KR101230858B1 - 폴리염화비페닐의 분해능을 가지는 슈도모나스 속 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

폴리염화비페닐의 분해능을 가지는 슈도모나스 속 미생물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경 정화를 위한 미생물인 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 폐광산 유래 토양으부터 분리된 폴리염화비페닐(PCB, polychlorinated biphenyls) 화합물을 분해-제거시키는 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04) 및 상기 균주를 이용한 염화비페닐 화합물의 분해-제거방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물인 슈도모나스 속 KM-04는 인간 및 다른 생물에 유독한 환경호르몬인 염화비페닐을 분해-제거할 수 있는 유용한 특징을 가지고 있으므로, 상기 미생물을 이용한 생분해 과정을 통하여 비페닐 오염된 환경을 정화, 복원하는데 효율적으로 사용할 수 있다.

Description

폴리염화비페닐의 분해능을 가지는 슈도모나스 속 미생물 및 이의 용도{Pseudomonas sp. having a capability of Degrading Poly Chlorinated Biphenyls and the Use thereof}
본 발명은 폴리염화비페닐(PCB, polychlorinated biphenyls) 오염 토양의 생물 정화를 위한 폴리염화비페닐 분해 미생물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양에 포함되어 있는 폴리염화비페닐, 그 중에서도 특히, 비페닐을 분해할 수 있는 신규한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주 및 이의 분해경로, 그리고 이의 토양 복원 용도에 관한 것이다.
석탄광 및 금속광 등의 개발을 포함하는 광산 활동은 환경적인 측면에서 탄화수소오염, 토양부식, 비산먼지, 수계오염, 생물종감소 등의 부작용을 넓은 지역에서 야기시키는 일련의 과정이다. 특히, 광산활동 중에 사용하는 축전기, 변압기 등의 여러 기기적인 장치들이 이후 폐광이 된 후에 방치됨으로써 직간접적으로 토양 및 지하수를 오염시키는 일도 빈번하여 해당 오염 지역 내 오염물질들을 모니터링하고 그에 상응하는 복원 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되고 있다. 특히, 폴리염화비페닐은 절연유 등으로 다양한 기기장치에서 사용 후 특별한 후처리 없이 폐광지역에 잔류하는 경향이 있어서 폐광산지역 토양 등을 국지적으로 오염시키는 결과를 가져왔다.
비페닐은 콜타르, 원유, 천연가스 등에서 발생하는 자연물질임과 동시에 폴리염화비페닐, 식품보존제, 혹은 다양한 유기물질을 합성하는 주원료로 널리 사용하고 있다. 최근 비페닐에 대한 유해성이 널리 알려지면서 생산 및 사용에 규제가 이루어지고 있지만, 물질의 특이적인 잔류성 때문에 토양, 지하수 등에서 광범위한 오염이 관찰되어 심각한 환경문제로 인식되고 있다. 이러한 비페닐에 염소원소가 붙은 상태인 폴리염화비페닐은 절연유 등의 산업적인 사용을 목적으로 생산되었고 널리 이용되어서 많은 양이 환경 내에 축적되어 있다. 그러나, 폴리염화비페닐은 신경계, 내분비계, 생식계 등에 치명적인 영향을 주는 독성이 매우 강해 이미 1970년대에 생산 및 사용이 금지되었으나, 이 물질 역시 환경 내 잔류성이 매우 강해 많은 양이 다양한 환경에 노출되어 있다.
현재까지 염화비페닐을 처리하는 방법은 열분해, 촉매분해, 활성탄 흡착 등 물리화학적인 방법이 주류를 이루고 있고 미생물에 의한 처리에 관한 연구는 매우 미진하였다. 그 이유는 효과적으로 염화비페닐을 분해 또는 제거하는 미생물이 밝혀진 것이 매우 적으며 이를 이용한 생물공정 또한 개발이 되지 않고 있기 때문이다. 더구나, 현재까지 폐광산지역에서 비페닐 분해균이 분리되어 보고된 적도 없다.
물론, 몇몇 연구결과들에서 미생물은 폴리염화비페닐 오염 지역을 친환경적으로 복원할 수 있는 방법으로 인식되어 지금까지 몇 종의 분해미생물이 분리된 보고는 존재하지만, 산업적으로 이용하기 위해서는 고농도의 염화비페닐에 견딜 수 있는 보다 우수한 비페닐 분해능을 가진 미생물의 개발 및 분해효소의 생성능 유도시킬 수 있는 배지 및 생물공정의 확립이 필요하다. 더욱이, 비페닐의 완전분해를 통해 분해경로를 확립하는 것이 연구에 많은 도움을 줄 것이다.
이에, 본 발명자들은 염화비페닐을 제거할 수 있는 미생물의 탐색을 시도한 결과, 폐광산 지역의 토양으로부터 분리한 한 균주가 생분해 실험 결과 염화비페닐의 하나인 비페닐(biphenyl)을 효율적으로 완전히 분해 제거할 수 있는 균주임을 밝히고, 나아가 분해과정 중에 나타나는 분해산물 분석을 통해 분해 경로를 도출함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폴리염화비페닐(PCB, polychlorinated biphenyls)의 분해능을 가지는 하는 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04)의 신규한 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 슈도모나스 속 KM-04의 다양한 용도를 제공하는데 있다. 즉, 슈도모나스 속 KM-04을 함유하는 폴리염화비페닐 분해용 조성물 및 이를 접종하여 폴리염화비페닐 오염 토양을 생물학적으로 복원하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 폴리염화비페닐 분해활성을 가지는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주를 제공한다. 본 발명의 신규 슈도모나스 속 균주는 폐광산 지역의 폴리염화비페닐 오염 토양으로부터 분리할 수 있다.
특히, 상기 슈도모나스 속 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있는 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04) 균주임이 바람직하다. 이는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 Accession No.JN088731로 등록되어 있다. 그리고, 기탁번호 KCTC 12090BP로 기탁되어 있다.
본 발명의 슈도모나스 속 KM-04는 비페닐 구조를 함유하는 화합물을 탄소원으로 사용하므로, 폴리염화비페닐을 분해하는 능력을 가지고 있다. 특히, 비페닐을 이수산화비페닐(DHB, Dihydroxybiphenyl), 호프다(HOPDA, 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid), 벤조산(Benzoic acid)으로 분해할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 5일 동안 10mg/ml 농도의 비페닐을 상기 산물들로 완전히 분해하는 효율을 보였다.
그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주를 활성 성분으로 함유하는 폴리염화비페닐 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주를 폴리염화비페닐로 오염된 토양에 접종하여, 상기 폴리염화비페닐을 분해하여 제거하는 것을 특징으로 하는, 오염 토양의 생물학적 복원 방법을 제공한다. 이 때, 상기 균주를 25 내지 35℃ 온도의 환경조건에 유지시키는 것이 바람직하다.
즉, 비페닐 등의 폴리염화비페닐로 오염된 토양 및 기타 다양한 환경 매체들을 복원할 때, 본 발명의 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) KM-04가 잠재적인 생물촉매(Biocatalyst)로 사용될 수 있다.
본 발명은 비페닐을 탄소원으로 이용하면서 분해하고 성장할 수 있는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) KM-04의 발견 및 이의 이용에 관한 것으로, 상기 미생물은 우수한 효율로 비페닐을 분해하므로, 폴리염화비페닐로 오염된 토양의 생물학적 처리에 유용하며, 향후 폴리염화비페닐 오염 환경의 생물적 방법에 의한 복원에 매우 유용하다.
도 1은 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04) 균주의 시간에 따른 생장곡선 및 비페닐의 감소곡선이다.
도 2는 슈도모나스 속 KM-04를 포함하는 토양 내 폴리염화비페닐 오염도를 조사한 분석 결과도이다.
도 3은 슈도모나스 속 KM-04에 의한 비페닐의 분해 경로의 모식도이다.
명백히 지시된 바가 없다면 이 출원에서 특정된 다양한 범위들의 수적인 값들의 사용은, 기술된 범위들에서 최소값과 최대값은 "약"이라는 용어가 앞서게 됨으로서 근사치로서 기술된다. 이런 방법으로 기술된 범위 위 아래의 약간의 변동은 범위들 내의 값들로서 실질적으로 같은 결과를 이루기 위해 사용될 수 있다. 여기 서 수적인 값을 언급할 때 사용된 "약" 및 "대략"이란 용어들은 당업자에게는 명백하고 보통의 의미를 가질 것이다. 또한, 범위의 명세는 형성될 수 있는 어떤 범위뿐 아니라 인용된 최소값 및 최대값 사이에 모든 값을 포함하는 연속적인 범위로서 의도된다. 이것은 유한의 상부 및/또는 하부의 한도를 포함하거나 하지 아니하게 형성될 수 있는 범위를 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서 폴리염화비페닐(Poly Chlorinated Biphenyls, PCBs), 특히 비페닐의 분해능을 가지는 하는 신규 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규한 균주는 폴리염화비페닐 오염 지역, 예를 들어, 폐광산 지역 토양 유래일 수 있고, 형태학적 특징, 대사 활성, 탄소원 이용 활성 등의 생리적 특징 및 16S rDNA의 서열분석을 통한 분자생물학적 동정 결과, 슈도모나스(Pseudomomas) 속 종균임이 밝혀졌다. 본 발명의 균주는, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서는 이를 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomomas sp. KM-04)이라 명명하고, 기탁하였다(KCTC 12090BP). 그리고, NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 서열번호 1의 정보를 등록하였다(Accession No.JN088731).
본 발명의 미생물 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomomas sp. KM-04)은, 예를 들어 다음과 같은 방법으로 동정할 수 있다.
비페닐로 오염된 폐광산 지역으로부터 토양을 채취하여 Enrichment culture 및 계대 배양을 통해 단일 콜로니로 분리하여 순수 배양한다. 일 구체예로서, 탄소원인 비페닐 및 미량원소용액(Trace element solution)을 포함하는 최소염배지(Minimal Salts Medium, MSM)를 이용하여 폐광산 지역 토양으로부터 비페닐 분해 미생물을 분리할 수 있다. 고체 MSM 배지에서 자라는 콜로니들을 선택하여 액체 MSM 배지 접종한 후 약 30℃에서 진탕배양하고, 일정시간이 지난 후 배양액 일정량을 고체 배지에 재도말·배양하여 균주들을 순수 분리할 수 있다.
그리고, 상기 비페닐을 탄소원으로 하는 분리 균주의 동정을 위해 16S rDNA 유전자를 PCR로 증폭시켜 직접적 시퀀싱(Direct sequencing)을 실시하여 얻은 염기서열을 NCBI의 GenBank와 EMBL등의 Database를 통해 알려진 16S rDNA 염기서열들 및 BLAST 검색을 토대로 비교 분석한다. 본 발명에서 발견한 균주는 슈도모나스(Pseudomomas ) 속 균주임을 확인하였다.
본 발명 균주의 분해대상이 되는 물질은 폴리염화비페닐(Polychlorinated biphenyls, PCBs), 바람직하게는 비페닐(biphenyls)이다.
이러한 폴리염화비페닐의 열적, 화학적, 생물학적 안정성은 제품 폐기시 분해가 곤란하게 하며, 또한 소각시에 다이옥신을 발생시킬 수 있다는 문제점 때문에 사용이 금지된 후에도 처리하지 못하고 보관된 양이 많은 반면, 기존의 폴리염화비페닐 함유 제품인 변압기, 축전기 등의 전기기구는 내구연한이 15년 이상으로 아직도 많은 제품들이 사용되고 있으며, 보관중인 폴리염화비페닐이 함유된 장비로부터 유출되거나, 폴리염화비페닐에 오염된 물질의 연소 및 연소부산물 등에 의해 지속적으로 배출되어 폴리염화비페닐로 인한 2차적인 환경문제도 야기되고 있는 실정이다.
염화비페닐은 DNA의 유전정보를 변화시키는 돌연변이 유발물질이기 때문에 매우 낮은 농도에서도 간을 손상시킬 수 있으며 생식세포에 여러 가지 문제와 암을 유발시킬 수 있다(Anderson et al., J. Natl. Cancer Inst ., 71(1):157-16 3, 1983). 기타 만성적인 영향으로는 눈꺼풀의 부풀음, 피부의 색소증가, 관절의 확장, 검은 오줌 및 황달 등을 일으킬 수 있다. 또한, 피부에 심한 발진을 유발하기도 하고 피부로 흡수되면 지방에 축적되어 유독한 효과가 나타내기도 한다.
상기 폴리염화비페닐이란, 기본적으로 하기의 비페닐(C6H5-C6H5)의 열 개의 수소원자 위치에 결합된 수소가 1~10개의 염소 원자로 치환된 화합물을 의미하는 것으로써, 이론적으로 209종의 이성질체가 있을 수 있으나, 실제 사용되는 것은 약 100여 종이다.
[화학식 1]
Figure 112012003871411-pat00001
(n은 1~10 중 하나의 정수)
이하에서 별도의 설명이 없는 한, 용어 본 발명에 따른 "폴리염화비페닐" 또는 "비페닐"은, 기본적인 골격 구조 및 특성을 지니고 있는 한, 화합물 그 자체, 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 등 그 변형된 형태를 모두 포함하는 개념으로 사용되고 있다.
'수화물(hydrate)'은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. '용매화물(solvate)'은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. '이성질체(isomer)'는, 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.
본 발명의 미생물, 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04) 균주는 이러한 폴리염화비페닐, 특히 비페닐의 분해에 효율적이다. 본 발명의 일 실시예에서는 비페닐 10 mg/ml를 5일 만에 완전히 분해하였다.
또한, 본 발명에서는 상기 슈도모나스 속 KM-04를 이용한 비페닐 분해경로 및 분해산물을 규명하였다.
미생물은 자연환경에서 화학물질의 생분해에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 화학물질의 생분해는 각각의 균주에 대한 대사 또는 미생물 군집에 의한 복합적인 대사에 의해 이루어지기 때문에 본 발명의 비페닐 분해경로 및 분해산물 정보를 유용하게 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 슈도모나스 속 KM-04를 이용하는 경우의 비페닐 분해 기작과 관련한 다양한 용도를 포함한다.
본 발명의 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04)에 의해 비페닐이 분해되면 이하의 3가지 극성 분해 산물들이 주요하게 생성된다.
3가지의 분해산물은 이수산화비페닐(DHB, Dihydroxybiphenyl), 호프다(HOPDA, 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid), 벤조산(Benzoic acid)이고, 본 발명의 일 실시예에서 이를 LC-MS 분석으로 구체적으로 살펴본 결과 특징은 다음과 같았다:
1) DHB(Dihydroxybiphenyl) : LC-MS 분석으로 검출된 특징 이온 m/z 187.2 [M+H]+
2) HOPDA(2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid) : LC-MS 분석으로 검출된 특징 이온 m/z 219.2 [M+H]+이며, 노란색을 띠고 있다. 비페닐이 메타-절단(meta-cleavage)될 때 생성되는 전형적인 분해산물이다.
3) 벤조산(Benzoic acid) : LC-MS 분석으로 검출된 특징 이온 m/z 123.1 [M+H]+
Figure 112012003871411-pat00002
또한, 이의 구체적인 분해경로를 도식화하면 아래와 같다(도 3).
Figure 112012003871411-pat00003

본 발명은 슈도모나스 속 KM-04의 폴리염화비페닐, 특히 비페닐의 분해 능력의 이용을 포함한다.
일 구체예로서, 본 발명의 슈도모나스 속 KM-04 균주는 적절한 형태의 미생물 제제로 제조되어 사용하거나 비페닐 오염 현장에 직접 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04)을 활성 성분으로 함유하는 비페닐 분해용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 폴리염화비페닐 분해용 조성물에 관한 것이다.
상기 균주를 순수배양한 후 상기 균주를 배양액 상태, 동결건조된 균주 및 담체로 고정된 균주 등의 형태로 함유하는 것이 바람직하고, 10% 글리세롤용액에 현탁하여 -80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조된 균주를 함유하는 조성물의 형태로 제제할 수 있다. 이 때, 비페닐의 분해도를 증가시키기 위해 공지의 비페닐 분해능을 가지는 첨가제 등을 추가로 포함시킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서 슈도모나스 속 KM-04을 폴리염화비페닐 또는 상기 조성물을 오염된 토양에 접종하여, 상기 폴리염화비페닐을 분해하여 제거하는 것을 특징으로 하는, 오염 토양의 생물학적 복원 방법에 관한 것이다.
오염물질에 오염된 환경에 생물을 이용하여 정화하는 방법은 널리 이용되고 있다. 해당오염물질의 분해능을 갖는 미생물을 오염지역에 투여함으로써 그 환경에서 오염물질을 제거하거나 분해능을 증가시키는 것은 매우 유용한 도구이다
본 발명의 미생물 슈도모나스 속 KM-04를 폴리염화비닐(PCB)로 오염된 토양에 적절하게 처리하여 PCB 오염을 정화시킬 수 있는데, 사용량 및사용 조건은 오염 정도 및 대상 환경에 따라 적절하게 가감 또는 변경할 수 있다. 예를 들어 슈도모나스 속 KM-04 접종량이 배지 포함 접종량의 0.001~8%(v/v 또는 v/w)의 범위로 접종하여 사용할 수 있고 이의 적합한 배양 환경을 위해 25 내지 35℃의 온도를 유지하는 것이 바람직하다.
접종(투여)방법은 넓은 면적의 토양에 적용될 경우 소방차, 헬리콥터 등을 이용하여 골고루 살포하고, 좁은 면적의 토양에는 분무기 등을 이용하여 골고루 살포한다. 살포 후에는 정기적으로 경작기를 이용하여 토양층을 뒤집어주는 경작법 등을 추가로 수행하여 정화처리할 수 있다. 분해 효율을 높이기 위해 반복 접종할 수도 있다.
즉, 비페닐 등의 폴리염화비페닐(PCB)로 오염된 토양 및 기타 다양한 환경 매체들을 복원할 때, 본 발명의 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04) 균주가 잠재적인 생물촉매(Biocatalyst)로 적용될 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 비페닐 탄소원으로 이용하면서 분해하고 성장할 수 있는 슈도모나스 속 KM-04의 발견 및 이의 이용에 관한 것으로, 상기 미생물은 비페닐 등의 폴리염화비페닐로 오염된 환경 매체의 생물학적 처리에 유용하며, 향후 폴리염화비페닐 오염 환경의 생물 복원에 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 토양 분석
본 발명의 신규미생물을 채취한 곳은 국지적으로 폴리염화비페닐이 오염된 삼척 폐광산지역으로서 해당 지역의 토양을 채취하여 폴리염화비페닐 오염도를 분석하였다
신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04를 분리한 폐광산지역 오염토양 내 폴리염화비페닐 분석을 토양 추출 방법을 통해 수행하였다. 해당 지역에서 2.5 g의 토양을 채취한 후에 25 ml의 아세톤으로 1:10 (g/mL)의 비율로 고체:액체 추출을 수행하였다. 추출액은 원심분리를 통해 토양과 분리하고, 노말-헥산으로 액체:액체 추출을 하여 기체크로마토그래피를 통해 정량 및 정성 분석하였다. 기체크로마토그래프 분석법은 EPA 방법 8082에 근거하여 분석했으며, 전자포획검출장치(ECD, Electron Capture Detector)가 장착된 에이질런트 사 6890 기체크로마토그래프를 이용하였다.
결과를 도 1에 나타내었다.
건조토양 총량 기준으로 335.08 pg/g 이 검출되었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 여러 이성질체 중 저염화 이성질체 보다는 고염화 이성질체가 많이 검출되었으며, 특히 육염화비페닐(hexachloro-biphenyl)이 가장 높은 농도로 검출되었다. 이는 저염화 이성질체는 분자량이 작고 휘발성이 고염화 물질들보다 강하기 때문에 대기 중으로 날아가 토양 내 흡착하고 있는 양이 상대적으로 적어서 생긴 결과라고 여겨지며, 상대적으로 고염화 물질들은 휘발성이 적어 토양 입자에 많은 양 흡착하여 존재했던 것으로 생각되었다.
실시예 2: 균주의 분리 및 동정
신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04는 상기 삼척 폐광산 지역 내 폴리염화비페닐 오염 토양으로부터 시료를 채취하여 분리 및 동정하였다.
채취한 토양을 멸균된 50 mL 플라스틱 용기에 넣고, 단일 콜로니를 얻을 때까지 계대 배양을 통해 균주를 분리하였다. 비페닐을 탄소원으로 배양을 시켜서 분리를 했으며, 사용된 MSM은 Fortnagel et al.,(1990)이 제시한 배지를 변형시켜 사용하였는데, 그 조성은 표 2와 같다.
표 2에 나타낸 배지 조성으로 인산 버퍼(Phosphate buffer) 20 mL과 미네랄 염(Mineral salts) 용액 20 mL, 미량원소 용액(Trace elements solution) 0.5 mL을 혼합하여 최종 1 L의 배지를 제조하고, pH를 7.25로 맞춘 후 사용하였다(Nam et al., 2008).
Figure 112012003871411-pat00004
분리된 순수배양 미생물은 고체영양배지 내에서 밝은 노란색의 콜로니 색을 띠었고, 16S rDNA 염기서열분석 결과 및 BLAST 검색을 토대로 Pseudomonas 종임이 확인되어 Pseudomonas sp. KM-04로 명명하고, 기탁하였다(KCTC 12090BP). 이를 서열번호 1로 기재하였다.
실시예 3: 균주의 배양 및 비페닐 분해능
(1) 균주의 생장
상기 균주 Pseudomonas sp. KM-04의 생장을 확인하기 위해, 10 mg/mL 농도의 비페닐을 탄소원으로 공급해주고 100 mL 삼각플라스크에 10 mL의 멸균된 상기 표 2의 제한배지를 넣고 실험을 수행하였다.
초기 접종한 신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04의 농도는 600 nm에서의 흡광도 0.11에 맞추었고, 항온배양기에서 28°C, 160 rpm으로 5일간 배양하였다. 동시에 실시한 대조군 시험은 동일 조건에서 단지 신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04에 10 mM Sodium azide(NaN3)를 첨가하여 균을 사멸시키고, 추가적으로 열처리(70°C, 40 min)를 통해 만들어진 사균을 사용하였다.
5일간의 배양 중에 초기를 포함하여 각 24 시간마다 각각 준비되었던 삼각플라스크를 취하여 냉동보관하고, 시험이 모두 마친 후에 동시 분석하였다.
신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04를 호기적 조건에서 비페닐을 유일한 탄소원으로 배양을 시켜 발생하는 신규미생물 생장곡선과 탄소원인 비페닐의 감소곡선을 도 2에 나타냈다.
대조군 시험에서는 신규미생물 생장이 관찰되지 않았으나, 5 일 내 초기에 공급해 준 10 mg/mL 농도의 비페닐이 거의 소진됨을 보여주고 있으며, 신규미생물 생장도 OD600기준으로 1.25까지 증가함을 나타내고 있다.
이러한 결과는 신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04가 비페닐을 탄소원으로 이용해 분해하면서 생장함을 명확히 나타내고 있으며, 폐광산지역에 국지적으로 존재하는 비페닐 및 다염화비페닐에 의해 오염된 토양을 복원할 수 있는 생물촉매로 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.
(2) 비페닐 분해산물 및 분해경로
또한, 비페닐 분해과정에서 발생하는 분해산물의 정성분석을 위해 Resting cell을 사용하였는데, 이에 대한 준비는 신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04를 100 mg/mL 농도의 비페닐을 2-L 삼각플라스크에 200 mL의 제한배지 넣고 전 배양을 수행했다.
72 시간 후, 배양액을 원심분리(9,000×g, 20 min, 4°C)하여 모으고, 20 mM phosphate buffer 용액(pH 7.2)을 이용하여 전 배양에서 사용했던 탄소원을 제거했다. 최종 균주가 포함된 현탁액의 농도는 흡광도 기준으로 600 nm에서 4.0으로 조정했다.
한편, 신규미생물에 의해 비페닐을 분해하는 시험에 있어서 배양액 내 남아있는 비페닐에 대한 정량분석은 기체크로마토그래프-질량분석기를 통해 알아보았다.
배양기간 중 발생하는 시료에 대해 시간에 따라 각각 1개씩의 배양기를 취한 후 1 mL 85% 인산을 첨가 및 냉동을 시켜 추가적인 반응을 억제하고, 120 시간의 모든 반응이 종료한 시점에서 동시에 정량 분석을 수행하였다. 모아진 모든 시료를 녹이고, 유기용매 에틸아세테이트를 사용한 10회의 액체:액체 추출을 통해 비페닐 잔량을 추출했다. 5회는 정상 pH에서 나머지 5회는 산성 pH에서 진행하여 추출 효율을 향상시켰다. 그리고 검출된 분해산물들은 모두 해당하는 표준물질로 비교하여 정성 분석 및 구조를 해석하였다. 즉, 비페닐 분석은 표준물질을 먼저 분석하여 해당 머무름 시간과 질량 스펙트럼을 비교하여 정성 및 정량 분석을 수행했다.
그 결과, 신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04에 의해 비페닐이 분해되면 3가지의 극성 분해산물이 생성되는 것을 확인하였다. 그 3가지의 분해산물은 이수산화비페닐(DHB, Dihydroxybiphenyl), 호프다(HOPDA, 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid), 벤조산(Benzoic acid)이었고, 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같이 정리할 수 있다.
1) DHB(Dihydroxybiphenyl) : LC-MS 분석으로 검출된 특징 이온 m/z 187.2 [M+H]+ ;
2) HOPDA(2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid) : LC-MS 분석으로 검출된 특징 이온 m/z 219.2 [M+H]+이며, 노란색을 띠고 있다. 비페닐이 meta-cleavage 되었을 때 생성되는 전형적인 분해산물
3) Benzoic acid : LC-MS 분석으로 검출된 특징 이온 m/z 123.1 [M+H]+
Figure 112012003871411-pat00005
그리고, 상기 분해 산물들을 기반으로 도 3에 나타낸 것과 같이 신규미생물 Pseudomonas sp. KM-04에 의해 분해된 비페닐의 분해 경로를 요약할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12090BP 20111128
<110> KOREA INSTITUTE OF GEOSCIENCE AND MINERAL RESOURCES(KIGAM) <120> Pseudomonas having a capability of Degrading Poly Chlorinated Biphenyls and the Use thereof <130> PN6095 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 975 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. <400> 1 nnggnnncnt atcggattac tgggcgtaag cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt 60 gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca tccaaaactg gcaagctaga gtacggtaga 120 gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg 180 cgaaggcgac cacctggact gatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 240 gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg gaatccttga 300 gattttagtg gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 360 aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 420 gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac atgcagagaa ctttccagag atggattggt 480 gccttcggga actctgacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 540 tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg ttatggtggg 600 cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca 660 tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc 720 cgcgaggtgg agctaatctc acaaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga 780 ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc 840 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtggtt gcaccagaag tagctagtct 900 aaccttcggg aggacggtta ccacggtgtg atcatgactg gggtgaagtc gtacagaggg 960 gagaccacnt aataa 975

Claims (13)

  1. 폴리염화비페닐 분해활성을 가지며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 5일 동안 10mg/ml 농도의 비페닐을 완전히 분해하는 효율을 가진 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04, 기탁번호 KCTC 12090BP) 균주를 활성 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리염화비페닐 분해용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04, 기탁번호 KCTC 12090BP) 균주는 폐광산 지역의 폴리염화비페닐 오염 토양으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 폴리염화비페닐 분해용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리염화비페닐은 비페닐 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리염화비페닐 분해용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 속 KM-04(Pseudomonas sp. KM-04, 기탁번호 KCTC 12090BP) 균주는 비페닐을 이수산화비페닐(DHB, Dihydroxybiphenyl), 호프다(HOPDA, 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid), 벤조산(Benzoic acid)으로 분해하는 것을 특징으로 하는 폴리염화비페닐 분해용 조성물.
  6. 삭제
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