KR20140135302A - 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍삼박 메탄올 추출물 또는 여정실 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미백 조성물은 세포독성이 없는 효능, 세포 내 티로시나제의 활성을 저해하는 효능, α-MSH로 활성화된 세포 내 티로시나제의 활성을 저해하는 효능, 세포 내 멜라닌 함량을 감소시키는 효능, 세포 내 α-MSH로 활성화된 멜라닌 함량을 감소시키는 효능, 세포 내 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 저해하는 효능, α-MSH에 의한 과색소 침착시의 멜라닌 합성을 저해하는 효능, 세포 내 MITF, CREB, pCREB, p38 및 pp38의 발현을 저해하는 효능, 세포 내 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 촉진하는 효능을 보유하고 있다.

Description

홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물{A COMPOSITE COMPRISING RED GINSENG RESIDUE AND LIGUSTRI FRUCTUSE FOR SKIN WHITENING}

본 발명은 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍삼박 메탄올 추출물 또는 여정실 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미백 조성물은 세포독성이 없는 효능, 세포 내 티로시나제의 활성을 저해하는 효능, α-MSH로 활성화된 세포 내 티로시나제의 활성을 저해하는 효능, 세포 내 멜라닌 함량을 감소시키는 효능, 세포 내 α-MSH로 활성화된 멜라닌 함량을 감소시키는 효능, 세포 내 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 저해하는 효능, α-MSH에 의한 과색소 침착시의 멜라닌 합성을 저해하는 효능, 세포 내 MITF, CREB, pCREB, p38 및 pp38의 발현을 저해하는 효능, 세포 내 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 촉진하는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 미백 조성물은 유효성분으로 사용된 홍삼박 메탄올 추출물의 농도는 0.0156~0.25 mg/ml, 여정실 추출물의 농도는 12.5~100 ㎍/ml(세포 기준)인 것을 기술적 특징으로 보유하고 있다.

인류의 평균 수명이 늘어나고 삶의 질을 중시하게 됨에 따라, 미용은 큰 관심사가 되어왔다. 특히 흰 피부는 동서고금을 막론하고 미의 상징 중 하나라 할 수 있어, 피부 미백은 더욱 관심의 대상이 되어왔으며 그에 따라 피부 미백에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다.

자외선 등의 외부 스트레스를 받게 되면 피부 각질 세포에서 α-MSH (melanocyte stimulating hormone) 등의 호르몬과 사이토카인이 분비되며 이들은 멜라닌 세포(melanocyte)에 존재하는 수용체에 결합하여 멜라닌 세포를 활성화시키고 활성화된 멜라닌 세포는 멜라닌 소체(melanosome)에서 멜라닌을 합성한다.

멜라닌(melanin)은 복합체 형태를 갖는 페놀류의 고분자 천연색소로서, 흑갈색 색소인 유멜라닌(eumelanin)과 적황색 색소인 페오멜라닌(pheomelanin)으로 분류할 수 있으며, 인간의 피부색을 결정하고 외부 스트레스로부터 피부를 방어하는 기전의 일환으로 작용한다.

하지만 멜라닌이 과도하게 생성될 경우 피부에 색소가 침착되어 기미, 주근깨, 점, 검버섯 등이 형성되기 때문에 피부 미백에서 멜라닌의 합성 저해는 주요한 과제이다.

여기에서 멜라닌의 합성 과정을 자세히 살펴보면 다음과 같다.

피부가 자외선에 노출되면 뇌하수체 중엽에서 멜라닌 세포 활성화호르몬인 α-MSH가 분비되어 멜라닌 세포 특이 수용체인 MC1R(melanocortin 1 receptor)에 결합한다. 이는 아데닐 사이클레이즈(adenylyl cyclase)를 활성화시켜 세포 내 cAMP(cyclic adenosine monophosphate)를 증가시키고 신호전달 단백질을 활성화시켜 멜라닌 합성을 유도한다. 이때 멜라닌 합성을 유도하는 신호전달 통로는 PKA신호전달 통로, ERK 신호전달 통로, PKC(protein kinase C) 신호전달 통로, 니트릭 옥사이드(nitric oxide)에 의한 cGMP 신호전달 통로 및 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)신호전달 통로 등이 알려져 있다. 그 중 멜라닌 합성의 주요신호전달 통로는 PKA 신호전달 통로 및 ERK 신호전달 통로이다.

먼저 PKA 신호전달 통로를 살펴보면, 세포 내 cAMP가 증가하면 PKA(protein kinase A)가 활성화되고 CREB(cAMP resposive element binding protein)이 인산화되어 MITF(Microphtha;mia associated transcription factor)의 발현이 증가한다.

MITF는 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사조절 인자로서 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 티로시나제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein 1) 및 TRP-2(tyrosinase related protein 2)의 전사를 촉진한다. 티로시나제는 멜라닌 합성의 속도결정단계인 초기반응에 작용하는 효소로서, L-티로시나제를 L-DOPA(3, 4-dihydroxyphenylalanine)로 전환시키고 L-DOPA를 L-DOPA 퀴논(phenylanine-3,4-quinone, 페닐알라닌-3,4-퀴논)으로 산화시킨다. L-DOPA퀴논은 시스테인(cysteine)과 결합하여 시스테이닐(cysteinyl) DOPA로 대사된 후 여러 단계의 반응을 거쳐 페오멜라닌이 형성된다.

도파크롬(dopachrome)은 L-DOPA 퀴논에 의해 산화된 후 TRP-2의 작용에 의해 DHOCA(5,6-dihydr-oxy-indole-2-carboxylic acid)로 변환되고 TRP-1의 작용에 의해 DHICA(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)로 산화된 후 중합반응을 거쳐 유멜라닌이 형성된다.

또한 도파크롬은 자동산화된 후 DHI(5,6-dihydroxy-indole)로 변환되고 티로시나제의 작용에 의해 인돌(indole)-5,6-퀴논으로 변환된 후 중합반응을 거쳐 유멜라닌이 형성된다. 즉, 티로시나제의 작용으로 페오멜라닌이 형성되고, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 작용으로 유멜라닌이 형성된다.

다음으로 ERK 신호전달 통로를 살펴보면, cAMP는 Ras 및 B-raf 발현을 촉진시켜 MEK를 활성 및 인산화(pMEK)시키고 pMEK는 ERK(extracellular singnal-regulated kinase)를 활성 및 인산화(pERK1/2)시킨다. MITF는 pERK1/2에 의해 Ser-73위치에서 인산화된 후 hUBC 효소에 의존적으로 유비퀴틴-프로테아좀(ubiquitin-proteosome) 신호전달 통로를 통해 분해되며 이로 인해 티로시나제 발현이 저해되어 멜라닌 합성이 저해된다.

이로써, 멜라닌 합성을 유도하는 신호전달 단백질인 MITF, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2, ERK 등을 저해하면 멜라닌 합성을 저해할 수 있다.

피부 미백 수단에는 레이저 박피술, 코직 산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 하이드로퀴논(Hydroquinon) 등의 피부 미백제, 피부 미백 화장품 등이 있는데, 피부 미백제 및 미백 화장품에는 자외선 차단, 각질층 제거, 색소환원 및 멜라닌 합성을 유도하는 신호전달 단백질 저해활성을 가지는 물질들을 배합하여 사용하여 왔으나, 피부 미백 화장품은 효과가 매우 미미하고 피부 미백제는 대부분 화학물질로 구성되어 있어 당뇨병, 피부암 등의 부작용을 초래할 수 있어 그 사용이 제한되고 있다.

한편 전통적인 약재인 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 오가피과 인삼속 인삼종에 속하는 다년생식물로서, 건조여부와 가공방법에 따라 수삼, 건삼, 홍삼으로 나눌 수 있다. 수삼은 어떤 가공도 하지 않은 인삼, 건삼은 열풍 등으로 말린 인삼, 홍삼은 수삼을 수증기 또는 기타 방법으로 쪄서 건조한 것을 말한다.

여정실(Ligustri Fructuse)은 물푸레나무과에 속한 제주광나무(Ligustr uM lucid uM Aiton)의 성숙한 과실을 건조한 것으로서 음의 기운을 보하는 효능이 양호한 약재로서 간과 신장의 음기를 충만히 하고 간과 신의 허약으로 인한 두통, 귀울림, 관절이나 허리가 아픈 증상, 뼈 속에 열이 있는 증상 등을 치료하는데 사용한다.

인삼 및 홍삼에는 사포닌(Saponin)을 비롯하여 인삼향 성분인 파나센(Panacen), 폴리아세틸렌(Polyacetylen)계 화합물, 함질소성분, 플라보노이드(Flavonoid), 비타민 B군, 미량원소, 효소, 항산화물질, 유기산 및 아미노산 등을 함유하고 있다. 이들 중 주요 약리활성을 보이는 성분은 사포닌 성분으로 중추신경, 내분비, 면역, 대사, 노화, 피부질환, 항암 등 전반에 걸쳐 다양한 효과를 나타낸다.

사포닌은 분석방법 및 함량에 따라 조사포닌, 총사포닌 및 개별사포닌으로 구분할 수 있다.

조사포닌(crude saponin)은 인삼 및 홍삼을 메탄올 등 용매로 추출하여 에테르로 기름층을 제거하고 수포화부탄올을 이용하여 여과분리 후 감압 농축하여 얻은 것으로 색상은 적황색을 띄며 분말상이다. 총사포닌(total saponin)은 인삼의 사포닌 성분 중 조사포닌을 분리정제하여 진세노사이드를 얻는 것으로 진세노사이드의 총량을 말한다. 개별사포닌은 총사포닌을 구성하는 화합물 하나하나를 말하는 것으로 진세노사이드라 한다.

진세노사이드는 복합 탄수화물 즉 알코올 또는 페놀과 당의 복합체로서, 대부분 트리테르페노이드(Triterpenoid)계의 담마란(Dammarane)계 사포닌이다. 담마란계 사포닌에는 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol, PPD)과 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol, PPT)이 있다.

PPD는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh2 등을 포함하여 19~22종이 보고되어 있는데, 수산기(OH-)가 2개이며 주로 중추신경계 진정작용을 보유하고 있다. PPT는 진세노사이드 Re, Rf, Rg1, Rg2 등을 포함하여 10~14종이 보고되어 있는데, 수산기(OH-)가 3개이며 주로 중추신경계 흥분작용이 있다고 알려져 있다.

현재 인삼에는 20~24종의 진세노사이드가 분리 보고된 것에 비하여, 홍삼에는 34~36종의 진세노사이드가 분리 보고되었는데, 홍삼에는 특유의 진세노사이드 성분인 -Rh2, -Rh1, Rg 등의 14종 가량이 더 함유되어 있다고 알려져 있다.

홍삼을 이용하여 홍삼추출물을 제조하는 과정에서 부산물로 생성되는 홍삼박은 홍삼을 물 또는 알코올 등의 용매로 추출하여 홍삼정(紅蔘精) 즉 홍삼엑기스(red ginseng extract) 성분이 추출되고 남은 잔사로서, 홍삼을 수회 반복 추출하더라도 내부의 유효성분을 모두 추출할 수 없다. 또한 추출용매에 따라 물 또는 알코올에 용해되는 성분만 추출되고 용해되지 않은 유효 잔류성분이 다량 남게 된다. 하지만 추출 비용상(가열비용, 용매비용, 공정반복비용 등) 홍삼의 유효성분이 남아 있더라도 더 이상 추출할 수 없으므로 홍삼박에는 사포닌, 폴리아세틸렌, 단백질 등의 유효성분이 대략 20~40% 정도 잔류하게 된다.

이와 같이 유효성분이 다량 잔류되어 있는 홍삼박은 재활용하기 어렵고 그 활용범위가 제한적이어서 현재에는 대부분 경마장에서 경마의 사료 등 가축의 사료나 퇴비조성물의 첨가제로만 단순히 사용되고 있는 실정이다. 또한 홍삼박에서 조사포닌을 추출하는 방법은 그리 어렵지 않으나, 순도를 높인 각각의 홍삼 사포닌을 추출하는 방법은 쉽지 않다.

이로써, 홍삼박에 잔류하고 있는 유효 성분 중 순도 높은 진세노사이드 성분을 효과적으로 추출하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있는데, 이에 대한 종래기술로 공개특허공보 제10-2011-0019973호에 초임계 이산화탄소를 이용하여 인삼 원료로부터 오일을 추출하는 것이 개시되어 있는데, 상세한 설명에는 인삼 원료가 홍삼박을 포함하는 것이 개시되어 있다.

구체적으로 살펴보면, 인삼, 홍삼, 인삼박, 홍삼박 등의 초임계 이산화탄소를 이용하여 인삼 원료로부터 비수용성 성분인 폴리아세틸렌 화합물 함유 오일과 향성분 함유 오일을 추출하여 분리해내는 방법에 관한 것이다.

하지만 상기 종래기술은 홍삼박을 비극성 용매 또는 초임계 이산화탄소로 추출하여 오일을 얻는 것으로 홍삼박에서 진세노사이드 성분을 추출하는 것과는 관련이 없다고 하겠다.

또한 진세노사이드 성분을 다량 함유하고 있는 홍삼박을 이용하여 멜라닌 합성을 유도하는 신호전달 단백질 활성을 저해하여 피부 미백제의 효과 및 부작용을 개선하기 위한 연구가 진행되고 있는데, 이에 대한 종래기술로 공개특허공보 제10-2009-0128808호에 인삼 사포닌 Rg1을 이용한 주름개선용 한방화장품 및 이를 이용한 팩이 개시되어 있다.

구체적으로 살펴보면, 인삼추출 후 생긴 인삼전분을 증류수로 증류한 후 인삼잎에서 추출한 사포닌 Rg1을 첨가하여 인삼첨가물을 제조한 후 인삼첨가물을 이용하여 팩을 제조하고 팩을 사용한 후 피부질환 개선상태를 조사한 것이다.

하지만, 상기 종래기술은 홍삼박을 이용한 것이 아니라 인삼전분 증류액에 인삼잎에서 추출한 Rg1을 첨가한 인삼첨가물을 이용한 것으로, Rg1의 첨가량이 기재되어 있지는 않지만 상기 종래기술의 효과가 인삼전분 증류액만으로 인해 발생되었다고 볼 수 없다. 또한 인삼첨가물을 이용하여 제조된 팩을 사용한 후 피부질환의 개선상태를 조사한 것으로 인삼첨가물이 멜라닌 합성을 유도하는 신호전달 단백질 활성을 저해하는 것에 대해서는 기재되어 있지 않다.

본 발명의 목적은, 천연 유래의 소재를 이용하여 부작용 및 세포독성 없이 피부 미백 작용을 하는 미백 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은, α-MSH에 의해 유도된 세포 내 멜라닌 합성, 세포 내 티로시나제 활성, α-MSH에 의한 과색소 침착시의 세포 내 멜라닌 합성을 저해하는 미백 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 및 MITF의 발현, p38, CREB 및 pCREB 발현을 감소시켜 멜라닌 합성을 저해하는 미백 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은, ERK 1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 촉진시켜 멜라닌 합성을 저해하는 미백 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은, 천연 유래의 소재를 이용하여 부작용 및 세포독성 없이 피부 미백 작용을 하는, 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, α-MSH에 의해 유도된 세포 내 멜라닌 합성, 세포 내 티로시나제 활성, α-MSH에 의한 과색소 침착시의 세포 내 멜라닌 합성을 저해하는 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 및 MITF의 발현, p38, CREB 및 pCREB 발현을 감소시켜 멜라닌 합성을 저해하는, 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, ERK 1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 촉진시켜 멜라닌 합성을 저해하는, 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 조성물은, 항산화제, 항염증 및 피부 미백용 약학적 조성물로 제공될 수 있으며, 각각의 조성물은 식품학적으로 허용되는 처리제를 이용하여 건강기능식품으로 제조하여 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용한 화장료의 경우, 함량은 전체 화장료 조성물에 대하여 0.0001 ~ 10.0 중량%이고, 바람직하게 0.0005 ~ 10.0 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.005 ~ 5.0 중량%이다. 만약 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 뚜렷한 피부 미백 개선 효과를 기대할 수 없고, 함량이 10.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않는다.

본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 화장품 또는 가축용 사료에 사용될 수 있으며, 각 경우마다 화장품 또는 사료에서 허용되는 처리 또는 추가제를 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 처리제가 추가될 수 있음은 물론이다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로 필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 스핑고 지질, 고분자다당, 고분자 펩티드로 이뤄진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(DL-알파 토코페롤, D-알파 토코페롤, D-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 DL-알파토코페롤, 니코틴산 DL-알파 토코페롤비타민 E. DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등)도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유류나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장료에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다. 이외에 처리해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료,유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 처리해도 되는 배합 성분은 위에 한정되는 것은 아니며, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.01 ~ 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 ~ 3 중량%로 배합된다.

본 발명에 따른 조성물은 화장료 이외에도 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 추가하여 건강기능식품으로 활용되도록 할 수 있음은 물론이다.

이 경우에는 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가하되, 홍삼박 메탄올 추출물이 포함될 경우에는 잔류 메탄올 성분을 제거하는 공정을 추가한 후에 첨가제를 첨가하도록 한다.

본 발명인 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물은, 천연 유래의 소재를 이용하여 부작용 및 세포독성 없이 피부 미백 작용을 하는 효과를 보유하고 있다.

본 발명인 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물은, α-MSH에 의해 유도된 세포 내 멜라닌 합성, 세포 내 티로시나제 활성, α-MSH에 의한 과색소 침착시의 세포 내 멜라닌 합성을 저해하는 효과를 보유하고 있다.

본 발명인 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물은, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 및 MITF의 발현, p38, CREB 및 pCREB 발현을 감소시켜 멜라닌 합성을 저해하는 효과를 보유하고 있다.

본 발명인 홍삼박 또는 여정실을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물은, ERK 1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 촉진시켜 멜라닌 합성을 저해하는 효과를 보유하고 있다.

도 1은 홍삼박에서 진세노사이드 성분을 순수분리 및 정제하는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 2는 홍삼박 메탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 그래프로 나타낸 그래프이다.
도 3은 홍삼박 메탄올 추출물의 세포독성 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 α-MSH 및 홍삼박 메탄올 추출물을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 멜라닌 합성 저해 효능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 α-MSH 및 홍삼박 메탄올 추출물을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 멜라닌 함량 증가에 따른 세포 변화 양상을 나타낸 사진이다.
도 6은 α-MSH 및 홍삼박 메탄올 추출물을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 티로시나제 활성 저해 효능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 홍삼박 메탄올 추출물의 농도에 따른 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현 저해 효능을 나타낸 사진이다.
도 8은 홍삼박 메탄올 추출물의 배양시간에 따른 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현 저해 효능을 나타낸 사진이다.
도 9는 홍삼박 메탄올 추출물의 농도에 따른 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현 촉진 효능을 나타낸 사진이다.
도 10은 홍삼박 메탄올 추출물의 배양시간에 따른 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현 촉진 효능을 나타낸 사진이다.
도 11은 홍삼박 메탄올 추출물의 CREB, pCREB, p38 및 pp38의 발현 저해 효능을 나타낸 사진이다.
도 12는 PD98059로 유도된 멜라닌 함량 증가 양상을 나타낸 그래프이다.
도 13은 PD98059 처리시의 멜라닌 함량 변화 양상을 나타낸 사진이다.
도 14는 PD98059 처리시의 티로시나제 활성 변화 양상을 나타낸 사진이다.
도 15는 PD98059 처리시 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현을 나타낸 사진이다.
도 16은 PD98059 처리시 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 나타낸 사진이다.
도 17은 PD98059를 처리 후 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 농도별로 처리하여 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MITF, pERK1/2 및 pMEK의 발현을 나타낸 사진이다.
도 18은 여정실 추출물 처리시의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 19는 여정실 추출물 처리시의 티로시나제 활성 저해 효능을 나타낸 그래프이다.
도 20은 여정실 추출물 처리시의 α-MSH로 유도된 티로시나제 활성 저해 효능을 나타낸 그래프이다.
도 21은 여정실 추출물 처리시 멜라닌 합성의 저해 효능을 나타낸 그래프이다.
도 22는 여정실 추출물 처리시 α-MSH로 유도된 멜라닌 합성의 저해 효능을 나타낸 그래프이다.
도 23은 여정실 추출물 처리시 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현 저해 효능을 나타낸 사진이다.
도 24는 여정실 추출물의 α-MSH에 의한 과색소 침착시의 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 저해 효능을 나타낸 사진이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이로써, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

제조예 1. 홍삼박 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물

홍삼을 용매로 추출하여 추출액을 생성하고 남은 부산물인 홍삼박을 수득한다.

홍삼의 추출 방법에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법 등 다양한 방법이 사용될 수 있다. 추출 시간 역시 달라질 수 있다.

추출 용매 역시 다양한 용매가 사용될 수 있다. 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올, 이소프로판올 등이 있다.

설계 조건에 따라, 수득된 홍삼박을 농축 후 추출하거나, 건조 후 분쇄하여 분말화한 후 추출할 수도 있다. 또한 수득된 홍삼박을 바로 추출한 후 건조하여 분말화할 수도 있다. 홍삼박의 추출시에도 다양한 추출 방법과 다양한 추출 용매가 사용될 수 있으며, 여과와 환류 추출 등의 과정이 추가될 수도 있다.

또한, 추출 용매의 농도는 용매의 종류에 따라 조절될 수 있다. 일 예로, 메탄올을 이용하여 홍삼박을 추출할 시에는 30~100%의 농도에서 추출하는 것이 바람직하다.

농축 방법에는 증발 농축, 건조 농축 등의 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 건조 방법에는 양건조법, 음건조법, 동결건조법, 열풍건조법 등의 다양한 건조 방법이 사용될 수 있다.

최종 과정의 일 예로, 홍삼을 12~48시간 동안 80~100℃에서 열수추출하여 추출액을 생성한 후 홍삼박을 수거하여 열풍건조기로 40~50℃에서 60~84시간 동안 건조시키고 연속식 분쇄기에서 10~20 메쉬(mesh)로 조분쇄하여 홍삼박 분말을 생성한 후, 생성된 홍삼박 분말을 메탄올을 이용하여 환류추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 일 예로, 생성된 홍삼박을 메탄올 90% 10 g/ml를 이용하여 1~3시간 동안 환류 추출하여, 상층액을 No.5 필터페이퍼를 이용하여 여과하고 잔류층을 동일 조건에서 추가로 환류 추출 후, 모든 추출액을 첫 번째 상층액과 합하여 45 ℃에서 감압 농축기를 이용하여 용매를 제거하여 추출물을 생성할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

홍삼박 추출물의 효능이 유지되며 세포독성이 없는 적정 공급 농도는 추출 방법에 따라 다를 수 있다. 일 예로 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 적정 공급 농도는 세포 기준으로 0.0156~0.25 mg/ml이다.

제조예 2. 여정실 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물

설계 조건에 따라, 여정실 추출에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이 실행될 수 있다.

또한, 2가지 이상의 추출 방법을 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

용매 추출법에 이용 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올, 이소프로판올 등이 있으며, 바람직하게는 물 및 에탄올이 이용될 수 있다.

또한, 분배계수가 다른 2가지 이상의 용매를 동시에 사용하여 추출할 수도 있으며, 2가지 이상의 용매를 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

이외에도 분획 추출법을 이용하여 여정실 추출물을 각 분획으로 나눌 수 있다.

일 예로, 여정실 2,000g에 비율별로 혼합된 증류수와 에탄올을 10배수 가하여 80~100로 3시간 가열한 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조하고 동량의 EtOAc를 넣어 분획하는 과정을 2회 반복, EtOAc 추출물과 증류수 분획물을 수득할 수 있다.

증류수와 에탄올의 혼합비는 증류수 100% : 에탄올 0%, 에탄올 30% : 증류수 70%, 증류수 30% : 에탄올 70%, 증류수 5%: 에탄올 95%와 같이 실행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 여정실의 추출물은 다음과 같은 분획 추출 과정을 통하여 수득될 수도 있다.

물 또는 에탄올 추출물에 대하여 증류수를 첨가한 다음 헥산을 첨가하여 물층과 헥산층으로 분획할 수 있다. 또한 물층에 다시 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하고, 물층에 다시 부탄올을 첨가하여 부탄올층과 물층으로 최종적으로 분획할 수 있다.

또한 여정실의 메탄올 추출물에 대하여 증류수를 첨가한 다음 헥산을 첨가하여 물층과 헥산층으로 분획할 수 있다. 또한 물층에 다시 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하고, 물층에 다시 부탄올을 첨가하여 부탄올층과 물층으로 최종적으로 분획할 수 있다.

또한 여정실의 C₁-C₅ 지방족 알콜 추출물에 대하여 증류수를 첨가한 다음 헥산을 첨가하여 물층과 헥산층으로 분획할 수 있다. 또한 물층에 다시 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하고, 물층에 다시 부탄올을 첨가하여 부탄올층과 물층으로 최종적으로 분획할 수 있다.

여정실 추출물의 효능이 유지되며 세포독성이 없는 적정 공급 농도는 세포 기준으로 12.5~100 ㎍/ml이다.

제조예 3. 홍삼박 메탄올 추출물과 여정실 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물

제조예 1에서 언급한 바와 같이, 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 적정 공급 농도는 세포 기준으로 0.0156~0.25 mg/ml이며, 제조예 2에서 언급한 바와 같이, 여정실 추출물의 적정 공급 농도는 세포 기준으로 12.5~100 ㎍/ml이다.

제조예 1 또는 제조예 2를 이용하여 제조된 추출물의 농도를 각각의 적정 공급 농도 내에서 조절한 후 혼합, 제조예 1 또는 제조예 2를 이용하여 제조된 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물을 제조한다.

혼합 후에 농축, 여과, 건조 등의 다양한 처리 과정이 실행될 수 있음은 물론이다.

설계 조건에 따라, 기타 한약재들을 유효성분으로 일부 포함하도록 제조될 수도 있으며, 이는 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물 또는 화장료 조성물 등으로 이용되도록 할 수 있다.

실험예 1. 홍삼박 메탄올 추출물의 진세노사이드 분석

홍삼박에서 순도 높은 진세노사이드 성분을 효과적으로 추출하는 방법을 제공하기 위해, 추출방법 및 용매에 따른 홍삼박 추출물의 진세노사이드 성분을 측정하는 실험을 수행하였다. 이때 추출 방법은 열수추출법 및 주정추출법을 이용하였고, 용매는 2차 증류수 및 5개의 농도별 메탄올을 이용하였다.

1. 실험 준비

(1) 시약 준비

추출에 사용한 시약으로서 증류수와 메탄올(덕산화학)을 이용하였으며, 진세노사이드 성분 분리, 정제 및 분석은 리사이클링 프렙(Recycling Prep) HPLC, 실리카 컬럼(silica col uMn) 및 사포닌 표준품을 이용하였고, 리사이클링 프렙 HPLC에 사용한 시약은 HPLC 급(grade)으로 아세토니트릴(J.T. Baker) 및 증류수를 이용하였다. 여기에서, 사포닌 표준품(83ppm)의 순도 100 ㎍/ml은 Rg1, Re, Rg2+Rh1, Rc, Ra1, Rb3, Rd의 경우 0.980, Rb1, Rb2, Rg3의 경우 0.970, Rf의 경우 0.960이었다.

2. 실험 과정

(1) 진세노사이드 성분 분리 및 정제

도 1은 홍삼박에서 진세노사이드 성분을 순수분리 및 정제하는 과정을 나타낸 개요도이다.

진세노사이드 성분 분리 및 정제는 본 발명의 실시하여 제조된 홍삼박 추출물로부터 각각의 PPT, PPD, 조사포닌을 분리하였다.

(2) 진세노사이드 성분 분석

열수추출 홍삼박 분말을 2차 증류수와 5개의 농도별 메탄올을 이용하여 얻은 열수추출 홍삼박 추출물의 진세노사이드 성분을 측정하고 그 결과를 하기의 [표 1]에 나타내었다.

메탄올 농도(%)	PPT (mg/10g)				PPD (mg/10g)
	Rg1	Re	Rf	Rg2+Rh1	Rb1	Rc	Ra1	Rb2	Rb3	Rd	Rg3
2차 증류수	0.580	0.559	0.846	0.644	2.651	0.981	0.482	0.933	0.157	0.497	0.776
30%	0.795	0.799	1.496	1.413	5.929	2.237	1.022	2.112	0.355	1.095	2.625
50%	1.003	1.093	1.841	1.871	8.215	3.133	1.496	3.084	0.503	1.730	6.375
60%	0.773	0.811	2.002	2.015	8.931	3.410	1.580	3.714	0.620	2.338	7.502
90%	1.208	1.353	2.331	2.436	11.345	4.346	2.170	4.335	0.700	2.493	9.254
100%	1.523	1.784	2.308	2.105	10.481	3.949	2.154	4.351	0.763	2.297	8.044

3. 실험 결과

측정 결과, 용매로 2차 증류수보다 메탄올을 이용하였을 때 열수추출 홍삼박 추출물의 진세노사이드 성분이 높게 나타났으며, 메탄올 농도가 증가할수록 진세노사이드 성분이 유의적으로 증가하는 결론을 도출할 수 있었다.

특히, 90% 메탄올을 이용하였을 때 Rg1, Re 및 Rb3를 제외한 진세노사이드 성분이 가장 높게 나타났고, Rg1, Re 및 Rb3는 100% 메탄올을 이용하였을 때 높게 나타났다.

이로써, 열수추출 홍삼박 추출물은 90% 메탄올을 용매로 이용할 때 진세노사이드 성분이 고른 분포로 높게 나타나는 것을 알 수 있었고, 그 중 Rb1은 11.345 ㎎/10g, Rg3는 9.254 ㎎/10g로 높게 나타난다는 결론을 도출할 수 있었다.

주정추출 홍삼박 분말을 2차 증류수와 5개의 농도별 메탄올을 이용하여 얻은 주정추출 홍삼박 추출물의 진세노사이드 성분을 측정하고 그 결과를 하기의 [표 2]에 나타내었다.

메탄올 농도(%)	PPT (mg/10g)				PPD (mg/10g)
	Rg1	Re	Rf	Rg2+Rh1	Rb1	Rc	Ra1	Rb2	Rb3	Rd	Rg3
2차 증류수	0.386	2.280	0.239	0.259	2.590	0.550	0.486	0.600	0.110	0.411	0.147
30%	0.601	3.597	0.537	0.779	8.293	3.019	1.726	2.785	0.873	2.075	2.892
50%	0.680	4.209	0.655	0.916	10.576	4.392	2.698	4.587	1.841	3.251	6.791
60%	0.871	4.531	0.682	0.880	11.769	6.904	4.276	6.369	2.917	4.499	9.288
90%	0.932	4.826	0.762	0.950	12.197	4.073	2.662	3.693	0.988	3.097	9.471
100%	0.772	3.760	0.625	0.815	10.050	3.252	2.324	3.053	1.018	2.670	8.476

측정 결과를 살펴보면, 2차 증류수보다 메탄올을 이용하여 추출하였을 때 주정추출 홍삼박 추출물의 진세노사이드 성분이 높게 나타났으며, 메탄올 농도가 증가할수록 진세노사이드 성분이 유의적으로 증가하는 결론을 도출할 수 있었다.

특히, PPT는 90% 메탄올을 이용하였을 때 높게 나타났고, PPD는 60% 메탄올을 이용하였을 때 Rb1 및 Rg3를 제외한 진세노사이드 성분이 높게 나타났다. Rb1 및 Rg3는 90% 메탄올을 이용하였을 때 가장 높게 나타났다.

이로써, 주정추출 홍삼박 추출물은 PPT는 90% 메탄올을 이용하였을 때 높게 나타나고, PPD는 60% 메탄올을 이용하였을 때 높게 나타나는 결론을 도출할 수 있었다.

측정 결과를 총괄적으로 살펴보면, 용매종류에 따른 추출물의 진세노사이드의 성분은 열수추출 홍삼박 추출물 및 주정추출 홍삼박 추출물 모두 2차 증류수보다 메탄올을 이용하여 추출하였을 때 높게 나타났으며, 메탄올 농도가 증가할수록 진세노사이드 성분이 유의적으로 증가하는 결론을 도출할 수 있었다.

또한 열수추출 홍삼박 추출물은 90% 메탄올을 용매로 이용할 때 진세노사이드 성분이 높게 나타났고, 주정추출 홍삼박 추출물은 PPT는 90% 메탄올, PPD는 60% 메탄올을 이용하였을 때 높게 나타나는 결론을 도출할 수 있었다.

추출방법에 따른 추출물의 진세노사이드의 성분을 비교하기 위해 90% 메탄올을 용매로 하는 열수추출 홍삼박 추출물(열수-90%), 60% 메탄올 및 90% 메탄올 용매로 하는 주정추출 홍삼박 추출물(주정-60% 및 주정-90%)을 서로 비교해 보았다.

그 결과, PPT는 열수-90%가 높게 나타났다. 또한 PPD는 주정-60%와 주정-90%가 높게 나타났고, 주정-60%는 주정-90%에 비해 Rb1 및 Rg3를 제외한 진세노사이드 성분이 높게 나타난다는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 2. 홍삼박 메탄올 추출물의 항산화능 분석

실험예 2 이하의 모든 참고 도면에 기재되어 있는 'RGE'라는 단어는 홍삼박 메탄올 추출물을 뜻하며, 실험예 2 이하에서 사용되는 모든 홍삼박 메탄올 추출물은 모두 실험예 1에 기재된 사항과 동일한 과정으로 제조되었음을 밝혀둔다.

1. 실험 과정

진세노사이드 성분 분석결과 진세노사이드 성분이 높게 나타난 메탄올을 용매로 하여 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 제조한 뒤 항산화능을 분석하였다.

홍삼박 분말은 진세노사이드 성분이 고른 분포로 높게 나타난 열수추출법을 이용하여 제조하였다.

제조된 열수추출 홍삼박 분말을 30% 메탄올, 50% 메탄올, 60% 메탄올, 90% 메탄올, 100% 메탄올을 이용하여 각각의 홍삼박 메탄올 추출물을 얻은 후 0.3 mM DPPH 용액을 첨가한 후 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다.

2. 실험 결과

도 2는 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 그래프로 나타낸 그래프로, 도 2를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 메탄올 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였고, 특히 90% 메탄올을 이용하였을 때 가장 효과가 높은 것으로 나타났다. 이로부터 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 항산화효능이 높다는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 3. 홍삼박 메탄올 추출물의 세포독성 분석

진세노사이드 성분 및 항산화능 분석 결과, 진세노사이드 성분 및 항산화능이 높게 나타난 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 시료로 사용하여 세포독성에 미치는 효과를 알아보았다.

1. 실험 준비

(1) 세포 배양

멜라닌 색소를 다량 함유하고 있는 악성 흑생종 B16F10 멜라노마 세포를 96-웰 플레이트(well plates)에 넣고 24시간 동안 5% CO₂를 함유하며 37℃를 유지하는 세포배양기에서 배양하였다.

2. 실험 과정

홍삼박 90% 메탄올 추출물의 세포독성을 알아보기 위해, 다양한 농도의 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 B16F10 멜라노마 세포에 처리한 뒤 세포의 생존능력을 MTT 어세이(assay)를 이용하여 측정하였다.

배양된 세포에 홍삼박 90% 메탄올 추출물 0 mg/ml, 0.004 mg/ml, 0.008 mg/ml, 0.0156 mg/ml, 0.0313 mg/ml, 0.0625 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml 및 1 mg/ml을 각각 처리한 뒤 5% CO₂를 함유하며 37℃를 유지하는 세포배양기에서 3일 동안 배양하였다.

그 다음 인산완충액(Phosphate buffer silutuin; PBS)으로 한 번 세척하고 MTT 시약을 0.5 ㎍/ml 처리한 뒤 동일한 조건의 배양기에서 30분간 배양하였다.

그 후 각 웰(well)에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 처리하여 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시키고 흡광도를 측정하였다.

세포독성 측정결과는 시료의 흡광도를 대조군(홍삼박 90% 메탄올 추출물 0 mg/ml)의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

3. 실험 결과

도 3은 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 세포독성 측정결과를 나타낸 그래프로, 도 3을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 세포의 생존능력은 대조군에 비해 홍삼박 90% 메탄올 추출물 0.0313 mg/ml를 처리하였을 때부터 조금씩 낮아지기 시작하여 0.25 mg/ml를 처리하였을 때부터는 농도 의존적으로 낮아지는 것으로 나타났다.

이로부터 홍삼박 90% 메탄올 추출물 0.25 mg/ml에서부터 농도 의존적으로 세포독성이 있다는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 4. 홍삼박 메탄올 추출물 처리시 멜라닌 합성 유도 신호전달 단백질의 저해 효능

홍삼박 메탄올 추출물이 멜라닌 합성을 유도하는 신호전달 단백질 활성에 미치는 효과를 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1. 실험 준비

(1) 세포 배양

멜라닌 색소를 다량 함유하고 있는 악성 흑생종인 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)를 6-웰 플레이트(well plates)에 넣고 24시간 동안 5% CO₂를 함유하며 37℃를 유지하는 세포배양기에서 배양하였다.

배양된 B16F10 멜라노마 세포에 α-MSH 200 nM과, 홍삼박 90% 메탄올 추출물 0 ㎎/ml, 0.0156 ㎎/ml, 0.0313 ㎎/ml, 0.0625 ㎎/ml 및 0.125 ㎎/ml을 함께 처리한 뒤 5% CO₂를 함유하며 37℃를 유지하는 세포배양기에서 3일 동안 배양하였다. 대조군은 α-MSH 및 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 모두 처리하지 않고 배양하였다.

2. 실험 과정

(1) 멜라닌 함량 분석

홍삼박 90% 메탄올 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 효과를 알아보기 위해, α-MSH를 이용하여 멜라닌 합성을 유도하고 멜라닌 함량을 측정하고 멜라닌 함량에 따른 세포의 변화 양상을 관찰하였다.

B16F10 멜라노마 세포를 3일 동안 배양한 후 배양액을 모두 제거하고 트립신(trypsin)을 처리한 후 세포를 회수하고 10,000~13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 이를 알코올로 세척한 후, 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH 용액으로 80℃ 항온조에서 1시간 방치하여 용해한 후 분광흡광계를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정은 세포를 배양한 다음날부터 매일 3일 동안 수행하였고, 측정 결과는 시료의 멜라닌 함량을 대조군의 멜라닌 함량에 대한 백분율로 나타내었다.

3. 실험 결과

도 4는 α-MSH 및 홍삼박 메탄올 추출물을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 멜라닌 합성 저해 효능을 나타낸 그래프로, 도 4를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 멜라닌 함량은 α-MSH를 처리하였을 때 대조군 대비 약 3.5배 증가하였고, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 함께 처리하였을 때부터 농도 의존적으로 감소되는 것으로 나타났다.

또한 트립신을 처리한 후 튜브에 세포를 회수하여 멜라닌 함량의 증가에 따른 세포의 변화 양상을 관찰하였다.

도 5는 α-MSH 및 홍삼박 메탄올 추출물을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 멜라닌 함량 증가에 따른 세포 변화 양상을 나타낸 사진으로, 도 5를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, α-MSH를 처리하였을 때 대조군에 비해 멜라닌 함량이 증가하였고, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 함께 처리하였을 때부터 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 5. 홍삼박 메탄올 추출물 처리시 티로시나제의 활성 저해 효능

홍삼박 90% 메탄올 추출물이 α-MSH에 의해 유도된 티로시나제 활성에 미치는 효과를 알아보았다.

1. 실험 과정

B16F10 멜라노마 세포를 3일 동안 배양한 후 라이시스 버퍼(1% Triton X-100, pH 7, 0.1mM PMSF, 0.1M phosphate buffer)를 첨가하여 30분간 얼음에서 반응시킨 후 원심분리하였다.

원심분리된 B16F10 멜라노마 세포를 50 ㎍을 취하여 라이시스 버퍼와 L-DOPA 2 ㎍/ml를 처리하고 37℃에서 1시간 방치한 후 분광흡광계를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정결과는 시료의 티로시나제 활성을 대조군의 티로시나제 활성에 대한 백분율로 나타냈다.

2. 실험 결과

도 6은 α-MSH 및 홍삼박 메탄올 추출물을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 티로시나제 활성 저해 효능을 나타낸 그래프로, 도 6을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 티로시나제 활성은 α-MSH를 처리하였을 때 대조군에 비해 급격하게 증가하였고, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 함께 처리하였을 때부터 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 직접적으로 티로시나제 활성을 감소시켜 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 6. 홍삼박 메탄올 추출물 처리시 PKA 신호전달 통로 관련 단백질 발현 저해 효능

홍삼박 90% 메탄올 추출물이 PKA 신호전달 통로에서의 멜라닌 합성에 관련된 주요 단백질인 티로시나제의 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 및 MITF 발현의 변화 양상을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하였다.

1. 실험 과정

B16F10 멜라노마 세포를 3일 동안 배양한 후 인산완충액(Phosphate buffer silutuin; PBS)으로 한번 세척하고 라이시스 버퍼를 첨가하여 30분간 얼음에서 반응시킨 후 원심분리하였다.

단백질 정량은 바이오-래드(Bio-Rad) 시약을 이용하였고 40 ㎍의 단백질을 이용하여 10% SDS-PAGE를 실시하였다. 5% 스킴 밀크(skim milk)에 각각의 항체를 처리하여 반응시킨 후 ECL 키트를 이용하여 단백질 발현을 측정하였다.

2. 실험 결과

도 7은 홍삼박 메탄올 추출물의 농도에 따른 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현 저해 효능을 나타낸 사진으로, 도 7을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 모든 단백질 발현은 α-MSH를 처리하였을 때 증가하였고 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 함께 처리하였을 때부터 감소하는 것으로 나타났다. 특히 홍삼박 90% 메탄올 추출물에 의한 발현감소는 MITF 발현에서 가장 현저하게 나타났다.

또한 배양시간에 따른 단백질 발현의 변화 양상을 확인하였다. 홍삼박 90% 메탄올 추출물은 단백질 발현의 감소가 일어나기 시작한 최소 농도인 0.0156 ㎎/ml를 시료에 처리하여 세포배양과 동일한 방법으로 3일 동안 배양하였고, 단백질 발현은 배양한 다음날부터 3일 동안 측정하였다.

도 8은 홍삼박 메탄올 추출물의 배양시간에 따른 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF 발현 저해 효능을 나타낸 사진으로, 도 8을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, TRP-2 발현은 6시간 이후부터 감소하였고 TRP-1 발현은 12시간 이후부터 현저히 감소하였으며 티로시나제 발현은 3시간 이후부터 감소하는 것으로 나타났다. 이로부터 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 티로시나제, TRP-2, TRP-1 순서로 발현을 감소시키는 결론을 도출할 수 있었다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자인 MITF 발현을 감소시켜 멜라닌 합성을 저해하는 결론을 도출할 수 있었다. 또한 MITF 발현뿐만 아니라 티로시나제, TRP-1, TRP-2 발현에도 모두 영향을 미치는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 7. 홍삼박 메탄올 추출물 처리시의 ERK 신호전달 통로 관련 단백질 발현 촉진 효능

α-MSH에 의해 유도된, ERK 신호전달 통로에서의 멜라닌 합성과 관련된 주요 단백질은 MEK, pMEK이며, ERK의 8가지 동위체(isoform) 중 MEK에 의해 조절되는 것은 ERK1과 ERK2이다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 α-MSH에 의해 유도된 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현 변화 양상에 미치는 영향을 측정하였다.

1. 실험 과정

실험예 6에 기재된 사항과 동일한 과정으로 측정하였다.

2. 실험 결과

도 9는 홍삼박 메탄올 추출물의 농도에 따른 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현 촉진 효능을 나타낸 사진으로, 도 9를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, pMEK 활성은 α-MSH를 처리하였을 때 대조군에 비해 감소하고 홍삼박 90% 메탄올 추출물 0.0313 ㎎/ml을 함께 처리할 때부터 증가하는 것으로 나타났다. 또한 pERK1/2 활성은 α-MSH를 처리하였을 때 대조군에 비해 감소하고 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 함께 처리하였을 때부터 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.

α-MSH는 MEK 활성을 증가시켜 인산화(pMEK)시키고 pMEK는 ERK 활성을 증가시켜 인산화(pERK1/2)시킴으로써 MITF를 분해한다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 MEK 및 ERK 활성을 증가시켜 인산화반응을 촉진시킴으로써 MITF 분해를 촉진하여 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

또한 배양시간에 따른 ERK 신호전달 통로를 통한 단백질 발현의 변화 양상을 알아보았다. 홍삼박 90% 메탄올 추출물은 단백질 발현의 증가가 일어나기 시작한 최소 농도인 0.0156 ㎎/ml를 시료에 처리하여 세포배양과 동일한 방법으로 3일 동안 배양하였고, 단백질 발현은 배양한 다음날부터 3일 동안 측정하였다.

도 10은 홍삼박 메탄올 추출물의 배양시간에 따른 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK 발현 촉진 효능을 나타낸 사진으로, 도 10을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, ERK1/2 및 pERK1/2 활성은 배양 시간에 의존적으로 증가하였고, MEK 활성은 배양 후 증가하였다가 6시간 이후부터 조금씩 감소하여 처음과 비슷한 수치로 감소하는 것으로 나타났다. 또한 pMEK 활성은 배양 시간에 따라 감소하다가 12시간 이후부터 조금씩 증가하는 것으로 나타났다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 MEK 및 ERK 활성을 증가시켜 인산화반응을 촉진시킴으로써 MITF 분해를 촉진하여 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 8. 홍삼박 메탄올 추출물 처리시의 p38 MAPK 신호전달 통로 관련 단백질 발현 저해 효능

홍삼박 90% 메탄올 추출물이 α-MSH에 의해 유도된 p38 MAPK 신호전달 통로를 통한 멜라닌 합성에 관련된 주요 단백질인 CREB, pCREB, p38 및 pp38 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해, CREB, pCREB, p38 및 pp38 발현의 변화 양상을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정하였다.

1. 실험 과정

실험예 6에 기재된 사항과 동일한 과정으로 측정하였다. 단, 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 농도를 농도별로 0 ㎎/ml, 0.0156 ㎎/ml, 0.0313 ㎎/ml, 0.0625 ㎎/ml, 0.125 ㎎/ml로 처리하였다.

2. 실험 결과

도 11은 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 CREB, pCREB, p38 및 pp38 발현 저해 효능을 나타낸 사진으로, 도 11을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 모든 단백질 발현은 α-MSH를 처리하였을 때 대조군에 비해 증가하고 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 함께 처리할 때부터 농도 의존적으로 감소하였다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 p38 발현을 감소시켜 α-MSH의 활성을 감소시키며 이로 인해 CREB 발현 및 인산화가 감소되어 멜라닌 합성이 저해된다는 결론을 도출할 수 있었다.

실험예 9. 홍삼박 메탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 기작 입증

1. 실험 과정

홍삼박 90% 메탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 기작을 정확히 입증하기 위하여, α-MSH 200 nM로 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 멜라노마 세포에 ERK 신호전달 통로를 저해하는 PD98059를 10 uM 전처리한 후, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 농도별로 처리하여 3일 동안 배양하였다.

2. 실험 결과

도 12는 PD98059로 유도된 멜라닌 함량 증가 양상을 나타낸 그래프로, 도 12를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, PD98059가 처리되지 않은 군에서는 멜라닌 합성이 시간 및 농도의존적으로 저해되었다. 그러나 PD98059가 처리된 군에서는 멜라닌 함량이 다시 증가하였다. 이는 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 처리되었을시에도 동일한 결과였으며, 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 효능이 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

도 13은 PD98059 처리시의 멜라닌 함량 변화 양상을 나타낸 사진으로, 도 13을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, PD98059가 처리되지 않은 군에서는 멜라닌 합성이 저해되어 멜라닌 함량이 낮았으나, PD98059가 처리된 군에서는 멜라닌 함량이 높았다. 이는 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 처리되었을시에도 동일한 결과였으며, 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 효능이 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물은 ERK 신호전달 통로를 활성화하는 기작으로 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 10. 홍삼박 메탄올 추출물의 티로시나제의 활성 저해 기작 입증

1. 실험 과정

홍삼박 90% 메탄올 추출물의 티로시나제의 활성 저해 기작을 확실히 입증하기 위하여, α-MSH 200 nM로 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 멜라노마 세포에 ERK 신호전달 통로를 저해하는 PD98059를 10 uM 전처리한 후, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 농도별로 처리하여 3일 동안 배양하였다.

2. 실험 결과

도 14는 PD98059 처리시의 티로시나제 활성 변화 양상을 나타낸 사진으로, 도 14를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, PD98059가 처리되지 않은 군에서는 티로시나제 활성이 농도의존적으로 저해되어 티로시나제의 활성이 낮았다. 그러나 PD98059가 처리된 군에서는 티로시나제의 활성이 증가되어 티로시나제의 활성이 높았다. 이는 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 처리되었을시에도 동일한 결과였으며, 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 티로시나제 활성 저해 효능이 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물은 ERK 신호전달 통로를 활성화하는 기작으로 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 11. 홍삼박 메탄올 추출물의 PKA 신호전달 통로 관련 단백질 발현 저해 기작 입증

1. 실험 과정

PKA 신호전달 통로에서의 멜라닌 합성과 관련된 주요 단백질 TPR1, TPR2, 티로시나제 및 MITF의 발현을 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 저해하는 기작을 확실히 입증하기 위하여, α-MSH 200 nM로 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 멜라노마 세포에 ERK 신호전달 통로를 저해하는 PD98059를 10 uM 전처리한 후, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 농도별로 처리하여 3일 동안 배양하고 시간별로 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

2. 실험 결과

도 15는 PD98059 처리시 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현을 나타낸 사진으로, 도 15를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험예 6을 참고하여 실험 결과를 비교 분석해 보면, 실험예 6에서는 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 시간별로 0.0156 mg/ml 처리한 후 단백질의 발현을 확인하였는데 TRP-1의 발현은 홍삼박 90% 메탄올 추출물 처리 12시간 후부터 감소하였으며, TRP-2과 티로시나제의 발현은 홍삼박 90% 메탄올 추출물 처리 6시간 후부터 감소하였다.

반면, PD98059를 처리한 본 실험에서는 TRP-1의 발현이 홍삼박 90% 메탄올 추출물 처리 후 24시간 후부터 약간 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, TRP-2과 티로시나제의 발현 역시 홍삼박 90% 메탄올 처리 24시간 후부터 감소하였다. PD98059가 단백질 발현의 감소를 저해하였기 때문에, 단백질 발현의 감소 시작 시점이 느려졌음을 알 수 있다.

실험예 12. 홍삼박 메탄올 추출물의 ERK 신호전달 통로 관련 단백질 발현 저해 기작 입증

1. 실험 과정

ERK 신호전달 통로에서의 멜라닌 합성과 관련된 주요 단백질 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 저해하는 기작을 확실히 입증하기 위하여, α-MSH 200 nM로 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 멜라노마 세포에 ERK 신호전달 통로를 저해하는 PD98059를 10 uM 전처리한 후, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 시간별로 0.0156 mg/ml 처리하여 3일 동안 배양하고 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

2. 실험 결과

도 16은 PD98059 처리시 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 나타낸 사진으로, 도 16을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현 변화 양상을 관찰할 수 있었다.

실험예 13. 홍삼박 메탄올 추출물의 PKA 신호전달 통로 및 ERK 신호전달 통로 관련 단백질 발현 저해 기작 입증

1. 실험 과정

PKA 신호전달 통로에서의 멜라닌 합성과 관련된 주요 단백질인 티로시나제, TRP-1, TRP-2와, ERK 신호전달 통로에서의 멜라닌 합성과 관련된 주요 단백질인 pERK1/2, pMEK의 발현을 홍삼박 90% 메탄올 추출물이 저해하는 기작을 확실히 입증하기 위하여, α-MSH 200 nM로 멜라닌 합성이 유도된 B16F10 멜라노마 세포에 ERK 신호전달 통로를 저해하는 PD98059를 10 uM 전처리한 후, 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 농도별로 처리하여 3일 동안 배양하고 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

2. 실험 결과

실험예 11 및 실험예 12에서는 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 농도를 고정하고 시간별로 처리하였는데, 단백질 발현 감소 시작 시점이 느려지는 결과가 도출되었다. 본 실험에서는 홍삼박 90% 메탄올 추출물을 농도별로 처리하여 비교하고자 하였다.

도 17은 PD98059를 처리 후 홍삼박 90% 메탄올 추출물의 농도별로 처리하여 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MITF, pERK1/2 및 pMEK의 발현을 나타낸 사진으로, 도 17을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 발현이 저해되었던 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, ERK와 MEK의 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이로써, 홍삼박 90% 메탄올 추출물은 PD98059 처리시에는 시간과 농도에 관계없이 영향을 미치지 못하며, 홍삼박 90% 메탄올 추출물은 ERK 신호전달 통로를 활성화하는 기작으로 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 14. 여정실 추출물의 세포독성 분석

실험예 14 이하에 기재된 모든 실험예에서는 제조예 2의 과정으로 제조된 추출물을 사용하였음을 밝혀둔다.

1. 실험 과정

24-웰 플레이트(well plate)에 한 웰당 5×10³개의 세포를 심고 여정실을 12.5, 25, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 처리하여 세포를 3일 동안 배양하고 MTT 용액을 처리하였다.

2. 실험 결과

도 18은 여정실 추출물 처리시의 세포 생존율을 나타낸 그래프로, 도 18을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 여정실 추출물 12.5, 25, 50, 100 ㎍/ml에서 각각 94%, 90%, 90%, 91%의 생존율을 보였다.

이로써, 여정실 추출물은 어떤 농도에서도 세포독성이 없음을 확인할 수 있다.

실험예 15. 여정실 추출물의 티로시나제 활성 저해 효능

1. 실험 과정

여정실 추출물 25, 50 ㎍/ml를 처리한 B16F10 멜라노마 세포를 3일간 배양한 후 관찰하였다.

2. 실험 결과

도 19는 여정실 추출물 처리시의 티로시나제 활성 저해 효능을 나타낸 그래프로, 도 19를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 어떤 처리도 하지 않은 대조군을 100%로 설정하여 기준으로 설정하였을 때 여정실 추출물 25 ㎍/ml를 처리한 군은 62%로, 50 ㎍/ml를 처리한 군은 33%로 티로시나제 활성이 감소하였다.

이로써, 여정실 추출물이 티로시나제 활성을 저해하였다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 16. 여정실 추출물의 α-MSH로 유도된 티로시나제 활성 저해 효능

1. 실험 과정

실험예 6에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

도 20은 여정실 추출물 처리시의 α-MSH로 유도된 티로시나제 활성 저해 효능을 나타낸 그래프로, 도 20을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, α-MSH 단독 처리시 티로시나제의 활성도는 359%로 증가하였으나, 여정실 25 ㎍/ml와 α-MSH의 처리군은 289%로 티로시나제의 활성도가 감소하였으며, 여정실 50 ㎍/ml와 α-MSH의 처리군은 175%로 티로시나제 활성도가 감소하였다.

이로써, 여정실 추출물이 α-MSH로 유도된 티로시나제의 활성을 저해하였다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 17. 여정실 추출물의 세포 내 멜라닌 합성 저해 효능

1. 실험 과정

여정실 추출물을 B16F10 멜라노마 세포에 25, 50 ㎍/ml로 처리하고 3일간 배양한 후 세포 내의 멜라닌 함량을 측정하였다.

2. 실험 결과

도 21은 여정실 추출물 처리시 멜라닌 합성의 저해 효능을 나타낸 그래프로, 도 21을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 대조군에서는 100% 였던 멜라닌 함량은 여정실 추출물 25 ㎍/ml 처리군에서는 88%로 나타났으며 여정실 추출물 50 ㎍/ml 처리군에서는 64%로 나타났다.

이로써, 여정실 추출물은 세포 내 멜라닌 합성 저해 효능이 있다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 18. 여정실 추출물의 α- MSH 로 유도된 멜라닌 합성 저해 효능

1. 실험 과정

α-MSH와 여정실 추출물을 B16F10 멜라노마 세포에 25, 50 ㎍/ml로 처리하고 3일간 배양한 후 세포 내의 멜라닌 함량을 측정하였다. 대조군에는 어떤 처리도 하지 않았다.

2. 실험 결과

도 22는 여정실 추출물 처리시 α-MSH로 유도된 멜라닌 합성의 저해 효능을 나타낸 그래프로, 도 22를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 대조군의 멜라닌 함량을 100% 기준으로 설정하여 실험군들과 비교하였다. α-MSH 단독 처리군의 세포 내의 멜라닌 함량은 220%로 증가하였으며, 여정실 추출물 25 ㎍/ml와 α-MSH를 처리한 군에서는 187%로 감소하였고, 여정실 추출물 50 ㎍/ml와 α-MSH를 처리한 군에서는 139%로 더욱 감소하였다.

이로써, 여정실 추출물이 B16F10 멜라노마 세포에서 α-MSH로 유도된 멜라닌 합성을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 19. 여정실 추출물의 멜라닌 합성 관련 단백질 발현에 대한 저해 효능

1. 실험 과정

여정실 추출물이 멜라닌 합성과 관련된 단백질인 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 여정실 추출물 50 ㎍/ml을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2를 대상으로 웨스턴 블롯을 실행하였다.

2. 실험 과정

도 23은 여정실 추출물 처리시 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현 저해 효능을 나타낸 사진으로, 도 23을 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, 여정실 추출물 50 ㎍/ml 처리군에서 티로시나제의 발현이 감소하였으며, TRP-1, TRP-2의 발현은 큰 차이를 보이지 않았다.

이로써, 여정실 추출물은 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 20. 여정실 추출물의 α- MSH 에 의한 과색소 침착시의 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 저해 효능

1. 실험 과정

α-MSH에 의하여 세포 내에 색소가 과다하게 침착되었을시 여정실 추출물이 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 α-MSH 전처리 후 여정실 추출물 50 ㎍/ml을 처리한 B16F10 멜라노마 세포의 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2를 대상으로 웨스턴 블롯을 실행하였다. 웨스턴 블롯 과정은 실험예 6에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행되었다.

2. 실험 결과

도 24는 여정실 추출물의 α-MSH에 의한 과색소 침착시의 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 저해 효능을 나타낸 사진으로, 도 24를 참고하여 결과를 분석하여 보았다. 실험 결과, α-MSH 처리군은 대조군에 비해 티로시나제의 발현양이 현저하게 증가하였으나, 여정실 추출물 50 ㎍/ml 처리군에서는 감소하였음을 관찰할 수 있었다.

TRP-1은 α-MSH에 의한 증가는 관찰되지 않았으며, 여정실 추출물 처리 시에도 변화 양상는 관찰되지 않았다.

TRP-2는 α-MSH 단일 처리군에서 발현이 현저히 증가하였으며, 여정실 추출물 처리시 변화 양상는 관찰되지 않았다.

이로써, 여정실 추출물은 α-MSH 처리시 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 저해하는 효능이 있다는 결론을 도출할 수 있었다.

한편, 상기에서 제조예 및 실험예를 이용하여 서술한 것은, 본 발명의 주요 사항만을 서술한 것으로, 그 기술적 범위 내에서 다양한 설계가 가능한 만큼, 본 발명이 이에 한정되는 것이 아님은 자명하다.

Claims (6)

1. 홍삼박 메탄올 추출물 또는 여정실 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 홍삼박 메탄올 추출물 및 상기 여정실 추출물은 세포독성이 없는 효능, 세포 내 티로시나제의 활성을 저해하는 효능, α-MSH로 활성화된 세포 내 티로시나제의 활성을 저해하는 효능, 세포 내 멜라닌 함량을 감소시키는 효능, 세포 내 α-MSH로 활성화된 멜라닌 함량을 감소시키는 효능, 세포 내 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 저해하는 효능, α-MSH에 의한 과색소 침착시의 멜라닌 합성을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 미백 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 홍삼박 메탄올 추출물은 세포 내 MITF, CREB, pCREB, p38 및 pp38의 발현을 저해하는 효능, 세포 내 ERK1/2, pERK1/2, MEK 및 pMEK의 발현을 촉진하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 미백 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 홍삼박 메탄올 추출물의 농도는 0.0156~0.25 mg/ml(세포기준), 상기 여정실 추출물의 농도는 12.5~100 ㎍/ml(세포 기준)인 것을 특징으로 하는 미백 조성물.
   
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 조성물에 미용학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가한 화장료 조성물.
   
6. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 조성물에 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가하되, 홍삼박 메탄올 추출물이 포함될 경우에는 잔류 메탄올 성분을 제거하는 공정을 추가한 후에 상기 첨가제를 첨가하여 제조한 미백용 건강 기능 식품.

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