KR20140066521A

KR20140066521A - 점액을 분비하는 어류로부터 수득한 점액을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20140066521A
Application number: KR1020120133864A
Authority: KR
Inventors: 박성민; 박지영; 서일호
Original assignee: 주식회사 뉴메디온
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2014-06-02
Also published as: KR101460669B1

Abstract

본 발명은 점액을 분비하는 어류로부터 수득한 점액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부장벽기능 회복, 아토피 개선 효과, 항염증 효과가 매우 뛰어나다.

Description

점액을 분비하는 어류로부터 수득한 점액을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition with mucus from fish}

본 발명은 점액을 분비하는 어류로부터 수득한 점액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am . Acad . Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am . Acad . Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 상기 외에도, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화 될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고, 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 MMP(Matrix metallopretease)라는 효소가 관여하는데, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 하지만, 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 분해효소(MMP)의 활성만을 단순 억제하는 것이 대부분이었다.

한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌이 과잉생산되면 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있는데, 멜라닌 과잉생산을 예방하기 위한 연구개발이 현재 활발히 진행되고 있다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있다. 하지만, 이들 성분은 화장품 제형 중에서 안정성이 나빠, 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하거나 또는 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

한편, 인체에 있어서 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다. 이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌 세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 진피층에서 공급된 물은 주로 수동적 확산에 의해 각질층 상부로 이동하며 최종적으로는 외부로 배출된다. 이를 경피수분 손실(Trans Epidermal Water Loss : TEWL)이라 하며, 이러한 경피수분 손실을 적절한 수준으로 유지시켜주는 것이 각질세포층의 지질막 성분인 피지성분과 표피지질이라고 알려져 있다.

한편, 각질세포층에는 천연보습 인자(Natural Moisturizing Factor : NMF) 라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 각질세포층은 수분이 10내지 30% 정도가 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다. 하지만, 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 예를 들어, 건성피부의 경우에는 각질세포의 결집력이 약화되어 피부표면으로부터 비늘조각과 같이 각질세포가 허옇게 벗겨져 나오는 스케일링현상이 나타난다. 이와 같이 피부가 건성화되는 것은 각질세포층의 수분함량이 정상피부에 비해 적기 때문이다. 이 외에, 건강한 피부라 할지라도 혹독한 외부환경 즉, 바람, 추운 날씨, 햇빛, 세안, 면도 등에 의해 수분 부족현상이 일어나 피부상태가 나빠지기도 한다.

따라서, 피부 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH 기)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기(OH 기)가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있다. 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 보습능력에 한계가 있었다.

각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 아미노산, 젖산, 요소 및 무기염 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어질 수 있는데, 피부 외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다.

한편, 최근에는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

본 발명자들은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 점액을 분비하는 표피를 갖는 어류로부터 수득된 점액을 선정하였으며, 이들 점액에서 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부장벽기능 회복, 아토피 개선 효과, 항염증의 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

본 발명은 점액을 분비하는 표피를 갖는 어류로부터 점액을 수득하여 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부장벽기능 회복, 항염증의 효과, 아토피 개선 효과를 가지는 화장료 조성물로 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 피부로 점액을 분비하는 점액성 표피를 갖는 어류로부터 수득된 점액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 ‘피부로 점액을 분비하는’ 소위, ‘점액성 표피’를 갖는 어류란 민물고기, 바닷고기를 막론하고 비늘이 없으면서(메기) 표피가 점액성 물질로 싸여 있거나, 비늘이 체표면에 깊이 파묻혀있는 둥근비늘을 가지고 있으면서 표피가 점액성 물질로 싸여있는 어류를 포함한다. 일 예로는, 바다장어, 뱀장어, 미꾸라지, 미꾸리, 메기, 먹장어 등이 있으며, 작업의 편의상 장어, 먹장어를 사용하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 점액성 표피를 갖는 어류로부터 수득된 점액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는데, 조성물 중 첨가되는 점액의 양은 특정한 범위로 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30 중량% 함유되는 것이 좋다. 상기 범위 내로 점액을 함유하면 화장료 조성물의 품질 적성을 훼손하지 않으면서 상기의 점액성 표피를 갖는 어류로부터 수득된 점액의 효과가 충분히 발휘되게 된다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 일 예로, 항산화용, 주름 개선용, 피부 미백용, 아토피 개선용, 피부보습용, 피부장벽기능 회복용, 항염증용 중 선택되는 어느 하나의 용도를 가질 수도 있다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 점액성 표피를 갖는 어류로부터 수득된 점액 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.001 내지 30중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특정한 것에 한정되는 것은 아니고, 일 예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 에멀젼, 연고로 이루어진 기초화장료 제형, 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 좋다. 또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있으며, 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부장벽기능 회복, 아토피 개선 효과, 항염증 효과가 매우 뛰어나다.

또한, 본 발명은 어류 점액을 이용하기 때문에 인체에 무해하여 안전성이 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지 모두 포함한다.

실시예 : 점액성 표피를 갖는 어류로부터 점액의 수득

점액성 어류로는 시중에서 구할 수 있는 50~60㎝ 정도의 장어와 먹장어를 선별하였으며 일반적 방법으로 사육하였다. 장어와 먹장어를 흐르는 깨끗한 물에 세척하고 비슷한 크기(50~60㎝)만 선별하여 70% 에탄올로 깨끗이 소독하고 정확하게 점액을 얻기 위해 무게를 측정하였다.

무게를 측정한 장어와 먹장어를 망에 넣어 10분간 분비된 점액을 수집하고 다시 먹이를 준 후 12시간 회복기를 주고 위와 동일한 방법으로 다시 점액을 수집하였으며, 수집한 점액은 냉장보관하였다.

시험예 1: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어와 먹장어 점액의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 레티놀과 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하여, NBT법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium ; NBT)과 반응하여 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서,

1. 0.05M Na2CO3 ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl2 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1과 같다.

[수학식 1]

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시험 결과, 표 1과 같이 0.1% 처리농도에서 시험한 시료 모두에서 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 장어 및 먹장어 점액의 항산화 효과는 88, 90%로 레티놀 및 BHT과 비슷한 우수한 항산화 효과가 있음이 확인되었다.

시료명	처리농도(%)	항산화효과(%)
장어 점액	0.1	88
먹장어 점액	0.1	90
레티놀	0.1	88
BHT	0.1	84

시험예 2: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 및 먹장어 점액의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E와 같은 항산화제를 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서,

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2에 나타내었다.

[수학식 2]

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시험 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 장어 및 먹장어 점액은 0.01% 농도에서 녹차추출물과 비타민E 보다 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

시료명	처리농도 (%)	항산화 효과 (%)
장어 점액	0.01	58
먹장어 점액	0.01	61
녹차추출물	0.01	40
비타민 E	0.01	37

시험예 3: in vitro MMP -1 inhibition assay

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 및 먹장어 점액의 항노화 효과를 측정하기 위해 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성을 생화학적 모델에서 측정하였는데, 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 하였다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라 프루브).

클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek (상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트내에 공급하였다. 돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl2 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프로브스)를 이용하였다. 장어 및 먹장어 점액은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다.

각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물 (control)도 동일하게 항온처리하였다.

또한, 각각의 실험 조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기 (여기:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다.

‘효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타냈다.

결론적으로 선택된 실험 조건하에서 0.04 내지 4%(v/v)에서 테스트된 장어 및 먹장어 점액은 투여량 의존성으로 항콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

결과는 표 3에 나타난 바와 같이 장어 및 먹장어 점액은 0.04% 처리 시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 83%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 것으로 확인되었다.

실험샘플	저해율 (%)
실험샘플	처리농도 (%) 0.02	처리농도 (%) 0.04
장어 점액	68	85
먹장어 점액	67	83
레티놀	0	9
녹차추출물	55	70

시험예 4: 자외선 조사 후 장어 및 먹장어 점액에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 및 먹장어 점액의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃ 에서 60분 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

결과는 표 4에 나타난 바와 같이, 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 장어 및 먹장어 점액은 20% 이상의 억제율을 보였으며, 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다.

시험군	처리농도 (%)	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
장어 점액	0.1	25
먹장어 점액	0.1	24
레티놀	0.1	21

시험예 5: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예에서 수득한 장어 및 먹장어 점액의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다.

세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res ., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH (10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

[수학식 3]

저해율 (%) = [(A-B)/A]x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 하기 표 5에서와 같이 장어 및 먹장어 점액의 IC₅₀값은 각각 0.10%와 0.09%로, 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 비슷하거나 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

시료명	멜라닌 생성 억제효과(IC₅₀)
장어 점액	0.10%
먹장어 점액	0.09%
하이드로퀴논	0.06%
알부틴	0.31%
상백피 추출물	0.12%
유용성 감초 추출물	0.04%

시험예 6: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 및 먹장어 점액의 항염증효과를 확인하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 평가한 것이다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 장어 및 먹장어 점액을 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕취하여 IL-1α를 정량함으로서 장어 및 먹장어 점액의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay;ELISA)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 4에 의해 계산하였다.

[수학식 4]

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

실험결과, 표 6에 나타난 바와 같이 장어 및 먹장어 점액은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.02% 농도에서 각각 67%, 65% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

시료명	처리농도 (%)	염증성 사이토카인 발현 억제율 (%)
장어 점액	0.01	35
장어 점액	0.02	67
먹장어 점액	0.01	34
먹장어 점액	0.02	65

시험예 7: 피부미백 측정 실험

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 점액을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 7에 나타낸 바와 같았다. 우선 표 7에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 1, 비교예 1)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 10명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 1에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타 (Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기 변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

[미백효능 평가 기준]

-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선

표 8에서 나타낸 바와 같이 장어 점액을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있었다.

	원료	실시예 1	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
	유동파라핀	5	5
나	장어 점액	5	-
	프로필렌글리콜	5	5
	글리세린	4	4
	정제수	to 100	to 100

주)단위: 중량%

	피부색의 밝기 변화(ΔL)	숙련자의객관적 평가		피검자의주관적 평가
	피부색의 밝기 변화(ΔL)	실시예 1	비교예 1	실시예 1	비교예 1
평균값	3.4	2.7	1.7	2.9	1.8

ΔL= 시험 후 피부 밝기 - 시험 전 피부 밝기

시험예 8: 피부잔주름 개선 효과 측정 실험

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 점액을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 잔주름 개선효과와 피부미용효과를 비교실험을 행하여 평가하였다. 비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 7에 나타낸 바와 같았다. 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 크림을 실험자(20세-35세의 여성) 10명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 1에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험완료 후 피부 잔주름 완화효과는 제품 사용전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하였다.

표 9는 실시예 1에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소율을 비교예 1의 크림을 사용한 실험자와 비교한 것이다. 표 9에서 나타난 바와 같이 장어 점액을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 눈주위 피부에서 피부 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있었다.

	실시예 1		비교예 1
	사용 전	2개월 사용 후	사용 전	2개월 사용 후
평균 잔주름 깊이	0.190	0.156	0.188	0.181
사용전 대비 주름 감소율(%)		17.89 %		3.72 %

n=10, p＜0.05

시험예 9 : 피부 보습효과 측정 실험

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 점액을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 보습효과를 비교예 2∼5와 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타내 바와 같았다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 2, 비교예 2~5)을 제조하였다. 실험자 20명을 대상으로 하박부에 실시예 2, 비교예 2~5를 바르고, 약 90분 후에, 바르기 전과 바른 후의 보습 능력을 Corneometer(CM 820)로 △Hydration을 평가하였다.

원료		실시예 4	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
가	스테아릴 알콜	8	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가) 알콜에스테르	3	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2	2	2	2
나	장어 점액	5	-	-	-	-
	글리세린	-	-	5	-	-
	Na-히알루론산염	-	-	-	5	-
	1,3-부틸렌글라이콜	-	-	-	-	5
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

주)단위: 중량%

구분	실시예 2	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
보습제 종류	장어 점액	-	글리세린	Na-히아루론산염	1,3-부틸렌글라이콜
Corneometer (△Hydration)	18	5	10	13	9

시험결과, 표 11에서 나타낸 바와 같이 장어 점액을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 보습효과가 우수함을 알 수 있었다.

시험예 10 : 경피수분손실량 ( TEWL : Trans - epidermal water loss ) 측정

본 시험예는 실시예에서 수득한 장어 점액을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 경피수분손실량(TEWL : Trans-Epidemal Water Loss)을 Tewameterr(TM300, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 비교실험을 행하여 평가하였다. 비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 상기 표 10에 나타내 바와 같았다.

20 ~ 40대 여성 40명을 대상으로 오른쪽과 왼쪽 얼굴에 각 시료를 바르고 눈가에서 3cm 우측으로 1cm 아래로 떨어진 부위를 바르기 전과 바른 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간의 경피수분손실량을 Tewameterr(TM300, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 3회 측정하여 평균값을 사용하여 경피수분손실량을 평가하였다.

구분	1시간	2시간	4시간	6시간
실시예 2	14.7	11.5	9.6	7.2
비교예 2	18.6	16.7	13.5	10.8
비교예 3	16.8	14.1	12.2	9.5
비교예 4	15.4	14.6	11.9	9.7
비교예 5	15.5	13.8	11.4	9.2

표 12에서 나타낸 바와 같이, 경피수분손실량을 측정한 결과, 장어 점액을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 경피수분손실량이 감소했음을 알 수 있었다.

시험예 11 : 아토피 개선 효과

본 시험예는 상기 실시예1과 비교예 1의 화장료에 대하여 아토피가 있는 사람을 대상으로 아토피 개선 효과를 비교실험을 행하여 평가하였다.

아토피가 있는 실험자(3세-40세) 20명을 대상으로 이중 10명에게는 아토피 피부 부위에 실시예 1에서 제조된 크림을, 나머지 10명에게는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 4주간 도포하였다. 제품 도포 전(0주), 제품 도포 4주 후에 피험자의 시험 부위의 아토피 피부염 중증도, IgE 변화, 산호성 백혈구(Eosinophil) 변화, 수분함유량, 피부산성도를 각각 측정하였다. 4주간 시험에 참여한 모든 피험자들에게서 이상반응은 없었다.

표 13에는 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 아토피 개선효과를 비교한 것을 나타내었다.

시료명	아토피 피부염 중증도		IgE 변화		산호성 백혈구 변화		수분함유량		피부산성도
시료명	전	후	전	후	전	후	전	후	전	후
실시예 1	37.50	29.21	434.1	318.6	314	247	25.85	26.90	5.723	6.068
비교예 1	37.76	33.05	446.8	366.4	320	283	26.35	25.00	5.711	5.825

n=20, p＜0.05

표 13에 나타난 바와 같이, 아토피 피부 진단 기준이 되는 아토피 피부염 중증도, 혈액에서의 IgE 및 산호성 백혈구의 변화, 수분함유량, 피부산성도 등이 본 실시예의 장어 점액을 함유한 크림을 도포한 실험자에서 우수하여 본 발명의 장어 점액은 아토피 개선 효과가 우수함을 알 수 있었다.

Claims

피부로 점액을 분비하는 점액성 표피를 갖는 어류로부터 수득된 점액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 어류는,
바다장어, 뱀장어, 미꾸라지, 미꾸리, 메기 및 먹장어 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 점액은,
조성물 총 중량에 대해 0.001 ～30.0중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 주름 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
아토피 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 장벽 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.