、-COOH、-NH2、 -NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、-NHC(O)O(C1-C6)烷基、-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基、-NH-PEG或(C6-C10)芳基。
如同本文中使用，术语“(C6-C10)芳基”或“芳基(aryl)”意指具有高达十环碳原子的单环或双环碳氢环体系，其中至少一个碳环的环具有π电子体系。(C6-C10)芳基环体系的示例包括但不限于苯基或萘基。除非另外指明，芳基基团可以为未被取代的或被一种或更多种基团所取代，该一种或更多种基团独立地选自但不限于卤素、卤(C1-C6)烷基、羟基、氰基、硝基、(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-COOH和-NH2。
如同本文中使用，术语“-O(C1-C6)烷基”或“烷氧基”意指未被取代的或被取代的(C1-C6)烷基自由基，其具有向其连接的氧原子。代表性的烷氧基基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基、正丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基或1,1-二甲基乙氧基。被取代的烷氧基基团意指-O(C1-C6)烷基基团，其中烷基被一种或更多种基团取代，该一种或更多种基团选自但不限于卤素、羟基、-O(C1-C6)烷基、硝基、氰基、-COOH、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、-NHC(O)O(C1-C6)烷基、-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基、-NH-PEG或(C6-C10)芳基。
如同本文中使用，术语“卤(C1-C6)烷基”或“卤烷基”意指自由基，其中烷基基团的氢原子的一个或更多个被一个或更多个卤素取代。单卤烷基自由基，例如，可以具有一个氯、溴、碘或氟原子。二卤和多卤烷基自由基可以具有两个或更多个相同或不同的卤素原子。“卤(C1-C6)烷基”或“卤烷基”的示例包括但不限于氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、二氯乙基、二氯丙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基或二氟丙基。
如同本文中使用，术语“卤素”意指氟、氯、溴和碘。
如同本文中使用，术语“PEG”意指聚乙二醇聚合物。PEG无毒性、无免疫原性、无抗原性并且在水中高度可溶。基于分子内环氧乙烷(即-OCH2CH2-)的重复单元的数目的多种不同分子量的PEG是商业上可得的。例如，PEG可以从商业供应商诸如Sigma-Aldrich Co.LLC或NOF公司得到。PEG的一些示例为但不限于，(a)O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺-琥珀酰胺基)乙基]聚乙二醇(α,ω-双-NHS-PEG)，分子量在2000Da至10,000Da的范围，下面将其结构性地示出：
(b)甲基-PEG-NHS酯(MS(PEG)n，其中n为24)，分子量1214.39Da，下面将其结构 性地示出；
以及；
(c)聚乙二醇的分枝的三甲基和琥珀酰亚胺酯类衍生物(TMS(PEG)n，其中n为12、分子量2420.80Da)。典型地，优选具有1000至20,000Da范围的分子量的PEG，用于如同本文中描述的化合物的PEG共轭物的制备。
在本发明的上下文中，术语“式(1c)的化合物”、“式(1)的化合物的衍生物”或“式(1c)的衍生物”可互换地使用，且这些术语的每个意指由式(1c)表示的式(1)的化合物；以及其同分异构体、互变异构体或药学上可接受的盐类的衍生物。
根据一个实施例，本发明提供式(1c)的化合物， 
其中，
R1和R4为H；
R2为-O(C1-C6)烷基或-OC(O)(C1-C6)烷基；
R3为羟基或-O(C1-C6)烷基；
其中，(C1-C6)烷基未被取代或被-NH2、-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基或-NH-PEG取代；
以及其所有同分异构或互变异构形式或药学上可接受的盐类。
根据另一个实施例，本发明提供式(1c)的化合物， 
其中，
R1和R4独立地表示H或不存在； 
R2和R3独立地选自H和羟基；
表示单键或双键；
并规定若R2和R3两者为羟基，那么R1和R4为不存在并且表示双键； 
以及其所有同分异构或互变异构形式或药学上可接受的盐类。
包含在根据本发明的代表性式(1c)的化合物包括：
以及其所有同分异构或互变异构形式或药学上可接受的盐类。
以式(1c)表示的式(1)的化合物的衍生物，可以通过本领域已知的方法制备。用于制备式(1c)的化合物的工艺中采用的试剂可以为商业上可得的或可以通过本领域已知的工艺制备。
R1和R4为H；且R2和R3独立地选自羟基和-O(C1-C6)烷基，其中R2和R3中的至少一个为-O(C1-C6)烷基的式(1c)的化合物能够通过将式(1)的化合物反应来制备，其为将式(1a)的化合物在将选自甲醇、乙醇、丙醇或丁醇的醇类和甲苯或苯组合，与在有机溶剂诸如己烷或甲苯中的烷基化试剂诸如三甲基甲硅烷重氮甲烷一起，在-5℃至5℃的温度范围中反应1至5小时。通过此方法制备化合物1和2。
R1和R4为H；且R2和R3独立地选自羟基和-OC(O)(C1-C6)烷基使R2和R3的至少一个为-OC(O)(C1-C6)烷基；其中(C1-C6)烷基被-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基取代的式(1c)的化合物能够通过将式(1)的化合物反应来制备，其为将式(1a)的化合物，在溶剂诸如四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)或二甲基甲酰胺(DMF)，伴随试剂诸如N-芐氧基羰基-L-丙胺酸(Cbz丙胺酸)或N-(9-芴基甲氧羰基)-L-丙胺酸(Fmoc丙胺酸)，在耦合剂诸如苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鏻(PyPOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基胺基)六氟磷酸鏻(BOP)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或丙烷膦酸酐(T3P)，以及碱类诸如N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙基胺或4-二甲基胺基吡啶(DMAP)的存在下，在5℃至5℃的温度范围中反应1至20小时。通过此方法制备化合物3。因此获得的化合物通过在溶剂诸如甲醇、乙醇、乙酸乙酯或THF，使用酸类诸如稀释HCl创造的酸性环境中使用催化剂诸如Pd/C或Pt/C的催化还原作用而被去保护，以获得式(1c)的化合物，其中R2和R3独立地选自羟基和-OC(O)(C1-C6)烷基，使R2和R3的至少一个为-OC(O)(C1-C6)烷基；其中(C1-C6)烷基被-NH2取代。通过此方法制备化合物4。
R1和R4为H；且R2和R3独立地选自羟基和-OC(O)(C1-C6)烷基，使R2和R3的至少一个为-OC(O)(C1-C6)烷基；其中(C1-C6)烷基被-NH2取代的式(1c)的化合物可以用于聚乙二醇化 (其经由将所述化合物溶解于有机溶剂诸如DCM、甲醇或DMF中，在碱类诸如三乙基胺或DIPEA的存在下，并加入聚乙二醇(PEG)聚合物诸如O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺-琥珀酰胺基)乙基]聚乙二醇(α,ω-双-NHS-PEG)或甲基-PEG-NHS酯，并且在25℃至35℃的温度范围搅拌10-20小时)，以获得式(1c)的化合物，其中R2和R3独立地选自羟基和-OC(O)(C1-C6)烷基，使R2和R3的至少一个为-OC(O)(C1-C6)烷基；其中(C1-C6)烷基被-NH-PEG取代。通过此方法制备化合物8。
可以将式(1)的化合物氧化以移除在R1和R4位置的氢(其经由使用在选自二氯甲烷或二氯乙烷的有机溶剂中的试剂诸如间氯过氧苯甲酸，在25℃至35℃的温度范围中计10-20小时)，以获得式(1c)的化合物，其中R1和R4为不存在，并且R2和R3为羟基。通过此方法制备化合物5。
可以将式(1)的化合物的N-羟基基团转变为NH(脱氧作用)(其经由将在选自甲醇、乙醇或DMF的有机溶剂中的式(1)的化合物加至在溶剂诸如THF、DCM或DMF中的试剂诸如双(环戊二烯)钛(IV)二氯化物和活化锌溶液，并且在-5℃至-50℃的温度范围搅拌0.1hr至1hr)，以获得式(1c)的化合物其中R1和R4为H或不存在，并且R2和R3为H。通过此方法制备化合物6。
可以将式(1)的化合物的N-羟基基团的酰基衍生物，经由将式(1)的化合物在溶剂诸如二氯甲烷、嘧啶或二氯乙烷中，伴随试剂诸如乙酰氯或乙酸酐，在碱类诸如嘧啶、TEA或DMAP的存在下，在-5℃至30℃的温度范围反应1hr至5hr而制备，以获得式(1c)的化合物，其中R2和R3独立地选自羟基和-OC(O)(C1-C6)烷基，使R2和R3的至少一个为-OC(O)(C1-C6)烷基。通过此方法制备化合物7。
能够将式(1)化合物的衍生物的式(1c)的化合物任选地转变为其药学上可接受的盐类。
式(1)的化合物或其药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物具有抗癌活性。这已通过对广泛的癌细胞分别测试的本发明的代表性的化合物包括式(1)、式(1a)、式(1b)和式(1c)的化合物而证实。
可以将式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物，作为药物和以药物组合物的形式给药至对其有需求的受试者。可以将式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物给药至被诊断为具有癌症的受试者。
因此，本发明还涉及用于制造癌症治疗药剂的式(1)的化合物特别是式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物用于制造治疗癌症药剂的用途。
本发明进一步涉及一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物，以及药学上可接受的赋形剂或载体。该药物组合物提供于癌症的治疗。作为药物制剂活性成分的治疗有效量的式(1)的化合物或其立体异构物或其互变异构体或其药学上可接受的盐类或其式(1c)的衍生物可以为约0.01mg至1000mg的范围；或可以为约0.1mg至750mg的范围；或可以为约0.5mg至500mg的范围；或可以为约1mg至250mg的范围。
包括式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物的本发明的化合物发现在治疗癌症上的用途。本发明的化合物被使用于降低、抑制或减少肿瘤细胞的增生，并且能够提供于肿瘤尺寸的缩小。能够通过本发明的化合物治疗的代表性癌症包括但不限于白血病、肺癌、脑癌、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、肝癌、肾脏癌、膀胱癌、泌尿道癌、乳癌、头颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、胚细胞瘤、胆管上皮癌、颅外癌、肉瘤、间皮瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、室管膜瘤、神经细胞瘤、皮肤癌、卵巢癌、复发性卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、结直肠癌、淋巴组织增生病、难治性多发性骨髓瘤、抗多发性骨髓瘤或骨髓增生性疾病。
根据本发明的一个实施例，其中，癌症选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、成人急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑干神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、包括小脑星形细胞瘤和大脑星形细胞瘤的星形细胞瘤、视通路神经胶质瘤、丘脑神经胶质瘤、幕上原始神经外胚层(supratentorial primitive neuroectodermal)、松果体瘤(pineal tumors)、髓母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、霍奇金氏病、肝细胞癌、肾细胞癌、肾母细胞瘤(Wilms'tumor)、膀胱癌、泌尿道癌、Ewing’s肉瘤肿瘤家族、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、乳癌、子宫内膜癌、口癌、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、胚细胞瘤、胆管上皮癌、颅外癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、室管膜瘤、神经细胞瘤、皮肤癌、卵巢癌、复发性卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、结直肠癌、淋巴组织增生病、难治性多发性骨髓瘤、抗多发性骨髓瘤或骨髓增生性疾病。
根据本发明的另一个实施例，其中，癌症选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、成人急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑干神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、包括小脑星形细胞瘤和大脑星形细胞瘤的星形细胞瘤、视通路神经胶质瘤、松果体瘤、髓母细胞瘤、原 发性中枢神经系统淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、霍奇金氏病、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱癌、泌尿道癌、骨肉瘤、乳癌、子宫内膜癌、口癌、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、神经细胞瘤、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、结直肠癌、淋巴组织增生病或骨髓增生性疾病。
根据本发明的进一步的实施例，其中，癌症选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、成人急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑干神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、包括小脑星形细胞瘤和大脑星形细胞瘤的星形细胞瘤、髓母细胞瘤、肾细胞癌、膀胱癌、泌尿道癌、乳癌、口癌、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或结直肠癌等等。
根据一个实施例，本发明提供一种通过将治疗有效量的式(1)的化合物或其式(1c)的衍生物或同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类给药至受试者来治疗受试者的癌症的方法。
根据另一个实施例，本发明提供一种通过将治疗有效量的式(1a)的化合物或式(1b)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类给药至受试者来治疗受试者的癌症的方法。
根据又一个实施例，本发明提供一种通过将治疗有效量的式(1c)的衍生物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类给药至受试者来治疗受试者的癌症的方法。
式(1)的化合物或其药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物；或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类可以口服地、鼻吸地、局部地、皮下地、肌肉地、由静脉地或通过其他给药模式给药。
在适用于特定情况的给药方法由要治疗的癌症的类型和癌症的阶段而定。进一步地，给药方法可以由医师使用本领域已知的方法来优化。
按照惯例，适用于特定情况的剂量范围由要治疗的癌症类型以及个别症状或疾病的状态而定。可以由熟练的医师，根据包括待治疗的症状(癌症)、由许多因素诸如个别受试者的年龄、体重和身体健康及反应、药代动力学、疾病的严重程度等医学领域已知的因素而定的给药选择途径的相关情况，立即确定选择的剂量程度。可以变化本发明的药物组合物中的活性成分实际剂量程度，以获得有效达到用于特定受试者(需要治疗的受试者)所需的治疗反应的活性成分的量、组合物以及用于受试者的给药模式，而没有毒性。平均而言，用于受试者的活性化合物(本发明化合物中的一种或更多种)的每日剂量可以为每公斤约0.05mg至约500mg或为每公斤约0.5mg至约200mg或为每公斤约1mg至约100mg的范围，或是落在如同本文指明的较宽剂量范围的范围内的任何剂量范围。在需要治疗的较重体重受试者 的情况下，活性化合物的剂量可以为约1mg至约1000mg或为约5mg至约500mg的范围。活性化合物，即本发明的化合物的所需剂量可在很宽的范围内选择。选择给药的每日剂量以便在接受癌症治疗的受试者中达到合意治疗效果。如有需要，还可以给药较高或较低的每日剂量。
与其他药学上可接受的赋形剂诸如湿润剂、增溶剂诸如表面活性剂、媒介物、张度剂、填料、着色剂、掩蔽香料、润滑剂、崩解剂、稀释剂、粘合剂、成形剂、乳化剂、软膏基质、软化剂、增稠剂、聚合物、脂类、油类、助溶剂、络合剂或缓冲物质一起的，包含式(1)的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类或式(1c)的衍生物的药物组合物为片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒、粉剂、乳膏剂、软膏、凝胶、糖浆、乳液、悬浮液或适合用于肠外给药的溶液的形式。
在本发明的一个实施例中，包含式(1)的化合物或式(1c)的衍生物；或其同分异构体或互变异构体、药学上可接受的盐类的药物组合物可用于与一种或更多种抗癌剂诸如天冬酰胺酶(asparaginase)、博莱霉素(bleomycin)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、门冬酰胺酶(colaspase)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、依托泊甙(etoposide)、氟尿嘧啶、六甲蜜胺、羟尿素(hydroxyurea)、异环磷酰胺、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、美司那(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、5-氮杂胞苷(5-azacytidine)、克拉屈滨(cladribine)、白消安(busulfan)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、2',2'-二氟脱氧胞苷、多烯紫杉醇(docetaxel)、红-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤、炔雌醇(ethinyl estradiol)、5-氟脱氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)、5-氟脱氧尿苷单磷酸酯、注射用磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、伊达比星(idarubicin)、干扰素、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法仑(melphalan)、米托坦(mitotane)、紫杉酚(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、N-膦乙酰基-L-天冬胺酸(PALA)、普利霉素(plicamycin)、替尼泊甙(teniposide)、丙酸睪酮、噻替派(thiotepa)、三甲基蜜胺、尿苷、长春瑞滨(vinorelbine)、Alsterpaullone、丁内酯I(butyrolactone I)、2-(2- 羟乙基胺基)-6-(3-氯苯胺基)-9-异丙基嘌呤、靛玉红-3'-单肟、Kenpaullone、奥罗莫星(olomoucine)、异奥罗莫星、N9-异丙基-奥罗莫星、普伐兰诺A(purvalanol A)、罗斯维汀(roscovitine)、(S)-同分异构体罗斯维汀以及WHI-P180[4-(3’-羟苯基)胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉]组合；用于如同本文所描述的癌症治疗。
不实质地影响本发明的各种具体实施例的活性的修改应被理解为包含于本文揭露的发明的范围内。因此，下列示例是意图于说明，但不限制本发明的范围。
示例
在示例中采用下列术语/符号/缩写/化学式：
示例1
来自海生源的培养编号PM0895172的分离
a)分离培养基组合物：
1％胨、2％葡萄糖、0.2％碳酸钙、0.001％氯化钴六水合物、1.5％琼脂、pH(在25℃下)7.5。
人造海水(artificial seawater，ASW)组合物：2.46％氯化钠、0.067％氯化钾、0.136％氯化钙、0.629％硫酸镁、0.466％氯化镁、0.018％碳酸氢钠；水。
b)工序
从印度马哈拉施特拉邦，孟买的近海区域收集深海沉积物，并且在到印度孟买，戈尔甘(East)Piramal Enterprises Limited(Formerly Piramal Healthcare Limited)的NCE研究部门(Piramal LifeSciences division)的整个旅途中存储于-20℃下。
对来自收集的沉积物样本的未培养海生放射菌分离，实施分子生物学方法。对于此，基因组DNA从沉积物样本中分离并且对聚酮合成酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)的存在进行扩增。然后将所关注培养物从具有NRPS途径的沉积物样本中分离。
将样本储存于-20℃至22℃并且稍后解冻至室温(25±2℃)用于微生物分离。将土壤样本(～2g)悬浮在高压灭菌的臼和杵的25ml无菌人工海水(ASW)中，并且将其彻底粉碎。将1ml的此悬浮液转移至试管中并且将其涡旋震荡30秒。将试管涡旋震荡30秒。在无菌ASW中制备达到10-5的成列的稀释。将100μl的10-3的稀释物表面涂布在包含分离培养基的盘上。将盘在室温(25±2℃)下培养，直到观察到菌落。在培养20-22日后，如同上述提到，将出现在此培养基的菌落分离培养基的培养皿上划线培养。纯化分离菌并提供培养ID编号PM0895172。从而将培养编号PM0895172从生长的微生物之间分离出作为单一分离菌。
示例2
培养编号PM0895172的纯化
a)纯化培养基的组合物：
1％胨、2％葡萄糖、0.2％碳酸钙、0.001％氯化钴六水合物、1.5％琼脂；pH(在25℃下)7.5。
b)工序：
将培养编号PM0895172划线培养在包含纯化培养基的培养皿上。将培养皿在27℃下培养十天。将来自培养皿的一个分离菌落转移至包含ISP4琼脂(HiMedia,India)的新鲜斜面培养基。将斜面培养基在27℃下培养十天。
示例3
生产者菌株—培养编号PM0895172的维持
将此特定菌株维持于包含ISP4培养基(HiMedia,India)的斜面培养基。在通过加热彻底溶解培养基之后，将生成物溶液分布于试管并在121℃灭菌30分钟。将试管冷却并使其在倾斜的位置中固化。将琼脂倾斜培养基用生长良好的培养编号PM0895172通过金属线环 划线并且在27℃至29℃下培养，直到观察到良好生长。将良好生长的培养物储存在4℃至8℃的冰箱中。
示例4
在摇瓶中培养编号PM0895172的发酵作用 
a)种子培养基(seed medium)的组合物：
0.2％碳酸钙、0.5％氯化钠、0.5％玉米浆、0.75％胨、1.5％葡萄糖、0.75％酵母萃取物；软化水；pH 7。
b)工序：
将50ml的上述种培养基分布于500ml容量的锥形瓶中并且在121℃下高压灭菌30分钟。将锥形瓶冷却至室温(25±2℃)并将每个锥形瓶以生长良好的生产菌(培养编号PM895172)的菌环量播种于斜面并且在旋转震荡器中在30℃(±1℃)下以230rpm至250rpm震荡72小时，以便提供种培养物。
c)生产培养基组合物：
1％胨、2％葡萄糖、0.2％碳酸钙、0.001％氯化钴六水合物、1.5％琼脂以及pH(在25℃下)7.5。
d)工序：
将在500ml的容量的锥形瓶中的100ml的生产培养基在121℃下高压灭菌30分钟，将其冷却至29℃至30℃并且用3％(v/v)在示例4b中提及的种子培养物播种。
e)发酵作用参数：
将生产烧瓶在震荡器上，在30℃和220rpm下培养96小时。从生产烧瓶收获(收获物pH：7.0至8.0)并且将来自每个培养基烧瓶的整个培养液用相同体积的溶剂混合物(甲醇：乙酸乙酯(1：9))萃取。将这些收获的烧瓶维持在室温下4-6小时用于上清液的分离后的萃取。上清液使用于测试抗癌活性。
示例5
在用于发酵罐批量的摇瓶中种子培养物的制备
a)种子培养基274(1)的组合物： 
葡萄糖15g、玉米浆5g、胨7.5g、酵母萃取物7.5g、碳酸钙2g、氯化钠5g、软化水1.0L、pH 6.5-7.5(灭菌前)。
b)工序：
将200ml的上述培养基分布于1000ml锥形瓶并且在121℃下高压灭菌30分钟。将锥形瓶冷却至室温，并且将每个锥形瓶用生长良好的生产菌(PM0895172)的菌环量播种于斜 面并且在旋转震荡器中在29℃-30℃下以230-250rpm震荡70-74小时，以获得种培养物。
示例6
在发酵罐中培养编号PM0895172的培养
a)生产培养基的组合物：
大豆胨10g、葡萄糖20g、碳酸钙2g、氯化钴0.001g、软化水1.0L，pH 7.0(灭菌前)。
b)工序：
在1000L发酵罐中，将500L的生产培养基与作为消泡剂的200ml desmophen一起，在121℃下原位灭菌20分钟，冷却至29℃-30℃并且用8-10L在示例5b中获得的种子培养物播种。
c)发酵作用参数：
温度29℃-30℃、尖端速率(tip speed)0.94m/s、充气250lpm以及收获时间24hr。培养液的收获物pH为6.5-7.5。通过HPLC测定在发酵液中式(1a)的化合物或式(1b)的活性化合物的产物，并且测试生物活性用于抗癌活性。
示例7
式(1a)的化合物的分离和表征
将在示例6的步骤c)中收获的全培养液(500L)使用乙酸乙酯(500L)萃取。使用迭盘式分离器(disc stack separator，Alfa Laval(USA)，型号LAPX404)分离有机层并浓缩，以获得粗制的萃取物(150g)。将粗制的萃取物通过柱色谱法(硅胶，溶剂：异丙醇/氯仿)处理。将活性化合物用在氯仿中的1-2％异丙醇洗提，将其浓缩以获得浓缩化合物(30g)。
将此材料通过柱色谱法纯化(RP C-18硅胶，溶剂：水/乙腈)。将得到的活性化合物在水中用40％乙腈洗提，将其蒸发以获得2g所需的半纯的式(1)的活性化合物(式(1a)和式(1b)的化合物的混合物)。
如同下述，通过反相制备型HPLC(reversed phase preparative HPLC)进行进一步的纯化：
柱：Water’s X-Bridge RP-18(250mm X 19mm,10μ)
洗提液：乙腈:水(50:50).
流速：25ml/min
检测(UV)：220nm
将收集的活性波峰蒸发至干燥，以获得1g活性化合物(式(1a)的化合物)。
如同下述，通过硅胶制备型HPLC进行活性化合物的最终纯化：
柱：Water’s sunfire silica,(150mm X 19mm,5μ)
洗提液：氯仿:甲醇(98.5:1.5)
流速：15ml/min
检测(UV)：240nm
Rt时间：8-9min。
将来自重复注入的包含活性化合物的洗提物浓缩，以获得145mg的纯式(1a)的化合物。
式(1a)的化合物的物理和光谱特性在表格1中给出。
分析型HPLC条件如同下述：
柱：Kromasil RP-18(150mm X 4.6mm,3.5μ)
洗提液：梯度(在20分钟内10％乙腈至100％乙腈对水，接着额外的5分钟用100％乙腈)
流速：1ml/min
检测(UV)：220nm
停留时间：17-18min(纯度>99％)
表格1：式(1a)的化合物的物理和光谱特性
示例8
式(1b)的化合物的分离和表征
将在示例7中的RP-18制备型HPLC后获得的包含式(1a)的化合物和式(1b)的化合物的半纯化合物进行RP-18制备型HPLC，以获得15mg的纯式(1b)的化合物。 
将式(1b)的化合物的物理和光谱特性在表格2中给出。
分析型HPLC条件如同下述：
柱：Kromasil RP-18(150mm X 4.6mm,3.5μ)
洗提液：梯度(在20分钟内10％乙腈至100％乙腈对水，接着额外的5分钟用100％乙腈)
流速：1ml/min
检测(UV)：220nm
停留时间：15-17min(纯度>99％)
表格2：式(1b)的化合物的物理和光谱特性
示例9
2-羟基-N-(18-羟基-22-异丙基-6-甲氧基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧二十四氢二哒 嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-23-基)-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺(化合物1)和
2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)-N-(22-异丙基-6,18-二甲氧基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧二十四氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-23-基)丙酰胺(化合物2)的制备
将TMSCHN2(三甲基甲硅烷基重氮甲烷，在己烷中的48μl，0.097mmol，2M溶液)用逐滴的方式加至在甲醇(1ml)和甲苯(1ml)中的式(1a)的化合物(在示例7中描述，20mg,0.024mmol)的溶液，并且将生成的反应混合物在0℃下搅拌3小时，然后升温至室温。在反应完成之后，移除溶剂以获得固体，将其用柱色谱法纯化(硅胶，二氯甲烷中的1％甲醇)，以获得5mg的化合物1和3mg的化合物2。
化合物1：1HNMR(CDCl3,300MHz)：δ7.98,7.10,6.92,6.54,6.20,5.52,5.50,5.30,5.16,5.14,5.07,4.96,4.54,4.51,4.13,4.05,3.80,3.18,3.12,2.79,2.14,2.04,1.98,1.95,1.77,1.71,1.68,1.60,1.52,1.45,1.15,1.10,1.05,0.98,0.95,0.90,0.88,0.85；ESI-MS：m/e 839(M-H)-。
化合物2：1HNMR(CDCl3,300MHz)：δ7.85,7.15,7.10,6.20,5.82,5.42,5.38,5.30,5.15,4.98,4.80,4.60,4.15,3.95,3.85,3.70,3.25,3.15,2.85,2.23,2.15,1.98,1.95,1.77,1.71,1.68,1.65,1.60,1.52,1.44,1.15,1.10,1.05,0.98,0.95,0.90,0.88,0.85；ESI-MS：m/e 853(M-H)-。
示例10
18-羟基-23-(2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺基)-22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧二十氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-6(7H,13H,22H)-基3-(((芐氧基)羰基)胺基)丙酸酯(化合物3)的制备。
方法I：
将Cbz丙胺酸(Cbz alanine，27mg，0.12mmol)和PyBOP(75mg,0.14mmol)在0℃下加至在THF(5ml)中的式(1a)的化合物(在示例7中描述，40mg，0.048mmol)的溶液中，接着通过逐滴的方式加入DIPEA(51μl,0.29mmol)。将生成的反应混合物在室温下搅拌过夜。再将反应混合物用水(5ml)稀释并且以乙酸乙酯(3x 20ml)萃取。复合的有机层用饱和NaHCO3、盐水清洗，通过无水Na2SO4干燥并浓缩，以获得粗制的化合物，将其通过柱色谱法纯化(硅胶，在二氯甲烷中的1％甲醇)，以获得纯的化合物3。
产量：12mg；1HNMR(CDCl3,300MHz)：δ7.90,7.39,7.2,6.45,6.34,6.15,5.65,5.50,5.38,5.30,5.15,5.10,4.90,4.60,4.50,4.10,3.85,3.7,3.65,3.55,3.4,3.2,3.15,2.7,2.6,2.5,2.3,2.19,1.98,1.95,1.77,1.71,1.68,1.65,1.60,1.52,1.44,1.15,1.10,1.05,0.98,0.95,0.90,0.88,0.85；ESI-MS:m/e 1030(M-H)-。
方法II：
将T3P(0.216ml,0.363mmol,在乙酸乙酯中50wt.％)在氮气气氛下加至在乙腈(20ml,0.121mmol)中的Cbz丙胺酸(Cbz alanine，67.5mg,0.302mmol)的冷却溶液中，并且搅拌10min。将在乙腈(20ml,0.121mmol)中的式(1a)的化合物(描述于示例7，100mg,0.121mmol)加至上述溶液，接着通过逐滴的方式加入三乙胺(0.051ml,0.363mmol)。将生成的反应混合物持续搅拌4hr。在反应完成后，将水(10ml)加至反应混合物中并且用乙酸乙酯(3x20ml)萃取反应混合物。复合的有机层用饱和NaHCO3、盐水和水清洗，通过无水Na2SO4干燥并浓缩以获得粗制的化合物，将其用柱色谱法纯化(硅胶，在二氯甲烷中的1-2％甲醇)，以获得化合物3。产量：38mg。
示例11
18-羟基-23-(2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺)-22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧二十氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-6(7H,13H,22H)-基3-丙胺酸酯的制备(化合物4)。
将1当量数的HCl和催化量的10％Pd/C加至在甲醇(3ml)中的如示例10中获得的化合物3(30mg,0.029mmol)的溶液中，并且将生成的反应混合物在室温下搅拌2小时。在反应完成之后，通过硅藻土过滤反应混合物并浓缩过滤物，以获得化合物4。
产量：15mg；1HNMR(DMSO-d6；300MHz)：δ7.92,7.30,7.10,6.75,5.85,5.45,5.35,5.15,5.00,4.85,4.16,3.86,3.46,3.10,2.85,2.73,2.56,2.15,1.85,1.80,1.70,1.68,1.65,1.60,1.52,1.44,1.15,1.10,1.05,0.98,0.95,0.88,0.82,0.80；ESI-MS:m/e 896(M-H)-。
示例12
N-(6,18-二羟基-22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧-3,4,4a,5,6,7,8,9,10,11,15,16,16a,17,18,19,20,22,23,24-二十氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-23-基)-2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺(化合物5)的制备。
将间氯过氧苯甲酸(18mg,0.104mmol)在0℃下加至在二氯甲烷(6ml)中的示例7获得的式(1a)的化合物(30mg,0.036mmol)的溶液中，并且将生成的反应混合物在室温下搅拌过夜。用水(20ml)稀释反应混合物并且用二氯甲烷(3x25ml)萃取。复合的有机层用盐水、水清洗，并且通过无水Na2SO4干燥，并且浓缩以获得粗制的化合物，将其以柱色谱法纯化(硅胶，在二氯甲烷中的5％甲醇)以获得化合物5。
产量：20mg；1HNMR(DMSO-d6,300MHz)：δ10.34,9.62,7.84,7.52,7.45,7.43,7.07,6.68,6.19,5.77,5.64,5.51,5.41,5.04,5.02,4.94,4.17,4.12,2.20,1.98,1.90,1.60,1.51,1.33, 1.23,1.04,0.90,0.87,0.82；ESI-MS:846(M+Na)。
示例13
2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)-N-(22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧二十四氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-23-基)丙酰胺(化合物6)的制备。
将配置搅拌棒的干净、以火焰干燥的圆底烧瓶抽真空并用Ar冲洗。在室温，Ar下，将Cp2TiCl2(193mg,0.774mmol)和活化锌(411mg,6.29mmol)的脱气THF溶液(3ml)搅拌45min。反应混合物的颜色从暗红色变为橄榄绿色。将反应混合物冷却至-30℃并且用在示例7中获得的式(1a)的化合物(40mg,0.048mmol)的甲醇溶液(3ml)在3min内逐滴加料。将反应混合物搅拌45min，维持水浴温度介于-30℃至-10℃。将反应混合物升温至室温并在饱和5％K2CO3(5ml)和乙酸乙酯(20ml)间分隔。由移液管移除有机层并且通过whatman玻璃微纤维滤器(GF/F型)过滤以移除不溶的钛盐。用乙酸乙酯(4×20ml)萃取水层并且在每次萃取之后通过whatman玻璃微纤维滤器(GF/F型)过滤有机层。通过无水Na2SO4干燥复合的有机层并且浓缩，以获得固体，将其通过柱色谱法纯化(硅胶，己烷中的70％乙酸乙酯)，以获得化合物6。
产量：8mg；1HNMR(DMSO-d6,300MHz):δ8.32,7.78,6.87,6.65,6.25,5.75,5.59,5.32,5.28,5.21,5.15,4.95,4.77,4.73,4.45,4.23,4.12,3.94,3.34,2.73,2.27,2.18,2.08,1.99,1.88,1.63,1.35,1.30,1.23,1.04,0.90,0.87；ESI-MS:817(M+Na)。
示例14
18-羟基-23-(2-羟基-2-(2-羟基-5-异丁基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)丙酰胺)-22-异丙基-7,19-二甲基-5,8,11,17,20,24-六氧二十氢二哒嗪并[6,1-f:6',1'-o][1,4,7,10,13,16]五氮杂氧环十九炔-6(7H,13H,22H)-基乙酸(化合物7)的制备。
将吡啶(0.0255ml,0.30mmol)在0℃下加至在二氯甲烷(10ml)中的示例7获得的式(1a)的化合物(0.050g,0.060mmol)的溶液，并且搅拌15min，接着加入乙酰氯(0.043ml,0.60mmol)。将生成的反应混合物在室温下搅拌2hr。用乙酸乙酯(3x30ml)萃取反应混合物。将复合的有机层用稀释的1％HCl(5ml)、水(10ml)清洗，通过无水Na2SO4干燥并且浓缩。将粗制产物通过柱色谱法纯化(在二氯甲烷中的2％甲醇)，以获得化合物7。
产量：15mg；1HNMR(CDCl3,300MHz)：δ7.92,7.28,6.85,6.45,6.15,5.45,5.36,5.20,5.15,4.90,4.85,4.65,4.21,3.80,3.15,2.35,2.25,2.12,1.98,1.95,1.77,1.71,1.68,1.60,1.52,1.40,1.15,1.05,0.98,0.95,0.90,0.88,0.86；ESI-MS：891(M+Na)。
示例15
聚乙二醇化(PEGylated)共轭物(化合物8)的制备。
将N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(135ml,0.779mmol)在0℃下加至在DMF(10ml,0.223mmol)中的示例11获得的化合物4(200mg,0.223mmol)的溶液，并且加入一部分O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰基胺基)乙基]聚乙二醇(722mg,1.448mmol)，并且将生成的反应混合物在室温下搅拌过夜。在加速真空、室温下移除DMF，以获得固体，将其通过sephadex G-15尺寸排除色谱柱纯化。
使用在DMF和水中的一系列游离式(1a)的化合物浓度对其在269nm的吸光值来构建标准曲线系。使用下列公式基于式(1a)的化合物的含量测定聚乙二醇化共轭物的浓度：
PEG共轭物的浓度＝聚乙二醇化共轭物吸光值-(截距/斜率)
发现在聚乙二醇化共轭物形式(化合物8)中的式(1a)的化合物含量为10％。
示例16
式(1a)的化合物的生物学评估：
在药理试验中采用下列术语/符号/缩写/化学式：
CO2：二氧化碳 EDTA：乙二胺四乙酸
mM：毫摩尔浓度 DMSO：二甲基亚砜
μM：微摩尔浓度 CCK-8：八肽缩胆囊素
μL：微升 FITC：异硫氰酸荧光素
nm：奈米 p53：肿瘤蛋白质53
hrs：小时 FACS：荧光活化细胞分检器
S.E：标准误差 IC50：50％抑制浓度
  RT：室温(25±2℃)
体外试验
如同在引用文献BMC Cancer,2010,10,610,1-11的设计试验；将其揭露内容通过引用的方式并入用于试验的指导。
单层细胞试验 
步骤1
细胞株的维持 
使人类肿瘤细胞株：Panc-1(胰腺癌)、HCT 116(结直肠癌)、ACHN(肾细胞癌)、Calu-1(肺癌)、MiaPaca2(胰腺癌)、FADU(头颈癌)、PC3(前列腺癌)、G361(黑色素瘤)、 MDA-MB435S(黑色素瘤)、HeLa(宫颈癌)生长在由AMIMED(BioConcept–瑞士)获得的带有Eagle’s基本盐类的最低必需培养基(MEM–EBS)中。将肿瘤细胞株：MDA-MB231(乳癌)、JURKAT(T细胞白血病)、H460(小细胞肺癌)培养在RPMI 1640(AMIMED,BioConcept，瑞士)培养基。将所有肿瘤细胞株用10％胎牛血清(FBS)(GIBCO)、1％青霉素/链霉素(Sigma)和1％抗性抗体(Anti-Anti)(GIBCO)补充并且使其生长在T-175组织培养瓶(Nunc)中。将非致肿瘤细胞株MCF-10A培养于带有所有标准添加物(Lonza,Catalog.No.CC-3150)的乳腺上皮基础培养基(Mammary Epithelial Basal Medium Mammary Epithelial Basal Medium，MEBM)。使所有细胞生长在37℃的5％CO2培养箱中。在80-90％汇流时将细胞传代培养。使粘附细胞使用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)胰蛋白酶消化并维持。所有细胞株是从ATCC(Rockville,MD,USA)购买的。
步骤2
样本制备
将式(1a)的化合物(在示例7中描述的)溶解于DMSO，以提供所需的20mM贮存溶液。通过贮存溶液的连续稀释制备八个不同浓度的式(1a)的化合物，最后造成高(相比于测试浓度)200倍的浓度。分别在0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM和3μM的浓度下测试式(1a)的化合物。在重复三次下评估每个浓度。
步骤3
试验
式(1a)的化合物的IC50的测定方法：
a)在组织培养级96孔盘中，在3000细胞/200μL孔的密度下播种不同的癌症/正常细胞，并且使它们在37±0.5℃下在加湿的5±0.2％CO2培养箱中恢复24小时。
b)在24hr后，将溶解于DMSO的1μL 200X(用200X表示比所需浓度高200倍)式(1a)的化合物加至用癌症/正常细胞播种的上述组织培养盘。孔中DMSO的最终浓度为0.5％。使用DMSO作为媒介物对照组。
c)在24hr后，将盘从CO2培养箱移出，并且每孔加入5μL的CCK-8(Dojindo Molecular Technologies,Inc.USA,catalog.no.CK04-20)。
d)然后将盘置于37℃2hr。
e)在450nm下记录吸光值。
f)使用下列公式计算细胞毒性百分比。
通过浓度-效果曲线的目测来评估IC50数值。用于测试的、十四个细胞株的平均IC50数值的计算，选择几何平均值。
结果呈现在表格3中，如下给出。
表格3：不同癌细胞和正常细胞中的式(1a)的化合物的IC50数值
序号 癌症细胞株 癌症类型 IC50(μM)
1 Panc-1 胰腺癌 0.0013±0.00032
2 H460 非小细胞肺癌 0.0092±0.00076
3 ACHN 肾脏癌 0.0071±0.00064
4 HCT116 结直肠癌 0.0151±0.0023
5 Calu 1 肺癌 0.0252±0.0035
6 MiaPaca 2 胰腺癌 0.0253±0.0046
7 FADU 头颈癌 0.0224±0.0012
8 PC3 前列腺 0.0052±0.00041
9 G361 黑色素瘤 0.0241±0.0043
10 MDAMB435S 黑色素瘤 0.0029±0.00048
11 MDAMB231 乳癌 0.0061±0.00052
12 HeLa 宫颈癌 0.0101±0.0031
13 Jurkat T细胞白血病 0.0159±0.0026
14 MCF10A 正常乳腺上皮细胞 0.0197±0.0031
结论
体外研究显示，式(1a)的化合物在不同癌症细胞中表现0.0013μM至0.025μM范围的IC50；而在正常细胞(MCF-10A)中，其表现0.019μM的IC50。这数据显示式(1a)的化合物对高度增生的癌细胞株具有活性。
示例17
试验
FITC钙磷脂结合蛋白V细胞凋亡的检测：
用于检测细胞凋亡的经典技术—钙磷脂结合蛋白V试验是用于通过流式细胞仪检测细胞凋亡的最常使用的方法。细胞凋亡最早的特征之一为磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)从细胞膜内层至外层的易位作用，从而将磷脂酰丝氨酸暴露于外界环境。
钙磷脂结合蛋白V(cat.no.556420,BD Biosciences,USA)结合至暴露于细胞表面的磷脂酰丝氨酸并且在细胞凋亡较早阶段辨识细胞。
a)在组织培养级96孔盘中，在0.5×106细胞/2000μL孔的密度下播种HeLa癌细胞(在示例16的步骤1中提到)，并且使它们在37±0.5℃下在加湿的5±0.2％CO2培养箱中恢复12小时。
b)在12hr后，将溶解于DMSO的5μL 200X(用200X表示比所需浓度高200倍)式(1a)的化合物(示例16步骤2)加至用HeLa癌细胞播种的上述组织培养盘。式(1a)的化合物的最终测试浓度为0.0003μM、0.003μM和0.01μM。孔中的DMSO的最终浓度为0.5％。
c)在48hr后，将盘从CO2培养箱移出，并且依照制造商指导使用Apoptosis Detection Kit(目录编号：556547,BD biosciences,USA)对FITC钙磷脂结合蛋白染色。
d)在BD流式细胞仪中分析经处理的细胞用于钙磷脂结合蛋白V检测。使用FACS分析测定存在于M1和M2的种群。
结果：媒介物对照组细胞显示2.01％钙磷脂结合蛋白V阳性细胞(M2)，而用0.0003μM、0.003μM和0.01μM浓度暴露12hr的式(1a)的化合物细胞分别显示33.80％、40.27％和59.05％细胞对于钙磷脂结合蛋白V染色呈阳性(M2)(如同图5显示)。
结论：此数据表示式(1a)的化合物在HeLa癌细胞中通过细胞凋亡诱发细胞死亡。
示例18
试验
通过高含量筛选(high content screening)的蛋白质表现研究
在HeLa细胞中通过Cellomics高含量成像进行细胞周期蛋白D、核因子-k B(p65)[NFkB(p65)]、核糖体蛋白S6(pS6)、肿瘤蛋白53(p53)、蛋白质c-jun氨基端激酶(pJNK)、切割半胱天冬酶9、切割半胱天冬酶3和切割聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白质表现(在示例16的步骤1中提到)。这些一级抗体购买自Santacruz Biotechnology,USA。简单地说在带有透明底的96孔组织培养级黑盘(Nunc,USA)中播种1X104细胞，并且使其粘附24h，然后以新鲜培养基替换，并且将细胞用0.01μM、0.003μM和0.0003μM浓度的式(1)的化合物(在示例16的步骤2中提到)处理，并且分别培养1h和3h。在各自的时间点，将细胞在RT下用3.7％甲醛(Sigma St.Louis,MO)固定10分钟，接着用0.15％Triton X-100(Sigma St.Louis,MO)透化(permeabilization)10分钟。再将细胞用5％牛血清白蛋白阻滞2小时。在阻滞步骤之后，加入特定一级抗体1h，且将不同蛋白质的一级抗体通过用Dylight548(红色)标记的二级抗体(Thermofisher,USA)定位。在二级抗体培养之后，将核通过Hoechst 3342(蓝色)(Sigma,USA)染色。通过在Cellomics ArrayVTI HCS读取仪(Thermo-Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)中扫描盘来测定免疫荧光。使用Cellomics的Compartmental Analysis bio-algorithm分析所有数据点，并且相对于未处理细胞将定量数据以活化％表示。对每个重复孔计数1000细胞，并且将结果用平均±S.E表示。
结果总结在表格4和表格5中。
表格4：式(1a)的化合物在3小时后对HeLa细胞中的p53、pJNK、切割半胱天冬酶9、切割半胱天冬酶3和切割PARP蛋白质表现的作用
表格5：式(1a)的化合物在3小时后对HeLa细胞中细胞周期蛋白D、NFkB(p65)和pS6蛋白质表现的作用
结论
在癌细胞中，式(1a)的化合物显著地向下调节NFkB(p65)、pS6和细胞周期蛋白D的蛋白质表现。其还向上调节p53、Pjnk、切割半胱天冬酶9表现，随后诱发驱动癌细胞朝向细胞凋亡的切割半胱天冬酶3和切割PARP的显著向上调节。
示例19
式(1b)的化合物和化合物1至8的生物评估
如同上述示例16的描述设计试验。如同上述示例16的描述进行用于体外试验的样本制备和式(1b)的化合物(在示例8中描述)和如同在示例9至15获得的化合物(与化合物1至8相对应)的IC50数值的测定。
通过浓度-效果曲线的目测来评估IC50数值。用于测试的、六个细胞株(PC3、MDA MB、HCT116、MCF7、MIAPaCa2、MCF10A)的平均IC50数值的计算，选择几何平均值。
结果呈现在下面给出的表格6中。
表格6：不同癌症细胞株和正常细胞中式(1b)的化合物和化合物2至9的IC50数值
-未测试
结论
体外试验显示(i)式(1b)的化合物在不同癌细胞中显示0.018μM至0.071μM范围的IC50；而在正常细胞(MCF-10A)中其显示0.030μM的IC50；(ii)化合物1至8在不同癌细胞中显示0.009μM至1.045μM范围的IC50；而在正常细胞(MCF-10A)中其显示<0.010μM至0.830μM范围的IC50。
这些数据显示式(1b)的化合物和化合物1至8对高度增生的癌细胞株具有活性。

Claims (22)

1.一种式(1)的化合物；
其中在所述式(1)的化合物中，当所述键代表单键且R1为H时；将所述化合物称作式(1a)的所述化合物；以及
当所述键为双键且R1不存在时；将所述化合物称作式(1b)的所述化合物；
或其同分异构体或互变异构体或混合物，或衍生物；或其药学上可接受的盐类。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为所述式(1a)的化合物，其特征在于：
a)分子量为826.9，
b)分子式为C37H62N8O13，
c)IR(KBr)光谱：3325,2960,2872,1755,1641,1524,1445,1331,1306,1288和1254cm-1，
d)1H NMR光谱(500MHz,CDCl3)：δ9.20,8.00,7.10,6.90,6.40,6.10,5.40,5.38,5.29,5.10,4.90,4.80,4.70,4.60,3.90,3.70,3.15,2.70,2.30,2.10,1.98,1.95,1.77,1.71,1.68,1.60,1.52,1.40,1.15,1.10,1.05,0.98,0.95,0.90,0.88和0.85(如同图1给出)，
e)13C NMR光谱(75MHz,CDCl3)：δ176.0,172.0(3),171.0,170.0,169.0,99.9,78.9,77.2,71.7,53.5,52.9,49.3,49.0,47.1,46.7,46.2,42.2,41.0,39.8,29.9,27.4,24.8,24.6,24.2,24.1,23.2,21.7,21.5(2),20.6,19.9,19.4,18.1,12.9和11.7(如同图1给出)。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为所述式(1b)的化合物，其特征在于：
a)分子量824.4，
b)分子式为C37H60N8O13，
c)IR(KBr)：3342,3030,2953,1752,1650,1524,1421,1293,1255和1239cm-1，
d)1H NMR光谱(500MHz,CDCl3)：δ9.20,8.00,7.19,7.0,6.18,6.14,5.80,5.41,5.39,5.30,5.10,4.80(2),4.20,3.70,3.19,2.62,2.27,2.10,2.01,1.98,1.77,1.71,1.62,1.58,1.44,1.40,1.39,1.37,1.20,1.10,1.05,0.96,0.91,0.90,0.86和0.85(如同图3给出)，
e)13C NMR光谱(75MHz,CDCl3)：δ176.0,171.8,171.7,170.8,170.6,170.3,168.9,144.6,98.8,79.0,77.2,71.7,53.6,53.5,50.6,49.1,47.1,46.4,42.6,41.0,39.8,29.9,27.4,24.7,24.6,24.2,24.0,22.1,21.5,21.4,19.8,19.5,19.4,18.1,17.2,12.9和11.8(如同图4给出)。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为所述式(1)的化合物的衍生物，其以所述式(1c)表示，
其中，
R1和R4独立地代表H或不存在；
R2和R3独立地选自H、羟基、-O(C1-C6)烷基和-OC(O)(C1-C6)烷基；
表示单键或双键；
其中，
(C1-C6)烷基未被取代或被一个或更多个基团取代，所述一个或更多个基团独立地选自卤素、羟基、-O(C1-C6)烷基、硝基、氰基、-COOH、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、-NHC(O)O(C1-C6)烷基、-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基、-NH-PEG或(C6-C10)芳基；
(C6-C10)芳基未被取代或被一个或更多个基团取代，所述基团独立地选自卤素、卤(C1-C6)烷基、羟基、氰基、硝基、(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-COOH和-NH2；
以及PEG为聚乙二醇，其选自O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺-琥珀酰胺基)乙基]聚乙二醇(α,ω-双-NHS-PEG)、甲基-PEG-NHS酯(MS(PEG)n，其中n为24)，和聚乙二醇的分枝的三甲基和琥珀酰亚胺酯衍生物(TMS(PEG)n，其中n为12)；
伴随规定若R2和R3两者为羟基，那么R1和R4为不存在并且表示双键；
或其同分异构体或互变异构体或混合物；或其药学上可接受的盐类。
5.根据权利要求4所述的化合物，其为式(1c)的化合物；
R1和R4为H；
R2为-O(C1-C6)烷基或-OC(O)(C1-C6)烷基；
R3为羟基或-O(C1-C6)烷基；
其中，(C1-C6)烷基未被取代或被-NH2、-NHC(O)O(C1-C6)烷基(C6-C10)芳基或-NH-PEG取代；
或其同分异构体或互变异构体或混合物；或其药学上可接受的盐类。
6.根据权利要求4所述的化合物，
其中，
R1和R4独立地表示H或不存在；
R2和R3独立地选自H和羟基；
表示单键或双键；
伴随规定若R2和R3两者为羟基，那么R1和R4不存在并且表示双键；
或其同分异构体或互变异构体或混合物；或其药学上可接受的盐类。
7.根据权利要求4至6中的任一项所述的化合物，其中所述化合物为：
或其同分异构体或互变异构体或混合物；或其药学上可接受的盐类。
8.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1至7中任一项所述的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂及/或载体。
9.一种如权利要求1至7中任一项所述的化合物，或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类；用于癌症治疗的用途。
10.一种用于如权利要求9所述的用途的化合物，其中所述癌症选自白血病、肺癌、脑癌、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、肝癌肾脏癌、膀胱癌、泌尿道癌、乳癌、头颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、胚细胞瘤、胆管上皮癌、颅外癌、肉瘤、间皮瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、多发性骨髓瘤、头颈癌、胰腺癌、室管膜瘤、神经细胞瘤、皮肤癌、卵巢癌、复发性卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、结直肠癌、淋巴组织增生病、难治性多发性骨髓瘤、抗多发性骨髓瘤或骨髓增生性疾病。
11.一种用于如权利要求9或10所述的用途的化合物，其中所述癌症选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、成人急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑干神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、包括小脑星形细胞瘤和大脑星形细胞瘤的星形细胞瘤、视通路神经胶质瘤、松果体瘤、髓母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、霍奇金氏病、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱癌、泌尿道癌、骨肉瘤、乳癌、子宫内膜癌、口癌、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、神经细胞瘤、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、结直肠癌、淋巴组织增生病或骨髓增生性疾病。
12.一种用于如权利要求9至11中任一项所述的用途的化合物，其中所述癌症选自急性淋巴性白血病、急性髓性白血病、成人急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、多毛细胞白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑干神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、包括小脑星形细胞瘤和大脑星形细胞瘤的星形细胞瘤、髓母细胞瘤、肾细胞癌、膀胱癌、泌尿道癌、乳癌、口癌、黑色素瘤、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或结直肠癌。
13.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗所述癌症的用途。
14.一种如权利要求1至7中任一项所述的化合物；或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类的用于制造治疗癌症的药剂的用途。
15.一种治疗在受试者中的癌症的方法；其包括将治疗有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物或其同分异构体或互变异构体或药学上可接受的盐类给药至受试者。
16.一种如权利要求1所述的化合物的制备方法，其包括如下步骤；
a)使所述培养编号PM0895172或其变异体或突变体中的一种生长在包含碳、氮以及营养无机盐及/或微量元素源的营养培养基中的水下需氧条件下，以获得包含式(1)的化合物的培养液；
b)从所述培养液分离所述式(1)的化合物；以及
c)纯化所述式(1)的化合物。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括将式(1)的化合物转变为其药学上可接受的盐类。
18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)中的所述培养液包含式(1a)的所述化合物和式(1b)的化合物的混合物。
19.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)中所述式(1)的化合物为所述式(1a)的化合物。
20.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)中所述式(1)的化合物为所述式(1b)的化合物。
21.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(c)中所述式(1)的化合物为所述式(1a)的化合物。
22.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(c)中所述式(1)的化合物为所述式(1b)的化合物。
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