KR20140120706A - 황색포도알균에 특이적 항균 활성을 가지는 리신 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 특이적 항균 활성을 가지는 리신 융합 단백질, 상기 리신 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 항생제, 및 소독제에 관한 것이다. 본 발명은 박테리오파지의 리신 및 게놈 상에 존재하는 오토리신 대비 높은 활성을 나타내어 황색포도알균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 또한 항생제 또는 소독제로도 응용될 수 있어 식품 위생, 축산업 분야 등에서 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

황색포도알균에 특이적 항균 활성을 가지는 리신 융합 단백질 및 이의 용도{Lysin fusion Protein Having Antibacterial Activity Specific to Staphylococcus aureus and use thereof}

본 발명은 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 특이적 항균 활성을 가지는 리신 융합 단백질, 상기 리신 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 항생제, 및 소독제에 관한 것이다.

황색포도알균(Staphylococcus aureus)은 가장 빈발하는 병원체의 하나로 식중독, 피부나 조직의 감염증, 독소에 의한 쇼크, 폐렴, 세균혈증 등 다양한 병증을 초래하며 병원내 감염이나 식중독처럼 집단 감염이 일어난다. 황색포도알균의 20% 내지 40%는 사람의 피부나 점막에 상재하여 기회감염의 위험성이 높고 (Wertheim, 2005, Lancet InfectDis 5: 751-762), 미국 식육점 판매 육류의 47%가 황색포도알균에 오염되어 있으며, 이들 중 52%가 항생제 내성을 가지고 있는 것으로 보고되었다 (Waters, 2011, Clin Infect Dis52: 1227-1230). 2002년도 식약청 연구용역 자료에 의하면 메티실린 내성 황색포도알균과 페니실린 비감수성 폐렴구균은 각각 73%와 77%로 심각한 수준으로 나타나 국민 보건의 심각한 위협이 되고 있으며, 메티실린 내성 황색포도알균 치료제 시장이 연평균 12.9%의 성장률로 2006년 14억 4820만불에서 2011년 26억 5970만불에 이른 것으로 평가되고 있다.

한편 박테리오파지는 박테리아에 특이적으로 감염되는 바이러스로 1915년 Twort와 1917년 d'Herelle이 발견하였고, d'Herrelle은 박테리오파지를 박테리아(세균)성 질병 치료에 처음으로 적용하였다. 박테리오파지를 이용한 치료법은 최근 다약제 내성 박테리아 및 슈퍼박테리아 출현으로 항균제의 대안으로서 각광받고 있으나, 박테리오파지 생산을 위해 병원성 숙주 박테리아를 사용해야 하고 박테리오파지를 확보하기 위해서는 많은 시간과 비용이 요구된다.

박테리오파지 리신(lysin)은 박테리오파지가 증식을 완료한 후 세포벽을 분해하여 숙주세포로부터 탈출하는데 중요한 기능을 수행하는 세포벽의 주성분인 펩티도글리칸 가수분해효소(PGH, peptidoglycan hydorlase)로서 glucoseaminidase(GA), amidase(Ami) 및 endopeptidase(EP) 활성을 가지며 세포벽의 작용점은 도 1과 같다. 리신은 박테리오파지의 자연 감염 상태에서는 세포질에 존재하므로 세포벽을 손상시키지 않아 살균 효능이 발현되지 않으나, 용균 박테리오파지의 생활사 중 후반부에 holin이 발현되어 세균막에 구멍이 생기면 이를 통해 세포벽으로 나가 펩티도글리칸을 분해하고, 약해진 부분으로 그람 양성박테리아의 높은 팽압이 작용해 풍선이 부풀어 오르듯 하다가 박테리아가 파열되어 죽게 하므로 살균 효능을 보인다. 최근 리신을 정제하여 그람양성 박테리아에 처리하여도 살균효과(표 1)를 보여 항생제로서의 개발 가능성이 보고 되고 있으며, 관련 연구들이 하기 표 2와 같이 진행되었다.

박테리아	참고문헌
B. Anthracis	Schuch, R. et al, 2002
C. perfringens	Zimmer, M. et al, 2002
S. pneumoniae	Loeffler, J. et al, 2001
L. monocytogenes	Loessner, M.J, 1995

연구기관	연구내용
Igene Biotechnology, Inc.	연쇄상구균 파지 생산 및 리신 생산법에 대한 미국특허 (1989)
New Horizons Diagnostics Co.	파지 관련 리신을 이용한 세균성 소화기, 호흡기, 피부질병 치료에 관한 미국 특허 (2001)
Nymox Pharmaceutical Co.	식품의 세균오염 예방용 박테리오파지조성물 미국 특허 (2002)
록펠러 대학(V. A. Fischetti)/ New Horizons Diagnostics Co.	리신을 이용한 A군 연쇄상구균 상재 예방 및 제거 (PNAS, 2001)
	탄저균 치료용 리신 연구 보고 (Nature, 2002)
BioTix Co.	300개 이상의 인체 치료용 박테리오파지 확보
Exponential Biotherapies Co.	최초의 미국 파지 요법 전문 회사로 반코마이신 내성 장구균 치료용 파지 개발
Intralytix Co.	VRE, 양계 살모넬라 예방/치료용 파지 제품, 미국내PhageBioDerm개발 중
Georgian Technical University (R. KatS. aureusrava; 러시아)	PhagoBioDerm (화상 및 외상 보호용) 임상시험 완료, 200년 1월 24일 제품 허가
P. Barrow (Institute of Animal Health, Compton Lab. UK)	닭과 송아지의 병원성 대장균에 의한 패혈증 및 뇌수막염 파지 요법 개발
O'Flaherty et al.	광범위한 숙주역을 갖는 S. aureus특이 파지 K를 이용한 MRS. aureus저감 기술(2005)
Donovan et al., 2006; S. aureusss&Bierbaum, 2007)	파지 유래 재조합 리신의 용균 효과 연구
iNtRON Biotechnology	소 유방염 원인 포도상구균 용균 파지 및 재조합 리신 연구 및 특허출원
	S. aureuslmonella Enteritidis에 특이적인 박테리오파지를 이용한 미생물 항생제 개발

한편 최근 활발한 게놈사업의 결과 중요 박테리아의 게놈구조와 염기서열이 밝혀졌는데, 그 중 박테리오파지의 리신과 유사한 기능성 도메인을 갖는 유전자들이 밝혀졌다. 상기 박테리오파지의 리신과 유사한 유전자들 중에 박테리아의 아포토시스(apoptosis)나 분열 중에 발현되어 세포벽을 분해하는 리신을 오토리신(autolysin)이라 부르고 있으며, 오토리신은 리신을 대체할 수 있는 새로운 항생제로 개발될 가능성을 가지고 있다.

본 발명은 박테리오파지의 리신 및 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 오토리신 대비 높은 활성을 갖는 리신 융합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 일 구현예는 황색포도알균에 특이적 항균 활성을 가지는 리신 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제 또는 소독제를 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 특이적 항균 활성(antibacterial activity)을 가지며, 황색포도알균 오토리신 유래 단편과 박테리오파지 ΦK의 리신 유래 단편을 포함하는 리신 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분을 포함하는 황색포도알균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 황색포도알균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 항생제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 황색포도알균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 소독제를 제공한다.

본 발명은 박테리오파지의 리신 및 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 오토리신의 가장 활성이 좋은 기능성 도메인을 찾아 최적의 조합을 이루는 경우, 박테리오파지의 리신 및 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 오토리신 대비 높은 활성을 갖는 리신을 제공할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 구현예는 황색포도알균 오토리신 또는 이의 단편과 박테리오파지 ΦK의 리신 또는 이의 단편을 포함하며, 황색포도알균에 특이적 항균 활성을 갖는 리신 융합 단백질 및 이를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에 따른 리신 융합 단백질은 박테리오파지 ΦK의 리신 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 황색포도알균에 특이적인 박테리오파지의 리신은 도 2에 나타난 바와 같은 도메인을 가지며, 각각의 도메인은 개별적으로 또는 다른 도메인과 융합된 상태에서도 고유의 활성을 갖는 모듈(module)이다. 구체적으로 CHAP(cystein, histidine dependent amidohydrolase/peptidase), Ami_2, Amidase_3 및 AmiC는 펩티도글리칸 가수분해효소(peptidoglycan hydrolase) 활성을 갖는 도메인이며, SH3_5(bacterial SH domain)은 세포벽부착도메인(cell wall binding domain)인 것으로 알려져 있다. 세포벽부착도메인은 효소활성을 높이는데 중요하며, 세포벽부착도메인을 인위적으로 결손시키는 경우 효소활성이 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다. CHAP 및 Ami(Ami_2, Amidase_3 및 AmiC)도메인 중 하나와 세포벽부착도메인이 있는 경우에도 효소활성은 있으나 모든 도메인이 있는 경우보다 활성이 낮다는 사실이 알려져 있다(Donovan et al., 2006; Sass and Bierbaum, 2007).

본 발명에서 상기 박테리오파지 ΦK 리신의 유전자는 서열번호 1 및 이의 단편을 포함할 수 있으며, 상기 단편은 구체적으로 박테리오파지 ΦK 리신 전체 염기서열(서열번호 1)의 1 내지 516 bp 단편(서열번호 6), 493 내지 1485 bp 단편(서열번호 3), 또는 1120 내지 1485 bp 단편(서열번호 9)일 수 있다. 상기 유전자에 의해서 암호화되는 단백질의 단편은 구체적으로 리신 유전자의 1 내지 516 bp 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열 (서열번호 8), 493 내지 1485 bp 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열 (서열번호 5), 또는 1120 내지 1485 bp 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열 (서열번호 11)일 수 있다.

바람직하게는, 융합 단백질 또는 이의 암호화 유전자의 제조 및 생산에 유리하도록 서열을 코돈 최적화 및/또는 GC 조성이 최적화된 리신 유전자 또는 이의 단편을 제공할 수 있다. 상기 코돈 최적화 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자 또는 단편은 최적화 처리 전 아미노산 서열과 동일하며, 염기서열은 1 내지 516 bp 단편(서열번호 8), 493 내지 1485 bp 단편(서열번호 5), 또는 1120 내지 1485 bp 단편(서열번호 11)일 수 있다.

본 발명에 따른 리신 융합 단백질은 황색포도알균 오토리신 유래 단편과 황색포도알균에 존재하는 오토리신의 특정 효소활성을 가지는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.

황색포도알균의 게놈 구조가 밝혀져 있고, 도 3에 나타난 바와 같이 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 오토리신의 기능성 도메인의 아미노산 서열은 다양성을 보이고 있다. LytM의 COG3942는 φPVL의 CHAP와 유사하며, peptidase_M23은 glycyl glycine endopeptidase 활성을 가지고 있으며, LytH는 파지의 리신과 유사하나 SH3의 위치(N-말단), SH3 및 amidase의 아미노산 서열에서 파지의 리신과 차이를 보이고 있고, 전체 게놈 서열이 알려진 대부분의 황색포도알균에서 공통적으로 보유하고 있다. SleI는 세포벽에 결합하는 lysin motif (LysM) 2개가 존재하나 LysM의 아미노산 서열은 서로 다르며, Φpvl의 CHAP와 유사한 COG3942를 가지고 있으나 자체로 황색포도알균의 자기분해(autolysis)를 일으키지는 못하며(Kajimura et al., 2005), SleI중에서는 LysM을 세 개 가지고 있는 경우도 있다. Truncated Autolysin E는 자기분해를 일으키며, 모든 황색포도알균에서 보존되어 있으며 파지에도 유사한 구조가 존재한다.

상기 황색포도알균 오토리신의 유전자는 SleI , atlE , LytM 또는 LytH 일 수 있으며, 바람직하게는 SleI 또는 atlE , 또는 상기 유전자의 기능성 단편일 수 있으며, 예를 들면, SleI (서열번호 12)의 염기서열 454 내지 795 bp을 포함하는 단편부분(서열번호 13) 또는 atlE (서열번호 15)의 염기서열 718 내지 1179bp를 포함하는 단편부분(서열번호 16)일 수 있다.

예를 들면, 본 발명에 따른 리신 융합 단백질의 황색포도알균의 오토리신 유전자는 sleI 유전자일 수 있으며, 상기 리신 융합 단백질은 sleI 유전자의 단편에 의해 암호화되는 단백질과 박테리오파지 ΦK의 리신 유전자의 염기서열 또는 이의 단편에 의해 암호화되는 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산로 이루어진 단백질 단편을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-말단부터 순차적으로, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 리신 융합 단백질의 황색포도알균의 오토리신 유전자는 atlE 유전자일 수 있으며, 상기 리신 융합 단백질은 atlE 유전자의 단편에 의해 암호화되는 단백질과 박테리오파지 ΦK의 리신 유전자의 염기서열 또는 이의 단편에 의해 암호화되는 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산로 이루어진 단백질 단편을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-말단부터 순차적으로, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함할 수 있다.

예컨대 상기 리신 융합 단백질은 서열번호 19 또는 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 리신 융합 단백질일 수 있다. 이를 암호화 하는 핵산분자는 상기 서열번호 19 또는 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 18 또는 20로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다. 상기 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 리신 융합 단백질은 본 명세서에서 ALS-SA-2로 명명되며, 상기 서열번호 20로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 리신 융합 단백질은 본 명세서에서 ALS-SA-3로 명명된다.

상기 ALS-SA-2인 리신 융합 단백질은 박테리오파지 ΦK의 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 CHAP 도메인 대신 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 sleI 오토리신의 gCHAP 도메인을 코딩하는 454-795번째 염기서열(서열번호 13)과 박테리오파지 ΦK 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 493-1485번째 염기서열(서열번호 4)을 SOE-PCR로 연결하여 제조될 수 있다(도 4).

상기 ALS-SA-3인 리신 융합 단백질은 박테리오파지 ΦK 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 1-516번째 염기서열(서열번호 7), atlE 유전자의 718-1179번째 염기서열(서열번호 16) 및 ΦK 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 1120-1485번째 염기서열(서열번호 10)을 SOE-PCR로 연결하여 제조될 수 있다(도 5).

상기 리신 융합 단백질인 ALS-SA-2 및 ALS-SA-3 제조에는 하기 표 3에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다.

리신	증폭대상	프라이머의 염기서열
ALS-SA-2	sleI의 454-795 부분에 해당하는 342bp(서열번호 13)의 증폭	ATGGCATCATCTTTTAATCACCAA(서열번호 79)
		TTCCTTCTTAACAGTAGTACCTGCATGGATGAATGCATAGCTAGA(서열번호 80)
	코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 493-1485에 해당하는 부분인 993bp(서열번호 4)의 증폭	GCAGGTACTACTGTTAAGAAGG(서열번호 81)
		TTTGAAAACACCCCATGCAAC(서열번호 82)
	sleI의 454-795 부분과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 493-1485 부분(서열번호 18)이 연결된 1338bp의 증폭	ATGGCATCATCTTTTAATCACCAA(서열번호 79)
		TTTGAAAACACCCCATGCAAC(서열번호 82)
ALS-SA-3	atlE의 718-1179 부분에 해당하는 462bp(서열번호 7)의 증폭	GCAGGTACTACTGTTAAGAAGGAACCTAAATACGCATACCGTAAC(서열번호 88)
		AACGACAGTAGAAGAAGAAGTACCGTCATATAATTGATCATAACT(서열번호 89)
	코돈 및 GC 조성이 최적화 ΦK 리신의 1-516에 해당하는 부분인 516bp(서열번호 16)의 증폭	ATGGCAAAGACTCAGGCAGA(서열번호 86)
		TTCCTTCTTAACAGTAGTACC(서열번호 87)
	코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485에 해당하는 부분인 366bp(서열번호 10)의 증폭	TTTGAAAACACCCCATGCAAC(서열번호 82)
		GGTACTTCTTCTTCTACTGTC(서열번호 90)
	atlE의 718-1179 부분, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516 부분 및 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485 부분(서열번호 20)이 연결된 1344bp의 증폭	TTTGAAAACACCCCATGCAAC(서열번호 82)
		ATGGCAAAGACTCAGGCAGA (서열번호 86)

상기 리신 융합 단백질의 항균 특이적 활성은 황색포도알균의 세포벽을 분해시키는 것이 특징일 수 있다.

다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 황색포도알균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 앞서 상술한 바와 같이 상기 리신 융합 단백질이 황색포도알균의 세포벽을 분해하여 황색포도알균을 특이적으로 사멸시키므로 황색포도알균에 의해 유발되는 감염성 질환의 치료에 효과를 나타낸다.

상기 황색포도알균에 의해 유발되는 감염성 질환은 당업자에게 일반적으로 알려진 모든 질환을 포함한다. 예컨대 황색포도알균은 식중독, 피부 또는 조직의 감염증, 독소에 의한 쇼크, 폐렴, 세균혈증, 유방염, 또는 관절염를 유발하므로, 상기 약학적 조성물은 식중독, 피부 또는 조직의 감염증, 독소에 의한 쇼크, 폐렴, 세균혈증, 유방염, 또는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 박테리아에 의해 유발된 감염성 질환의 억제뿐만 아니라 황색포도알균에 의해 유발된 감염성 질환의 경감을 모두 포함하는 것을 의미한다.

상기 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

상기 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 상기 약학적 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 리신 융합 단백질을 0.0001-10%(w/v) 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.001-1% (w/v) 를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 황색포도알균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 항생제를 제공한다. 상기 리신 융합 단백질에 대해서는 앞서 상술한 바와 같다. 또한 상기 '항생제'는 방부제, 살균제, 및 항균제를 총칭한다.

상기 항생제는 일차적으로 황색포도알균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료제로 활용될 수 있다. 또한 기존 항생제에 대한 내성을 획득한 황색포도알균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 활용될 수 있다.

상기 항생제는 리신 단백질을 항생 물질로 이용하여 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 박테리아의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생 물질에 비하여 제품수명주기(life cycle)가 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다. 즉 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 상기 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 항생제로서의 제품수명 주기가 길어질 것으로 기대된다. 따라서 상기 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 일 구현예는 상기 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 황색포도알균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 소독제를 제공한다.

상기 소독제는 병원 2차 감염 예방, 식품 위생, 및 축산업 분야에서의 소독제로 그 활용가치가 높다. 예컨대 식품산업에서 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며, 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 리신 융합 단백질은 박테리오파지의 리신 및 게놈 상에 존재하는 오토리신 대비 높은 활성을 나타내어 황색포도알균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 또한 항생제 또는 소독제로도 응용될 수 있어 식품 위생, 축산업 분야 등에서 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 박테리오파지 리신(lysine)의 glucoseaminidase(GA), amidase(Ami) 및 endopeptidase(EP) 활성의 세포벽에 대한 작용점을 나타낸 모식도이다.
도 2는 황색포도알균에 특이적인 박테리오파지의 리신의 도메인을 나타낸 것이다.
도 3은 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 박테리오파지 리신과 유사한 기능을 갖는 효소의 기능성 도메인을 나타낸 것으로서, LytM의 도메인, LytH의 도메인, SleI의 도메인, SleI의 도메인 중 LysM이 3개인 도메인, Truncated Autolysin E의 도메인 및 AtlE의 도메인을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 ΦK 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 CHAP 도메인 대신 황색포도알균 게놈 상에 존재하는 sleI 오토리신의 gCHAP 도메인을 코딩하는 454-795번째 염기서열과 ΦK 코돈, 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 493-1485번째 염기서열을 SOE-PCR로 연결하여 ALS-SA-2를 제작과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 ΦK 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 1-516번째 염기서열, atlE 유전자의 718-1179번째 염기서열, 및 ΦK 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 1120-1485번째 염기서열을 증폭하여 SOE-PCR로 연결하여 ALS-SA-3를 제작과정을 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 1.1에서 얻은 ΦK의 리신 유전자의 코돈 및 GC 조성을 최적화하는 과정에 관한 도면이다.
도 7은 실시예 3.2에 따른 Expressway cell-free E. coli expression system 키트를 사용하여 단백질 발현이 일어나도록 하는 실험과정을 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 3.2에 따른 음성대조군과 ALS-SA-2 시험관 전사/번역 반응액을 첨가한 군의 배양결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. ALS - SA -2 제조

1.1 ΦK의 게놈 및 황색포도알균의 DNA 추출

ΦK(ATCC No.19685-B1) 동결건조 시료를 멸균한 인산완충용액 1ml에 부유한 후, 그 중 100㎕를 채취하여 Viral gene spin (인트론바이오테크놀로지, 대한민국) 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ΦK의 게놈 DNA를 추출하였다.

TSA(Tryptic Soy Agar)배지에서 하룻밤 동안 배양한 황색포도알균(ATCC19685)(S. aureus)을 백금이로 채취하여 400㎕의 용균완충용액(Tris 10mM+EDTA mM+Lysostaphin 25U/ml)에 부유하여 37℃에서 1시간 배양하였고, 그 후 95℃에서 10분간 가열하여 얼음에 정치하여 냉각시켰다. 그 후 냉각시킨 세균부유액을 12,000xg에서 15분간 원심분리 한 후 상층액 150㎕를 채취하여 Viral gene spin 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 황색포도알균의 게놈 DNA를 추출하였다.

1.2 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자의 인공합성

실시예 1.1에서 얻은 ΦK의 리신 유전자의 대장균 발현 및 이후 실험단계를 원활히 진행하기 위하여, 코돈 및 GC 조성을 최적화하였다. 상기 최적화 설계는 리신의 아미노산 서열에 상응하는 코돈을 대장균에서 가장 빈도가 높은 코돈으로 치환하였으며, 즉 글리신(Gly)은 GGT, 알라닌(Ala)은 GCA, 트레오닌(Thr)은 ACT, 시스테인(Cys)은 TGT, 아스파탐산(Asp)은 GAC, 글루탐산(Glu)은 GAA, 페닐알라닌(Phe)은 TTC, 히스티딘(His)은 CAT, 이소류신(Ile)은 ATC, 리신(Lys)은 AAA, 류신(Leu)은 CTG, 메티오닌(Met)은 ATG, 아스파라긴(Asn)은 AAC, 프롤린(Pro)은 CCG, 글루타민(Gln)은 CAG, 아르기닌(Asn)은 CGT, 세린(Ser)은 TCT, 발린(Val)은 GTT, 트립토판(Trp)은 TGG, 타이로신(Tyr)은 TAT로 치환하였고, 일부에서 GC 조성이 50% 미만인 경우 G나 C를 갖는 코돈으로 교체하여 GC조성을 최적화 하였다. 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자는 서열번호 22 내지 서열번호 78의 프라이머(표 4 참조)를 사용하여 도 6에 나타난 바와 같이 인공합성 하였다.

서열번호	염기서열
22	ATGGCAAAGACTCAGGCAGAAATCAACAAACGTCTGGACGCATATG
23	ATACGGAGAGTCAACAGTACCCTTTGCATATGCGTCCAGACGTTTGT
24	GTACTGTTGACTCTCCGTATCGTGTTAAGAAAGCAACTTCTTATGACC
25	CTGCTTCCATAACACCGAAAGACGGGTCATAAGAAGTTGCTTTCTT
26	CTTTCGGTGTTATGGAAGCAGGTGCAATCGACGCAGACGGTTATTAT
27	GTGATCAGGTCCTGACACTGTGCATGATAATAACCGTCTGCGTCGA
28	CAGTGTCAGGACCTGATCACTGACTATGTTCTGTGGCTGACTGACA
29	TGCGTTACCCCAAGTACGAACTTTGTTGTCAGTCAGCCACAGAACA
30	TTCGTACTTGGGGTAACGCAAAAGACCAGATCAAACAGTCTTATGG
31	TGTTTTCATGGATTTTGAAACCAGTACCATAAGACTGTTTGATCTG
32	CTGGTTTCAAAATCCATGAAAACAAACCGTCTACTGTTCCGAAGAA
33	CAGAAGTGAAAACTGCGATCCAACCCTTCTTCGGAACAGTAGACGG
34	GATCGCAGTTTTCACTTCTGGTTCTTATGAACAGTGGGGTCATATC
35	GTGTTACCACCGTCATAAACGATACCGATATGACCCCACTGTTCAT
36	GTTTATGACGGTGGTAACACTTCTACTTTCACTATCCTGGAACAGA
37	TTCTTGTTTGCATAACCGTTCCAGTTCTGTTCCAGGATAGTGAAAG
38	GGAACGGTTATGCAAACAAGAAGCCGACTAAACGTGTTGACAACTAT
39	TTCGATGAAATGAGTCAGACCATAATAGTTGTCAACACGTTTAGTCG
40	GGTCTGACTCATTTCATCGAAATCCCGGTTAAAGCAGGTACTACTGT
41	CAGACTTCTTTGCAGTTTCCTTCTTAACAGTAGTACCTGCTTTAACC
42	AGGAAACTGCAAAGAAGTCTGCATCTAAAACTCCGGCACCGAAGAA
43	TCTTAGAAACTTTCAGAGTTGCCTTTTTCTTCGGTGCCGGAGTTTT
44	GGCAACTCTGAAAGTTTCTAAGAACCACATCAACTATACTATGGACA
45	ATACCTTCCGGTTTCTTACCACGTTTGTCCATAGTATAGTTGATGTG
46	GGTAAGAAACCGGAAGGTATGGTTATCCATAACGACGCAGGTCGTT
47	AGAGTTTTCATACTGCTGACCAGAAGAACGACCTGCGTCGTTATGG
48	GGTCAGCAGTATGAAAACTCTCTGGCAAACGCAGGTTATGCACGTT
49	CCATAATAATGTGCGATACCGTTTGCATAACGTGCATAACCTGCGTTT
50	ACGGTATCGCACATTATTATGGTTCTGAAGGTTATGTTTGGGAAGCA
51	ATGCGATCTGGTTCTTTGCGTCGATTGCTTCCCAAACATAACCTTC
52	CGCAAAGAACCAGATCGCATGGCATACTGGTGACGGTACTGGTGCA
53	ACCTGCGAAACGGAAGTTACCAGAGTTTGCACCAGTACCGTCACCA
54	GTAACTTCCGTTTCGCAGGTATCGAAGTTTGTCAGTCTATGTCTGC
55	CGTTCTTCAGGAACTGTGCGTCAGATGCAGACATAGACTGACAAAC
56	CGCACAGTTCCTGAAGAACGAACAGGCAGTTTTCCAGTTCACTGCAG
57	AGTCAGACCCCATTCCTTGAACTTTTCTGCAGTGAACTGGAAAACT
58	TCAAGGAATGGGGTCTGACTCCGAACCGTAAGACTGTTCGTCTGCA
59	GACATGCAGTCGGAACGAATTCCATATGCAGACGAACAGTCTTACG
60	ATTCGTTCCGACTGCATGTCCGCATCGTTCTATGGTTCTGCATACT
61	GACCCTGAGTAACCGGGTTGAAACCAGTATGCAGAACCATAGAACG
62	AACCCGGTTACTCAGGGTCGTCCGTCTCAGGCAATCATGAACAAAC
63	GATCTGCTTGATGAAATAGTCCTTCAGTTTGTTCATGATTGCCTGAG
64	GGACTATTTCATCAAGCAGATCAAGAACTACATGGACAAGGGTACTT
65	TACCGTCTTTAACGACAGTAGAAGAAGAAGTACCCTTGTCCATGTAG
66	CTACTGTCGTTAAAGACGGTAAAACTTCTTCTGCATCTACTCCGGCA
67	CTTCCAAGAACCAGTAACCGGACGAGTTGCCGGAGTAGATGCAGAA
68	CGGTTACTGGTTCTTGGAAGAAAAACCAGTACGGTACTTGGTATAA
69	CCGTTAACGAAAGTTGCGTTTTCCGGTTTATACCAAGTACCGTACTGG
70	AAACGCAACTTTCGTTAACGGTAACCAGCCGATCGTTACTCGTATC
71	AACCGGTGCGTTCAGGAACGGAGAACCGATACGAGTAACGATCGGCT
72	GTTCCTGAACGCACCGGTTGGTGGTAACCTGCCGGCAGGTGCAACTAT
73	GCCTGGATACAAACTTCGTCATAAACGATAGTTGCACCTGCCGGCA
74	GACGAAGTTTGTATCCAGGCAGGTCATATCTGGATCGGTTATAACGC
75	GACAATAAACACGGTTACCGTTATATGCGTTATAACCGATCCAGATA
76	ACGGTAACCGTGTTTATTGTCCGGTTCGTACTTGTCAGGGTGTTCC
77	CATGCAACACCCGGGATCTGGTTCGGCGGAACACCCTGACAAGTAC
78	AGATCCCGGGTGTTGCATGGGGTGTTTTCAAA

구체적으로 phiKL-P1(서열번호 22) 내지 phiKL-P10(서열번호 31) 프라이머로 구성된 1번조각(F1), phiKL-P11(서열번호 32) 내지 phiKL-P20(서열번호 41) 프라이머로 구성된 2번조각(F2), phiKL-P21(서열번호 42) 내지 phiKL-P30(서열번호 51) 프라이머로 구성된 3번조각(F3), phiKL-P31(서열번호 52) 내지 phiKL-P40(서열번호 61) 프라이머로 구성된 4번조각(F4), phiKL-P41(서열번호 62) 내지 phiKL-P50(서열번호 71) 프라이머로 구성된 5번조각(F5), phiKL-P51(서열번호 72) 내지 phiKL-P57(서열번호 78) 프라이머로 구성된 6번조각(F6)을 각각 1ul씩 PCR 반응액인 10×buffer 5ul, dNTPs (2.5mM each) 1ul, Taq DNA polymerase (5U/ul) 1ul, DW 33ul에 첨가한 후, 1) 94℃ 1분, 2) 94℃ 20초, 54℃ 20초, 72℃ 30초, 3) 72℃ 1분으로, 상기 2)는 15 cycles로 PCR을 수행한 후 각각의 조각 증폭을 위해 F1에는 phiKL-P1(서열번호 22)과 phiKL-P10(서열번호 31), F2에는 phiKL-P11(서열번호 32)과 phiKL-P20(서열번호 41), F3에는 phiKL-P21(서열번호 42)과 phiKL-P30(서열번호 51), F4에는 phiKL-P31(서열번호 52)과 phiKL-P40(서열번호 61), F5에는 phiKL-P41(서열번호 62)과 phiKL-P50(서열번호 71), F6에는 phiKL-P51(서열번호 72)과 phiKL-P57(서열번호 78) 프라이머를 넣어 1) 94℃ 1분, 2) 94℃ 20초, 72℃ 30초, 3) 72℃ 1분으로, 상기 2)는 30 cycles로 PCR을 수행하였고, 증폭산물을 전기영동하여 겔에서 정제하였다. 정제된 증폭산물 F1내지 F6 1ul를 PCR 반응액인 10×buffer 5ul, dNTPs (2.5mM each) 1ul, Taq DNA polymerase (5U/ul) 1ul, DW 35ul에 첨가하여 1) 94℃ 1분, 2) 94℃ 20초, 54℃ 20초, 72℃ 30초, 3) 72℃ 1분으로, 상기 2)는 15 cycles로 PCR을 수행한 후, phiKL-F와 phiKL-R 프라이머 각 1ul를 첨가하여 1) 94℃ 1분, 2) 94℃ 20초, 72℃ 30초, 3) 72℃ 1분으로, 상기 2)는 30 cycles로 PCR을 수행하여 1,485bp의 리신 유전자(서열번호 2)를 확보하였다.

합성된 리신 유전자는 TOPO TA-cloning 키트(Invitrogen Co.)에 클로닝하여 염기서열을 결정(마크로젠 의뢰)하였고, 정확한 염기서열을 갖는 대장균 클론은 -70℃에 보관하였다.

1.3. ALS - SA -2 제조

1) sleI의 454-795 부분에 해당하는 342bp의 증폭

실시예 1.1에서 추출한 황색포도알균의 게놈 DNA 원액 1㎕으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 79(ATGGCATCATCTTTTAATCACCAA) 및 서열번호 80(TTCCTTCTTAACAGTAGTACCTGCATGGATGAATGCATAGCTAGA)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕; 마크로젠, 대한민국) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 1분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 sleI의 454-795 부분에 해당하는 342bp의 특이적인 증폭산물이 확인되었다.

2) 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 493-1485에 해당하는 부분인 993bp의 증폭

실시예 1.2에서 제조된 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 플라스미드 DNA 원액을 멸균한 3차증류수로 200배 희석하였고, 그 중 1㎕으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 81(GCAGGTACTACTGTTAAGAAGG) 및 서열번호 82(TTTGAAAACACCCCATGCAAC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 코돈 및 GC 조성이 최적화 ΦK 리신의 493-1485에 해당하는 부분인 993bp의 특이적인 증폭산물이 확인되었다.

3) sleI의 454-795 부분과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 493-1485 부분이 연결된 1338bp의 증폭(ALS-SA-2)

상기 증폭산물들을 전기영동 하여 sleI의 454-795 부분과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 493-1485 부분이 연결된 1338bp의 특이적인 밴드를 잘라내어 Gel purification kit (Qiagen 사)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제한 후 각각으로부터 1㎕를 채취하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 79(ATGGCATCATCTTTTAATCACCAA) 및 서열번호 82(TTTGAAAACACCCCATGCAAC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 39.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 sleI의 454-795 부분과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 493-1485 부분이 연결된 1338bp의 증폭산물(ALS-SA-2)이 제조되었다. 상기 증폭산물을 TOPO TA-cloning 키트를 사용하여 클로닝 하였고, 염기서열을 결정하여 서열번호 18로 이루어진 염기서열 및 서열번호 19으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 정확한 클론을 선발하였다.

실시예 2. ALS - SA -3 제조

2.1. ΦK의 게놈 및 황색포도알균의 DNA 추출 및 리신 및 오토리신 유전자 증폭은 상기 실시예 1.1과 동일하게 수행하고, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 리신 유전자 인공합성은 실시예 1.2와 동일하게 수행하였다.

2.2 atlE 의 718-1179 부분에 해당하는 462 bp 의 증폭

실시예 1.1에서 제조된 황색포도알균 게놈 DNA 원액 1㎕으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 88(GCAGGTACTACTGTTAAGAAGGAACCTAAATACGCATACCGTAAC) 및 서열번호 89(AACGACAGTAGAAGAAGAAGTACCGTCATATAATTGATCATAACT)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 1분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 atlE의 718-1179 부분에 해당하는 462bp의 특이적인 증폭산물이 확인되었다.

2.3 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516에 해당하는 부분인 516 bp 의 증폭

실시예 1.2에서 제조된 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 플라스미드 DNA 원액을 멸균한 3차증류수로 200배 희석하였고, 그 중 1㎕으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 86(ATGGCAAAGACTCAGGCAGA) 및 서열번호 87(TTCCTTCTTAACAGTAGTACC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 1분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516에 해당하는 부분인 516bp의 특이적인 증폭산물이 확인되었다.

2.4. 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485에 해당하는 부분인 366bp의 증폭

실시예 1.3에서 제조된 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 플라스미드 DNA 원액을 멸균한 3차증류수로 200배 희석하였고, 그 중 1㎕으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 82(TTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 90(GGTACTTCTTCTTCTACTGTC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 1분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485에 해당하는 부분인 366bp의 특이적인 증폭산물이 확인되었다.

2.5. atlE 의 718-1179 부분, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516 부분 및 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485 부분이 연결된 1344 bp 의 증폭( ALS - SA -3)

상기에서 증폭된 증폭산물들을 전기영동 하여 atlE의 718-1179 부분, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516 부분 및 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485 부분이 연결된 1344bp의 특이적인 밴드를 잘라내어 Gel purification kit를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제한 후 각각으로부터 1㎕를 채취하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 82(TTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 86(ATGGCAAAGACTCAGGCAGA)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 38.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 40 cycle로 수행하였다. PCR 수행 결과 atlE의 718-1179 부분, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516 부분 및 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485 부분이 연결된 1344bp의 증폭산물(ALS-SA-3)이 제조되었다. 상기 증폭산물을 TOPO TA-cloning 키트를 사용하여 클로닝 하였고, 염기서열을 결정하여 서열번호 20로 이루어진 염기서열 및 서열번호 21로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 정확한 클론을 선발하였다.

실시예 3. 리신(ALS-SA-2 및 ALS-SA-3)의 효능 시험

3.1 전사/번역용 DNA 준비

1) ALS-SA-2의 전사/번역용 DNA 준비

실시예 1.3에서 제조된, sleI의 454-795 부분과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 φK 리신의 493-1485 부분이 연결된 1338bp의 ALS-SA-2가 증폭되었다. 증폭산물을 포함하는 ALS-SA-2 플라스미드 DNA 원액을, 멸균한 3차 증류수로 50배 희석하였고, 그 중 1㎕으로 PCR을 수행하였다.

PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 83(GGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCATCATCTTTTAATCACCAA) 및 서열번호 84(CTATTTGAAAACACCCCATGCAAC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 30 cycle로 수행하였다.

PCR 수행 결과 증폭된 산물을 전기영동하여 sleI의 454-795 부분과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 φK 리신의 493-1485 부분이 연결된 1338bp의 특이적인 밴드를 잘라내어 Gel purification kit를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제한 후, 각각으로부터 5㎕를 채취하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 84(CTATTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 85(GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 38.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 30 cycle로 수행하였다. PCR 결과 증폭된 시험관 전사/번역용 ALS-SA-2 DNA를 PCR purification 키트를 사용하여 정제한 후, UV spectrophotometer로 DNA를 정량 하였다.

2) ALS-SA-3의 전사/번역용 DNA 준비

실시예 2.4에서 제조된, atlE의 718-1179 부분, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516 부분 및 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485 부분이 연결된 1344bp의 증폭산물를 포함하는 ALS-SA-3 플라스미드 DNA 원액을 3차 증류수로 50배 희석하였고, 그 중 1㎕으로 PCR을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 84(CTATTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 91(GGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAAAGACTCAGGCAGA)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 30 cycle로 수행하였다.

PCR 수행 결과 증폭된 산물을 전기영동하여 atlE의 718-1179 부분, 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1-516 부분 및 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 1120-1485 부분이 연결된 1344bp의 특이적인 밴드를 잘라내어 Gel purification kit를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제한 후, 각각으로부터 5㎕를 채취하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 82(TTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 85(GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 38.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 30 cycle로 수행하였다. PCR 결과 증폭된 시험관 전사/번역용 ALS-SA-3 DNA를 PCR purification 키트를 사용하여 정제한 후, UV spectrophotometer로 DNA를 정량 하였다.

3) 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신의 전사/번역용 DNA 준비

실시예 1.2에서 제조된 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 플라스미드 DNA 원액을 멸균한 3차증류수로 50배 희석하였고, 그 중 1㎕를 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 84(CTATTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 91(GGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAAAGACTCAGGCAGA)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 40.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 30 cycle로 수행하였다.

PCR 수행 결과 증폭된 산물을 전기영동하여 1,513bp의 특이적인 밴드를 잘라내어 Gel purification kit를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제한 후, 각각으로부터 5㎕를 채취하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응으로 10×buffer 5㎕, dNTPs (2.5mM each) 1㎕, 서열번호 82(TTTGAAAACACCCCATGCAAC) 및 서열번호 85(GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC)의 프라이머 각각 (10pmol/ul) 1.0㎕, Taq DNA polymerase (5U/㎕) 0.5㎕, DW 38.5㎕를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건으로는 1) 94℃ 4분, 2) 94℃ 30초, 54℃ 20초, 72℃ 2분, 3) 72℃ 5분으로, 2)는 30 cycle로 수행하였다. 증폭된 1,562bp의 시험관 전사/번역용의 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 DNA를 PCR purification 키트를 사용하여 정제한 후 UV spectrophotometer로 DNA를 정량 하였다.

3.2 ALS - SA -2의 효능 평가

실시예 3.1의 시험관 전사/번역용 ALS-SA-2 DNA, 시험관 전사/번역용 ALS-SA-3 DNA, 및 증폭된 시험관 전사/번역용의 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 DNA는 Expressway cell-free E. coli expression system 키트(Invitrogen, 미국)를 사용하여 단백질 발현이 일어나도록 하였다. 구체적으로 키트에서 제공하는 E. coli slyD-extract 20ul, 2.5X IVPS E. coli reaction buffer(-A.A) 20ul, 50mM Amino acids(-Met) 1.25ul, 75mM Methionine 1ul, T7 enzyme mix 1ul, Dnase/Rnase-free 증류수(DW) 3ul에 ALS-SA-2 DNA, ALS-SA-3 DNA, ΦK 리신 DNA 1ug (3ul) 및 3차증류수 3ul를 각각 첨가하여 37℃ 교반배양기에서 3,000rpm으로 30분간 배양하였으며 각 반응액에 2X IVPS feed buffer 20ul, 50mM amino acids (-Met) 1.25ul, 75mM Methionine 1ul, Dnase/Rnase-free DW 27.75ul를 첨가하여 37℃ 교반배양기에서 3,000rpm으로 5시간 배양하여 단백질 발현이 일어나도록 하였다(도 7).

실시예 3.1에서 제조된 시험관 전사/번역용 ALS-SA-2의 활성을 알아보기 위해, 실시예 3.1의 ALS-SA-2 시험관 전사/번역 반응액 10㎕(1,290ng), 실시예 3.3의 코돈/GC 조성 최적화 ΦK 리신 시험관 전사/번역 반응액 10㎕(1836ng), 리소스타핀(lysostaphin) (1U/ml) 10㎕, 음성대조군(DNA 첨가하지 않은 시험관 전사/번역 반응액- 상기 5시간 배양하여 단백질 배양이 완료된 배양액) 10㎕을 각각 첨가한 4개의 군을 제조하고, 이들 각각을 BHI(Brain heart infusion) 육즙배지에서 하룻밤 배양한 황색포도알균(ATCC19685, 1X10⁴/ml)을 부유시킨 90㎕ 인산완충용액에 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후 BHI Agar배지에 도말하여 배양하였다. 상기 배양결과를, 대조군의 황색포도알균 집락수(cfu)를 기준으로 감소된 황색포도알균의 집락수(cfu)를 백분율로 표시하여, 황색포도알균 (ATCC19685) Inhibition rate (cfu)로서 하기 표 5에 나타내었다. 또한, 음성대조군과 ALS-SA-2 시험관 전사/번역 반응액을 첨가한 군의 배양결과를 도 8에 나타내었다.

리신	황색포도알균(ATCC19685) Inhibition rate(cfu)
코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 (1836ng) 10ul	0%
ALS-SA-2 (1,290ng) 10ul	79.60%
리소스타핀(1U/ml) 10ul	75.40%
음성대조군 10ul	0%

표 5에 나타난 바와 같이, 실험결과 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 시험관 전사/번역 반응액은 대조군 대비 차이가 없어 황색포도알균에 대한 0%의 억제능력을 나타내었으나, 대표적인 황색포도알균 살균 단백질인 리소스타핀 (1U/ml)은 황색포도알균에 대한 75.4%의 억제능력을 나타내었고, ALS-SA-2의 경우 황색포도알균에 대한 79.6%의 억제능력을 나타내었다(도 13 참고). ALS-SA-2는 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 대비 황색포도알균에 대한 높은 억제능력을 나타냈다. 시험관 전사/번역을 통해 충분한 양의 단백질이 만들어지지 않는 점을 감안하면 ALS-SA-2는 적은 양으로도 황색포도알균에 대해 높은 억제활성을 나타냄을 확인하였다.

3.3 ALS - SA -3의 효능 평가

실시예 3.1에서 제조된 시험관 전사/번역용 ALS-SA-3의 활성을 알아보기 위해, 실시예 3.1의 ALS-SA-3 시험관 전사/번역 반응액 20㎕(864ng), 코돈/GC 조성 최적화 ΦK 리신 시험관 전사/번역 반응액 20㎕(918ng), 리소스타핀 (5U/ml) 20㎕, 음성대조군(DNA 첨가하지 않은 시험관 전사/번역 반응액- 상기 실시예 3.2에서 5시간 배양하여 단백질 배양이 완료된 배양액) 20㎕를 각각 BHI 육즙배지에서 하룻밤 배양한 황색포도알균(ATCC19685, 1X104/ml)을 부유시킨 80㎕ 인산완충용액에 첨가하여 37℃에서 30분간 배양한 후 BHI 한천배지에 도말하여 배양하였고, 상기 배양결과를, 대조군의 황색포도알균 집락수(cfu)를 기준으로 감소된 황색포도알균의 집락수(cfu)를 백분율로 표시하여, 황색포도알균 (ATCC19685) Inhibition rate (cfu)로서 하기 표 6에 나타내었다.

리신	황색포도알균(ATCC19685) Inhibition rate(cfu)
코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 (918ng) 20ul	11%
ALS-SA-3 (864ng) 20ul	7%
리소스타핀(5U/ml) 20ul	99%
음성대조군 20ul	0%

표 6에 나타난 바와 같이, 실험결과 상기 코돈 및 GC 조성이 최적화된 ΦK 리신 시험관 전사/번역 반응액은은 대조군 대비 황색포도알균에 대한 11%의 억제능력을 나타내었으나, 대표적인 황색포도알균 살균 단백질인 리소스타핀 (5U/ml)은 99%의 억제능력을 나타내었고, ALS-SA-3의 경우 황색포도알균에 대한 7%의 억제능력을 나타내었다. ALS-SA-3는 코돈 및 GC 조성이 최적화 ΦK 리신 대비 황색포도알균에 대한 높은 억제능력을 보이지는 않았으나, 황색포도알균에 대한 억제활성을 나타내어 ΦK 리신 유전자의 517-1119bp 부분에 다양한 활성을 갖는 외부유전자 조각을 삽입할 수 있음을 나타내었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> LYSIN FUSION PROTEIN HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY SPECIFIC TO STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND USE THEREOF <130> DPP20130358KR <160> 91 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1485 <212> DNA <213> Bacteriophage phi K <400> 1 atggctaaga ctcaagcaga aataaataaa cgtttagatg cttatgcaaa aggaacagta 60 gatagccctt acagagttaa aaaagctaca agttatgacc catcatttgg tgtaatggaa 120 gcaggagcca ttgatgcaga tggttactat cacgctcagt gtcaagacct tattacagac 180 tatgttttat ggttaacaga taataaagtt agaacttggg gtaatgctaa agaccaaatt 240 aaacagagtt atggtactgg atttaaaata catgaaaata aaccttctac tgtacctaaa 300 aaaggttgga ttgcggtatt tacatccggt agttatgaac agtggggtca cataggtatt 360 gtatatgatg gaggtaatac ttctacattt actattttag agcaaaactg gaatggttat 420 gctaataaaa aacctacaaa acgtgtagat aattattacg gattaactca cttcattgaa 480 atacctgtaa aagcaggaac tactgttaaa aaagaaacag ctaagaaaag cgcaagtaaa 540 acgcctgcac ctaaaaagaa agcaacacta aaagtttcta agaatcacat taactataca 600 atggataaac gtggtaaaaa acctgaagga atggtaatac acaacgatgc aggtcgttct 660 tcaggacaac aatacgagaa ttcattagct aatgcaggtt atgctagata cgctaatggt 720 attgctcatt actacggctc tgaaggttat gtatgggaag caatagatgc taagaatcaa 780 attgcttggc acacgggtga tggaacagga gcaaactcag gtaactttag atttgcaggt 840 attgaagtct gtcaatcaat gagtgctagt gatgctcaat tccttaaaaa tgaacaagca 900 gtattccaat ttacagcaga gaaatttaaa gaatggggtc ttactcctaa ccgtaaaact 960 gtaagattgc atatggaatt tgtaccaact gcctgtcctc accgttctat ggttcttcat 1020 acaggattta atccagtaac acaaggaaga ccatcacaag caataatgaa taaattaaaa 1080 gattatttca ttaaacaaat taaaaactac atggataaag gaacttcaag ttctacagta 1140 gttaaagatg gtaaaacaag tagcgcaagt acaccggcaa ctagaccagt tacaggttct 1200 tggaaaaaga accagtacgg aacttggtat aaaccggaaa atgcaacatt tgtcaatggt 1260 aaccaaccta tagtaactag aataggttct ccattcttaa atgctccagt aggcggtaac 1320 ttaccggcag gggctacaat tgtatatgac gaagtttgta tccaagcagg tcacatttgg 1380 ataggttata atgcttacaa cggtaacaga gtatattgcc ctgttagaac ttgtcaaggt 1440 gttccaccta atcaaatacc tggcgttgcc tggggagtat tcaaa 1485 <210> 2 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon and GC composition optimized lysin (Bacteriophage phi K) <400> 2 atggcaaaga ctcaggcaga aatcaacaaa cgtctggacg catatgcaaa gggtactgtt 60 gactctccgt atcgtgttaa gaaagcaact tcttatgacc cgtctttcgg tgttatggaa 120 gcaggtgcaa tcgacgcaga cggttattat catgcacagt gtcaggacct gatcactgac 180 tatgttctgt ggctgactga caacaaagtt cgtacttggg gtaacgcaaa agaccagatc 240 aaacagtctt atggtactgg tttcaaaatc catgaaaaca aaccgtctac tgttccgaag 300 aagggttgga tcgcagtttt cacttctggt tcttatgaac agtggggtca tatcggtatc 360 gtttatgacg gtggtaacac ttctactttc actatcctgg aacagaactg gaacggttat 420 gcaaacaaga agccgactaa acgtgttgac aactattatg gtctgactca tttcatcgaa 480 atcccggtta aagcaggtac tactgttaag aaggaaactg caaagaagtc tgcatctaaa 540 actccggcac cgaagaaaaa ggcaactctg aaagtttcta agaaccacat caactatact 600 atggacaaac gtggtaagaa accggaaggt atggttatcc ataacgacgc aggtcgttct 660 tctggtcagc agtatgaaaa ctctctggca aacgcaggtt atgcacgtta tgcaaacggt 720 atcgcacatt attatggttc tgaaggttat gtttgggaag caatcgacgc aaagaaccag 780 atcgcatggc atactggtga cggtactggt gcaaactctg gtaacttccg tttcgcaggt 840 atcgaagttt gtcagtctat gtctgcatct gacgcacagt tcctgaagaa cgaacaggca 900 gttttccagt tcactgcaga aaagttcaag gaatggggtc tgactccgaa ccgtaagact 960 gttcgtctgc atatggaatt cgttccgact gcatgtccgc atcgttctat ggttctgcat 1020 actggtttca acccggttac tcagggtcgt ccgtctcagg caatcatgaa caaactgaag 1080 gactatttca tcaagcagat caagaactac atggacaagg gtacttcttc ttctactgtc 1140 gttaaagacg gtaaaacttc ttctgcatct actccggcaa ctcgtccggt tactggttct 1200 tggaagaaaa accagtacgg tacttggtat aaaccggaaa acgcaacttt cgttaacggt 1260 aaccagccga tcgttactcg tatcggttct ccgttcctga acgcaccggt tggtggtaac 1320 ctgccggcag gtgcaactat cgtttatgac gaagtttgta tccaggcagg tcatatctgg 1380 atcggttata acgcatataa cggtaaccgt gtttattgtc cggttcgtac ttgtcagggt 1440 gttccgccga accagatccc gggtgttgca tggggtgttt tcaaa 1485 <210> 3 <211> 993 <212> DNA <213> Bacteriophage phi K <400> 3 gcaggaacta ctgttaaaaa agaaacagct aagaaaagcg caagtaaaac gcctgcacct 60 aaaaagaaag caacactaaa agtttctaag aatcacatta actatacaat ggataaacgt 120 ggtaaaaaac ctgaaggaat ggtaatacac aacgatgcag gtcgttcttc aggacaacaa 180 tacgagaatt cattagctaa tgcaggttat gctagatacg ctaatggtat tgctcattac 240 tacggctctg aaggttatgt atgggaagca atagatgcta agaatcaaat tgcttggcac 300 acgggtgatg gaacaggagc aaactcaggt aactttagat ttgcaggtat tgaagtctgt 360 caatcaatga gtgctagtga tgctcaattc cttaaaaatg aacaagcagt attccaattt 420 acagcagaga aatttaaaga atggggtctt actcctaacc gtaaaactgt aagattgcat 480 atggaatttg taccaactgc ctgtcctcac cgttctatgg ttcttcatac aggatttaat 540 ccagtaacac aaggaagacc atcacaagca ataatgaata aattaaaaga ttatttcatt 600 aaacaaatta aaaactacat ggataaagga acttcaagtt ctacagtagt taaagatggt 660 aaaacaagta gcgcaagtac accggcaact agaccagtta caggttcttg gaaaaagaac 720 cagtacggaa cttggtataa accggaaaat gcaacatttg tcaatggtaa ccaacctata 780 gtaactagaa taggttctcc attcttaaat gctccagtag gcggtaactt accggcaggg 840 gctacaattg tatatgacga agtttgtatc caagcaggtc acatttggat aggttataat 900 gcttacaacg gtaacagagt atattgccct gttagaactt gtcaaggtgt tccacctaat 960 caaatacctg gcgttgcctg gggagtattc aaa 993 <210> 4 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon and GC composition optimized 493-1485 lysin (Bacteriophage phi K) <400> 4 gcaggtacta ctgttaagaa ggaaactgca aagaagtctg catctaaaac tccggcaccg 60 aagaaaaagg caactctgaa agtttctaag aaccacatca actatactat ggacaaacgt 120 ggtaagaaac cggaaggtat ggttatccat aacgacgcag gtcgttcttc tggtcagcag 180 tatgaaaact ctctggcaaa cgcaggttat gcacgttatg caaacggtat cgcacattat 240 tatggttctg aaggttatgt ttgggaagca atcgacgcaa agaaccagat cgcatggcat 300 actggtgacg gtactggtgc aaactctggt aacttccgtt tcgcaggtat cgaagtttgt 360 cagtctatgt ctgcatctga cgcacagttc ctgaagaacg aacaggcagt tttccagttc 420 actgcagaaa agttcaagga atggggtctg actccgaacc gtaagactgt tcgtctgcat 480 atggaattcg ttccgactgc atgtccgcat cgttctatgg ttctgcatac tggtttcaac 540 ccggttactc agggtcgtcc gtctcaggca atcatgaaca aactgaagga ctatttcatc 600 aagcagatca agaactacat ggacaagggt acttcttctt ctactgtcgt taaagacggt 660 aaaacttctt ctgcatctac tccggcaact cgtccggtta ctggttcttg gaagaaaaac 720 cagtacggta cttggtataa accggaaaac gcaactttcg ttaacggtaa ccagccgatc 780 gttactcgta tcggttctcc gttcctgaac gcaccggttg gtggtaacct gccggcaggt 840 gcaactatcg tttatgacga agtttgtatc caggcaggtc atatctggat cggttataac 900 gcatataacg gtaaccgtgt ttattgtccg gttcgtactt gtcagggtgt tccgccgaac 960 cagatcccgg gtgttgcatg gggtgttttc aaa 993 <210> 5 <211> 331 <212> PRT <213> Bacteriophage phi K <400> 5 Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys Ser Ala Ser Lys 1 5 10 15 Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val Ser Lys Asn His 20 25 30 Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro Glu Gly Met Val 35 40 45 Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln Tyr Glu Asn Ser 50 55 60 Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly Ile Ala His Tyr 65 70 75 80 Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile Asp Ala Lys Asn Gln 85 90 95 Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly Ala Asn Ser Gly Asn Phe 100 105 110 Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln Ser Met Ser Ala Ser Asp Ala 115 120 125 Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala Val Phe Gln Phe Thr Ala Glu Lys 130 135 140 Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr Pro Asn Arg Lys Thr Val Arg Leu His 145 150 155 160 Met Glu Phe Val Pro Thr Ala Cys Pro His Arg Ser Met Val Leu His 165 170 175 Thr Gly Phe Asn Pro Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser Gln Ala Ile Met 180 185 190 Asn Lys Leu Lys Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys Asn Tyr Met Asp 195 200 205 Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly Lys Thr Ser Ser 210 215 220 Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser Trp Lys Lys Asn 225 230 235 240 Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr Phe Val Asn Gly 245 250 255 Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe Leu Asn Ala Pro 260 265 270 Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Asp Glu Val 275 280 285 Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala Tyr Asn Gly 290 295 300 Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly Val Pro Pro Asn 305 310 315 320 Gln Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys 325 330 <210> 6 <211> 516 <212> DNA <213> Bacteriophage phi K <400> 6 atggctaaga ctcaagcaga aataaataaa cgtttagatg cttatgcaaa aggaacagta 60 gatagccctt acagagttaa aaaagctaca agttatgacc catcatttgg tgtaatggaa 120 gcaggagcca ttgatgcaga tggttactat cacgctcagt gtcaagacct tattacagac 180 tatgttttat ggttaacaga taataaagtt agaacttggg gtaatgctaa agaccaaatt 240 aaacagagtt atggtactgg atttaaaata catgaaaata aaccttctac tgtacctaaa 300 aaaggttgga ttgcggtatt tacatccggt agttatgaac agtggggtca cataggtatt 360 gtatatgatg gaggtaatac ttctacattt actattttag agcaaaactg gaatggttat 420 gctaataaaa aacctacaaa acgtgtagat aattattacg gattaactca cttcattgaa 480 atacctgtaa aagcaggaac tactgttaaa aaagaa 516 <210> 7 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon and GC composition optimized 1-516 lysin (Bacteriophage phi K) <400> 7 atggcaaaga ctcaggcaga aatcaacaaa cgtctggacg catatgcaaa gggtactgtt 60 gactctccgt atcgtgttaa gaaagcaact tcttatgacc cgtctttcgg tgttatggaa 120 gcaggtgcaa tcgacgcaga cggttattat catgcacagt gtcaggacct gatcactgac 180 tatgttctgt ggctgactga caacaaagtt cgtacttggg gtaacgcaaa agaccagatc 240 aaacagtctt atggtactgg tttcaaaatc catgaaaaca aaccgtctac tgttccgaag 300 aagggttgga tcgcagtttt cacttctggt tcttatgaac agtggggtca tatcggtatc 360 gtttatgacg gtggtaacac ttctactttc actatcctgg aacagaactg gaacggttat 420 gcaaacaaga agccgactaa acgtgttgac aactattatg gtctgactca tttcatcgaa 480 atcccggtta aagcaggtac tactgttaag aaggaa 516 <210> 8 <211> 172 <212> PRT <213> Bacteriophage phi K <400> 8 Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Val Lys Lys Ala Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp 50 55 60 Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile 65 70 75 80 Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser 85 90 95 Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile 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cgttaaagac ggtaaaactt cttctgcatc tactccggca 60 actcgtccgg ttactggttc ttggaagaaa aaccagtacg gtacttggta taaaccggaa 120 aacgcaactt tcgttaacgg taaccagccg atcgttactc gtatcggttc tccgttcctg 180 aacgcaccgg ttggtggtaa cctgccggca ggtgcaacta tcgtttatga cgaagtttgt 240 atccaggcag gtcatatctg gatcggttat aacgcatata acggtaaccg tgtttattgt 300 ccggttcgta cttgtcaggg tgttccgccg aaccagatcc cgggtgttgc atggggtgtt 360 ttcaaa 366 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Bacteriophage phi K <400> 11 Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly Lys Thr Ser Ser Ala 1 5 10 15 Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser Trp Lys Lys Asn Gln 20 25 30 Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr Phe Val Asn Gly Asn 35 40 45 Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe Leu Asn Ala Pro Val 50 55 60 Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Asp Glu Val Cys 65 70 75 80 Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala Tyr Asn Gly Asn 85 90 95 Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly Val Pro Pro Asn Gln 100 105 110 Ile Pro 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720 tatacatctt acttccctaa atacgcatac cgtaacggtg taggtcgtcc tgaaggtatc 780 gttgttcatg atacagctaa tgatcgttcg acgataaatg gcgaaattag ttatatgaaa 840 aacaactatc aaaacgcatt cgtacatgca tttgttgatg gggatcgtat aatcgaaaca 900 gcaccaacgg attacttatc ttggggtgtc ggtgcagtcg gtaaccctag attcatcaat 960 gttgaaatcg tgcacacaca cgattatgct tcatttgcac gttcaatgaa taactatgct 1020 gactatgcag ctacacaatt acaatattat ggtttaaaac ctgatagtgc tgaatatgat 1080 ggaaatggta cagtatggac tcactacgct gtaagtaaat atttaggtgg tacggaccat 1140 gccgatccac atggatattt aagaagtcat aattatagtt atgatcaact atatgactta 1200 attaatgaaa aatatttaat aaaaatgggt aaagtggcgc catggggtac gcaatctaca 1260 actaccccta ctacaccatc aaaaccatca acaccgtcga aaccatcaac accatcaact 1320 ggtaaattaa cagttgctgc taataatggt gtcgcacaaa tcaaacctac aaatagtggt 1380 ttatatacta ctgtttacga caaaactggt aaagcaacta atgaagttca aaaaacattt 1440 gctgtatcta aaacagctac attaggtaat caaaaattct atcttgttca agattacaat 1500 tctggtaata aatttggttg ggttaaagaa ggcgatgtgg tttacaacac agctaaatca 1560 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ggtattcgtg cttctgttta tgaaaaaaca gcgaaaaacg gtgcaaaata tgcggatcgt 2460 acattctatg taacaaaaga acgtgcacat ggtaatgaaa catacgtatt attaaataat 2520 acaagtcata atattccatt aggttggttc aatgtaaaag acttaaatgt tcaaaactta 2580 ggcaaagaag ttaaaacgac tcaaaaatat actgttaaca gatcaaataa cggcttatca 2640 atggttcctt ggggtactaa aaaccaagtc attttaacag gcaataacat tgctcaaggt 2700 acatttaatg caacgaaaca agtatctgta ggcaaagatg tttatttata cggtactatt 2760 aataaccgca ctggttgggt aaattcaaaa gatttaactg caccaactgc tgttaaacca 2820 actacatcag ctgccaaaga ttataactac acttatgtaa ttaaaaatgg taatggttat 2880 tactatgtaa caccaaattc tgatacagct aaatactcat taaaagcatt taatgaacaa 2940 ccattcgcag ttgttaaaga acaagtcatt aatggacaaa cttggtacta tggtaaatta 3000 tctaacggta aattagcatg gattaaatca actgatttag ctaaagaatt aattaagtat 3060 aatcaaatag gtatgacatt aaaccaagtt gctcaaatac aagctggttt acaatataaa 3120 ccacaagtac aacgtgtacc aggtaagtgg acagatgcta actttaatga tgttaagcat 3180 gcaatggata cgaagcgttt agctcaagat ccagcattaa aatatcaatt cttacgctta 3240 gaccaaccac aaaatatttc tattgataaa attaatcaat tcttaaaagg taaaggtgta 3300 ttagaaaacc aaggtgctgc atttaacaaa gctgctcaaa tgtatggcat taatgaagtt 3360 tatcttatct cacatgccct attagaaaca ggtaacggta cttctcaatt agcaaaaggt 3420 gcagatgtag tgaacaacaa agttgtaact aactctaaca cgaaatacca taacgtattt 3480 ggtattgctg catatgataa cgatccttta cgtgaaggta ttaaatatgc taaacaagct 3540 ggttgggaca cagtatcaaa agcaatcgtt ggtggtgcta aattcatcgg caactcatat 3600 gttaaagctg gtcaaaatac gctttacaaa atgagatgga atcctgcaca tccaggaaca 3660 caccaatatg ctacagatgt agattgggct aacatcaatg ctaaaatcat caaaggctac 3720 tatgataaaa ttggcgaagt cggcaaatac ttcgacatcc cacaatataa ataa 3774 <210> 16 <211> 462 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 16 gattatacat cttacttccc taaatacgca taccgtaacg gtgtaggtcg tcctgaaggt 60 atcgttgttc atgatacagc taatgatcgt tcgacgataa atggcgaaat tagttatatg 120 aaaaacaact atcaaaacgc attcgtacat gcatttgttg atggggatcg tataatcgaa 180 acagcaccaa cggattactt atcttggggt gtcggtgcag tcggtaaccc tagattcatc 240 aatgttgaaa tcgtgcacac 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acagtatgga ctcactacgc tgtaagtaaa 900 tatttaggtg gtacggacca tgccgatcca catggatatt taagaagtca taattatagt 960 tatgatcaat tatatgacgg tacttcttct tctactgtcg ttaaagacgg taaaacttct 1020 tctgcatcta ctccggcaac tcgtccggtt actggttctt ggaagaaaaa ccagtacggt 1080 acttggtata aaccggaaaa cgcaactttc gttaacggta accagccgat cgttactcgt 1140 atcggttctc cgttcctgaa cgcaccggtt ggtggtaacc tgccggcagg tgcaactatc 1200 gtttatgacg aagtttgtat ccaggcgggt catatctgga tcggttataa cgcatataac 1260 ggtaaccgtg tttattgtcc ggttcgtact tgtcagggtg ttccgccgaa ccagatcccg 1320 ggtgttgcat ggggtgtttt caaa 1344 <210> 21 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALS-SA-3 <400> 21 Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Val Lys Lys Ala Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp 50 55 60 Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile 65 70 75 80 Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser 85 90 95 Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr 100 105 110 Glu Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser 115 120 125 Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys 130 135 140 Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu 145 150 155 160 Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Pro Lys Tyr Ala 165 170 175 Tyr Arg Asn Gly Val Gly Arg Pro Glu Gly Ile Val Val His Asp Thr 180 185 190 Ala Asn Asp Arg Ser Thr Ile Asn Gly Glu Ile Ser Tyr Met Lys Asn 195 200 205 Asn Tyr Gln Asn Ala Phe Val His Ala Phe Val Asp Gly Asp Arg Ile 210 215 220 Ile Glu Thr Ala Pro Thr Asp Tyr Leu Ser Trp Gly Val Gly Ala Val 225 230 235 240 Gly Asn Pro Arg Phe Ile Asn Val Glu Ile Val His Thr His Asp Tyr 245 250 255 Ala Ser Phe Ala Arg Ser Met Asn Asn Tyr Ala Asp Tyr Ala Ala Thr 260 265 270 Gln Leu Gln Tyr Tyr Gly Leu Lys Pro Asp Ser Ala Glu Tyr Asp Gly 275 280 285 Asn Gly Thr Val Trp Thr His Tyr Ala Val Ser Lys Tyr Leu Gly Gly 290 295 300 Thr Asp His Ala Asp Pro His Gly Tyr Leu Arg Ser His Asn Tyr Ser 305 310 315 320 Tyr Asp Gln Leu Tyr Asp Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp 325 330 335 Gly Lys Thr Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly 340 345 350 Ser Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala 355 360 365 Thr Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro 370 375 380 Phe Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile 385 390 395 400 Val Tyr Asp Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr 405 410 415 Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln 420 425 430 Gly Val Pro Pro Asn Gln Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P1 (1-46) <400> 22 atggcaaaga ctcaggcaga aatcaacaaa cgtctggacg catatg 46 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P2 (26-72) <400> 23 atacggagag tcaacagtac cctttgcata tgcgtccaga cgtttgt 47 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P3 (53-100) <400> 24 gtactgttga ctctccgtat cgtgttaaga aagcaacttc ttatgacc 48 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P4 (79-124) <400> 25 ctgcttccat aacaccgaaa gacgggtcat aagaagttgc tttctt 46 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P5 (104-150) <400> 26 ctttcggtgt tatggaagca ggtgcaatcg acgcagacgg ttattat 47 <210> 27 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P6 (131-176) <400> 27 gtgatcaggt cctgacactg tgcatgataa taaccgtctg cgtcga 46 <210> 28 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P7 (157-202) <400> 28 cagtgtcagg acctgatcac tgactatgtt ctgtggctga ctgaca 46 <210> 29 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P8 (183-228) <400> 29 tgcgttaccc caagtacgaa ctttgttgtc agtcagccac agaaca 46 <210> 30 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P9(209-254) <400> 30 ttcgtacttg gggtaacgca aaagaccaga tcaaacagtc ttatgg 46 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P10 (235-280) <400> 31 tgttttcatg gattttgaaa ccagtaccat aagactgttt gatctg 46 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P11 (252-302) <400> 32 ctggtttcaa aatccatgaa aacaaaccgt ctactgttcc gaagaa 46 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P12 (283-328) <400> 33 cagaagtgaa aactgcgatc caacccttct tcggaacagt agacgg 46 <210> 34 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P13 (309-354) <400> 34 gatcgcagtt ttcacttctg gttcttatga acagtggggt catatc 46 <210> 35 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P14 (335-380) <400> 35 gtgttaccac cgtcataaac gataccgata tgaccccact gttcat 46 <210> 36 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P15 (361-406) <400> 36 gtttatgacg gtggtaacac ttctactttc actatcctgg aacaga 46 <210> 37 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P16 (386-431) <400> 37 ttcttgtttg cataaccgtt ccagttctgt tccaggatag tgaaag 46 <210> 38 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P17 (410-456) <400> 38 ggaacggtta tgcaaacaag aagccgacta aacgtgttga caactat 47 <210> 39 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P18 (434-480) <400> 39 ttcgatgaaa tgagtcagac cataatagtt gtcaacacgt ttagtcg 47 <210> 40 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P19 (460-506) <400> 40 ggtctgactc atttcatcga aatcccggtt aaagcaggta ctactgt 47 <210> 41 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P20 (486-532) <400> 41 cagacttctt tgcagtttcc ttcttaacag tagtacctgc tttaacc 47 <210> 42 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P21 (512-557) <400> 42 aggaaactgc aaagaagtct gcatctaaaa ctccggcacc gaagaa 46 <210> 43 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P22 (533-583) <400> 43 tcttagaaac tttcagagtt gcctttttct tcggtgccgg agtttt 46 <210> 44 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P23 (561-46) <400> 44 ggcaactctg aaagtttcta agaaccacat caactatact atggaca 47 <210> 45 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P24 (581-632) <400> 45 ataccttccg gtttcttacc acgtttgtcc atagtatagt tgatgtg 47 <210> 46 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P25 (613-653) <400> 46 ggtaagaaac cggaaggtat ggttatccat aacgacgcag gtcgtt 46 <210> 47 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P26 (639-684) <400> 47 agagttttca tactgctgac cagaagaacg acctgcgtcg ttatgg 46 <210> 48 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P27 (664-709) <400> 48 ggtcagcagt atgaaaactc tctggcaaac gcaggttatg cacgtt 46 <210> 49 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P28 (690-737) <400> 49 ccataataat gtgcgatacc gtttgcataa cgtgcataac ctgcgttt 48 <210> 50 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P29 (716-762) <400> 50 acggtatcgc acattattat ggttctgaag gttatgtttg ggaagca 47 <210> 51 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P30 (742-787) <400> 51 atgcgatctg gttctttgcg tcgattgctt cccaaacata accttc 46 <210> 52 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P31 (768-813) <400> 52 cgcaaagaac cagatcgcat ggcatactgg tgacggtact ggtgca 46 <210> 53 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P32 (795-840) <400> 53 acctgcgaaa cggaagttac cagagtttgc accagtaccg tcacca 46 <210> 54 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P33 (821-866) <400> 54 gtaacttccg tttcgcaggt atcgaagttt gtcagtctat gtctgc 46 <210> 55 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P34 (847-892) <400> 55 cgttcttcag gaactgtgcg tcagatgcag acatagactg acaaac 46 <210> 56 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P35 (873-919) <400> 56 cgcacagttc ctgaagaacg aacaggcagt tttccagttc actgcag 47 <210> 57 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P36 (900-945) <400> 57 agtcagaccc cattccttga acttttctgc agtgaactgg aaaact 46 <210> 58 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P37 (926-971) <400> 58 tcaaggaatg gggtctgact ccgaaccgta agactgttcg tctgca 46 <210> 59 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P38 (952-997) <400> 59 gacatgcagt cggaacgaat tccatatgca gacgaacagt cttacg 46 <210> 60 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P39 (978-1023) <400> 60 attcgttccg actgcatgtc cgcatcgttc tatggttctg catact 46 <210> 61 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P40 (1003-1048) <400> 61 gaccctgagt aaccgggttg aaaccagtat gcagaaccat agaacg 46 <210> 62 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P41 (1030-1075) <400> 62 aacccggtta ctcagggtcg tccgtctcag gcaatcatga acaaac 46 <210> 63 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P42 (1055-1101) <400> 63 gatctgcttg atgaaatagt ccttcagttt gttcatgatt gcctgag 47 <210> 64 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P43 (1080-1126) <400> 64 ggactatttc atcaagcaga tcaagaacta catggacaag ggtactt 47 <210> 65 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P44 (1107-1153) <400> 65 taccgtcttt aacgacagta gaagaagaag tacccttgtc catgtag 47 <210> 66 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P45 (1133-1179) <400> 66 ctactgtcgt taaagacggt aaaacttctt ctgcatctac tccggca 47 <210> 67 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P46 (1161-1206) <400> 67 cttccaagaa ccagtaaccg gacgagttgc cggagtagat gcagaa 46 <210> 68 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P47 (1182-1232) <400> 68 cggttactgg ttcttggaag aaaaaccagt acggtacttg gtataa 46 <210> 69 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P48 (1212-1259) <400> 69 ccgttaacga aagttgcgtt ttccggttta taccaagtac cgtactgg 48 <210> 70 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P49 (1239-1284) <400> 70 aaacgcaact ttcgttaacg gtaaccagcc gatcgttact cgtatc 46 <210> 71 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P50 (1265-1311) <400> 71 aaccggtgcg ttcaggaacg gagaaccgat acgagtaacg atcggct 47 <210> 72 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P51 (1293-1340) <400> 72 gttcctgaac gcaccggttg gtggtaacct gccggcaggt gcaactat 48 <210> 73 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P52 (1322-1367) <400> 73 gcctggatac aaacttcgtc ataaacgata gttgcacctg ccggca 46 <210> 74 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P53 (1348-1394) <400> 74 gacgaagttt gtatccaggc aggtcatatc tggatcggtt ataacgc 47 <210> 75 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P54 (1374-1420) <400> 75 gacaataaac acggttaccg ttatatgcgt tataaccgat ccagata 47 <210> 76 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P55 (1400-1445) <400> 76 acggtaaccg tgtttattgt ccggttcgta cttgtcaggg tgttcc 46 <210> 77 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P56 (1427-1472) <400> 77 catgcaacac ccgggatctg gttcggcgga acaccctgac aagtac 46 <210> 78 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-P57 (1454-1485) <400> 78 agatcccggg tgttgcatgg ggtgttttca aa 32 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHAPATG-F <400> 79 atggcatcat cttttaatca ccaa 24 <210> 80 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHAPKL-R <400> 80 ttccttctta acagtagtac ctgcatggat gaatgcatag ctaga 45 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLdCHAP-F <400> 81 gcaggtacta ctgttaagaa gg 22 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKL-R <400> 82 tttgaaaaca ccccatgcaa c 21 <210> 83 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS-gCHAP (RBS-gCHAP-specific primer) <400> 83 gggttaactt taagaaggag atatacatat ggcatcatct tttaatcacc aa 52 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TR (phi K lysin SH3-end reverse primer) <400> 84 ctatttgaaa acaccccatg caac 24 <210> 85 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7Ecol-ComF <400> 85 ggatcctaat acgactcact atagggttaa ctttaagaag gagatatac 49 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phiKLF <400> 86 atggcaaaga ctcaggcaga 20 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLCHAP-R <400> 87 ttccttctta acagtagtac c 21 <210> 88 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gAMILink-F <400> 88 gcaggtacta ctgttaagaa ggaacctaaa tacgcatacc gtaac 45 <210> 89 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gAMILink-R <400> 89 aacgacagta gaagaagaag taccgtcata taattgatca taact 45 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLSH3-F <400> 90 ggtacttctt cttctactgt c 21 <210> 91 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS-Klysin (RBS-phi K lysin-specific primer) <400> 91 gggttaactt taagaaggag atatacatat ggcaaagact caggcaga 48

Claims (10)

1. 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 특이적 항균 활성(antibacterial activity)을 가지며,
   황색포도알균의 오토리신 유래 단편과 박테리오파지 ΦK의 리신 유래 단편을 포함하는 리신 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 리신 융합 단백질은 N-말단부터 순차적으로, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함하거나, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편을 포함하는 리신 융합 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 리신 융합 단백질은 서열번호 19 또는 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 리신 융합 단백질.
4. 제1항에 있어서, 상기 항균 특이적 활성은 황색포도알균의 세포벽을 분해시키는 것을 특징으로 하는 리신 융합 단백질.
5. 제2항의 리신 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 18 또는 20로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 감염성 질환은 식중독, 피부 또는 조직의 감염증, 독소에 의한 쇼크, 폐렴, 또는 세균혈증인 약학적 조성물.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 항생제.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 리신 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 황색포도알균(Staphylococcus aureus)에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 소독제.

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