KR20140122380A

KR20140122380A - Ｔｃｔｐ-ｐｔｄ를 포함하는 유전자 전달체

Info

Publication number: KR20140122380A
Application number: KR20130038927A
Authority: KR
Inventors: 이경림; 이혁진; 김효영
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2014-10-20
Also published as: KR101595152B1

Abstract

본 발명은 TCTP-PTD를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 TCTP-PTD는, 유전자와 화학 결합하여 세포 내로 유전자를 효과적으로 전달할 수 있으며 독성이 낮아 유전자 치료제로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

ＴＣＴＰ-ＰＴＤ를 포함하는 유전자 전달체{Gene delivery system comprising TCTP-PTD}

본 발명은 유전자를 세포 내로 효과적으로 전달하기 위한 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein protein transduction domain)의 용도 및 이의 이용에 관한 것이다.

일반적으로 유전자를 전달하는 방법은 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 나누어진다. 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), AAV(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 백시나바이러스(vaccina virus) 등이 있는데 유전자 효율은 높은 반면 전달 가능한 유전자의 크기가 제한적인 한계점이 있다. 또한 바이러스성 벡터는 대량생산이 어렵고, 숙주의 염색체 내에 들어가 돌연변이를 유발할 가능성이 문제되고 있으며, 염증을 유발하는 부작용이 있어 사용이 매우 제한적이다(Kremer et al., Br. Med.Bull, 51, 31-44, 1995; Yibin Wang et al., DDT, 5(1), 2000).

이러한 단점을 극복하기 위해 양이온성 리포좀(liposome)과 양이온성 펩타이드, 양이온성 고분자물질들을 이용한 비바이러스성 벡터가 개발되고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터들은 특별한 면역반응을 유발하지 않아 안전성이 뛰어나고, DNA 크기에 제한 받지 않으며, 대량생산이 가능하다는 장점이 있다(Garcia Chaumont et al., Pharmacol, Ther. 76, 161-1601, 2000). 그러나 이러한 양이온은 세포전달능력이 뛰어나고 바이러스벡터에 비해 부작용이 적지만, 시중에 판매되고 있는 상업용 리포좀의 경우 세포종류에 따라 세포 내 전달효율이 일정하지 않으며 세포막에 손상을 입혀 독성을 나타내는 문제점이 있다 (Amarnath Sharma et al., International journal of pharmaceutics, 154, 123-140, 1997; Saghir Akhtar et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 44, 3-24, 2000). 또한 양이온을 띠는 리포좀도 siRNA와 정전기적 결합을 통해 안정적으로 효과를 나타내지만 엔도좀(Endosome)에 들어가 세포 밖으로 나오지 못하여 유전자 침묵 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 혈청 내 반감기가 짧고 간에서 빠르게 분해되는 문제점이 알려져 있다(Controlled delivery of antisense oligonucleotides: a brief review of current strategies, 2009, Expert Opin Durg Deliv). 양이온을 띠는 폴리머의 경우, 다른 단백질에 의한 영향을 적게 받고 안정화된 상태로 siRNA를 세포 내로 전달하는 반면, 생체 내 에서 빠르게 분해되고 간이나 비장에 침식되는 독성이 나타난다고 보고되고 있으며 고가의 비용이 요구된다(Polymers in siRNA delivery, 2011, Oligonucelotides). 골드나노입자 또한 유전자 전달체로 많이 사용되고 있으며 목적 유전자에 특이적으로 전달이 가능하며, 혈청 내에서 매우 안정적이고 세포독성이 낮은 장점이 있다. 반면, 골드나노입자는 간에서 빠르게 분해되며 면역시스템을 자극한다는 단점이 있고 크기와 이온에 따라 생 분해와 독성반응에 확연한 차이가 있고 비용이 비싸다는 문제점이 있다(Oligonucleotide-modified gold nanoparticles for intracellular gene regulation, 2006. Science).

이러한 문제점을 개선하기 위해 비바이러스 벡터의 전달효율을 높이고자 세포투과 능력이 뛰어난 막투과 단백질 도메인 기능을 갖는 펩타이드인 PTD(protein transduction domain)를 이용하는 연구가 많이 진행되고 있다. PTD는 10~20개의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드로, 특별한 수용체의 도움 없이 세포막을 투과하는 물질을 말한다. PTD는 HIV-1의 TAT 단백질을 세포배양 배지에 첨가하면 이 단백질이 세포 내로 들어가는 것을 발견하면서 처음 알려졌으며(Green et al., 1988, Frankel et al., 1988), 이 이후에 세포막을 건너서 세포 내로 도입하는 능력을 가진 초파리의 안테나피디아 호메오 전사인자(Drosophila Antennapedia (Antp) homeotic transcription factor, Joliot et al., 1991)와 허피스 심플렉스 바이러스-1 DNA 결합단백질 VP22(herpessimplex-virus-1 DNA-binding protein VP22, Elliot et al., 1997)도 밝혀졌다. 지금까지 알려진 PTD는 양이온을 띄고 있으며, 음이온인 DNA와 상호작용하여 세포 내 이입을 촉진하고 DNA를 세포 내로 전달하여 유전자의 전달효율을 높인다고 알려져 있다(Gratton J.P., Nature Medicine. 9(3), 357-362, 2003). 그러나 이러한 정전기적 결합은 용해도가 낮고 응집현상이 나타나는 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.

한편, TCTP 단백질(translationally controlled tumor protein)은 MacDonald et al.(1995)에 의해 히스타민 유리활성이 있는 IgE 의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine-releasing factor; 이하, HRF)로 보고된 단백질이다. TCTP는 1980년대까지 종양에 관련된 단백질(tumor-specific protein)로 알려져 왔으며, 그 합성은 종양의 증식 단계(proliferative stage)와 관련이 있을 것으로 생각되어 왔다. 마우스 적백혈병(erythroleukemia) 세포에서는 21kDa의 종양 단백질 p21으로 밝혀졌고(Chitpatima et al.,1988), 에를리히 복수암(Ehrlich ascites tumor)에서 세포성장과 관련이 있는 단백질 p23이 TCTP/HRF와 동일한 것으로 밝혀졌다(Bohm et al., 1989).

본 발명자는 TCTP/HRF가 세포막을 투과할 수 있으나, TCTP/HRF의 아미노산 서열에는 대표적인 PTD의 특징인 염기성 아미노산(아리기닌, 리신)이 풍부한 특이적 부위가 없다는 점, 다른 개개의 PTD들과 유사한 아미노산 서열이 없다는 것을 확인하고 TCTP/HRF는 현재까지 알려진 PTD와 구조적으로 전혀 상이한 도메인을 갖는 것을 보고한 바 있다.

이에 본 발명자들은 PTD 기능을 갖는 TCTP 유래 서열(TCTP-PTD)을 이용한 유전자 전달체를 연구하던 중, 서열번호 1의 TCTP-PTD 서열을 유전자와 결합시키면 유전자를 세포내로 자극 없이 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국특허출원 제10-2007-0017201호

본 발명의 목적은 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein-protein transduction domain)를 포함하는 유전자 전달체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 TCTP-PTD를 이용하여 세포 내 유전자 전달능을 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 전달체를 제공한다.

상기 "서열번호 1의 아미노산"은 TCTP(translationally controlled tumor protein)에서 유래된 것으로 막투과 기능을 갖는 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein-protein transduction domain)일 수 있다.

또한 본 발명의 유전자 전달체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 막투과 기능을 저하시키지 않는 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체 TCTP-PTD를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실 및 이의 임의의 조합일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산은 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 2를 포함하는 염기서열에 의해서 암호화 될 수 있다. 서열번호 2는 atg att atc tac cgg gac ct c atc agc cac로 이루어진 염기서열을 나타낸다.

또한, 본 발명은 유전자를 전달하기 위하여 서열번호 1의 아미노산 서열에 유전자를 결합한 유전자 전달체를 제공한다.

상기 유전자는 DNA, RNA, 앱타머, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DNAzyme 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 siRNA일 수 있다. 상기 유전자는 본 발명에서 체내로 효과적으로 전달하고자 하는 생리활성 물질일 수 있으며, 생체 내에서 목적하고자 하는 약리 효과를 나타내는 물질을 제한없이 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 유전자는 억제시키고자하는 타깃 유전자의 일부 서열에 상보적인 서열을 가지고 체내로 효과적으로 전달되어 타깃 유전자의 발현을 억제시킴으로써 타깃 유전자의 활성을 매우 효율적으로 억제시켜 약리 효과를 나타낼 수 있다.

상기 "앱타머"는 특정 타겟에 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 의미하며, 예컨대 RNA 앱타머일 수 있다.

상기 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. siRNA는 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타깃 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 siRNA는 타겟 유전자에 특이적으로 작동하도록 타겟 유전자 또는 타겟 뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.

상기 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stemloop)구조를 이룰 수 있으며 보다 구체적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

상기 "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킬 수 있다.

상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA이다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

상기 "DNAzyme"은 은 효소 활성을 가지는 단일 가닥 DNA 분자로, 10-23 뉴클레오타이드로 구성된 DNAzyme(10-23DNAzyme)은 생리적으로 유사한 조건 하에서 RNA가닥을 특정위치에서 절단한다. 10-23 DNAzyme은 염기 쌍을 이루지 않고 노출된 어떠한 퓨린 및 피리미딘 사이를 절단한다. 10-23 DNA효소(DNAzyme)는 15개의 보존된 염기서열(5'-GGCTAGCTACAACGA-3')로 이루어진 효소의 활성부위(catalytic domain) 및 상술한 효소의 활성부위 좌우로 RNA 기질을 인식하는 7-8개의 DNA 염기서열로 이루어진 기질인식 자리(RNA substrate binding domain)로 구성될 수 있다.

상기 "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 유전자의 결합은 화학 결합일 수 있다.

상기 화학 결합은 바람직하게는 아민(amine), 티올(thiol), 카복실레이트(carboxylate), 하이드로실(hydrosilyl), 알데하이드(aldehyde), 케톤(ketone), 아크릴레이트(Acrylate), 아지아드(Azide), 알키인(Alkyne), 카테콜(catechol) 및 파로갈롤(pyrogallol)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 작용기를 이용한 화학 결합일 수 있다.

보다 구체적으로 상기 화학결합을 위하여 아민 작용기를 이용하는 경우, 아이소타이오사이안산염(Isothiocyanates), 이소시아네이트(Isocyanates), 아크릴 아지드(Acryl azide), NHS(N-hydroxysuccinimide) 에스터, 술포닐 클로라이드(Sulfony chloride), 알데하이드(Aldehyde), 에폭시드(Eposide), 플루오로벤젠(Fluorobenzene), 무수숙신산(Succinic Anhydride)과의 반응을 통해 화학결합을 형성할 수 있으며, 티올 작용기를 이용하는 경우, 이오도아세틸(Iodoacetyl), 말레아미드(Maleimide), 아지리딘(Aziridine), 아크릴로일(Acryloyl), 플루오로벤젠(Fluorobenzene), 비닐설폰(Vinysulfone)과의 반응을 통해 화학결합을 형성할 수 있으며, 카르복실레이트 작용기를 이용하는 경우, 다이아조아세트산(Diazoacetate)과의 반응을 통해 화학 결합을 형성할 수 있고, 하이드록실 작용기를 이용하는 경우, 엔-하이드록시석신이미드 클로로포름(N-Hydrosysuccinimidyl Chloroformate), 이소시아네이트(Isocyanates)와의 반응을 통해 화학 결합을 형성할 수 있고, 알데하이드 작용기를 이용하는 경우, 하이드라자이드(Hydrazide), 아민(Amine)과의 반응을 통해 화학결합을 형성할 수 있으며, 아지아드(Azide) 작용기 또는 알키인(Alkene) 작용기를 이용하는 상호 결합하여 화학 결합을 형성할 수 있고, 카테콜(catechol)을 작용기로 이용하는 경우, 아민(amine) 또는 티올(thiol)과 화학 결합을 형성할 수 있으며, 파로갈롤(pyrogallol) 작용기를 이용하는 경우에도 아민(amine) 또는 티올(thiol)과 화학 결합을 형성할 수 있다. 상기 화학결합의 종류는 예시적인 것이며, siRNA와 TCTP-PTD 사이에서 컨쥬게이션 반응을 할 수 있는 화학 결합은 제한없이 사용할 수 있다.

상기 티올 작용기를 이용한 화학 결합은 말레아미드-티올(maleimide-thiol) 결합일 수 있다.

상기 말레아미드-티올(maleimide-thiol) 결합은, 보다 구체적으로 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 TCTP-PTD의 말단에 말레이미드(maleimide)를 결합시키고, 전달하고자 하는 유전자의 말단에 티올을 결합시켜 형성되는 방법일 수 있다. 전달하고자 하는 유전자에 디티오트레이톨(DTT) 또는 TCEP를 30분 동안 처리하여 3' 혹은 5' 말단에 SH 그룹이 생성되도록 제조할 수 있으며, 이를 N 또는 C 말단에 말레이미드가 결합된 TCTP-PTD와 상호작용하도록 1시간 내지 3시간, 바람직하게는 2시간 동안 저온 반응시켜 상호간 티올 결합된 TCTP-siRNA 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 상기 저온 반응은 1 내지 10℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 4℃에서 수행될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체는 상기와 같이 서열번호 1을 포함하는 TCTP-PTD 와 목적 유전자가 화학 결합을 이루도록 함으로써, 기존 기술인 핵산과 양전하의 정전기적 결합을 이용하는 경우에 발생되는 독성 및 세포 표면 전하에 따른 혈류 내의 빠른 분해 문제점을 해결할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 유전자 전달체를 포함하는 유전자 치료제를 제공한다.

상기 '치료'란 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

상기 유전자 치료제는 면역질환을 타깃으로 할 수 있으며 바람직하게는 syk(spleen tyrosin kinase)를 타깃으로 하여 질병을 치료할 수 있는 유전자 치료제일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 질병은 천식, 알레르기(allergy), 류마티즘 염증이 될 수 있다.

또한 상기 유전자 치료제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제조할 수 있으며, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 유전자 치료제를 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 포함하여 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 상기 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 국소 투여 시에 상기 약학적 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 유전자 치료제를 포함하는 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액,정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명의 유전자 치료제를 포함하는 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 비강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하, 흡입 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 유전자 치료제를 생체에 투여할 때의 투여량이나, 투여 횟수는 투여 형태, 환자의 연령, 체중, 증상의 중독도(重篤度)에 따라 적당히 선택될 수 있지만, 바람직하게는 성인 1인당 1.0mg~ 50mg, 바람직하게는 1.0mg∼20mg의 범위에서 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유전자 치료제와 결합되는 치료 유전자의 목적 질환 종류에 따라, 투여 경로를 달리 할 수 있고, 목적 세포에 따라 표적화 인자를 결합하여 다양한 질환 치료에 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열과 유전자를 결합시키는 단계;를 포함하는 유전자 전달능을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 결합은 아민(amine), 티올(thiol), 카복실레이트(carboxylate), 하이드로실(hydrosilyl), 알데하이드(aldehyde), 케톤(ketone), 아크릴레이트(Acrylate), 아지아드(Azide), 알키인(Alkyne), 카테콜(catechol) 및 파로갈롤(pyrogallol)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 작용기를 이용한 화학 결합일 수 있으며, 바람직하게는 티올 작용기를 이용한 말레아미드-티올 결합일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 유전자가 화학결합을 통해 컨쥬게이션을 형성함으로써, 유전자는 저자극으로 독성없이 세포 내로 효과적으로 전달될 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열은 일반 유전자 전달 물질인 PTD와 비교하여 양이온이 거의 존재하지 않는 물질이므로 세포 표면의 전하에 영향을 받지 않아 유전자의 전달능이 효과적으로 증가될 수 있다.

본 발명에 따른 TCTP-PTD는, 전달 대상인 유전자와 화학 결합하여 세포 내로 유전자를 효과적으로 전달할 수 있으며 독성이 낮아 유전자 치료제로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 TCTP-PTD와 siRNA의 컨쥬게이션 반응을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 TCTP-siRNA 컨쥬게이트의 생성을 확인한 결과를 나타낸 도이다(화살표: TCTP-siRNA 컨쥬게이트 밴드).
도 3은 TCTP-siGFP를 HeLA-GFP 난소암세포에 처리(35, 75, 150 nM)한 후, 세포 투과 효율을 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸 도이다(PC: 리포펙타민-siRNA 양성대조군, siGFP: siGFP 단독 처리군, HeLa-GFP: 미처리군).
도 4는 TCTP-siGFP(35, 75, 150 nM)의 GFP 유전자 침묵 효율을 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 TCTP-siGFP(75nM)의 GFP 유전자 침묵 효율을 형광현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(LF-siGFP: 리포펙타민-siRNA 양성대조군, siGFP: siGFP 단독 처리군, HeLa-GFP: 미처리군).
도 6은 TCTP-siGFP의 유전자 침묵효과에 의한 GFP 단백질 발현 감소를 항원항체 반응을 이용한 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 TCTP-siLuc를 HeLA-Luc 난소암세포에 처리(10, 35, 75 nM)후, 루시퍼라아제 유전자 침묵 효과를 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸 도이다(PC: 리포펙타민-siRNA 양성대조군, siLuc: siLuc 단독 처리군, HeLa-Luc: 미처리군).
도 8은 TCTP-siGFP 컨쥬게이트(10, 35, 50, 75, 100nM)의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. TCTP-PTD 와 siRNA를 포함하는 유전자 전달체 제조

TCTP-PTD를 유전자 전달에 이용하기 위하여 유전자 전달체를 제조하였다. TCTP-PTD는 5'-MIIYRDLISH-3'(서열번호 1)로 이루어진 서열은 펩트론에 합성을 의뢰하여 제작된 것을 사용하였으며 전달될 유전자로 아래 [표 1]의 유전자를 사용하였다. siGFP가 세포 내로 들어가는 정도를 유세포분석기(FACS, BD사)로 확인하기 위하여 전달될 유전자인 siGFP 센스 가닥의 5' 말단에 형광물질인 cy5를 표지하였으며, 발광 단백질인 siLuci는 별도의 형광물질 표지 없이 사용하였다. siGFP는 IDT(미국) siLuiferase는 바이오니어(대전)에서 제작하여 사용하였다.

[표 1]

기존의 정전기적 결합의 단점을 개선하고 siRNA의 전달을 효과적으로 할 수 있도록 하기 위하여, TCTP-PTD와 siRNA가 화학적 결합을 형성하도록 하였다. TCTP-PTD와 siRNA가 컨쥬게이션할 수 있도록 하기 위하여, TCTP-PTD의 말단에는 말레이미드(maleimide)를 결합시키고, 말레이미드와 잘 반응할 수 있는 티올(thiol)을 siRNA에 결합시켰으며 상호간의 반응을 통해 티올 결합이 되도록 하였다.

구체적인 TCTP-PTD와 siRNA의 컨쥬게이션 반응을 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 5'-cy5가 붙어있는 센스에 디티오트레이톨(DTT) 또는 TCEP를 30분간 처리하여 3'-SH인 티올 그룹을 제조하였으며, TCTP-PTD의 말레이미드와 상호 화학적으로 결합할 수 있도록 2시간 동안 4 ℃에서 반응시켜 TCTP-siRNA 컨쥬게이트를 제조하였다. 상기 반응 조건은 siGFP, siLuci에 동일하게 사용하였다.

실험예 1. TCTP-PTD와 siRNA의 컨쥬게이션 확인

TCTP-siRNA 컨쥬게이트의 제조를 확인하기 위하여, SDS를 제외한 7% 네이티브페이지(native-PAGE)를 수행하고 새로운 밴드의 유무로 TCTP-siRNA 컨쥬게이트의 생성을 확인하였으며, TCTP-siRNA 컨쥬게이트의 정도는 센스와 안티센스 결합과 이 결합에 TCTP-PTD를 결합시킨 것을 정량화하여 확인하였다.

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 두 가닥의 siRNA와 TCTP-PTD를 이용하는 경우 새로운 밴드가 형성되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 정량화한 결과 약 50%의 컨쥬게이트가 형성되어 TCTP-siRNA 컨쥬게이트가 효과적으로 형성되는 것을 확인하였다.

실험예 2. TCTP-siRNA 컨쥬게이트를 이용한 유전자 전달능 확인-GFP

상기 실시예 1에서 제조된 TCTP-siRNA 컨쥬게이트를 이용하면 세포를 잘 투과하여 유전자가 세포 내로 효과적으로 전달될 수 있는지 확인하기 위하여, 첫 번째로 녹색형광단백질(GFP)을 이용하여 유전자 전달 효과를 확인하였다.

서열번호 1의 TCTP-PTD와 서열번호 3 및 4의 siRNA를 이용하여 실시예 1에 따라 TCTP-siRNA 컨쥬게이트 TCTP-siGFP를 제조하였다. 제조된 TCTP-siGFP는 35, 75, 150nM로 녹색형광단백질(GFP)이 안정적으로 발현되게 만든 HeLA-GFP 난소암세포에 24시간 동안 처리하였으며, siRNA 센스 5' 말단에 Cy5 형광 물질을 결합시켜 Cy5 형광량을 통해 세포 내 투과 정도를 확인하였다. 상기 HeLa-GFP 난소암 세포는 HeLa 세포를 ATCC에서 구입한 후, 녹색형광단백질이 발현되도록 마크로젠에 제작을 의뢰하여 사용하였다. 유전자를 전달하는데 상업적으로 사용되는 리포펙타민(Lipofectamin RNAiMAX)에 35nM siRNA를 반응시켜 양성 대조군으로 세포에 처리하였으며 음성대조군으로 150nM siRNA를 단독으로 처리하였다. 처리 후 24시간이 경과한 후, 세포 투과 효율을 유세포 분석기(FACS, BD사)로 확인하였다.

결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, TCTP-siGFP를 이용한 결과 35, 75, 150 nM 농도 의존적으로 세포 내 투과도가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 양성 대조군과 비교하여 35nM 동일한 농도에서 TCTP-siRNA 컨쥬게이트가 높은 세포 내 투과 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

상기와 동일한 실험 조건을 이용하여 TCTP-siGFP의 유전자 침묵 효율을 녹색형광단백질의 발현정도를 이용하여 유세포 분석기 및 형광현미경으로 확인하였다.

결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, TCTP-siGFP를 75nM 농도로 처리한 경우 50% 이상의 녹색형광단백질 발현의 감소를 확인할 수 있었으며, 농도의존적인 녹색형광 단백질 발현의 감소를 확인할 수 있었다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, TCTP-siGFP를 75nM 농도로 처리하고 형광현미경으로 관찰한 결과, siGFP 단독 처리군과 비교하여 뚜렷하게 감소된 녹색 형광을 확인할 수 있었다. 이를 통해, TCTP-siGFP를 이용한 유전자 전달이 효과적으로 이루어졌으며 전달된 siRNA에 의하여 GFP 유전자의 침묵 효과가 뚜렷하게 나타남을 확인하였다.

TCTP-siGFP의 유전자 침묵이 단백질 발현양도 감소시키는지 확인하기 위해 구입한 녹색형광단백질의 항체(anti-GFP; Santacruze사, 미국)를 이용하여 상기와 동일한 실험군을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 항체-항원 결합에 의한 실험의 대조군으로 세포 내에 일정하게 분비되고 있는 하우스키핑유전자인 GAPDH를 이용하였다.

결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, TCTP-siGFP를 처리한 경우, GFP 단백질의 발현이 대조군과 비교하여 뚜렷히 감소됨을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통하여, TCTP-siGFP가 효과적으로 유전자를 세포 내로 전달할 수 있으며, 전달되는 목적 유전자 siGFP에 의해서, GFP 유전자 침묵 효과가 효과적으로 나타날 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 3. TCTP-siRNA 컨쥬게이트를 이용한 유전자 전달 효과 확인-루시퍼라아제

TCTP-siRNA 컨쥬게이트의 유전자 전달 효과를 확인하기 위하여 루시퍼라아제를 이용한 유전자 침묵 효과를 확인하였으며, 서열번호 1의 TCTP-PTD와 서열번호 5 및 6의 siRNA를 이용하여 실시예 1에 따라 TCTP-siRNA 컨쥬게이트 TCTP-siLuc를 제조하였다. 제조된 TCTP-siLuc는 10, 35, 75 nM로 HeLA-Luc 난소암세포에 24시간 동안 처리하였으며, 상기 실험예 2와 동일한 유세포 분석방법으로 유전자 침묵 효과를 확인하였다.

결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, HeLa-Luc 세포에서 TCTP-siLuc는 농도 의존적으로 루시퍼라아제의 유전자 침묵 효과를 증가시켰으며, 모든 농도에서 양성 대조군보다 높은 유전자 침묵 효과를 나타냈다.

실험예 4. TCTP-siRNA 컨쥬게이트의 세포 독성 확인

기존 양이온 분자를 이용한 유전자 복합체는 세포독성을 나타내므로 유전자 치료제에 적합하지 않은 문제점이 있었다. 따라서, 본 발명의 TCTP-siRNA 컨쥬케이트가 세포독성을 나타내지 않아 유전자 치료제로 이용할 수 있는지 여부를 확인하였다. 실시예 1의 방법으로 서열번호 3 및 4의 서열을 이용하여 제조된 TCTP-siGFP 컨쥬게이트를 10, 35, 50, 75, 100nM의 다양한 농도로 HeLa-GFP세포에 24시간 동안 처리한 후, CCK-8(cell counting kit-8)를 사용하여 세포 독성을 확인하였다. CCK-8은 살아있는 세포의 탈수소효소(dehydrogenase) 활성을 측정하는 원리를 이용하며, 화학적 조건이 살아있는 세포의 탈수소효소 활성에 영향을 끼치는지 확인하는 방법으로 살아있는 세포의 수를 측정 가능한 파장인 450 내지 650nm에서 확인하는 방법이다. 상기 방법에서 650nm는 참고 파장으로 사용되었다.

결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, TCTP-siGFP 컨쥬게이트가 유전자 침묵을 일으키는 75 nM에서 세포독성이 없는 것을 확인하였다. 실험예 2 및 3의 결과와 같이 TCTP-siRNA 컨쥬게이트는 10nM, 35nM과 같은 농도에서도 양성 대조군과 같거나 더 높은 정도의 유전자 전달 효과를 나타내므로, TCTP를 유전자 전달체로 이용하는 본 발명은 기존의 세포 독성 문제를 해결한 새로운 유전자 치료제로 활용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Gene delivery system comprising TCTP-PTD <130> p13-014-EWHA <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCTP-PTD <400> 1 Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Ile Ser His 1 5 10 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCTP-PTD <400> 2 atgattatct accgggacct catcagccac 30 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense-GFP <400> 3 acaugaagca gcacgacuu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense-GFP <400> 4 aagucgugcu gcuucaugu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense-Luciferase <400> 5 aacgcugggc guuaaucaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense-Luciferase <400> 6 uugauuaacg cccagcguu 19

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 상기 아미노산은 막투과 기능을 갖는 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein-protein transduction domain)인 것인, 유전자 전달체.
제2항에 있어서, 상기 TCTP-PTD는 서열번호 2를 포함하는 염기서열에 의해서 암호화되는 것인, 유전자 전달체.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에 유전자가 결합한, 유전자 전달체.
제4항에 있어서, 상기 유전자는 DNA, RNA, 앱타머, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DNAzyme 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 유전자 전달체.
제4항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 말단에 말레아미드기가 결합된 것인, 유전자 전달체.
제4항에 있어서, 상기 유전자는 말단에 아민(amine), 티올(thiol), 카복실레이트(carboxylate), 하이드로실(hydrosilyl), 알데하이드(aldehyde), 케톤(ketone), 아크릴레이트(Acrylate), 아지아드(Azide), 알키인(Alkyne), 카테콜(catechol) 및 파로갈롤(pyrogallol)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 작용기가 결합한 유전자인 유전자 전달체.
제4항에 있어서, 상기 결합은 화학 결합인, 유전자 전달체.
제8항에 있어서, 상기 화학 결합은 아민(amine), 티올(thiol), 카복실레이트(carboxylate), 하이드로실(hydrosilyl), 알데하이드(aldehyde), 케톤(ketone), 아크릴레이트(Acrylate), 아지아드(Azide), 알키인(Alkyne), 카테콜(catechol) 및 파로갈롤(pyrogallol)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 작용기를 이용한 화학 결합인, 유전자 전달체.
제9항에 있어서, 상기 화학 결합은 말레아미드-티올(maleimide-thiol) 결합인 유전자 전달체.
제10항에 있어서, 상기 말레아미드-티올(maleimide-thiol) 결합은 서열번호 1의 아미노산 서열의 말단에 결합된 말레아미드기와 유전자의 말단에 결합된 티올기가 결합된 것인 유전자 전달체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유전자 전달체를 포함하는 유전자 치료제.
서열번호 1의 아미노산 서열과 유전자를 결합시키는 단계;를 포함하는 유전자 전달능을 증가시키는 방법.