CN116064364A - 12-氧-植物二烯酸促进蒙氏假单胞菌生长和定殖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及12‑氧‑植物二烯酸促进蒙氏假单胞菌生长和定殖。本发明发现了12‑氧‑植物二烯酸在蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM‑41生长和定殖中能够发挥积极作用，可促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM‑41的生长、生物膜形成，也能够促进其在三七根际的定殖。
Description
技术领域
本发明涉及农业领域，具体涉及12-氧-植物二烯酸在促进三七根际有益蒙氏假单胞菌生长和定殖方面的应用。
背景技术
云南是中药材三七的主产区，作为我国特有的名贵中药材，具有极高的药用价值。近年来，由于连年大面积单一种植，三七生产出现连作障碍问题，已严重影响其产量和品质。目前用于缓解三七连作障碍的主要手段包括土壤熏蒸、作物轮作和生物防治等。土壤熏蒸往往使用一些高毒的化学熏蒸剂，而生产实践表明，即使采用大量化学农药灌根或土壤熏蒸也不能有效地缓解连作障碍的发生，还会对环境产生危害并限制其在实际生产中的应用；三七轮作周期长，一般种植后要经过10年以上的轮作才能再次种植，且适宜的用于缓解三七连作障碍的作物目前还未见在生产中的应用。利用有益微生物来缓解三七连作障碍具有低毒、无污染、环境友好等优点，是三七绿色生态防控的有效途径，但是微生物在三七根际的有效定殖限制了其在生产中应用。
蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41是申请人前期分离自三七根际土壤，既能降解三七生长过程中分泌到根际土壤中的自毒皂苷，又能明显拮抗根腐病菌的有益微生物，能明显缓解三七的连作障碍(CN201910935485.6)。但是如何增强蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41在三七根际的定殖仍然是该菌株能否应用于三七根腐病防治的问题之一。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种12-氧植物二烯酸在促进三七根际有益蒙氏假单胞菌生长和定殖方面的应用。
12-氧-植物二烯酸(OPDA)是茉莉酸生物合成途径中的一种中间产物，能够触发自主信号通路，调控茉莉酸响应基因，调控植物的生长过程和防御反应。除了与茉莉酸活性有关外，OPDA在介导对病原体和害虫的抗性方面发挥着独立的作用。12-氧-植物二烯酸可从三七根系分泌物中找到。
本发明的第一个方面在于提供一种12-氧-植物二烯酸在促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)生长和定殖方面的应用。
在一个优选的实施方案中，所述应用包括对蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)使用12-氧-植物二烯酸进行处理。
在一个优选的实施方案中，处理蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的12-氧-植物二烯酸以溶液形式施用，其浓度为5～50μg/mL。
优选的，所述浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL。所述浓度优选为10～50μg/mL，进一步优选为10～20μg/mL。
在一个优选的实施方案中，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成。
在一个优选的实施方案中，所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
因此，优选的，所述应用包括将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、12-氧-植物二烯酸一起添加到三七根际土，从而促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)在三七根际土中的定殖和生长。
本发明的第二个方面在于提供一种促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)生长和定殖的方法，所述方法包括将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)使用12-氧-植物二烯酸进行处理。
在一个优选的实施方案中，处理蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的12-氧-植物二烯酸以溶液形式施用，其浓度为5～50μg/mL。
优选的，所述浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL。所述浓度优选为10～50μg/mL，进一步优选为10～20μg/mL。
在一个优选的实施方案中，所述处理包括使得蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)与12-氧-植物二烯酸接触一段时间。优选的，所述接触包括采用12-氧-植物二烯酸培养蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)，或者将12-氧-植物二烯酸与蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)一起加入到欲定殖的环境中，如土壤，特别是三七根际土。优选的，所述时间大于12h，更优选大于24h。
在一个优选的实施方案中，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成。
在一个优选的实施方案中，所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
因此，优选的，所述方法包括将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、12-氧-植物二烯酸一起添加到三七根际土，从而促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)在三七根际土中的生长和定殖。
本发明中，12-氧-植物二烯酸在应用时，可与辅料制成水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等溶液剂型。其中，12-氧-植物二烯酸的浓度为5～50μg/mL，具体为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL。所述浓度优选为10～50μg/mL，进一步优选为10～20μg/mL。
因此，本发明的第三个方面还提供了一种包含12-氧-植物二烯酸的溶液制剂，其中12-氧-植物二烯酸的浓度为5～50μg/mL，具体为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL。所述浓度优选为10～50μg/mL，进一步优选为10～20μg/mL。
所述制剂的剂型包括水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等。
本发明的第四个方面在于提供12-氧-植物二烯酸在制备促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的生长和定殖的制剂中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成。
在一个优选的实施方案中，所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
在一个优选的实施方案中，所述制剂为溶液制剂，其中12-氧-植物二烯酸的浓度为5～50μg/mL，具体为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL。所述浓度优选为10～50μg/mL，进一步优选为10～20μg/mL。
所述制剂的剂型包括水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等。
本发明中，所述蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)包括蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41，其保藏信息如下：保藏编号为CGMCC No.18491；分类命名为：蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteilii；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期为2019年9月16日。
有益效果：
本发明通过使用12-氧-植物二烯酸作为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的外源添加物，评价12-氧-植物二烯酸在蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41生长和定殖过程中的作用，解析了三七根系分泌物中12-氧-植物二烯酸在促进有益微生物蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41生长和定殖中发挥的功能。趋化试验中，蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对1～100μg/mL浓度的12-氧-植物二烯酸具有显著的趋化效应；促生试验中，10μg/mL浓度可以明显促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的生长，50μg/mL和100μg/mL浓度可以明显促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41生物膜的形成；定殖试验中，10μg/mL浓度可以明显促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41在三七根际的定殖。因此在有益微生物蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的使用中，使用10～50μg/mL浓度的12-氧-植物二烯酸既能够促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41的生长、生物膜形成，也能够促进其在三七根际的定殖。
附图说明
图1：蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对12-氧-植物二烯酸的趋化效应测定(不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著)；
图2：12-氧-植物二烯酸对蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41生长的效应测定；
图3：12-氧-植物二烯酸对蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41生物膜形成的影响测定(不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著)；
图4：12-氧-植物二烯酸对蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41在土壤中定殖能力的影响测定(**表示经t检验法检验与对照相比在P<0.01水平差异显著)。
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。
实施例1：蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41对12-氧-植物二烯酸的趋化效应
取100μl的菌液到900μl LB液体培养基中培养菌株2天，使其细菌浓度OD590值达到0.6，准备无菌黄枪头，1ml注射器，LB平板培养基。用无菌水将12-氧-植物二烯酸配制成不同浓度溶液(1μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)，超净工作台无菌条件下，用移液枪移取100μl菌液于黄枪头中，注射器中吸取100μl的12-氧-植物二烯酸溶液，然后将注射器针头插入黄枪头中，平放在工作台上静置40min后，将注射器里液体转至无菌干净2ml小管里，用无菌水进行稀释10倍，100倍，1000倍，后取100μl进行涂板，28℃培养1天后观察并计数其菌落数。
试验结果表明(图1)，菌株PM-41对浓度为1μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的12-氧-植物二烯酸存在显著的趋化效应。说明菌株PM-41对12-氧-植物二烯酸具有明显的趋化效果。
实施例2:12-氧-植物二烯酸促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41生长和生物膜形成
取100μl的菌液到900μl LB液体培养基中，28℃过夜培养，使其细菌菌浓度OD590值达到0.4，取20μl菌液添加到96孔板180μl的不同浓度(1μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)12-氧-植物二烯酸1/10LB溶液中，28℃静置培养52h，在培养期间测量菌株OD590值，绘制生长曲线；并在培养52h后，用结晶紫法测定菌株在不同浓度代谢物下生物膜的形成情况。
图2试验结果表明，10μg/mL 12-氧-植物二烯酸能促进菌株生长。图3试验结果表明，培养52h后10、50、100μg/mL浓度的12-氧-植物二烯酸均能促进菌株生物膜形成，其中50、100μg/mL浓度具有显著的促进作用。
实施例3：12-氧-植物二烯酸促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41在根际土中的定殖
筛选氯霉素和利福平抗性标记的蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41，培养2d后使其菌浓度OD590值达到0.6。每个组培瓶中装入三七根际土，添加17mL溶液(5mL菌液+7mL浓度为10μg/mL的12-氧-植物二烯酸溶液+5mL水/抗生素)，搅拌均匀后盖上盖子培养10d。在培养期间的第3、5和10天取5g土加入50mL灭菌水，在摇床上摇培30min，稀释10倍、100倍、1000倍后用移液枪吸取100μL并在添加了抗生素的TSA培养基上涂板，28℃下过夜培养后，记录菌落形成数量，评价蒙氏假单胞菌PM-41在土壤中的定殖效果。
试验结果表明(图4)，与空白对照相比，有12-氧-植物二烯酸存在的条件下，接种后5、10d后蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)PM-41在土壤中的定殖菌落数均明显增加，表明10μg/mL 12-氧-植物二烯酸的协同添加有利于促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)在三七根际的定殖。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (10)
1.一种12-氧-植物二烯酸在促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)生长和定殖方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括对蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)使用12-氧-植物二烯酸进行处理。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，处理蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)的12-氧-植物二烯酸以溶液形式施用，其浓度为5～50μg/mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、12-氧-植物二烯酸一起添加到三七根际土中。
5.一种促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)生长和定殖的方法，所述方法包括将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)使用12-氧-植物二烯酸进行处理。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，处理蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)的12-氧-植物二烯酸以溶液形式施用，其浓度为5～50μg/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括将蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、12-氧-植物二烯酸一起添加到三七根际土中。
8.12-氧-植物二烯酸在制备促进蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)的生长和定殖的制剂中的应用。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用、方法，其特征在于，所述生长包括菌株繁殖和生物膜形成；所述定殖包括在土壤中定殖，特别是在三七根际土中定殖。
10.一种包含12-氧-植物二烯酸的溶液制剂，其中12-氧-植物二烯酸的浓度为5～50μg/mL。
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