KR20140132770A

KR20140132770A - 분비-유사 면역글로불린을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20140132770A
Application number: KR1020147028261A
Authority: KR
Inventors: 블라이세 코르테시; 스테파니 롱젯; 마리우스 룃셔; 실비아 미셰르; 아드리안 취르허
Original assignee: 체에스엘 베링 아게
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2014-11-18
Also published as: US10385117B2; RU2014140744A; CN104254542A; RU2644240C2; NZ629072A; WO2013132052A1; US10221233B2; BR112014022240A2; CN111116735A; JP2019038834A; US20190256577A1; JP2021038246A; AU2013201393B2; AU2013201393A1; EP2822967A1; SG11201404958SA; JP2015510875A; EP2822967B1; CA2866634C; US20150056180A1

Abstract

본 발명은, 분비-유사 면역글로불린, 특히, 분비-유사 IgA 및/또는 분비-유사 IgM을 포함하는 조성물의 제조 방법, 및 당해 방법으로 수득할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

분비-유사 면역글로불린을 포함하는 조성물{COMPOSITIONS COMPRISING SECRETORY -LIKE IMMUNOGLOBULINS}

조성물

본 발명은, 분비-유사 면역글로불린, 특히, 분비-유사 IgA 및/또는 분비-유사 IgM을 포함하는 조성물의 제조 방법, 및 당해 방법에 의해 수득가능한 조성물에 관한 것이다.

IgA는, 사람 혈장에서 IgG 다음으로 두번째로 가장 풍부한 Ig 부류이고, 여기서, 이는 0.88 내지 4.10g/L로 발견된다. 분자의 힌지 영역에서의 유의한 차이로 인한 이들의 항원 다양성 뿐만 아니라 중쇄 및 경쇄를 연결하는 이들의 이황화물 결합도 상이한 2가지 소부류의 IgA, IgA1 및 IgA2가 존재한다(도 1)[참조: Zuercher AW et al. Plasma derived immunoglobulins. Principles of Immunopharmacology. 3rd ed. Birkhauser, 2011: p. 271-301]. 두 가지 소부류의 글리코실화 패턴은 상이하다: 두 가지 소부류의 중쇄는 N-글리코실화되며; 이와 대조적으로, IgA2의 절삭된 힌지 영역(truncated hinge region)으로 인하여, O-글리코실화는 IgA1에서 발견되지만 IgA2에서는 발견되지 않는다.

사람 IgA는 2개의 주요 형태로 발견된다: 혈액/혈장에서 순환하거나 점막 표면으로 분비된다. 혈장에서, IgA는 주로 단량체로서 존재하고(80 내지 90%) 골수 혈장 세포에 의해 생산되며; 혈장 중의 주요 소부류는 IgA1이다.

용어 "중합체성 IgA(pIgA)"는, 이들의 "테일-피스(tail-piece)"에서 연결(joining)(J) 쇄에 의해 공유결합적으로 연결된(joined) 이량체성, 때때로 사량체성, IgA를 기술한다(도 1).

IgM 분자는 총 혈청 Ig 함량의 10%를 구성한다. 이들은 혈관내 풀(intravascular pool)에 주로 국한되며, 주요한 항원-특이적 체액성 면역 반응의 일부이고; 계통발생적으로 및 개체발생적으로 이들은 가장 빠른 항체(Ab) 분자이다. IgM은, 주로, J 쇄에 의해 결합된 오량체로서 존재하며, 평면 구조로 배열되고; 때때로, IgM은 또한 J 쇄가 결여되어 있는 육량체 형태로 발견될 수 있다(참조: Zuercher AW et al. Plasma derived immunoglobulins. Principles of Immunopharmacology. 3rd ed. Birkhauser, 2011 : p. 271-301).

소화관, 호흡관 및 비뇨생식관 뿐만 아니라 외분비선 관의 점막 표면은, 외부 환경으로부터 신체의 내부 구획을 분리하는 치밀한 장벽을 형성하는 상피 세포의 층들에 의해 라이닝된다. 사람에서, 이러한 광범위한 표면은, 외인성 병원체에 영구적으로 노출되는 면적 400m²를 덮는다(참조: Corthesy, B. (2010) Future Microbiol. 5:817-829). 선천적 및 유도성 세포 및 분자 메커니즘의 조합은 미생물에 의한 콜로니화 및 진입/침입에 대한 보호를 보장한다. 건강한 개체에서, 분비성 IgA(SIgA)는 점막 표면의 내강 측에서의 면역 배제의 기능을 충족하는 가장 풍부한 항체(Ab)이고[참조: Macpherson, A.J. et al. (2008) Mucosal Immunol. 1:11-22], 반면, 분비성 IgM Ab는 IgA-결핍 환자에서 흡수된다. SIgA는 장내 고유판(intestinal lamina propria), 상부 호흡관 또는 비뇨생식관의 점막성 혈장 세포에 의해 합성된다. SIgA는 pIgA 이량체, 및 대략 75 kDa의 고도로 글리코실화된 분비 성분(SC)으로 이루어지며(도 1); 유사하게, SC와 회합된 오량체성 J 쇄-함유 IgM은 SIgM을 구성한다. SC는 중합체성 Ig 수용체(pIgR)의 세포외 부분을 나타낸다. pIgR은 생산 부위로부터 점막 표면으로의 pIgA 또는 오량체성 IgM의 경상피 수송(trans-epithelial transport)을 위해 필요하며, 여기서, pIgR-pIgA/pIgR-IgM 복합체는 효소적 개열에 의해 SIgA/SIgM으로 전환된다(참조: Zuercher AW et al. Plasma derived immunoglobulins. Principles of Immunopharmacology. 3rd ed. Birkhauser, 2011: p. 1-31]. SC와의 회합은 단백질 분해적 소화로부터 IgA 또는 IgM을 보호한다. SIgA는 타액, 기관-기관지, 초유, 우유(milk), 눈물액, 장 분비물 및 비뇨생식 분비물과 같은 장점액 분비물에서 우세한 Ig이다. 이는 점막 라이닝(및 따라서 사람 신체)에서 생산된 가장 현저한 Ig이고; 대략 3 내지 5g의 SIgA가 매일 장 내강으로 분비된다. SIgA는, 따라서, 면역 배제에 대하여 필수적이며, 상피 통합성을 유지하기 위해 필수적이다. SIgM은 보다 낮은 수준에서 존재하지만 SIgA와 동일한 면역 배제 기능을 충족한다.

폴리오바이러스, 살모넬라 또는 인플루엔자와 같은 몇몇의 병원체에 관해서, 점막 감염에 대한 보호는, 허가된 백신으로의 활성 점막 면역화에 의해 유도할 수 있다. 그러나, 대부분의 점막 병원체에 관해서, 어떠한 활성 점막 백신도 이용 불가능하다. 대안으로, Ab의 보호 수준은 수동적 면역화에 의해 점막 표면으로 직접 전달될 수 있다. 사실상, 이는 우유를 통해 이들의 새끼에게 모계 항체를 이동시킴으로써 많은 포유동물 종에서 생리학적으로 발생한다[참조: Brandtzaeg, P. (2003) Vaccine 21:3382-3388]. 수동적 점막 면역화를 이용한 사람 및 동물 연구는, 경구, 비강내, 자궁내 또는 폐 점적주입(lung instillation)에 의해 투여된 pIgA 및 SIgA 항체 분자가 세균 및 바이러스 감염을 예방, 감소 또는 치유할 수 있음을 입증해 왔다(참조: Corthesy, B. (2003) Curr. Pharm. Biotechnol. 4:51-67]. 그러나, 점막 표면에서 천연적으로 발견되는 IgA의 분비 형태는 드물게 사용되었고, SIgA를 대량 생산하는 것은 현재까지 가능하지 않다. 생물공학적 방법을 사용한 SIgA의 작제는 도전과제이지만 이러한 분자는 중요한 임상학적 적용을 가질 수 있었다(참조: Corthesy, B. (2002) Trends Biotechnol. 20:65-71]. 동일한 것이 또한 분비 성분-함유 IgM에 적용된다.

발명의 요약

놀랍게도, 본원의 발명자들은, 혈장-유도된 J 쇄-함유 면멱글로불린, 특히 IgA 및/또는 IgM을, J 쇄-함유 면역글로불린을 먼저 정제할 필요없이 분비 성분과 조합할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 예를 들면, 대상체, 특히 사람 대상체에서 점막 표면의 감염의 예방 및 치료를 위해, 의약에서 사용할 수 있는 분비-유사 IgA 및/또는 IgM을 대량 생산하기 위한 문호를 개방한다.

본 발명의 한 가지 양상은,

(a) 정제되지 않은 형태의, J 쇄를 함유하는 면역글로불린, 특히 IgA 및/또는 IgM을 포함하는 혈액-유도된 단백질 조성물을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 조성물을 분비 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 분비-유사 면역글로불린, 특히, IgA 및/또는 IgM을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이다.

바람직하게는, 분비-유사 면역글로불린은 분비-유사 IgA이다. 바람직하게는, 단계 (a)의 조성물은 적어도 5%의 J 쇄 함유 IgA, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30%, 가장 바람직하게는 적어도 50%의 J 쇄-함유 IgA를 함유한다. 바람직하게는, 단계(a)의 조성물은 사람 혈액, 예를 들면, IgA 또는 심지어 J 쇄-함유 IgA가 풍부한 사람 혈장 또는 이의 분획으로부터 유도되지만, J 쇄-함유 IgA의 정제는 필요하지 않다.

바람직하게는, 분비-유사 면역글로불린은 분비-유사 IgM이다. 바람직하게는, 단계(a)의 조성물은 적어도 5%의 J 쇄-함유 IgM, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30%, 가장 바람직하게는 적어도 50%의 J 쇄-함유 IgM을 포함한다. 바람직하게는, 단계(a)의 조성물은 사람 혈액, 예를 들면, IgA 또는 심지어 J 쇄-함유 IgA가 풍부한 사람 혈장 또는 이의 분획으로부터 유도되지만, J 쇄-함유 IgA의 정제는 필요하지 않다.

단계(b)에서 사용된 분비 성분은 바람직하게는 포유동물 세포주에 의해 생산된, 바람직하게는 재조합체 분비 성분, 보다 바람직하게는 사람 재조합체 분비 성분이다. 그러나, 우유, 타액, 점액 또는 유사한 공급원으로부터 정제된 분비 성분과 같은, 천연 공급원으로부터의 분비 성분이 사용될 수도 있다.

단계(a)의 조성물 중의 IgA 이량체/중합체(다량체) 또는 IgM 오량체 내의 분비 성분과 J 성분 사이의 몰 비는 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1이다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 단계(a)의 조성물 내의 분비 성분과 J 쇄 사이의 몰 비는 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1의 범위이다.

본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 분비-유사 IgA 및/또는 분비-유사 IgM 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물이다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 양상은 의학적 용도에 대하여 위에서 기술한 조성물이다.

발명의 상세한 설명

위에서 이미 언급한 바와 같이, 본원의 발명자들은 놀랍게도, 혈장-유도된 J 쇄-함유 면역글로불린, 특히 J 쇄-함유 IgA 및/또는 J 쇄-함유 IgM을 J 쇄-함유 면역글로불린을 먼저 정제할 필요없이 분비 성분과 조합할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 예를 들면, 대상체, 특히 사람 대상체에서 점막 표면의 감염의 예방 및 치료를 위해, 의약에서 사용할 수 있는 분비-유사 IgA 및/또는 IgM을 대량 생산하기 위한 문호를 개방한다.

본 발명의 한 가지 양상은,

(a) 정제되지 않은 형태의, J 쇄를 함유하는 IgA 또는 J 쇄를 함유하는 IgM을 포함하는 혈액-유도된 단백질 조성물을 수득하는 단계; 및

(b) 단계(a)의 조성물을 분비 성분과 혼합하는 단계를 포함하여, 시험관 내에서, 분비-유사 면역글로불린, 특히 분비-유사 IgA 및/또는 분비-유사 IgM을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이다.

바람직하게는, 단계 (a)의 조성물은 적어도 5% (w/w) J 쇄-함유 IgA, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70% J 쇄-함유 IgA를 함유할 것이다. 바람직하게는, 단계 (a)의 조성물은 사람 혈액, 예를 들면 IgA 또는 심지어 J 쇄-함유 IgA가 풍부한 사람 혈장 또는 분획으로부터 유도되지만, J 쇄-함유 IgA 이량체 또는 중합체에 대한 특정한 정제 단계는 필요하지 않다. 따라서, J 쇄-함유 IgA는 단량체성 IgA, IgM, 또는 IgG와 같은 기타 단백질을 또한 함유하는 조성물 중에 존재할 것이다. 예를 들면, 당해 조성물은 10% 이상의 단량체성 IgA, 및/또는 10% 이상의 IgG, 및/또는 10% 이상의 IgM을 포함할 수 있다. J 쇄-함유 이량체성 IgA에 대한 농축은, IgG, 알부민, 알파-1 안티트립신 및 응고 인자와 같은 혈장 단백질을 정제하기 위한 사람 혈장 분획의 처리 부분으로서 발생할 수 있지만, 관련 분자 질량의 친화성 크로마토그래피 또는 크기 배제 및 선택과 같은, 다른 단백질로부터 J 쇄-함유 이량체성 IgA 또는 중합체를 분리하도록 구체적으로 설계된 정제 단계는 단계(a)의 조성물을 수득하기 위해 필요하지 않다.

본 발명의 또 다른 바람직한 양상에서, 단계(a)의 조성물은 적어도 5% (w/w) J 쇄-함유 IgM, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70% J 쇄-함유 IgM을 포함한다. 바람직하게는, 단계 (a)의 조성물은 사람 혈액, 예를 들면, IgM 또는 심지어 J 쇄-함유 IgM이 풍부한 사람 혈장 또는 이의 분획으로부터 유도되지만, J 쇄-함유 IgM에 대한 특정한 정제 단계는 필요하지 않다. 따라서, J 쇄-함유 IgM은 IgA 또는 IgG와 같은 다른 단백질을 추가로 함유하는 조성물 속에 존재할 것이다. 예를 들면, 당해 조성물은 10% 이상의 IgA, 및/또는 10% 이상의 IgG를 포함할 수 있다. J 쇄-함유 IgM에 대한 농축은, IgG, 알부민, 알파-1 안티트립신 및 응고 인자와 같은 혈장 단백질을 정제하기 위한 사람 혈장 분획의 처리 부분으로서 발생할 수 있지만, 관련 분자 질량의 친화성 크로마토그래피 또는 크기 배제 및 선택과 같은, 다른 단백질로부터 J 쇄-함유 IgM을 분리하도록 구체적으로 설계된 정제 단계는 단계(a)의 조성물을 수득하기 위해 필요하지 않다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "분비 성분"은, J-쇄-함유 면역글로불린에 특이적으로 결합하고, 중합체성 면역글로불린 수용체(pIgR), 바람직하게는 포유동물 pIgR, 보다 바람직하게는 영장류 pIGR, 가장 바람직하게는 사람 pIgR의 세포외 부분과 관련되거나 이로부터 유도가능하거나 이와 동일한 단백질을 나타낸다. 바람직하게는, 분비 성분은 J-쇄 함유 면역글로불린에 증가된 안정성을 부여한다. 당해 조성물에 포함된 분비 성분은 재조합체 분비 성분, 바람직하게는 포유동물 세포주에서 생산된 분비 성분일 수 있다. 이의 전통적인 협소한 의미(본원에서 "천연 분비 성분"으로 언급됨)에서의 분비 성분은, 분비 동안에 J 쇄를 함유하는 이량체성 또는 중합체성 IgA 또는 오량체성 IgM과 통상적으로 회합되는, 중합체성 면역글로불린 수용체(pIgR)의 세포외 부분이다. J 쇄-함유 IgA/IgM은 상피 세포의 기저외측 표면(basolateral surface)에서 중합체성 면역글로불린 수용체에 결합하고 트랜스사이토시스(transcytosis)에 의해 세포 내로 흡수된다. 이러한 수용체 복합체는 이후에 세포 구획(compartment)을 통해 전이된 다음 상피 세포의 루멘 표면으로 이동된다. 트랜스사이토시스된 IgA/IgM-pIgR 복합체는 이후에 단백질 분해를 통해 방출되고, 천연 분비 성분으로 언급된 중합체성 면역글로불린 수용체(pIgR)의 일부는 J 쇄-함유 IgA/IgM와 회합된 채로 잔류하여 분비성 IgA/IgM을 방출한다. 기저외측 표면에 대한 루멘 표면으로부터, IgA의 역 트랜스사이토시스가 또한 발생할 수 있다.

사람 pIgR은 클로닝되고 서열분석되고, 이의 서열은 스위스프로트 엔트리(SwissProt entry) P01833으로서 이용가능하며, 서열번호 1에 나타낸다. 사람 pIgR은 시그날 펩타이드(잔기 1 내지 18), 세포외 부분(잔기 19 내지 638), 막관통 영역(잔기 639 내지 661 ), 및 세포질 영역 잔기 662 내지 764)를 포함하는, 764개 아미노산 잔기를 갖는 당단백질이다. 잔기 19 내지 603은 상기한 J 쇄-함유 IgA와 회합된 것으로 고려되며, 당해 당단백질의 당해 부분은 대개 분비 성분(본원에서 "천연 분비 성분"으로 언급됨)으로 언급된다.

본 발명의 조성물에 사용된 분비 성분은, J 쇄-함유 IgA와 회합할 수 있는 어떠한 세포외 pIgR 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 분비 성분은 포유동물 공급원, 예를 들면, 영장류, 소, 말, 고양이, 개, 토끼, 기니 피그, 랫트 또는 마우스로부터의 pIgR의 세포외 도메인, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상이한 종으로부터의 면역글로불린-유사 도메인을 분비 성분-유사 단백질 내로 융합시켜 제조한, 수개의 포유동물 종 또는 이의 변이체로부터의 세포외 도메인의 기능적 하이브리드를 또한 본 발명에서 사용하기 위해 고려한다. 기능적 분비 성분은 또한, 일반적으로 존재하는 면역글로불린-유사 도메인의 선택을 융합시킴으로써 형성할 수 있으며, 예를 들면, 단지 도메인 1, 4 및 5로 구성되는 토끼 분비 성분은 기능성이다. 바람직하게는, 그러나, 사람 분비 성분 또는 이의 기능적 변이체가 사용된다.

따라서, 본 발명의 조성물에 사용된 분비 성분은 바람직하게는 서열번호 1의 잔기 19 내지 603 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 기능적 변이체는 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 치환은 보존적 치환이며, 예를 들면, 염기성 아미노산 잔기는 또 다른 염기성 아미노산으로 치환되고, 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산 등으로 치환된다. 변이체 분비 성분은 서열번호 1의 잔기 19 내지 603과 서열에서 적어도 50% 동일하며, 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 또는 심지어 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 92%, 94%, 95%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 동일하다. 바람직하게는, 분비 성분은 pIgR의 세포외 부분, 보다 바람직하게는 사람 pIgR의 세포외 부분을 포함하며, 가장 바람직하게는 분비 성분은 서열번호 1의 잔기 19 내지 603을 포함하거나 심지어 이들로 이루어진다

숙련가는 재조합 기술에 의해 분비 성분을 생산하는 방법을 잘 알고 있다. CHO 세포 중의 사람 분비 성분의 발현의 예는 문헌[참조: Phalipon et al (Phalipon A et al (2002) Immunity 17:107-115)]에 기술되어 왔지만, 본 발명은 이러한 시스템에 의해 생산된 분비 성분에 제한되지 않는다. 예를 들면, 목적하는 cDNA 서열은 합성적으로 생산할 수 있거나 주형으로서 pIgR을 발현하는 세포 또는 조직을 사용하여, RT-PCR을 통해 클로닝할 수 있다. cDNA는 이후에 pcDNA3와 같은 포유동물 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다 - 많은 대안적 발현 벡터들이 이용가능하다. 재조합체 발현 벡터는 이후에 적합한 숙주 세포주, 예를 들면, CHO, Cos, HEK293, 또는 BHK 내로 도입될 것이다. 다른 세포주들이 이용가능하며 또한 사용될 수 있다. 이러한 벡터를 세포주 내로 도입시키는 방법은 리포펙션(lipofection), 전기 천공 및 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 다른 기술을 포함한다. 일반적으로 발현 벡터를 지니고 목적하는 단백질을 발현하는 세포가 이후에 선택되고 클로닝된다. 바이러스 발현 시스템이 또한 사용될 수 있고, 예를 들면, 우두 바이러스를 사용하여 포유동물 세포에서 높은 수준으로 단백질을 발현할 수 있고, 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포에서 높은 수준으로 단백질을 발현할 수 있다. 효모 또는 세균 발현 시스템을 또한 고려할 수 있으며, 이러한 발현 시스템은 당업자에게 공지되어 있다. 마찬가지로, 식물 발현 시스템을 또한 고려할 수 있으며, 이러한 시스템은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 조성물에서 사용된 분비 성분 또는 이의 변이체는 또한, 수득되는 단백질의 정제 시 도움을 줄 수 있는 태그(tag), 예를 들면, 헥사-히스티딘 태그를 포함할 수 있다. 이러한 태그가 절단가능한 링커를 통해 부착되는 경우, 태그는 본 발명에서 사용하기 전에 분리할 수 있다. 유사하게, 분비 성분은 융합 단백질로서 생산할 수 있다. 다시, 분리가능한 링커를 사용하여 융합 파트너가 본 발명에서 사용하기 전에 분비 성분을 분리할 수 있다.

당업자는 이후에 발현된 단백질을 표준 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 재조합체 분비 성분은 적합한 방법, 예를 들면, 크기-배제 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 고순도로 정제할 수 있다. 바람직하게는, 제조합체 분비 성분의 최종 제제는 오염물질, 특히 숙주 세포 단백질을 본질적으로 함유하지 않을 것이다. 그러나, 분비 성분은 또한 정제되지 않은 형태로 J-쇄 함유 면역글로불린과 특이적으로 회합될 수 있으므로, J-쇄-함유 면역글로불린과의 회합 전의 정제는 필수적이지 않다.

분비 성분은 또한 천연 공급원, 바람직하게는 우유, 타액 또는 점액으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 분비 성분은 사람 기원의 것이지만, 기타 종으로부터의 분비 성분이 또한 본 발명에 사용될 수 있다.

단계(a)의 조성물 중의 IgA 이량체/중합체 또는 IgM 오량체 내의 분비 성분과 J 쇄 사이의 몰 비는 1:10 내지 10:1 , 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1의 범위이다.

단계(a)의 조성물 내의 분비 성분과 J 쇄 사이의 몰 비는 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1이다.

단계(b)에서 사용된 분비 성분의 양은 단계(a)의 조성물 중의 적어도 1(중량)부의 분비 성분 내지 50(중량)부의 단백질, 바람직하게는 적어도 1부 내지 40, 30, 20, 15, 10, 가장 바람직하게는 적어도 1부의 분비 성분 내지 5부의 단백질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분비-유사 IgA를 함유하는 조성물이다. 본 발명의 여전히 또 다른 양상은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분비-유사 IgM을 포함하는 조성물이다. 여전히 추가의 양상은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 분비-유사 IgA 및 분비-유사 IgM을, 예를 들면, 10:1 내지 1 :10, 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 보다 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 몰 비로 포함하는 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 조성물 중의 IgA 및 IgM의 합한 함량은 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 보다 바람직하게는 70% 초과, 더욱 더 바람직하게는 80% 초과, 더욱 더 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 100%이다.

본 발명의 추가의 양상은 의학적 용도를 위한 위에서 기술한 조성물이다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 괴사성 장염, 및 일반적으로 점막 표면에서의 감염을 치료하는데 유리하게 사용할 수 있다.

조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 및/또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 이 조성물은 액체 형태로, 시럽으로서, 로션, 연고, 투여 전에 액체와 재구성될 수 있는 분말, 캡슐제, 환제, 겔, 크림, 젤리, 서방성 제형, 또는 의도된 의학적 용도에 적합한 어떠한 다른 제형으로 제형화될 수 있다. 예를 들면, GI 질병을 치료하기 위해, 조성물은 당해 조성물을 방출하기 위한 GI 관의 목적하는 영역에서 용해되는 보호 코팅으로 제형화될 수 있다. 이 조성물은 경구로 취해질 수 있고, 국소적으로, 장내로, 흡입에 의해, 또는 의도된 용도를 위한 어떠한 다른 적합한 경로로 투여될 수 있다. 경구 적용을 위해, 산 펌프 억제제가 동시 투여될 수 있다.

조성물 중의 단백질은, 예를 들면, 제형화되기 전에, 정용여과/한외여과 또는 다른 표준 방법을 사용하여 농축시킬 수 있다. 또한, 이 조성물은 동결건조시킨 다음, 사용 전에 적합한 용액과 재구성할 수 있다.

정의

용어 "분비-유사 IgA" 또는 "분비-유사 혈장 IgA"는, 단백질 분해적 소화로부터 일부 보호를 제공하는 작용을 하는, 분비 성분 또는 이의 기능성 변이체인 단백질과 조합된 J 쇄 함유 (혈장) IgA를 포함하는 것으로 의도된다. 전형적으로, J-쇄 함유 IgA는 시험관 내에서 분비 성분 또는 이의 변이체와 혼합될 것이며, 즉, 분비 성분과 J 쇄-함유 IgA 사이의 회합은 트랜스사이토시스 동안 보다는 시험관내에서 발생한다.

용어 "분비-유사 IgM"은 시험관 내에서 분비 성분 또는 이의 기능성 변이체와 조합된 J 쇄-함유 (혈장) IgM을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, J 쇄-함유 IgM은 오량체성 IgM일 것이다.

"J 쇄-함유 IgA 이량체 또는 중합체를 위한 특수한 정제 단계"는 기타 단백질, 예를 들면, 단량체성 IgA, 기타 면역글로불린, 및 기타 혈장 단백질로부터 J 쇄-함유 IgA 이량체 또는 중합체를 분리하도록 특수하게 설계된 정제 공정에서 포함될 수 있는 정제 단계에 관한 것이다. 이러한 특정한 정제 단계는, 예를 들면, J 쇄-함유 IgA 이량체에 상응하는 분자량의 단백질을 함유하는 분획을 선택하는 크기 배제 크로마토그래피 또는, J 쇄에 특이적으로 결합하는 리간드와의 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 혈장으로부터 조성물을 제조하는 공정은 IgA 또는 심지어 J 쇄-함유 IgA를 농축시키는 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있지만, J 쇄-함유 IgA는 특정하게 정제되지 않는다. 따라서, "정제되지 않은 형태의 J 쇄-함유 IgA"는 80% 미만의 J 쇄-함유 IgA, 전형적으로 70%, 60%, 또는 50% 미만의 J 쇄-함유 IgA를 함유하는 조성물을 나타내며, 이는 심지어 40%, 30%, 25%, 20%, 15% 미만 또는 심지어 10% 미만의 J 쇄 함유 IgA를 함유할 수 있다.

"J 쇄-함유 IgM을 위한 특수한 정제 단계"는, 기타 단백질, 예를 들면, 기타 면역글로불린, 및 기타 혈장 단백질로부터 J 쇄-함유 IgM을 분리하도록 특수하게 설계된 정제 공정에 포함될 수 있는 정제 단계에 관한 것이다. 이러한 특정한 정제 단계는, 예를 들면, J 쇄-함유 IgM 오량체에 상응하는 분자량의 단백질을 함유하는 분획을 선택하는 크기 배제 크로마토그래피, 또는 IgM 또는 J 쇄에 특수하게 결합하는 리간드와의 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 혈장으로부터 조성물을 제조하는 공정은 J 쇄-함유 IgM을 농축시키는 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있지만, J 쇄-함유 IgM은 특정하게 정제되지 않는다. 따라서, "정제되지 않은 형태의 J 쇄 함유 IgM"은 80% 미만의 J 쇄-함유 IgM, 전형적으로 70%, 60%, 또는 50% 미만의 J 쇄-함유 IgM을 함유하는 조성물을 나타내며, 이는 심지어 40%, 30%, 25%, 20%, 15% 미만 또는 심지어 10% 미만의 J 쇄 함유 IgM을 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "분비 성분"은 J-쇄-함유 면역글로불린에 특수하게 결합하고, 중합체성 면역글로불린 수용체(pIgR), 바람직하게는 포유동물 pIgR, 보다 바람직하게는 영장류 pIGR, 가장 바람직하게는 사람 pIgR의 세포외 부분과 관련되거나 이로부터 유도가능하거나 또는 이와 동일한 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 분비 성분은 J-쇄 함유 면역글로불린에 증가된 안정성을 제공한다. 위에서 상세히 기술한 바와 같이, 가장 바람직한 분비 성분은, 예를 들면 서열번호 1의 잔기 19 내지 603에 상응하는 사람 분비 성분이다. 그러나, 아미노산 결실, 삽입, 치환은, 이들이 기능성 단백질을, 즉 J 쇄-함유 IgA와 여전히 회합할 수 있고 바람직하게는 이에 단백질 분해적 소화로부터의 보호를 제공할 수 있는 기능성 단백질을 생성하는 한 포함될 수 있다. 기타 포유동물 종으로부터의 동족체는 또한, 상이한 종으로부터의 부분을 포함하는 키메라 단백질이기 때문에 포함된다.

조성물/제제 중의 면역글로불린의 함량을 기술하기 위해 사용된 경우 용어 "%[퍼센트]"는 단백질 중량당 중량을 의미한다.

도면의 목록
본 발명은 이제 다음의 도면 및 서열 목록을 참조로 하여, 다음의 비제한적인 실시예로 설명할 것이다.
도 1은 단량체성, 이량체성 및 J 쇄-함유 분비 IgA의 구조의 다이아그램(diagram)을 나타낸다.
도 2는 상이한 항체로 개발된, 상이한 IgA 제제의 웨스턴 블롯(Western blot)을 나타낸다:
·도 2a는 항-α 쇄, 항-J 쇄 또는 항-분비 성분 항체로 개발된, 상이한 분비-유사 및 분비성 IgA 제제의 웨스턴 블롯을 도시한다.
·도 2b는 항-분비 성분 항체로 개발된, 상이한 분비-유사 및 분비 IgA 제제의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
·도 2c는 분비 성분, α 쇄 및 J 쇄에 대한 항체로 개발된, 분비-유사 IgAF5의 상이한 크기 배제 크로마토그래피 분획의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
·도 2d는 분비-유사 IgAF5의 크기 배제 크로마토그래피 수행의 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 고정된 분비 성분을 사용하는 도트 블롯(dot blot)을 나타낸다.
도 3a는 검정이 설정되는 방법의 유동 다이아그램을 나타낸다.
도 3b는 J 쇄-함유 IgA를 포획하는 SC를 나타낸다.
도 3c는 J 쇄-함유 IgM을 포획하는 SC를 나타낸다.
도 4는 장 세척(intestinal wash)으로 항온배양된(incubated) 상이한 IgA 제제 (A) 또는 IgM 제제 (B)의 시간 경로 시험의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 블롯들은 항-중쇄 항체를 사용하여 개발되었다.
도 5는 상이한 IgA 제제를 사용한 시겔라(Shigella)에 의한 감염에 대한 보호를 나타낸다:
도 5a는 분극화된(polarized) Caco-2 단일층 위에서 시겔라에 의한 경상피 내성에서의 감소, 및 항-시겔라 SIgA(참조: Phalipon A et al (1995) J. Exp. Med. 182: 769- 778), IgAF5 및 SIgAF5에 의한 TER에서의 이러한 감소로부터의 보호를 나타낸다.
도 5b는 항-시겔라 SIgA, IgAF5 및 SIgAF5에 의한 결합되고 내재화된 세균의 감소를 나타낸다.
도 6은 양성 대조군으로서 사용된 항-시겔라 SIgA(SIgAC5), 및 혈장-유도된 중합체성 IgAF5, SIgAF5, 단량체성 IgAF5 및 IgG로 항온배양한 후 수득된 면역 복합체 내의 시겔라의 영상을 나타낸다.
도 7은 시겔라 단독에 노출되거나 다양한 Ab와의 복합체로 노출된 분극화된 Caco-2 상피 세포 단일층에 의한 사이토킨 TNF-α 및 케모킨 CXCL8 및 CCL3의 분비를 나타낸다.
도 8은 오량체성 IgM 및 SIgM 제제에 의한 시겔라에 의한 감염에 대한 보호를 나타낸다.
·도 8은 분극화된 Caco-2 단일층 위에서 시겔라에 의한 경상피 내성에서의 감소, 및 항-시겔라 SIgA(참조: Phalipon A et al (1995) J. Exp. Med. 182: 769- 778), IgM 및 SIgAM에 의한 TER에서의 이러한 감소로부터의 보호를 나타낸다.
서열번호 1은 사람 pIgR의 단백질 서열을 나타낸다.

실시예

실시예 1: 재조합체 분비 성분과 혼합된 혈장으로부터의 IgA 제제의 웨스턴 블롯

물질 및 방법

1.1 MPHQ 컬럼의 친화성 크로마토그래피 및/또는 순차적 용출에 의한 혈장으로부터의 IgA 제제

사람 혈장 IgA는, 출발물질로서 상이한 혈장 IgA의 3개의 상이한 공급원, 즉 저온-고갈된 혈장, 재-가용화된 냉 에탄올 분획화 페이스트, 또는 CSL 베링 AG (스위스 베른(Berne) 소재)의 통상적으로 적용된 IgG 정제 공정에 따라, 상기 컬럼을 멸균시킴으로써 수득된 음이온-교환(AIEX) 크로마토그래피 컬럼으로부터의 스트립 분획을 사용하는 수지 제조업자의 지시에 따라 정제하였다. 요약하면, 저온-고갈된 풀 혈장(pool plasma), 재-가용화된 페이스트 또는 AIEX 스트립 분획을 대략 1mg/mL의 IgA 농도로 인산염 완충된 염수(PBS) 속에서 희석시킨 다음, 컬럼의 IgA 결합 용량을 초과하지 않고, PBS-평형화된 CaptureSelect 사람 IgA 컬럼 상으로 로딩(loading)시켰다. 로딩한 후에, 컬럼을 PBS로 세척하고, IgA를 pH 3에서 글리신 완충제로 용출시켰다. 용출물은 0.5M Tris (pH 8)를 사용하여 pH 4.5로 조절하고 PBS 중에서 16 mG/mL 단백질까지 농축시켰다. 사람 우유로부터의 SIgA를 동일한 방법으로 정제하였다.

CSL 베링 AG(스위스 베른 소재)의 IVIg 제조공정의 AIEX 크로마토그래피 단계로부터, 분획 F4를, pH 7.6에서 55 mM 타르트레이트 / 5 mM 아세테이트를 사용한 용출에 의해 pH 6.5에서 10 mM 포스페이트 / 30 mM 아세테이트를 사용하여 Macro-Prep High Q (Bio-Rad, Hercule, CA) 컬럼으로 후-세척한 후에 수득하였다. 이후에, 분획 F5를 50 mM 포스페이트 / 25 mM 시트레이트를 사용하여 pH 5.0에서 용출시켰다. F4 및 F를 한외여과/정용여과에 의해 PBS 중에서 대략 1 mG/mL로 만든 다음, IgSelect 수지를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 IgG를 고갈시켰다(참조: GE Healthcare, 스위스 글랏트부루크(Glattbrugg) 소재). IgAF4를 F4 로드의 IgSelect 크로마토그래피의 통과액 속에서 직접 수거하였다. IgAF5를 수득하기 위하여, F5 로드의 IgSelect 통과액은 CaptureSelect 사람 IgM 수지(제조원: Bioaffinity Company BAC)를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 IgM을 고갈시켰다. IgAF4 및 IgAF5는 한외여과/정용여과에 의해 최종 농도로 되었다.

1 .2 친화성 크로마토그패피에 의한 혈장으로부터의 IgM 제조

사람 혈장 IgA는, IgA에 대하여 단락 1.1에 기술된 바와 같이 출발물질과 동일한 3개의 상이한 공급원, 즉 저온-고갈된 혈장, 재-가용화된 냉 에탄올 분획화 페이스트, 또는 CSL 베링 AG(스위스 베른(Berne) 소재)의 통상적으로 적용된 IgG 정제 공정에 따라, 상기 컬럼을 멸균시킴으로써 수득된 음이온-교환(AIEX) 크로마토그래피 컬럼으로부터의 스트립 분획을 사용하는 수지 제조업자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 요약하면, 저온-고갈된 풀 혈장(pool plasma), 재-가용화된 페이스트 또는 AIEX 스트립 분획을 대략 1mg/mL의 IgM 농도로 인산염 완충된 염수(PBS) 속에서 희석시킨 다음, 컬럼의 IgM 결합 용량을 초과하지 않고, PBS-평형화된 CaptureSelect 사람 IgM 컬럼 상으로 로딩시켰다. 로딩한 후에, 컬럼을 PBS로 세척하고, IgA를 pH 3에서 글리신 완충제로 용출시켰다. 용출물은 0.5M Tris (pH 8)를 사용하여 pH 4.5로 조절하고 PBS 중에서 16 mG/mL 단백질까지 농축시켰다.

1.3 웨스턴 블롯

니트로셀룰로스(NC) 막 위로의 SDS-PAGE 및 전기이동은 제조업자의 프로토콜에 따라 인비트로겐(캘리포니아주 칼스배드(Carlsbad) 소재)으로부터의 미니-셀 시스템(Mini-Cell system)을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 샘플을 환원 또는 비-환원 조건하에서 샘플 완충액 중에서 각각 변성시키고, NuPAGE MOPS 전기영동 완충액(Invitrogen)을 사용하는, 예비-캐스트 구배 겔, NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12% 1.0 mm 10 웰(well) 위에서 전기영동적으로 분리시켰다. NC 막 (0.2 pm) 위로의 습윤 이동은 XCell II 블롯 모듈(Invitrogen) 및 NuPAGE 이동 완충제로 수행하였다. 막을 이후에 4% Rapilait 탈지 분유(Migros, Switzerland)를 포함하는 PBS-0.5% Tween 20 용액(PBS-T)에서 30분 동안 차단하였다. 면역 블롯팅을 위하여, 폴리클로날 토끼 항체를 사용하였다: 1) 토끼 항-사람 알파 쇄(Dako, 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합됨: 1/5'000 희석); 2) 토끼 항-사람 J 쇄(BioGenex, Fremont, CA; 1/300 희석), 이후에 2차 항-토끼 HRP-접합된 항혈청 (Sigma; 1/10'000 희석); 3) 토끼 항-사람 SC(Dako; 1/5000 희석), 이후에 2차 항-토끼 HRP-접합된 항혈청(Sigma; 1/10'000). 모든 배양물을 PBS-T 함유 4% 전지 분유 속에서 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 수행하였다. PBS-T로 최종 세척한 후에, 막 위의 면역검출은 화학발광으로 밝혀졌고 ImageQuant LAS 4000 시스템(GE Healthcare Lifesciences)에서 디지털적으로 기록되었다.

1.4 혈장 유도된 IgA와 재조합체 분비 성분의 회합

분비-유사 IgA는, 시험관내에서 100 mg의 IgAF5와 4 mg의 재조합체 사람 분비 성분(recSC)을 조합함으로써 수득하였다. 회합은 문헌(참조: Crottet, P., and Corthesy, B. (1998) J. Immunol. 161:5445-5453)에서 미리 기재된 바와 같이 실온에서 30분 동안 PBS에서 수행하였다.

1.5 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분획화

분비-유사 IgA(시험관 내에서 recSC와 회합됨)를 함유하는 IgAF5를 크기 배제 크로마토그래피를 위해 TSKgel G3000SWXL 7.8 mm ID x 30 cm 컬럼(Tosoh Bioscience) 위에서 1.5 mL/분의 유동 속도에서 200 μG/ 20μL에서 아질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies) 1050 HPLC 시스템 내로 주입하였다. 0.75 mL의 분획을 30초 간격으로 8.0 내지 13.5분 보유 시간에서 수집하였다.

결과

결과를 도 2에 나타낸다. 도 2a는 단락 1.1에 기재된 바와 같이 IgAF5를 수득하기 위해 순차적 용출에 의해 또는 AIEX 스트립 분획으로부터 및 재-가용화된 페이스트로부터, 혈장으로부터 친화성 크로마토그래피로 정제된 IgA의 사람 우유로부터의 SIgA의 비교를 입증한다. 분비 성분은 우유로부터의 SIgA에서 발견었지만 사람 혈장으로부터 정제된 IgA 분획 중의 어느 것에서도 발견되지 않았다. 모든 제제는 동일한 양의 IgA 중쇄/알파-쇄를 포함하였다. 예측된 바와 같이, 우유로부터의 SIgA는, 본질적으로 모든 IgA 분자가 J 쇄-함유 이량체로서 존재하는 것으로 예측되기 때문에 최고량의 J 쇄를 함유하였다. 혈장으로부터 정제된 IgA 중의 J 쇄 및 이에 따라 J 쇄-함유 IgA 이량체의 양은 낮았다. 이는, 단지 작은 부분의 혈장 IgA가 이량체 형태로 존재하기 때문에 예측된다. 유사한 함량의 J 쇄가 재-가용화된 페이스트로부터 정제된 IgA에서 관찰되었다. 놀랍게도, 증가된 분획의 IgA는, J 쇄의 증가된 양에 의해 입증되는 바와 같이 컬럼 스트립 분획에서 J 쇄-함유 이량체로서 존재한다. 놀랍게도, 이는 IgAF5에서 추가로 증가되었다. 이러한 축적은 증량을 위한 특정한 공정을 적용하지 않고 발생하였다.

도 2b는, 분비 성분 함유 IgA가 IgAF5에 존재하지 않음을 나타낸다. recSC와 회합된 후에 유리 recSC (75kDa), 및 recSC와 회합된 이량체성 IgA가 발견되었다. 실제로, 분비-유사 혈장 IgA는 우유로부터의 SIgA와 유사하게 나타났다. 나타낸 실험에서 사용된 IgAF5의 제조 시, J 쇄-함유 IgAF5의 함량은 약 20%이었던 것으로 추정되었다. 실제로, 레인 2에서 관찰된 신호 강도는 1:5-희석된 사람 우유 SIgA의 신호와 비교할만하였다.

도 2c는 분비-유사 IgAF5의 크기 배제 크로마토그래피로 수득된 분획 중의 SC, IgA 알파 쇄 및 J 쇄의 함량을 나타낸다. recSC는 IgA-유사 중합체성 및 이량체성 형태의 고분자량 형태에 상응하는 초기 분획에서 관찰되었다. SC의 출현은 J 쇄의 출현과 일치하였는데, 이는 실제로 IgAF5의 SC-함유 분획이 이량체성, J 쇄-함유 분획이었음을 나타낸다. 또한, IgA 알파-쇄는, 유사하게 IgAF5의 단량체성 분획을 포함하는, 소분자량의 분획 속에서 검출되었으며; 이들 분획은 SC 및 J 쇄가 존재하지 않았다. 이들 데이터는, IgA의 단량체성 및 이량체성 형태를 함유하는 혈장-유도된 IgA와 혼합된 recSC가 IgA의 이량체성 J 쇄-함유 형태와 특이적으로 회합됨을 입증한다.

도 2d는, 분획이 보유시간 8.0분과 13.5분 사이에서 수집되는 동안의 SEC 수행의 크로마토그램을 나타낸다. IgA 중합체, 이량체 및 단량체를 나타내는 피크가 나타내어져 있다.

실시예 2: 도트 - 블롯 재-회합 검정( DORA )

도트-블롯 재회합 검정을 사용하여 시험관 내에서 혈장-유도된 IgA 또는 IgM을 사용한 고정된 분비 성분의 회합을 나타내었다. 요약하면, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 분비 성분을 블롯팅 막 위로 돗팅하고; 비-특이적 결합 부위를 차단하였다. 이후에, 단락 1.1 및 1.2에 기술된 바와 같이 수득된 혈장(레인 4), 재-가용화된 페이스트(레인 5) 또는 AIEX 스트립 분획(레인 6)으로부터의 친화성 크로마토그래피에 의해 수득된 혈장-유도된 IgA (도 3b) 또는 IgM (도 3c)을 막에 적용하였다. 세척한 후에, 결합되지 않은 IgA 또는 IgM, 결합된 IgA IgM을 하기에 간략히 기재된 바와 같이 검출하였다.

DORA는 다음과 같이 변형시키면서 문헌[참조: Rindisbacher, L. et al (1995) J. Biol. Chem. 270:14220-14228]에 본질적으로 기재된 바와 같이 수행하였다: 블롯팅 막은 폴리비닐피롤리돈 플루오라이드(PVDF) 중합체로 구성되었고, 차단 용액은 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산염-완충된 염수-0.05% Tween-20 (PBS-T)이었고, IgA가 농축된 조악한 제제는 0.1% BSA를 함유하는 200 μl의 PBS-T 속에서 오버레이 항온배양에 사용하였고, 검출 항체는 HRP에 직접 커플링하였다.

IgA에 대한 결과는 도 3b에 나타낸다. 고정된 분비 성분은 혈장-유도된 IgA를 포획할 수 있었다. 도 2c에 나타낸 바와 유사하게, 이는, recSC가 혈장-유도된 IgA 이량체와 회합되었음을 입증한다.

IgM에 대한 결과는 도 3c에 나타낸다. 고정된 분비 성분은 혈장-유도된 IgM을 포획할 수 있었다. 이는, recSC가 혈장-유도된 IgM과 회합되었음을 입증한다.

실시예 3: 장 세척을 사용한 분비-유사 Ig A 및 분비-유사 Ig M 의 소화

J 쇄-함유 IgA 및 IgM 각각과 정제된 분비 성분의 회합의 기능적 이점을 입증하기 위하여, IgA 및 IgM을 단락 1.1 및 1.2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 분비-유사 IgA는, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 J 쇄-함유 IgA를 증량시키고 이의 25 μg을 시험관 내에서 2.5 μg의 재조합체 사람 분비 성분(hSCrec)과 조합함으로써 수득하였다. 분비-유사 IgM은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 오량체성 IgM을 증량시키고 이의 25μg을 시함관 내에서 2.5 μg의 재조합체 사람 분비 성분(hSCrec)과 조합함으로써 수득하였다. 회합은 위에서 기술한 바와 같이 실온에서 30분 동안 PBS 중에서 수행하였다[참조: Crottet, P., and Corthesy, B. (1998) J. Immunol. 161:5445-5453]. 분자들의 가능하게는 공유 복합체 내로의 통합 및 적절한 조립은 환원 및 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE한 다음, 위에서 나타낸 바와 같이 hSC에 특이적인 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅 및 면역검출함으로써 시험하였다.

BALB/c 마우스(4 내지 6주령)로부터의 장 세척의 회수는 공개된 과정[참조: Crottet, P., and Corthesy, B. (1998) J. Immunol. 161:5445-5453]에 따라 수행하였다. 시험관내 소화에 있어서, 120 ng의 정제된 J 쇄-함유 IgA 및 재구성된 분비-유사 IgA를 20 μL의 PBS의 최종 용적으로 1 또는 2 μl의 장 세척물과 혼합(또는 비혼합)하고 도 4(T = 시간(h))에 나타낸 바와 같은 각종 시간 동안 37℃에서 항온배양하였다. IgM의 시험관내 소화에 있어서, 250 ng의 정제된 IgM 및 분비-유사 IgM을 4 μl의 장 세척물과 혼합하였다. 반응을 2μl의 Complete™ 프로테아제 억제제 혼합물(스위스 롯크레우츠(Rotkreuz) 소재의 Roche Applied Science)을 첨가하여 중단시키고, 항체의 중쇄의 감소된 형태를 검출하는 웨스턴 블롯에 의한 분석까지 동결되도록 유지시켰다.

결과를 도 4a 및 4b에 나타낸다. 단락 1.1에 기술된 바와 같이 수득된 컬럼 스트립 및 재-가용화된 페이스트로부터의 IgA 및 단락 1.2에 기술된 바와 같은 컬럼 스트림으로부터의 IgM을 그 자체로서 또는 둘 다 recSC와의 회합 후에 사용하여 분비-유사 IgA (도 4a) 또는 분비-유사 IgM (도 4b)을 형성시켰다. IgA에 있어서, 장 효소를 사용한 소화 4시간 후에 회합되지 않은 IgA의 신호가 감소되기 시작하는 데, 이는 단백질 분해 소화의 지표이다; 그 효과는 6시간 및 밤새 소화 후에 더 강하였으며, 웨스턴 블롯에 의해 온전한 IgA 알파-쇄는 검출되지 않았다. 대조적으로, 분비-유사 IgA는 장 프로테아제에 의한 소화에 대하여 훨씬 덜 민감하였으며 밤새 노출시킨 후에도 분비-유사 IgA 내의 IgA 알파-쇄의 상당한 부분이 온전하게 잔류하였다.

IgM (도 4b)에 있어서, IgM 및 새롭게 회합된 분비-유사 IgM (SIgM)을 24시간 및 48시간의 소화 후에 동일한 제제와 비교한 것을 나타낸다. 분해된 mu-쇄 분획의 출현은 SIgM과 비교하여 IgM에 대하여 더 신속하고 더 집중적으로 일어났는데, 이는 IgA에 대한 것과 유사한 IgM에 있어서 recSC와의 회합이 구조적 안정성을 개선시켰음을 확인해준다.

전체적으로, 이는, recSC와의 특이적 회합이 개선된 구조적 안정성을 제공하였으며, 예를 들면, 경구 경로를 통해 점막 적용을 위한 소화되기 쉬운 혈장 IgA 분자를 만들 것임을 입증한다.

실시예 4: 시겔라 플레스네리

사람 대장 샘암종 상피 Caco-2 세포주(American Type Tissue Collection)는 문헌(참조: Crottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., and Corthesy, B. (2002) J. Biol. Chem. 277:33978-33986)에 기술된 바와 같은 폴리에스테르 스냅웹 필터(polyester Snapwell filter; 직경, 12 mm; 공극 크기, 0.4 μm; Corning Costar) 상에서 씨딩(seeding)하였다. 분극화된 Caco-2 세포 단일층의 통합성은 밀리셀(Millicell)-ERS 장치(Millipore)를 사용하여 경상피 전기 내성(TER)을 측정하여 점검하였다. 양호하게 구분된 단일층의 TER 값은 450-550 Ω x cm²의 범위이었다.

2 x 10⁷ 세균 (참조: Phalipon A. et al (1995) J. Exp. Med. 182:769-778)을 100 μg의 IgA, 125 μg의 분비-유사 IgA, 275 μg IgM 또는 300 μg SIgM과 500 μL의 최종 용적의 플레인 DMEM (P-DMEM: 10 mM HEPES, 20 μg/ml 트랜스페린, 2 mM 글루타민, 1 % 비-필수 아미노산, 1 mM 피루부산 나트륨으로 보충된 DMEM)과 혼합하고 온화한 교반하에 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 혼합물을 P-DMEM 중에서 재현탁시켜 분극화된 Caco-2 세포 단일층을 감염시켰다.

분극화된 Caco-2 세포 단일층을 사용하기 1시간 전에, C-DMEM을 정점 및 기저외측 구획 둘 다에서 P-DMEM으로 대체시켰다. 정점 매질은 이후에 500 μl의 세균 현탁액(2 x 10⁷개의 세균)으로 그 자체로 또는 항체와 조합하여 대체시켰다. TER 값은 감염 진행의 초기로부터 선택된 시점에서 측정하였다.

세포에 부착되고 감염된 세균을 정량화하기 위하여, 필터 내의 Caco-2 세포를 PBS로 3회 세척하고, 세포를 500 μl의 냉 분해 완충액[10 mM Tris-HCI (pH 7), 0.2 % Nonidet P-40, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA (pH 8)] 속에서 빙상에서 5분 동안 항온배양시키고 상하 피펫팅으로 분해시켰다. 세포 분해물의 일련의 희석물 (10^-2-10^-6)을 LB 아가 플레이트(agar plate) 위로 적용시키고 37℃에서 24시간의 항온배양 후에, 콜로니-형성 단위(CFU)를 이중 플레이트를 눈으로 계산하여 측정하였다.

Caco-2 세포 단일층의 통합성을 시험하기 위하여, 스냅웰(Snapwell)을 4℃에서 5 ml의 4% 파라포름알데히드를 사용하여 밤새 고정시키기 전에 PBS로 세척하였다. PBS로 세척한 후에, 필터를 투과가능하게 만들고 비-특이적 결합 부위를 5% FCS 및 0.2% Triton X-100 (PBS-Tr)을 함유하는 PBS를 사용하여 실온에서 30분 동안 차단시켰다. 모든 항체를 PBS-Tr 속에서 희석시켰다. 필터를 토끼 항-사람 ZO-1 (1/200, Invitrogen)을 사용하여 실온에서 2시간 동안 항온배양시키고, PBS 속에서 세척한 다음, Alexa Fluor® 647 (1/100, Invitrogen)로 접합된 염소 항-토끼 IgG로 실온에서 90분 동안 처리하였다. 세포를 가시화하기 위하여, 필터를 PBS (Invitrogen) 중의 100 ng/ml의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 30분 동안 최종적으로 항온배양하였다. 필터를 이의 홀더(holder)에서 꺼내서 절단하고, 10x 또는 40x 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 710 메타 공촛점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰하기 위해 벡타쉴드 용액(Vectashield solution) 속에 장착시켰다. 영상은 Zeiss ZEN 2009 광 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다.

시겔라-IgA 복합체를 시험하기 위하여, 녹색 형광 단백질을 구성적으로 발현하는 세균을 사용하였고 면역 복합체의 형성은 바이오티닐화된 마우스 항-사람 IgA1/IgA2 (1/10, BD)를 사용하여 온화한 교반하에 실온에서 30분 동안 항온배양한 후에 확인한 다음, 시아닌 5-접합된 스트렙타비딘 (1/400, GE HealthCare)으로 실온에서 30분 동안 온화한 교반하에 확인하였다. PBS를 사용한 3회 세척을 각각의 단계 사이에서 수행하고 모든 항체를 PBS/5% FCS 속에서 희석시켰다. 표지된 면역 복합체를 63x 대물렌즈가 구비된 Zeiss LSM 710 메타 공초점 현미경 (Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 장착되고 즉시 가시화된, 유리 슬라이드(Thermo Scientific) 위에 위치시켰다. 영상을 Zeiss ZEN 2009 광 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다.

분극화된 Caco-2 세포 단일층의 기저외측 구획 내의 사람 CXCL8 (IL-8), TNF-α, 및 CCL3 (MIP-3α)을 시판되는 키트(각각 BD Biosciences 및 R&D Systems)를 사용하여 ELISA로 정량화시켰다.

결과

분극화된 장 상피 세포 단일층을 시겔라에 노출시키면 TER의 감소로 입증된, 단일층의 통합성의 붕괴(도 5a), 상피 세포와 함께 발견된 상승된 세균 수 및, 레이저 스캐닝 공촛점 현미경 관찰법(microscopy)에 의해 관찰된 바와 같은 가시적으로 절충된 세포 단일층에 의해 입증된, 거대한 침입(도 5b)을 일으켰다. 분비-유사 IgA의 첨가는, TER의 감소의 상당한 억제(도 5a), 상피 세포-결합된 세균의 수의 감소(도 5b), 및 공촛점 현미경 관찰법에 의해 분석 시 더 보존된 세포 단일층 통합에 의해 나타낸, 단일층의 파괴를 지연시키고 부분적으로 억제시켰다.

시겔라-특이적 모노클로날 SIgA SIgAC5, 중합체성 IgA 및 분비-유사 IgA의 회합은, 세균만으로 피복된 단량체성 IgA 및 IgG와 대조적으로(도 6), 다수의 세균의 면역 응집체(도 6)를 형성시켰다. 특이적 mAb 및 혈장-유도된 pIgA 및 분비-유사 IgAc에 의한 세균 응집은 도 5b에서 관찰된 Caco-2 세포에 대한 세균 접착을 감소시키는 데 기여한 것으로 보인다. 동일한 3개의 항체 제제는 Caco-2 세포에 의해 전-염증성 사이토킨/케모킨의 생산을 현저히 감소시켰지만, 단량체성 IgAF4 및 IgG는 (TNF-α 및 CCL3) 또는 약한 (CXCL8) 효과를 갖지 않았다(도 7). 이는, 분비성 및 중합체성 IgA에 의한 시겔라의 중화가 Caco-2 세포의 반응성을 감소시키고, 궁극적으로 IgA의 전체 소염 특성에 기여함을 나타낸다.

시겔라에 의한 감염으로부터 분극화된 Caco-2 세포 단일층을 보호하는 것은 IgM 및 분비-유사 IgM을 사용하여, 특수한 SIgAC5를 사용하는 경우 회복된 것과 적어도 유사한 수준으로 유사하게 성취되었다(도 8). 적어도 12h30에 대한 TER의 유지는, IgM 동형이 시겔라에 대한 노출에 의해 유도된 손상으로부터 Caco-2 단일층을보호하는 중화 특성을 지님을 나타내었다.

실시예 5: 클로스트리듐 디피실레 감염( CDI )의 재발 방지

본 발명의 조성물은 클로스트리듐 디피실레 감염의 마우스 모델에서 사용된다.

C57BL/6 마우스는 앞서 기술된 바와 같이 경구 항생제(가나마이신, 젠타마이신, 콜리스틴, 메트로니다졸, 및 반코마이신)의 혼합물로 3일 동안 치료한다(참조: Chen X, et al . Gastroenterology 2008 Dec;135(6):1984-92). 2일 후에, 이들에게는 비경구 클린다마이신 포스페이트(10 mg/kg s.c.) [일 -1 ]를 제공한다. 1일 후에 [일 0], 이들은 0.5 x 105 cfu의 톡시노게닉 씨. 디피실레 균주 10465를 사용한 위관 영양법으로 챌린지(challenge)한다. 보통 내지 급격히 발병하는 대장염은 씨. 디피실레를 투여한 지 1 내지 5일 후에 발현된다. 비치료시, 이것은 대부분의 동물들에서 심각하고 치명적인 대장염을 신속하게 진행시킨다. 주요 감염을 치료하기 위하여, 동물들에게 반코마이신을, 씨. 디피실레 챌린지 후 5일 동안 제공하고, 동물들을 사망률 뿐만 아니라 설사가 있는 중증 CDI의 존재 또는 부재도 모니터링한다. 빈사상태인 것으로 판단된 동물은 나트륨 펜토바르비탈을 단일 주사하여 안락사시킨다. CDI의 재발을 연구하기 위하여, 주요 씨. 디피실레 챌린지에서 생존하는 동물은 관찰하에 28일까지 유지시킨다. 반코마이신 치료를 중지한 후에, 반코마이신을 마지막으로 투여한 후의 일이 시작되는 5일 동안 동물에게 IgA 또는 분비-유사 IgA (경구 경로를 통한 400 mg/kg 체중)를 제공한다.

결과

반코마이신으로 치료한 동물은 씨. 디피실레에 의한 주요 감염에서 생존한다. 그러나, 70%까지의 상당한 비율의 동물은, 반코마이신 치료를 중지한 후 3 내지 4일 내에 씨. 디피실레 감염의 재발로 죽는다. 대조적으로, 동물이 경구 경로를 통해 분비-유사 IgA로 치료되는 경우 감염의 재발은 방지된다. 혈장 IgA 단독은, 씨. 디피실레 감염의 재발을 방지하는 데 있어서 분비-유사 IgA로서 효과적이지 않다(또는 적어도 효과적이지 않다).

대안적으로, 조성물은 왓킨스 등의 문헌(참조: Oral Dis 2010, 16:655-660)에 기술된 바와 유사한 경구 점막염의 모델에서 사용된다.

적절하게 제형화된 IgA 제제(또는 대조군을 위한 비히클 용액)는 예방학적으로 (예를 들면, 일 - 3에서 출발) 매일 3회씩 시리안 골덴 햄스터(Syrian Golden Hamster)에게 연구의 전체 지속 동안 28일까지 제공한다. 금성 방사선-유도된 점막염의 모델에서, 0일째에 하나의 외번된 구강 볼주머니(everted buccal cheek)에 방사선 조사(irradiation)하고(40 Gy), 나머지 볼주머니는 대조군으로서 치료하지 않은 채로 남겨둔다. 대안적으로, 분획화된 방사선-유도된 점막염의 모델에서, 60 Gy의 누적 선량(dose)을 인가하고 문헌(참조: Watkins, Oral Dis 2010, 16:655-660)에 기술된 바와 같이 7.5 Gy의 8개의 분획으로 나눈다. 조합된 시스플라틴 및 급성 방사선-유도된 점막염의 여전히 또 다른 모델에서, 질병은 0일째에 시스플라틴(5 mg/kg) 및 35 Gy 방사선의 조합에 의해 유도한다. 경구 점막염의 임상적 평가 및 체중의 모니터링은, 6일째에 시작하여 연구가 종료될 때까지, 전형적으로 28일째까지 매일 수행한다. 점수 매김 시스템은 문헌(참조: Watkins Oral Dis, 2010 16:655-660)에 기재되어 있다. 또한, 조직 및 혈장 샘플을 수집하고 조직학적 분석, 혈장 중의 염증성 마커의 측정 및 각종 조직의 유전자 발현 연구를 위한 연구 전반에 걸쳐 적절하게 처리한다.

결과

미치료된/비히클 치료된 동물은 경구 점막염을 발현하고, 질병은 대략 16 내지 18일경에 피크이며, 점막염의 퇴행으로 입증되는, 자발적 치유는 대략 18일 내지 20일경에 시작된다. IgA 및 특히 분비-유사 IgA로 치료된 동물은 대조군 동물과 비교하여 상당히 더 낮은 점막염 점수를 가지며 체중 감소가 거의 없고, 덜 심각한 조직학적 발견 및 감소된 수준의 염증성 마커(염증성 사이토킨 및 케모킨을 포함하지만 이에 제한되지 않음)와 비교된다. 염증의 감소 및 상처-치유의 촉진은 유전자-발현 분석 기술에 의한 mRNA 발현의 수준에서 확인된다.

SEQUENCE LISTING <110> CSL BEHRING AG <120> COMPOSITIONS COMPRISING SECRETORY-LIKE IMMUNOGLOBULINS <130> A192 <150> EP 12158931.1 <151> 2012-03-09 <150> EP 12168343.7 <151> 2012-05-16 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 764 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile 1 5 10 15 Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu 20 25 30 Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn 35 40 45 Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys 50 55 60 Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn 85 90 95 Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu 100 105 110 Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser 115 120 125 Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu 130 135 140 Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln 145 150 155 160 Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val 165 170 175 Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg 180 185 190 Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn 195 200 205 Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp 210 215 220 Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His 245 250 255 Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg 260 265 270 Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys 275 280 285 Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys 290 295 300 Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala 305 310 315 320 Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly 325 330 335 Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile 340 345 350 Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala 355 360 365 Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp 370 375 380 Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp 385 390 395 400 Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu 405 410 415 Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr 420 425 430 Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu 435 440 445 Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu 450 455 460 Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val 465 470 475 480 Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys 485 490 495 Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly 500 505 510 Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser 515 520 525 Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys 530 535 540 Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val 545 550 555 560 Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala 565 570 575 Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg 580 585 590 Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu 595 600 605 Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser 610 615 620 Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu 625 630 635 640 Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val 645 650 655 Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val 660 665 670 Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn 675 680 685 Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr 690 695 700 Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu 705 710 715 720 Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys 725 730 735 Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr 740 745 750 Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala 755 760

Claims

시험관 내에서 분비-유사 면역글로불린을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 정제되지 않은 형태의 J 쇄-함유 면역글로불린을 포함하는 혈액-유도된 단백질 조성물을 수득하는 단계,
(b) 상기 단계 (a)의 조성물을 분비 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 분비-유사 면역글로불린을 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 분비-유사 면역글로불린이 분비-유사 IgA 및/또는 분비-유사 IgM인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 조성물이 5% 이상의 J 쇄-연결된 IgA를 함유하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 (a)의 조성물이 10% 이상의 J 쇄-연결된 IgA를 함유하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 (a)의 조성물이 20% 이상의 J 쇄-연결된 IgA를 함유하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 (a)의 조성물이 30% 이상의 J 쇄-연결된 IgA를 함유하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 (a)의 조성물이 50% 이상의 J 쇄-연결된 IgA를 함유하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 조성물이 사람 혈액으로부터 유도되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 분비 성분이 재조합체 분비 성분인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비 성분이 사람 분비 성분인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비 성분이 포유동물 세포주에서 생산되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비 성분이 중합체성 면역 글로불린 수용체 pIgR의 세포외 부분인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, IgA 이량체/중합체 내의 첨가된 분비 성분과 J 쇄 사이의 몰 비가 1:10 내지 10:1의 범위인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 몰 비가 약 1:5 내지 5:1의 범위인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 몰 비가 약 1:2 내지 2:1의 범위인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득할 수 있는 분비-유사 IgA 및/또는 분비-유사 IgM 또는 이들의 조합물을 포함하는, 조성물.
제16항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
제16항 또는 제17항에 있어서, 의학적 용도를 위한, 조성물.