KR20140065583A - 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물 - Google Patents

항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물은 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 봉독을 유효성분으로 함유하는 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물이 제공되며, 특히, 기존 항생제 내성을 갖는 MRSA균에 대한 천연물 봉독의 사멸효과가 있어 MRSA균에 의한 치료도 가능하다.

Description

항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물{COMPOSITION FOR THE GROWTH INHIBITING OF ANTIBIOTIC RESISTANT HAZARDOUS MICROBES}
본 발명은 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물에 관한 것으로서, 특히 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
현재까지 개발된 항생제 가운데 세계에서 가장 강력한 항생제는 반코마이신(vancomycin)으로, 페니실린의 대체약인 메티실린(methicillin)에 내성이 생긴 황색포도상구균이 퍼지자 1950년대에 개발하여 황색 포도상구균의 중증 감염증을 치료하는 데 사용해 왔다.
그러나, 항생제의 남용으로 인하여 병원균 스스로 저항할 수 있는 힘을 길러 그 내성이 점차로 강해져 어떤 항생제에도 저항할 수 있게 된 일명 슈퍼 박테리아(super bacteria)가 1996년 일본에서 처음 등장함에 따라 항생제의 효과적인 사용에 문제가 발생하였다.
세균은 항생제를 극복할 수 있는 자연적인 돌연변이체가 될 수 있으며, 이 내성균들은 내성 유전자를 다른 세균들에게 전달시켜 주어 내성균의 확대는 신속하게 이루어질 수 있다.
슈퍼박테리아는 대표적으로 MRSA(Methicillin - resistant Staphylococcus aureus)와 더욱 강한 항생제 내성을 가진 VRSA(Vancomycin - resistant Staphylococcus aureus) 및 VRE(Vancomycin -resistant Enterococci)를 들 수 있고, 항생제 내성 박테리아의 경우 항생제에 내성을 가지고, 내성은 점차로 강해져 어떤 항생제에도 저항할 수 있게 되며, 미국에서만 한 해 약 1만9000명이 슈퍼박테리아라는 항생제 내성균에 의해 사망하고 있는 등 슈퍼박테리아에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있다.
현재 슈퍼박테리아 항생제인 자이복스(Zyvox)등이 시판되고 있으나, 자이복스(Zyvox)등의 슈퍼박테리아 항생제는 부작용을 가지고 있으며, MRSA(Methicillin -resistant Staphylococcus aureus) 균이 내성이 생기기 시작하여 약효가 급격히 떨어지고 있는 현실이며, 반코마이신, 페니실린, 메티실린 내성 균주 등 수퍼박테리아에 대해 두루 효과를 가지는 슈퍼박테리아 항생제의 개발이 시급한 실정이다.
관련 선행기술로는 대한민국공개특허 제10-2004-0090432호(공개일: 2004년 10월 25일, 명칭: 베르베린을 유효성분으로 하는 메티실린 내성 포도구균의 항균 약제용 조성물)과 대한민국등록특허 제10-1171871호(공개일: 2010년 11월 23일, 명칭: 설포라펜을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 균주에 대한 항균용 조성물)이 있다.
본 발명의 목적은 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물은 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.
상기 봉독은 서양종 꿀벌의 15일령 이상된 일벌에서 유래되며 당류와 휘발성물질을 제거하여 수용성인 것이 특징이다.
상기 봉독은 전체중량대비 10-4~10 중량%를 함유하는 것이 특징이다.
상기 항생제 저항성 유해균은 메티실린 저항성 포도상구균인 것이 특징이다.
상기 조성물은 항생제를 추가로 더 포함하며, 특히 페니실린을 추가로 더 포함되며, 바람직하게는 전체중량대비 1~50 중량%로 포함되는 것이 특징이다.
상기 조성물은 음료, 사료, 식품, 의약품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 형태인 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 봉독을 유효성분으로 함유하는 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물이 제공되며, 특히, 기존 항생제 내성을 갖는 MRSA균에 대한 천연물 봉독의 사멸효과가 있어 MRSA균에 의한 치료가 가능하다.
도 1은 같은 일령때 벌을 대상으로 단백질 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 서양종 꿀벌의 15일령 미만의 일벌에서 분리된 봉독을 대상으로 성분변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 서양종 꿀벌의 15일령때의 일벌에서 분리된 봉독을 대상으로 함유된 성분을 나타낸 그래프이다.
도 4는 정제전과 서양종 꿀벌의 15일령 이후의 본 발명이 정제법을 통해 정제된 봉독의 현미경 사진도면이다.
도 5는 봉독의 MRSA CCARM 3366 균주에 대한 사멸 소요시간을 나타낸 그래프이다.
도 6은 봉독의 MRSA CCARM 3708 균주에 대한 사멸 소요시간을 나타낸 그래프이다.
도 7은 봉독의 MRSA 균 사멸기전을 나타낸 도면이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
본 발명은 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물을 제공하기 위한 것이 특징이다.
설명하면, 상기 봉독은 벌의 독낭에 들어있는 것으로, 약 40여 가지의 물질로 이루어져 있으며 기원전부터 인체의 질병치료에 이용되어 왔다.
현재 봉독 성분에 따른 작용과 기전, 봉독의 과민성과 독성, 면역요법 및 관절염, 단순포진, 다발성 경화증, 종양 등의 질병 치료 등에 대한 연구가 보고되고 있으며 특히 항균작용과 세포 손상개선효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 봉독을 본 발명에서는 우선 벌에서 분리해 내고, 그 다음 물로 용해하고 원심분리한 후 나온 상등액을 동결건조한 분말상태의 봉독건조물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 벌의 종류로 15일령 이상의 서양종 꿀벌을 사용한다.
설명하면, 꿀벌의 종류는 일반적으로 서양종꿀벌(Apis mellifera), 동양종꿀벌(Apis cerana, 인도최대종(Apis dorsata), 인도최소종(Apis florea) 등 4개의 종이 알려져 있다. 이 중 현재 우리나라에는 서양종꿀벌과 동양종꿀벌이 서식하고 있다. 특히 동양종꿀벌은 고려시대부터 사육되기 시작하였으며, 민간과 한방에서 봉침요법으로 사용되어져 왔다. 그러나 서양종꿀벌은 조선시대 고종황제시기에 독일인 선교사에 의해 1892년경에 우리나라에 도입되어 사육되고 있다.
봉독은 벌의 종류에 따라 그 성분에 차이를 보이며, 동일한 벌이라도 일령에 따라 성분의 차이가 발생한다. 이에 본 발명에서 사용한 봉독은 서양종꿀벌로 품종(sub species, strain)은 이탈리안계통 일벌(worker)로 15일령 이상된 꿀벌을 사용하여 분리한다.
이러한 상기의 봉독을 대상으로 항생제저항성 유해균에 대하여 항균효과를 나타내며, 특히 MRSA 균에 대하여 세포억제능과 살균효과를 알아낸 바, 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물을 제공하게 된다.
이때, 봉독은 상기 조성물 전체중량대비 10-4~10 중량%로 함유하는 것이 좋다.
이는 상대적으로 상기 봉독의 함량범위가 상기 10-4중량% 미만으로 함유될 경우 목적하는 항생제저항성 유해균에 대한 세포억제능과 살균효과가 떨어지게 되며, 상기 10중량%를 초과하여 함유될 경우 오히려 독성이 우려가 되며 화장품, 의약품, 식품 등 실질적으로 사용되는 제품으로 사용하기에는 부적한 상태로 제조되기 때문이다.
또한, 추가적으로 기존의 항생제를 함께 사용하며, 특히 페니실린을 함께 사용할 경우 더욱더 상승된 항생제저항성 유해균의 생장 억제능을 갖는 조성물을 제공하게 된다. 이때, 상기 항생제는 통상적으로 사용가능한 범위인 전체중량대비 1~50 중량%로 포함하는 것이 좋다.
이와 같이 본 발명은 독성이 없고 부작용이 적어 인체에 안전한 봉독을 유효성분으로 포함함으로써 항생제저항성 유해균 생장 억제용 조성물을 제공할 수 있게 된다.
또한, 상기 조성물은 어느 형태로든 사용이 가능하나, 특히 음료, 사료, 식품, 의약품 및 화장품으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 형태로 이루어져 사용하게 된다.
설명하면, 상기 본 발명의 항생제저항성 유해균 생장 억제용 조성물을 음료의 형태로 제조하기 위해서는 봉독을 입자화시킨 상기 봉독건조물 다음 액상의 베이스에 첨가하여 혼합하여 음료를 제조한다. 액상의 베이스로 물 또는 우유, 커피, 차 등이 적용될 수 있다.
상기 봉독 입자에 외에도 액상의 통상적인 음료 첨가물이 첨가될 수 있다. 음료 첨가물로 예를 들어 단당류, 이당류, 다당류, 당알콜 등의 당류와, 타우마틴, 스테비아 추출물, 사카린, 아스파르탐 등의 향미제와, 영양제, 비타민, 풍미제, 착색제, pH 조절제, 안정화제, 탄산화제 등이 첨가될 수 있다. 그밖에 음료는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다
상기 본 발명의 항생제저항성 유해균 생장 억제용 조성물을 사료의 형태로 제조하기 위해 봉독을 입자화시킨 상기 봉독건조물과 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제들이 함께 포함되어 제조된다.
상기 본 발명의 항생제저항성 유해균 생장 억제용 조성물을 식품의 형태로 제조하기 위해 봉독을 입자화시킨 상기 봉독건조물과 부형물질로 찹쌀, 맵쌀, 밀가루, 꿀, 결정 셀룰로오스, 이산화규소, 결정과당, 무수구연산, 이눌린, 비타민C, 참기름, 간장, 버터, 이스트, 소금, 설탕, 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 함께 사용될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 본 발명의 항생제저항성 유해균 생장 억제용 조성물을 의약품의 형태로 제조하기 위해 봉독을 입자화시킨 상기 봉독건조물과 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함께 사용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다. 즉, 이는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 선택될 수 있음을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체로는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 항생제저항성 유해균 생장 억제용 조성물을 화장품의 형태로 제조하기 위해 봉독을 입자화시킨 상기 봉독건조물과 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과의 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함께 혼합하여 제조하게 된다, 예를 들어 물성개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제, 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수도 있으며, 상기 첨가제의 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택되어 사용한다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 유효성분인 봉독 분리
1) 봉독
서양종꿀벌(Apis meliffera L.)을 봉독채집장치를 이용하여 봉독을 채집하되, 15일령 이상된 일벌의 봉독만을 채집하였으며, 이에 대한 성분은 하기 표 1과 같다.
분류항목
(Class of Molecules)		 구성요소
(Component)		 건조봉독에 함유된 함량
(% of Dry venom)
Enzymes Phospolipase A2 10~12
Hyaluronidase 1~3
Acid phosphomonoesterase -
Lysophopholipase -
a -glucosidase -
Other Proteins and Peptides Melittin 50
Apamine 1~3
Mast Cell Degranulating Peptide (MCD) 1~2
Secapin 0.5~2.0
Procamine 1~2
Adolapin -
Protease inhibitor -
Tertiapin * 0.1
Small peptides (with less than 5 amino acids) 13~15
Physiologically Active Amines Histamine 0.5~2.0
Dopamine 0.2~1.0
Noradrenaline 0.1~0.5
Amino Acids t -aminobutyric acid 0.5
a -amino acids 1.0
Sugars Glucose and fructose 2
Phospholipids 5
Volatile compounds 4~8
상기 표 1과 같이 구성된 봉독은 봉독의 간이정제방법을 통해 당류(sugars)와 휘발성물질(volatile compounds)를 제거함으로써 하기 표 2와 같은 성분으로 이루어져 순수한 수용성을 갖는 봉독 건조물을 본 실험에 사용하였다.
분류항목
(Class of Molecules)		 구성요소
(Component)		 건조봉독에 함유된 함량
(% of Dry venom)
Enzymes Phospolipase A2 10~12
Hyaluronidase 1~3
Acid phosphomonoesterase -
Lysophopholipase -
a -glucosidase -
Other Proteins and Peptides Melittin 45~65
Apamine 1~3
Mast Cell Degranulating Peptide (MCD) 1~2
Secapin 0.5~2.0
Procamine 1~2
Adolapin -
Protease inhibitor -
Tertiapin * 0.1
Small peptides (with less than 5 amino acids) 13~15
Physiologically Active Amines Histamine 0.5~2.0
Dopamine 0.2~1.0
Noradrenaline 0.1~0.5
Amino Acids t -aminobutyric acid 0.5
a -amino acids 1.0
Phospholipids 5
<실시예 2> 본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제효과를 갖는 봉독을 포함하는 음료 제조
상기 제조된 봉독건조물을 80℃ 온수에 전체중량의 10 중량%를 혼합하여 음료를 제조하였다.
<실시예 3> 본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제효과를 갖는 봉독을 포함하는 사료 제조
상기 제조된 봉독건조물을 통상의 기초사료(옥수수, 당밀, 콩가루, 어분, 옥수수글루텐, 대두유, 동물성지방, 염분, 인사염, 석회석, 비타민 무기물제제로 구성)에 전체중량의 5 중량%를 혼합하여 사료를 제조하였다.
<실시예 4> 본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제효과를 갖는 봉독을 포함하는 식품 제조
상기 제조된 봉독건조물을 기본 죽재료(찹쌀과 맵쌀로 구성)에 전체중량의 3 중량%를 혼합하여 식사대용의 죽 형태인 식품을 제조하였다.
<실시예 5> 본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제효과를 갖는 봉독을 포함하는 의약품 제조
상기 제조된 봉독건조물을 캅셀제 형식의 의약품의 기초재료(경정성 셀룰로오스, 락토오수, 마그네슘 스테아레이트)에 전체중량의 10-1 중량%를 혼합하고 이를 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제 형식의 의약품을 제조하였다.
<실시예 6> 본 발명의 항생제저항성 유해균의 생장 억제효과를 갖는 봉독을 포함하는 화장품 제조
상기 제조된 봉독건조물을 기능성 화장재료(카제인, 엘-시스틴, 옥수수 기름, 셀룰로오스, 비타민 혼합물, 미네랄 혼합물, 슈크로스, 옥수수전분으로 구성) 에 전체중량의 1 중량%를 혼합하여 화장품을 제조하였다.
<실험예 1> 서양종꿀벌과 동양종 꿀벌 독이 성분차이 확인
서양종 꿀벌과 동양종 꿀벌의 독의 성분 차이를 확인하기 위하여 단백질 전기영동(4~20 중량%, gradient gel tris)를 시행하였다.
설명하면, 각각의 독은 10㎍/㎖의 농도로 증류수로 희석한 후 로딩 버퍼(loading buffer)와 혼합 한 후 겔(gel)에 주입하였다. 80V의 세기로 2시간 동안 전기영동을 시행하였다. 겔을 전기영동 장치에서 제거한 후 실버스테인(silver stain)한 후 고정하였다.
그 결과, 도 1에 나타나 있듯이 같은 일령때 벌을 대상으로 단백질 전기영동한 결과로 서양종 꿀벌과 동양종 꿀벌간의 독 성분차이를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 2> 기간경과에 따른 봉독의 성분 변화 분석
실시예 1에서 분리된 봉독을 대상으로 기간경과에 따른 성분변화를 액체크로마토그래피를 통해 확인하였다.
비교대상으로 서양종 꿀벌의 15일령 미만의 일벌에서 분리해낸 봉독을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타나 있듯이 서양종 꿀벌의 15일령 미만의 일벌에서 분리해낸 봉독은 기간(연령)이 경과함에 따라 봉독성분의 변화가 발생됨을 확인되었다.
이에 반해 도 3에 나타나 있듯이 15일령 이후에 분리해 낸 실시예 1의 봉독은 기간이 경과함에 따라 성분변화가 일어나지 않음을 확인하였다. 즉, 15일령째나 그 이후 다른 연령에서 분리된 봉독의 성분변화는 차이가 없었다.
다시 말해, 하기 표 3에도 나타나 있듯이 15일령 미만의 일벌에서 분리해낸 봉독은 1시간 이내에 독량이 1마리당 0.065 mg을 나타내며 5일령이내에는 0.166 mg, 6~10 일령에는 0.211 mg을 나타낸 반면, 서양종 꿀벌의 15일령 이상된 일벌에서 분리해낸 본 발명의 실시예 1의 봉독은 0.294 mg을 함유하는 것으로 기간이 경과되어도 그 함량의 변화는 나타나지 않았다.
비교대상(15일령전) 본 발명 실시예1
1시간이내 5일령이내 6~10일령 15일령
독량(mg/마리) 0.065 0.166 0.211 0.294
상기 실험결과, 서양종 꿀벌의 15일령 이상된 일벌에서는 독성분의 변화가 없으므로, 여기서 봉독을 분리하여 간이정제한 봉독(실시예 1)을 사용할 경우 인체에 안전하게 사용가능한 함량을 정확히 측정하여 사용할 수 있으므로 , 화장품, 의약품, 기능성 식품 등 어떠한 용도로 사용하여도 안전하게 사용 가능함을 알 수 있다.
또한, 도 4에도 나타나 있듯이 정제전과 서양종 꿀벌의 15일령 이후의 본 발명이 정제법을 통해 정제된 봉독이 서로 다른 구조를 가지고 있음을 알 수 있었다.
<실험예 3> 봉독의 MRSA(메티실린 저항성 포도상 구균)균에 대한 최소생장 억제농도 및 최소 살균농도 측정
1. 실험방법
상기 실시예 1에서 준비한 봉독에 대해 최소저지억제농도(MIC)를 측정하였다. 항생제 내성균주은행으로부터 구입한 MRSA(Methicillin - resistant Staphylococcus aureus)균 CCARM 3366, CCARM 3706에 대한 봉독의 항균효과를 측정하였다.
항균효과는 액체배지 희석법에 의한 최소 성장억제농도(Minimun Inhibitory Concentration, MIC)를 확인하여 측정하였다.
봉독은 멸균 증류수로 희석한 후 무균 여과하여 액체배지 희석법에 준하여 단계적으로 희석하였다.
BHI(Brain heart infusion broth)배지에서 37℃, 18시간 동안의 호기 조건으로 배양한 후 시험에 사용하였다.
각각의 접종균은 2×106 CFU/well이 되도록 조절하여 다양한 농도로 희석한 봉독 시료와 함께 18시간 동안 배양한 후, 육안 및 현미경으로 균의 성장을 관찰하였다.
이에, 흡수파장 540 nm에서 흡광도를 측정하여 순수배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제농도로 결정하였으며 최소살균농도는 BHI배지에 배양한 봉독 시료균을 콜로니 테스트하여 군락이 형성되지 않는 봉독의 농도로 결정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 4와 같이 나타났다.
균주 MIC(㎍/㎖) MBC(㎍/㎖)
MRSA(CCARM 3366) 0.085 0.106
MRSA(CCARM 3708) 0.11 0.14
상기 표 4에 나타나 있듯이 봉독은 MRSA균에 대하여 최소생장억제농도(MIC)가 0.085~0.11㎍/㎖로 나타났으며, 최소 살균농도(MBC)는 0.106~0.14 ㎍/㎖로 나타냄으로써, 봉독은 MRSA균에 대하여 생장억제효과 및 살균효과를 나타냄을 알 수 있었다.
<실험예 4> 봉독의 MRSA균 사멸 소요시간 측정
1. 실험방법
상기 실험예 3에서 사용된 균주를 통해 봉독의 살균력 지속시간(PAE, postantibiotic effect)을 측정하여, 항균력에 대한 안정성을 확인하였다.
MRSA(Methicillin - resistant Staphylococcus aureus)균 CCARM 3366, CCARM 3706 상기 균주들은 각각 2.5×105 CFU/well 로 조절하여 각 MIC값 2배 농도의 봉독 시료와 함께 1시간 동안 배양한 후, 원심분리와 배지 희석법을 사용하여 봉독을 제거하였다.
이후 새로운 배지로 교환하여 37℃ 배양기에서 배양하며 2시간 간격으로 균주를 측정하였다.
이때, PAE 수치가 클수록 항균 지속 효과가 우수하다고 할 수 있으며, PAE를 구하는 식은 아래와 같다.
PAE = T - C
T : 봉독을 처리한 시험구에서 log 10 까지의 생육에 걸리는 시간
C : 무처리구에서 log 10 까지의 생육에 걸리는 시간
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 5과 도 6에 나타나 있듯이, 봉독은 MRSA균에 대하여 적어도 1시간이 경과되면 사멸효과를 나타내었으며, 시간이 지남에 따라 점차적으로 높은 사멸효과를 나타냄을 알 수 있었다.
<실험예 5> 기존의 항생제와 봉독의 MRSA 균 시너지(synergy)효과 확인
1. 실험방법
상기 실험예 4와 같이 봉독과 기존 항생제를 단독으로 또는 병용하여 첨가 한 후 MRSA 균 시너지효과를 측정하였다. 시너지 효과는 Mates et al.(1982)의 방법에 따라 FICI값을 구하였다. FICI 구하는 식은 아래와 같다.
FICI = (MIC drug A 병용효과/ MIC drug A 단독효과) + (MIC drug B 병용효과/ MIC drug B 단독효과)
FICI = 0.5 (시너지 효과가 있음)
0.5< FICI <1.0 (일부 효과 있음)
FICI = 1.0 (영향을 주지 않음)
1.0< FICI <4.0 (효과 없음)
FICI = 4.0 (길항작용 있음)
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 5와 같이 나타났다.
균주 실험군
 최소성장억제농도
(MIC, ㎍/㎖)		 FIC
(㎍/㎖)
 FICI
(㎍/㎖)		 비고
단일 복합
MRSA 3366 암피실린 435 1.06 0.002 1.002
 시너지 효과가 없음
봉독 0.085 0.085 1.00
페니실린 680 1.33 0.001 0.631
 시너지 효과가 있음
봉독 0.085 0.054 0.63
MRSA 3708 암피실린 540 1.33 0.002 1.002
 시너지 효과가 없음
봉독 0.11 0.11 1.00
페니실린 851 1.75 0.002 0.775
 시너지 효과가 있음
봉독 0.11 0.085 0.77
FIC(fractional inhibitory concentration) : 항생제간의 상승효과를 파악하는 지표
0.5< FIC <1 (시너지 상승 효과가 있음)
1< FIC <4 (시너지 상승 효과가 없음)
상기 표 5에 나타나 있듯이, 봉독과 기존의 항생제 중 페니실린을 함께 사용할 경우 시너지 효과가 있음을 확인되었다.
<실험예 6> 봉독의 MRSA균 사멸기전 확인
1. 실험방법
MRSA균의 세포분열을 관여하는 자가분해효소(murein hydrolases) 생성에 관여하는 Atl 유전자의 발현에 봉독이 관여하는지를 확인하기 위하여 RT-PCR을 하였다.
O.D 값 0.5 의 균을 10 ㎖ 준비 후 농도별로 봉독을 처리, 4 시간 배양하여 MRSA균을 수거한 후 키트(QIAGEN RNeasy Mini Kit)와 RNA 보호 박테리아 시약(RNA protect Bacteria Reagent)을 이용하였으며 RNA를 분리하였다.
cDNA 합성은 전체 RNA 1㎍ 은 RT 프리믹스 키트(RT Premix kit/ Oligo dT primer)를 이용하여 45℃에서 1시간, 95℃에서 5분간 반응시킨 후 4℃ 또는 -20℃ 에 보관한 후 사용하였다.
합성된 cDNA는 PCR Premix kit (i-Taq) (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Gyunggi-do, Korea)를 이용하여 10 pmol의 Yqil과 Atl primer(표 6)을 가지고 PCR을 시행하였으며 조건은 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초, 95℃에서 45초로 30회 반복하였다. 합성된 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔로 확인하였다.
target gene Direction sequence(5'-3') bp
Yqil forward GACGTGCCAGCCTATGATTT 137
Yqil reverse ATTCGTGCTGGATTTTGTCC
Atl forward AATCAAGGTGGCACACAACA 243
Atl reverse CTCGATGCTCATGATTGACG
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 7에 나타나 있듯이, 봉독 1mg/㎖ 농도이하에서 Atl 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이에 MRSA균이 생성이 억제됨을 알 수 있었다.
상기의 결과를 토대로 본 발명에 의해, 항생제 저항성 유해균의 항균활성을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는 항생제저항성 유해균의 생장 억제용 조성물이 제공되며, 특히, 기존 항생제 내성을 갖는 MRSA균에 대한 천연물 봉독의 사멸효과가 있어 MRSA균에 의한 환자 및 가축 치료가 가능해진다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 봉독은 서양종 꿀벌의 15일령 이상된 일벌에서 유래되며 당류와 휘발성물질을 제거하여 수용성인,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  3. 청구항 1항에 있어서,
    상기 봉독은 전체중량대비 10-4~10 중량%를 함유하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  4. 청구항 1항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유해균은 메티실린 저항성 포도상구균인 것이 특징인,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  5. 청구항 1항에 있어서,
    상기 조성물은 항생제를 추가로 더 포함하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  6. 청구항 5항에 있어서,
    상기 항생제는 페니실린인,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  7. 청구항 5항에 있어서,
    상기 항생제는 전체중량대비 1~50 중량%로 포함되는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 약학 조성물.
  8. 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 화장료 조성물.
  9. 청구항 8항에 있어서,
    상기 봉독은 전체중량대비 10-4~10 중량%를 함유하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 화장료 조성물.
  10. 청구항 8항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유해균은 메티실린 저항성 포도상구균인 것이 특징인,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 화장료 조성물.
  11. 항생제저항성 유해균의 억제능 및 살균능을 갖는 봉독을 유효성분으로 함유하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 식품 조성물.
  12. 청구항 11항에 있어서,
    상기 봉독은 전체중량대비 10-4~10 중량%를 함유하는,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 식품 조성물.
  13. 청구항 11항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유해균은 메티실린 저항성 포도상구균인 것이 특징인,
    항생제저항성 유해균의 생장 억제용 식품 조성물.
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