KR20140049960A

KR20140049960A - 반복 서열을 분석하기 위한 ｍＰＣＲ 방법

Info

Publication number: KR20140049960A
Application number: KR1020137013631A
Authority: KR
Inventors: 개리 제이. 라탐; 리앙징 첸; 앤드류 해드; 사친 사; 루 카오
Original assignee: 아수라겐, 인크.
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2014-04-28
Also published as: JP2013540452A; CN103282517A; EP2633073B1; EP2633073A1; WO2012058633A1; AU2011320359B2; KR101911966B1; ZA201303478B; US20120107824A1; JP6081366B2; CN106868107A; BR112013010585B1; BR112013010585A2; US9777330B2; AU2011320359A1; IL225833A0; CN103282517B

Abstract

본 발명은 GC가 풍부한 주형의 메틸화 상태를 측정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 메틸화 상태 및 CGG 반복 길이의 동시 특징규명을 가능하게 하는 GC 참조 표준의 사용을 포함한다. 본 방법은 취약 X 증후군을 포함하여, GC가 풍부한 반복과 연관된 유전자형을 검출하는데 유용하다.

Description

반복 서열을 분석하기 위한 ｍＰＣＲ 방법{mPCR METHODS FOR ANALYZING REPEAT SEQUENCES}

본 출원은 2010년 10월 29일에 출원된 미국 가출원 제61/408,367호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용된다.

본 출원에 기재된 과업은 유니스 케네디 쉬리버 국립 아동보건 및 인간발달 연구소(Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development)로부터 승인 번호 R43HD060450 및 R44HD060450 하에 연방 정부에 의해 부분적으로 투자되었다. 따라서, 연방 정부는 본 발명에 대해 특정의 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 특히 GC가 풍부한(GC-rich) 주형 및 생성물의 메틸화 상태를 측정하는 방법에 관한 핵산 분석 분야에 속한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 GC 참조 표준(reference standard)에 관한 것이다.

특정 실시양태들에서, 본원에 기재된 방법은 GC가 풍부한 유전자좌(locus)의 메틸화 상태를 측정하는데 사용된다. 일부 경우, GC가 풍부한 영역의 확장(expansion)은 다양한 질환 상태와 연관된다. CGG 반복의 확장과 연관된 유전자좌의 예는 X 염색체상의 취약 X 정신 지체-1 유전자(FMR1)의 5' 비번역 영역(UTR)이다. 이 영역에서 200 초과 CGG 반복으로의 확장은 FMR1 유전자의 과메틸화와 연관되며 "완전 돌연변이(full mutation)" 대립유전자로서 지칭된다. 이러한 대립유전자는 FMR1 단백질 생성의 상실, 및 취약 X 증후군(FXS) 장애와 관련된다. FXS는 정신 지체, 자폐증, 조기 난소 부전, 및 기타 인지적 및 행동적 병태들을 포함할 수 있다(J. Mol Diag. 10(6): 496-501 (2008)).

GC가 풍부한 주형(template)의 메틸화 상태 및 FMR1의 메틸화 상태를 측정하는 방법은 서던 블롯(SB) 분석 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 포함한다. SB 분석은 삼중항(triplet) 반복 영역의 크기의 대략적인 측정 및 메틸화의 평가를 제공한다. 메틸화된 부위를 개열시키지 않는 메틸화 민감(methylation-sensitive) 효소가 메틸화된 대립유전자와 비메틸화된 대립유전자 간을 구분하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, SB 분석에 의한 메틸화 상태의 측정은 겔 전기영동에 의해 충분히 분해(resolve)되는 대립유전자에 한정된다. SB 분석은 또한 게놈 DNA (gDNA) 물질의 요구되는 양과, 고처리량 과정과 양립할 수 없는 지루한 처리과정(workflow)에 의해 제약된다(Genet. Med. 7(8): 584-587 (2005)).

PCR 기법은 삼중항 반복 영역의 크기를 결정하는데 있어 보다 큰 정확도를 제공할 수 있다. 그러나, FMR1 5' UTR의 완전 돌연변이 대립유전자를 포함하는 GC가 풍부한 긴 서열의 증폭에 있어 제약이 반복 영역의 정량화를 제한해왔다. 예를 들어, FMR1의 PCR에 대한 최적화가 시도되고 있고, 이는 통상적인 PCR 분석 조건에 대한 변형을 포함한다(문헌[참조: Genome Res. 6(7): 633-8, (1996); J. Mol. Diagn. 8: 544-550, (2006); 및 Am J Med Genet. 51(4): 527-34, (1994)]). 보다 최근에는, 200을 넘는 CGG 반복의 신뢰성있는 증폭을 가능하게 하는 PCR 기법이 개발되고 있다. 미국 특허 출원 공보 제2010/0209970호가 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용될 수 있다. 그러나, PCR 단독으로는 GC가 풍부한 주형의 메틸화 상태를 특징규명할 수 없다.

다수의 기법들이 PCR과 메틸화 평가를 위한 다른 방법들을 조합한다. 이러한 방법들 중 대부분이 메틸화 상태를 확인하기 위해 비설파이트(bisulfite) 전환에 대한 5-메틸사이토신의 저항성을 이용하고 있다. 그러나, FMR1의 경우, 예를 들어, 비설파이트계 메틸화 PCR 방법은 여성 샘플에 대한 해석에 혼돈을 일으키는 혼합 메틸화 상태로 인해 남성 샘플의 평가에만 실제로 한정되고 있고/있거나, 상기 방법은 확장된 대립유전자(expanded alleles)에 대해 제한된 효용을 나타내고 있다(문헌[참조: Hum. Mutation 14: 71-79, (1999); Clin. Chem. 52: 1492-1500, (2006); J. Med. Genet. 41: 1-8, (2004); 및 Hum. Genet. 108: 450-458, (2001)]). 메틸화 민감 제한 효소의 사용과 같은 비설파이트 처리에 대한 대안이 보고되고 있지만, 여성 샘플에 대한 분석에는 여전히 문제가 있다(J. Mol Diag. 10(6): 496-501, (2008)).

지금까지, SB 이외의 어떠한 접근법도 남성 샘플과 여성 샘플 둘다에서 확장된 대립유전자에 대한 정확한 메틸화 평가를 입증하고 있지 못하고 있다. 따라서, GC가 풍부한 유전자좌의 메틸화 및 반복 상태를 특징규명하는데 사용될 수 있는 단순한 처리과정을 갖는 빠르고 정확한 분석에 대한 필요성이 존재한다.

본원에 기재된 방법은 남성 샘플과 여성 샘플 둘다에서 GC가 풍부한 반복 길이의 스펙트럼에 대해 메틸화 상태를 검출하고 분해할 수 있는 PCR계 기술에 관한 것이다. 전체적인 처리과정은 일반적인 시험 및 고처리량 스크리닝 적용을 따를 수 있고, SB 분석에 대한 요구없이 포괄적인 FMR1 분석에 대한 토대를 제공한다.

일 실시양태에서, 본 방법은

a) 샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소(DNase)와 접촉시키는 단계;

b) 75% 이상의 GC 풍부도(GC-richness)를 갖는 GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계;

c) 각각 GC 참조 표준을 함유하는 샘플의 제1 부분과 제2 부분에 대해 DNA 증폭 반응을 실시하는 단계로서, 각 부분에서 증폭된 DNA가 상이한 표지(label)로 표시되는 것인 단계; 및

d) 샘플의 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 DNA를 분석하여 FMR 유전자좌의 메틸화 상태를 특징규명하는 단계

를 포함하는, DNA 샘플에서 FMR 유전자좌의 특징규명에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 단계 (d)는 모세관 전기영동(CE)을 포함한다. 부가적인 실시양태에서는, 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 DNA를 단일 CE 실행(run)으로 분석한다. 일부 방법에서, GC 참조 표준은 메틸화 민감 DNA 분해효소에 대한 인식 부위가 없다. 특정 방법에서, GC 참조 표준은 천연 발생 FMR 대립유전자와 중첩되지 않는 CE 이동 시간(migration time)을 가진다. 예를 들어, GC 참조 표준은 약 20 미만, 약 24 내지 27, 또는 약 32 초과 CGG 반복의 상대 체류 시간(relative retention time)을 가질 수 있다. 부가적인 예에서, GC 참조 표준은 약 175 내지 약 225 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 일부 실시양태에서, GC 참조 표준은 제1 부분을 DNA 분해효소와 접촉시킨 후 샘플에 첨가된다.

다른 실시양태에서, 증폭 반응은 200회 이상의 CGG 반복을 증폭시킬 수 있다. 특정 증폭 반응은 GC/AT 비가 1을 초과하는, 예를 들면 약 2.5 내지 약 10인 dNTP 혼합물을 포함한다. 특정 방법에서, FMR 유전자좌는 FMR1이다. 몇몇 방법에서 메틸화 민감 DNA 분해효소는 Hpa II, Eag I, 또는 Nru I로부터 선택된다.

추가 실시양태에서, 샘플의 제2 부분은 대조군 효소(control enzyme)와 접촉한다. 몇몇 경우에, 대조군 효소는 EcoRI 및 Sau3A1로부터 선택된다. 다른 경우에, 대조군 효소는 EcoRI, DpnI, NaeI, 및 HindIII-HF로부터 선택된다.

본원에 기재된 특정 실시양태는

a) 샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소와 접촉시키는 단계;

b) 75% 이상의 GC 풍부도를 갖는 GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계;

c) 샘플의 제1 부분과 제2 부분에 대해 DNA 증폭 반응을 실시하는 단계로서, 각 부분에서 증폭된 DNA가 상이한 표지로 표시되는 것인 단계; 및

d) 샘플의 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 DNA를 분석하여 취약 X 증후군(FXS), 취약 X 관련 진전 운동실조 증후군(tremor ataxia syndrome), 및/또는 취약 X 관련 원발성 난소 부전(primary ovarian insufficiency)과 연관된 유전자형을 검출하는 단계

를 포함하는 인간 DNA 샘플을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본원에 기재된 특정 실시양태는 식: 5'-A-B-C-3'의 핵산 서열을 포함하는 GC 참조 표준에 관한 것으로, 여기서 A는 서열번호: 40의 10개 이상의 연속(consecutive) 뉴클레오티드를 포함하는 서열이고 게놈 FMR1 5' 비번역 영역에 특이적으로 혼성화될 수 있으며; C는 서열번호: 41의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열이고 게놈 FMR1 5' 비번역 영역에 특이적으로 혼성화될 수 있으며; B는 75% 이상의 GC 풍부도를 가진 서열이고, 길이가 X-300 내지 X+10 뉴클레오티드이다. X는 a) A의 3' 말단과 서열번호: 40의 마지막 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 개수; 및 b) 서열번호: 41의 첫번째 뉴클레오티드로부터 C의 5' 말단까지의 뉴클레오티드의 개수의 합이다.

특정 실시양태에서, B는 길이가 150 내지 200 뉴클레오티드이다. 부가적인 실시양태에서, B는 90% 이상의 GC 풍부도를 가진다. 추가 실시양태에서, B는 94% 이상의 GC 풍부도를 가진다. 일 실시양태에서, A는 GCGCTCAGCTCCGTTTCGGT (서열번호: 17)를 포함한다. 부가적인 실시양태에서, C는 AGTGCGGGGCTCCAATGGCG (서열번호: 39)를 포함한다.

상기의 일반적인 기재와 하기의 상세한 설명 둘다 단지 예시적이고 설명적이며 청구된 본 발명을 제약하는 것이 아님을 이해해야 할 것이다.

도 1은 GC가 풍부한 대립유전자의 메틸화 상태를 측정하기 위한 절차적 처리과정의 일례를 제공하며, 여기서 HpaII가 메틸화 민감 DNA 분해효소로서 사용된다.
도 2는 천연 발생 FMR1 GC가 풍부한 유전자좌와 중첩되지 않는 상대 체류 시간에서 이동하도록 설계된 GC 참조 표준의 일례를 도시한다.
도 3의 A는 공지 분율의 FMR1 메틸화를 갖는 메틸화된 DNA 표준에 대한 전기영동도를 도시한다. 각 흔적(trace)은 세포주 DNA로부터 완전 돌연변이 대립유전자(~645 CGG)의 백그라운드에서 DNA 표준의 프로파일을 포함한다.
도 3의 B는 공지의 입력(input) 메틸화 DNA 표준에 대한 검출된 메틸화 퍼센트의 선형 피트(fit)를 작도한 것이다. 백그라운드, 완전히 메틸화된 645 CGG 대립유전자의 정량화가 겹쳐처리되어 있다 (평균=104±5%).
도 4a-d는 mPCR이 실시된 4가지 세포주 샘플의 모세관 전기영동도를 SB 데이터와 매칭하여 도시하고 있다.
도 5a-d는 완전 돌연변이 대립유전자를 갖는 4가지 대표적인 임상 샘플의 모세관 전기영동도를 SB 데이터와 매칭하여 도시하고 있다.
도 6a-d는 4가지 대표적인 임상 여성 불완전 돌연변이 샘플의 모세관 전기영동도를 SB 데이터와 매칭하여 도시하고 있다.
도 7은 HEX 및 FAM 채널 둘다에서 정상적인 31 CGG 대립유전자의 백그라운드에서 임상의 완전 돌연변이 대립유전자의 1% 질량 분율의 적정을 도시한다.
도 8은 완전히 비메틸화된 완전 돌연변이 샘플 (#125)의 90% 질량 분율의 백그라운드에서 완전히 메틸화된 완전 돌연변이 샘플 (#08)의 10% 질량 분율의 적정을 도시한다.
도 9는 EagI 또는 HpaII를 사용하여 분석한 임상 샘플의 비교를 도시한다.
도 10은 GC가 풍부한 대립유전자의 메틸화 상태를 측정하기 위한 대안적인 절차적 처리과정을 도시하고 있으며, 샘플이 두 부분으로 나눠지고 절단 반응이 수행되기 이전에 절단 대조군(digestion control)과 CGG DNA 대조군(CGG 참조 표준)이 샘플에 첨가되며, 두 부분 중 하나에서 HpaII가 메틸화 민감 DNA 분해효소로서 사용된다.
도 11a-d는 도 10의 대안적인 처리과정에 따라 mPCR 분석이 실시된 4가지 세포주 DNA 샘플의 대표적인 모세관 전기영동도를 평행의(parallel) 서던 블롯 분석으로부터의 비교 데이터와 함께 도시하고 있다. 피크 아래의 박스에는 원시(raw) 체류 시간(제1 행), 피크 실체(peak identity)(제2 행), 및 피크 강도(제3 행)가 제공된다. 피크 강도는 임의적인(arbitrary) 형광 단위의 최고 형광(피크 높이)으로서 표시된다. 피크 실체 약어는 하기와 같다: DIG.C = 절단 대조군; REF = GC 참조 표준; FM = 완전 돌연변이 대립유전자; PM = 불완전 돌연변이 대립유전자; NOR = 정상 대립유전자.
도 12a-g는 도 10의 대안적인 처리과정에 따라 mPCR이 실시된 7가지 임상 시료에 대한 대표적인 모세관 전기영동도를 평행의 서던 블롯 분석으로부터의 비교 데이터와 함께 도시하고 있다. 피크 아래의 박스는 도 11a-d에서와 같은 정보를 제공한다.

특정 측면에서, 본 발명은 GC가 풍부한 핵산 주형의 메틸화 상태를 특징규명하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 본 방법은 GC 참조 표준의 존재하에서 PCR과 조합한 메틸화 민감 DNA 분해효소를 이용한 처리를 수반한다. 본원에 기재된 방법은 "mPCR" 방법으로 지칭될 수 있다.

본 발명의 이해를 돕기 위해, 특정 용어들이 우선적으로 정의된다. 부가적인 정의는 출원서 전반에 걸쳐 제공된다.

단수 단어 "a", "an" 또는 "the"는, 청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용시, "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 모순되지 않는다.

"GC/AT 비"는 정해진 용액 또는 혼합물에서, dCTP, dGTP, 및 이들의 모든 뉴클레오티드 유사체의 합의 농도 : dATP, dTTP, dUTP, 및 이들의 모든 뉴클레오티드 유사체의 합의 농도의 비를 의미한다.

"dNTP"는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 나타내고 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, 및 이들의 유사체를 지칭한다.

"뉴클레오티드 유사체"는 천연 염기인 아데닌 (A), 사이토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 또는 우라실 (U) 이외의 염기 모이어티, 데옥시리보스와 동일하거나 유사한 당 모이어티, 및 하나 이상의 포스페이트 또는 복수의 포스페이트(예를 들면, 디포스페이트 또는 트리포스페이트) 모이어티를 포함하는 분자 또는 이온이다. 뉴클레오티드 유사체는 특정뉴클레오티드, 특히 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 또는 dUTP의 유사체이고, 트리포스페이트와 당 모이어티를 포함하는 경우, 둘의 구조 및 배치는 중합효소에 의한 핵산 이중 나선 중으로의 도입에 적합하고, 핵산 이중 나선에서 염기쌍 성질과 핵산 이중 나선에서 DNA 중합효소에 의한 도입 유전자좌가 앞서 수록한 5종의 뉴클레오티드 중 하나와 거의 유사하며, 예외적으로 dTTP의 유사체는 일반적으로 또한 dUTP의 유사체일 것이고 역 또한 그러할 것이다.

"GC 풍부도"는 구아닌 잔기, 사이토신 잔기, 또는 이의 유사체인 핵산에서의 총 핵염기(nucleobase) 잔기의 분율(fraction) 또는 백분율이다. 예를 들어, 정확히 30개 사이토신, 정확히 30개 구아닌, 정확히 하나의 사이토신 유사체, 및 정확히 하나의 구아닌 유사체를 함유하는 100 뉴클레오티드(nt) 핵산은 62%의 GC 풍부도를 가진다. 몇몇 실시양태에서, GC가 풍부한 주형은 적어도 51, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.5% 구아닌 잔기, 사이토신 잔기, 또는 이의 유사체를 함유할 수 있다.

I. 메틸화 상태의 특징규명 방법

특정 실시양태에서, 본 발명은 GC가 풍부한 핵산 주형의 메틸화 상태를 특징규명하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 본 방법은 샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소와 접촉시키는 단계, GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계, 샘플의 제1 부분과 제2 부분에 대해 핵산 증폭 반응을 실시하는 단계, 및 샘플의 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 핵산을 분석하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제1 부분과 제2 부분은 상이하게 표지된다.

추가 실시양태에서, 제2 부분은 증폭 이전에 대조군 효소와 접촉하고, 여기서 대조군 효소는 증폭된 서열을 개열시키지 못한다. 대조군 효소는 예를 들어, EcoRI, DpnI, NaeI, 및 HindIII-HF로부터 선택될 수 있다. 부가적으로 가능한 대조군 효소는 Sau3A, NheI, TfiI, ApaLI, MluCI, NcoI, ScaI, StuI, XmnI 및 Hpy16611을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대조군 효소는 DNA 증폭 반응에 의해 증폭되는 영역 내에서는 존재하지 않는 인식 부위를 가진 제한 엔도뉴클레아제로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 대조군 효소는 DNA 증폭 반응에 의해 증폭되는 영역 내의 비표적 부위에서 비특이적 개열(cleavage)(비특이적 활성도(star activity))을 거의 나타내지 않는, 예컨대 DNA 증폭 반응에 의해 증폭되는 영역 내의 비표적 부위의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 또는 1% 미만의 개열을 나타내는 효소들로부터 선택된다. 개열의 정도는 DNA 증폭 반응에 의해 증폭되는 영역 내에서 하나 이상의 개열 사건(event)을 겪는 분자들의 분율의 관점으로 표시된다.

부가적인 실시양태에서, 제1 및 제2 부분의 분석은 단일 분석으로 실시된다.

도 1 및 10은 본 발명의 방법에 따른 예시적인 분석을 보여주는 모식도이다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 FXS, 취약 X 관련 진전 운동실조 증후군, 및 취약 X 관련 원발성 난소 부전과 연관된 유전자형을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이들 병태와 연관된 유전자좌는 당업계에 공지되어 있고, FMR1, FMR2, FMR1의 5' UTR, FMR2의 5' UTR, FMR1의 5' UTR 내의 CGG 반복, 및 FMR2의 5' UTR 내의 CGG 반복을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 "FMR 유전자좌"라는 용어는 FMR1 유전자좌 또는 FMR2 유전자좌를 지칭한다. 부가적인 실시양태에서, 본 방법은 GC가 풍부한 트리뉴클레오티드 반복 장애, 예컨대 FXS, 취약 X 관련 진전 운동실조 증후군, 및 취약 X 관련 원발성 난소 부전, 근긴장성 이양증(myotonic dystrophy), 헌팅톤 병, 척수구근 근위축증, 구시상하핵 위축증(Dentatorubropallidoluysian atrophy), 및/또는 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia)과 연관된 유전자형을 검출하는데 사용될 수 있다. 이들 병태와 연관되는 유전자좌는 당업계에 공지되어 있고, FMR1, FMR2, DMPK , ZNF9 , HTT, AR , ATN1 , ATXN1 -3, ATXN7 , ATXN10 , CACNA1A , SCA8 , PPP2R2B , 및 TBP를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Nat Genet. 1996 May;13(1):105-8; Nat Genet. 1996 May;13(1):109-13]을 참조하기 바란다. 이들 유전자좌에서 GC가 풍부한 영역의 과대확장(Hyperexpansion) 및/또는 과메틸화는 이러한 질환과 연관된다.

A. GC 참조 표준

몇몇 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 GC 참조 표준에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법의 GC 참조 표준은 외부(external) 참조 표준이며, FMR 유전자좌와 함께 증폭되도록 설계된다. 몇몇 실시양태에서, GC 참조 표준은 유전자좌, 예컨대 FMR1 유전자 부근에 존재하는 GC가 풍부한 유전자좌에 존재하는 CGG 반복의 횟수를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, GC 참조 표준은 CE에 의한 원하는 상대 체류 시간을 가지도록 설계된다.

본원에서 사용된 "상대 체류 시간"이라는 용어는 GC 참조 표준으로부터 증폭된 생성물이 CE에서 모세관을 통해 이동하는 데 소요되는 시간을 정해진 길이 및/또는 GC 풍부도의 증폭된 다른 생성물의 이동 시간과 비교한 시간을 지칭한다. 특정 실시양태에서, GC 참조 표준의 상대 체류 시간은 공지 횟수의 CGG 반복을 함유하는 서열과 비교된다. 몇몇 경우에, GC 참조 표준은 인간 대상체로부터의 FMR1 유전자좌에서 CGG 반복 횟수를 측정하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, GC 참조 표준의 상대 체류 시간은 증폭을 위해 동일한 프라이머를 사용하여 일 유전자좌와 비교된다. 몇몇 실시양태에서, GC 참조 표준은 천연 발생 FMR1 대립유전자와 중첩되지 않도록 CE 분석에서 상대 체류 시간을 가진다. 예를 들어, FMR1 유전자좌에서 메틸화 상태 및 CGG 반복 횟수를 측정하기 위한 분석에서, CGG 반복을 함유하는 천연 발생 게놈 대립유전자와 비교했을 때 0 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진 GC 참조 표준이 포함될 수 있다. 또 다른 실시양태는 약 40 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진 GC 참조 표준을 포함한다. 부가적인 실시양태에서, GC 참조 표준은 게놈 샘플과 비교하여 약 20 미만, 약 24 내지 약 27, 또는 약 32 초과 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다.

예시적인 GC 참조 표준은 하기 식을 가진 서열을 함유한다:

5'-A-B-C-3'

상기 식에서, A 및 C는 정방향 및 역방향 PCR 프라이머에 의해 인식되는 서열을 나타내고, B는 GC가 풍부한 서열이다. 일반적으로, GC 참조 표준은 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 GC 풍부도를 가진다. 서열 A는 GC가 풍부한 영역 또는 CGG 반복 영역의 상류의 게놈 서열로부터 선택될 수 있고, 서열 C는 이러한 영역의 하류의 게놈 서열로부터 선택될 수 있다. 증폭 반응 동안, 이들 서열 또는 이들의 상보서열(complements)이 프라이머 인식 부위로서 사용되어 참조 표준이 표적 서열과 동일한 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있도록 한다.

특정 실시양태에서, 서열 A 및 C는 각각 GC가 풍부한 영역의 FMR1 5' UTR 상류 및 하류로부터 선택된다. A 및 C의 서열, 또는 이들의 상보서열은 증폭 반응을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 서열 A의 예는 하기를 포함한다: CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (서열번호: 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T (서열번호: 2), CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G (서열번호: 3), TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC (서열번호: 4), GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG (서열번호: 5), GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG (서열번호: 6), GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA (서열번호: 7), CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G (서열번호: 8), GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A (서열번호: 9), GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G (서열번호: 10), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA (서열번호: 11), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG (서열번호: 12), GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC (서열번호: 13), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (서열번호: 14), CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA (서열번호: 15), TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (서열번호: 16), 및 GCG CTC AGC TCC GTT TCG GT (서열번호: 17).

서열 C의 예는 하기를 포함한다: CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC (서열번호: 18), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC (서열번호: 19), ATG GAG GAG CTG GTG GTG GAA GTG CG (서열번호: 20), CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC CG (서열번호: 21), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC GG (서열번호: 22), CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC CGG (서열번호: 23), CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC CGG CG (서열번호: 24), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC GGC GC (서열번호: 25), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC GGC G (서열번호: 26), TGG TGG AAG TGC GGG GCT CCA ATG GCG C (서열번호: 27), TGG AAG TGC GGG GCT CCA ATG GCG C (서열번호: 28), GGA AGT GCG GGG CTC CAA TGG CGC T (서열번호: 29), GTG GAA GTG CGG GGC TCC AAT GGC G (서열번호: 30), TGG TGG TGG AAG TGC GGG GCT CCA A (서열번호: 31), GAG GAG CTG GTG GTG GAA GTG CGG GGC T (서열번호: 32), AGG AGC TGG TGG TGG AAG TGC GGG GCT C (서열번호: 33), CTG GTG GTG GAA GTG CGG GGC TCC AAT G (서열번호: 34), AGA TGG AGG AGC TGG TGG TGG AAG TGC GGG (서열번호: 35), GGA AGT GCG GGG CTC CAA TGG CGC TTT CTA (서열번호: 36), GGA AGT GCG GGG CTC CAA TGG CGC TT (서열번호: 37), TGG AGG AGC TGG TGG TGG AAG TGC G (서열번호: 38), 및 AGT GCG GGG CTC CAA TGG CG (서열번호: 39).

서열번호 40 및 41은 CGG 반복 영역의 상류 및 하류의 FMR1 서열을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 서열 A는 서열번호: 40으로부터 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 서열 C는 서열번호: 41로부터 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.

서열 B는 GC가 풍부한 서열이며, 참조 표준이 CE 분석에서 특정한 상대 체류 시간을 가지도록 하는 길이를 가질 수 있다. 체류 시간은 정해진 길이 및 GC 특성(character)을 가진 공지의 표준과 관련하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 서열 B의 길이는 참조 표준이 게놈 샘플과 비교하여 약 20 미만, 약 24 내지 약 27, 또는 약 32 초과 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가지도록 선택될 수 있다. 서열 B의 길이는 참조 표준이 약 0 이하 CGG의 상대 체류 시간을 가지도록 선택될 수 있다. 특정 예에서, 참조 표준은 약 -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10 또는 0 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 몇몇 실시양태에서, GC 참조 표준은 3, 2, 1, 0, -1, -2, -3, -4, -5, -10, -15, 또는 -20 이하 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 참조 표준의 상대 체류 시간은 프라이머 피크 또는 천연 발생 FMR1 대립유전자와 중첩되지 않도록 선택될 수 있다. GC 참조 표준의 상대 체류 시간은 또한 절단 대조군(후술됨)(사용되는 경우)과 중첩되지 않도록 선택될 수 있다.

GC 참조 표준은, 예를 들어, 참조 표준이 GC가 풍부한 영역을 둘러싸는 플랭킹(flanking) 서열을 게놈 샘플로부터 증폭된 생성물보다 더 적게 가지는 경우에 음의(-) 상대 체류 시간을 가질 수 있다. 따라서, GC 참조 표준은 실제로 양의(+) 수의 CGG 반복을 함유할 수 있지만, 플랭킹 서열 함량 차이로 인해 음의(-) 수의CGG 반복을 가진 가상의(hypothetical) 게놈 샘플과 동일한 체류 시간을 가진다.

몇몇 실시양태에서, B의 길이는 길이가 X-300 내지 X+10 뉴클레오티드이고, 여기서 X는 하기 a) 및 b)의 합이다:

a) 서열 A의 3' 말단과 GC가 풍부한 영역의 시작 사이의 뉴클레오티드 개수; 및

b) GC가 풍부한 영역의 말단과 서열 C의 5' 말단 사이의 뉴클레오티드의 개수.

몇몇 실시양태에서, B는 서열 CGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGtGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGG (서열번호: 48)를 포함하거나 이러한 서열로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, B는 서열번호: 48의 적어도 50, 75, 100, 또는 125개 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, B는 서열 CGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGG (서열번호: 49)를 포함하거나 이러한 서열로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, B는 서열번호: 49의 적어도 50, 75, 100, 또는 125개 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, B는 엄격한 조건하에 서열번호:48 또는 서열번호: 49와 혼성화하는 서열을 포함하거나 그러한 서열로 구성된다.

엄격한 혼성화 조건의 일례는 50% 포름아마이드, 5X SSC (여기서 1X SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트이다), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 5X 덴하르트(Denhardt) 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ㎍/ml 변성된, 전단된 연어의 정액 DNA를 포함하는 용액에서 42℃에서 혼성화에 이어 65℃에서 0.1X SSC를 포함하는 용액에서의 세척이다.

도 2는 FMR1 GC가 풍부한 유전자좌로부터의 천연 발생 서열과 중첩되지 않는 상대 체류 시간을 가진 GC 참조 표준의 일례를 보여준다.

특정 실시양태에서, GC 참조 표준은 플라스미드 또는 다른 벡터 내에 포함된다. 플라스미드 또는 다른 벡터는 예를 들어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 선형화되거나, 또는 온전한 상태로 존재할 수 있다. 일 실시양태에서, 플라스미드는 pBR322이다. GC 참조 표준이 보다 큰 DNA 분자, 예컨대 플라스미드의 일부로서 샘플 또는 샘플의 일부에 첨가되는 경우, 증폭 반응이 보다 큰 DNA 분자의 모든 부분을 반드시 증폭시키지는 않으며 (예를 들어, 증폭될 수 없는 서열은 플라스미드 복제 기원, 항생제 내성 마커, 개입(intervening) 비코딩 서열, 등을 포함할 수 있음), 본 발명의 목적상, GC 참조 표준을 포함하는 분자에서 이러한 증폭되지 않은 서열은 GC 참조 표준의 상대 체류 시간 또는 GC 풍부도를 측정하는데 있어 고려되지 않는다.

GC 참조 표준은 메틸화 민감 DNA 분해효소를 이용한 처리 이전 또는 이후에 핵산 샘플에 첨가될 수 있다. 메틸화 민감 DNA 분해효소를 이용한 처리 이전에 GC 참조 표준의 첨가는 GC 참조 표준을 샘플의 두 부분 중으로 피펫팅함으로 인해 야기될 수 있는 오차(error)를 감소시킬 수 있고, 샘플의 두 부분 중 하나는 메틸화 민감 DNA 분해효소로 처리되었고 하나는 처리되지 않았다. 즉, GC 참조 표준이 메틸화 민감 DNA 분해효소를 이용한 처리 이전에 샘플에 첨가되는 경우에는, 샘플을 두 부분으로 나누기 이전에 샘플에 첨가될 수 있다. GC 참조 표준이 메틸화 민감 DNA 분해효소 또는 대조군 효소 이전에 샘플에 첨가되는 실시양태에서, GC 참조 표준은 DNA 분해효소에 의해 개열되지 않는데, 예를 들면, DNA 분해효소에 대한 인식 부위가 없고/없거나 메틸화 민감 DNA 분해효소에 의한 개열에 견디도록 메틸화될 수 있다. 메틸화 민감 DNA 분해효소를 이용하여 샘플의 일부를 처리한 후에 GC 참조 표준이 샘플에 첨가되는 경우에, GC 참조 표준은 샘플의 제1 및 제2 부분에 첨가된다. 샘플에 첨가되는 GC 참조 표준의 양은 증폭 반응의 종류 및 증폭 정도 (예를 들어, 사이클 횟수 또는 등온 인큐베이션의 기간)에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 증폭 반응으로서 PCR을 이용하는 몇몇 실시양태에서는, 각 PCR 반응을 위해 약 750 내지 약 12,000 카피(copies)의 GC 참조 표준이 첨가될 수 있다.

B. 절단 대조군

본원에 기재된 방법은 절단 대조군의 사용을 포함할 수 있다. 절단 대조군은 샘플 DNA의 일 영역, 예컨대 FMR 유전자좌와 함께 증폭되도록 설계된다. 절단 대조군은 비메틸화되고 메틸화 민감 DNA 분해효소에 대한 하나 이상의 인식 부위를 포함하며, 이에 따라 메틸화 민감 DNA 분해효소를 이용한 처리시 개열된다. 그 결과, 이러한 대조군 주형은 메틸화 민감 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단의 효과성(effectiveness)을 보고한다.

몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 CE 분석에서 특정의 상대 체류 시간을 가지도록 하는 구조 및 길이를 가진다. 증폭 반응이 PCR을 포함하는 실시양태에서, 게놈 표적 유전자좌 및 절단 대조군을 증폭시키기 위해 동일한 프라이머가 사용될 수 있다. 메틸화 민감 DNA 분해효소에 의한 절단으로 인한 절단 대조군의 분획은 절단 대조군의 증폭을 지지하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 게놈 샘플과 비교하여 약 20 미만, 약 24 내지 약 27, 또는 약 32 초과 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 특정 예에서, 절단 대조군은 약 -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10 또는 0 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 3, 2, 1, 0, -1, -2, -3, -4, -5, -10, -15, 또는 -20 이하 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 절단 대조군의 상대 체류 시간은 프라이머 피크 또는 천연 발생 FMR1 대립유전자와 중첩되지 않도록 선택될 수 있다. 절단 대조군의 상대 체류 시간은 또한 GC 참조 표준과 중첩되지 않도록 선택될 수 있다.

특정 실시양태에서, 절단 대조군은 플라스미드 또는 다른 벡터 내에 포함된다. 플라스미드 또는 다른 벡터는 예를 들어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 선형화되거나 또는 온전한 상태로 존재한다. 일 실시양태에서, 플라스미드는 pBR322이다. 절단 대조군이 보다 큰 DNA 분자, 예컨대 플라스미드의 일부로서 샘플 또는 샘플의 일부에 첨가되는 경우, 증폭 반응이 보다 큰 DNA 분자의 모든 부분을 반드시 증폭시키지는 않으며 (예를 들어, 증폭될 수 없는 서열은 플라스미드 복제 기원, 항생제 내성 마커, 개입 비코딩 서열, 등을 포함할 수 있음), 본 발명의 목적상, 절단 대조군을 포함하는 분자에서 이러한 증폭되지 않은 서열은 절단 대조군의 상대 체류 시간 또는 GC 풍부도를 측정하는데 있어 고려되지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 서열 TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCCGGGGGCGTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC TGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCAGGAAGTGGAAGTGCGGGGCTCCAATGGCGCT (서열번호: 50)를 포함하거나 이러한 서열로 구성된다. 밑줄친 부분은 결과적인 앰플리콘(amplicon)의 크기를 변형하도록 조절될 수 있는 플랭킹 서열의 예들이다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 서열번호: 50의 적어도 100, 150, 175, 200, 또는 220개 뉴클레오티드를 포함하거나 이러한 뉴클레오티드로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 엄격한 조건하에 서열번호: 50과 혼성화하는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 절단 대조군이 앞서 언급한 상대 체류 시간을 가지도록 하기 위해 보다 많거나 적은 횟수의 CGG 반복을 가지도록 변형된 서열번호: 50의 일 버전(version)인 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다.

몇몇 실시양태에서, 절단 대조군 및 참조 표준의 상대 체류 시간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 CGG 반복의 당량(equivalent)만큼 차이가 있다. GC가 풍부한 증폭 반응에서는 주형 또는 프라이머 슬리핑(slipping)이 일어날 수 있는데, 그 결과 본래 표적으로부터 약 1-3 CGG 반복만큼 길이가 상이한 생성물이 얻어진다. 따라서, 특정 실시양태에서, 절단 대조군 및 참조 표준의 상대 체류 시간은 신호 중첩을 최소화하기 위해 4 또는 그 이상의 CGG 반복의 당량만큼 차이가 있다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군과 참조 표준 둘다 3, 2, 1, 0, -1, -2, -3, -4, -5, -10, 또는 -15 이하의 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 절단 대조군은 앞서 기재한 바와 같은 A, B, 및 C 서열을 포함하는 GC 참조 표준의 몇몇 실시양태에 대한 상기 섹션 I.A에 기술한 일반적인 일차 구조를 가진다. 절단 대조군 및 GC 참조 표준 둘다 상술한 바와 같은 A, B, 및 C 서열을 포함하는 경우, 절단 대조군이 참조 표준의 길이와 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 CGG 반복의 당량만큼 상이한 길이이도록 절단 대조군에서 A, B, 또는 C 세그먼트 중 적어도 하나는 GC 참조 표준에서의 이의 상대물(counterpart)과 길이가 상이할 수 있다. 절단 대조군은 메틸화 민감 뉴클레아제에 의한 절단에 대해 적절한 메틸화 상태(이 상태는 참조 표준의 메틸화 상태와 정반대일 수 있음)를 여전히 가질 것이다.

샘플에 첨가되는 절단 대조군의 양은 증폭 반응의 종류 및 증폭 정도(예를 들면, 사이클 횟수 또는 등온 인큐베이션 기간)에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 증폭 반응으로서 PCR을 이용하는 몇몇 실시양태에서, 각 PCR 반응의 경우 약 750 내지 약 12,000 카피의 절단 대조군이 첨가될 수 있다.

C. 메틸화 민감 뉴클레아제

본원에 기재된 방법은 메틸화 민감 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 뉴클레아제는 제한 효소와 같은 DNA 분해효소이다. 본원에서 제공된 방법의 메틸화 민감 뉴클레아제는 메틸화 상태에 기초하여 증폭되는 FMR 유전자좌의 일부를 차등적으로 개열시킨다. 대조군 뉴클레아제는 그러한 부분을 개열시키지 못한다.

메틸화 민감 DNA 분해효소는 AatII, Acc65I, AccI, AciI, AclI, AfeI, AgeI, AeI-HF^TM, AhdI, AleI, ApaI, ApaLI, AscI, AsiSI, AvaI, AvaII, BaeI, BanI, BbvCI, BceAI, BcgI, BfuAI, BfuCI, BglI, BmgBI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaI-HFT^M, BseYI, BsiEI, BsiWI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspDI, BspEI, BsrBI, BsrFI, BssHII, BssKI, BstAPI, BstBI, BstUI, BstZ17I, BtgZI, Cac8I, ClaI, DraIII, DrdI, EaeI, EagI, EagI-HF^TM, EarI, EciI, EcoRI, EcoRI-HF^TM, EcoRV, EcoRV-HF^TM, FauI, Fnu4HI, FokI, FseI, FspI, HaeII, HgaI, HhaI, HincII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, Hpy166II, Hpy188III, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4IV, KasI, MboI, MluI, MmeI, MspA1I, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NgoMIV, NheI, NheI-HF^TM, NlaIV, NotI, NotI-HF^TM, NruI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.CviPII, PaeR7I, PhoI, PleI, PmeI, PmlI, PshAI, PspOMI, PspXI, PvuI, RsaI, RsrII, SacII, SalI, SalI-HF^TM, Sau3AI, Sau96I, ScrFI, SfaNI, SfiI, SfoI, SgrAI, SmaI, SnaBI, StyD4I, TfiI, TliI, TseI, TspMI, XhoI, XmaI, 또는 ZraI을 포함한다(New England Biolabs; Nature Protocols 1: 1621-1636 (2006)).

특정 실시양태에서, 메틸화 민감 DNA 분해효소는 HpaI, NruI, EagI, BssHII, 및 HhaI로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 메틸화 민감 DNA 분해효소는 HpaII이다.

선택된 메틸화 민감 DNA 분해효소에 대한 인식 부위는 하기에 나타나 있다:

특정 실시양태에서, 샘플의 제1 부분은 메틸화 민감 뉴클레아제로 처리되지만, 제2 부분은 대조군 뉴클레아제로 처리된다. 대조군 뉴클레아제는 증폭된 유전자좌를 개열시키지 않는 제한 효소일 수 있다. 대조군 뉴클레아제는 비-메틸화 민감 뉴클레아제일 수 있다. 다수의 제한 효소 및 이들의 특이성이 업계에 익히 알려져 있다. 기재된 방법에서 사용될 수 있는 대조군 뉴클레아제의 예는 여러 예들 중에서 HindIII-HF, DpnI, NaeI, EcoRI, 또는 Sau3A1을 포함한다. 대조군 뉴클레아제는 섹션 I의 도입부에서 앞서 상세히 논의되어 있다.

D. 증폭 방법

본 발명의 방법은 또한 핵산 증폭을 포함한다. 역방향 전사, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 실시간 PCR(RT-PCR), 핵산 서열-염기 증폭(NASBA), 리가제 연쇄 반응, 다중 결합성(multiplex ligatable) 프로브 증폭, 침입자 기법(invader technology) (Third Wave), 롤링 써클 증폭, 시험관내 전사, 가닥 치환 증폭, 전사 매개 증폭(TMA), RNA (Eberwine) 증폭, 루프 매개 등온 증폭, 및 업계의 숙련인에게 공지된 다른 방법을 포함한, 핵산 서열의 증폭을 위한 다수의 방법들이 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 하류 분석을 위한 비-연쇄적인 증폭 산물을 제공하기 위해, 증폭 반응, 예컨대 롤링 써클 증폭 또는 루프 매개 등온 증폭에 의해 생성된 연쇄적인(concatenated) 증폭 산물을, 예를 들어 증폭 주형 또는 도입된 프라이머에 존재하는 인식 부위의 엔도뉴클레아제식 개열에 의해 가공처리하는 단계를 더 포함한다.

전형적인 PCR 반응은 표적 핵산 종을 선택적으로 증폭하는 복수의 증폭 단계, 또는 사이클을 포함한다. 전형적인 PCR 반응은 3 단계를 포함한다: 표적 핵산을 변성시키는 변성 단계; 일 세트의 PCR 프라이머(정방향 및 역방향 프라이머)를 상보적인 DNA 가닥에 어닐링하는 어닐링 단계; 및 열안정성 DNA 중합효소가 프라이머를 연장시키는 연장 단계. 이들 단계를 수회 반복함으로써, DNA 분획이 증폭되어 표적 DNA 서열에 상응하는 앰플리콘을 생성한다. 전형적인 PCR 반응은 변성, 어닐링, 및 연장의 20회 이상의 사이클을 포함한다. 다수의 경우, 어닐링 및 연장 단계는 동시에 실시될 수 있으며, 이 경우 사이클은 단지 2 단계를 포함한다.

특정 방법에서는, 각 표적 서열을 위해 한 세트의 프라이머가 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 단일 세트의 프라이머가 GC 참조 표준 및 표적 핵산 둘다를 증폭시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 프라이머의 길이는 프라이머들 사이의 원하는 혼성화 온도, 표적 핵산 서열, 및 증폭될 상이한 표적 핵산 서열의 복잡성(이에 한정되지 않음)을 포함한 다수의 인자에 의존한다. 특정 실시양태에서, 프라이머는 길이가 약 15 내지 약 35개 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 프라이머는 길이가 15, 20, 25, 30 또는 35개 이하의 뉴클레오티드이다. 부가적인 실시양태에서, 프라이머는 길이가 35개 초과의 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머 세트는 서열번호: 40에 혼성화하는 일 프라이머와, 서열번호: 41에 혼성화하는 제2 프라이머를 포함한다. 프라이머는 서열번호: 40에 나타낸 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 프라이머는 서열번호: 41에 표시된 가닥에 상보적인 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 방법은 적어도 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 또는 그 이상의 CGG 반복을 증폭시킬 수 있는 PCR 반응을 포함한다. 규모가 큰 GC가 풍부한 주형을 증폭시킬 수 있는 예시적인 방법이 예를 들어, 미국 특허 공보 제2010/0209970호에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용된다.

PCR 반응은 1 초과의 GC/AT 비에서 그리고 GC가 풍부한 주형을 이용한 DNA의 합성을 촉진하는 총 dNTP 농도에서 dNTP들을 제공하는 단계를 포함한다. GC/AT 비는 약 1.1, 1.2, 1.4, 1.6, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 또는 그 이상일 수 있다. GC/AT 비는 1.1 내지 20, 1.1 내지 15, 1.1 내지 10, 1.1 내지 8, 1.1 내지 7, 1.1 내지 6, 1.1 내지 5, 1.2 내지 25, 1.4 내지 25, 1.6 내지 25, 2 내지 25, 3 내지 25, 4 내지 25, 5 내지 25, 2 내지 15, 2.5 내지 10, 또는 4 내지 10일 수 있다. 총 dNTP 농도는 약 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2, 1.5, 2, 또는 3 mM 일 수 있다. dNTP 농도는 0.4 내지 3 mM, 0.5 내지 3 mM, 0.6 내지 3 mM, 0.7 내지 3 mM, 0.8 내지 3 mM, 0.9 내지 3 mM, 1 내지 3 mM, 0.4 내지 2 mM, 0.4 내지 1.5 mM, 0.4 내지 1.2 mM, 0.4 내지 1 mM, 0.4 내지 0.9 mM, 0.4 내지 0.8 mM, 0.4 내지 0.7 mM, 0.5 내지 2 mM, 0.5 내지 1 mM, 또는 0.6 내지 0.9 mM일 수 있다.

PCR 반응에서 사용된 DNA 중합효소는 야생형 중합효소, 변형된 중합효소, 호열성(thermophilic) 중합효소, 키메라 중합효소, 조작된 중합효소, 및/또는 1 초과의 중합효소의 혼합물을 포함할 수 있다. DNA 중합효소는 정확한(Exact) 중합효소(5 PRIME GmbH), AccuSure^TM DNA 중합효소(Bioline), Phusion^TM AccuPrime^TM Pfx(Invitrogen), 백금 Taq DNA 중합효소 고충실도(High Fidelity)(Invitrogen), Phire^TM 핫스타트 DNA 중합효소(New England Biolabs), Phusion^a 핫스타트 고충실도 DNA 중합효소 (New England Biolabs), JumpStart^TM REDTaq^TM DNA 중합효소(Sigma-Aldrich), PfuUltra^TM 핫스타트 DNA 중합효소(Stratagene), PfuTurbo^®Cx 핫스타트 DNA 중합효소(Stratagene), PrimeSTAR^TM HS DNA 중합효소(Takara), 익스텐서(Extensor) 하이-피델리티(Hi-Fidelity) PCR 효소(ABgene), ACCUZYME^TM DNA 중합효소(Bioline), SAHARA^TM DNA 중합효소(Bioline), VELOCITY DNA 중합효소(Bioline), GeneChoice^® AccuPOL^TM DNA 중합효소 (GeneChoice, Inc.), GeneChoice^® UniPOL^TM DNA 중합효소 (GeneChoice, Inc.), 일롱가제(Elongase) 효소 믹스(Invitrogen), Pfx50^TM DNA 중합효소 (Invitrogen), Phusion DNA 중합효소 (New England Biolabs), KOD HiFi DNA 중합효소 (Novagen), KOD XL DNA 중합효소 (Novagen), 익스팬드(Expand) 20 kb PLUS 열안정성 DNA 중합효소 혼합물(Roche Applied Science), 익스팬드 고충실도 PLUS 열안정성 DNA 중합효소 혼합물(Roche Applied Science), 익스팬드 고충실도 열안정성 DNA 중합효소 혼합물(Roche Applied Science), 익스팬드 긴 주형 열안정성 DNA 중합효소 혼합물(Roche Applied Science), Easy-A^TM 고충실도 PCR 클로닝 효소(Stratagene), EXL^TM DNA 중합효소 (Stratagene), Herculase^® 향상된(Enhanced) DNA 중합효소 (Stratagene), Herculase^®II 융합 DNA 중합효소 (Stratagene), 카파(Kapa) LongRange^TM DNA 중합효소 (Kapa Biosystems), 카파 HiFi^TM DNA 중합효소 (Kapa Biosystems), Kapa2G^TM 로부스트(Robust) DNA 중합효소 (Kapa Biosystems), Kapa2G^TM 로부스트 핫스타트 DNA 중합효소 (Kapa Biosystems), Kapa2G^TM 빠른(Fast) DNA 중합효소 (Kapa Biosystems), Kapa2G^TM 빠른 핫스타트 DNA 중합효소 (Kapa Biosystems), LA TAQ DNA 중합효소 (Takara), Optimase DNA 중합효소 (Transgenomic, Inc.), Exo-Pfu DNA 중합효소 (Stratagene), HotMaster Taq DNA 중합효소 (5 PRIME GmbH), HotTaq DNA 중합효소 (Abnova Corporation), AmpliTaq Gold^® DNA 중합효소 (Applied Biosystems), Bst DNA 중합효소 Lg Frag (New England Biolabs), MasterAmp^TM Tfl DNA 중합효소 (EPICENTRE Biotechnologies), Red Hot DNA 중합효소 (ABgene), Thermoprime Plus DNA 중합효소 (ABgene), Taq-red DNA 중합효소 (AppliChem GmbH), BIO-X-ACT^TM 긴 DNA 중합효소 (Bioline), BIO-X-ACT^TM 짧은 DNA 중합효소 (Bioline), Bioline HybriPol^TM DNA 중합효소 (Bioline), BioTherm Taq DNA 중합효소 (eEnzyme LLC), EU-Taq DNA 중합효소 (eEnzyme LLC), Synergy Taq DNA 중합효소 (eEnzyme LLC), GeneChoice^® RedPOL^TM DNA 중합효소 (GeneChoice, Inc.), AccuPrime^TM GC가 풍부한 DNA 중합효소 (Invitrogen), PyroPhage^® 3173 DNA 중합효소, Exo Minus (Lucigen), 9 Degrees North (변형된) DNA 중합효소 (New England Biolabs), Therminator DNA 중합효소 (New England Biolabs), Pwo DNA 중합효소 (Roche Applied Science), Paq5000^TM DNA 중합효소 (Stratagene), YieldAce^TM DNA 중합효소 (Stratagene), e2TAK^TM DNA 중합효소 (Takara), 또는 예를 들어 피. 코다카라엔시스(P. kodakaraensis), 피. 푸리오수스(P. furiosus), 티. 고르고나리우스(T. gorgonarius), 티. 질리기이(T. zilligii), 티. 리토랄리스(T. litoralis ) " VentTM ", P. GB -D " Deep Vent ", T. 9N-7, 티. 아그레간스(T. aggregans), 티. 바로시이(T. barossii), 티. 푸미콜란스(T. fumicolans), 티. 셀러(T. celer), 피로코커스(Pyrococcus) 종 균주 ST700 , 티. 파시피쿠스(T. pacificus), 피. 아비시이(P. abysii), 티. 프로푼두스(T. profundus), 티. 시쿨리(T. siculi), 티. 히드로써말리스(T. hydrothermalis), 써모코커스(Thermococcus) 종 균주 GE8 , 티. 티오레두센스(T. thioreducens), 피. 호리코쉬이(P. horikoshii ) 또는 티. 온누리네우스(T. onnurineus) NA1 , 써모코커스 종 9°N-7, 써모코커스 종 GI -J, 써모코커스 종 MAR -13, 써모코커스 종 GB -C, 써모코커스 종 GI -H, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써무스 터모필러스(Thermus thermophilus), 써무스 칼도필러스(Thermus caldophilus), 써무스 필리포르미스(Thermus filiformis), 써무스 플라부스(Thermus flavus), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 또는 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)로부터 유래한 천연 발생 DNA 중합효소를 포함할 수 있다.

예시적인 실시양태에서, 증폭된 핵산은 증폭 반응 동안 표지된다. 특정의 경우, 메틸화 민감 DNA 분해효소로 처리된 샘플의 일부가 제1 표지로 표시되고, 샘플의 대조군 부분은 제2 표지로 표시된다. 몇몇 실시양태에서, 각 표지는 CE에 의해 검출가능하다.

표지는 검출가능한 형광, 화학발광, 또는 생물발광 신호를 발생하거나 소광시키는 발광, 광산란, 및 광흡수 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌[참조: Kricka, L., Nonisotopic DNA Probe Techniquies, Academic Press, San Diego (1992) 및 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press (1997)]). 표지로서 유용한 형광 리포터 염료는 플루오레세인 (예를 들어, 미국 특허 제5,188,934호, 제6,008,379호, 및 제6,020,481호 참조), 로다민(예를 들어, 미국 특허 제5,366,860호, 제5,847,162호, 제5,936,087호, 제6,051,719호, 및 제6,191,278호 참조), 벤조페녹사진(예를 들어, 미국 특허 제6,140,500호), 도너 및 억셉터의 쌍을 포함하는 에너지 전달 형광 염료(예를 들어, 미국 특허 제5,863,727호; 제5,800,996호; 및 제5,945,526호 참조), 및 시아닌(예를 들어, WO　9745539 참조)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 플루오레세인 염료의 예는 6-카르복시플루오레세인; 2',4',1,4-테트라클로로플루오레세인; 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 시아닌 염료의 예는 WellRed^® 적외선 염료 D1, D2, D3 또는 D4를 포함한다. 부가적인 표지는 리싸민(lissamine), 피코에리트린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 케스케이드 블루, Cy3, Cy5, 6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그라핀(Renographin), ROX, SYPRO, TAMRA, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드뿐만 아니라, 다른 표지로부터 검출가능하고 구별가능한 염료 신호를 발생시킬 수 있는 임의의 다른 형광 모이어티로부터 유도될 수 있다. 플루오레세인 염료의 예는 6-카르복시플루오레세인; 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인; 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 측면에서, 형광 표지는 CE 분석과 상용가능한 SYBR-그린, 6-카르복시플루오레세인 ("FAM"), TET, NED, ROX, VIC^TM,또는 JOE로부터 선택된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 표지는 상이한, 스펙트럼 분해가능한 파장에서 광을 발생시킬 수 있는 다양한 형광물질(예를 들어, 4가지 상이한 색상의 형광 물질)이고; 이러한 특정 표지된 프로브는 업계에 공지되어 있고 상기 및 미국 특허 제6,140,054호에 기재되어 있다. 리포터 형광물질 및 소광제(quencher) 형광물질을 포함하는 이중 표지된 형광 프로브가 몇몇 실시양태에서 사용된다. 다른 예로는 Freedom^® 염료를 포함할 수 있으며, 이는 일반 염료에 대한 상업적으로 입수가능한 대체물이다. 쉽게 구분이 가능하도록 구별되는 발광 스펙트럼을 가진 형광물질 쌍들이 선택될 수 있음이 인지될 것이다.

추가 측면에서, 표지는 듀플렉스(duplex), 예를 들어, 인터컬레이터 및 인터컬레이팅 염료 (에티디움 브로마이드 및 SYBR-그린 포함(이에 한정되지 않음)), 마이너-그루부(minor-groove) 바인더들, 및 가교결합성 작용기들의 혼성화를 증진시키거나, 안정화시키거나, 또는 촉진하는 역할을 하는 혼성화 안정성 모이어티이다(예를 들어, 문헌[참조: Blackburn et al., eds. "DNA and RNA Structure" in Nucleic acids in Chemistry and Biology (1996)]).

단일 분석에서 2 이상의 표지를 사용하는 경우에, 쉽게 구분이 될 수 있도록 구별되는 발광 스펙트럼을 가진 표지가 선택됨을 인식할 것이다. 몇몇 예에서, FAM 및 HEX 표지는 샘플의 제1 부분과 제2 부분을 표시하기 위해 사용된다. 부가적인 실시양태에서, FAM 또는 HEX는 본원에 기재된 방법에서 다른 것들 중에서 NED 또는 ROX 표지와 함께 사용될 수 있다.

E. 분석 방법

몇몇 실시양태에서, 증폭된 핵산은 메틸화 상태를 확인하기 위해 분석된다. 예시적인 실시양태에서, 분석 방법은 업계에 친숙한 기기들(instruments), 예컨대 ABI 3100, 3130, 3730, 또는 3500 모델을 사용하는 모세관 전기영동(CE)이다. 다른 구현들은 DNA의 전기영동식 크기배분 및 다색 분해가 가능한 임의의 기기를 포함한다. 예를 들어, WellRed 적외선 염료(D1, D2, D3 및 D4)의 검출을 위한 Beckman Vidiera 또는 SEQ6000 모세관 전기영동 시스템 또는 IR염료가 도입되는 Li-Cor 기기가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 미세유체(microfluidic) CE 시스템, 예컨대 Agilent 2100 생물분석기 및 유사한 플랫폼, 질량 분광분석, 아가로스겔 전기영동에 이은 스캔 농도계측(densitometry), 및 포스포이미저(phosphorImager)를 이용한 방사성표지된 생성물의 분석 또는 방사선 사진의 스캔 농도계측을 포함한다. 부가적인 실시양태에서, 샘플의 제1 및 제2 부분으로부터의 증폭된 핵산은 단일 CE 분석으로 분석된다.

특정 분석법, 예컨대 CE는 주형에 존재하는 메틸화 상태 및 CGG 반복 횟수의 동시 특징규명을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, CE 분석은 36 또는 50 cm 컬럼에서 POP-4, 5, 6, 또는 7 액체 폴리머를 사용하여 수행된다. 일 실시양태에서, 액체 폴리머는 POP-7이다.

특정 실시양태에서는, 메틸화 백분율이 계산될 수 있다. CE 전기영동도, 포스포이미저 스캔, 농도계측 스캔, 질량 스펙트럼, 또는 다른 데이터 형태에서 관측된 피크의 강도를 업계에 공지된 적합한 방법, 예를 들어, 피크 높이, 곡선 아래 면적(적분), 또는 곡선 피팅과 같은 방법에 따라 측정할 수 있다. 이후, 대조군으로서 처리된 샘플과 메틸화 민감 DNA 분해효소에 의해 절단된 샘플의 부분들로부터의 상응하는 피크들에 대한 피크 강도 값들을 비교할 수 있고; GC 참조 표준을 사용하여 피크 강도를 정규화할 수 있다. 예를 들어, 정규화는 각각의 관측된 피크 강도를 샘플의 동일 부분에서 GC 참조 표준에 대해 관측된 피크 강도에 대한 비로서 표시함으로써 이루어질 수 있다.

다른 실시양태에서, 메틸화 상태는 비메틸화 또는 메틸화로서 특징규명될 수 있다. 추가 실시양태에서, 메틸화 상태는 비메틸화, 부분적 메틸화, 또는 완전 메틸화로서 분류될 수 있다.

II . 샘플

본원에서 제공된 방법은 샘플에서 핵산 주형의 메틸화 상태의 특징규명에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 핵산 샘플은 인간으로부터 얻어진다. 예를 들어, 샘플은 환자 샘플일 수 있다. "환자 샘플"은 환자로부터의 임의의 생물학적 시료이다. 이 용어는 생물학적 유체, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 눈물, 타액, 림프액, 투석액, 세척액, 정액, 및 기타 액체 샘플 뿐만 아니라 생물 기원의 세포 및 조직을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 세포 및 조직은 구강 세포(buccal cell), 입세척 수집물, 또는 모낭을 포함한 피부 세포를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 인간으로부터 단리된 세포 또는 이로부터 유래한 세포를 포함하며, 배양물 중의 세포, 세포 상등액, 및 세포 용해물을 포함한다. 이는 또한 장기 또는 조직 배양물 유래 유체, 조직 생검(biopsy) 샘플, 종양 생검 샘플, 대변 샘플, 및 생리학적 조직에서 추출된 유체 뿐만 아니라, 고형 조직으로부터 분리된 세포, 조직 절편, 및 세포 용해물을 포함한다. 이는 또한 사후의 고형 조직 샘플, 예컨대 뇌로부터 얻어진 샘플을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 샘플은 약 80, 100, 150, 200, 500, 또는 1,000 ng 미만의 DNA를 함유한다.

몇몇 경우에, 샘플은 게놈 DNA를 포함한다. DNA는 본 발명의 방법이 실시되기 이전에 샘플의 다른 비-DNA 성분들로부터 분리될 수 있다. 다수의 DNA 분리 및 정제 방법이 업계에 공지되어 있다.

샘플은 DNA 주형을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 특정 방법에서, DNA 주형은 DNA 중합효소에 의해 촉진되는 반응에서 합성의 표적일 수 있다. DNA 주형의 GC 풍부도는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.5% 이상의 C 및 G 잔기일 수 있다. DNA 주형은 C 및 G 잔기를 포함하는 디-, 트리-, 또는 테트라뉴클레오티드 반복을 포함할 수 있다. DNA 주형은 질환 관련 유전자좌 내부의 또는 그러한 유전자좌 부근의 서열을 포함할 수 있다. DNA 주형은 FMR1 또는 FMR2 유전자의 5' UTR의 적어도 일부를 포함할 수 있다. DNA 주형은 FMR1 유전자의 5' UTR의 CGG 반복 또는 FMR2 유전자의 5' UTR에서의 CGG 반복을 포함할 수 있다. DNA 주형의 크기는 약 50, 100, 200, 300, 500, 또는 700 bp, 또는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 7, 또는 10 kb일 수 있다. DNA 주형의 크기는 50 bp 내지 10 kb, 100 bp 내지 10 kb, 200 bp 내지 10 kb, 300 bp 내지 10 kb, 500 bp 내지 10 kb, 700 bp 내지 10 kb, 1 kb 내지 10 kb, 1.5 bp 내지 10 kb, 2 bp 내지 10 kb, 3 bp 내지 10 kb, 50 bp 내지 7 kb, 50 bp 내지 5 kb, 50 bp 내지 4 kb, 50 bp 내지 3 kb, 50 bp 내지 2 kb, 50 bp 내지 1.5 kb, 100 bp 내지 7 kb, 200 bp 내지 5 kb, 또는 300 bp 내지 4 kb일 수 있다.

III . 실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하고 있으며 본 발명의 범위를 제약하는 의도가 아니다.

실시예 1. 메틸화 상태를 특징규명하기 위한 처리과정

도 1은 본원에 기재된 mPCR 방법론의 일례를 도시한다. 샘플 DNA는 메틸화 민감 DNA 분해효소, 예컨대 비메틸화된 주형은 분해하지만 메틸화된 대립유전자를 보유하는 HpaII i를 함유하는 반응 믹스로 처리하거나, 또는 메틸화 민감 효소가 없는 대조군 믹스로 처리된다. 샘플 DNA의 각 부분은 외부 GC 참조 표준의 존재하에 PCR이 실시된다. PCR은 또한 200회를 넘는 CGG 반복을 가진 대립유전자를 증폭시킬 수 있다. HpaII 부분과 대조군 부분을 위한 프라이머는 상이한 표지(예를 들어, FAM 및 HEX)를 가진다. 이후, PCR 생성물을 풀링(pooling)하고 모세관 전기영동으로 분석한다. CE에서 앰플리콘 신호 상실은 HpaII 부위에서 절단 및 메틸화의 결핍을 나타내지만, 신호의 유지는 상응하는 대립유전자의 메틸화를 나타낸다. 대립유전자에 의한 메틸화 분율은 HpaII로 절단된 정해진 대립유전자에 대한 앰플리콘 수율 : 절단되지 않은 상응하는 대립유전자의 앰플리콘 수율의 비로부터 결정된다. 이 비는 외부 GC 참조 표준의 신호로 정규화된다.

실시예 2. 실험 과정

A. 임상 및 세포주 DNA 샘플

임상시험심사위원회의 승인에 따라 M.I.N.D. 진료 협회에서 확인된 환자의 혈액 샘플로부터 gDNA를 수득하였다 (Filipovic-Sadic et al., Clin Chem 2010; 56:399-408). 세포주 DNA 샘플을 코리엘 셀 리포지토리즈(Coriell Cell Repositories)(CCR, 미국 뉴저지주 캄덴 소재의 코리엘 인스티튜트 포 메디컬 리서치)로부터 수득하였다. 임상 및 세포주 DNA 샘플을 PCR 이전에 10 mM Tris, 0.5 mM EDTA, pH 8.8에서 20 ng/μL로 희석하였다.

B. FMR1 메틸화 PCR

AmplideX^TM 메틸화 PCR 시약(텍사스 오스틴 소재의 Asuragen, Inc.)을 이용한 메틸화 평가를 위해 각 샘플로부터 40 ng gDNA의 두 분취량을 준비한다. 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사에서 구입한 것이다. DNA의 일 분취량을 절단 버퍼 및 메틸화 민감 효소(달리 언급이 없으면 HpaII)와 혼합하고, 제2 분취량은 절단 버퍼와 대조군 효소, 예컨대 Sau3AI 또는 EcoRI와 혼합한다. 제한 효소는 반응 혼합물에 0.15 U/㎕의 최종 농도로 존재한다. 각 반응에서 버퍼 성분의 최종 농도의 예가 표 1에 나타나 있다(효소 저장 버퍼로부터의 시약 기여도(contributions)를 포함하지 않음).

예시적인 반응 조건

절단 믹스 A
시약	농도
MgCl₂	10 mM
비스-트리스-프로판-HCl, pH 7.0	10 mM
디티오트레이톨	1　mM
절단 믹스 B
시약	농도
MgCl₂	10　mM
트리스-HCl	50　mM
NaCl	100　mM
절단 믹스 C
시약	농도
MgCl₂	7.5mM
TrisHCl, pH 7.5	10mM
BSA	100 ㎍/ml

밀봉된 96 웰 플레이트에서 HpaII 및 대조군 반응을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한다. HpaII 처리된 생성물 (FAM 프라이머) 또는 비-HpaII-대조군 (HEX 프라이머) 생성물에 대해 메틸화 PCR 시약의 개별 PCR 마스터믹스를 준비하고, 제한 효소 절단 또는 대조군 절단 혼합물로 직접적으로 분배한다. 각 마스터믹스는 mPCR AMP 버퍼(Asuragen, 카탈로그 번호 145152), GC가 풍부한 중합효소 믹스(Asuragen, 카탈로그 번호 145153), 탈이온수, 및 mPCR 프라이머(정방향: 5' TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA-3'(서열번호: 42); 역방향: 5'-FAM- 또는 HEX-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (서열번호: 43)) (Filipovic-Sadic, 2010)를 함유한다. 각 마스터믹스는 또한 외부 GC 참조 표준을 함유한다(PCR 사이클의 횟수에 따라 ~3000-12,000 카피/PCR 반응).

최종 PCR 버퍼/시약 조건은, 절단 버퍼로부터 운반되는 부가적인 0.67 mM MgCl₂, 2.66 mM 비스-트리스-프로판, pH 7.0, 및 0.266 mM DTT (절단 믹스 A 샘플의 경우); 부가적인 10 mM TrisHCl, pH 7.5, 및 20 mM NaCl (절단 믹스 B 샘플의 경우); 또는 부가적인 2.66 mM TrisHCl, pH 7.5, 및 26.6 ㎍/ml BSA (절단 믹스 C 샘플의 경우)를 제외하고는 AmplideX^TM FMR1 키트(Asuragen, 카탈로그 번호 49402; 미국 특허 공보 제2010/0209970호)에서와 동일하다.

특정 반응은 40 CGG의 상대 체류 시간을 가진 GC 참조 표준(서열번호: 44; "40-CGG-대조군")을 사용할 수 있으며, 이는 30 CGG 반복을 함유하는 플라스미드에 비인간 DNA 서열의 30 뉴클레오티드를 삽입함으로써 작제된다. PCR 단계 동안, 참조 표준은 플라스미드로부터 증폭된다. 부가적인 예는 플라스미드 내에 함유된 0 CGG의 상대 체류 시간을 가진 참조 표준을 포함한다(Asuragen, 카탈로그 번호 49441; 서열번호: 45; "0-CGG-대조군"). 언급한 바와 같이, 교대(alternate) 이동 시간을 가진 비-플라스미드 대조군이 또한 사용된다.

샘플은 95℃에서 5분간의 초기 열 변성 단계에 이어, 97℃에서 35초, 62℃에서 35초 및 72℃에서 4분간의 25 사이클, 및 72℃에서 10분간 PCR 증폭된다. 앰플리콘을 CE 분석을 위해 준비하거나, 또는 -15 내지 -30℃에서 보관한다.

FMR1 앰플리콘의 서열은, 프로빙된 두 HpaII 부위의 표시와 함께, 하기와 같이 나타내어진다:

5'-X-(CGG 반복 영역)-Y-3'

상기 식에서 X는 TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTT CCGG TGGAGGGCCGCCTCTGAGCGGGCGGCGGGCCGACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCG (서열번호: 46)이고; Y는 CTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTC CCGG CGCTAGCAGGGCTGAAGAGAAGATGGAGGAGCTGGTGGTGGAAGTGCGGGGCTCCAATGGCGCTT-3' (서열번호: 47)이다.

서열번호: 46 및 47에서, 밑줄친 영역은 정방향 및 역방향 프라이머가 결합되는 서열을 나타내고, 이탤릭체와 밑줄친 CCGG 서열은 2개의 HpaII 부위를 나타낸다.

C. 모세관 전기영동 ( CE )

언급한 경우를 제외하고는 실험을 위해 3130xl 유전자 분석기(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems Inc., ABI)가 사용된다. 미정제된 PCR 생성물 총 2 ㎕ (HEX 표지된 생성물 및 FAM 표지된 생성물로부터 각 1 ㎕)를 HI-DI Formamide^®(ABI) 11 ㎕ 및 ROX 1000 사이즈 래더(Ladder)(Asuragen) 2 ㎕와 혼합하고, 95℃에서 2분간 열 변성시킨 다음 분석을 위해 CE 시스템으로 옮긴다. 언급된 경우를 제외하고는, 주입(injection)은 15 kV에서 20초 및 40분 실행을 위해 2.5 kV의 주입을 이용하는 표준 분획 사이징 조건(36 cm, POP7)을 따른다. 언급되는 경우 ABI 3500xL CE (50 cm, POP7)가 사용된다. POP7 폴리머의 분해 한계로 인해, >250 CGG 반복을 가진 모든 FMR1 앰플리콘은 CE에서 유사한 이동도를 가진다.

D. 데이터 분석

GeneMapper 4.0 (3500xL 데이터의 경우 4.1) 또는 PeakScanner V1.0 소프트웨어(ABI)를 사용하여 전기영도도를 분석한다. 염기쌍 크기의 CGG 반복 횟수로의 전환은 20, 29, 31, 54 및 119 CGG 반복을 가진 주형으로부터 생성된 대조군 앰플리콘으로의 직선 회귀에 의해 결정된다 (Filipovic-Sadic, 2010). 각 피크에 대한 피크 크기는 (Size_i-230.3/2.975)를 이용하여 CGG 반복 길이로 전환된다.

각각의 검출된 대립유전자에 대한 CGG 반복 길이 및 메틸화 퍼센트의 결과가 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 표로 만든다. 메틸화 퍼센트, %M_i는 방정식 1에 나타낸 바와 같이 절단된 (Peak_i _, _FAM) 샘플과 비절단된 샘플 (Peak_i _, _HEX) 간의 피크 높이의 비를 GC 참조 표준 앰플리콘 피크 높이 (CTRL_HEX 또는 CTRL_FAM)로 정규화하는 방식으로 계산된다:

약 100%이거나 또는 공칭 100%를 초과하는 메틸화 값은 완전 메틸화로서 기록된다. 이러한 값은 전형적으로 후술되는 바와 같이 잘 발현되는(well represented) 대립유전자에 대한 분석의 변동 범위 내에서 관찰되지만, 때때로 대립유전자 특이적 신호가 CE 기기의 검출의 보다 낮은 범위 부근인 경우 낮은 존재(low abundance)의 대립유전자 (예를 들어, 임상의 완전 돌연변이 샘플의 겨우 1% 질량 분율의 투입)의 메틸화 평가시 과장되어 있어(예를 들어, 120 내지 137%) GC 참조 표준 피크의 신호에 비해 정량적으로 신뢰성이 낮다.

E. 서던 블롯 분석

80종의 임상 샘플의 SB 분석을 문헌[Tassone et al., J Mol Diagn 2008;10:43-9]에 기재된 바와 같이 실시한다. EcoRI 및 EagI (NEB)를 사용하여 SB를 위한 세포주 DNA를 준비한다. SB 이미지를 분류별로 평가하고 (비메틸화, 부분 메틸화 및 완전 메틸화 대립유전자) 각 샘플에서 메틸화 퍼센트를 문헌[Tassone, 2008]에 기재된 바와 같이 측정한다.

실시예 3. 메틸화된 DNA 표준 및 샘플을 이용한 mPCR 의 정확도 및 재현성

2-색 mPCR 처리과정의 정확도를 평가하기 위해, 30 CGG 반복 및 공지의 메틸화 분율을 함유하는 8종의 정해진 분석 표준 한 세트를 제작하였다. 표준 과정에 따라 pBR322 중으로 클로닝된 30 CGG 반복 대립유전자의 PCR 생성물로부터 메틸화 및 비메틸화된 DNA 대조군을 제조하였다 (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual . 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: CSHL Press, 1989). 30 CGG 표준을 Hpa II 메틸트랜스퍼라제(매사추세츠주 입스위치 소재의 New England Biolabs, NEB)로 메틸화하고 HindIII (NEB)로 선형화시켰다.

메틸화 또는 비메틸화된 30 CGG 표준의 다양한 비율을 0-100%로 혼합하고 645 CGG 세포주 DNA (NA04025, CCR) 20 ng/㎕에서 1.5 x 10⁴ 카피/㎕로 희석하였다. 코리엘 셀 레포지토리즈(CCR, 뉴저지주 캄덴 소재의 코리엘 인스티튜트 포 메디컬 리서치)로부터 세포주 DNA 샘플을 수득하였다. 각 샘플에 대해 절단 믹스 A에서 HpaII 절단을 실시하고(대조군 반응의 경우 절단 믹스 A에서 Sau3A1), 40-CGG-대조군의 존재하에 PCR 25 사이클을 실시하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 CE를 수행하였다.

30 CGG 표준을 위한 FAM-채널에서 신호에 있어 비율 변화를 강조하는 일련의 전기영동도가 도 3의 A에 도시되어 있다. 메틸화 퍼센트가 증가할수록, 40-CGG-대조군 및 혼합된 645 CGG 완전 돌연변이 대립유전자에 대한 피크에 비해 30 CGG 표준에 대한 신호가 증가하였다. 피크 높이에 있어 변화를 40-CGG-대조군 피크 높이로 정규화하였고 HEX 채널에서의 정규화된 비와 비교하였다 (방정식 1). 3가지 상이한 실행 일(days)에 걸쳐 두 명의 작업자에 의해 실시된 바에 따르면(도 3의 B)(입력(input) 메틸화는 x-축에 표시되고, 측정된 메틸화는 y-축에 표시됨), 공지의 메틸화 분율과 mPCR에 이어 경험적으로 회수된 분율 간에 선형의 상관관계(R²=0.998)가 관찰되었다. 평가된 표준 각각의 경우 645 CGG 대립유전자의 메틸화는 정량적인 것으로 확인되었다(104±5%) (도 3의 B).

2가지 CE 기구 플랫폼(ABI 3130xl 및 3500xL)에서 2종의 정상 대립유전자 (여성 임상 샘플로부터 30 및 32 CGG) 및 2종의 완전 돌연변이 대립유전자 (550 CGG 및 940 CGG)의 8가지 복제물(replicate)에 대해 mPCR의 재현성을 추가로 평가하였다. 메틸화 분율, 표준 편차, 변이계수(coefficients of variation, CV), 및 95% 신뢰구간(CI)이 표 2에 제시되고 있다.

정상 및 완전 돌연변이 대립유전자에 대한 2가지 CE 플랫폼에 대해 메틸화의 mPCR 평가

플랫폼	샘플	대립유전자 ( CGG )	평균 (%)	표준편차 (%)	CV	95% CI
3130xl	AS10017	30	74	5.3	7%	70.4-77.7
	AS10017	32	25	2.0	8%	23.4-26.2
	NA07862	~550	101	10.0	10%	94.5-108.4
	NA09237	~940	97	15.7	16%	86.5-108.3
3500xL	AS10017	30	76	5.7	8%	71.8-79.7
	AS10017	32	27	2.1	8%	25.9-28.8
	NA07862	~550	101	8.0	8%	95.7-106.8
	NA09237	~940	97	12.0	12%	88.6-105.3

계산된 mPCR 메틸화 분율은 2가지 상이한 플랫폼에서 정상 대립유전자의 경우 CV=7-8%였고 완전 돌연변이 대립유전자의 경우 CV=8-16%였다. 부가적으로, mPCR 결과는 4종의 완전 돌연변이 샘플을 포함한 8종의 세포주 샘플을 사용하여 2명의 다른 작업자(CV=7%)에서 재현가능하였다. 때때로 100%를 초과하는 메틸화 퍼센트의 측정은 본 방법의 언급된 변동의 결과였으며, 이러한 샘플은 SB 분석을 이용한 비교 목적을 위해 완전 메틸화로서 표에 기록되었다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, mPCR 방법은 적어도 SB 분석만큼 우수한 임상 샘플에 대한 결과를 제공했다.

실시예 4: 세포주 DNA 의 mPCR 평가 및 SB 분석과의 비교

남성 및 여성 샘플 둘다로부터 정상, 불완전 돌연변이 및 완전 돌연변이 대립유전자를 포함하는 8종의 시판용 세포주 DNA 주형을 사용하여 mPCR을 평가하였다. 샘플에 대해 절단 믹스 A에서 HpaII 절단을 실시하고(대조군 반응의 경우 절단 믹스 A에서 Sau3A1), 40-CGG-대조군의 존재하에 PCR 25 사이클을 실시하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 CE를 수행하였다. mPCR 및 SB 분석으로부터 대립유전자 크기 및 메틸화 상태에 대한 결과가 표 3에 요약되어 있다.

8종의 세포주 DNA 샘플에 대해 mPCR 및 SB 분석의 비교. 볼드체 샘플은 도 4에 도시되어 있다.

샘플 정보				SB 분석		mPCR
샘플 ID	유전자형	성별	Coriell 카탈로그 반복 길이( CGG )	추정 크기 (~ CGG )	분류별 메틸화 (완전, 부분, 비)	mPCR CE 반복 길이	CE 에서 메틸화 %
NA06892	PM	M	93 (80-85)	~110	비	90	2%
NA09145	FM	M	전체	660~990	완전	>250	109%
NA06852	FM	M	>200	395	완전	>250	108%
NA04025	FM	M	645	795	완전	>250	113%
NA09237	FM	M	931-940	1062	완전	>250	109%
NA20241	PM	F	29/93-110	정상	부분	29	24%
				103-130	부분	88	83%
						111	83%
						116	0%
NA06896	PM	F	23/95-140	정상	부분	23	21%
				148-201	부분	112	69%
						136	96%
						153	0%
						175	0%
						>250	0%
NA07537	FM FM	F	28/336	정상	부분	29	8%
NA07537	FM FM	F	28/336	329	완전	>250	100%

매칭 SB 데이터를 가진 4종의 샘플의 전기영동도가 도 4a-d에 도시되어 있다. 각 도면에서, 상부 패널은 HpaII로 처리되지 않은 샘플의 부분을 나타내고, 하부 패널은 절단된 샘플을 도시한다. 표 3의 샘플 ID가 반복 길이와 함께 각 도면에 도시되어 있다. 도 4에서 반복 길이는 >250 CGG의 경우 코리엘 명명을 이용하고 <250 CGG의 경우 PCR 결과를 이용하여 표시된다. 각 도면은 또한 mPCR에 의해 측정된 메틸화 백분율을 포함한다. "Ctrl"로 표시된 피크는 40-CGG-대조군을 나타낸다.

각각의 경우에, mPCR 결과는 상응하는 SB 데이터와 정량적으로 일치했다. 예를 들어, 도 4a에 도시된 바와 같이, 남성 불완전 돌연변이 대립유전자 (NA06892, 90 CGG)는 mPCR에 의해 2% 메틸화를 나타내었으며, 이는 SB의 비메틸화된 영역에서만 검출된 생성물의 존재와 일치했다. 여성 정상 대립유전자(NA07537, 도 4c)의 편중(skewed) X-불활성화(8% 메틸화)는 또한, 완전 메틸화된 완전 돌연변이 대립유전자와 조합되어, SB 분석 및 이미 공개된 데이터와 일치했다(Zhou et al., Clin Chem 52:1492-1500 (2006)).

mPCR은 길이가 최대 ~250 CGG인 복합 샘플에서 대립유전자 특이적 메틸화 상태에 대한 보다 상세한 해석을 제공했다. 예를 들어, 모자이크(mosaic) 여성 샘플 (NA06896, CCR에 따라 "23/95-140")은 23, 112, 136 CGG의 주(primary) 피크와 153, 175, 196, 및 219 CGG의 4개의 부가적인 낮은 존재의 피크로 검출되었다 (도 4d). 23 CGG 및 112 CGG 피크는 부분적으로 메틸화되었고, 136 CGG 피크는 완전히 메틸화되었으며, 153 내지 219 사이의 피크는 완전 비메틸화되었다.

이러한 결과는 SB 분석으로부터의 결과와 정량적으로 유사했다. SB는 대부분 메틸화된 23 CGG 대립유전자, 광범위 세트의 확장된 비메틸화 대립유전자 (<5.2 kb), 및 보다 한정된 셋트의 확장된 메틸화 대립유전자를 나타내었다. 중요하게는, mPCR 데이터는 SB에서 비메틸화된 스미어(smear) 패턴에 대한 개별적인 크기 모자이크 기여도를 나타내었다. 예를 들어, SB 이미지는 mPCR에서 보고된 바와 같이 부분 메틸화된 112 CGG와 비메틸화된 153-219 CGG의 보다 높은 반복 대립유전자와 일치했다.

실시예 5. 임상 DNA 샘플을 이용한 메틸화 PCR 분석 성능

FMR1 mPCR 분석은, 임상적으로 관련된 대립유전자 크기의 전 범위 및 메틸화 상태를 나타내는 한 세트의 80가지 임상 시료를 사용하여 평가되었고, 대립유전자 크기에 대해 앞서 평가된 동일한 세트로부터 선택되었다 (Filipovic-Sadic, 2010). 실험은 실시예 4에 기재된 바와 같이 실시하였다. 메틸화 상태는 또한 SB로 측정하였다 (Tassone, 2008). CGG 반복 길이, 메틸화 퍼센트 및 SB 데이터에 대한 비교를 각 임상 샘플에 대해 표로 나타내었고 (표 4) 표에 요약하였다 (표 5). 표 4에서, mPCR을 이용하여 검출된 대립유전자는 SB의 분해 한계와 매칭되도록 그룹핑되었다. 완전 돌연변이 대립유전자를 가진 샘플은 회색 음영으로 표시되었고, 볼드체로 표시된 샘플은 도 5 및 6에 도시되어 있다. 각 도면에서, "Ctrl"로 표시된 피크는 40-CGG-대조군을 나타낸다.

X-활성화(Rousseau et al., J Med Genet 28:830-6 (1991))는 정상 및 완전 돌연변이 샘플에서 여성 정상 대립유전자에 대한 메틸화 퍼센트와 상반된다. 평균 X-활성화는 정상 여성 대립유전자 (n=8)의 경우 0.51이었고, 여성 완전 돌연변이 (n=12) 샘플의 정상 대립유전자의 경우 0.67이었으며, de Vries 등이 보고한 값들(각각 0.50 및 0.71) (de Vries et al., Am J Hum Genet 58:1025-32 (1996))과 일치했다.

[표 4]

SB에 의한 분류별 콜(categorical call) 및 메틸화 추정치와 mPCR 반복 길이 및 메틸화 퍼센트의 비교

^aRousseau 등 및 de Vries 등; 특정 샘플만을 위해 입수가능한 데이터.

^b 완전 = 밴딩 <5.4 kb의 징표 없음, 부분 = 블롯의 두 영역에서 밴딩의 징표, 비= 밴딩 > 5.4 kb의 징표 없음.

^c메틸화 및 비메틸화된 분리된 밴드들 간의 밴드 강도의 추정 퍼센트로서 유도됨.

^d 도 6에 도시된 전기영동도 및 SB 이미지.

^e 도 5에 도시된 전기영동도 및 SB 이미지.

^f160 CGG에서 검출된 낮은 존재 대립유전자 (60% 메틸화)

mPCR 결과는 SB 분석과 일치했지만, mPCR은 SB에 비해 상이한 메틸화 상태의 검출 및 해석을 단순화하고 개선했다. CE의 보다 높은 분해력으로 인해, mPCR에 의해 용이하게 구분될 수 있는 몇몇 대립유전자는 SB에 의해 분해되지 않았다 (예를 들어 유사 크기의 두 불완전 돌연변이). 이들 경우에, 대립유전자는 SB 분석의 분해 한계와 매칭되도록 그룹핑되었다.

mPCR의 감도는 2가지 상이한 실험을 통해 확인되었다. 제1 실험에서, 정상 31 CGG 대립유전자의 백그라운드에서 임상의 완전 돌연변이 대립유전자의 1% 질량 분율 만큼 적은 적정(titration)이 HEX 및 FAM 채널 둘다에서 검출가능했다 (도 7). 제2 실험에서는, 완전 메틸화된 완전 돌연변이 샘플 (#08)의 10% 질량 분율이 완전 비메틸화된 완전 돌연변이 샘플 (#125)의 90% 질량 분율의 백그라운드에서 확인될 수 있었다 (도 8). 두 샘플의 메틸화 상태는 표 4에 나타낸 바와 같이 SB 분석으로 확인되었다. 따라서, 도 3과 마찬가지로, 심지어 10% 메틸화 모자이크가 임상 샘플을 이용하여 검출될 수 있었다.

A. 완전 돌연변이 대립유전자에서 메틸화 상태의 확인 및 분해

대표적인 완전 돌연변이 샘플에 대한 전기영동도 및 매칭된 SB 이미지가 도 5에 도시되어 있다. 앞서 기재한 바와 같이(Filipovic-Sadic, 2010), 이들 실험에서 사용된 CE 설정은 앰플리콘의 차등적인 분해를 <250 CGG를 가진 것에 한정했으며, 이에 따라, 비록 완전 돌연변이의 광범위한 카테고리에 대한 전체 메틸화 퍼센트가 하기 데이터에 의해 뒷받침되고 있듯이 정확하게 평가되었지만, 보다 큰 반복 확장들의 증폭 생성물들이 함께 이동했다. 예를 들어, 남성 완전 돌연변이 샘플 #88에서 (도 5a), 확장된 대립유전자는 비메틸화 영역에서 약한(faint) 생성물(~10-20% 신호)과 함께 SB의 메틸화 영역에서 주로 검출되었다. mPCR은 본 샘플에 대해 82% 메틸화를 나타내었으며, 이는 SB 결과와 일치했다. 나아가, 여성 완전 돌연변이 샘플 #117의 경우 SB를 사용하여 정상 대립유전자에 대한 부분 메틸화 및 확장된 대립유전자에 대한 완전 메틸화가 관찰되었다 (도 5b). mPCR 결과는 또한 30 CGG 대립유전자의 부분(44%) 메틸화 및 확장된 대립유전자에 대한 완전 (104%) 메틸화를 나타내었다.

mPCR은 SB에 대해 문제가 있을 수 있는 보다 복잡한 샘플에서 메틸화 상태의 존재 확인을 단순화시켰다. 남성 완전 돌연변이 샘플 #125 (도 5c)는 비메틸화된 영역 (3 내지 >5 kb 범위)에 걸쳐 낮은 강도의 스미어를 나타내었다. mPCR을 이용하여, 완전 돌연변이 피크가 HEX에서 명확히 검출되었지만 40-CGG-대조군의 증폭에도 불구하고 FAM 채널에서는 검출되지 않았다. 따라서, 완전 돌연변이 대립유전자는 비메틸화되었다. 또 다른 예에서 (도 5d), 크기 및 메틸화 모자이크 교잡(mosaicism)의 비정상적인 패턴이 분해되었다. SB 분석에 의해, 완전 돌연변이 대립유전자는 부분적으로 메틸화된 것으로 나타났지만, mPCR은 편중 메틸화를 가진 2개의 구별되는 대립유전자 크기를 나타내었다. 주된 완전 돌연변이 신호는 비메틸화된 보다 긴 주형(들)에서 관측되었지만, ~200 CGG에서 보다 덜 풍부한 주형은 완전히 메틸화되었다. 따라서, 크기 모자이크 교잡은 mPCR에 의해 보다 명확히 분해되었으며, 메틸화 패턴은 SB에 의해 나타난 것보다 더 복잡했다.

B. SB 분석에 의해 마스킹된 여성 불완전 돌연변이 대립유전자에서 신규의 편중 패턴의 확인

4가지 대표적인 여성 불완전 돌연변이 샘플에 대한 전기영동도 및 매칭된 SB 이미지가 도 6에 도시되어 있다. 각 샘플의 특징부는 보다 긴 대립유전자에 대한 반복 크기의 두 그룹, 즉 53 및 54-56 CGG, 70 및 71-75 CGG, 90 및 92-101 CGG, 및 107 및 109-125 CGG의 검출이었다 (각각 도 6a-d). FAM-표지된 프라이머를 이용한 증폭 및 절단 후, 각 모자이크 샘플 내에 단지 보다 짧은 CGG 반복 길이가 검출되었다. 크기 모자이크 교잡이 특징적인 여성 샘플의 Hpa II-처리된 FAM 채널에서 관찰되지 않았고 또한 필적하는 반복 길이의 11가지 시험 남성 불완전 돌연변이 대립유전자 중 임의의 대립유전자의 PCR 이후에 관찰되지 않았기 때문에, 이러한 패턴은 중합효소 "스터터링(stuttering)"의 부산물이 아닌 것으로 보인다. 각각의 경우에, 불완전 돌연변이 대립유전자의 보다 확장된 CGG 반복은 완전히 비메틸화되었다. 이러한 동일한 모자이크 교잡 및 편중 메틸화 패턴이 시험된 코호트(cohort) 내에서 84% (19 중에서 16) 여성 불완전 돌연변이 샘플에서 확인되었다. 이에 반해, SB의 분해 한계는 단지 하나의 검출가능한 불완전 돌연변이 밴드를 나타내었으며, 이에 따라 생물학적 디테일의 이러한 수준을 불명료하게 했다. 부가적으로, 관찰된 편중 모자이크 교잡은 메틸화된 HpaII 부위의 분석에 특이적이지 않았다. 구체적으로, mPCR 분석은 또한 HpaII 보다 EagI을 이용하여 실시되었다. 절단 믹스 B에서 EcoRI이 대조군 반응을 위해 사용되었다. EagI 분석은 약 -12.8 CGG 반복의 상대 체류 시간에서 이동하는 CGG 대조군을 이용했고, 플라스미드-계 40-CGG-대조군 대신에 PCR 앰플리콘으로부터 유래한 것이다. 부가적으로, EagI 인식 부위가 앰플리콘에 존재하도록 PCR 프라이머를 선택했다. 주형을 HpaII가 아닌 EagI로 처리했을 때 동일한 패턴이 관찰되었고, EagI 메틸화 부위의 평가를 가능하게 하는 mPCR 방법의 변형을 이용하여 분석하였다 (도 9; "Ref"는 HpaII 샘플에서 40-CGG-대조군 및 EagI 샘플에서 -12.8 GCC 대조군을 지칭한다).

mPCR 연구 과정은 고 부피의 샘플 분석을 지지할 수 있으며, 이는 작업자 당 최대 48 샘플을 가공처리하기 위해 단지 하루 및 대략 2시간의 총 수작업 시간(대부분이 자동화될 수 있음)을 필요로 한다. 부가적으로, mPCR은 단지 80 ng의 DNA의 투입을 요구한다 - SB와 비교하여 50배 내지 100배 감소, 및 비설파이트(Panagopoulos et al., Hum Mutat 14:71-9 (1999); Zhou et al., Clin Chem 52:1492-500 (2006); Dahl et al., Nucleic Acids Res 35:e144 (2007)) 또는 이전에 보고된 HpaII-매개된 PCR 방법(Carrel et al., Am J Med Genet 64:27-30 (1996); Kline et al., Fertil Steril 85:1488-95 (2006); Allen et al., Am J Hum Genet 51:1229-39 (1992))과 비교하여 10배 감소. 그 결과, 뉴런 세포, 예컨대 구강 또는 피부 세포와 외배엽 세포 계통을 공유하는 전혈에 대한 대안적인 샘플 타입이, 심지어 이들이 SB를 위해 충분한 DNA 수율을 제공하지 않더라도, mPCR 분석에 적용될 수 있다.

본 연구에서 평가된 mPCR 기술은 남성 및 여성 샘플 둘다에서 CGG 반복 길이의 스펙트럼에 대해 메틸화 상태를 검출하고 분해하는 PCR-계 방법론을 나타낸다. 전체적인 처리과정은 일상적인 시험 및 고처리량 스크리닝 적용을 따를 수 있다. 본 방법은 SB 분석에 대한 요구없이 포괄적인 FMR1 분석에 대한 토대를 제공한다.

실시예 6: 대체 메틸화 민감 효소를 이용한 mPCR

mPCR 방법의 다재능(versatility)을 입증하기 위해, 선택된 임상 샘플을 효소 EagI 및 NruI뿐만 아니라 HpaII를 사용하여 분석하였다. 실험은 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 절단 믹스 B에서 EagI 또는 NruI로 2시간 동안 처리된 샘플과 절단 믹스 B에서 2시간 동안 EcoRI로 처리된 대조군 샘플을 이용하여 실시되었다. EagI 실험을 위해 비-플라스미드 -12.8 CGG 표준을 사용하였고, 비-플라스미드 -41 CGG 표준은 NruI 샘플을 사용하였다. 앰플리콘이 적절한 효소에 대한 인식 부위를 함유하도록 EagI 및 NruI 실험을 위한 PCR 프라이머를 선택하였다. HpaII 실험을 실시예 4에 기재된 바와 같이 실시하였다. 표 6은 이들 실험의 결과를 비교한다. 다양한 효소를 이용한 결과는 비메틸화 대 메틸화 대립유전자 뿐만 아니라, 비메틸화, 부분 메틸화 및 완전 메틸화 대립유전자를 구별하였다.

실시예 7. HpaII 부위에서 메틸화를 평가하기 위해 "0 CGG " 참조 표준을 이 용하는 메틸화 PCR 분석 성능

코리엘 셀 레포지토리로부터의 6가지 샘플의 메틸화 상태를 생물학적 FMR1 대립유전자의 검출 범위 밖의 상대 체류 시간을 가진 0-CGG-대조군을 사용하여 평가하였다. 절단 믹스 C에서 HpaII 또는 Sau3A1 (대조군), 및 27 사이클 PCR을 이용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 실험을 실시하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 참조 표준의 선택은 2% 메틸화에서 정량적으로 메틸화에 이르는 메틸화 상태의 범위에 걸쳐 메틸화 데이터의 해석을 변경시키지 않았다. 결과는 실시예 4에 기재된 바와 같이 40-CGG-대조군을 사용하여 얻어진 결과와 비교되었다.

실시예 8. 대조군 뉴클레아제

본원에 기재된 방법은 큰 게놈 DNA를 FMR1 유전자좌의 증폭 영역 밖에서 개열시키고, 메틸화 민감 절단 반응에서의 것에 필적하여 PCR 증폭을 위해 비교적 선호적인 DNA 주형의 크기를 감소시키기 위해 대조군 반응에서 엔도뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다.

다수의 제한 효소 및 이들의 특이적 인식 부위가 익히 특징규명되어진다. 시험을 위해 총 14종의 시판용 제한 엔도뉴클레아제(Sau3A, EcoRI, NaeI, DpnI, HindIII-HF, NheI, TfiI, ApaLI, MluCI, NcoI, ScaI, StuI, XmnI 및 Hpy16611 포함)가 선택되었다.

본 방법에서 사용될 수 있는 제한 효소의 예는 Sau3A, EcoRI, NaeI, DpnI 및 HindIII-HF를 포함한다. Sau3A는 주형 상의 비-표적 부위의 개열의 관점에서 감소된 선택도를 나타내었다. EcoRI, NaeI, DpnI 및 HindIII-HF는 주형에서 비-표적 부위의 개열이 거의 또는 전혀 관측되지 않았다는 점에서 높은 선택도를 나타내었다 (즉, 서열번호: 40 및 41에 의해 결합된 FMR1 유전자좌의 영역).

실시예 9. 메틸화 상태를 특징규 명하기 위한 대안적인 처리과정

메틸화 상태를 특징규명하기 위한 대안적인 처리과정이 도 10에 도시되어 있다. 이러한 처리과정에서, 게놈 DNA 샘플은 절단 대조군 및 GC 참조 표준 (도면에서 CGG DNA 대조군으로 지칭됨)과 함께 미리 혼합된다. DNA 혼합물의 각 부분을 메틸화 민감 뉴클레아제 (HpaII) 또는 대조군 뉴클레아제 (HindIII-HF)로 처리한다. 이후, 절단된 DNA 혼합물에 대해 각각 FAM-표지된 프라이머 (HindIII-HF 반응) 또는 HEX-표지된 프라이머 (HpaII 반응)를 사용하여 PCR 증폭을 실시한다. 이후, PCR 생성물을 풀링하고 모세관 전기영동으로 분석한다.

절단 대조군과 GC 참조 표준 둘다 전기영동도의 초기 창에서 이동하고 샘플 특이적 프로파일에 저촉되지 않는다. HEX-표지된 PCR에서 절단 대조군으로부터 앰플리콘의 상실은 HpaII 절단의 효율을 나타낸다. GC 참조 표준은 FAM- 및 HEX-표지된 PCR 생성물 간의 신호 강도를 정규화하기 위해 사용된다. 제한 효소 절단 이전에 GC 참조 표준의 첨가는 각 반응에서 게놈 DNA의 양의 다양성(variability)을 정규화하기 위해 사용된다. 따라서, 각 대립유전자에 의한 메틸화의 백분율은 상응하는 반응으로부터 GC 참조 표준으로의 정규화 이후에 절단된 (HEX) 및 대조군 반응 (FAM) 간의 피크 높이의 비로서 결정된다.

실 시예 10. 대안적인 처리과정에서 세포주 DNA 의 mPCR 평가 및 SB 분석과의 비교

남성 및 여성 샘플 둘다로부터 정상, 불완전 돌연변이, 및 완전 돌연변이 대립유전자를 포함하는 4가지 시판용 세포주 DNA 주형 (Coriell Institute for Medical Research)에 대해 실시예 9의 대안적인 처리과정에 따른 mPCR을 평가하였다. 각 샘플을 서열번호: 50을 포함하는 절단 대조군 및 GC 참조 표준(여기서 A, B, 및 C 서열은 각각 서열번호 17, 48, 및 39를 포함)과 미리 혼합했다. 절단 대조군 및 GC 참조 표준의 첨가 후, 샘플을 두 부분으로 나누었다. 샘플의 일 부분에 대해 HpaII 절단을 실시한 반면, 나머지 부분에 대해서는 대조군 반응으로서 HindIII-HF 절단을 실시했다. 이후, 실시예 9에서와 같이 표지된 프라이머를 사용하여 두 부분 각각에 대해 25-27 사이클의 PCR 증폭을 실시하고, 생성물을 CE로 분석했다. 동일 세포주로부터의 DNA를 SB로 또한 분해했다. mPCR 및 SB로부터의 대립유전자 크기 및 메틸화 상태에 대한 결과가 표 9에 요약되어 있다. 4가지 샘플에 대한 전기영동도를 상응하는 SB 데이터와 함께 도 11a-11d에 도시하고 있다. 각 도면에서, 상부 패널은 대조군으로서 HindIII-HF로 처리된 샘플의 일부를 나타내고, 하부 패널은 HpaII로 절단된 동일 샘플을 나타낸다. 각 도면은 또한 mPCR로 측정한 메틸화 백분율을 포함한다.

각 샘플의 경우, mPCR 결과는 SB 데이터와 일관되게 일치했다. 예를 들어, 두 남성 완전 돌연변이 샘플(NA07862 및 NA06852)은 mPCR에 의해 ≥100% 메틸화를 가지는 것으로 측정되었으며, 이는 SB에서 대립유전자 >200CGG에 대한 메틸화 영역에서 만의 생성물의 존재와 일치했다.

부가적으로, mPCR은 복잡한 모자이크 교잡을 가진 샘플에서 대립유전자 특이적 메틸화 상태에 대한 보다 상세한 정보를 제공했다. 예를 들어, 2가지 모자이크 여성 샘플(NA06896, 23/96-140 및 NA20242, 30/73)은 SB에서 주 피크로 검출되었지만, 이들 샘플은 또한 mPCR로 분석한 경우 SB에서 가시화되지 않은 낮은 존재 피크를 나타내었다 (도 11c-11d). mPCR 데이터는 또한 SB 상의 메틸화 패턴에 각 대립유전자의 개개 기여도를 나타내었다. 예를 들어, NA06896는 완전 메틸화된 113 CGG 및 138 CGG 대립유전자와 143 내지 >200CGG의 비메틸화된 보다 큰 대립유전자가 검출되었으며(도 11c), 이는 SB에서 보고된 부분 메틸화된 FM과 일치한다.

실시예 11. 대안적인 처리과정에서 임상 DNA 시료를 이용한 mPCR 평가

임상적으로 관련된 대립유전자 크기 및 메틸화 상태의 범위를 나타내는 일 세트의 12종의 임상 시료를 사용하여 실시예 9에 따른 대안적인 처리과정에 따른 mPCR 분석을 추가로 평가하였다. 실시예 10에 기재된 바와 같이 실험을 실시하였다. mPCR로부터의 대립유전자 크기 및 메틸화 상태에 대한 결과 및 SB와의 비교가 표 10에 요약되어 있다. 표 10에서 *로 표시된 샘플의 전기영동도는 상응하는 SB 데이터와 함께 도 12a-12g에서 제공된다.

mPCR 결과는 SB 분석과 잘 일치했다. mPCR은 SB 보다 높은 분해능(resolution) 및 상이한 메틸화 상태의 보다 상세한 검출 및 해석을 제공했다. SB에 의해 분해되지 않은 몇몇 대립유전자는 mPCR에 의해 용이하게 구분이 되었다 (예컨대, 유사 크기의 두 대립유전자). 예를 들어, 샘플 #7은 30 및 31 CGG 대립유전자를 함유하는데, 이들은 SB에 의해서는 식별이 불가능했다. mPCR에서, 이들 두 대립유전자는 메틸화된 30 CGG 및 비메틸화된 31 CGG로 명확히 검출되었으며 (도 12f), 이에 따라 SB 분석에 의해 검출 불가능한 대립유전자 특이적 메틸화를 보여주었다.

14가지 임상 샘플에 대한 mPCR 및 SB 분석의 비교. *로 표시된 샘플은 도 2에 도시되어 있다. 100% 이상의 메틸화를 가진 모든 샘플은 "≥100"로서 분류 매김되었다.

샘플 정보		mPCR			SB 분석
샘플 ID	샘플 콜	절단 대조군(Dig Ctrl)의 절단%	mPCR 반복 길이	mPCR에서 메틸화 %	분류별 메틸화 (완전, 부분 또는 비)	SB에 의한 메틸화 추정치
#1*	FM	99%	80	3%	비	0%
			225	≥100%	완전	90%
			249	≥100%
			256	85%
			268	73%
			271	54%
#2*	FM	99%	94	7%	ND	ND
			209	≥100%	부분	60%
			257	0%
			272	1%
#3*	FM	99%	240	90%	부분	70%
			257	72%
			272	31%
#4*	PM	99%	23	28%	부분	30%
			72	77%	부분	60%
#5*	PM	99%	41	7%	비	10%
			96	≥100%	완전	90%
			101	≥100%
			114	≥100%
#6*	Nor	99%	30	76%	부분	50%
			31	9%
#7*	FM	99%	23	19%	부분	30%
			94	3%
			239	98%	완전	100%
			257	90%
			271	96%
#8	PM	100%	155	≥100%	N/A
			175	2%
#9	PM	99%	41	43%
			57	16%
#10	FM	99%	53	0%
			153	96%
			256	1%
			271	1%
#11	FM	99%	198	74%
			213	84%
			257	63%
			272	≥100%
#12	FM	98%	149	19%
			258	≥100%
			268	≥100%
			273	≥100%

* * *

본 발명의 다른 실시양태들은 본원에 기재된 명세서 및 본 발명의 실시를 고려하여 업계의 숙련인에게 분명해 질 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적으로 간주되며, 본 발명의 실제 범주 및 취지는 하기 청구범위에서 규정되는 것으로 의도된다. 방법에서 특정 순서로 수록된 단계들은 달리 명확히 지적하거나 또는 일 단계의 결과가 또 다른 단계를 위해 요구되는 경우를 제외하고는 단계들이 반드시 그러한 순서로 진행되어져야 하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 예를 들어, "샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소와 접촉시키는 단계"와 "GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계"는 어느 하나의 단계가 나머지 단계로부터의 결과를 요구하지 않기 때문에 임의의 순서로 실시될 수 있다. 한편, "각각 GC 참조 표준을 함유하는 샘플의 제1 및 제2 부분에 대해 DNA 증폭 반응을 실시하는 단계"는 "GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계" 이후에 이루어지는데 그 이유는 전자의 단계가 첨가 단계의 결과인 샘플의 부분들에서 GC 참조 표준의 존재를 요구하기 때문이다.

본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체로 본원에서 참고적으로 인용된다. 참고적으로 인용되는 공보 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 본 발명과 모순되는 경우에는 본 명세서가 임의의 모순되는 자료를 대체할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> LATHAM, Gary J. CHEN, Liangjing HADD, Andrew SAH, Sachin CAO, Ru <120> mPCR Methods for Analyzing Repeat Sequences <130> 10256.0037-00000 <150> US 61/408,367 <151> 2010-10-29 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 cggtggaggg ccgcctctga gc 22 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 caggcgctca gctccgtttc ggttt 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 cagtcaggcg ctcagctccg tttcg 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 tccggtggag ggccgcctct gagc 24 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 ggttcggcct cagtcaggcg ctcagctccg tttcg 35 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 gggttcggcc tcagtcaggc gctcagctcc gtttcg 36 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 cacttccggt ggagggccgc ctctga 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 ttccggtgga gggccgcctc tgagc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 gcgctcagct ccgtttcggt 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 cacctctcgg gggcgggctc c 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 acctctcggg ggcgggctcc c 21 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 atggaggagc tggtggtgga agtgcg 26 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 cacctctcgg gggcgggctc ccg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 acctctcggg ggcgggctcc cgg 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 cacctctcgg gggcgggctc ccgg 24 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 cacctctcgg gggcgggctc ccggcg 26 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 acctctcggg ggcgggctcc cggcgc 26 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 acctctcggg ggcgggctcc cggcg 25 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 tggtggaagt gcggggctcc aatggcgc 28 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 tggaagtgcg gggctccaat ggcgc 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 ggaagtgcgg ggctccaatg gcgct 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 gtggaagtgc ggggctccaa tggcg 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 tggtggtgga agtgcggggc tccaa 25 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 gaggagctgg tggtggaagt gcggggct 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 aggagctggt ggtggaagtg cggggctc 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 ctggtggtgg aagtgcgggg ctccaatg 28 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 agatggagga gctggtggtg gaagtgcggg 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 ggaagtgcgg ggctccaatg gcgctttcta 30 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 ggaagtgcgg ggctccaatg gcgctt 26 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 tggaggagct 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gtgcggggct ccaatggcgc tttctacaag 120 gtacttggct ctagggcagg ccccatcttc gcccttcctt ccctcccttt tcttcttggt 180 gtcggcggga ggcaggcccg gggccctctt cccgagcacc gcgcctgggt gccagggcac 240 gctcggcggg atgttgttgg gagggaagga ctggacttgg ggcctgttgg aagcccctct 300 ccgactccga gaggccctag cgcctatcga aatgagagac cagcgaggag agggttctct 360 ttcggcgccg agccccgccg gggtgagctg gggatgggcg agggccggcg gcaggtacta 420 gagccgggcg ggaagggccg aaatcggcgc taagtgacgg cgatggctta ttcccccttt 480 cctaaacatc atctcccagc 500 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 tcaggcgctc agctccgttt cggtttca 28 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 aagcgccatt ggagccccgc acttcc 26 <210> 44 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 aagcttcagc gggccggggg ttcggcctca gtcaggcgct cagctccgtt tcggtttcac 60 ttcccgtgga gggccgcctc tgagcgggcg gcgggccgac ggcgagcgcg ggcggcggcg 120 gtgacggagg cgccgctgcc agggggcgtg cggcagcgcg gcggcggcgg cggcggcggt 180 ggcgacggag gcggcggcgg cgtcggcggc ggcagcggag gcggcggcgg cggcggcggc 240 ggcggcggct gggcctcgtg cgcccgcagc ccacctcttg ggggcggtct ccccgcgcta 300 gcagggctga agagaagaca gtgttcattc atcgccatca gctgcagctg gaggagctgg 360 tggtggaagt gcggggctcc aatggcgctt tctaggatcc 400 <210> 45 <211> 248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 gaattctcag gcgctcagct ccgtttcggt ttcacgctgc cagggggcgt gcggcagcgc 60 ggcggcggag gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggtg gaggcggcgg cggcggcggc 120 ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcgga 180 ggcggcggcg gctgggcctc gagcgcccgc agcccaggaa gtgcggggct ccaatggcgc 240 ttgtcgac 248 <210> 46 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 tcaggcgctc agctccgttt cggtttcact tccggtggag ggccgcctct gagcgggcgg 60 cgggccgacg gcgagcgcgg gcggcggcgg tgacggaggc gccgctgcca gggggcgtgc 120 ggcagcg 127 <210> 47 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 ctgggcctcg agcgcccgca gcccacctct cgggggcggg ctcccggcgc tagcagggct 60 gaagagaaga tggaggagct ggtggtggaa gtgcggggct ccaatggcgc tt 112 <210> 48 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 cggcggcgga ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggt ggaggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gaggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 aggcggcggc gg 132 <210> 49 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 cggcggcgga ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggaggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gaggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 aggcggcggc gg 132 <210> 50 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 tcaggcgctc agctccgttt cggtttcacg gtgacggagg cgccgctgcc cgggggcgtg 60 cggcagcgcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc 120 ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggctg ggcctcgagc 180 gcccgcagcc caggaagtgg aagtgcgggg ctccaatggc gct 223

Claims

a) 샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소(DNase)와 접촉시키는 단계;
b) 75% 이상의 GC 풍부도(GC-richness)를 갖는 GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계;
c) 각각 GC 참조 표준을 함유하는 샘플의 제1 부분과 제2 부분에 대해 DNA 증폭 반응을 실시하는 단계로서, 각 부분에서 증폭된 DNA가 상이한 표지(label)로 표시되는 것인 단계; 및
d) 샘플의 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 DNA를 분석하여 FMR 유전자좌의 메틸화 상태를 특징규명하는 단계
를 포함하는, DNA 샘플에서 FMR 유전자좌를 특징규명하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)는 모세관 전기영동(CE)을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, GC 참조 표준은 메틸화 민감 DNA 분해효소에 대한 인식 부위가 없는 것인 방법.
제2항에 있어서, 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 DNA를 단일 CE 실행으로 분석하는 것인 방법.
제2항에 있어서, GC 참조 표준은 천연 발생 FMR 대립유전자와 중첩되지 않는 CE 이동 시간을 가지는 것인 방법.
제2항에 있어서, GC 참조 표준은 약 20 미만, 약 24 내지 27, 또는 약 32 초과 CGG 반복의 상대 체류 시간(relative retention time)을 가지는 것인 방법.
제2항에 있어서, GC 참조 표준은 약 3 미만 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가지는 것인 방법.
제2항에 있어서, GC 참조 표준은 약 175 내지 약 225 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 메틸화 민감 DNA 분해효소는 Hpa II, Eag I, 또는 Nru I로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 증폭 반응은 200회 이상의 CGG 반복을 증폭시킬 수 있는 것인 방법.
제10항에 있어서, 증폭 반응은 GC/AT 비가 1을 초과하는 dNTP 혼합물을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, GC/AT 비가 약 2.5 내지 약 10인 방법.
제1항에 있어서, FMR 유전자좌는 FMR1 유전자좌인 방법.
제1항에 있어서, GC 참조 표준은 제1 부분을 DNA 분해효소와 접촉시킨 후 샘플에 첨가되는 것인 방법.
제1항에 있어서, GC 참조 표준은 제1 부분을 DNA 분해효소와 접촉시키기 이전에 샘플에 첨가되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 샘플의 제2 부분을 대조군 효소와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 대조군 효소는 EcoRI 및 Sau3A1로부터 선택되는 것인 방법.
제16항에 있어서, GC 참조 표준은 제1 부분을 DNA 분해효소와 접촉시키기 이전에 샘플에 첨가되고 대조군 효소는 HindIII-HF, EcoRI, DpnI, 및 NaeI로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소와 접촉시키기 이전에 절단 대조군(digestion control)을 샘플에 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 절단 대조군은 약 3 미만 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가지고, GC 참조 표준은 약 3 미만 CGG 반복의 상대 체류 시간을 가지며, 절단 대조군 증폭 생성물과 참조 표준의 상대 체류 시간이 약 4 CGG 반복 이상 만큼 차이가 있는 것인 방법.
a) 샘플의 제1 부분을 메틸화 민감 DNA 분해효소와 접촉시키는 단계;
b) 75% 이상의 GC 풍부도를 가진 GC 참조 표준을 샘플에 첨가하는 단계;
c) 샘플의 제1 부분과 제2 부분에 대해 DNA 증폭 반응을 실시하는 단계로서, 각 부분에서 증폭된 DNA가 상이한 표지로 표시되는 것인 단계; 및
d) 샘플의 제1 및 제2 부분으로부터 증폭된 DNA를 분석하여 취약 X 증후군(Fragile X Syndrome), 취약 X 관련 진전 운동실조 증후군, 및/또는 취약 X 관련 원발성 난소 부전과 연관된 유전자형을 검출하는 단계
를 포함하는, 인간 DNA 샘플을 분석하는 방법.
하기 식의 핵산 서열을 포함하는 GC 참조 표준:
5'-A-B-C-3'
상기 식에서
A는 서열번호: 40의 10개 이상의 연속(consecutive) 뉴클레오티드를 포함하는 서열이고 게놈 FMR1 5' 비번역 영역에 특이적으로 혼성화될 수 있으며;
C는 서열번호: 41의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열이고 게놈 FMR1 5' 비번역 영역에 특이적으로 혼성화될 수 있으며;
B는 75% 이상의 GC 풍부도를 가진 서열이고, 길이가 X-300 내지 X+10 뉴클레오티드이며, 여기서 X는 하기 a) 및 b)의 합이다:
a) A의 3' 말단과 서열번호: 40의 마지막 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 개수; 및
b) 서열번호: 41의 첫번째 뉴클레오티드로부터 C의 5' 말단까지의 뉴클레오티드의 개수.
제22항에 있어서, B는 길이가 150 내지 200 뉴클레오티드인 GC 참조 표준.
제23항에 있어서, B는 90% 이상의 GC 풍부도를 가지는 것인 GC 참조 표준.
제23항에 있어서, B는 94% 이상의 GC 풍부도를 가지는 것인 GC 참조 표준.
제22항에 있어서, A는 GCGCTCAGCTCCGTTTCGGT (서열번호: 17)을 포함하는 것인 GC 참조 표준.
제22항에 있어서, C는 AGTGCGGGGCTCCAATGGCG (서열번호: 39)를 포함하는 것인 GC 참조 표준.
제22항에 있어서, B는 서열번호: 48의 100개 이상의 뉴클레오티드 또는 서열번호: 49의 100개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 GC 참조 표준.