KR20140063085A - 형질전환 식물체를 이용한 어류 바이러스성 신경괴사증 예방 경구백신 제조방법과 그에 따른 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 또는 이의 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 백신 조성물, 상기 백신 조성물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 사료 첨가제 및 상기 백신 조성물 또는 상기 사료 첨가제를 어류에 경구투여하는 것을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증을 예방하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 백신을 어류 양식 산업에 이용한다면, 현재 국내에서 최고급, 최고가의 어종 중의 하나인 능성어류에서 치명적으로 발생하는 질병의 발병율을 낮춤으로써 생산성 향상에 크게 이바지할 수 있고, 또한 사료 및 질병방제관련 산업의 성장도 기대할 수 있다.

Description

형질전환 식물체를 이용한 어류 바이러스성 신경괴사증 예방 경구백신 제조방법과 그에 따른 식물체{Method for producing oral vaccine against fish viral nervous necrosis using transgenic plant and the plant thereof}

본 발명은 형질전환 식물체를 이용한 어류 바이러스성 신경괴사증 예방 경구백신 제조방법과 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 삽입된 식물 색소체 형질전환용 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 식물체를 형질전환하여 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 색소체 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 색소체 형질전환 식물체, 상기 색소체 형질전환 식물체의 종자, 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 또는 이의 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 백신 조성물, 상기 백신 조성물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 사료 첨가제 및 상기 백신 조성물 또는 상기 사료 첨가제를 어류에 경구투여하는 것을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증을 예방하는 방법에 관한 것이다.

근래에 해산어 자원의 보호 및 확보를 위해 약 40 종류의 해산어가 국내에서 양식되고 있다. 또한, 수많은 종류의 치어도 양식의 종묘로서 생산되고 있다. 이러한 생선에 대한 종묘 생산 기술 및 양식 기술도 개발되고 있지만, 감염 특히 바이러스 감염에 의해 일어나는 질병에 대한 제어는 점점 곤란에 직면하고 있다. 예를 들어, 방어 등에 대한 YAV(yellowtail ascites virus)에 의한 비르나바이러스(birnavirus) 감염, 능성어나 넙치 등에 대한 노다바이러스(nodavirus) 감염에 의한 VNN(viral nervous necrosis: 바이러스성 신경 괴사증) 등이 보고되어 있다.

그 중에서도 특히 노다바이러스 감염에 의한 바이러스성 신경괴사증은 1990년 이후 세계 각지에서 해산어에 발생하여, 치사성이 매우 높은 점에서, 종묘 생산업 및 양식업에서 위협이 되고 있다. 또한 그 병에 걸린 어종도 30종을 넘어서고 있다.

능성어류는 국내에서 양식이 되지 않는 어종으로 해수어중 최고급, 최고가의 어종 중의 하나인데, 특히 제주도 인근 해역에서만 포획되는 능성어류인 자바리 (일명 다금바리)는 그 중에서도 가장 고가이면서 귀한 어종으로 널리 알려져 있다. 그러나 아직까지 국내에서는 능성어류에 대한 상업적 양식은 이루어지지 않고 있다. 이러한 이유는 능성어류에 대한 전반적인 이해가 부족한 것도 기인하지만 무엇보다도 능성어류에서 가장 치명적인 질병 중의 하나인 바이러스성 신경괴사증(VNN)에 의한 자·치어 피해에 있다고 할 수 있다. VNN은 해수어 노다바이러스 (nodavirus)의 감염으로 인한 질병으로써 1990년대 후반부터 해산어 종묘생산장에 치명적인 피해를 입히고 있는 질병으로 돔류, 능성어류, 범가자미류, 넙치 등의 어종에서 발병되고 있으며, 어류가 이 질병에 감염될 경우 높은 폐사율을 나타내므로 큰 피해를 입히게 된다.

최근 국내 양식장에서 바이러스 질병실태 조사를 한 결과 능성어, 돔류, 넙치에서 이 질병으로 인한 폐사가 발생된 것으로 확인되었다. 노다바이러스 감염은 주로 부화 후 15-30일령의 어체에서 발생되고, 이 바이러스에 의한 감염증은 황점볼락, 홍민어, 조피볼락 및 능성어에서도 확인되고 있다. 특히, 성장 초기 단계의 자·치어 시기에 치사성이 매우 높게 나타나는 것으로 보고되고 병어는 양어장 표층을 힘없이 유영하거나, 회전 유영을 특징적으로 보이며, 그 후 쇠약해지면 양어장 바닥에 가라앉아 폐사하게 된다. 이 질병은 외관상으로는 특별한 병변을 나타내지 않는 경우가 많으나 때에 따라서는 체색흑화 및 척추의 이상이 보여지는 경우도 있다. 조직학적으로는 뇌 및 망막 조직의 세포에 괴사 및 붕괴에 의한 큰 공포를 형성시키는 특징을 갖고, 그러한 세포의 세포질 내에서 소형의 바이러스 입자가 고밀도로 모여 있는 것을 확인할 수 있다.

국내 양식장의 규모가 점차적으로 대형화되면서 높은 밀집 사육 및 수질 저하로 인해 어류 감염성 질병 발생율이 증가하는 추세이다. 어류의 세균성 질병 발생을 막기 위해 항생제가 사용되지만 바이러스성 질병은 수평감염뿐만 아니라 수정란에 의한 수직감염이 되기 때문에 한번 발생하면 치료가 불가능하고 대량폐사를 일으키는 경우가 많다. 특히 8-9월경 고수온 환경이 되면 용존산소가 감소함에 따라 바이러스 발병률이 높아지므로 예방차원의 방역조치가 중요하다. 양식 어류의 감염 질병을 방지하기 위한 항생제의 지속적인 사용은 내성균을 유발시키며 환경오염 등의 문제를 일으키고 있어 이에 대한 대책으로 수산 선진국에서는 항생제 사용을 제한하는 대신 백신 개발을 적극적으로 추진하고 있다.

어류백신의 종류는 크게 불활화백신(inactivated vaccines), 약독화백신(live attenuated vaccines), DNA 백신, 재조합 단백질백신(recombinant vaccines) 등이 있다. 백신을 투여하는 방법으로는 크게 주사법, 침지법 및 경구투여법 등이 있다. 이 중에서 주사법은 투여량이 정확하고 백신의 양도 적게 소요되며 면역보강제의 첨가가 가능하여 어류에 확실한 면역능력을 부여하는 장점이 있지만, 노동력이 많이 소요되어 실용화하기가 어려운 단점이 있다. 침지법에는 고농도로 백신이 첨가된 용기에 어류를 단시간 침지시키는 표준법과, 사육수조에 백신을 직접 저농도로 첨가하여 침지시키는 저농도법이 있다. 표준법은 소요되는 백신의 양은 적지만 처리작업이 번거로운 반면, 저농도법은 작업이 간편한 대신 백신 사용량이 많다. 주사법과 표준침지법은 처리시 스트레스를 많이 받기 때문에 어린 어류에게는 사용하기 어렵다. 경구투여법은 사료에 백신을 혼합한 후에 사용하므로 투여방법이 가장 간편하지만 다량의 백신을 장기간 투여하여야 하며 예방효과도 떨어지는 단점이 있다. 따라서 어류의 스트레스를 줄이는 동시에 백신의 생산비용, 대량 생산 시스템 및 안전한 저장과 운반 시스템 등을 고려한다면 경구백신의 단점을 보완한 백신을 개발하는 것이 한층 효과적이다.

최근 식물을 이용한 외래단백질 생산시스템이 개발되기 시작하여 인체 혹은 동물 질병 치료를 위한 항체 및 백신 등을 생산하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 동물세포나 미생물 발현시스템과는 달리 식물 발현시스템으로 생산된 외래단백질은 분리 정제과정 없이도 바로 경구투여용으로 사용할 수 있어 경제적이고 편리한 장점을 지니고 있다.

한국공개특허 제2006-0131931호에서는 노다바이러스의 감염 예방법과 치료법에 대해 기재되어 있으나, 본 발명과 같이 형질전환 식물체를 이용한 어류 바이러스성 신경괴사증 예방 경구백신 제조방법과 그에 따른 식물체에 관해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 노다바이러스에 의해 발생되는 능성어류의 바이러스성 신경 괴사증을 예방하기 위해 노다바이러스 외피 단백질(capsid protein)을 코딩하는 유전자를 니코틴 프리 담배 색소체에서 발현시켜 경구 백신용 형질전환 식물체를 제조하였고, 상기 경구 백신용 형질전환 식물체를 급이한 마우스에서 노다바이러스 항체가 생성된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 삽입된 식물 색소체 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환하여 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 색소체 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 색소체 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 또는 이의 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 상기 사료 첨가제를 어류에 경구투여하는 것을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명을 통해 개발된 백신을 어류 양식 산업에 이용한다면, 현재 국내에서 최고급, 최고가의 어종 중의 하나인 능성어류에서 치명적으로 발생하는 질병의 발병율을 낮춤으로써 생산성 향상에 크게 이바지할 수 있고, 또한 사료 및 질병방제관련 산업의 성장도 기대할 수 있다.

도 1은 노다 바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 원래의 유전자의 염기서열(상단) 및 이의 엽록체 코돈 최적화(chloroplast condon-optimization)한 유전자의 염기서열(하단)을 나타낸다. 하단 서열에서, 적색으로 표시된 서열이 코돈 최적화한 서열이다.
도 2는 노다 바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 분석하기 위해 수행한 오버랩 신장 PCR (Overlap extension PCR) 방법을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 사용된 벡터이다. (상단) 니코틴 프리(nicotine-free) 담배 색소체 형질전환용 벡터를 제조하기 위한 기본 카세트 벡터, (하단) 니코틴 프리(nicotine-free) 담배 색소체를 활용한 노다 바이러스 외피 단백질 발현용 벡터.
도 4는 재분화된 담배 색소체 형질전환체를 PCR을 통해 확인한 결과이다. WT; 야생형(wild type), C; 플라스미드 벡터 대조구(TIA_Rclp::synNoda).
도 5는 담배 색소체 형질전환체를 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 노다바이러스 외피 단백질의 발현 여부를 형질전환 담배 색소체에서 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다. M; 사이즈 마커, C; 대장균에서 추출한 노다바이러스 단백질, WT; 야생형(wild type), kD; 킬로달톤(kilodalton).
도 7은 마우스 면역실험을 위한 각 그룹별 면역 방법 및 마우스 개체수를 나타낸다.
도 8은 마우스 면역실험 후 소장에서 채취한 시료 중의 점막면역 항체 IgA를 측정한 결과이다. A; 급이만 한 그룹, B; 1회 프라이밍(primimg) 후 급이한 그룹, C; 1회 프라이밍 및 1회 부스팅(boosting) 후 급이한 그룹. A, B 및 C에서 Control; 음성 대조군(일반사료 급이군), 10%; 형질전환 식물체 함유량이 급이 중의 10%, 20%; 형질전환 식물체 함유량이 급이 중의 20%를 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 삽입된 것을 특징으로 하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 색소체 형질전환용 재조합 발현 벡터는 도 3의 하단에 도시된 pTIARclp::synNoda인 벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 원래의(original) 노다 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 유전자일 수도 있지만, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 엽록체 코돈 최적화(chloroplast condon-optimization)한 유전자일 수 있다.

또한, 상기 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 유전자 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 aadA(스펙티노마이신 저항성 유전자), 베타인알데하이드 유전자, gfp(green fluorescent protein) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 psbA 터미네이터, rrnB1 /B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환하여 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 색소체 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물에 상관없이 어떤 식물체도 형질전환시킬 수 있으나, 본 발명에서는 쌍자엽 식물인 담배, 특히 니코틴 프리(nicotine-free) 담배에 형질전환을 실시하였다. 이는 형질전환 담배를 사료 형태로 제공하기 위해서 니코틴이 함유되어 있지 않은 담배를 사용하는 것이 바람직하기 때문이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 식물체는 애기장대, 토마토, 가지, 담배, 고추, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 미나리, 파슬리, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 무, 순무, 배추, 양배추, 당근, 우엉, 고구마, 마, 연근, 감자 및 생강 등의 근채류 작물; 인삼, 칡 및 더덕 등의 약용식물; 옥수수 및 콩 등의 사료작물; 벼 등의 주곡작물; 유채 등의 유지작물을 포함하는 뿌리로 이용될 수 있는 식물체들을 포함하나, 이에만 한정되는 것은 아니다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 particle bombardment (입자 충격법)이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 색소체 형질전환 식물체 및 종자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체, 이의 절편 또는 이의 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 백신 조성물에서, 상기 유전자는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 백신 조성물에서, 상기 어류는 양식되는 모든 종류의 어류가 포함되고, 바람직하게는 돔류, 범가자미류, 넙치류, 황점볼락, 홍민어, 조피볼락 및 능성어류(일명 다름바리인 자바리)가 포함되며, 더욱 바람직하게는 능성어류이나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, "백신"은 적어도 한가지 면역보호성 항원성 물질을 포함하는 어류에 투여하는데 이용되는 조성물이다.

상기에서 추출물은 액상형태일 수도 있으며, 식물체 또는 이의 절편을 동결 건조하여 분쇄한 분말형태일 수도 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 약제학적으로 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 바람직하게는 경구투여용 제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 경구투여용 고형제제 또는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 액상제제로 제제화하는 것이 바람직하다. 고형제제로 제제화하는 경우에는 adjuvant로서 CM-chitin을 이용할 수 있다. 액상제제로 제제화하는 경우에는 본 발명에 따른 백신 조성물에 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 혼합할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 사료에 첨가되어 어류에게 섭취시킴으로써, 이를 섭취한 어류에서 어류 바이러스성 신경 괴사증의 노다바이러스에 대한 항체 형성을 유도하여 면역효과를 유발시킬 수 있다. 이때 백신 조성물은 분말형태 또는 액상 형태로 사료에 첨가 되어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 백신 조성물 또는 상기 사료 첨가제를 어류에 경구투여하는 것을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증을 예방하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 동결 건조하여 이를 분말화한 후, 사료 및 전분과 혼합하여 환제 형태의 사료로 어류에 섭취시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 형질전환 식물체를 사료첨가제로서 사료와 혼합하여 어류에 급여하는 경우, 어류에 지속적으로 백신을 투여하는 효과를 나타낼 수 있다.

노다바이러스 유래의 외피 단백질을 포함하는 식물은 필요와 상황에 따라서 다양한 방식으로 피험자, 즉 어류에 투여될 수 있다고 생각된다. “투여”는 어류의 체내로 물질의 도입으로 정의되고, 구강, 비강, 직장, 질내, 장관외 경로를 포괄한다. 본 발명의 조성물은 피하(SQ), 근육내(IM), 정맥내(IV), 점막, 비강 또는 구강을 비롯한 임의의 투여 경로를 통하여 개별적으로, 또는 다른 치료제와 공동으로 투여될 수 있다. 특히 바람직하게는 경구 경로이다.

본 발명에 따른 항원성 조성물의 특정 용량은 조성물이 투여되는 어류의 종, 연령, 전반적인 상태 및 조성물의 투여 양식을 비롯한 다양한 인자에 좌우된다. 본 발명에 따른 조성물의 효과량은 통상적인 실험을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다. 시험관내와 생체내 모델을 이용하여 적량을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 백신의 효능은 백신의 투여가 치료되거나 목적 병원균에 의해 유발되는 질환의 증상을 적어도 5%, 바람직하게는 10-20%, 더욱 바람직하게는 25-100% 예방하거나 완화시킨다는 것을 예증함으로써 결정된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 노다바이러스 항원단백질 유전자의 식물체 발현 최적화를 위한 코돈 최적화

식물체에서 외래 단백질의 발현을 극대화하기 위해 노다바이러스 캡시드 유전자를 식물 색소체 유전자 전사과정에 맞도록 Graphical codon usage analyser program 및 http://www. kazusa.or.jp/codon의 데이터베이스를 활용하여 염기서열을 담배 색소체의 코돈에 맞게 최적화하였다(도 1). 코돈이 최적화된 노다바이러스 캡시드 유전자는 오버랩 신장 PCR(overlap extension PCR) 기법을 응용하여 합성하였다(도 2). 약 60bp 길이로 정방향의 13개의 프라이머 및 정방향 프라이머와 약 20bp 정도 겹치도록 역방향으로 13개의 프라이머를 제작하였다. 8개의 프라이머 조합(F1~F7, R2~R8)을 이용하여 95℃에서 5분 동안의 최초 변성; 95℃에서 20초 변성, 51℃에서 15초 어닐링 및 72℃에서 30초 중합의 30회 반응; 이어서 95℃에서의 추가적인 5분 중합으로 PCR을 수행하여 약 340bp 길이의 블럭 1을 제작하였다(1st step). 같은 조건으로 블럭 2 및 3을 만든 후 3개의 PCR 반응 산물들을 겔 정제한 후 동량의 비율로 혼합하여 주형을 준비하였다. 1,042bp의 전장 클론을 만들기 위해 주형 2㎕, 10pmole 농도의 F1, R26 프라이머 각각 1㎕, 2.5mM dNTPs 2㎕, pyrobest DNA 폴리머라제 0.3㎕(Takara), 10X PB 버퍼 2.5㎕를 넣고 총 반응액 25㎕를 만들어 95℃에서 5분 동안의 최초 변성; 95℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 30초 중합의 30회 반응; 이어서 95℃에서의 추가적인 5분 중합의 조건으로 2차 PCR을 수행하였다(2nd step). 최종 증폭된 산물을 겔 정제한 후, pGEM T-Easy 벡터로 클로닝하여 염기서열을 분석하고 확인하였다.

실시예 2. 식물 색소체 형질전환 벡터 제조

코돈 최적화된 노다바이러스 캡시드 유전자는 식물 색소체 형질전환 과정 중 유전자간의 이차 재조합을 방지할 수 있도록 고안한 rclp 프로모터가 포함된 색소체 형질전환 기본벡터인 TIA::RclpGAH로 도입하였다(도 3, 상단). 먼저 기본 벡터인 TIA::RclpGAH로부터 mGFP 부분을 제거하기 위해 DNA를 제한효소 PstI으로 자른 후 Klenow 효소 처리를 하였다. 처리한 반응물을 SalI 제한효소로 자른 다음 페놀/클로로포름 및 에탄올 정제하여 벡터를 준비하였다. pGEM T-Easy 벡터 내의 노다바이러스 캡시드 유전자는 EcoRV 및 SalI 제한효소로 처리한 후 겔 정제 키트(Bioneer)를 사용하여 분리하였다. 분리된 노다바이러스 캡시드 유전자를 DNA Ligation kit-Mighty mix(Takara)를 이용하여 mGFP가 제거된 TIA::RclpGAH 벡터(SalI/PstI*) 자리로 서브 클로닝한 후 대장균(E. coli) 내로 도입하여 TIARclp::synNoda를 제작하였다(도 3, 하단).

실시예 3. 노다바이러스 항원단백질 유전자의 니코틴 프리 ( nicotine - free ) 담배 색소체 내 도입

항원 단백질을 발현할 담배는 사료 형태로 직접 제공되므로 니코틴이 함유되지 않은 담배를 사용하였다. 항생제가 첨가되지 않은 MS 배지에서 발아 후 5주 이상 기내에서 배양된 담배 잎을 Rmop 배지 위에서 치상한 후 Bio-Rad 사 PDS-1000 기종을 사용하여 형질전환을 시행하였다. CaCl₂와 스퍼미딘(spermidine)을 사용하여 형질전환 플라스미드 벡터를 0.6㎛ 금 입자로 코팅하였다. 무균 상태 챔버 내 진공은 28 in.Hg, 압력은 1100psi, 거리는 9㎝로 하여 배지 위에 치상된 담배 잎에 충격을 주었다(bombarding). 충격을 받은 담배 잎을 2일간 동일 배지에 배양한 후, 5㎜ x 5㎜로 절단하여 Rmop에 스펙티노마이신(spectinomycin)이 첨가된 선발배지에서 6-7주 배양하여 저항성 신초(shoot)를 유도하였다. 스펙티노마이신(Spectinomycin) 저항성 배지에서 유도된 신초는 3㎜ x 3㎜ 크기로 절단한 후 동일한 선발배지에서 재분화시켜 저항성 신초를 다시 유도하였다. 상기와 같은 방법으로 선발 배지에서 재분화를 반복하여 도입된 유전자의 호모플라스미(homoplasmy)를 높여주었다.

실시예 4. 니코틴 프리 담배 색소체 게놈 내에 도입된 항원유전자의 세대 간 유지 확인( T0 및 T1 세대 분석 데이터)

① 선발배지에서 선발한 담배 색소체 형질전환체의 PCR 분석

항생제 첨가 배지에서 재분화된 식물체가 목표의 유전자가 도입된 형질전환체인지를 확인하기 위하여 각 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하여 벡터 특이적인 프라이머 trnIF(5'-ATCTCTCGAGCACAGGTTTA-3'; 서열번호 3) 및 trnAR(5'-TTCTTGACAGCCCATCTTT-3'; 서열번호 4)을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물 크기가 크기 때문에 Ex Taq(Takara)을 사용하였고, 95℃에서 5분 동안의 최초 변성; 95℃에서 30초 변성, 58℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 5분 중합의 30회 반응; 이어서 95℃에서의 추가적인 5분 중합의 조건으로 PCR을 수행하였다. 유전자가 도입되지 않은 야생형에서는 1.6kb의 DNA 밴드가 검출된 반면, T0 및 T1 세대 형질전환체에서는 프로모터와 목표 유전자 등 벡터가 도입되었음을 나타내는 4.5kb의 DNA 밴드가 검출되었다(도 4).

② 게놈 DNA PCR 로 선발한 담배 색소체 형질전환체의 RT - PCR 분석

게놈 DNA PCR로 유전자 도입이 확인된 식물체를 대상으로 목표 유전자의 전사체(RNA 수준에서의 발현)를 확인하기 위하여 각 식물체로부터 총 RNA를 추출한 후 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 노다바이러스 유전자 특이적 프라이머로 PCR을 수행한 결과 상대적으로 발현양이 많은 라인들(#1-5, #3-4, #3-6, #4-3, #5-5, #10-5)을 선별할 수 있었다. 같은 양의 cDNA를 이용하여 항시 발현하는 액틴 유전자 프라이머로 PCR한 결과와 비교했을 때 노다바이러스 유전자의 전사체가 적어도 2-3배 이상 많은 것을 아가로스 겔 상에서 확인하였다(도 5).

③ RT - PCR 로 선발한 담배 색소체 형질전환체의 웨스턴 블랏 분석

RT-PCR로 노다바이러스 항원 단백질의 전사체가 발현되는 식물체를 선별한 후 목표 유전자가 단백질 수준에서 발현하는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 식물체 잎에서 단백질 추출 버퍼로 총 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 겔에 로딩한 후 0.2㎛ immuno-blot^TM PVDF 막(Bio-Rad)에 이동시켜 5% 탈지분유로 블로킹하였다. 1차 항체로는 노다바이러스 항원 단백질의 항체를 1:5000으로 희석하여 상온에서 밤새 반응시켰고, 염소 항-토끼 HRP-표지된 2차 항체를 1:10000의 농도로 희석하여 상온에서 6시간 반응하였다. HRP가 연결(conjugation)된 2차 항체에 화학 발광 기질인 supersignal westpico(Thermo scientific)로 반응시킨 후 chemidoc^TM XRS+(Bio-Rad)를 통해서 시그널을 확인하였다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 담배 색소체 형질전환체에서 약 43kD의 노다바이러스 단백질이 검출된 것을 확인하였고, 야생형(WT)에서는 검출되지 않는 것을 확인하였다(도 6).

실시예 5. 마우스 경구투여 실험

① 마우스 경구투여를 통한 면역 반응 실험

6주령 암컷 ICR 마우스를 준비 후 총 4개의 그룹으로 분리하였다. 그룹 A는 식물발현 재조합 항원 배합 사료만을 급이한 그룹, 그룹 B는 대장균에서 발현된 재조합 항원을 1회 주사하여 마우스에서 항원 감작(priming)을 시킨 후 식물발현 재조합 항원 배합 사료만을 급이한 그룹, 그룹 C는 대장균에서 발현된 재조합 항원을 1회 주사하여 마우스에서 항원 감작(priming) 시킨 후 1회 부스팅(boosting) 주사를 추가로 실시하고 식물발현 재조합 항원 배합 사료만을 급이한 그룹으로 구분하였다. 일반 사료만을 급이한 그룹 D는 음성대조군으로 사용하였다. 급이는 각각의 그룹에서 형질전환 식물체 함유량이 10% 및 20%가 되도록 다시 두 그룹으로 세분하여 급이를 실시하였다(도 7).

② 경구투여한 마우스의 IgA 측정

경구면역(점막면역)은 감염이 시작되는 부위인 점막면에 직접 항원을 투여함으로써 면역이 유도된다는 점에서 전신성 면역체계와는 크게 차이가 있다. 이러한 이유 때문에 먼저 점막면역 기전을 잘 이해하는 것이 중요하다. 경구적으로 항원을 투여할 때 유도되는 IgG 또는 IgM 항체와는 달리 점막면역에서는 주로 IgA 항체가 국소적으로 생산된다. IgA는 점막 면역(mucosal immunity)에 중요한 역할을 하며 여러 종류의 병원성 물질을 포획하여 활성을 정지시키는 움직이지 않는 항체이다. 장 점막뿐만 아니라 눈물, 타액, 초유, 장액, 질 액, 전립선 액, 호흡기 상피 등에도 존재하며 혈액에도 소량 함유되어 있다. 효소에 의한 분해에도 저항성을 갖기 때문에 소화기계 및 호흡기계와 같은 험난한 환경에서도 기능을 잃지 않아 세균 감염에 대항한다. IgA는 장관강 내에 존재하는 세균, 음식 잔여물, 곰팡이, 기생충, 바이러스에 대한 신체의 일차 방어선이다. 따라서 IgA를 분석하여 경구투여를 통한 면역성을 확인하였다.

급이를 통한 최종 면역 후 7 일째에 마우스의 소장 시료를 채취하여 항체가를 측정하였다. 소장 부위를 약 3cm 정도 채취한 뒤 장관강 내 분변을 제거하고 소장시료에 PBS 0.5㎖을 첨가하여 조직 분쇄기(Tissue grinder)로 세절한 다음 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액 내의 IgA 농도를 측정하기 위해 96 웰 플레이트에 대장균 내에서 발현 및 순수 분리된 재조합 항원을 1㎍/웰/90㎕로 코팅한 후 1% 탈지분유를 첨가한 PBS로 블로킹하고, PBST(PBS+0.05% Tween-20, pH7.4)로 3회 세척하였다. 측정하고자 하는 시료의 상층액을 1차 항체로 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, PBST로 3회 세척단계를 거쳐 염소 항-마우스 IgA HRP가 연결(conjugate)된 2차 항체를 1:500으로 희석하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후, PBST로 3회 세척하였다. 면역(priming)되지 않은 마우스의 장 시료를 음성 대조군으로 사용하였다. 결합된 2차 항체의 검출은 기질용액(100mM citric acid buffer, pH4.0, ABTS stock solution, H₂O₂)을 이용하여 발색을 실시하였다. 이후 암실에서 기질 용액과의 반응을 5분 동안 실시한 후, 흡광도 405nm에서 ELISA 리더기를 이용하여 O.D 값을 측정하였다. 소장에서 채취한 시료 중의 IgA를 측정한 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 각 실험군 그룹에서 형질전환 식물체가 20% 함유된 사료를 투여한 투여군에서 통계적으로 유의성 있게(P<0.05) 항체가가 상승하는 것을 확인하였다. 또한, 1차 면역(priming)시킨 후 추가로 부스팅(boosting)을 시킨 후 형질전환 식물체가 배합된 사료를 급이한 C 그룹에서 가장 많은 항체가 생성된 것을 확인하였다(도 8).

<110> GenDocs, Inc. <120> Method for producing oral vaccine against fish viral nervous necrosis using transgenic plant and the plant thereof <130> PN12275 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1017 <212> DNA <213> Nodavirus <400> 1 atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga ccaccaaggc cgcgaatccg 60 caaccccgcc gacgtgctaa caatcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc acctgtgtct 120 aaggcctcga ctgtaactgg atttggacgt gggaccaatg acgtccatct ctcaggtatg 180 tcgagaatct cccaggccgt cctcccagcc gggacaggaa cagacggata cgttgttgtt 240 gacgcaacca tcgtccccga cctcctgcca cgactgggac acgctgctag aatcttccag 300 cgatacgctg ttgaaacact ggagtttgaa attcagccaa tgtgccccgc aaacacgggc 360 ggtggttacg ttgctggctt cctgcctgat ccaactgaca acgatcacac cttcgacgcg 420 cttcaagcaa ctcgtggtgc agtcgttgcc aaatggtggg aaagcagaac agtccgacct 480 cagtacaccc gcacgctcct ctggacctcg tcgggaaagg agcagcgtct cacgtcacct 540 ggtcggctga tactcctgtg tgtcggcaac aacactgatg tggtcaacgt gtcagtgctg 600 tgtcgctgga gtgttcgact gagcgttcca tctcttgaga cacctgaaga gaccaccgct 660 cccatcatga cacaaggttc cctgtacaac gattcccttt ccacaaatga cttcaagtcc 720 atcctcctag gatccacacc actggacatt gcccctgatg gagcagtctt ccagctggac 780 cgtccgctgt ccattgacta cagccttgga actggagatg ttgaccgtgc tgtttattgg 840 cacctcaaga agtttgctgg aaatgctggc acacctgcag gctggtttcg ctggggcatc 900 tgggacaact tcaacaagac gttcgcagat ggcgttgcct actactctga tgagcagcct 960 cgtcaaatcc tgctgcctgt tggcactgtc tgcactaggg ttgactcgga aaactaa 1017 <210> 2 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nodavirus coat protein chloroplast codon-optimized sequence <400> 2 atggtacgaa aaggtgagaa gaaattggca aaacctgcaa caacaaaggc tgcaaatcct 60 caaccacgac gacgtgctaa caatcgtaga cgttctaatc gaactgacgc acctgtatct 120 aaggcttcta ctgtaactgg atttggacgt ggaacaaatg acgttcatct ttcaggtatg 180 tctagaatct ctcaggccgt ccttccagct ggaacaggaa cagacggata cgttgttgtt 240 gacgcaacaa tcgttcccga ccttttgcca cgattgggac acgctgctag aatcttccag 300 cgatacgctg ttgaaacatt ggagtttgaa attcagccaa tgtgccctgc aaacactgga 360 ggtggttacg ttgctggatt cttgcctgat ccaactgaca acgatcacac tttcgacgca 420 cttcaagcaa ctcgtggtgc agttgttgct aaatggtggg aaagtagaac agttcgacct 480 cagtacacac gaacgcttct ttggacatct tctggaaagg agcagcgtct tacttctcct 540 ggtcgattga tacttttgtg tgttggaaac aacactgatg tagttaacgt atcagtattg 600 tgtcgatgga gtgttcgatt gagtgttcca tctcttgaga cacctgaaga gacaacagct 660 cctatcatga cacaaggttc tttgtacaac gattctcttt ctacaaatga cttcaagtct 720 atccttttag gatctacacc attggacatt gctcctgatg gagcagtttt ccagttggac 780 cgtccgttgt ctattgacta cagtcttgga actggagatg ttgaccgtgc tgtttattgg 840 caccttaaga agtttgctgg aaatgctgga acacctgcag gatggtttcg atggggaatc 900 tgggacaact tcaacaagac tttcgcagat ggtgttgctt actactctga tgagcagcct 960 cgtcaaatct tgttgcctgt tggaactgtt tgcactagag ttgactctga aaactaa 1017 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trnIF primer <400> 3 atctctcgag cacaggttta 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trnAR primer <400> 4 ttcttgacag cccatcttt 19

Claims (13)

1. 노다 바이러스(nodavirus) 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 삽입된 것을 특징으로 하는 식물 색소체 형질전환용 재조합 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
3. 제1항의 벡터로 식물체를 형질전환하여 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 색소체 형질전환 식물체의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물체인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물체는 니코틴 프리(nicotine-free) 담배 식물체인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제3항의 방법에 의해 제조된 색소체 형질전환 식물체.
7. 제6항의 색소체 형질전환 식물체의 종자.
8. 노다 바이러스 유래의 외피 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 식물체 또는 이의 추출물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 백신 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 어류는 능성어류인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
11. 제8항의 백신 조성물을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증의 예방용 사료 첨가제.
12. 제11항에 있어서, 상기 어류는 능성어류인 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.
13. 제8항의 백신 조성물 또는 제11항의 사료 첨가제를 어류에 경구투여하는 것을 포함하는 어류 바이러스성 신경 괴사증을 예방하는 방법.

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