KR20140065326A - 유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 ｉｊ-1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 ｉｊ-1 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유류분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 신균주에 관한 것으로서, 본 발명의 균주는 원유, 휘발유, 등유 및 경유 등의 유류를 분해할 수 있는 활성이 우수하고 나아가 생물계면활성제를 생산하는 능력도 가지고 있다. 따라서 본 발명의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주는 유류 오염의 확산 방지 및 유류 분해를 위한 생물학적 제조로 사용할 수 있어 친환경적인 생물계면활성제로 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 ＩＪ-1 균주 및 이의 용도{Novel strain Bacillus pumilus IJ-1 being able to degrade oil and use thereof}
본 발명은 유류분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 신균주 및 상기 신균주를 이용한 유류의 생물학적 분해에 관한 것이다.
전 세계적으로 유류수송은 대부분 해양수송에 의존하고 있으며, 유조선의 사고 등에 의한 유류 유출 및 각종 폐유 방출 등으로 해양오염이 늘어나면서 해양 생태계에 커다란 피해를 유발시키고 있다. 최근, 유류수송 선박이 대형화, 자동화 및 고속화됨에 따라 해양사고 시 수만톤에서 수십만톤에 이르는 초대형 오염사고도 발생하고 있는데, 1989년 Exxon Valdez호 오염사고, 1991년 걸프전쟁 당시의 고의유출사고, 1993년 영국 Braer호 유출사고 등 전 세계적으로 원유가 해양으로 유출되는 양은 엄청나다. 우리나라에서도 해양 유류 오염 사고가 수시로 발생되어 해양오염에 의한 자연생태계의 파괴와 연안 해역에서의 양식업에도 중대한 피해를 입히고 있다. 이러한 해양 유류 오염의 발생증가와 아울러 유류 오염 문제를 해결하려는 노력들이 많은 연구자들에 의해 활발하게 진행되어 왔다.
특히 해양 유류 오염물질인 n-, iso-, cyclo-alkane 계열의 탄화수소원과 원유(crude oil) 및 경유, 등유 등의 석유 제품에 대한 다양한 탄화수소원 기질을 분해 및 제거시키기 위한 기술이 개발되어 사용되고 있는데, 오일펜스를 설치하거나 유겔화제(oil solidifying agent)를 사용하거나, 제한된 범위에 한해서는 붐형 유흡착제(boom type absorbent)를 연결하여 사용하기도 한다. 유출된 유류는 유회수기(oil skimmer, trawl skimmer)를 이용하여 기계적으로 회수하거나 유흡착제를 사용하여 유출유를 직접 흡유하여 회수한다. 그 후에 남은 얇은 유막은 유처리제를 살포하여 해상의 유출유를 미립자화하여 분산시켜 자연계에 존재하는 유류분해 미생물이 유적 (oil droplet)을 효과적으로 이용할 수 있게끔 접촉면적을 넓혀 제거한다.
그러나 종래 이러한 방법들은 '유처리제 사용지침'에 의거하여 사용해아 하며, 유류를 회수하지 않고 현장을 소각하는 방법은 대기오염이나 소각 잔재물의 영향 등으로 좋은 방법이라고 할 수는 없다.
따라서 해양 유류 사고 시 유류 오염의 조기포착, 오염의 확산 방지 및 효율적인 방제를 위한 새로운 기술이 개발될 필요가 있으며, 특히 이러한 방법으로 생물학적 처리 방법에 대한 관심이 증가하고 있다.
이는 종래 물리 화학적인 방법보다는 생물학적 처리 방법, 예컨대 자연에 존재하는 유용 미생물을 사용할 경우 친환경적인 장점이 있기 때문에 자연에 존재하는 유류 분해능이 우수한 유용 미생물의 발굴이 시급한 실정이다.
한국등록특허 제10-0641834호 한국등록특허 제10-52063호
이에 본 발명에서는 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주를 동정하였고, 이 균주가 우수한 유류 분해능을 갖는다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 유류 분해능을 갖는 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 유류 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 유류 분해 조성물을 유효성분으로 포함하는 생물계면활성제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 유류 분해용 조성물을 유류가 오염된 환경에 살포하는 단계를 포함하는 생물환경정화(bioremediation) 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유류 분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P)를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 원유, 휘발유, 등유 또는 경유를 분해할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 용혈작용(hemolysis)을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 pH 4 ~ 10, 온도 20 ~ 50℃ 및 염 농도 10% (w/v) 이하의 조건에서 생육이 활발할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 pH 7 ~ 9, 온도 30 ~ 35℃ 및 염 농도 10% (w/v) 이하의 조건에서 생육이 활발할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 유류 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 유류 분해 조성물을 유효성분으로 포함하는 생물계면활성제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 유류 분해용 조성물을 유류가 오염된 환경에 살포하는 단계를 포함하는 생물환경정화(bioremediation) 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 환경은 토양 또는 해양일 수 있다.
본 발명은 신규한 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주에 관한 것으로서, 본 발명의 균주는 원유, 휘발유, 등유 및 경유 등의 유류분해능이 뛰어나고 더 나아가 생물계면활성제를 생산하는 능력도 가지고 있다.
따라서 본 발명의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주는 해양 유류 사고 시 또는 토양의 유류 오염 시 유류 오염의 확산 방지 및 유류의 효율적인 분해를 위한 생물학적 제제로 사용할 수 있어 환경 산업적으로도 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 를 위상차 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1의 계통학적 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 신균주에 유류를 분해하는 능력이 있는지를 알아보기 위하여 본 발명의 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1와 대조군으로 B. megaterium과 Escherichia coli DH5α(대장균)를 이용하여 (도 3a): 원유, (도 3b): 휘발유, (도 3c): 등유 및 (도 3d): 경유를 분해하는 모습을 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 신균주가 용혈작용(hemolysis) 능력을 나타냄으로써 생물계면활성제 생산 능력이 있음을 간접적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 신규주의 유류 분해능을 측정하기 위하여, 원유에 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1을 처리하여 48시간 배양한 다음, 잔류 원유 성분을 Gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID)로 분석하여 분해된 원유 시료 중의 복합 탄화수소류 크로마토그램의 피크 패턴을 나타낸 것이다(A: 대조구, B: 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1을 처리구).
본 발명은 유류 분해능이 우수한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주를 제공함에 그 특징이 있으며, 또한 상기 균주를 이용하여 유류 오염을 제거할 수 있는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
석유 탄화수소 화합물이 포함된 유류의 유출은 자연환경 오염을 야기하고 인간의 건강을 해치는 원인이 되고 있으며, 특히 유류의 해양과 토양으로의 유출은 생태계의 오염과 함께 오염된 해양과 토양 복원을 위해 많은 시간과 비용이 소비되는 문제가 있다.
따라서 유류오염 제거를 위한 많은 기술들이 종래 연구된 바 있지만 대부분이 화학물질을 사용하는 방법으로서 이러한 방법은 다른 자연환경 오염의 원인이 될 수 있다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 유류오염 제거를 위한 방법으로 미생물을 사용할 수 있는 방법을 개발하기 위해 유류 분해능이 우수한 자연계에 존재하는 미생물을 분리 및 동정하였다.
그 결과, 본 발명자들이 동정한 균주는 종래 보고된 바 없었던 신균주로서 “바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주”로 명명하였고 상기 균주는 함께 동정된 다른 균주들에 비해 유류 분해능이 가장 우수한 균주인 것으로 확인되었다. 따라서 상기 동정한 균주를 2012년 11월 02일자로 한국미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11319P를 부여받았다.
이에 본 발명자들은 동정한 상기 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주가 정말 우수한 유류 분해 활성이 있는지 조사하기 위해, 본 발명의 하기 실시예 2에서는, (주) SK 에너지에서 제공받은 원유, 시중 주유소에서 판매되고 있는 등유와 경유, 휘발유를 구입하여 이들 유류를 LB 고체배지에 첨가한 후, 본 발명의 균주를 접종시킨 다음, 각종 오일에 대하여 유류 분해 시 생성되는 투명환(emulsified halo)의 형성 여부를 조사하였는데, 조사 결과, 종래 유류 분해능을 가지고 있는 것으로 알려진 B. megaterium 균주에 비해 본 발명의 신균주가 더 우수한 유류 분해 능력을 가지고 있는 것으로 나타났다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 하기 실시예 3에서는 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1의 용혈작용(hemolysis) 활성 분석하였으며, 그 결과 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주를 처리한 군의 경우 대조군인 E. coli DH5α에 비해 용혈작용이 뚜렷한 큰 용혈존(hemolysis zone)이 나타났다. 따라서 본 발명자들이 분리 동정한 상기 신균주는 생물계면활성제 생산 및 활성능이 있는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
또한, 본 발명의 하기 실시예 4에서는 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주의 유류분해능을 좀 더 자세히 살펴보고자, (주) SK 에너지에서 제공받은 원유에 본 발명의 상기 미생물을 적용한 후 48시간 배양에 따른 잔류 원유 성분을 Gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID)를 통해 분석하였으며, 그 결과 원유가 함유된 액체배지에서 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주를 접종하지 않은 상태의 대조구(도 5A 참조)는 각종 탄화수소류의 피크(peak) 패턴이 높게 나타난 반면, 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주 접종 후 48시간 (도 5B 참조)에서는 각종 탄화수소류들이 상기 균주에 의해 분해되어 감소된 피크(peak) 패턴을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 상기 신균주 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1을 유류 오염 제거를 위한 용도로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 상기 신균주의 배양 조건을 확인하는 실험을 수행하였는데, 그 결과, 상기 균주는 pH 4 ~ 10, 온도 20 ~ 50℃ 및 염 농도 10% (w/v) 이하의 조건에서 생육이 활발한 것으로 나타났고, 바람직하게는 pH 7 ~ 9, 온도 30 ~ 35℃ 및 염 농도 10% (w/v)이하의 조건에서 생육이 매우 활발한 것으로 나타났다.
특히 본 발명의 신균주는 염 농도가 10% (w/v)가 되는 고농도의 염(NaCl) 조건 하에서도 생육이 활발한 특징이 있어, 해양 유류 오염이 발생할 경우, 오염된 해수 처리에도 유용하게 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명은 유류 분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스( Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P)를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 균주가 분해할 수 있는 유류로는 이에 제한되지는 않으나, 원유, 휘발유, 등유 또는 경유일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 유류 분해용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 배양물은 통상적인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양하여 수득할 수 있으며, 배양배지로는 탄소원, 질소원 및 미네랄을 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 상기 탄소원으로는 전분, 수크로즈, 시트레이트, 말토스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤 또는 자일로스를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 신균주는 유류를 탄소원으로 사용할 수 있는 특징이 있다.
또한, 상기 배양물은 본 발명의 균주를 포함하는 배양물 자체의 형태로도 사용할 수 있으며, 또는 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
이러한 상기 배양물에는 본 발명에 따른 균주의 대사산물 또는 균주로부터 생산되는 생물계면활성제를 포함할 수 있는데, “생물계면활성제(biosurfactant)”란 넓은 뜻으로는 생물이 생산하는 계면활성물질은 모두가 생물계면활성제가 되지만 특히, 미생물이 균체 외로 생산하는 계면활성물질을 말한다. 계면활성제는 액체에 소량 첨가하여 계면 또는 표면 장력을 저하시키는 성질이 있는 물질로서 세제, 향료, 가소제, 윤활유 등 다양한 분야에서 이용되고 있다. 일반적으로 미생물이 생산하는 계면활성제는 뛰어난 분해능을 갖고 있기 때문에 지구환경에 뛰어난 계면활성제로서 주목을 받고 있다. 또한, 해양오염 처리나 유전에서 석유의 3차 회수 등의 응용에 대해서도 가능성이 있을 것으로 당업자들은 보고 있다.
따라서 이러한 점을 고려하여, 본 발명의 신균주를 배양한 배양배지가 유류 분해능을 가지고 있다는 사실을 통해, 본 발명의 균주 배양물에는 유류 분해능을 갖는 균주의 대사산물 또는 균주로부터 생산되는 생물계면활성제을 포함하고 있다는 것을 알 수 있다.
그러므로 본 발명은 상기 본 발명에 따른 유류 분해 조성물을 유효성분으로 포함하는 생물계면활성제를 제공할 수 있으며, 나아가 유류 분해용 조성물을 유류가 오염된 환경에 살포하는 단계를 포함하는 생물환경정화 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 생물환경정화 방법은 본 발명의 균주가 10% (w/v)의 염 농도가 높은 조건 하에서도 생육이 활발한 특징이 있어 토양을 비롯한 해양 유류 오염 지역에서 모두에서 유류 오염 정화를 위한 용도로 활용할 수 있는 특징이 있다.
나아가 본 발명에서 동정한 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P)는 용혈작용(hemolysis) 능력이 있는 특징이 있다.
이는 본 발명의 일실시예를 통해 확인하였는데, 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주가 배양된 배지를 sheep blood agar plate에 스트리크(streak)하여 배양한 결과, 혈액이 용해되어 투명환이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주는 유류를 분해할 수 있는 활성뿐만 아니라 용혈작용(hemolysis) 능력을 나타냄으로써 생물계면활성제를 생산할 수 있는 특징을 모두 가지고 있다.
참고로, 이러한 실험을 통해 확인된 본 발명의 신균주에 대한 용혈작용(hemolysis)은 생물계면활성제를 생산할 수 있다는 사실을 간접적으로 확인한 것으로서, 이는 1996년에 Carrillo 등에 의해 보고된 사실로서 용혈작용(hemolysis)능과 생물계면활성제(biosurfactant) 생산능의 관계가 규명된 바 있고, 본 발명의 일실시예에서 수행한 실험 방법(용혈작용 확인실험)은 생물계면활성제의 생산 및 활성을 확인하기 위해 수행되는 방법이다(Carrillo PG, Mardaraz C, Pitta-Alvarez SI, and Giulietti AM (1996) Isolation and selection of biosurfactant-producing bacteria. World J Microbiol Biotechnol 12, 82-84).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
신균주인 바실러스 퓨밀러스( Bacillus pumilus ) IJ-1의 분리
<1-1> 균주의 분리
본 발명자들은 유류 분해능을 갖는 신균주를 발굴하기 위해 2007년 12월 유류 유출 사고 지역인 충남 태안반도(해수 및 바위 틈)에서 유류를 채취하여 4℃에서 보관하며 농화배양시의 접종원으로 사용하였다.
시료는 변형된 LB[0.5%(w/v) 이스트 추출물, 1%(w/v) 트립톤, 3%(w/v) NaCl, 1.5%(w/v) agar] 배지에서 균체 생육이 우수한 균주만을 선별하였고, 이들을 3% (w/v) tributyrin(DifcoTM, USA)이 함유된 LB 배지에서 배양하여 tributyrin 분해능이 가장 우수한 균주를 최종 분리하였다.
<1-2> 선발된 균주의 동정
a. 형태학적 동정
상기 실시예 <1-1>에서 최종 분리된 균주를 위상차 현미경을 통해 형태학적 모양을 관찰하였다.
관찰 결과, 동정된 균주의 세포는 0.2~0.5μm의 길쭉한 타원형의 형태를 갖는 것을 관찰할 수 있었다(도 1 참조).
b. 분자생물학적 동정
또한, 실시예 <1-1>에서 선발된 균주의 분자생물학적 동정을 위해 당업계에서 사용되고 있는 16S ribosomal RNA의 염기서열을 분석하였고 Clustal-X 및 neighbour-joining 방법을 통해 계통 분류학 분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 도 2에 나타낸 바와 같이, 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 균주인 것으로 확인되었으며, 16S rRNA 서열분석 결과 상기 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임인 것으로 확인되었다. 이에 본 발명자들은 2012년 11월 02일자로 한국미생물 보존센타(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11319P를 부여받았다. 또한, 본 발명자들은 상기 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주를 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1로 명명하였다.
c. 균학적 동정
상기 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주의 균학적 특징을 조사하였는데, 즉 다양한 온도 조건, 다양한 pH 조건 및 다양한 염 농도 하에서 최적의 배양조건을 조사하였다.
조사 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 생육 온도는 20 ~ 50℃의 온도에서 성장하는 특징이 있는 것으로 나타났으며, 특히 30 ~ 35℃의 온도에서 성장이 우수한 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 신균주가 성장하기 좋은 최적 pH는 7 ~ 9이고 NaCl 농도는 10%(w/v)의 고염농도까지 성장할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, VITEK system (VITEK 2 Compact 60, bioMerieux Inc., Hazelwood, MO, USA)을 이용한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주의 생화학적 특성(enzymatic, acidification, alkalinization, assimilation, inhibition, and precipitation tests)을 표 2에도 나타내었다.
본 발명의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 의 생장 조건
특성 (Characteristics) Bacillus pumilus IJ-1
Temperature (℃) for Optimum growth 30~35
Temperature (℃) for Growth range 20~50
pH for optimum growth 7~9
pH for Growth range 4~10
Growth in NaCl at (%, w/v): 0.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 1.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 3.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 5.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 7.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 9.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 10.0 +
Growth in NaCl at (%, w/v): 11.0 -
Growth in NaCl at (%, w/v): 12.0 -
Growth in NaCl at (%, w/v): 13.0 -
a＋, positive; b－, negative.
본 발명의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 의 생화학적 특성
Characteristics B. pumilus
IJ-1		 Characteristics B. pumilus
IJ-1
Acidification test : L-lysine arylamidase -
cyclodextrine - L-proline arylamidase -
D-galactose - L-pyrrolydonyl arylamidase -
D-glucose (+) phenylalanine arylamidase -
D-mannitol + phosphoryl cholin -
D-mannose + tyrosine arylamidase -
D-melezitose - α-galactosidase -
D-ribose (-) β-galactosidase +
D-tagatose + α-glucosidase -
D-trehalose (-) β-glucosidase +
glycogene - α-mannosidase +
inulin - β-mannosidase -
L-rhamnose - β-N-acetyl-glucosaminidase -
maltotriose - β-xylosidase +
methyl-D-xyloside - Alkalinisation test :
methyl-a-D-glucopyranoside - pyruvate (-)
myo-inositol - Assimilation test :
N-acetyl-D-glucosamine - putrescine -
palatinose - Precipitation test :
Enzymatic test : esculin hydrolysis +
alanine arylamidase - tetrazolium RED +
ala-phe-pro-arylamidase + Inhibition test :
ellman - growth in 6.5% NaCl +
glycine arylamidase - kanamycin resistance -
leucine arylamidase - oleandomycin resistance -
L-aspartate arylamidase - plomixin-βresistance -
aVITEK system was used; b＋, positive; c－, negative; d(＋), weakly positive; e(－), weakly negative.
< 실시예 2>
본 발명에서 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스( Bacillus pumilus ) IJ-1의 유류 분해능 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주가 유류 분해능을 갖는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. (주) SK 에너지에서 제공받은 원유, 시중 주유소에서 판매되고 있는 등유와 경유, 휘발유를 구입하고 본 발명의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1을 이들 원유(crude oil), 휘발유(gasoline), 등유(kerosene) 및 경유(light oil)가 각각 3.0%(v/v) 첨가된 LB 고체배지[LB; 3.0%(w/v) NaCl, 1.0% (w/v) tryptone, 0.5%(w/v) yeast extract, 1.5% (w/v) agar]에 접종하여 35℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후 생성된 집락 주위에 각종 오일에 대하여 유류 분해 시 생성되는 투명환(emulsified halo)의 형성 여부를 조사하여 유류 분해 여부를 가늠하였다. 이때 대조군으로는 종래 유류 분해능을 가지고 있는 것으로 알려진 본 실험실의 B. megaterium 균주와 유류 분해능이 없다고 알려진 E. coli DH5α를 본 발명의 신균주 대신 처리한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 3과 같이, 본 발명의 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1는 대조군으로 사용한 B. megaterium과 E. coli DH5α 균주와는 달리 3.0%(v/v) 원유, 휘발유, 등유 및 경유를 모두 분해하여 균주 주위에 투명환을 형성하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주가 원유, 휘발유, 등유 및 경유를 모두 분해하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
신균주인 바실러스 퓨밀러스 ( Bacillus pumilus ) IJ -1의 용혈작용( hemolysis ) 활성 분석
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1이 생물계면활성제 생산 및 활성능이 있는지 분석하기 위해, 본 발명의 균주를 sheep blood agar (Asan Pharmaceutical, Korea) 고체배지에서 접종하여 37℃에서 16-20 시간 배양한 후 투명환이 생성되는 것을 조사하였다. 이때 대조군으로는 본 발명의 균주 대신 E. coli DH5α를 이용하였으며 본 실험은 Nakano 등 및 Feignier 등에 의해 보고된 실험방법을 참고하여 진행하였다(Nakano MM, Marahiel MA, and Zuber P (1988) Identification of a genetic locus required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in Bacillus subtilis. J Bacteriol 170, 5662-5668.; Feignier C, Besson F, and Michel G (1995) Studies on lipopeptide biosynthesis by Bacillus subtilis: isolation and characterization of iturin-, surfactin + mutants. FEMS Microbiol Lett 127, 11-15. 참고).
분석 결과, 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주를 사용한 군의 경우, 대조군인 E. coli DH5α에 비해 용혈작용이 뚜렷한 큰 용혈존(hemolysis zone)을 확인할 수 있었으며, 참고로 E. coli DH5α에 나타난 작고 검은 환은 균주가 자란 흔적인 것으로 확인되었다(도 4 참조).
따라서 상기의 결과로 본 발명의 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1는 유류분해능이 우수하고 더불어 용혈작용(hemolysis) 효과도 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4>
본 발명에서 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스( Bacillus pumilus ) IJ-1의 GC-FID에 의한 잔류 원유 성분 분석
본 실험에서는 상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주의 유류분해능을 좀 더 자세히 살펴보고자, (주) SK 에너지에서 제공받은 원유에 본 발명의 상기 미생물을 적용한 후 48시간 배양에 따른 잔류 원유 성분을 Gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID)를 통해 분석하였다.
원유 (crude oil) 분해의 분석은 gas chromatograph (Shimadzu GC-Q2010, Japan)-flame ionization detector (FID)를 이용하여 수행하였다. 분석조건은 하기 표 3과 같은 방법으로 하였다. 분해된 원유 시료 중의 복합 탄화수소류는 크로마토그램의 피크 패턴에 의하여 비교·식별하였다. 시료의 전처리는 LB 액체 배지[1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) yeast extract]에 1.0% (v/v) 원유를 첨가하여 상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신균주인 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주를 1% (v/v) 접종한 뒤 35℃에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양 후 배양액을 같은 양의 n-헥산에 녹여 4℃, 14,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 수분과 고형물, 찌꺼기 등을 제거한 후 잔류 원유를 회수하여 GC/FID로 분석하고, 이를 대조구와 비교하였다. 대조구로는 균주를 접종하지 않은 1% (v/v) 원유 포함 LB 액체배지를 사용하였다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 원유가 함유된 액체배지에서 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주를 접종하지 않은 상태의 대조구(도 5A 참조)는 각종 탄화수소류의 피크(peak) 패턴이 높게 나타난 반면, 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주 접종 후 48시간 (도 5B 참조)에서는 각종 탄화수소류들이 상기 균주에 의해 분해되어 감소된 피크(peak) 패턴을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11319P 20121102

Claims (10)

  1. 유류 분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 원유, 휘발유, 등유 또는 경유를 분해할 수 있는 것을 특징으로 하는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 용혈작용(hemolysis)을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 pH 4 ~ 10, 온도 20 ~ 50℃ 및 염농도 10% (w/v) 이하의 조건에서 생육이 활발한 것을 특징으로 하는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P).
  5. 제4항에 있어서,
    상기 균주는 pH 7 ~ 9, 온도 30 ~ 35℃ 및 염농도 10% (w/v) 이하의 조건에서 생육이 활발한 것을 특징으로 하는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 유류로 오염된 해양으로부터 분리한 것을 특징으로 하는 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주(기탁번호 KCCM 11319P).
  7. 제1항의 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 유류 분해용 조성물.
  8. 제7항의 유류 분해 조성물을 유효성분으로 포함하는 생물계면활성제.
  9. 제8항의 유류 분해용 조성물을 유류가 오염된 환경에 살포하는 단계를 포함하는 생물환경정화 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 지역은 토양 또는 해양인 것을 특징으로 하는 방법.
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