KR20050043506A - 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법 및 동미생물활성화제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법 및 동 미생물 활성화제에 관한 것으로서, 본 발명의 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법은 유류 오염 토양에서 분리된 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주에서 선택된 하나의 균주군을 유류 오염지역에 접종하여 유류를 분해하여 제거함을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 구성에 따르면, 유류 오염 토양에서 분리된 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주의 분해 활성도를 증가시키는 생물활성제는 2-알킬-3-히드록시산 및 그 유도체로 됨을 특징으로 한다.
상기와 같이 구성되는 본 발명은 원유로부터 유래된 유류 오염원을 효과적으로 제거 할 수 있는 미생물의 분리 동정과, 이러한 미생물 균주의 분해를 촉진하는 생물 계면활성제인, 2-알킬-3-하이드록시지방산 및 그 유도체를 제공하고 이를 이용한 오염토양복원방법에 을 제공함으로서, 기존의 오염토양복원 방법에 비하여, 효과적이며 저렴한 비용으로 오염 환경을 정화 할 수 있는 유용한 발명이다.
Description
본 발명은 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법 및 동 미생물 활성화제에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 특히 원유로부터 유래된 유류로 오염되어 있는 토양에서의 오염물을 효과적으로 분해하여 제거할 수 있는 미생물 및 이들 미생물의 분해 활성도를 증가시킬 수 있는 활성화제를 제공하고, 이를 이용하여 오염 토양복원의 방법을 제공하는 것이다.
토양오염복원기술이 적용되는 대상은 공장 등에서 사용된 유류, 화학물질 등으로 오염된 토양, 유류사고 등으로 오염된 해안, 소수성 오염물질이 함유된 슬럿지, 주유소 또는 유류저유소 근방의 흙 등이 해당된다.
종래의 오염 토양에서 소수성 오염 물질을 제거하는 방법은 토양증기추출법(Soil Vapor Extraction, SVE), 토양세정(Soil Flushing), 토양세척기법(Soil Washing), 소각, 저온열탈착법(Low Temperature Thermal Desorption, LTTD), 바이오벤팅법(Bioventing), 생물학적 증가법(Bioaugmentation), 토양경작법(Land Farming), 바이오파일(Biopile), 생물학적 반응기법(Bioreactor) 등 여러 가지 기술 등이 개발 되어 왔다. 이러한 종래의 오염된 토양으로부터 오염물질을 제거하기 위한 방법들에 대해 간략히 기술하면 다음과 같다.
토양증기추출법은 토양을 진공상태로 만들어 줌으로써 토양으로부터 휘발성, 준휘발성 오염물질을 제거하는 기술이다.
토양세정법은 계면활성제, 등과 같은 첨가제를 함유한 물 또는 순수한 물을 오염된 토양 및 지하수에 주입하고 다시 오염토양 지역내에서 추출한 다음 오염원을 처리 및 정제한 처리수를 다시 오염 지역에 투입하는 기술이다.
토양세척기법은 적절한 세척제를 사용하여 토양입자에 결합되어 있는 유기오염물질 및 중금속을 분리시켜 처리하는 기법으로 적용하는 방식에 따라 in-situ 토양세정기법(soil flushing)과 ex-situ 토양세척기법(soil washing)으로 대별 할 수 있다.
소각은 적당한 산소를 공급하여 유기물질을 연소시켜 분해하는 열적 파기 공정이다.
저온열탈착법은 저온 열휘발(Low temeperature thermal volatilzation)이라고도 하는데 굴착된 토양으로부터 석유계 탄화수소를 물리적으로 분해하기 위해 열(90 ~ 320 )을 사용하는 ex situ 처리기법이다.
바이오벤팅법은 오염된 토양에서의 분해 미생물의 활성화를시키기 위해 공기, 습기 및 영양 물질 등을 주입시키는 방법이다.
생물학적 증가법은 오염된 토양에 대상으로 하는 오염원을 분해하는 미생물이 서식하지 않을 경우, 외부에서 따로 배양한 미생물을 도입하여 미생물학적 정화가 일어나도록 하는 방법이다.
토양경작법은 오염된 토양을 굴착하여 지표면에 깔아 놓고 정기적으로 뒤집어 줌으로써, 토양의 공기 접촉면적을 넓혀 토양 내에 서식하는 유류 분해 미생물의 활성화를 촉진 시키는 방법이다.
바이오파일은 오염원 처리장으로 사용하는 부지 면적이 좁을 경우, 오염된 토양을 굴착하여 지상에서 야적하여 처리하는 방법으로 공기 주입 등이 가능한 토양 정화 장치를 통해 영양분과 미생물을 주입시켜 정화하는 방법이다.
생물학적 반응기는 굴착된 오염 토양을 적절한 첨가제와 함께 물과 섞어 반응기에 투입하고, 교반하여 미생물을 활성화 시킴으로써 유류분해를 촉진 시키는 방법이다.
그러나, 상기의 방법들은 각각의 장점을 가지고 있으나, 여러 종류의 유류에 의해 복합적으로 오염되어 있거나, 토양의 종류, 형상 및 함수율에 따라 다양한 토양층을 거의 완전하게 정화하기에는 여러모로 적합하지 않다는 단점이 있다.
한편, 종래의 미생물을 이용하는 방법에 있어서는, 오염된 토양은 대부분 한 종류의 유류에 의해서가 아니라, 다양한 종류의 유류에 의해 복합적으로 오염되어 있기 때문에 각각의 유류에 대해 높은 효율을 가지고 선택적으로 분해할 수 있는 능력을 지닌 미생물들을 함께 조합하여 사용하여야 바람직하게 오염된 토양을 정화할 수 있게된다. 그러나 현재까지 동정된 미생물 중 많은 종류의 미생물이 유류분해능력을 가지고 있으나, 각 미생물의 특성에 따라 분해 능력이 낮거나, 유류의 종류에 따라 선택적으로 분해력을 나타내고, 더욱이 고농도의 유류오염 지역에서는 오염물질에 의해 성장이 저해 받는 등의 많은 문제점이 제기되고 있어 효율적으로 유류 오염 토양을 정화할 수 있는 방법등이 제시되고 있지 못하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 오염원의 종류에 관계없이 우수한 분해능력을 나타내는 미생물을 동정하여 이를 이용하여 유류오염 토양 복원방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱이 본발명은 상기 미생물이 고농도의 유류오염에서도 오염물질에 의해 성장에 지장을 받지않으면서, 오염물질을 분해할 수 있는 분해능을 증가할 수 있는 활성화제를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법은;
유류 오염 토양에서 분리된 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주에서 선택된 하나의 균주군을 유류 오염지역에 접종하여 유류를 분해하여 제거함을 특징으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 구성에 따르면, 유류 오염 토양에서 분리된 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주의 분해 활성도를 증가시키는 생물활성제는 다음 구조식;
(상기 식 중, R1, R2는 각각 탄소수 4∼20의 직쇄 혹은 분지형 알킬기 ; R3는 수소, 글루코스, D-글루코사민)
의 2-알킬-3-히드록시산 및 그 유도체로 됨을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 생물 활성제제인 2-알킬-3-히드록시산 및 그 유도체는 0.0001 ~ 10 중량%로 포함됨을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시형태를 들어 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
상기 본 발명에 따른 유류분해 균주의 분리는, 유류에 의해서 토양을 채취하여 유류분해 균주를 순수 분리한 다음, 상기 분리된 수백 여종의 균주를 분리하여 배양한 후 그 중 오일 분해능이 우수한 균주를 1차 분리한 다음 생물 계면활성제에 의해 고농도의 오일 오염원의 분해가 증가되는 균주를 선별하여 분리 동정하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 생물 계면활성제는 미생물이 분비하는 미콜산(Mycolic acid)계 계면활성제로서, 그람 양성균인 아세트마이탈계의 미생물의 세포벽에 존재하며, 기능은 고농도로 존재하는 유류 지역에서 미생물이 유류를 탄소원으로 사용하여 성장할 수 있도록, 미생물과 유류 탄소원 간의 계면장력 (Interfacial Tension)을 낮추어, 미생물이 유류을 이용 할 수 있도록 도와주는 기능을 한다. 따라서, 본 발명에 따른 생물 계면활성제가 동정 분리된 상기 미생물의 유류오염원 분해능의 활성도를 증가시킴을 알 수 있다.
여기서 사용된 생물 계면활성제는 2-알킬-3-하이드록시지방산 및 유도체로서 다음의 식과 같은 기본구조를 갖는다.
(상기 식 중, R1, R2는 각각 탄소수 4 ~ 20의 직쇄 혹은 분지형 알킬기 ; R3는 수소, 글루코스, D-글루코사민)
상기 화합물의 합성 반응식은 본 출원인이 선출원한 한국특허 출원 97-79218(2-분지쇄-3-히드록시 지방산 및 그염의 제조 방법), 한국특허 출원98-8554(2-분지쇄-3-히드록시 지방산 및 그염의 제조 방법) 그리고 한국특허 출원 03-37538(2-분지쇄-3-히드록시 지방산 및 그염의 제조 방법)에 자세히 언급되어 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1~11 및 비교예 1~4
유류를 분해활성을 갖는 미생물의 분리
경기도 일대에서 오랫동안 다양한 유류로 오염된 토양을 접종 시료로 사용하였다. 기름 오염지 토양을 지하 0 ~ 2 미터 부위에서 선발한 후 즉시 공구병에 투입하고 4 에서 냉장 보관 하였다. 구체적인 채취 상황은 다음 표 1에 기재한 바와 같다.
| 채취 일자 | 채취장소 | 시료수 | 오염원 |
| 2002년 10월 15일 | 경기 인천지역 오일 저유소 | 2 | 디젤, 케로센, 벙커C유 |
| 2002년 11월 15일 | 경기 인천지역 오일 저유소 | 2 | 디젤, 케로센, 벙커C유 |
| 2002년 12월 15일 | 경기 인천지역 오일 저유소 | 2 | 디젤, 케로센, 벙커C유 |
| 2002년 10월 17일 | 경기 시화호 폐수 | 1 | 오일 슬러지 |
유류의 분해능이 우수한 미생물을 선별하기 위해, 우선적으로 LB(Luria-Bertani) 아가 배지나 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar) 배지로 조성된 평판 배지에 도말하고 30 에서 1일간 배양한 이후, 형성된 균주 단일 콜로니(single colony)를 새로운 상기의 평판 배지에 다시 도말하여 분리(isolation)한 다음, 삼각 플라스크에 1,000 ppm, 5,000 ppm, 10,000 ppm, 20,000 ppm의 디젤과 미네랄 성분(NH4NO3, 1g/L; MgSO4, 0.2g/L; CaCl2, 0.02g/L; FeCl2
, 0.05g/L; KH2PO4, 1g/L; K2HPO4, 1g/L; pH 7.0)을 주입한 액체 배지 성분에 분리된 균주를 접종한 이후, 30 에서 7일간 배양하였다.
분리된 미생물의 동정
상기 실험에서 분리 배양된 균주들은 균주 동정을 진행 하였다. 동정 실험은 분리된 각각의 미생물으로부터 유전자의 DNA를 추출한 다음, 16S rDNA의 염기 서열을 분석하여, 얻어진 유전자 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 와 DSMZ (German) D/B를 이용하여 비교하고, 기타 생리학적 특성, 형태학적 특성을 분석한 결과, 다음 표 2의 균주들과 일치함을 확인하였다.
분리된 미생물의 유류오염 분해 활성도 측정
상기 실험에서 분리된 각각의 균주들의 유류오염 분해 활성도는 가스크로마토그라피(Gas Chromatograpy) 사용하여 평가 하였다. 남은 유류오염원에 대한 추출은 N-헥산 추출법을 사용하였고 분해율의 계산은 다음과 같으며, 분해율 50% 이상의 균주 선별 만을 선별하여 동정하였다. 구체적인 실험 결과는 표 2에 기재한 바와 같다.
분해율 (%) = 남은 TPH의 GC의 면적 / Control의 GC X 100
(여기서, TPH는 전체 페트롤륨 하이드로카본(Total Petroleum Hydrocarbon)을 나타냄)
| 실시예 1 | 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | 실시예 5 | ||
| 균주명 | Pseudomonas aeruginosa | Klebsiella pneumonia | Acinetobacter junii | Bacillus subtilis | Streptomyces speibonae | |
| 디젤농도에 따른분해율 | 1,000 ppm | - | - | - | - | - |
| 5,000 ppm | 50,13% | 61.00% | 82.78% | 51.78% | 53.67% | |
| 10,000 ppm | - | - | - | - | - | |
| 20,000 ppm | - | - | - | - | - | |
| 실시예 6 | 실시예 7 | 실시예 8 | 실시예 9 | 실시예 10 | ||
| 균주명 | Bacillus pumilus | Rodococcus sp. | Acinetobacter sp. | Gordonia sp. | 실시예 7 ~ 9의혼합 배양 균주 | |
| 디젤농도에 따른분해율 | 1,000 ppm | - | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% |
| 5,000 ppm | 50,13% | 92.12% | 91.33% | 89.29% | 92.36% | |
| 10,000 ppm | - | 38.14% | 50.20% | 86.18% | 93.88% | |
| 20,000 ppm | - | 32.70% | 47,54% | 55.87% | 93.23% | |
본 발명에서 실시예 1, Pseudomonas aeruginosa; 실시예 2, Klebsiella pneumonia; 실시예 3, Acinetobacter junii; 실시예 4, Bacillus subtilis; 실시예 5, Streptomyces speibonae; 실시예 6, Bacillus pumilus의 경우, 5,000 ppm의 디젤 농도에서 평균 50 ~ 60%의 유류 분해 효과를 나타내었다. 본 발명에서 실시예 7, Rodococcus sp.; 실시예 8, Acinetobacter sp.; 실시예 9, Gordonia sp.의 경우, 1,000 ppm와 5,000 ppm의 디젤 농도에서 89% 이상 100%의 우수한 분해 능력을 가지나, 10,000 ppm과 20,000 ppm에서는 상대적으로 유류 분해 능력이 감소됨을 확인하였다. 실시예 10 에서는 실시예 7, 실시예 8 그리고 실시예 9의 균주를 혼합 배양하여 측정한 결과, 개별적 균주에 비하여 디젤에 대한 분해능력이 증가 되었다.
생물 계면활성제에 의한 미생물의 유류 분해 활성도 증가능 측정
상기 실시예에서 분리된 균주의 경우, 10,000 ppm 이상의 고농도 디젤에서 미생물의 분해능이 감소되는 경향을 나타내었다. 이 경우, 생물 계면활성제, 2-알킬-3-하이드록시 지방산(탄소수 16개)을 20,000 ppm의 디젤과 미네랄 배지 성분(NH4NO3, 1g/L; MgSO4, 0.2g/L; CaCl2, 0.02g/L; FeCl2
, 0.05g/L; KH2PO4, 1g/L; K2HPO4, 1g/L; pH 7.0)을 주입한 액체 배지 성분에 첨가한 다음, 상기의 균주를 접종하여 30 에서 7일간 배양한 후, 위의 실험에서와 같이 가스 크로마토그라피를 사용하여 유류 분해능을 측정 하였다. 표 4의 실시예 11, 실시예 12, 실시예 13과 같이 Rodococcus sp.,
Acinetobacter sp. 그리고 Gordonia sp.는 상기의 생물 계면활성제가 첨가 되었을 경우, 유류 분해 활성도가 증가함을 확인하였다.
| 실시예 11 | 실시예 12 | 실시예 13 | ||
| 균주명 | Rodococcus sp. | Acinetobacter sp. | Gordonia sp. | |
| 디젤 농도 | 20,000 ppm | 20,000 ppm | 20,000 ppm | |
| 생체계면활성제농도 (cmc) | 첨가 않함 | 변화 없음 | 변화 없음 | 변화 없음 |
| cmc = 0.1 | 분해 증가 | 증가 않됨 | 증가 | |
| cmc = 1 | 증가 | 증가 | 증가 | |
| cmc = 10 | 증가 | 증가 | 증가 | |
cmc (critical micelle concentration) = 1 의 경우, 87.5 mg/L
상기와 같이 구성되는 본 발명은 원유로부터 유래된 유류 오염원을 효과적으로 제거 할 수 있는 미생물의 분리 동정과, 이러한 미생물 균주의 분해를 촉진하는 생물 계면활성제인, 2-알킬-3-하이드록시지방산 및 그 유도체를 제공하고 이를 이용한 오염토양복원방법에 을 제공함으로서, 기존의 오염토양복원 방법에 비하여, 효과적이며 저렴한 비용으로 오염 환경을 정화 할 수 있는 유용한 발명이다.
Claims (4)
- 유류 오염 토양에서 분리된 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주에서 선택된 하나의 균주군을 유류 오염지역에 접종하여 유류를 분해하여 제거함을 특징으로 하는 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법.
- 다음 구조식;(상기 식 중, R1, R2는 각각 탄소수 4∼20의 직쇄 혹은 분지형 알킬기 ; R3는 수소, 글루코스, D-글루코사민)의 2-알킬-3-히드록시산 및 그 유도체로 됨을 특징으로 하는 유류 오염 토양에서 분리된 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주의 분해 활성도를 증가시키는 생물활성제.
- 제 1항에 있어서, 다음 구조식;(상기 식 중, R1, R2는 각각 탄소수 4∼20의 직쇄 혹은 분지형 알킬기 ; R3는 수소, 글루코스, D-글루코사민)의 2-알킬-3-히드록시산 및 그 유도체로 되는 생물 계면활성제를 0.0001 ~ 10 중량%를 포함함을 특징으로 하는 특정 미생물을 이용한 유류오염 토양 복원방법.
- 유류에 의해서 토양을 채취하여 유류분해 균주를 순수 분리한 다음, 상기 분리된 수백 여종의 균주를 분리하여 배양한 후 그 중 오일 분해능이 우수한 균주를 1차 분리한 다음 생물 계면활성제에 의해 고농도의 오일 오염원의 분해가 증가되는 균주를 선별하여 분리 동정하는 과정을 통해 분리됨을 특징으로 하는 유류 분해능을 갖는 리도코커스 종(Rodococcus sp.), 아씨네박터 종(Acinetobacter sp.), 고르도니아 종(Gordonia sp.) 또는 이들의 혼합 배양 균주에서 선택된 하나의 균주군.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR100704986B1 (ko) * | 2006-04-27 | 2007-04-09 | 한국생명공학연구원 | 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보 및보존방법 |
| KR100830704B1 (ko) * | 2007-01-25 | 2008-05-20 | 이화여자대학교 산학협력단 | 고르도니아 속 미생물, 이를 이용한 유류오염 토양정화방법 및 식물 생장촉진방법 |
| KR101477409B1 (ko) * | 2012-11-21 | 2014-12-29 | 인제대학교 산학협력단 | 유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 ｉｊ-1 균주 및 이의 용도 |
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-
2003
- 2003-11-06 KR KR1020030078421A patent/KR20050043506A/ko active IP Right Grant
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| CN107299066B (zh) * | 2017-06-21 | 2020-08-28 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种含油污泥的微生物降解液的制备方法以及降解处理方法 |
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