BR112013010585B1 - método de caracterização de um locus de fmr1 ou um locus de frm2 em uma amostra de dna e método de análise de um locus fmr1 ou um locus fmr2 de uma amostra de dna humana - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DE LOCUS DE RETARDADO MENTAL DO X FRÁGIL (FMR) EM DNA POR PADRÃO DE REFERÊNCIA GC ANÁLISE DE DNA. A presente invenção refere-se a métodos para determinação do estado de metilação de ricos em GC. Os métodos incluem uso de padrões de referência GC que permitem caracterização simultânea de estado de metilação e comprimento de repetição de CGC. Os métodos são úteis para detecção de genótipos associados com repetições ricas em GC, incluindo Síndrome do X Frágil.

Description

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa¬ tente Provisório U.S. No. 61/408.367 depositado em 29 de outubro de 2010, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0002] O trabalho descrito no presente pedido foi parcialmente pa¬ trocinado pelo Governo federal sob as Concessões Nos. R43HD060450 e R44HD060450 da Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development. Desta maneira, o Go¬verno federal tem certos direitos na invenção.

[0003] A presente invenção está no campo de análise de ácido nucleico, particularmente com relação a métodos para determinação do estado de metilação de moldes e produtos ricos em GC. Ainda, a invenção se refere a padrões de referência de GC que pode ser usa¬dos de acordo com os métodos descritos aqui.

[0004] Em certas modalidades, os métodos descritos aqui são usa¬ dos para determinar o estado de metilação de um locus rico em GC. Em algumas circunstâncias, expansão de regiões ricas em GC está associa¬da com vários estados de doença. Um exemplo de um locus associado com a expansão de repetições de CGG é a região não traduzida 5’ (UTR) do gene do Retardo Mental do X Frágil-1 (FMR1) (Fragile X Mental Retardation-1) no cromossomo X. A expansão nesta região para mais de 200 repetições CGG está associada com hipermetilação do gene FMR1 e é referida como alelos "de mutação integral". Esses alelos estão asso¬ciados com a perda de produção de proteína FMR1 e o distúrbio da Sín- drome do X Frágil (FXS) (Fragile X Syndrome). FXS pode incluir retardo mental, autismo, falência ovariana prematura e outras condições cogniti- vas e comportamentais (J. Mol. Diag. 10(6): 496-501 (2008)).

[0005] Métodos para determinação do estado de metilação de moldes ricos em GC, e de FMR1, incluem estratégias de análise Southern blot (SB) e reação em cadeia da polimerase (PCR) (Polyme¬rase Chain Reaction). Análise SB provê uma medida bruta do tamanho de regiões de repetição triplas e uma avaliação de metilação. Uma en¬zima sensível à metilação, que não cliva sítios metilados, pode ser usada para distinguir entre alelos metilados e não metilados. No entan¬to, a determinação de estado de metilação através de análise SB é limitada a alelos que são bem resolvidos por eletroforese em gel. Aná¬lise SB é também limitada pela quantidade de material de DNA genô- mico (gDNA) que é requerido e um fluxo de trabalho tedioso que é in¬compatível com procedimentos de alto rendimento (Gene. Med. 7(8): 584-587 (2005).

[0006] Estratégias de PCR podem prover maior precisão na de¬ terminação do tamanho de regiões de repetição em tripleto. No entan¬to, limitações na amplificação de sequências ricas em GC longas, in¬cluindo alelos de mutação integral da UTR 5’ de FMR1, restringiram a quantificação de regiões de repetição. Otimizações para a PCR de FMR1, por exemplo, foram tentadas, e incluem modificações para condições de ensaio de PCR convencionais. (Vide Genome Res. 6(7): 633-8 (1996); J. Mol. Diagn. 8: 544-550 (2006); e Am. J. Med. Genet. 51(4): 527-34 (1994)). Mais recentemente, uma técnica de PCR foi de¬senvolvida que permite amplificação confiável de mais de 200 repeti¬ções CGG. Vide Pedido de Patente U.S. No. 2010/0209970, incorpo¬rado aqui a título de referência em sua totalidade. No entanto, PCR sozinha não permite a caracterização de estado de metilação de um molde rico em GC.

[0007] Várias estratégias combinam PCR com outros métodos pa¬ ra avaliação de metilação. A maioria dos métodos explorou a resistên- cia de 5-metilcitosina à conversão por bissulfeto para revelar estado de metilação. No entanto, para FMR1, por exemplo, métodos de PCR de metilação baseados em bissulfeto foram praticamente limitados a ava¬liações de amostras masculinas apenas, devido aos estados de meti- lação mistos que confundem interpretações de amostras femininas, e/ou os métodos demonstraram utilização limitada para alelos expan¬didos. (Vide Hum. Mutation 14: 71-79 (1999); Clin. Chem. 52: 1492¬1500 (2006); J. Med. Genet. 41: 1-8 (2004); e Hum. Genet. 108: 450¬458 (2001)). Alternativas para tratamento com bissulfeto, tal como o uso de enzimas de restrição sensíveis à metilação, foram relatadas, no entanto, análise de amostras femininas permanece problemática. (J. Mol. Diag. 10(6): 496-501 (2008)).

[0008] Até agora, nenhuma abordagem que não SB demonstrou avaliações de metilação precisas para alelos expandidos em ambas as amostras masculina e feminina. Desta maneira, permanece a necessi¬dade de um ensaio rápido, preciso, com um fluxo de trabalho simples que possa ser usado para caracterizar o estado de metilação e repeti¬ção de um locus rico em GC.

[0009] Os métodos descritos aqui se referem a uma tecnologia baseada em PCR que pode detectar e resolver estado de metilação através do espectro de comprimentos de repetição ricos em GC em ambas as amostras masculina e feminina. O fluxo de trabalho geral é condescendente a teste de rotina e aplicações de avaliação de alto rendimento, e provê a base para análises de FMR1 compreensivas sem a necessidade de análise SB.

[00010] Em uma modalidade, os métodos se referem à caracteriza¬ção de um locus de FMR em uma amostra de DNA compreendendo as etapas de: a) contato de uma primeira porção da amostra com uma DNase sensível à metilação; b) adição de um padrão de referência de GC à amostra, onde o padrão de referência tem pelo menos 75% de riqueza de GC; c) submissão da primeira porção e uma segunda porção da amostra, cada uma contendo o padrão de referência de GC, a uma reação de amplificação de DNA, onde o DNA amplificado em cada porção é marcado com um marcador diferente; e d) análise do DNA amplificado das primeira e segunda por¬ções da amostra, desta maneira caracterizando o estado de metilação do locus de FMR.

[00011] Em certas modalidades, a etapa (d) compreende eletrofore¬se capilar (CE) (Capillary Electrophoresis). Em modalidades adicio¬nais, o DNA amplificado das primeira e segunda porções é analisado em uma rodada de CE única. Em alguns métodos, o padrão de refe¬rência de GC é destituído de sítios de reconhecimento para a DNase sensível à metilação. Em certos métodos, o padrão de referência de GC tem um tempo de migração de CE que não sobrepõe a um alelo de FMR de ocorrência natural. Por exemplo, o padrão de referência de GC pode ter um tempo de retenção relativo de menos do que cerca de 20, cerca de 24 a 27 ou mais do que cerca de 32 repetições CGG. Em exemplos adicionais, o padrão de referência de GC tem um tempo de retenção relativo de cerca de 175 a cerca de 225 repetições CGG. Em algumas modalidades, o padrão de referência de GC é adicionado à amostra após contato da primeira porção com a DNase.

[00012] Em outras modalidades, a reação de amplificação é capaz de amplificar pelo menos 200 repetições CGG. Certas reações de am¬plificação compreendem uma mistura de dNTP com uma razão GC/AT maior do que 1, tal como de a partir de cerca de 2,5 a cerca de 10. Em certos métodos, o locus de FMR é FMR1. Em algumas métodos, a DNase sensível à metilação é escolhida de Hpa II, Eag I ou Nru I.

[00013] Em modalidades adicionais, a segunda porção da amostra é contatada com uma enzima controle. Em alguns casos, a enzima controle é escolhida de EcoRI e Sau3A1. Em outros casos, a enzima controle é escolhida de EcoRI, DpnI, Nael e HindIII-HF.

[00014] Certas modalidades descritas aqui se referem a um método de análise de uma amostra de DNA humano compreendendo as eta¬pas de: a) contato de uma primeira porção da amostra com uma DNase sensível à metilação; b) adição de um padrão de referência de GC à amostra, onde o padrão de referência tem pelo menos 75% de riqueza de GC. c) submissão da primeira porção e de uma segunda porção da amostra à reação de amplificação de DNA, onde o DNA amplificado em cada porção é marcado com um marcador diferente; e d) análise do DNA amplificado das primeira e segunda por¬ções da amostra, desta maneira detectando um genótipo associado com FXS, síndrome do tremor ataxia associado ao X Frágil e/ou insufi¬ciência ovariana primária associada ao X Frágil.

[00015] Certas modalidades descritas aqui se referem a um padrão de referência de GC compreendendo uma sequência de ácido nucleico da fórmula: 5’-A-B-C-3’, onde A é uma sequência compreendendo pelo menos 10 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO:40, onde A é ca¬paz de hibridizar especificamente para uma região não traduzida 5’ de FMR1; C é uma sequência compreendendo pelo menos 10 nucleotí- deos consecutivos de SEQ ID NO:41, onde C é capaz de hibridizar especificamente para uma região não traduzida 5’ de FMR1; e B é uma sequência tendo pelo menos 75% de riqueza de GC e está entre X-300 e X+10 nucleotídeos de comprimento. X é a soma de a) o nú¬mero de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de A e o último nucleotí- deo de SEQ ID NO:49; e b) o número de nucleotídeos do primeiro nu- cleotídeo de SEQ ID NO:41 para a extremidade 5’ de C.

[00016] Em certas modalidades, B está entre 150 e 200 nucleotí- deos de comprimento. Em modalidades adicionais, B tem pelo menos 90% de riqueza de GC. Em modalidades adicionais, B tem pelo menos 94% de riqueza de GC. Em uma modalidade, A compreende GCGCT- CAGCTCCGTTTCGGT (SEQ ID NO:17). Em uma modalidade adicio¬nal, C compreende AGTGCGGGGCTCCAATGGCG (SEQ ID NO:39).

[00017] Deve ser compreendido que ambas a descrição geral e a descrição detalhada que seguem são exemplares e explicativas ape¬nas e não restritivas da invenção, conforme reivindicado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00018] A Figura 1 provê um exemplo do fluxo de trabalho de pro¬cedimento para determinação do estado de metilação de alelos ricos em GC onde Hpall é usada como a DNase sensível à metilação.

[00019] A Figura 2 mostra um exemplo de um padrão de referência de GC projetado para migrar em um tempo de retenção relativo que não sobrepõe um locus rico em GC de FMR1 de ocorrência natural.

[00020] A Figura 3A mostra eletroferogramas de padrões de DNA metilado com frações conhecidas de metilação de FMR1. Cada traço inclui o perfil do padrão de DNA na base de um alelo de mutação inte¬gral do DNA da linhagem celular (~645 CGG).

[00021] A Figura 3B mostra um gráfico do ajuste linear de padrões de DNA metilado de registro conhecidos versus metilação percentual detectada. Quantificação do alelo 645 CGG integralmente metilado, de base, é superposta (Média = 104±5).

[00022] As Figuras 4A-D mostram eletroferogramas capilares de 4 amostras de linhagem celular submetidas à mPCR, com dados de SB compatíveis.

[00023] As Figuras 5A-D mostram eletroferogramas capilares de 4 amostras clínicas representativas com alelos de mutação integral, com dados de SB compatíveis.

[00024] As Figuras 6A-D mostram eletroferogramas capilares de 4 amostras de permutação femininas clínicas, com dados SB compatí¬veis.

[00025] A Figura 7 mostra titulação de uma fração de massa 1% de um alelo de mutação integral clínica em uma base de um alelo 31 CGG normal em ambos os canais HEX e FAM.

[00026] A Figura 8 mostra titulação de uma fração de massa 10% de uma amostra de mutação integral integralmente metilada (No. 8) na base de uma fração de massa 90% de uma amostra de mutação inte¬gral integralmente não metilada (No.125).

[00027] A Figura 9 mostra uma comparação de amostras clínicas analisadas usando Eagl ou HpaII.

[00028] A Figura 10 mostra um fluxo de trabalho de procedimento alternativo para determinação do estão de metilação de alelos ricos em GC e um controle de digestão e controle de DNA de CGG (padrão de referência CGG) são adicionados à amostra antes da divisão da amostra em duas porções e condução de reações de digestão, em uma das quais HpaII é usada como a DNase sensível à metilação.

[00029] As Figuras 11A-D mostram eletroferogramas capilares re-presentativos de 4 amostras de DNA de linhagem celular submetidas a um ensaio de mPCR de acordo com o fluxo de trabalho alternativo da Figura 10, com dados comparativos de uma análise Southern blot pa¬ralela. São providos em caixas abaixo dos picos tempo de retenção bruto (primeira fileira), identidade de pico (segunda fileira) e intensida¬de de pico (terceira fileira). As intensidades de pico são expressas co¬mo fluorescência máxima em unidades de fluorescência arbitrárias. Abreviações de identidade de pico são como segue: DIG.C = controle de digestão; REF = padrão de referência de GC; FM = alelo de muta¬ção integral; PM = alelo de pré-mutação; NOR = alelo normal.

[00030] As Figuras 12A-G mostram eletroferogramas capilares re- presentativos de 7 espécimes clínicos submetidos a um ensaio de mPCR de acordo com o fluxo de trabalho alternativo da Figura 10, com dados comparativos de uma análise Southern blot paralela. Caixas abaixo dos picos proveem informação como nas Figuras 11A-D.

MODALIDADES EXEMPLARES

[00031] Em certos aspectos, a invenção provê métodos para carac¬terização do estado de metilação de moldes de ácido nucleico ricos em GC. Em modalidades exemplares, os métodos envolvem tratamen¬to com uma DNase sensível à metilação em combinação com PCR na presença de um padrão de referência de GC. Os métodos descritos aqui podem ser referidos como métodos de "mPCR".

[00032] Para auxiliar na compreensão da presente invenção, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são providas ao longo do pedido.

[00033] O uso das palavras "um", "uma" e "o", "a" quando em con¬junto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relató¬rio pode significar "um", mas está também de acordo com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um".

[00034] "Razão de GC/AT" significa a razão da concentração da soma de dCTP, dGTP, e todos os seus análogos de nucleotídeo, para a concentração da soma de dTAP, dTTP, dUTP, e todos os seus aná¬logos de nucleotídeo, em uma dada solução ou mistura.

[00035] "dNTP" significa trifosfato de desoxinucleotídeo e se refere a dATP, dCTP, cGTP, dTTP, dUTP e seus análogos.

[00036] "Análogos de nucleotídeo" são moléculas ou íons compre¬endendo uma porção de base outra que não as bases naturais adeni- na (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) ou uracila (U), uma porção açúcar idêntica ou similar à desoxirribose, e pelo menos uma porção fosfato ou fosfato múltiplo (por exemplo, difosfato ou trifosfato). O aná¬logo de nucleotídeo é um análogo de um nucleotídeo específico, em particular dATP, dCTP, dGTP, dTTP ou dUTP, quando ele compreen¬de um trifosfato ou uma porção açúcar, a estrutura e a configuração de ambos são adequadas para incorporação a uma hélice dupla de ácido nucleico por uma polimerase, e uma base cujas propriedades de em- parelhamento de base em uma hélice dupla de ácido nucleico e loci de incorporação pela polimerase de DNA em uma hélice dupla de ácido nucleico são mais similares a um dos cinco nucleotídeos anteriormente listados, com a exceção que análogos de dTTP serão geralmente também análogos de dUTP e vice versa.

[00037] "Riqueza de GC" é a fração ou porcentagem de resíduos de nucleobase totais em um ácido nucleico que são resíduos guanina, resíduos citosina ou análogos dos mesmos. Por exemplo, um ácido nucleico de 100 nt que contém exatamente 30 citosinas, exatamente 30 guaninas, exatamente um análogo de citosina e exatamente um análogo de guanina tem uma riqueza de GC de 62%. Em algumas modalidades, um molde rico em GC pode conter pelo menos 51, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5% de resíduos guanina, resíduos citosina ou seus análogos.

I. MÉTODOS PARA CARACTERIZAÇÃO DE ESTADO DE METILA- ÇÃO

[00038] Em certas modalidades, a invenção se refere a métodos de caracterização do estado de metilação de um molde de ácido nucleico rico em GC. Em geral, os métodos incluem as etapas de contato de uma primeira porção de uma amostra com uma DNase sensível à me- tilação, adição de um padrão de referência de GC à amostra, submis¬são da primeira porção e uma segunda porção da amostra a uma rea¬ção de amplificação de ácido nucleico e análise dos ácidos nucleicos amplificados das primeira e segunda porções da amostra. Em algumas modalidades, a primeira porção e a segunda porção são diferentemen¬te marcadas.

[00039] Em modalidades adicionais, a segunda porção é contatada com uma enzima controle antes da amplificação, onde a enzima con¬trole não cliva a sequência amplificada. A enzima controle pode ser escolhida de, por exemplo, EcoRI, DpnI, Nael e HindIII-HF. Possibili¬dades adicionais incluem Sau3A, Nhel, Tfil, ApaLl, MluCl, Ncol, Scal, Stul, Xmnl e Hpy 16611. Em algumas modalidades, a enzima controle é escolhida de uma endonuclease de restrição com um sítio de reco¬nhecimento que não ocorre dentro da região que é amplificada pela reação de amplificação de DNA. Em algumas modalidades, a enzima controle é escolhida de enzimas que exibem pouca, se alguma, cliva-gem não específica (atividade de estrela) em sítios não alvo dentro da região que é amplificada pela reação de amplificação de DNA, tal co¬mo menos do que 20%, 15%, 10%, 5%, 3% ou 1% de clivagem de sí¬tios não alvo dentro da região que é amplificada pela reação de ampli¬ficação de DNA. A extensão da clivagem é expressa em termos da fração de moléculas sofrendo pelo menos um evento de clivagem den¬tro da região que é amplificada pela reação de amplificação de DNA.

[00040] Em modalidades adicionais, a análise das primeira e se¬gunda porções é realizada em um ensaio único.

[00041] As Figuras 1 e 10 mostram diagramas mostrando ensaios exemplares de acordo com os métodos da invenção.

[00042] Em certas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser usados para detectar genótipos associados à FXS, síndrome do tremor ataxia associado ao X Frágil e insuficiência ovariana primária associada ao X Frágil. Loci genéticos associados com essas condi¬ções são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, FMR1, FMR1, a UTR 5’ de FMR1, a UTR 5’ de FMR2, as repetições CGG dentro da UTR 5’ de FMR1 e as repetições CCG dentro da UTR 5’ de FMR2. Conforme aqui usado, o termo "locus de FMR" se refere a um locus de FMR1 ou um locus de FMR2. Em uma modalidade adicional, os métodos podem ser usados para detectar genótipos associados com distúrbios de repetição de trinucleotídeo rico em GC, tais como FXS, síndrome do tremor ataxia associado ao X Frágil, e insuficiência ovariana primária associado ao X Frágil, distrofia miotônica, doença de Huntington, atrofia muscular espinobulbar, atrofia Dentatorrubropalido- lusiana e/ou ataxia espinocerebelar. Loci genéticos associados com essas condições são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, FMR1, FMR2, DMPK, ZNF9, HTT, AR, ATN1, ATXN1-3, ATXN7, ATXN10, CACNA1A, SCA8, PPP2R2B e TBP. Vide, por exemplo, Nat. Genet. 1996 maio; 13(1):105-8; Nat. Genet. 1996 maio;13(1):109-13. Hiperexpansão e/ou hipermetilação das regiões ricas em GC nesses loci estão associadas com as doenças.

A. PADRÃO DE REFERÊNCIA DE GC

[00043] Em alguns aspectos, a invenção se refere a um padrão de referência de GC que pode ser usado de acordo com os métodos des¬critos aqui. Os padrões de referência de GC dos métodos descritos aqui são padrões de referência externos, e são projetados para serem coamplificados com os loci de FMR. Em algumas modalidades, os pa¬drões de referência de GC podem ser usados para avaliar o número de repetições CGG presentes em um locus genético, tal como um lo¬cus rico em GC presente próximo do gene de FMR1. Em modalidades exemplares, o padrão de referência de GC é projetado de maneira que ele tenha um tempo de retenção relativo desejado por CE.

[00044] Conforme aqui usado, o termo "tempo de retenção relativo" se refere à quantidade de tempo que leva para um produto amplificado do padrão de referência de GC migrar através de um capilar em CE, comparado com o tempo de migração dos outros produtos amplifica¬dos de um dado comprimento e/ou riqueza de GC. Em certas modali¬dades, o tempo de retenção relativo de um padrão de referência de GC é comparado com sequências contendo números conhecidos de repetições CGG. Em alguns casos, o padrão de referência de GC é usado para determinar o número de repetições CGG em um locus de MFR de um indivíduo humano. Em certas modalidades, o tempo de retenção relativo de um padrão de referência de GC é comparado com um locus genético usando os mesmos primers para amplificação. Em algumas modalidades, o padrão de referência de GC tem um tempo de retenção relativo em um ensaio de CE de maneira que ele não sobre¬põe um alelo de FMR1 de ocorrência natural. Por exemplo, em um en¬saio para determinar o estado de metilação e o número de repetições CGG em um locus de FMR1, um padrão de referência de GC que tem um tempo de retenção relativo de zero repetições CGG comparado com alelos genômicos de ocorrência natural contendo repetições CGG pode ser incluído. Outra modalidade inclui um padrão de referência de GC que tem um tempo de retenção relativo de cerca de 40 repetições CGG. Em modalidades adicionais, o padrão de referência GC tem um tempo de retenção relativo de menos do que cerca de 20, cerca de 24 a cerca de 27 ou mais do que cerca de 32 repetições CGG comparado com amostras genômicas.

[00045] Padrões de referência de GC exemplares contêm sequên¬cias tendo a fórmula: 5’-A-B-C-3’

[00046] onde A a C representam sequências reconhecidas por pri¬mers de PCR avançado e reverso e B é uma sequência rica em GC. Em geral, o padrão de referência de GC tem uma riqueza de GC de pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96, 98 ou 99 por cent. A sequência A pode ser escolhida de uma sequência ge- nômica a montante de uma região de repetição rica em GC ou de CGG e a sequência C pode ser escolhida de uma sequência genômica a jusante de tal região. Durante a reação de amplificação, essas se¬quências ou seus complementos podem ser usados como sítios de reconhecimento de primer, de maneira que o padrão de referência é amplificado usando os mesmos primers que a sequência alvo.

[00047] Em certas modalidades, as sequências A e C são escolhi¬das da 5’-UTR de FMR1 a montante ou a jusante da região rica em GC, respectivamente. As sequências de A e C, ou seus complemen¬tos, podem ser usados como primers para a reação de amplificação. Exemplos de sequência A incluem: CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (SEQ ID NO: 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T (SEQ ID NO: 2), CAG TCA GGC GOT CAG CTC CGT TTC G (SEQ ID NO: 3), TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC (SEQ ID NO: 4), GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG (SEQ ID NO: 5), GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG (SEQ ID NO: 6), GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA (SEQ ID NO; 7), CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G (SEQ ID NO: 8), GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A (SEQ ID NO: 9), GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G (SEQ ID NO: 10), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA (SEQ ID NO: 11), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG (SEQ ID NO: 12), GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC (SEQ ID NO: 13), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (SEQ ID NO: 14), CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA (SEQ ID NO: 15), TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (SEQ ID NO: 16), α e GCG CTC AGC TCC GTT TCG GT (SEQ ID NO: 17).

[00048] Exemplos de sequência C incluem: CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC (SEQ ID NO: 18), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC (SEQ ID NO: 19), ATG GAG GAG CTG GTG GTG GAA GTG CG (SEQ ID NO: 20), CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC CG (SEQ ID NO: 21), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC GG (SEQ ID NO: 22), CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC CGG (SEQ ID NO: 23), CAC CTC TCG GGG GCG GGC TCC CGG CG (SEQ ID NO: 24), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC GGC GC (SEQ ID NO: 25), ACC TCT CGG GGG CGG GCT CCC GGC G (SEQ ID NO: 26), TGG TGG AAG TGC GGG GCT CCA ATG GCG C (SEQ ID NO: 27), TGG AAG TGC GGG GCT CCA ATG GCG C (SEQ ID NO: 28), GGA AGT GCG GGG CTC CAA TGG CGC T (SEQ ID NO: 29), GTG GAA GTG CGG GGC TCC AAT GGC G (SEQ ID NO: 30), TGG TGG TGG AAG TGC GGG GCT CCA A (SEQ ID NO: 31), GAG GAG CTG GTG GTG GAA GTG CGG GGC T (SEQ ID NO: 32), AGG AGC TGG TGG TGG AAG TGC GGG GCT C (SEQ ID NO: 33), CTG GTG GTG GAA GTG CGG GGC TCC AAT G (SEQ ID NO: 34), AGA TGG AGG AGC TGG TGG TGG AAG TGC GGG (SEQ ID NO: 35), GGA AGT GCG GGG CTC CAA TGG CGC TTT CTA (SEQ ID NO: 36), GGA AGT GCG GGG CTC CAA TGG CGC TT (SEQ ID NO: 37), TGG AGG AGC TGG TGG TGG AAG TGC G (SEQ ID NO: 38), and AGT GCG GGG CTC CAA TGG CG (SEQ ID NO: 39).

[00049] As SEQ ID NOs: 40 e 41 mostram as sequências de FMR1 a montante e a jusante da região de repetição CGG. Em certas moda¬lidades, a sequência A compreende pelo menos 10 nucleotídeos de SEQ ID NO:40 e a sequência C compreende pelo menos 10 nucleotí- deos da SEQ ID NO:41.

[00050] A sequência B é uma sequência rica em GC e pode ter um comprimento de maneira que o padrão de referência tenha um tempo de retenção relativo particular na análise de CE. O tempo de retenção pode ser medido em relação a padrões conhecidos com comprimentos e caráter de GC definidos. Por exemplo, o composto da sequência B pode ser escolhido de maneira que o padrão de referência tenha um tempo de retenção relativo de menos do que cerca de 20, cerca de 24 a cerca de 27 ou mais do que cerca de 32 repetições CGG comparado com amostras genômicas. O comprimento da sequência B pode ser escolhido de maneira que o padrão de referência tenha um tempo de retenção relativo de menos do que ou cerca de zero CGG. Em certos exemplos, o padrão de referência tem um tempo de retenção relativo de cerca de -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10 ou zero re¬petições CGG. Em algumas modalidades, o padrão de referência de GC tem um tempo de retenção relativo de menos do que ou igual a 3, 2, 1, zero, -1, -2, -3, -4, -5, -10, -15 ou -20 repetições CGG. O tempo de retenção relativo do padrão de referência pode ser escolhido de maneira que ele não se sobreponha nem ao pico do primer nem um alelo de FMR1 de ocorrência natural. O tempo de retenção relativo do padrão de referência de GC pode ser também escolhido de maneira que ele não se sobreponha ao controle de digestão (discutido abaixo), quando um é usado.

[00051] O padrão de referência de GC pode ter um tempo de reten¬ção relativo negativo, por exemplo, quando o padrão de referência tem menos sequência de flanqueamento circundando a região rica em GC do que os produtos amplificados de uma amostra genômica. Desta maneira, um padrão de referência de GC pode conter na verdade um número positivo de repetições CGG, mas ter um tempo de retenção equivalente a uma amostra genômica hipotética com um número nega¬tivo de repetições CGG devido à diferença em teor de sequência de flanqueamento.

[00052] Em algumas modalidades, o comprimento de B é de a partir de X-300 a X+10 nucleotídeos de comprimento, onde X é a soma de: a) o número de nucleotídeos entre a extremidade 3’ da se¬quência A e o início da região rica em GC; e b) o número de nucleotídeos entre a extremidade da região rica em GC e a extremidade 5’ da sequência C.

[00053] Em algumas modalidades, B compreende ou consiste na sequência CGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGtGGaGGCGGCGGC GGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC GGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGG(SEQIDNO:48). Em algu¬mas modalidades, B compreende pelo menos 50, 75, 100 ou 125 nu- cleotídeos da SEQ ID NO:48. Em algumas modalidades, B compreen¬de ou consiste na sequência CGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGG CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG CGGCGGCGGCGGCGGCGGaGGCGGCGGCGG (SEQ ID NO: 49). . Em algumas modalidades, B compreende pelo menos 50, 75, 100 ou 125 nucleotídeos de SEQ ID NO:49. Em algumas modalidades, B compre¬ende ou consiste em uma sequência que hibridiza sob condições ads¬tringentes com SEQ ID NO:48 ou SEQ ID NO:49.

[00054] Um exemplo de condições de hibridização adstringentes é hibridização a 42°C em uma solução compreendendo 50% de forma- mida, 5X SSC (onde 1X SSC é NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5X, sulfato de dextrano 10% e 20 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguido por lavagem a 65°C em uma solução compreen¬dendo SSC 0,1X.

[00055] A Figura 2 mostra um exemplo de um padrão de referência de GC que tem um tempo de retenção relativo que não sobrepõe se¬quências de ocorrência natural de um locus rico em GC de FMR1.

[00056] Em certas modalidades, o padrão de referência de GC está contido dentro de um plasmídeo ou outro vetor. O plasmídeo ou outro vetor pode ser linearizado, por exemplo, através de digestão com uma enzima de restrição, ou deixado intacto. Em uma modalidade, o plas- mídeo é pBR322. Quando o padrão de referência de GC é adicionado a uma amostra ou uma porção de uma amostra como parte de uma molécula de DNA maior, tal como um plasmídeo, a reação de amplifi¬cação não amplifica necessariamente todas as partes da molécula de DNA maior (por exemplo, sequências que podem não ser amplificadas podem incluir uma origem de replicação de plasmídeo, marcador de resistência a antibiótico, sequências de não codificação intervenientes, etc), e para propósitos da presente invenção, tais sequências não am¬plificadas em uma molécula compreendendo o padrão de referência de GC não são consideradas na determinação do tempo de retenção rela¬tivo ou riqueza de GC do padrão de referência de GC.

[00057] O padrão de referência de GC pode ser adicionado a uma amostra de ácido nucleico antes ou após tratamento com a DNase sensível à metilação. Adição da referência de GC antes do tratamento com a DNase sensível à metilação pode reduzir erros que podem de outra maneira resultar da pipetagem do padrão de referência de GC em duas porções da amostra, uma das quais foi tratada com a DNase sensível à metilação e uma das quais não. Isto é, quando a referência de GC é adicionada à amostra antes do tratamento com a DNase sen¬sível à metilação, ela pode ser adicionada à amostra antes da divisão da amostra em duas porções. Em modalidades onde o padrão de refe¬rência de GC é adicionado à amostra antes da DNase sensível à meti- lação ou enzima controle, o padrão de referência de GC não é clivado pela DNase, por exemplo, ele pode ser destituído de sítios de reco¬nhecimento para a DNase e/ou ele pode ser metilado de maneira que ele é resistente à clivagem pela DNase sensível à metilação. Quando o padrão de referência de GC é adicionado à amostra após tratamento de uma porção da amostra com a DNase sensível à metilação, o pa¬drão de referência de GC é adicionado às primeira e segunda porções da amostra. A quantidade de padrão de referência de GC adicionada à amostra pode variar dependendo do tipo de reação de amplificação e do grau de amplificação (por exemplo, o número de ciclos ou a dura¬ção de incubação isotérmica). Por exemplo, em algumas modalidades usando PCR como a reação de amplificação, cerca de 750 a 12.000 cópias do padrão de referência de GC podem ser adicionadas a cada reação de PCR.

B. CONTROLE DE DIGESTÃO

[00058] Os métodos descritos aqui podem incluir o uso de um con¬trole de digestão. O controle de digestão é projetado para ser co- amplificado com uma região no DNA de amostra, tal como um locus de FMR. O controle de digestão é não metilado e contém pelo menos um sítio de reconhecimento para a DNase sensível à metilação, e então é clivado quando do tratamento com a DNase sensível à metilação. Co¬mo resultado, este molde de controle relata a eficácia da digestão pela endonuclease de restrição sensível à metilação.

[00059] Em algumas modalidades, o controle de digestão tem estru¬tura e comprimento de maneira que ele tem um tempo de retenção re¬lativo particular em uma análise de CE. Em modalidades onde a rea¬ção de amplificação compreende PCR, os mesmos primers podem ser usados para amplificar o locus alvo genômico e o controle de digestão. Fragmentos do controle de digestão resultantes da digestão pela DNase sensível à metilação não apoiam amplificação do controle de digestão. Em algumas modalidades, o controle de digestão tem um tempo de retenção relativo de menos do que cerca de 20, cerca de 24 a cerca de 27 ou mais do que cerca de 32 repetições CGG comparado com amostras genômicas. Em certos exemplos, o controle de digestão tem um tempo de retenção relativo de cerca de -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10 ou zero repetições CGG. Em algumas modalida¬des, o controle de digestão tem um tempo de retenção relativo de me¬nos do que ou igual a 3, 2, 1, zero, -1, -2, -3, -4, -5, -10, -15 ou -20 re¬petições CGG. O tempo de retenção relativo do controle de digestão pode ser escolhido de maneira que ele não sobreponha nem o pico de primer nem um alelo de FMR1 de ocorrência natural. O tempo de re¬tenção relativo do controle de digestão pode também ser escolhido de maneira que ele não sobreponha o padrão de referência de GC.

[00060] Em certas modalidades, o controle de digestão está contido dentro de um plasmídeo ou outro vetor. O plasmídeo ou outro vetor pode ser linearizado, por exemplo, através de digestão com uma en¬zima de restrição, ou deixado intacto. Em uma modalidade, o plasmí- deo é pBR322. Quando o controle de digestão é adicionado a uma amostra ou uma porção de uma amostra como parte de uma molécula de DNA maior, tal como um plasmídeo, a reação de amplificação não amplifica necessariamente todas as partes da molécula de DNA maior (por exemplo, sequências que podem não ser amplificadas podem in¬cluir uma origem de replicação de plasmídeo, marcador de resistência a antibiótico, sequências de não codificação intervenientes, etc), e pa¬ra propósitos da presente invenção, tais sequências não amplificadas em uma molécula compreendendo controle de digestão não são con¬sideradas na determinação do tempo de retenção relativo ou riqueza de GC do controle de digestão.

[00061] Em algumas modalidades, o controle de digestão compre¬ende ou consiste na sequência GGCGTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC GGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC GGCGGCGGCGG CTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCAG G AAGTGG AAGTGCG G G GCTCCAATGGGGCT(SEQIDNO:50). As porções sublinhadas são exemplos das sequências de flanqueamento que podem ser ajustadas para modificar o tamanho do amplicon resultante. Em algumas modali¬dades, o controle de digestão compreende ou consiste em pelo menos 100, 150, 175, 200 ou 220 nucleotídeos de SEQ ID NO:50. Em algu- mas modalidades, o controle de digestão compreende ou consiste em uma sequência que hibridiza sob condições adstringentes para SEQ ID NO:50. Em algumas modalidades, o controle de digestão compre¬ende ou consiste em uma sequência que é uma versão da SEQ ID NO:50 modificada pelo fato de ter um número maior ou menor de repe¬tições CGG, de maneira que o controle de digestão tenha um tempo de retenção relativo conforme acima discutido.

[00062] Em algumas modalidades, os tempos de retenção relativos do controle de digestão e do padrão de referência diferem pelo equiva¬lente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais repetições de CGG. Erros em molde ou primer podem ocorrer em reações de amplificação ricas em GC, resultando em produtos que diferem em comprimento em cer¬ca de 1-3 repetições CGG do alvo original. Desta maneira, em modali¬dades particulares, os tempos de retenção relativos do controle de di¬gestão e do padrão de referência diferem pelo equivalente de 4 ou mais repetições CGG para minimizar a sobreposição de sinal. Em al-gumas modalidades, ambos o controle de digestão e o padrão de refe¬rência têm um tempo de retenção relativo de menos do que ou igual a 3, 2, 1, zero, -1, -2, -3, -4, -5, -10 ou -15 repetições CGG. Em algumas modalidades, o controle de digestão tem a estrutura primária geral descrita na seção I.A acima para algumas modalidades do padrão de referência GC, incluindo sequências A, B e C conforme acima descrito. Quando ambos o controle de digestão e o padrão de referência de GC compreendem sequências A, B e C conforme acima descrito, pelo me¬nos um do segmento A, B ou C no controle de digestão pode diferir em comprimento de sua contraparte no padrão de referência de GC, de maneira que o controle de digestão é de um comprimento que difere pelo equivalente de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou mais repetições CGG do comprimento do padrão de referência. O controle de digestão terá ainda um estado de metilação apropriado para digestão pela nuclease sensível à metilação (estado que pode ser oposto ao estado de metila- ção do padrão de referência.

[00063] A quantidade de controle de digestão adicionada à amostra pode variar dependendo do tipo de reação de amplificação e do grau de amplificação (por exemplo, o número de ciclos ou a duração da in¬cubação isotérmica). Por exemplo, em algumas modalidades usando PCR como a reação de amplificação, cerca de 750 a cerca de 12.000 cópias do controle de digestão podem ser adicionadas a cada reação de PCR.

C. NUCLEASE SENSÍVEL À METILAÇÃO

[00064] Os métodos descritos aqui podem incluir o uso de uma nu¬clease sensível à metilação. Em alguns casos, a nuclease é uma DNase tal como uma enzima de restrição. A nuclease sensível à meti- lação dos métodos providos aqui clivam diferentemente a porção do locus de FMR que é amplificado com base em seu estado de metila- ção. Uma nuclease de controle não cliva esta porção.

[00065] DNases sensíveis à metilação incluem AatII, Acc65I, AccI, AciI, AclI, AfeI, AgeI, AeI-HF®, AhdI, AleI, ApaI, ApaLI, AscI, AsiSI, AvaI, AvaII, BaeI, BanI, BbvCI, BceAI, BcgI, BfuAI, BfuCI, BglI, BmgBI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaI-HF®, BseYI, BsiEI, BsiWI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspDI, BspEI, BsrBI, BsrFI, BssHII, BssKI, BstAPI, BstBI, BstUI, BstZ17I, BtgZI, Cac8I, ClaI, DraIII, DrdI, EaeI, EagI, EagI-HF®, EarI, EciI, EcoRI, EcoRI-HF®, EcoRV, EcoRV-HF®, FauI, Fnu4HI, FokI, FseI, FspI, HaeII, HgaI, HhaI, HincII, HinfI, HinP1I, HpaI, HpaII, Hpy166II, Hpy188III, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4IV, KasI, MboI, MluI, MmeI, MspA1I, MwoI, NaeI, NarI, NciI, NgoMIV, NheI, NheI-HF®, NlaIV, NotI, NotI-HF™, NruI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.CviPII, PaeR7I, PhoI, PleI, PmeI, PmlI, PshAI, PspOMI, PspXI, PvuI, RsaI, RsrII, SacII, SalI, SalI-HF™, Sau3AI, Sau96I, ScrFI, SfaNI, SfiI, SfoI, SgrAI, SmaI, SnaBI, StyD4I, TfiI, TliI, TseI, TspMI, XhoI, XmaI ou ZraI (New England Biolabs; Nature Protocols 1: 1621-1636 (2006)).

[00066] Em certas modalidades, a DNase sensível à metilação é escolhida de HpaI, NruI, EagI, BssHII e HhaI. Em certas modalidades, a DNase sensível à metilação é HpaII.

[00067] Sítios de reconhecimento para DNases sensíveis à metila- ção selecionadas são mostrados abaixo.

[00068] Em certas modalidades, uma primeira porção de uma amostra é tratada com uma nuclease sensível à metilação, enquanto uma segunda porção é tratada com uma nuclease de controle. A nu¬clease de controle pode ser uma enzima de restrição que não cliva o locus amplificado. A nuclease de controle pode ser uma nuclease não sensível à metilação. Muitas enzimas de restrição e suas especificida¬des são bem conhecidas na técnica. Exemplos de nucleases de con¬trole que podem ser usadas nos métodos descritos incluem HindIII-HF, DpnI, NaeI, EcoRI ou Sau3A1, dentre outras. Nucleases de controle são discutidas em mais detalhes acima na porção inicial da seção I.

D. MÉTODOS DE AMPLIFICAÇÃO

[00069] Os métodos da invenção também incluem amplificação de ácido nucleico. Muitos métodos existem para amplificação de sequên¬cias de ácido nucleico incluindo transcrição reversa, reação em cadeia da polimerase (PCR) (Polymerase Chain Reaction), PCR em tempo real (RT-PCR) (Real-time PCR), amplificação de base de sequência de ácido nucleico (NASBA) (Nucleic Acid Sequence-Base Amplification), reação em cadeia da ligase, amplificação de sonda ligável multiplex, tecnologia invasiva (terceira onda), amplificação de círculo de rolagem, transcrição in vitro, amplificação de deslocamento de filamento, ampli¬ficação mediada por transcrição (TMA) (Transcription-Mediated Ampli¬fication), amplificação de RNA (Eberwine), amplificação isotérmica mediada por alça e outros métodos que são conhecidos do versado na técnica. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda processamento de produtos de amplificação concatenados gerados através de uma reação de amplificação tal como amplificação de círcu¬lo de rolagem ou amplificação isotérmica mediada por alça, por exem¬plo, através de clivagem endonucleolítica de um sítio de reconheci¬mento presente no molde de amplificação ou primer incorporado, a fim de prover produtos de amplificação não concatenados para análise a jusante.

[00070] Uma reação de PCR típica inclui etapas de amplificação múltiplas, ou ciclos, que amplificam seletivamente espécies de ácido nucleico alvo. Uma reação de PCR típica inclui três etapas: uma etapa de desnaturação onde um ácido nucleico alvo é desnaturado; uma etapa de anelamento onde um conjunto de primers de PCR (primers avançado e reverso) anelam para filamentos de DNA complementares; e uma etapa de alongamento onde uma polimerase de DNA termoes- tável alonga os primers. Através da repetição dessas etapas múltiplas vezes, um fragmento de DNA é amplificado para produzir um ampli¬con, correspondendo à sequência de DNA alvo. Reações de PCR típi¬cas incluem 20 ou mais ciclos de desnaturação, anelamento e alon¬gamento. Em muitos casos, as etapas de anelamento e alongamento podem ser realizadas concomitantemente, caso onde o ciclo contém apenas duas etapas.

[00071] Em certos métodos, um conjunto de primers é usado para cada sequência alvo. Em algumas modalidades, um conjunto simples de primers pode amplificar ambos o padrão de referência de GC e o ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, os comprimentos dos primers dependem de muitos fatores, incluindo, mas não limitado a, a temperatura de hibridização desejada entre os primers, a sequência de ácido nucleico alvo e a complexidade das sequências de ácido nuclei- co alvo diferentes a serem amplificadas. Em certas modalidades, um primer é de cerca de 15 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, um primer é igual a ou menos do que 15, 20, 25, 30 ou 35 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades adicio¬nais, um primer tem mais do que 35 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o conjunto de primers inclui um primer que hi- bridiza para SEQ ID NO:40 e um segundo que hibridiza para SEQ ID NO:41. Um primer pode incluir pelo menos 10 nucleotídeos contíguos mostrados na SEQ ID NO:40 ou um primer pode incluir pelo menos 10 nucleotídeos contíguos complementares ao filamento mostrado da SEQ ID NO:41.

[00072] Em certas modalidades, os métodos incluem reações de PCR capazes de amplificar pelo menos 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 ou mais repetições CGG. Métodos exemplares capazes de amplificar moldes ricos em GC grandes são descritos, por exemplo, na Publicação Norte-americana No. 2010/0209970, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

[00073] As reações de PCR podem incluir provisão de dNTPs em uma razão de GC/AT maior do que um e uma concentração de dNTP total condutora da síntese de DNA usando moldes ricos em GC. A ra¬zão de GC/AT pode ser cerca de 1,1, 1,2, 1,4, 1,6, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou mais. A razão de GC/AT pode estar entre 1,1 e 20, 1,1 e 15, 1,1 e 10, 1,1 e 8, 1,1 e 7, 1,1 e 6, 1,1 e 5, 1,2 e 25, 1,4 e 25, 1,6 e 25, 2 e 25, 3 e 25, 4 e 25, 5 e 25, 2 e 15, 2,5 e 10 ou 4 e 10. A concentração de dNTP total pode ser cerca de 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,2, 1,5, 2 ou 3 mM. A concen-tração de dNTP pode estar entre 0,4 e 3 mM, 0,5 e 3 mM, 0,6 e 3 mM, 0,7 e 3 mM, 0,8 e 3 mM, 0,9 e3 mM, 1 e 3 mM, 0,4 e 2 mM, 0,4 e 1,5 mM, 0,4 e 1,2 mM, 0,4 e 1 mM, 0,4 e 0,9 mM, 0,4 e 0,8 mM, 0,4 e 0,7 mM, 0,5 e 2 mM, 0,5 e 1 mM ou 0,6 e 0,9 mM.

[00074] A polimerase de DNA usada em uma reação de PCR pode compreender uma polimerase do tipo selvagem, modificada, termofí- lica, quimérica, engenheirada e/ou uma mistura de mais de uma. A po- limerase de DNA pode compreender Exact Polymerase (5 PRIME GmbH), AccuSure® DNA Polymerase (Bioline), Phusion® AccuPrime® Pfx (Invitrogen), Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitro- gen), Phire® Hot Start DNA Polymerase (New England Biolabs), Phusiona Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Bi¬olabs), JumpStart® REDTaq® DNA Polymerase (Sigma-Aldrich), PfuUl- tra® Hotstart DNA Polymerase (Stratagene), PfuTurbo® Cx Hotstart DNA Polymerase (Stratagene), PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase (Takara), Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme (ABgene), ACCUZYME® DNA Polymerase (Bioline), SAHARA® DNA Polymerase (Bioline), VE¬LOCITY DNA Polymerase (Bioline), GeneChoice® AccuPOL® DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), GeneChoice® UniPOL® DNA Poly¬merase (GeneChoice, Inc.), Elongase Enzyme Mix (Invitrogen), Pfx50® DNA Polymerase (Invitrogen), Phusion DNA Polymerase (New Eng¬land Biolabs), KOD HiFi DNA Polymerase (Novagen), KOD XL DNA Polymerase (Novagen), Expand 20 kb PLUS Thermostable DNA poly¬merase mixture (Roche Applied Science), Expand High Fidelity PLUS Thermostable DNA polymerase mixture (Roche Applied Science), Ex¬pand High Fidelity Thermostable DNA polymerase mixture (Roche Ap¬plied Science), Expand Long Template Thermostable DNA polymerase mixture (Roche Applied Science), Easy-A® High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene), EXL™ DNA Polymerase (Stratagene), Hercu- lase® Enhanced DNA Polymerase (Stratagene), Herculase ® II Fusion DNA Polymerase (Stratagene), Kapa LongRange™ DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa HiFi™ DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G™ Robust DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G™ Ro¬bust HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G® Fast DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G® Fast HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), LA TAQ DNA Polymerase (Takara), Optimase DNA Polymerase (Transgenomic, Inc.), Exo- Pfu DNA Poly-merase (Stratagene), HotMaster Taq DNA Polymerase (5 PRIME GmbH), HotTaq DNA Polymerase (Abnova Corporation), AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Applied Biosystems), Bst DNA Polymerase Lg Frag (New England Biolabs), MasterAmp® Tfl DNA Polymerase (EPI¬CENTRE Biotechnologies), Red Hot DNA Polymerase (ABgene), Thermoprime Plus DNA Polymerase (ABgene), Taq-red DNA Polymer¬ase (AppliChem GmbH), BIO-X-ACT® Long DNA Polymerase (Bioline), BIO-X-ACT® Short DNA Polymerase (Bioline), Bioline HybriPol® DNA Polymerase (Bioline), BioTherm Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), EU-Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), Synergy Taq DNA Poly¬merase (eEnzyme LLC), GeneChoice® RedPOL® DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), AccuPrime® GC-Rich DNA Polymerase (Invitro- gen), PyroPhage® 3173 DNA Polymerase, Exo Minus (Lucigen), 9 De¬grees North (Modified) DNA Polymerase (New England Biolabs), Therminator DNA Polymerase (New England Biolabs), Pwo DNA Pol¬ymerase (Roche Applied Science), Paq5000® DNA Polymerase (Strat- agene), YieldAce® DNA Polymerase (Stratagene), e2TAK® DNA Poly¬merase (Takara) ou polymerases de DNA de ocorrência natural de P. kodakaraensis, P. furiosus, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis "VentTM", P. GB-D "Deep Vent", T. 9N-7, T. aggregans, T. barossii, T. fumicolans, T. celer, Pyrococcus sp. strain ST700, T. pacificus, P. abysii, T. profundus, T. siculi, T. hydrothermalis, Thermococcus sp. strain GE8, T. thioreducens, P. horikoshii ou T. onnurineus NA1, Thermococcus sp. 9°N-7, Thermococcus sp. GI-J, Thermococcus sp. MAR-13, Thermococcus sp. GB-C, Thermococcus sp. GI-H, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus fili- formis, Thermus flavus, Thermotoga maritima, Bacillus stearother- mophilus ou Bacillus caldotenax, por exemplo.

[00075] Em modalidades exemplares, os ácidos nucleicos amplifi¬cados são marcados durante a reação de amplificação. Em certos ca¬sos, a porção da amostra tratada com DNase sensível à metilação é marcada com um primeiro marcador e a porção controle da amostra é marcada com um segundo marcador. Em algumas modalidades, cada marcador é detectável através de CE.

[00076] Os marcadores incluem, mas não estão limitados a: com¬ postos de emissão de luz, difração de luz e de absorção de luz que geram ou extinguem um sinal fluorescente, quimioluminescente ou bio- luminescente detectável (vide, por exemplo, Kricka, L., Nonisotopic DNA Probe Techniquies, Academic Press, San Diego (1992) e Gar-man A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press (1997). Corantes repórteres fluorescentes úteis como marcadores incluem, mas não es¬tão limitados a, fluoresceínas (vide, por exemplo, Patentes Norte- americanas Nos. 5.188.934, 6.008.379 e 6.020.481), rodaminas (vide, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 5.366.860, 5.847.162, 5.936.087, 6.051.719 e 6.191.278), benzofenoxazinas (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.140.500), corantes fluorescentes de transferência de energia compreendendo pares de doadores e aceita¬dores (vide, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos. 5.863.727; 5.800.996; e 5.945.526) e cianinas (vide, por exemplo, WO 9745539). Exemplos de corantes fluoresceína incluem, mas não estão limitados a, 6-carboxifluoresceína; 2',4', 1,4,-tetraclorofluoresceína; e 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína. Corantes cianina exemplares in¬cluem o corante infravermelho WellRed® D1, D2, D3 D4. Marcadores adicionais podem ser derivados de lisamina, ficoeritrina, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY- R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5, 6-FAM, Isotiocianato de Fluoresceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Ore¬gon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetra- metilrodamina e/ou Texas Red, bem como qualquer outra porção fluo-rescente capaz de geração de um sinal de corante detectável e distinto de outro marcador. Exemplos de corantes fluoresceína incluem, mas não estão limitados a, 6-carboxifluoresceína; 2',4', 1,4,- tetraclorofluoresceína; e 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína. Em cer¬tos aspectos, o marcador fluorescente é selecionado de SYBR-Green, 6-carboxifluoresceína ("FAM"), TET, NED, ROX, VIC® ou JOE que são compatíveis com análise CE. Por exemplo, em certas modalidades, os marcadores são fluoróforos diferentes capazes de emissão de luz em comprimentos de onda diferentes, espectralmente resolvíveis (por exemplo, fluoróforos de 4 cores diferentes); certas tais sondas marca¬das são conhecidas na técnica e descritas acima e na Patente U.S. No. 6.140.054. Uma sonda fluorescente marcada dupla que inclui um fluoróforo repórter e um fluoróforo de extinção é usada em algumas modalidades. Outros exemplos podem incluir corantes Freedom® que são substitutos comercialmente disponíveis de corantes comuns. Será compreendido que são escolhidos pares de fluoróforos que têm espec-tros de emissão distintos de maneira que eles possam ser facilmente distinguidos.

[00077] Em um aspecto adicional, os marcadores são porções de estabilização de hibridização que servem para aumentar, estabilizar e/ou influenciar hibridização de dúplexes, por exemplo, corantes inter- caladores e de intercalação (incluindo, mas não limitado a, brometo de etídio e SYBR-Green), ligantes de ranhura menor e grupos funcionais de reticulação (vide, por exemplo, Blackburn e outros, eds. "DNA and RNA Structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)).

[00078] Será compreendido que em circunstâncias usando dois ou mais marcadores em um ensaio único, os marcadores que têm espec¬tros de emissão distintos são escolhidos de maneira que eles podem ser facilmente distinguidos. Em alguns exemplos, marcadores FAM e HEX podem ser usados para marcar uma primeira porção e uma se¬gunda porção de uma amostra. Em modalidades adicionais, FAM ou HEX pode ser usado com marcadores NED ou ROX, dentre outros, nos métodos descritos aqui.

E. MÉTODOS DE ANÁLISE

[00079] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos amplificados são analisados para determinar estado de metilação. Em modalidades exemplares, o método de análise de eletroforese capilar (CE) usando instrumentos familiares àqueles na técnica tais como o modelo ABI 3100, 3130, 3730 ou 3500. Outras implementações incluem qualquer instrumento capaz de dimensionamento eletroforético de DNA e reso-lução multicolorida. Por exemplo, os sistema de eletroforese capilar Beckman Vidiera ou SEQ6000 para a detecção de corantes infraver¬melho WellRed (D1, D2, D3 e D4) podem ser usados também ou o ins¬trumento Li-Cor incorporando IRDyes. Outros métodos que podem ser usados incluem sistemas de CE microfluidicos tal como o Agilent 2100 Bioanalyzer e plataformas similares, espectrometria de massa, eletro-forese em gel de agarose seguido por densitometria de varredura e análise de produtos radiomarcados usando fosfoimager ou densitome- tria de varredura de autorradiografias. Em modalidades adicionais, os ácidos nucleicos amplificados das primeira e segunda porções da amostra são analisados em um ensaio CE único.

[00080] Certos métodos de análise tal como CE permitem caracteri¬zação simultânea de estado de metilação e do número de repetições de CGG presentes em um molde. Em certas modalidades, análise de CE é realizada usando polímero líquido POP-4, 5, 6 ou 7 com uma co¬luna de 36 ou 50 cm. Em uma modalidade, o polímero líquido é POP- 7.

[00081] Em certas modalidades, a metilação percentual pode ser calculada. Intensidades de picos observadas em eletroferogramas de CE, varreduras de fosfoimager, varreduras densitométricas, espectros de massa ou outras formas de dados podem ser determinadas de acordo com métodos adequados conhecidos na técnica, por exemplo, métodos tais como altura do pico, área sob a curva (integração) ou ajuste de curva. Valores de intensidade de pico de picos correspon¬dentes das porções da amostra tratadas como o controle e submetidas à digestão pela DNase sensível à metilação podem então ser compa¬rados; as intensidades de pico podem ser normalizadas usando um padrão de referência de GC. Por exemplo, normalização pode ser rea¬lizada através da expressão de cada intensidade de pico observada como uma razão para a intensidade de pico observada para o padrão de referência de GC na mesma porção da amostra.

[00082] Em outras modalidades, estado de metilação pode ser ca-racterizado como não metilado ou metilado. Em modalidades adicio¬nais, estado de metilação pode ser categorizado como não metilado, parcialmente metilado ou integralmente metilado.

II. AMOSTRAS

[00083] Os métodos providos aqui se referem à caracterização do estado de metilação de um molde de ácido nucleico em uma amostra. Em certas modalidades, uma amostra de ácido nucleico é obtida de um humano. Por exemplo, a amostra pode ser uma amostra de paci¬ente. Uma "amostra de paciente" é qualquer espécie biológico de um paciente. O termo inclui, mas não está limitado a, fluidos biológicos tais como sangue, soro, plasma, urina, fluido cerebroespinhal, lágri¬mas, saliva, linfos, fluido de diálise, fluido de lavagem, sêmen e outras amostras líquidas, bem como células e tecidos de origem biológica. Células e tecidos podem incluir células bucais, coletas de lavagem bu- cal ou células de pele, incluindo folículos pilosos. O termo também in¬clui células isoladas de um humano ou células derivadas delas, inclu¬indo células em cultura, sobrenadantes celulares e lisatos de célula. Ele inclui ainda fluidos derivados de cultura de órgão ou tecido, amos¬tras de biópsia de tecido, amostras de biópsia de tumor, amostras de fezes e fluidos extraídos de tecidos fisiológicos, bem como células dis¬sociadas de tecidos sólidos, seções de tecido e lisatos de célula. Ele pode também incluir amostras de tecido sólido post-mortem tais como aquele do cérebro. Em algumas modalidades, a amostra contém me¬nos do que cerca de 80, 100, 150, 200, 500 ou 1.000 ng de DNA.

[00084] Em alguns casos, a amostra inclui DNA genômico. O DNA pode ser separado de outros componentes não DNA da amostra antes de ser submetido aos métodos da invenção. Muitos métodos da sepa¬ração e purificação de DNA são conhecidos no campo.

[00085] Uma amostra pode conter um molde de DNA. Em certos métodos descritos aqui, um molde de DNA pode ser o alvo de síntese em uma reação catalisada por uma polimerase de DNA. A riqueza de GC do molde de DNA pode ser maior do que ou igual a 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5% de resíduos de C e G. O molde de DNA pode compreender repetições de di-, tri- ou tetranucleotídeo compre¬endendo resíduos C e G. O molde de DNA pode compreender uma sequência dentro ou próximo do locus associado à doença. O molde de DNA pode compreender pelo menos parte da 5’ UTR do gene FMR1 ou FMR2. O molde de DNA pode compreender repetições CGG da 5’ UTR das repetições de FMR1 ou CCG na 5’ UTR do gene FMR2. O tamanho do molde do DNA pode ser cerca de 50, 100, 200, 300, 500 ou 700 bp ou 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 7 ou 10 kb. O tamanho do mol¬ de de DNA pode estar entre 50 pb e 10 kb, 100 pb e 10 kb, 200 pb e 10 kb, 300 pb e 10 kb, 500 pb e 10 kb, 700 pb e 10 kb, 1 kb e 10 kb, 1.5 pb e 10 kb, 2 pb e 10 kb, 3 pb e 10 kb, 50 pb e 7 kb, 50 pb e 5 kb, 50 pb e 4 kb, 50 pb e 3 kb, 50 pb e 2 kb, 50 pb e 1.5 kb, 100 pb e 7 kb, 200 pb e 5 kb ou 300 pb e 4 kb.

III. EXEMPLOS

[00086] Os exemplos que seguem ilustram várias modalidades da invenção e não pretendem limitar o escopo da invenção.

Exemplo 1. Fluxo de trabalho para caracterização do estado de metila- ção

[00087] A Figura 1 mostra um exemplo da metodologia de mPCR descrita aqui. DNA de amostra é tratado com uma mistura de reação contendo uma DNase sensível à metilação tal como HpaII i, que de¬grada os moldes não metilados, mas retém os alelos metilados, ou com uma mistura controle sem a enzima sensível à metilação. Cada porção do DNA da amostra é submetida à PCR na presença de um padrão de referência de GC externo. A PCR é ainda capaz de amplifi¬car alelos com mais de 200 repetições de CGG. Os primers para a porção HpaII e a porção controle têm marcadores diferentes (por exemplo, FAM e HEX). Os produtos de PCR são então agrupados e analisados através de eletroforese capilar. Uma perda em sinal de amplicon em CE indica digestão e a falta de metilação em qualquer sítio HpaII, enquanto a retenção de sinal indicava metilação do alelo correspondente. A fração de metilação pelo alelo é determinada a par¬tir da razão de rendimento de amplicon para um dado alelo que foi di¬gerido com HpaII com relação àquele para o alelo não digerido corres¬pondente. Esta razão é normalizada para o sinal do padrão de refe¬rência de GC externo.

Exemplo 2. Procedimentos experimentais A. Amostras de DNA Clínicas e de Linhagem Celular

[00088] gDNA de amostras de sangue foram obtidos de indivíduos vistos no M.I.N.D. Institute Clinic, following Institutional Review Board approval (Filipovic-Sadic e outros, Clin Chem 2010; 56:399-408). Amostras de DNA de linhagem celular foram obtidas do Coriell Cell Repositories (CCR, Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). Amostras de DNA clínicas e de linhagem celular foram diluídas para 20 ng/μl em Tris 10 mM, EDTA 0,5 mm, pH 8,8 antes da PCR.

B. PCR de Metilação de FMR1

[00089] Duas alíquotas de 40 ng de gDNA de cada amostra são preparadas para avaliação de metilação usando AmplideX® Methyla¬tion PCR reagents (Asuragen, Inc., Austin, Texas). As enzimas de res¬trição são da New England Biolabs. Uma alíquota de DNA é misturada com tampão de digestão e enzima sensível à metilação (Hpall a me¬nos que de outro modo mencionado), e a segunda alíquota com tam¬pão de digestão e uma enzima controle tal como Sau3Al ou EcoRl. As enzimas de restrição estão presentes na mistura de reação em uma concentração final de 0,15 U/μl. Exemplos da concentração final de componentes do tampão em cada reação são mostrados na Tabela 1 (não incluindo contribuições de reagente do tampão de armazenamen¬to de enzima). Tabela 1. Condições de Reação Exemplares

[00090] As reações de Hpall e controle são incubadas a 37° C por duas horas em placas de 96 cavidades vedadas. Mastermixes de PCR separadas de reagentes de PCR de metilação são preparadas para os produtos tratados com Hpall (primers de FAM) ou controle não Hpall (primers de HEX) e são aplicados diretamente à digestão de enzima de restrição ou à mistura de digestão controle. Cada mastermix con¬tém mPCR AMP Buffer (Asuragen, No. Catálogo 145152), GC-rich Polymerase Mix (Asuragen, No. Catálogo 145153), água deionizada e primers de mPCR (Avç: 5’TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA- 3’ (SEQ ID NO: 42); Rev: 5’-FAM- ou HEX- AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (SEQ ID NO: 43)) (Filipovic- Sadic, 2010). Cada mastermix também contém um padrão de referên¬cia de GC externo (~3000-12.000 cópias/reação de PCR, dependendo do número de ciclos de PCR).

[00091] As condições de tampão de PCR/reagente finais são as mesmas que aquelas no AmplideX™ FMR1 kit (Asuragen, No. Catálo¬go 49402; Patente U.S. No. 2010/0209970), exceto por mais MgCl2 0,67 mM, Bis-Tris-Propano 2,66 mM, pH 7,0 e 0, DTT 266 mM (para amostras Digestion Mix A); mais TrisHCl 10 mM, pH 7,5 e NaCl 20 mM (para amostras Digestion Mix B); ou mais TrisHCl 2,66 mM, pH 7,5 e BSA 26,6 μg/ml (para amostras Digestion Mix C) realizadas no tampão de digestão.

[00092] Certas reações podem usar um padrão de referência de GC que tem um tempo de retenção relativo de 40 CGG (SEQ ID NO:44; "40-CGG-Controle"), que é construído através da inserção de 30 nu- cleotídeos de uma sequência de DNA não humano em um plasmídeo contendo 30 repetições CGG. Durante a etapa de PCR, o padrão de referência é amplificado a partir do plasmídeo. Exemplos adicionais incluem um padrão de referência que tem um tempo de retenção rela¬tivo de zero CGG (Asuragen, No. Catálogo 49441; SEQ ID NO: 45; "zero-CGG-Controle"), também contido dentro de um plasmídeo. Con¬troles não plasmídeo com tempos de migração alternativos são tam¬ bém usados, conforme mencionado.

[00093] As amostras são amplificadas por PCR com uma etapa de desnaturação de calor inicial de 95° C por 5 minutos, seguido por 25 ciclos de 97° C por 35 seg, 62° C por 35 seg e 72° C por 4 min e 72° C por 10 minutos. Amplicons são preparados para análise de CE ou ar-mazenados a -15 a -30° C.

[00094] A sequência do amplicon de FMR1, junto com indicação dos dois sítios de HpaII que são sondados é mostrada como segue: 5’-X-(região de repetição CGG)-Y-3’

[00095] onde X é TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGTGGAGGGCCGCCTCTG AGCGGGCGGCGGGCCGACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGG CGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCG (SEQ ID NO: 46); e Y é CTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCÇÇGGCG CTAGCAGGGCTGAAGAGAAGATGGAGGAGCTGGTGGTGGAAGTGCGGGG CTCCAATGGCGCTT-3’ (SEQ ID NO: 47).

[00096] Nas SEQ ID NOs: 46 e 47, as regiões sublinhadas desig¬nam sequências ligadas pelos primers avançado e reverso e sequên¬cias CCGG em itálico e sublinhadas indicam os dois sítios de Hpall.

C. Eletroforese Capilar (CE)

[00097] Um 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., ABI, Foster City, CA) é usado para os experimentos, exceto onde mencio-nado. Um total de 2 μL de produtos de PCR não purificados (1 μL de cada um dos produtos marcados com HEX e produtos marcados com FAM) é misturado com 11 μL de HI-DI Formamide® (ABI) e 2 μL de ROX 1000 Size Ladder (Asuragen), desnaturado com calor a 95°C por 2 minutos e transferido para o sistema CE para análise. Exceto onde mencionado, as injeções seguem as condições de dimensionamento de fragmento padrão (36 cm, POP7) usando uma injeção de 2,5 kV por 20 s e uma rodada de 40 min a 15 kV. Um ABI 3500xL CE (50 cm, POP7) é usado onde mencionado. Devido a limitações de resolução do polímero POP7, todos os amplicons de FMR1 com >250 repetições CGG têm mobilidades similares em CE.

D. Análise de Dados

[00098] Eletroferogramas são analisados usando software Gene¬Mapper 4.0 (4.1 para dados 3500xL) ou PeakScanner V1.0 (ABI). A conversão de tamanho de par de base para número de repetições CGG é determinada por regressão linear para controlar amplicons produzidos a partir de moldes com 20, 29, 31, 54 e 119 repetições CGG (Filipovic-Sadic, 2010). Tamanhos de pico para cada pico são convertidos em comprimento de repetição CGG usando (Tamanhoi- 230,3/2,975).

[00099] Os resultados do comprimento de repetição CGG e metila- ção percentual para cada alelo detectado são tabulados em MS Excel. A metilação percentual, %Mi, é calculada como uma razão de alturas de pico entre a amostra digerida (Peaki,FAM) e a não digerida (Peaki,HEX) normalizadas para a altura de pico de amplicon padrão de referência GC (CTRLHEX or CTRLFAM) conforme mostrado na Equação 1:

[000100] Valores de metilação que são cerca de 100% ou excedem nominalmente 100% são classificados como integralmente metilados. Tais valores tipicamente observados dentro da faixa de variação do ensaio para alelos bem representados, conforme mencionado abaixo, mas são algumas vezes exagerados (por exemplo, 120 a 137%) em avaliações de metilação de alelos de pouca abundância (por exemplo, registro de apenas 1% de fração de massa de uma amostra de muta¬ção integral clínica) quando o sinal específico de alelo está próximo da menor faixa de detecção do instrumento CE e então quantitativamente menos confiável com relação ao sinal do pico padrão de referência GC.

E. Análise Southern Blot

[000101] Análise SB das 80 amostras clínicas é realizada conforme descrito em Tassone e outros, J. Mol. Diagn. 2008;10:43-9. O DNA da linhagem celular é preparado para SB usando EcoRI e Eagl (NEB). Imagens SB são avaliadas categoricamente (alelos não metilados, me- tilados e integralmente metilados) e a porcentagem de metilação em cada amostra determinada conforme descrito em Tassone, 2008.

Exemplo 3. Precisão e capacidade de reprodução de mPCR com pa¬drões e amostras de DNA metilado

[000102] Para avaliar a precisão do fluxo de trabalho de mPCR de duas cores, um conjunto de 8 padrões analíticos definidos contendo 30 repetições CGG e frações de metilação conhecidas foi desenvolvido. Controles de DNA metilados e não metilados foram preparados a partir de produtos de PCR de um alelo de repetição de 30 CGG que foi clo- nado em pBR322 seguindo procedimentos padrão (Sambrook J, Fri¬tsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: CSHL Press, 1989). O padrão 30 CGG foi metilado com metiltransferase Hpa II (New England Biolabs, NEB, Ipswich, MA) e linearlizado com HindIII (NEB).

[000103] Várias proporções dos padrões de 30 CGG metilados ou não metilados foram misturadas de 0-100% e diluídas para 1,5 x 104 c0pias/μL em 20 ng/μL de DNA de linhagem de célula de 645 CGG (NA04025, CCR). Amostras de DNA de linhagem celular foram obtidas da Coriell Cell Repositories (CCR, Coriell Institute for Medical Rese¬arch, Camden, NJ). Cada amostra foi submetida à digestão com HpaII em Digestion Mix A (Sau3A1 in Digestion Mix A para reação controle), 25 ciclos de PCR na presença do 40-CGG-Controle e CE conforme descrito no Exemplo 2.

[000104] Uma série de eletroferogramas destacando a mudança proporcional em sinal no canal FAM para o padrão de 30 CGG é mos¬trada na Figura 3A. Como a metilação percentual aumentou, o sinal para o padrão 30 CGG aumentou com relação aos picos para 40- CGG-controle e o alelo de mutação integral de 645 CGG misturado. A mudança em altura de pico foi normalizada para a altura de pico 40- CGG-Controle e comparada com a razão normalizada no canal HEX (Eq. 1). Uma relação linear (R2=0,998) foi observada entre a fração de metilação conhecida e a fração empiricamente recuperada seguindo mPCR, conforme realizado por dois operadores em três dias de roda¬da diferentes (Figura 3C), com metilação de registro de entrada indi¬cada no eixo x e metilação medida indicada no eixo y. Metilação do alelo de 645 CGG foi determinada ser quantitativa (104±5%) para cada um dos padrões avaliados (Figura 3B).

[000105] A capacidade de reprodução de mPCR foi avaliada mais em 8 réplicas de 2 alelos normais (30 e 32 CGG de uma amostra clíni¬ca feminina) e 2 alelos de mutação integral (550 CGG e 940 CGG) em 2 plataformas de instrumento de CE (uma ABI 3140xl e 3500xL). Fra¬ções de metilação, desvios padrão, coeficientes de variação (CV) e intervalos de segurança (CI) (Confidence Intervals) de 95% são apre¬sentados na Tabela 2. Tabela 2. Avaliações de mPCR de metilação em duas plataformas de CE para alelos normais e de mutação integral

[000106] A fração de metilação de mPCR calculada deu um CV = 7¬8% para os alelos normais e um CV = 8-16% para os alelos de muta¬ção integral nas duas plataformas diferentes. Ainda, resultados de mPCR foram reproduzíveis em 2 operadores diferentes (CV=7%) usando 8 amostras de linhagem celular, incluindo 4 amostras de muta¬ção integral. Medições de metilação percentual que algumas vezes excedeu 100% foram uma consequência da variação declarada do método e tais amostras foram tabuladas como integralmente tabuladas para propósitos de comparação com análise SB. Conforme demons¬trado nos Exemplos abaixo, o método de mPCR deu resultados para amostras clínicas que foram pelo menos tão bons quanto análise SB.

Exemplo 4: Avaliações de mPCR de DNA de linhagem celular e com-parações com análise SB

[000107] mPCR foi avaliada com 8 moldes de DNA de linhagem de célula comercialmente disponíveis que incluíam alelos de mutação normal, pré-mutação e mutação integral de ambas as amostras mas¬culina e feminina. As amostras foram submetidas à digestão com HpaII em Digestion Mix A (Sau3A1 em Digestion Mix A para reação contro¬le), 25 ciclos de PCR na presença do 40-CGG-Controle e CE conforme descrito no Exemplo 2. Os resultados para tamanho de alelo e estado de metilação de análises mPCR e SB são sumarizados na Tabela 3. Tabela 3. Comparação de análises mPCR e SB para 8 amostras de DNA de linhagem celular. As amostras sublinhadas são mostra¬das na Figura 4

[000108] Eletroferogramas de 4 amostras com dados de SB compa- tíveis são mostrados nas Figuras 4A-D. Em cada figura, o painel supe¬rior mostra a porção da amostra não tratada com Hpall e o painel infe¬rior mostra a amostra digerida. A ID da amostra da Tabela 3 é mostra¬da em cada figura, junto com o comprimento da repetição. Compri¬mentos de repetição na Figura 4 são marcados usando as designa¬ções Coriell para >250 CGG e usando os resultados de PCR quando <250 CGG. Cada figura também inclui porcentagem de metilação de¬terminada através de mPCR. O pico marcado "Ctrl" indica o 40-CGG- controle.

[000109] Em cada caso, os resultados de mPCR eram qualitativa¬mente consistentes com os dados de SB correspondentes. Por exem¬plo, conforme mostrado na Figura 4A, o alelo de pré-mutação masculi¬no (NA06892, 90 CGG) apresentou 2% de metilação através de mPCR, consistente com a presença de um produto que foi detectado apenas na região não metilada do SB. Inativação enviesada de X (me- tilação 8%) de um alelo normal feminino (NA07537, Figura 4C), em combinação com um alelo de mutação integral integralmente metilado, foi também concordante com análise SB, e dados previamente publi¬cados (Zhou e outros, Clin Chem 52:1492-1500 (2006)).

[000110] mPCR forneceu interpretações mais detalhadas de estados de metilação específicos de alelo em amostras complexas de até ~250 CGG de comprimento. Por exemplo, uma amostra fêmea de mosaico (NA06896, "23/95-140" de acordo com CCR) foi detectada com picos primários de 23, 112, 136 CGG e 4 picos de abundância baixa adicio¬nais de 153, 175, 196 e 219 CGG (Figura 4D). Os picos de 23 CGG e 112 CGG foram parcialmente metilados, o pico de 136 CGG foi inte¬gralmente metilado e os picos entre 153 e 219 foram completamente não metilados.

[000111] Esses resultados foram qualitativamente similares aos re-sultados de análise SB. SB revelou um alelo de 23 CGG na maior par¬te não metilado, um conjunto amplo de alelos não metilados expandi¬dos (<5,2 kb) e um conjunto mais definido de alelos metilados expan¬didos. Importante, dados de PCR revelaram contribuições de mosaico de tamanho individuais para o padrão de mancha não metilado em SB. Por exemplo, a imagem de SB era consistente com um 112 CGG par¬cialmente metilado e alelos de repetição maior não metilados de 153¬219 CGG conforme relatado através de mPCR.

Exemplo 5. Desempenho de ensaio de PCR de metilação com amos¬tras de DNA clínicas

[000112] O ensaio de mPCR de FMR1 foi avaliado com um conjunto de 80 espécimes clínicos representando uma faixa integral de tama¬nhos de alelo e estados de metilação clinicamente relevantes e seleci¬onados do mesmo conjunto anteriormente avaliado para tamanho de alelo (Filipovic-Sadic, 2010). Os experimentos foram realizados con¬forme descrito no Exemplo 4. O estado de metilação foi também de¬terminado através de SB (Tassone, 2008). O comprimento de repeti- ção CGG, metilação percentual e comparação com dados de SB foram tabulados para cada amostra clínica (Tabela 4) e sumarizados (Tabela 5). Na Tabela 4, os alelos detectados usando mPCR foram agrupados para serem compatíveis com os limites de resolução de SB. Amostras com alelos de mutação integral são sombreados em cinza e aqueles em negrito são mostrados nas Figuras 5 e 6. Em cada figura, o pico marcado "Ctrl" indica o 40-CGG-Controle.

[000113] Ativação de X (Rousseau et al., J. Med. Genet. 28:830-6 (1991)) é a recíproca de metilação percentual para alelos normais fê¬meas em amostras normais e de mutação integral. A ativação de X média foi 0,51 para amostras de alelos fêmeas normais (n=8) e 0,67 para os alelos normais de mutação integral fêmeas (n=12), consistente com os valores relatados por Vries e outros (0,50 e 0,71, respectiva¬mente) (de Vries e outros, Am. J. Hum. Genet. 58:1025-32 (1996)). Tabela 4. Comparação de comprimento de repetição e metilação percentual de mPCR com previsões categóricas e metilação esti¬mada por SB

[000114] Os resultados de mPCR estavam de acordo com análise SB, no entanto, mPCR simplificou e aperfeiçoou a detecção e a inter¬pretação de estados de metilação diferentes com relação a SB. Devido à resolução mais alta de CE, alguns alelos que eram prontamente dis¬tinguidos através de mPCR foram não resolvidos por SB (tais como duas pré-mutações de tamanho similar). Nesses casos, os alelos fo¬ram agrupados para serem compatíveis com os limites de resolução de análise SB.

[000115] A sensibilidade de mPCR foi direcionada por dois experi¬mentos diferentes. No primeiro, titulação de um mínimo de 1% de fra¬ção de massa de um alelo de mutação integral clínico em uma base de um alelo de 31 CGG normal foi detectável em ambos os canais HEX e FAM (Figura 7). No segundo, uma fração de 10% de massa de uma amostra de mutação integral integralmente metilada (No. 08) pôde ser identificada na base de uma fração de massa de 90% de uma amostra de mutação integral não metilada (No. 125) (Figura 8). O estado de metilação de ambas as amostras foi confirmado através de análise SB conforme mostrado na Tabela 4. Desta maneira, de acordo com a Fi¬gura 3, até mesmo um mosaico de 10% de metilação poderia ser de- tectado usando amostras clínicas.

A. Identificação e resolução de estado de metilação em alelos de mu¬tação integral

[000116] Os eletroferogramas e imagens de SB compatíveis para amostras de mutação integral representativas são mostrados na Figu¬ra 5. Conforme anteriormente descrito (Filipovic-Sadic, 2010), a confi¬guração CE usada nesses experimentos limitou a resolução diferencial e amplicons àqueles com <250 CGG, e então os produtos de amplifi¬cação de expansões de repetição maiores comigraram, embora a me- tilação de porcentagem geral para a categoria ampla de mutações in¬tegrais fosse precisamente avaliada como apoiado pelos dados abai¬xo. Por exemplo, na amostra de mutação integral masculina No. 88 (Figura 5A), o alelo expandido foi detectado principalmente na região metilada do SB com um produto fraco (sinal ~10-20%) na região não metilada. mPCR revelou 82% de metilação para esta amostra, consis¬tente com o resultado de SB. Ainda, metilação parcial para o alelo normal, e metilação integral para o alelo expandido, foi observada usando SB para amostra de mutação integral feminina No. 117 (Figura 5B). Os resultados de mPCR também indicaram metilação parcial (44%) do alelo de 30 CGG e metilação integral (104%) do alelo expan¬dido.

[000117] mPCR simplificou a identificação de estado de metilação em amostras mais complexas que pode ser problemático para SB. A amostra No. 125 de mutação integral masculina (Figura 5C) apresen¬tou uma mancha de baixa intensidade na região não metilada (faixa de 3 a >5 kb). Usando mPCR, o pico de mutação integral foi claramente detectado no canal de HEX, mas não no FAM apesar da amplificação do 40-CGG-Controle. Desta maneira, o alelo de mutação integral foi não metilado. Em outro exemplo (Figura 5D), um padrão não usual de tamanho e mosaicismo de metilação foi resolvido. Através de análise SB, o alelo de mutação integral perecia parcialmente metilado, en¬quanto mPCR revelou dois tamanhos de alelo distintos com metilação enviesada. O sinal de mutação integral predominante foi observado no(s) molde(s) mais longo não metilado, enquanto o molde menos abundante a ~200 CGG foi integralmente metilado. Desta maneira, o mosaicismo de tamanho foi mais claramente resolvido através de mPCR, e o padrão de metilação foi mais complexo do que indicado por SB.

B. Identificação de novos padrões de enviesamento em alelos de pré- mutação femininos que foram mascarados por análise SB

[000118] Eletroferogramas e imagens SB compatíveis para 4 amos¬tras de pré-mutação femininas representativas são mostrados na Figu¬ra 6. O traço característico de cada amostra foi a detecção de dois grupos de tamanhos de repetição para o alelo mais longo, a saber 53 e 54 CGG, 70 e 71-75 CGG, 90 e 92-101 CGG e 107 e 109-125 CGG (Figuras 6A-D, respectivamente). Após digestão e amplificação com primers marcados com FAM, apenas os comprimentos de repetição CGG mais curtos dentro de cada amostra de mosaico foram detecta¬dos. Devido ao fato do mosaicismo de tamanho não ter sido observado no canal FAM tratado com Hpa II das amostras femininas característi¬cas, nem ter sido observado após a PCR de qualquer um dos 11 ale- los de pré-mutação masculinos testados de comprimento repetido comparável, parece que esse padrão não era um artefato de "gaguei¬ra" de polimerase. Em cada caso, as repetições CGG mais expandidas do alelo de pré-mutação eram completamente não metiladas. Este mesmo mosaicismo e padrão de metilação enviesado foi identificado em 84% (16 das 19) das amostras de pré-mutação femininas com o coorte testado. Em contraste, as limitações de resolução de SB forne¬ceram apenas uma faixa de pré-mutação detectável e então obscure¬ceram este nível de detalhe biológico. Ainda, o mosaicismo enviesado observado não era específico para uma análise de sítios Hpall metila- dos. Especificamente, a análise de mPCR foi também realizada com Eagl ao invés de HpaII. EcoRI em Digestion Mix B foi usado para a re¬ação controle. A análise Eagl utilizou uma migração de controle CGG em um tempo de retenção relativo de cerca de -12,8 repetições CGG e derivada de um amplicon de PCR ao invés de 40-CGG-Controle base¬ado em plasmídeo. Ainda, primers de PCR foram selecionados de ma¬neira que sítios de reconhecimento de Eagl estavam presentes no am¬plicon. O mesmo padrão foi observado quando o molde foi tratado com Eagl, ao invés de Hpall, e analisado usando uma modificação do mé¬todo de mPCR que permitiu a avaliação de sítios metilados por Eagl (Figura 9; "Ref" se refere ao 40-CGG-Controle em amostras de Hpall e -12,8 GCC controle em amostras de Eagl).

[000119] O procedimento de pesquisa de mPCR pode apoiar análi¬ses de amostra de volume alto, requerendo apenas um único dia e aproximadamente 2 h de tempo de manuseamento total (muito do qual pode ser automatizado) para processar até 48 amostras por operador. Ainda, mPCR requer uma alimentação de apenas 80 ng de DNA - uma redução de 50 a 100 vezes comparado com SB, e redução de 10 vezes comparado com bissulfito (Panagopoulos e outros, Hum Mutat 14:71-9 (1999); Zhou et al., Clin Chem 52:1492-500 (2006); Dahl e ou¬tros, Nucleic Acids Res 35:e144 (2007)) ou métodos de PCR mediados por Hpall anteriormente relatados (Carrel e outros, Am J Med Genet 64:27-30 (1996); Kline e outros, Fertil Steril 85:1488-95 (2006); Allen e outros, Am J Hum Genet 51:1229-39 (1992)). Como resultado, tipos de amostra alternativos para sangue integral que compartilham uma li¬nhagem de célula ectodermal com células neuronais, tais como células bucais ou de pele, podem ser condescendentes à análise de mPCR mesmo se elas não proverem rendimentos de DNA suficientes para SB.

[000120] A tecnologia de mPCR avaliada neste estudo representa uma metodologia baseada em PCR que detecta e resolve estado de metilação através do espectro de comprimentos de repetição CGG em ambas as amostras masculinas e femininas. O fluxo de trabalho geral é condescendente a teste de rotina e aplicações de avaliação de alto rendimento. Os métodos proveem a base para análises de FMR1 compreensivas sem a necessidade de análise SB. Exemplo 6: mPCR com enzimas sensíveis à metilação alternadas

[000121] Para demonstrar a versatilidade dos métodos de mPCR, amostras clínicas selecionadas foram analisadas usando as enzimas Eagl e Nru, bem como Hpall. Os experimentos foram geralmente reali¬zados conforme descrito no Exemplo 2, com amostras tratadas com Eagl ou Nrul em Digestion Mix B por 2 horas, e amostras controle tra¬tadas com EcoRI em Digestion Mix B por 2 h. Um padrão de -12,8 CGG não plasmídeo foi usado para experimentos Eagl e um padrão - 41 CGG não plasmídeo foi usado com amostras Nrul. Primers de PCR para experimentos de Eagl e Nrul foram escolhidos de maneira que o amplicon continha sítios de reconhecimento para as enzimas apropria¬das. Experimentos de Hpall foram realizados conforme descrito no Exemplo 4. A Tabela 6 compara os resultados desses experimentos. Os resultados usando as várias enzimas diferenciaram alelos não me- tilados vs. metilados, bem como alelos não metilados, parcialmente metilados ou integralmente metilados. Tabela 6: Comparação de resultados de Hpall, Eagl e Nrul

Exemplo 7: Desempenho do ensaio de PCR de metilação usando um

[000122] O estado de metilação de 6 amostras do Coriell Cell Repo¬sitory foi avaliado usando o zero-CGG-Controle que tem um tempo de retenção relativo fora da faixa de detecção de alelos de FMR1 biológi¬cos. Os experimentos foram realizados conforme descrito no Exemplo 2, usando Hpall ou Sau3A1 (controle) em Digestion Mix C e 27 ciclos de PCR. Conforme mostrado na Tabela 7, a escolha de padrão de re¬ferência não alterou a interpretação dos dados de metilação na faixa de estado de metilação, de a partir de 2% de metilação a quantitativa¬mente metilado. Os resultados foram comparados com aqueles gera¬dos usando o 40-CGG-Controle conforme descrito no Exemplo 4.

Exemplo 8. Nuclease Controle

[000123] Os métodos descritos aqui podem incluir o uso de uma en- donuclease na reação controle para clivar o DNA genômico grande fora da região de amplificação do locus de FMR1 e reduzir o tamanho dos moldes de DNA comparáveis com aqueles na reação de digestão sensível à metilação e então comparavelmente favoráveis para ampli¬ficação de PCR.

[000124] Muitas enzimas de restrição e seus sítios de reconhecimen¬to específicos são bem caracterizados. Um total de 14 endonucleases de restrição comercialmente disponíveis foi selecionado para teste, incluindo Sau3A, EcoRI, NaeI, DpnI, HindIII-HF, NheI, TfiI, ApaLI, MluCI, NcoI, ScaI, StuI, XmnI e Hpy16611.

[000125] Exemplos de enzimas de restrição que podem ser usadas no método incluem Sau3A, EcoRI, NaeI, DpnI e HindIII-HF. Sau3A exibiu seletividade reduzida com relação à clivagem de sítios não alvo do molde. EcoRI, NaeI, DpnI e HindIII-HF exibiram um alto grau de se¬letividade, pelo fato que pouca a nenhuma clivagem de sítios não alvo no molde (isto é, a região do locus de FMR1 ligado a SEQ ID NOs: 40 e 41) foi observada. Tabela 8: Comparação das endonucleases de restrição testadas na reação de digestão de controle

Exemplo 9: Fluxo d e Trabalho Alternativo para Caracterização de Es-tado de Metilação

[000126] Um fluxo de trabalho alternativo para caracterização de es¬tado de metilação é mostrado na Figura 10. Neste fluxo de trabalho, uma amostra de DNA genômico é pré-misturada junto com controle de digestão e o padrão de referência de GC (referido na figura como con- trole de DNA CGG). Cada porção de mistura de DNA é submetida ao tratamento com nuclease sensível à metilação (Hpall) ou uma nu¬clease controle (HindIII-HF). Subsequentemente, a mistura de DNA digerido é submetida à amplificação por PCR usando os respectivos primers marcados com FAM (reação HindIII-HF) ou primers marcados com HEX (reação Hpall). Os produtos de PCR são então agrupados e analisados através de eletroforese capilar.

[000127] Ambos controle de digestão e padrão de referência GC mi¬gram na janela inicial do eletroferograma e não interferem com o perfil específico de amostra. A perda dos amplicons do controle de digestão na PCR marcada com HEX indica a eficiência da digestão de Hpall. O padrão de referência GC é usado para normalizar intensidade de sinal entre os produtos de PCR marcados com FAM e HEX. Adição de pa¬drão de referência GC antes da digestão com enzima de restrição é usada para normalizar a variabilidade da quantidade de DNA gnômico em cada reação. Desta maneira, a porcentagem de metilação por cada alelo é determinada como uma razão de altura de pico entre a reação digerida (HEX) e acontrole (FAM) após normalização para o padrão de referência GC da reação correspondente.

EXEMPLO 10. Avaliação de mPCR de DNA de Linhagem Celular no Fluxo de Trabalho Alternativo e Comparações com Análise SB

[000128] mPCR de acordo com o fluxo de trabalho alternativo do Exemplo 9 foi avaliada com 4 moldes de DNA de linhagem de célula comercialmente disponíveis (Coriell Institute for Medical Research) que incluíam alelos normais, de pré-mutação e mutação integral de ambas as amostras masculinas e femininas. Cada amostra foi pré-misturada com controle de digestão compreendendo SEQ ID NO:50 e padrão de referência onde as sequências A, B e C compreendiam as SEQ ID NOs: 17, 48 e 39, respectivamente. Após adição do controle de diges¬tão e do padrão de referência GC, a amostra foi dividida em duas por- ções. Uma porção da amostra foi submetida à digestão com Hpall, en¬quanto a outra foi submetida à digestão com Hindlll-HF como uma rea¬ção controle. 25-27 ciclos de amplificação por PCR foram então reali¬zados com cada uma das duas porções usando primers marcados como no Exemplo 9 e os produtos foram resolvidos por CE. DNA das mesmas linhagens celulares foi também analisado através de SB. Os resultados para tamanho de alelo e estado de metilação de mPCR e SB são sumarizados na Tabela 9. Eletroferogramas das 4 amostras com dados de SB correspondentes são mostrados nas Figuras 11A- 11D. Em cada figura, os painéis superiores mostram a porção da amostra tratada com HindIII-HF como controles e os painéis inferiores revelam a mesma amostra digerida com Hpall. Cada figura também inclui a porcentagem de metilação determinada através de mPCR.

[000129] Para cada amostra, os resultados de mPCR estavam con-sistentemente de acordo com os dados de SB. Por exemplo, as duas amostras de mutação integral masculinas (NA07862 e NA06852) fo¬ram medidas como tendo >100% de metilação por mPCR, de acordo com a presença de produto apenas na região metilada para o alelo >2000 CGG no SB.

[000130] Ainda, mPCR proveu informação mais detalhada para esta¬do de metilação específico de alelo em amostras com mosaicismo complexo. Por exemplo, duas amostras femininas de mosaico (NA06896, 23/96-140 e NA20242, 30/73) foram detectadas com picos primários em SB, mas essas amostras também revelaram picos abun¬dantes baixos não visualizados em SB (Figuras 11C-11D) quando ana¬lisadas através de mPCR. Os dados de mPCR também revelaram a contribuição individual de cada alelo para o padrão de metilação em SB. Por exemplo, NA06896 foi detectado com alelos 113 CGG & 138 CGG integralmente metilados e alelos maiores não metilados de 143 a >200 CGG (Figura 11C), que está de acordo com FM metilado parcial relatado em SB. Tabela 9. Comparação de análises mPCR e SB para 4 amostras de DNA de linhagem celular. Todas as amostras dando medições de 100% ou mais de metilação foram categoricamente classificadas como ">100%".

Exemplo 11. Avaliação de mPCR com Espécimes de DNA Clínicos no Fluxo de Trabalho Alternativo

[000131] O ensaio de mPCR de acordo com o fluxo de trabalho al¬ternativo de acordo com o Exemplo 9 foi avaliado mais com um con¬junto de 12 espécies clínicos que representavam uma faixa de tama¬nhos de alelo e estado de metilação clinicamente relevantes. Os expe¬rimentos foram realizados conforme descrito no Exemplo 10. Os resul¬tados para tamanho de alelo e estado de metilação de mPCR e com¬paração com SB são sumarizados na Tabela 10. Eletroferogramas das amostras marcadas com * na Tabela 10 são providos nas Figuras 12A- 12G com dados SB correspondentes.

[000132] Os resultados de mPCR estavam em boa concordância com análise SB. mPCR proveu resolução maior e permitiu detecção e interpretação mais detalhadas de estados de metilação diferentes de SB. Alguns alelos não resolvidos por SB foram facilmente distinguidos através de mPCR (tais como dois alelos de tamanho similar). Por exemplo, a amostra No. 7 contém 30 e 31 alelos CGG, que não eram distinguíveis por SB. Em mPCR, esses dois alelos foram claramente detectados com 30 CGG metilado e 31 CGG não metilado (Figura 12F), desta maneira revelando metilação específica de alelo não de- tectável através de análise SB. Tabela 10. Comparação de análises mPCR e SB para 14 amostras clínicas. Amostras marcadas com * são mostradas na Figura 2. To¬das as amostras com 100% ou mais de metilação foram categori¬camente classificadas ">100%".

[000133] Outras modalidades da invenção serão aparentes àqueles versados na técnica a partir de consideração da especificação e práti¬ca da invenção revelada aqui. É pretendido que o relatório e os exem¬plos sejam considerados apenas exemplares, com o verdadeiro esco¬po e espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações que seguem. A listagem de etapas em um método em uma ordem particu¬lar não deve ser considerada como uma indicação que as etapas de¬vem ser realizadas nesta ordem, exceto onde houver uma indicação explícita para o contrário ou o resultado de uma etapa seja requerido para ocorrência de outra etapa. Por exemplo, etapas de "contato de uma primeira porção da amostra com uma DNase sensível à metila- ção" e "adição de um padrão de referência GC à amostra" podem ser realizadas em qualquer ordem porque nenhuma etapa requer um re¬sultado da outra. Por outro lado, "submissão da primeira porção e uma segunda porção da amostra, cada uma contendo o padrão de referên¬cia GC, a uma reação de amplificação de DNA" ocorre após "adição de um padrão de referência GC à amostra" porque a etapa de submissão requer a presença da referência GC em porções da amostra, que re¬sulta da etapa de adição.

[000134] Todas as referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Até o ponto que publicações e patentes ou pedidos de patente incorporados a título de referência contradigam a invenção contida na especificação, o pedido vai suplan¬tar qualquer material contraditório.

Claims (15)

1. Método de caracterização de um locus de FMR1 ou um locus de FRM2 em uma amostra de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) contato de uma primeira porção da amostra com uma DNase sensível à metilação; b) adição de um padrão de referência GC à amostra, em que o padrão de referência: (i) compreende uma sequência possuindo a fórmula 5’-A-B- C-3’, onde A e C representam sequências reconhecidas por primers de PCR avançado e reverso e B é uma sequência rica em GC; (ii) tem pelo menos 75% de riqueza GC; e (iii) tem um tempo de retenção relativo como medido por eletroforese capilar de menos do que ou igual a 3 repetições CGG; c) submissão da primeira porção e de uma segunda porção da amostra, cada uma contendo o padrão de referência GC e primers de PCR avançado e reverso, para uma reação de amplificação de DNA de modo que uma sequência alvo de locus FMR1 ou FMR2 e um padrão de referência são amplificados, em que o DNA amplificado em cada porção é marcado com um marcador diferente; e d) análise do DNA amplificado das primeiras e segunda porções da amostra, desta maneira definindo a porcentagem de meti- lação e o número de repetições CGG presentes no locus de FMR, em que a etapa (d) compreende eletroforese capilar (CE).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência GC é destituído de sítios de reconhecimento para a DNase sensível à metilação.

3. Método de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o DNA amplificado das primeira e segunda porções da amostra é analisado em uma rodada de CE úni- ca.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência GC possui um tempo de retenção relativo como medido por eletroforese capilar de zero ou menos do que zero repetições CGG.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a DNase sensível à metilação é escolhida de Hpa II, Eag I ou Nru I.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a reação de amplificação com¬preende uma mistura do dNTP com uma razão de GC/AT maior do que 1.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a razão de GC/AT é de 2,5 a 10.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o locus de FMR é um locus de FMR1.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência GC é adi-cionado à amostra após contato da primeira porção com a DNase sen-sível à metilação.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica¬ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência GC é adicionado à amostra antes do contato da primeira porção com a DNase sensível à metilação.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica¬ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contato da segunda porção da amostra com uma enzima controle que não cli¬va o DNA amplificado.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a enzima controle é EcoRI ou Sau3A1.

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou reivindica-ção 12, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência GC é destituído de sítios de reconhecimento para a DNase sensível à meti- lação, o padrão de referência GC é adicionado à amostra antes do contato da primeira porção com a DNase sensível à metilação, e a en-zima controle é EcoRI.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindica¬ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência GC tem um tempo de retenção relativo conforme medido por eletroforese capilar de menos do que 0 repetições de CGG.

15. Método de análise de um locus FMR1 ou um locus FMR2 de uma amostra de DNA humana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) contato de uma primeira porção da amostra com uma DNase sensível à metilação; b) adição de um padrão de referência GC à amostra, em que o padrão de referência: (i) compreende uma sequência possuindo a fórmula 5’-A-B- C-3’, onde A e C representam sequências reconhecidas por primers de PCR avançado e reverso e B é uma sequência rica em GC; (ii) tem pelo menos 75% de riqueza de GC; e (iii) tem um tempo de retenção relativo como medido por eletroforese capilar de menos do que ou igual a 3 repetições CGG; c) submissão da primeira porção e da segunda porção da amostra, cada uma contendo o padrão de referência GC e primers de PCR avançado e reverso, a uma reação de amplificação de DNA, de modo que uma sequência alvo de locus FMR1 ou FMR2 e um padrão de referência são amplificados, em que o DNA amplificado em cada porção é marcado com um marcador diferente; e d) análise do DNA amplificado das primeira e segunda por-ções da amostra, desta maneira detectando hiperexpansão e hiperme- tilação das regiões ricas em GC em um locus genético selecionado de FMR1, FMR2, o 5’-UTR de FMR1, o 5’-UTR de FMR2, repetições CGG dentro do 5’-UTR de FMR1, e tições CGG dentro do 5’-UTR de FMR2.

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