CN116508784A

CN116508784A - 棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用

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Publication number: CN116508784A
Application number: CN202310527642.6A
Authority: CN
Inventors: 高南; 胡椿; 张欢欢; 徐虹
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2023-05-11
Filing date: 2023-05-11
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2043-05-11
Also published as: CN116508784B

Abstract

本发明公开了棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。本发明通过筛选获得了一种植物根系分泌物棕榈酸，研究发现，棕榈酸不仅自身可以减少农田土壤氧化亚氮的排放，还可以与施氏假单胞菌NRCB010协同作用，显著提高施氏假单胞菌的趋化性、生物膜的形成，促进植物的生长和植物根际的定殖，显著提高施氏假单胞菌NRCB010的脱氮能力、氧化亚氮还原酶活性和产IAA能力，进而提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放的能力。

Description

棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术和环境保护领域，具体涉及棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。

背景技术

在农业生产上，微生物肥料被广泛用于促进作物生长。然而微生物肥料肥效不稳定的现象广泛存在，是目前微生物肥料应用的技术瓶颈之一。植物根际促生菌是应用最广的微生物肥料资源，促进植物根际促生菌在作物根际定殖、形成优势菌群，均可以有效提高肥效和提升肥料的稳定性，即根际微生物在根表存活并成功定殖是发挥其功效的关键。根系分泌物被认为是植物和根际微生物之间沟通的最前线，在植物-微生物相互作用过程中起着桥梁的作用，为土壤微生物提供碳源、氮源和能源，能够促进植物根际促生菌的定殖。如西红柿根系分泌的柠檬酸和富马酸吸引荧光假单胞菌根际定殖；黄瓜根系分泌物D-半乳糖能显著增加贝雷兹芽孢杆菌SQR9趋化性作用和生物膜形成；拟南芥根系分泌的苹果酸可募集枯草芽孢杆菌到根系并刺激其形成生物膜。此外，部分根系分泌物源的代谢产物在调节植物生长发育，增强植物抗逆性等方面可能发挥重要作用。水稻幼苗分泌的抗菌二萜Momilacton A可增强植物抗毒能力。蜈蚣草根系分泌物的植酸有助于活化根际难溶态砷和铁，促进其吸收改善土壤污染并促进植物生长。

棕榈酸是根系分泌物的信号分子之一，又名十六烷酸、软脂酸，是一种有机物，化学式是C₁₆H₃₂O₂，是一种饱和高级脂肪酸，白色带珠光的磷片。不溶于水，微溶于石油醚，溶于乙醇。易溶于乙醚，氯仿和醋酸。广泛存在于自然界中，几乎所有的油脂中都含有数量不等的软脂酸组分。棕榈酸可以用作沉淀剂、防水剂、乳化剂，其的衍生物曾被用作制造为凝固汽油弹。

氧化亚氮(N2O)是重要的温室气体，大气中氧化亚氮浓度的增加不仅加剧了全球温室效应，还参与大气中许多光化学反应，破坏大气臭氧层。相对于二氧化碳，其危害约为二氧化碳的300倍(IPCC，2007)。农业生产过程中释放的氧化亚氮是氧化亚氮产生的重要人为源，排放的氧化亚氮约占全球人为氧化亚氮排放总量的52％。土壤微生物是影响农田土壤氧化亚氮排放的关键生物因素，主要通过土壤微生物的硝化和反硝化作用。我国是农业大国。农田土壤氧化亚氮排放量较大，故亟需寻求减少农田土壤氧化亚氮排放的措施。目前减排农田土壤氧化亚氮的措施主要有施肥管理(施肥量、施肥方式及肥料类型等)、科学耕作、使用硝化抑制剂、添加生物炭、接种具有氧化亚氮减排效应的微生物等。但是，目前尚未发现关于根系分泌物棕榈酸作为提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮中的应用的报道。

因此，通过分析植物根际促生菌诱导的植物根系分泌物代谢产物成分，筛选出有利于植物根际促生菌在根际存活及定殖的信号分子，并研究其对植物生长、减少农田土壤氧化亚氮排放，将有效提高植物根际促生菌在根际的功能发挥，为减少农田土壤氧化亚氮排放提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中农田土壤温室气体氧化亚氮减排难的问题，提供一种棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。

具体方法是向植物根际处添加施氏假单胞菌的菌悬液和含有棕榈酸的溶液。

其中，所述的施氏假单胞菌的菌悬液，其OD₆₀₀＝0.01-2.5，其添加量为0.1-15mL/株；优选的OD₆₀₀＝1，其添加量为10mL/株。

其中，所述的含有棕榈酸的溶液，其棕榈酸浓度为10-500mg/L，优选的浓度为20-200mg/L，更优选的浓度为50mg/L。

在考察棕榈酸与施氏假单胞菌协同作用关系上，所述的棕榈酸可以提高施氏假单胞菌的趋化菌落数、生物膜形成量、非生物胁迫下(盐胁迫和金属Cu²⁺离子胁迫)菌株生长量和生物素产生量；所述的棕榈酸可以提高施氏假单胞菌的菌株脱氮量和菌株氧化亚氮还原酶活性。即进一步说明棕榈酸提高了施氏假单胞菌在减少农田土壤的氧化亚氮排放的能力和促进植物生长并增加施氏假单胞菌在植物根际定殖的能力。

在一些具体实施例中，所述植物为番茄。

在一些具体实施例中，所述的施氏假单胞菌为施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri NRCB010，已于2019年12月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.19067，其具体信息内容已公开在专利CN111117934A中。

在一些具体实施例中，50mg/L和100mg/L棕榈酸能显著促进施氏假单胞菌NRCB010的生长；10mg/L和50mg/L棕榈酸能显著促进生物膜的形成；10mg/L、50mg/L、100mg/L棕榈酸均能显著促进菌株的趋化性；50mg/L棕榈酸能有效缓解盐分和Cu²⁺对菌株NRCB010生长的胁迫作用；50mg/L棕榈酸能显著增加NRCB010生长素的产生量；50mg/L和100mg/L棕榈酸能增加菌株的脱氮能力；50mg/L棕榈酸显著促进了菌株NRCB010氧化亚氮的还原能力，激发了菌株NRCB010的氧化亚氮还原酶活性。

棕榈酸在减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用也在本发明所保护的范围之内。

具体的，通过向土壤中添加含有棕榈酸的溶液。

有益效果：

本发明公开了棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。本发明通过筛选获得了一种植物根系分泌物棕榈酸，研究发现，棕榈酸不仅自身可以减少农田土壤氧化亚氮的排放，还可以与施氏假单胞菌NRCB010协同作用，显著提高施氏假单胞菌的趋化性、生物膜的形成、影响植物在逆境条件下生长，显著提高根系促生菌施氏假单胞菌NRCB010的脱氮能力、氧化亚氮还原酶活性和产IAA能力，从而提高NRCB010促进植物生长和减排农田土壤氧化亚氮的能力。因此，棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减排农田土壤氧化亚氮方面具有广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1施氏假单胞菌NRCB010诱导番茄根系分泌物变化，番茄根系分泌物(NRCB010-)和施氏假单胞菌NRCB010诱导的番茄根系分泌物(NRCB010+)，彩色表示标记代谢物的相对浓度水平

图2根系分泌物成分对NRCB010生长、涌动性、趋化性和生物膜形成的影响

图3棕榈酸对NRCB010在番茄根际定殖能力的影响

图4棕榈酸对NRCB010在逆境条件下生长的影响

图5根系分泌物对NRCB010反硝化能力的影响，柱状图表示4个平行的标准误(n＝4)，小写字母表示统一处理不同浓度间具有显著性差异(P<0.05)

图6棕榈酸对NRCB010氧化亚氮还原能力和氧化亚氮还原酶活性的影响

图7棕榈酸对NRCB010促生特性的影响，柱状图表示4个平行的标准偏差(n＝4)，小写字母表示不同处理的显著性差异(P<0.05)

图8微宇宙条件下，棕榈酸对农田土壤氧化亚氮排放的影响

图9温室盆栽条件下，棕榈酸对农田土壤氧化亚氮排放的影响

图10温室盆栽条件下，棕榈酸对番茄生长的影响

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为施氏假单胞菌NRCB010，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏号为CGMCCNO.19067，保藏日期为2019年12月02日。具体信息内容已公开在专利CN111117934A中。

实施例1施氏假单胞菌NRCB010诱导番茄根系分泌物变化

将菌株NRCB010接种于NBNS(高蛋白胨0.5g/L，LAB-Lemco粉0.3g/L，硝酸钠2.5mg/L，琥珀酸钠71mg/L，pH 7.0)液体培养基中30℃、200rpm过夜培养获得发酵液。发酵液经6000g离心5min后，用1/10Hoagland营养液重悬，至OD₆₀₀约为1.0。将番茄种子于2.5％的84消毒液中处理10min，自来水冲洗8-10次。将表面灭菌的番茄种子在1/10Hoagland营养液中培养7天。选择大小一致的4株番茄幼苗移栽至含有0(NRCB010-)和10⁵CFU/mL(NRCB010+)的NRCB010菌液的1/10Hoagland营养液中继续培养。每个处理设置3个平行。3天后，将番茄幼苗根部用无菌水清洗5次(避免根部损伤)后，在100Hz超声下处理5min，然后用无菌水清洗1次。将处理后的番茄幼苗移栽至60ml纯水中使根部浸没，培养24h收集番茄根系分泌物。将收集的番茄根系分泌物6500g离心5min，去除细胞碎片，再过0.22μm滤膜过滤除菌。将过滤除菌后的番茄根系分泌物(mL)与番茄根鲜重(g)比值调整为300mL/g。将番茄根系分泌物冻干，最后溶解于6ml(浓缩10倍)甲醇中。取2ml甲醇溶解液加入10μL硅烷衍生化试剂(BSTFA:TMC＝5:1)，密封后于60℃水浴中衍生1h，然后过0.22μm滤膜，-80℃保存用于后续成分分析。

将收集的番茄根系分泌物利用GC/MS Agilent-6890N/59731((Thermo,Italy)分析。色谱条件：HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；载气：高纯氦气；柱流量：1.0ml min^-1；进样量：1μL；溶剂延迟：3min；进样模式：无分流；进样口温度：280℃；柱箱温度：在70℃保持2min，然后从70℃以10℃min^-1的速度升至300℃保持10min；MS检测器离子源能量：70eV；扫描范围：35～650amu；扫描周期：0.32s。通过与标准品保留时间和NIST谱库的标准谱图(v.2.0)进行对比，以鉴定化合物。结果如图1所示，与NRCB010-处理相比，NRCB010+处理的根系分泌物中有11种根系分泌物成分的相对含量发生了显著变化。其中，8种成分(八乙二醇单十二烷基醚、3,4-二甲基苯甲酰胺、2,4-二叔丁基苯酚、棕榈酸甲酯、异胆酸乙酯、棕榈酸、壬醛二甲缩醛、硬脂酸甲酯)的相对含量显著增加(P<0.05)，3种组分(6-甲基-十八烷、12,15-十八碳二炔酸甲酯、2,6,10,14-四甲基-十七烷)的相对含量显著降低(P<0.05)。

实施例2根系分泌物成分对NRCB010生长、涌动性、趋化性和生物膜形成的影响

根据化学安全信息和相关参考文献，再结合实施例1的色谱分析结果，综上选择棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、2,4-二叔丁基苯酚和棕榈酸研究其对NRCB010生长、涌动性、趋化性和生物膜形成的影响。

(1)4种代谢物100倍母液配制：将上述4种化合物分别取0g(对照)、0.05g、0.25g、0.5g溶于50mL 100％乙醇中，得到0g/L(对照)、1g/L、5g/L和10g/L的代谢物100倍母液。

(2)NRCB010生长试验：将NRCB010在1/5NBNS液体培养基中于30℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为1.0。分别将2μL代谢物100倍母液和188μL 1/5NBNS液体培养基、10μL实施例1中过夜培养后的NRCB010发酵液充分混合，加入96孔板中。将混合后的混合物在100rpm下培养48h。使用酶标仪(INFINITE 200PRO,Austria)测定OD₆₀₀。

(3)涌动性试验：向LB平板中(酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂5g/L，pH 7.0)分别加入1％的4种代谢物100倍母液，使代谢物终浓度分别为0g/L(对照)、10mg/L、50mg/L和100mg/L。将2μL NRCB010菌液滴至平板中心4mm圆形滤纸上，于30℃正置培养72h后测定所形成的菌落直径。

(4)趋化性试验：将菌株NRCB010在LB培养基中于30℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为1.0。菌液于6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用等体积的0.86％ NaCl重悬得到菌悬液，吸取100μL菌悬液保留于200μL移液枪头中，待用。将1mL注射器作为趋化性试验的毛细管，分别吸取100μL含有1％的代谢物100倍母液的0.86％ NaCl，使代谢物终浓度分别为0g/L(对照)、10mg/L、50mg/L和100mg/L。将注射器针头插入上述移液枪头细口端，使含有代谢物的0.86％ NaCl与菌悬液充分接触，室温无菌培养2h后，从菌悬液中小心取出注射器针头，对注射器中所含的NRCB010菌液用0.86％NaCl逐级稀释，涂布到LB培养基上，在30℃条件下培养36h后，统计平板上菌落数(CFU)，代表NRCB010对代谢物的趋化性。

(5)生物膜形成试验：将菌株NRCB010接种到LB液体培养基中，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为1.0。菌液于6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用0.86％ NaCl重悬菌体，再离心后加入等量的K培养基(KH₂PO₄ 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.1g/L、NaCl 0.1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、MnSO₄·H₂O 0.01g/L、Fe₂(SO₄)₃·H₂O 0.01g/L、Na₂MoO₄·H₂O0.01g/L、乳酸钠10mL、(NH₄)₂SO₄ 0.4g/L，pH 6.8)悬浮菌体。将37.5μL的菌液和112.5μL含有代谢物溶液的K培养基混合，加入到96孔板中。代谢物在混合液中的最终浓度为0g/L(对照)、10mg/L、50mg/L和100mg/L。每个处理3个重复。30℃静止培养48h后，利用结晶紫染色法测定生物膜的形成。在560nm波长测定吸光值。

实验结果如图2所示，与对照相比，10mg/L硬脂酸甲酯、50mg/L和100mg/L棕榈酸显著促进NRCB010的生长(图2a)。10mg/L和50mg/L棕榈酸甲酯和棕榈酸显著促进生物膜的形成(图2b)。硬脂酸甲酯和50mg/L 2,4-二叔丁基酚显著增加了菌株的涌动性(图2c)。50mg/L棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、2,4-二叔丁基苯酚和棕榈酸均显著促进菌株的趋化性(图2d)。综上可得，棕榈酸对施氏假单胞菌NRCB010生长、趋化性和生物膜形成作用效果更好。

实施例3根系分泌物成分对NRCB010在番茄根际定殖能力的影响

将菌株NRCB010接种于LB培养基中30℃，200rpm过夜培养，测OD₆₀₀，并稀释至OD₆₀₀约为1.0。4000rpm、10min离心后收取菌体，并用无菌0.86％ NaCl等体积重悬，再用0.86％NaCl稀释10倍。将消毒的番茄种子在水琼脂平板中催芽7天后，然后将大小均一的幼苗分别浸泡在含有0％和1％的代谢物100倍母液的菌悬液(代谢物在菌悬液中的最终浓度为0mg/L和50mg/L)中2h。将幼苗从溶液中取出，吸干表面多余的水分，然后在含0.8％琼脂和0.6％蔗糖的1/5MS培养基上培养2天。每个处理3个重复。在无菌的环境下将番茄根部剪下并用无菌水轻轻清洗表面未定殖的菌体。然后，将根称重并加入无菌0.86％ NaCl研磨，最后将获得的根浊液用生理盐水分别稀释10²、10³和10⁴倍，并涂布于LB培养基上。以不含代谢物的菌悬液为对照处理。在30℃培养48h后，通过平板计数法测定定殖到番茄根部的活菌数。定殖到番茄根部的活菌数通过下述公式进行计算：

N(个/g)＝x×k×V1/m×V2

其中，x为活菌落个数(个)；k为稀释倍数；V1为根浊液总体积(mL)；V2为根浊液加入量(mL)；m为根质量(g)。

实验结果如图3，50mg/L棕榈酸能显著促进NRCB010的定殖能力，50mg/L棕榈酸甲酯、50mg/L硬脂酸甲酯和50mg/L 2,4-二叔丁基苯酚显著降低了NRCB010在根表面的定殖数量。

实施例4非生物胁迫下棕榈酸对NRCB010生长量的影响

分别研究pH、NaCl、和Cu²⁺条件下50mg/L棕榈酸对NRCB010生长的影响。pH设置为5.0、7.0、9.0、10.0和11.0；NaCl设置为：0％、1％、2％、2.5％、3％和4％，CuSO₄设置为0μM、4μM、8μM、12μM和16μM。将NRCB010菌株过夜培养至OD₆₀₀约为1.0，将188μL分别含pH、NaCl、和Cu²⁺的1/5NBNS培养基，2μL过夜培养的NRCB010菌株的发酵液和10μL 50mg/L棕榈酸充分混合后加入到96孔板中，30℃，100rpm摇床培养48h后测OD₆₀₀。实验结果如图4，棕榈酸能有效缓解盐分和Cu²⁺对菌株NRCB010生长的胁迫作用。然而，在pH5.0-11.0之间，棕榈酸抑制了菌株NRCB010的生长。

实施例5根系分泌物对NRCB010脱氮能力的影响

将菌株NRCB010接种于NBNS液体培养基中培养12h后，按1％的接种量(v/v)将菌液分别接种至含不同浓度(0mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L)的棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯和棕榈酸的反硝化DM培养基(KNO₃ 0.72g/L、K₂HPO₄ 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O1.0g/L、丁二酸钠2.8g/L，pH 7.0)中，28℃，200r/min振荡培养48h时，取样分析总氮的浓度。每个处理三个平行。如图5所示，棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯和棕榈酸在一定浓度下能增加菌株的脱氮能力。其中，50mg/L和100mg/L棕榈酸脱氮效果较好。

实施例6根系分泌物对NRCB010氧化亚氮还原能力和氧化亚氮还原酶活性的影响

向100ml玻璃血清瓶中加入30ml无KNO₃的DM培养基(K₂HPO₄ 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O1.0g/L、丁二酸钠2.8g/L，pH 7.0)，121℃灭菌20min后冷却至室温。用氦气替换玻璃血清瓶内部空气三次，并用氧化亚氮置换氦气。将OD₆₀₀约为1.0的NRCB010菌液6000rpm离心10min后去上清，用无KNO₃的DM培养基等量重悬，用无菌注射器向气瓶中各加入10ml菌液，再分别加入终浓度为50mg/L的棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯和棕榈酸。对照组为向气瓶中加入10ml无KNO₃的DM培养基和10ml菌液。30℃，200rpm摇床培养6h后采气。用气相色谱-质谱测定氧化亚氮的浓度，计算NRCB010的N₂O还原能力。每个处理进行三次重复。结果如图6a所示，培养6h内，添加硬脂酸甲酯和棕榈酸的气瓶中氧化亚氮浓度显著低于对照组，促进了菌株NRCB010氧化亚氮还原能力，其中，棕榈酸的效果比硬脂酸甲酯的效果更好；而棕榈酸甲酯则显著抑制了菌株氧化亚氮的还原能力。

将NRCB010菌株接种至NBNS培养基中，28℃，200rpm培养12h后，按1％v/v的接种量分别接种至含0和50mg/L棕榈酸的营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏粉3g/L)，并额外添加0.3mM NaNO₃和4mM琥珀酸钠，以诱导氧化亚氮还原酶活性，28℃，200rpm培养6h。取20ml培养液4℃、6000rpm、10min下离心收集培养物，将培养物用等量0.86％NaCl重悬并混匀，再离心用等量0.86％ NaCl重悬并混匀，重复三次上述步骤后收集菌体，并用0.86％ NaCl重悬，利用组织研磨仪将样品在功率60Hz、3min下破碎，破碎后的样品在4℃、6000rpm、离心30min，分离酶样。所得上清液用于测定氧化亚氮还原酶活性。按氧化亚氮还原酶测定试剂盒说明书测定上述样品氧化亚氮还原酶活性。在提取过程中，除特殊说明外，其余步骤均在4℃以下和厌氧状态下进行操作。结果如图6b所示，棕榈酸能显著激发菌株NRCB010的氧化亚氮还原酶活性。说明棕榈酸具有增强NRCB010菌株氧化亚氮还原能力。

实施例7棕榈酸对NRCB010促生特性的影响

制作标准曲线：分别取0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL的吲哚乙酸溶液2ml与2ml Salkowski比色液混合并避光静置1h后，测其OD₅₃₀。对应浓度的OD₅₃₀值分别为0、0.318、0.691、1.094、1.458、1.830和2.160。测定标准曲线为y＝27.631x，R²＝0.9997。

将菌株NRCB010接种于NBNS液体培养基中，于200rpm、28℃摇床培养12h。取1ml菌液将其转入99ml添加0.2g/L L-色氨酸和50mg/L棕榈酸的R2A液体培养基(胰蛋白胨0.25g/L、酸水解酪蛋白0.5g/L、酵母浸粉0.5g/L、可溶性淀粉0.5g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.1g/L、丙酮酸钠0.3g/L、蛋白胨0.25g/L、葡萄糖0.5g/L，pH 7.2)中，继续于28℃、200rpm培养48h。对照组为含0.2g/L L-色氨酸的R2A液体培养基。将培养液于室温、6000rpm离心10min后得上清液。取上清液2ml并加入2ml Salkowski比色液混合均匀后，避光放置1h。测其OD₅₃₀。根据得到的OD₅₃₀数据，通过生长素浓度与OD₅₃₀的标准关系曲线计算，得到相应的生长素浓度。结果如图7所示，棕榈酸能显著增加NRCB010生长素的产生量。

实施例8微宇宙条件下，棕榈酸对农田土壤氧化亚氮排放的影响

供试土壤：采集江苏宜兴蔬菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，待用。理化性质：pH7.08，有机质11.0g/kg，速效磷68.2mg/kg，速效钾271.2mg/kg，交换性钙1.16mg/kg，交换性镁1.05mg/kg。称取550g风干土到培养盆中，每个处理4个重复。将NRCB010菌株接种于NBNS液体培养基中30℃、200rpm过夜培养。菌液4000rpm离心10min后，用无菌1/10MS(不含有机元素，不含琼脂和蔗糖，pH 5.8)重悬菌体，至OD₆₀₀约为1.0，再稀释10倍。A1组(即图8中Control)中每盆中加入20ml的1/10MS(含1％乙醇)，A2组(即图8中NRCB010)中每盆中加入10ml菌悬液和10ml的1/10MS(含1％乙醇)，A3组(即图8中棕榈酸)中每盆中加入10ml的1/10MS和10ml的1/10MS(含50mg/L棕榈酸和1％乙醇)，A4组(即图8中NRCB010+棕榈酸)中每盆中加入10ml菌悬液和10ml的1/10MS(含50mg/L棕榈酸和1％乙醇)。置于光照时间：7:00-21:00；黑暗时间：21：00-7:00；26℃，光照强度：5000LX的温室条件下生长。每天检查土壤状态，保持湿润。

在处理的第1天、3天、5天、7天和9天采集气体样品。氧化亚氮气体采集采用传统静态箱法，将培养盆置于箱式采样装置中，密封稳定后，每15min采集一次，用50ml的注射器从采气箱顶部的密封采样孔插入，采集30ml的气样立即转移至己抽成真空的采样瓶中。采样时间一般固定在上午(9:00-11:00)。利用GC-ECD分析气体样品中的氧化亚氮浓度，计算氧化亚氮排放通量和累积排放量。结果如图8所示，在监测期内，土壤氧化亚氮排放通量随时间的增加而增加，在第5天时氧化亚氮排放通量达到最高随后降低。添加棕榈酸的土壤氧化亚氮排放趋势与Control对照一致，但排放量低于对照。添加NRCB010和添加NRCB010+棕榈酸皆能显著降低氧化亚氮排放量。与Control对照相比，添加NRCB010、棕榈酸、NRCB010+棕榈酸氧化亚氮累计排放量显著降低，分别减少了28.9％、27.7％和52.4％。

实施例9温室盆栽条件下，棕榈酸对番茄生长和农田土壤氧化亚氮排放的影响

供试土壤：采集江苏宜兴蔬菜地表层土壤，自然风干，过2mm筛，待用。理化性质：pH7.08，有机质11.0g/kg，速效磷68.2mg/kg，速效钾271.2mg/kg，交换性钙1157.2mg/kg，交换性镁1054.2mg/kg。称取550g风干土到培养盆中，每个处理4个重复。将NRCB010菌株接种于NBNS液体培养基中30℃、200rpm过夜培养。菌液4000rpm离心10min后，用无菌1/10MS(不含有机成分，不含琼脂和蔗糖，pH 5.8)重悬菌体，至OD₆₀₀约为1.0，再稀释10倍，备用。

将番茄种子于2.5％的84消毒液中处理10min，自来水冲洗8-10次。将消毒处理的种子于26℃培养箱中催芽3天后选取出芽相近的种子进行播种，每盆7颗番茄种子。T1组(即图9中Control)中每盆中加入20ml的1/10MS(含1％乙醇)，T2组(即图9中NRCB010)中每盆中加入10ml菌悬液和10ml的1/10MS(含1％乙醇)，T3组(即图9中棕榈酸)中每盆中加入10ml的1/10MS和10ml的1/10MS(含50mg/L棕榈酸和1％乙醇)，T4组(即图9中NRCB010+棕榈酸)中每盆中加入10ml菌悬液和10ml的1/10MS(含50mg/L棕榈酸和1％乙醇)。置于光照时间：7:00-21:00；黑暗时间：21：00-7:00；26℃，光照强度：5000LX的温室条件下生长。每天检查番茄种子状态，保持湿润。

在番茄移栽后的第18天、25天和31天时测量作物的株高、茎粗、叶长和鲜干重等指标。于番茄移栽后开始采集气体样品，氧化亚氮气体采集采用传统静态箱法，利用GC-ECD分析气体样品中的氧化亚氮浓度，计算氧化亚氮排放通量和累积排放量。结果如图9所示，在实验期内，实验处理的第一天氧化亚氮排放量出现峰值并随后降低。与Control对照相比，添加NRCB010、棕榈酸、NRCB010+棕榈酸氧化亚氮累计排放量显著降低，分别减少了33.％、43.0％和49.4％。说明棕榈酸能够有效减少土壤中氧化亚氮的排放，且与NRCB010共处理时，减排效果更优。以干重为核心指标分析，与对照相比，NRCB010、棕榈酸、NRCB010+棕榈酸处理皆能显著促进番茄的生长，分别增加了42.2％、41.5％和46％(图10)。

本发明提供了棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.棕榈酸在提高施氏假单胞菌在促进植物生长和减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，向植物根际处添加施氏假单胞菌的菌悬液和含有棕榈酸的溶液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的施氏假单胞菌的菌悬液，其OD₆₀₀＝0.01-2.5，其添加量为0.1-15mL/株。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的含有棕榈酸的溶液，其中，所述的棕榈酸浓度为10-500mg/L，优选的浓度为20-200mg/L，更优选的浓度为50mg/L。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的棕榈酸提高施氏假单胞菌的趋化菌落数、生物膜形成量、非生物胁迫下菌株生长量和生物素产生量；所述的棕榈酸提高施氏假单胞菌的菌株脱氮量和菌株氧化亚氮还原酶活性。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。

7.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其特征在于，所述的施氏假单胞菌为施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri NRCB010。

8.棕榈酸在减少农田土壤氧化亚氮排放中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，向土壤中添加含有棕榈酸的溶液。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的含有棕榈酸的溶液，其中，所述的棕榈酸浓度为10-500mg/L，优选的浓度为20-200mg/L，更优选的浓度为50mg/L。