KR20140047717A - 박테리아성 히스타민의 산물 및 이의 용도 - Google Patents

박테리아성 히스타민의 산물 및 이의 용도 Download PDF

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제임스 베르살로빅
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바이오가이아 에이비
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Abstract

히스타민을 생산하는 특이적인 프로바이오틱 젖산 박테리아의 선별하는 방법 및 포유류에게 이로운 효과를 위한 이러한 균주의 용도가 제공된다. 특히 본 발명은 포유류내 히스타민의 국부적 생산에서의 용도를 위한 젖산 박테리아 균주를 선별하는 방법과 관련되며, 여기서 상기 방법은 활성 히스티딘 오페론의 존재를 위해 박테리아를 스크리닝하는 단계 및 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함한다. 바람직하게 상기 균주는 250 pg/ml보다 큰 수준에서 히스타민을 생산하는 이의 능력에 대해 선별된다. 추가로 본 발명은 포유류내 히스타민의 국부적인 생산에서의 용도를 위해, 특히 염증 질환의 치료 또는 예방에서의 용도를 위해 본 발명의 선별 방법으로 얻을 수 있는 균주를 포함하는 산물을 제공한다.

Description

박테리아성 히스타민의 산물 및 이의 용도{PRODUCTION AND USE OF BACTERIAL HISTAMINE}
발명의 분야
본 발명은 히스타민을 생산하는 특이적인 프로바이오틱(probiotic) 젖산 박테리아를 선별하는 방법 및 숙주에게 이로운 효과를 전달하기 위해 이러한 균주의 용도와 관련된다.
본 발명의 배경
국제 연합의 식량 농업 기구는 프로바이오틱스(probiotics)를 "적절한 양으로 투여될 때 숙주에게 건강 혜택을 주는 살아있는 미생물 "로서 정의한다. 오늘날에는, 다수의 상이한 박테리아가 프로바이오틱스 예를 들어, 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria)와 같은 젖산 생산 박테리아로서 이용된다.
젖산 생산 박테리아는 인간 또는 동물의 건강에서 상기 박테리아의 이로운 효과를 위해 이용될 뿐만 아니라, 또한 그들이 발효 공정을 위해 식품 산업에서도 광범위하게 이용된다. 프로바이오틱스의 효과는 균주-특이적이고, 그리고 균주 각각은 상이한 메커니즘을 통해 숙주 건강에 기여할 수 있다. 프로바이오틱스는 병원체의 증식을 예방하거나 저해할 수 있고, 병원체에 의한 병독 인자(virulence factor)의 생산을 억제할 수 있고, 또는 전-염증 또는 항-염증 경로에서 면역 반응을 조절할 수 있다. 프로바이오틱 젖산 생산 박테리아, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)의 상이한 균주의 이용은 영아 산통의 개선, 습진의 완화, 직업병 사건의 감소, 및 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염의 억제를 위한 유망한 치료법이다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 인간 위장관의 고유 유기체로 간주되고 예를 들어, 위체부(gastric corpus), 유문동(gastric antrum), 십이지장, 및 회장의 점막 상에 존재한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,439,678호, 제5,458,875호, 제5,534,253호, 제5,837,238호, 및 제5,849,289호를 참고한다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri)가 글리세롤의 존재시 무산소 조건 하에 성장될 때, 그들은 루테린 (β-하이드록시 프로피온알데하이드)으로 공지된 항미생물 물질을 생산한다.
숙주 및 이의 미생물 사이의 관계는 복잡하고, 몇몇 박테리아의 경우, 이 숙주:미생물 관계는 수년에 걸쳐 공동-진화를 발달시켰다. 이것은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)에 대해 특히 사실임을 나타낸다. 장 미생물 및 인간 숙주 사이의 상호공생 관계의 지식은 이의 초기단계이지만, 장 미생물군집이 장에서 중요한 역할을 하고 면역계 발달, 영양, 및 새로운 연결이 장 미생물군집과 뇌 사이에서 확립되고 있다는 점을 이미 예리하게 알고 있다. 정상적인 장 미생물군집의 동요인, 장내 세균 불균형(dysbiosis)은 국부적인 장 환경에 영향을 미치는 것들을 포함하는 광범위한 질병 과정, 가령 염증성 장 질환 (IBD) 및 과민성 대장 증후군 (IBS) 및 장에서 먼 부위에서의 질병 과정, 가령 대사 증후군과 관련되어 왔다. 유의적인 치료 가능성은 장 미생물군집 내에 있으며, 그리고 연구는 뚜렷한 질병 과정을 예방하고 및/또는 치료하기 위하여 미생물 커뮤니티(microbial community)를 변경하는 미래 목표를 향해 노력하고 있다.
따라서, 숙주의 건강에 영향을 주는 특이적인 질병 또는 기타 상황과 관련된 미생물과 인간 사이의 이러한 특이적인 상호작용을 이해할 필요가 있으며 이는 가장 적절한 프로바이오틱 균주가 선별되고 이러한 발달에 대응하는 데에 이용될 수 있도록 하기 위함이다.
발명의 요약
본 발명은 포유류, 특히 인간에서 히스타민을 국부적으로 생산하는 특이적인 방법을 제공하고, 히스타민의 국부적인 생산은 젖산 박테리아의 특정한 균주를 선별함으로써 포유류 신체의 GI 관, 비뇨생식기 (GU) 관, 구강에서, 폐와 기도에서, 피부 상에서의 생산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 박테리아는 특정한 아미노산 및/또는 당과 함께 전달되고, 개별적으로 투여될 수 있거나 또는 활성 부위에 이미 존재할 수 있다.
본 발명의 첫 번째 목적은 포유류 신체의 GI 관, GU 관, 구강을 비롯한, 여러 가지 위치에서, 폐와 기도에서, 피부 상에서 히스타민을 국부적으로 생산할 수 있는 균주를 선별하는 것이다.
상기 균주를 함유한 산물을 제공하는 것이 본 발명의 추가적인 목적이다.
히스타민의 국부적인 발생을 보장하기 위하여, 히스티딘, 또는 히스티딘 함유 식품 또는 조성물의 투여와 박테리아의 투여를 병용하는 것이 본 발명의 추가적인 목적이다.
따라서 본 발명은 프로바이오틱스로서 그리고 치료법으로 유용한 젖산 박테리아 세포를 선별하기 위한 새로운 방법과 관련된다. 이 새로운 방법은 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있는 젖산 박테리아의 균주에 대한 스크리닝(screening) 및 선별을 포함한다. 놀랍게도, 이 방법에 의해 선별된 젖산 박테리아 균주는 프로바이오틱스로서 그리고 치료법으로, 특히 히스타민의 국부적인 생산의 방식으로, 항-염증 효과를 유발하는 것에서 유용하다. 박테리아의 이들 효과는 본 명세서의 다른 부분에서 논의된 바와 같이, 놀라우며, 이전에 히스타민을 생산하는 박테리아의 식품내 존재는 인식되는 건강상의 위험, 예를 들어, 잠재적인 독성 효과 때문에 능동적으로 회피되었다. 따라서, 포유류에게 히스타민의 국부적인 생산을 할 수 있는 젖산 박테리아의 투여, 또는 사실상, 활성 히스티딘 오페론 및 히스타민을 생산하는 능력의 존재에 기반하여 히스타민의 국부적인 생산의 이러한 능력을 위한 젖산 박테리아의 스크리닝 및 선별은 이 교시에 대한 직관에 반대된다. 사실상, 프로바이오틱스는 히스타민을 생산하는 것으로 보고된 적이 전에도 전혀 없었다.
따라서, 가장 일반적으로, 본 발명은 포유류내 히스타민의 국부적인 생산에서의 용도를 위한 젖산 박테리아 균주를 선별하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 활성 히스티딘 오페론의 존재에 대해 박테리아를 선별하는 단계 및 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함한다.
히스티딘 오페론은 세 가지 유전자 (히스티딘/히스타민 역수송체, 히스티딘 탈카르복실화효소 피루보일 유형 A (HdcA), 및 히스티딘 탈카르복실화효소 피루보일 유형 B (HdcB))를 포함한다. 각각의 이들 유전자의 활성도는 본 발명에 있어 중요하다는 점이 간주된다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보 박테리아는 모든 세 가지 유전자의 존재에 대해 평가되고 그리고 모든 세 가지 유전자에 대해 양성인 균주가 선별된다. 임의의 적절한 방법은 모든 세 가지 유전자의 존재의 탐지를 위해 이용될 수 있는데, 예를 들어, PCR과 같은 유전적 방법이 이용될 수 있다. 양호한 수준의 히스타민의 생산은 또한 모든 세 가지 유전자의 존재 및 활성 히스티딘 오페론의 존재의 지표일 수 있다. 따라서, 본 발명의 선별 방법은 히스타민을 생산할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 또한 수반한다. 고 생산 수준의 히스타민을 갖는 균주가 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 균주는 200 초과, 바람직하게는 250 초과 또는 더 바람직하게는 300 pg/ml 초과의 수준, 예를 들어, 350, 400, 450, 또는 500 pg/ml 초과의 수준으로 히스타민을 생산하는 이의 능력에 대해 선별된다. 이러한 값은 일반적으로 배양내 균주의 상청액에서 측정된 히스타민 값을 나타낸다.
히스타민 생산의 수준을 측정하는 적절한 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지될 것이다. 질량 분석법, 더욱 특이적으로 삼중 4극 질량 분석법의 방법이 본 명세서에서 예시화되고 선호된다. 하지만, 동일하게 ELISA 또는 면역어세이(immunoassay)가 히스타민 생산을 평가하고 정량화하는 데에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 몇몇 구체예에서, 선별 방법은 후보 균주에 의해 생산된 히스타민의 양 또는 수준을 탐지하는 단계가 수반될 것이다. 본 발명의 방법에 의해 선별된 균주의 다운스트림(downstream) 용도 때문에, 히스타민 생산 균주가 선별되거나 단리된 후, 다른 구체예는 이러한 균주를 배양하거나 번식시키는, 또는 가능한 한, 추후 사용을 위해 이러한 균주를 저장하는 추가 단계를 수반할 것이다.
이러한 추가 단계 (및 사실상 본 발명의 방법의 선별 단계)는 일반적으로, 히스타민 생산을 지원하는 적절한 배양 배지에서 수행될 필요가 있을 것이다. 바람직한 배양 배지는 상기 균주에 의한 히스타민의 생산을 지원할 적절한 탄소원을 함유할 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 배지는 탄소원으로서 글루코오스를 포함할 것이고 바람직하게는 수크로오스를 함유하지 않을 것이고, 또는 적어도, 균주에 의한 히스타민 생산을 유의적으로 약화시키지 않을 그런 수준으로만 수크로오스를 포함할 것이다. 히스티딘 또는 히스티딘 유사체가 또한 선택적으로, 다른 아미노산의 수크로오스와 함께 제공될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)의 균주이다.
본 발명의 방법을 이용하여 일단 적절한 균주가 선별되면, 이후 포유류내 히스타민의 국부적인 생산을 위해 이용될 수 있다. 따라서 상기 균주는 포유류내 히스타민의 국부적인 생산을 또한 할 수 있어야 한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 포유류내 히스타민의 국부적인 생산에서의 용도를 위해, 본 발명의 선별 방법으로 얻을 수 있는 젖산 박테리아 균주의 세포를 포함하는 산물을 제공하며, 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있다. 본 명세서의 다른 부분에서 약술되는 바와 같이, 바람직한 용도는 염증 질환의 치료 및/또는 예방, 또는 국부적인 히스타민 생산으로부터 이익을 얻을 질환 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 있다. 예를 들어, 히스타민의 이러한 국부적인 생산은 항-염증 효과를 야기할 수 있다.
본 발명의 대안적인 구체예는 포유류내 히스타민의 국부적인 생산에서의 용도를 위해 히스타민을 생산할 수 있는 젖산 박테리아 균주를 제공하며, 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖는다. 이 균주의 바람직한 특징 및 이의 용도는 본 명세서의 다른 부분에서 기술된다.
치료의 방법 또는 포유류내 히스타민의 국부적인 생산을 위한 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 상기 포유류에게 상기 포유류에서 히스타민의 국부적인 생산을 가능하게 하는 데에 효과적인 양으로, 본 발명의 선별 방법으로 얻을 수 있는 젖산 박테리아 균주의 세포를 포함하는 산물의 투여, 또는 젖산 박테리아 균주의 투여를 포함하며, 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있다. 균주의 바람직한 특징 및 이의 치료학적 용도는 본 명세서의 다른 부분에서 기술된다.
포유류내 히스타민의 국부적인 생산에서의 용도를 위한 조성물 또는 약물의 제조에서, 본 발명의 선별 방법으로 얻을 수 있는 젖산 박테리아 균주의 세포를 포함하는 산물의 용도가 본 발명에 의해 또한 제공되며, 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있다. 대안적인 구체예는 포유류내 히스타민의 국부적인 생산에서의 용도를 위한 조성물 또는 약물의 제조에서, 젖산 박테리아 균주의 용도를 제공하며, 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타딘을 생산할 수 있다. 균주의 바람직한 특징 및 이의 치료학적 용도는 본 명세서의 다른 부분에서 기술된다.
도 1 - HILIC-HPLC 분획물내 히스타민의 정량화. HILIC-HPLC 분획물의 선별 범위에서 존재하는 히스타민을 정량화하는 데에 삼중 4극 질량 분석법이 이용되었다. TNF-저해성 분획물은 검사된 모든 분획물 중 가장 많은 양의 히스타민을 가졌다.
도 2 - 정제된 히스타민 및 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475로부터의 히스타민은 히스타민 H2 수용체를 통해 TNF 생산을 저해한다. A. 정제된 히스타민은 TNF 생산을 유의적으로 저해하였고, 이는 용량-의존적 방식으로 특이적인 H2 수용체 길항제에 의해 차단된 효과이다. 균주 6475로부터 분비된 인자를 함유 (히스타민을 포함)한 조건화 배지 (또는 상청액)는 TNF 생산을 유의적으로 저해하였고, 이는 특이적인 H2 수용체 길항제에 의해 부분적으로 차단된 효과이다. N=3, 대조 배지와 비교하여 *p 값 < 0.05, 히스타민과 비교하여 **p 값 < 0.05, ATCC 6475 조건화 배지 (CM)와 비교하여 ***p 값 < 0.05. B. 히스타민을 함유한 균주 6475로부터의 세척된 세포 펠렛(pellet)은 TNF 생산을 억제하였고, 이는 특이적인 H2 수용체 길항제에 의해 부분적으로 차단된 효과이다. 상대적으로 순수한 히스타민을 함유한, 분획물 B3은 TNF 생산을 저해하였고, 이는 특이적인 H2 수용체 길항제에 의해 완전하게 차단된 효과이다. N=3, 대조 배지와 비교하여 *p 값 < 0.05, 세척된 ATCC 6475 세포 펠렛 (CP)과 비교하여 **p 값 <0.05, 분획물 B3과 비교하여 ***p 값 < 0.05.
도 3 - 히스티딘 오페론은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475의 TNF-저해성 표현형에 있어 중요하다. A. 히스티딘 오페론은 세 가지 유전자, 히스티딘/히스타민 역수송체, hdcA, 및 hdcB로 구성된다. B. 히스티딘 오페론내 임의의 한 가지 유전자에서의 돌연변이는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475에 의한 TNF 억제의 부분적인 감소를 야기한다. N=9, 대조 배지와 비교하여 *p 값 < 0.05, ATCC PTA 6475와 비교하여 **p 값 < 0.05.
도 4 - 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475는 TNBS 공격(challenge)에 의해 유도되는 무게 감소를 유의적으로 감소시켰고, 이 도면은 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 나타낸다, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
도 5 - 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475는 TNBS 공격에 의해 유도된 거시적인 결장 손상을 유의적으로 감소시켰고, 이 도면은 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 나타낸다, *p<0.05, ***p<0.001.
도 6 - 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475는 TNBS 공격에 의해 유도된 SAA 농도를 유의적으로 감소시켰고, 이 도면은 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 나타낸다, * p<0.05, *** p<0.001.
도 7 - 수득된 hdcA 돌연변이체는 결장염을 약화시키는 능력을 감소시켰고, 이 도면은 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 나타낸다, * p<0.05, ** p<0.01.
도 8 - 수득된 hdcA 돌연변이체는 결장염을 약화시키는 능력을 감소시켰고, 이 도면은 2개의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 나타낸다, * p<0.01, ** p<0.001.
본 발명의 상세한 설명 및 이의 바람직한 구체예
본 명세서에서 발명자는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)의 특정한 균주를 비롯한, 선별된 군의 락토바실리(lactobacilli)가 특정한 성장 조건 하에 히스타민을 국부적으로 생산한다는 점, 그리고 이러한 생산된 히스타민은 예를 들어, 염증을 감소시킴으로써, 그리고 특정한 암 등을 감소시킴으로써 숙주에게 이로울 것이라는 점을 밝혀냈다.
히스타민
히스타민은 국부적인 면역 반응을 비롯한, 그리고 장에서의 생리학적 기능을 조절하는 및 신경 전달 물질로서 작용하는 포유류의 여러 가지 건강 연관 공정에 관련된 유기 질소 화합물이다. 외래 병원체에 대한 면역 반응의 부분으로서, 히스타민은 호염구 및 비만 세포에 의해 생산된다. 히스타민은 아미노산 히스티딘의 탈카르복실화로부터 유래될 수 있고, 반응은 효소 L-히스티딘 탈카르복실화효소에 의해 촉매된다.
박테리아는 진핵 생물에서 발견되는 것들과 관련되지 않는 탈카르복실화효소 를 이용하여 히스타민을 생산할 수 있다. 오늘 날까지, 특정한 박테리아 균주에 의한 히스타민의 이러한 생산은 인간을 위한 가능한 혜택보다는 건강 위험으로서 보여지고 있다. 예를 들어, 비-감염성 식품 매개 질병의 형태인, 스콤브로이드(Scombroid) 식중독은 상한 식품, 특히 생선에서 박테리아에 의한 히스타민 생산에 기인한다. 발효 식품 및 음료는 발효 박테리아 또는 효모에 의해 수행되는 유사한 전환에 기인하여 적은 양의 히스타민을 자연적으로 함유한다. 선별된 박테리아로부터 특정 제어량의 히스타민의 전달은 놀랍게도, 상기 언급된 연구로부터 예상될 수 있는 바와 같은 해로운 효과보다는 이로운 효과를 줄 수 있다.
히스타민 수용체는 이들의 내생 리간드로서 히스타민과의 G 단백질-결합 수용체의 종류이다. 네 가지 공지된 히스타민 수용체가 있다; H1수용체 (H1R), H2수용체 (H2R), H3수용체 (H3R) 및 H4수용체 (H4R).
Vannier et al. (Histamine Suppresses Gene Expression and Synthesis of Tumor Necrosis Factor α via Histamine H 2 Receptors; J Exp Med. 1991 July 1;174(1):281-4)은 말초 혈액 단핵 세포내 TNF-α의 LPS-유도된 합성이 히스타민에 의해 억제되었다는 점을 보여주었고 그리고 그들은 추가로, 비만 세포로부터의 히스타민 방출이 H2 수용체-포함 세포내 국부적인 사이토카인 합성을 억제함으로써 염증 및 면역 반응의 정도를 제한할 수도 있다는 점을 제시한다.
히스타민의 항-염증 활성도는 Wang et al. (Histamine Antagonizes Tumor Necrosis Factor (TNF) Signaling by Stimulating TNF Receptor Shedding from the Cell Surface and Golgi Storage Pool; J. Biol. Chem. 278(24): 21751-21760)에 의해 이전에 개시되었으며, 이는 히스타민이 표면 TNFR1의 일시적인 감소, 증가된 TNFR1 박리(shedding), 및 배양된 인간 내피 세포내 골지(Golgi)로부터 TNFR1 분자의 가동화(mobilization)를 야기한다는 점을 보여준다. 면역결핍 생쥐에게 이식된 인간 피부 내로 히스타민 주사는 TNFR1의 박리를 야기하였고 내피 부착 분자의 TNF-매개된 유도를 감소시켰다.
Vannier et al. 및 Wang et al.은 프로바이오틱스로서 박테리아 균주를 생산하는 히스타민을 이용하는 것에 대하여 또는 숙주를 위한 특정한 건강 혜택, 가령 항-염증 효과를 보장하기 위해 이들 히스타민-생산 능력에 기반하여 어떻게 균주를 선별하는 지에 대하여 어떠한 것도 언급하지 않았다.
히스타민 디하이드로클로라이드의 제약학적-등급 형태인, 세플렌(Ceplene)이 급성 골수성 백혈병 (AML)을 진단받은 환자에서 재발의 예방을 위해 이용된다. 세플렌은 AML의 차도-후 단계에서, 즉 환자가 초기 화학요법을 끝마쳤을 때, 저용량의 면역-활성화 사이토카인 인터루킨-2 (IL-2)와 함께 투여된다. 연구는 세플렌/IL-2가 백혈병 세포의 면역-매개 사멸을 유도할 수 있다는 점을 보여주었다. 치료, 피하 주사는 18 개월 동안 집에서 환자에게 3-주 주기로 제공된다. 세플렌의 부작용은 일시적인 홍조와 두통을 포함한다. 필요 시, 피하 주사 대신에, 국부적으로 생산된 히스타민을 받는 것이 환자에게 이로울 것이다; 이 전달 전략은 본 발명에 따라 선별된 균주를 이용하여 환자에게 박테리아-유도된 히스타민을 투여함으로써 성취될 수 있다.
그람-음성 박테리아는 온도 오용 후 예를 들어 날 생선 및 고기에서 히스타민을 형성한다는 점 그리고 그람-양성 박테라아는 발효된 식품, 가령 치즈, 소시지, 된장, 콩 소스, 맥주 및 와인의 히스타민 부패를 야기한다는 점이 이전에 공지되었다. 식품에서 히스타민-생산 박테리아의 식별은 어려웠다.
또한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)는 이전에 히스타민과 연관되어 왔고, Casas et al. (Validation of the Probiotic Concept: Lactobacillus reuteri Confers Broad-spectrum Protection against Disease in Humans and Animals.; 2000, ISSN 0891-060X)은 Straub et.al. (Z Lebensm Unters Forsch(1995) 201: 79- 82) 관리 하의 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 두 가지 균주가 히스타민을 형성하기 위해 L-히스티딘을 탈카르복실화하는 것을 보여주었다는 점을 보고하고 그리고 상기 저자들은 프로바이오틱스로서 그리고 식품의 발효를 위한 이러한 균주를 이용하는 것에 대해 경고한다.
Trip et al. (HdcB, a novel enzyme catalyzing maturation of pyruvoyl-dependent histidine decarboxylase; Molecular Microbiology (2011) 79(4), 861-871)은 히스타민-생산 그람-양성 박테리아 중 히스티딘 탈카르복실화 유전자 자리의 유전적 구성화의 세 가지 유형을 나타낸다. 가장 큰 군은 락토바실러스 힐가르디(L. hilgardii) 0006, 락토바실러스 부크네리(L. buchneri) B301, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) F275 및 티오바실러스 할로필러스(T. halophilus)를 비롯한 젖산 박테리아에서 발견된다. 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii) 0006은 Lucas et al. (Histamine-Producing Pathway Encoded on an Unstable Plasmid in Lactobacillus hilgardii 0006; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2005, Vol. 71, No. 3, p. 1417-1424)에 의해 수행된 연구에서, 히스타민을 생산하는 것으로 나타났고, 그들은 추가로, 히스타민이 바람직하지 않은 박테리아의 성장 동안 여러 가지 산물에서 나타나는 오염물질이라는 점을 나타낸다. Lucas et al.은 와인의 그람-양성 박테리아의 히스타민-생산 경로에 관련된 유전자를 식별하기 위해 와인 젖산 박테리아의 수집의 스크리닝을 수행하였다.
락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri)의 히스타민 생산 균주는 히스타민 중독(poisoning)의 발생과 연관된 스위스 치즈로부터 단리되었다 (Summer et al. Isolation of histamine-producing Lactobacillus buchneri from Swiss cheese implicated in a food poisoning outbreak.; Applied and Environmental Microbiology (1985), Vol. 50, Issue 4, p. 1094-1096).
Calles-Enriquez et al. (Sequencing and Transcriptional Analysis of the Streptococcus thermophiles Histamine Biosynthesis Gene Cluster: Factors That Affect Differential hdcA Expression; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept. 2010, Vol 76, No. 18, p. 6231-6238)은 여러 가지 특정한 치즈 및 요거트의 상품을 위해 이용되는 호열성 스타터(starter)인, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophiles)의 히스타민-생산 균주를 기술한다. 추가로 그들은 히스티딘을 탈카르복실화하는 능력을 가진 균주의 존재가 제조 동안 또는 소비 전 저장 동안에 생산되는 히스타민을 함유한 산물을 야기할 수 있다는 점 그리고 이것은 발효된 유제품의 제조에서 오로지 히스타민-음성 균주만 이용하는 중요성을 강조한다는 점을 명시한다.
몇몇 락토바실러스(Lactobacillus)가 히스타민을 생산할 수 있다는 점이 이전에 공지되었음에도 불구하고, 히스타민을 생산하는 능력은 이의 숙주를 위한 특정한 건강 혜택, 예를 들어 특정한 락토바실러스(Lactobacillus) 균주의 항-염증 특성을 보장하기 위한 주요 요인이라는 점이 분명하게 공지되지 않았다.
이것이 락토바실러스(Lactobacillus)의 특정한 프로바이오틱 균주의 스크리닝 및 선별을 위해 이용될 수 있다는 점은 선행 기술로부터 공지되지 않거나 또는 명확하지 않다.
비만 세포
비만 세포 (또한 비만세포(mastocyte) 및 비만세포(labrocyte)로도 공지됨)는 여러 가지 유형의 조직의 상주 세포(resident cell)이고 히스타민 및 헤파린에서 풍부한 과립을 많이 함유한다. 알러지(allergy) 및 아나필락시스(anaphylaxis)에서 비만 세포의 역할이 가장 알려져 있지만, 비만 세포는 예를 들어 상처 치유 및 병원체에 대한 방어에 밀접하게 관련되는, 중요한 보호 역할도 한다.
비만 세포는 혈관 및 신경을 특징적으로 둘러싸는 조직에서 가장 많이 존재하고, 바깥 환경과 내부 환경 사이의 경계 근처, 가령 피부, 폐와 소화관의 점막, 그리고 입, 결막 및 코에서 특히 두드러진다.
알러지 반응에서, 비만 세포는 알러지원(allergen)이 이미 세포와 관련하여 IgE에 결합할 때까지 불활성으로 남아있는다. 다른 막 활성화 사건은 차후 탈과립화를 위해 비만 세포를 준비시킬 수 있거나 또는 FceRI 신호전달과 동반상승효과(synergy)로 작용할 수 있다. 이러한 과립화로부터 히스타민은 후모세혈관 정맥(post capillary venules)을 팽창시키고, 내피를 활성화하고, 그리고 혈관 침투성을 증가시킨다. 히스타민 방출은 국부적인 부종 (부기(swelling)), 온기, 발적, 및 방출 부위로 다른 염증 세포의 유인을 초래한다. 또한 이는 신경 말단을 자극한다 (가려움 또는 통증을 초래함). 히스타민 방출의 피부 징후는 "팽진 및 발적"-반응이다. 모기한테 물린 후 즉시 나타나는 돌기 및 발적이 알러지원에 의한 비만 세포의 공격 몇 초 이후에 발생하는, 이 반응의 좋은 예시이다. 비만 세포의 다른 생리학적 활성도는 훨씬 더 적게 이해된다. 여러 가지 증거는 비만 세포가 선천성 면역에서 상당히 근본적인 역할을 할 수 있다는 점을 제시한다 - 그들은 매우 다양한 중요 사이토카인 및 기타 염증 매개체, 가령 TNFα를 정교하게 할 수 있고, 그들은 다양한 종류의 병원체를 인식하는 것에 관련된 것으로 간주되는 복수의 "패턴 인식 수용체"를 발현하고, 그리고 비만 세포가 없는 생쥐는 여러 가지 감염에 훨씬 더 취약한 것으로 보인다.
식품내 박테리아성 히스타민의 독성 및 발효된 제품에서 히스타민-생산 균주를 피하는 것이 권고되는 사실을 고려하면 (Calles-Enriquez et al. Sequencing and Transcriptional Analysis of the Streptococcus thermophiles Histamine Biosynthesis Gene Cluster: Factors That Affect Differential hdcA Expression; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept. 2010, Vol. 76, No. 18, p. 6231-6238내 예시를 추가로 참고), 다양한 질병의 치료 및/또는 예방에서 히스타민의 국부적인 생산을 위한 특정 선별 락토바실러스 (Lactobacillus) 균주를 이용하는 것이 명확한 것으로 간주되지 않을 수 있다.
숙주 및 이의 미생물 사이의 관계는 복잡하고, 이것은 일정한 포유류 자체의 세포 유형,　가령 비만세포의 경우에도 그러하다. 이 숙주-미생물 관계는 수 년의 공동-진화를 걸쳐 발달되어 왔고, 이것은 영양적으로, 면역학적으로 등 숙주에게 이로울 수 있는, 특이적인 수용체의 전체 또는 부분적인 길항제, 작용제, 탈-감작 등 또는 다른 공정으로서 작용할 수 있는 다양한 대사물의 미생물 생산을 포함한다. 따라서, 숙주의 건강에 영향을 주는 특이적인 질병 또는 다른 상황에 관련된 미생물과 인간 사이의 이러한 특이적인 상호작용을 이해할 필요가 또한 있으며 이는 가장 적절한 프로바이오틱 균주가 선별되고 이러한 발달에 대응하는 데에 이용될 수 있도록 하기 위함이다.
본 명세서에서 발명자는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)의 특정한 균주를 비롯한, 선별된 군의 락토바실리(lactobacilli)가 특정한 성장 조건 하에 히스타민을 국부적으로 생산한다는 점을 밝혀냈다. 그리고 이러한 국부적으로 생산된 히스타민은 초기 신념과 대조적으로, 염증의 감소, 특정한 암을 감소시키는 것을 비롯한 복수의 방식으로 숙주에게 이로울 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신바이오틱(symbiotic) 산물을 갖기 위하여, 특정한 탄소원과 함께 상기 균주를 함유하는 산물을 제공하는 것이다.
다른 목적 및 이점은 다음 개시 및 첨부된 청구범위에서 더욱 완전하게 명백해질 것이다.
본 발명에 따라 선별된 젖산 박테리아 균주를 포유류에게 투여하는 것은 여러 가지 이유로 이로울 수 있는 국부적으로 생산된 히스타민을 야기할 것이다.
본 발명의 주요 목적은 양호한 항-염증 효과를 보장하는 젖산 박테리아 균주를 선별하는 방법을 제공하는 것이다. 이들 균주는 염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 바람직하게 이용될 수 있는데, 그 이유는 히스티딘 오페론 및 히스타민의 생산이 특정한 젖산 박테리아의 항-염증 능력에 있어 필수적이기 때문이다. 바람직하게, 균주는 포유류 신체의 GI 관, GU 관, 구강에서, 폐 및 기도에서, 피부 등에서 결장염, IBD, IBS, 게실증, 치은염, 질염 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 염증 과정의 치료 및/또는 예방을 위해 이용될 수 있다. H2 수용체를 통한 히스타민은 TNF-알파의 유전자 발현을 감소시킬 수 있다는 점이 이전에 공지되었다. 추가로, 비만 세포는 매우 다양한 중요 사이토카인 및 기타 염증 매개체, 가령 TNF-알파를 정교하게 할 수 있다. 하지만, 히스티딘 오페론, 및 이러한 선별된 균주의 국부적인 히스타민 생산은 숙주에게 이로울 수 있고 그리고 예를 들어 선별된 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 균주의 항-염증 능력에서 주요 요인이라는 점이 이전에는 공지되지 않았다. 히스타민을 요구하는 치료에서 본 발명에 따라 선별된 락토바실러스 루테리 (L. reuteri)를 이용하는 것도 이전에 공지되지 않았다.
염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 바람직한 산물 및 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 특히 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 6475 (ATCC PTA 6475)이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이용된 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 6475 (ATCC PTA 6475)가 아니다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 본 발명의 균주, 산물 및 조성물의 치료학적 용도는 관련된 질병 또는 질병의 증상의 감소 또는 완화를 일반적으로 야기한다, 예를 들어 포유류에서 염증 수준의 유의적인 감소를 야기할 수 있다. 예를 들어, 국부적으로 생산된 히스타민은 즉 전-염증성 사이토카인의 저해를 통해, 장 상피 세포에서 그리고 면역 세포에서 H2 수용체를 활성화시켜 숙주 점막의 면역력을 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 활성도 부위에서 식이 성분 (히스티딘)을 히스타민으로 전환 그리고 숙주 면역 반응 (즉 장에서)의 국부적인 조절을 허용한다. 예를 들어 히스타민의 경구 소화 또는 다른 형태의 투여보다, 특히 이러한 경구 소화는 인식된 독성 효과 및 건강 위험 때문에 옹호되지 않을 것이라는 점을 고려하면, 본 발명에 의해 제공된 히스타민의 이러한 국부적인 생산이 실제 이점을 제공할 수 있다는 점을 알 수 있다.
특히 장의 염증 질병을 고려하는 경우, 본 발명의 균주, 산물 및 조성물의 치료학적 용도는 예를 들어 월리스 점수(Wallace score)와 같은 표준 방법에 의해 측정된 궤양 및 장 손상 (가령 결장 손상)에서의 유의적인 감소, 무게 감소에서의 유의적인 감소 또는 장, 가령 결장의 염증에서 유의적인 감소를 야기할 수 있다.
질병 또는 이의 증상의 이러한 감소 또는 완화는 임의의 적절한 어세이에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게, 질병 또는 증상의 감소 또는 완화는 바람직하게도 <0.05의 확률치로, 통계학적으로 유의적이다. 질병 또는 증상의 이러한 감소 또는 완화는 일반적으로, 적절한 대조군 개체 또는 집단, 예를 들어 건강한 포유류 또는 처리되지 않거나 위약 처리된 포유류와 비교하여 결정된다.
투여의 적절한 방식 및 균주의 제제 등은 히스타민의 국부적인 생산이 바람직한 부위에 따라 선택된다. 투여의 바람직한 방식은 경구이지만, 몇몇 치료의 경우 동일하게 피부, 직장, 질, 잇몸에 국부적인 투여의 국소 또는 몇몇 다른 형태가 적절할 것이고, 또는 정맥내 또는 근육내 주사가 적절할 것이다.
본 명세서의 실시예가 결장염을 치료하기 위해 본 발명의 균주의 용도 및 이의 적절한 용량을 입증할 것이지만, 이것은 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증 질환 중 단지 한 가지 예시라는 점 그리고 본 명세서에서 정의된 바와 같은 본 발명의 균주, 산물 및 조성물의 적절한 용량은 치료되어야 할 질병, 투여의 방식 및 고려되는 제제에 따라 선택될 수 있다는 점이 이해될 것이다.
히스티딘을 포함하는 식이 혼합물은 히스티딘의 존재를 보장하고 그렇게 함으로써 박테리아의 효능을 증가시키는 데에 이용될 수 있다. 히스티딘은 단독으로 또는 박테리아와 함께 투여될 수 있다.
박테리아의 히스티딘 공급을 보장하기 위한 한 가지 가능성은 콩 단백질, 치즈, 계란, 닭고기 그리고 돼지고기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 히스티딘 풍부 식품을 먹는 것이다.
박테리아내 히스티딘 오페론은 낮은 pH 또는 에너지 공급원 제한의 조건 하에 성장 능력을 개선하는 것으로 나타났지만 (Calles-Enriquez et al.) 히스티딘 오페론은 특정한 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주의 항-염증 특징과 연관되지 않았다.
암 요법에서 본 방법에 따라 선별된 균주를 이용하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다. IL-2와 병용한 히스타민은 AML의 치료를 위해 이용되었다. 본 발명의 균주를 이용하는 것은 IL-2와 병용하여 AML의 치료를 위해 이용될 수 있는, 국부적으로 생산된 히스타민을 야기할 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식품 알러지, 다른 알러지 반응 또는 다른 자가면역 질병을 감소시키기 위하여 선별된 균주를 이용하는 것이다. 히스타민의 전신적인 증가는 이전에 공지된 바와 같이 비만 세포의 과립화에 의한 알러지의 결과이다. 본 발명에 따라 선별된 균주를 수여자에게 투여할 때, 국부적으로 생산된 히스타민은 알러지 또는 다른 자가면역 질병을 감소시킬 탈감작 효과를 야기할 것이다
또한 여행자 설사의 위험을 줄이기 위해 젖산 박테리아 균주를 생산하는 히스타민을 이용하는 것도 본 발명의 목적이다. 히스타민 차단제로 처리된 환자는 여행자 설사가 생길 증가된 위험을 가지며, 이 증가된 위험은 본 방법에 따라 선별된 젖산 박테리아를 투여함으로써 상쇄시킬 수 있었다.
본 발명의 또 다른 목적은 MS의 치료에서 선별된 균주를 이용하는 것이다. 히스타민은 MS에 대한 새로운 치료를 개발하기 위한 중요한 분자로 제안되어 왔고 본 발명에 따라 선별된 균주는 환자에게 히스타민을 제공할 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부내 이용가능한 히스티딘 및 히스티딘 유사체를 이용하여 피부-항-염증 치료로서 히스타민 생산 박테리아를 이용하는 것이다. 히스티딘은 피부가 UV 조사에 의해 생산하는 우로카닌산에 대한 기질이므로 우로카닌산은 피부 상에서 항-염증 특성을 갖는다.
ERK1/2의 활성화를 저해하기 위해 이러한 선별된 균주를 이용하기 위한 것이 또 다른 목적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TNF 알파를 저해하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증을 국부적으로 또는 전신적으로 감소시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ERK1/2를 저해함으로써 시냅스 소포 세포외 배출을 증진시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ERK1/2를 저해함으로써 인간 배아 줄기 세포 자기-재생을 촉진하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ERK1/2를 저해함으로써 대식세포 ABCA1 발현 및 콜레스테롤 유출을 유도하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ERK1/2를 저해함으로써 심장 비대 및 심부전을 감소시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 백혈병 (예를 들어 AML) 또는 악성 흑색종을 비롯한 특정한 암의 증식을 감소시키는 것이다. 따라서, 이러한 암은 본 발명의 균주, 산물 및 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 바람직한 질병이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예를 들어 CNS와의 GU 관 상호작용에서 신경 전달 물질로서, 그리고 또한 국부 통증에서 신경 신호전달로서 특정 조건 하에 히스타민을 생산하기 위해 선별된 균주를 이용하는 것이다. 신경 전달 물질로서 이 역할은 장 운동에 미치는 효과 (변비 또는 설사를 치료하기 위함) 그리고 장에서의 통증 신호전달에까지 연장될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 선별된 LAB가 히스타민을 생산하고 장 신경 시스템에서 내장의 통증 인지 및 신호전달에 영향을 줄 것이기 때문에, 장-뇌 축에 영향을 주기 위한 선별된 균주를 이용하는 것이다. 따라서, 본 발명이 히스타민의 국부적인 투여로 치료될 수 있는 임의의 질병의 치료 및/또는 예방 또는 국부적인 히스타민 생산으로부터 이익을 얻을 임의의 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 이용될 수 있다는 점을 알 수 있다.
상기 균주를 함유한 산물을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.
히스타민-생산 균주의 특정 자극을 통해 효과가 증진될, 신바이오틱 산물을 갖기 위하여, 특정 탄소원과 함께 상기 균주를 함유한 산물을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.
히스티딘 유사체 또는 히스티딘 함유 산물 또는 조성물을 비롯한, 히스티딘과 함께 상기 균주를 포함한 산물을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다. 바람직하게 이러한 혼합물은 작용 부위에서 히스티딘 및 박테리아 둘 모두의 생존을 보장하기 위해 더 낮은 GI 관에서 함유물의 방출을 위한 보호적인 캡슐로 경구로 투여된다.
상기 균주의 투여를 히스티딘 풍부 규정식과 병용하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 명세서의 다른 부분에서 정의된 바와 같은 치료학적 용도를 위한 산물을 제공하며, 여기서 상기 용도는 적어도 하나의 추가적인 치료제 또는 영양제의 투여를 추가로 포함한다. 이러한 구체예에서, 추가적인 치료제는 논의가 되고 있는 질병의 치료에서 유용한 임의의 추가적인 약제일 수 있고, 예를 들어 추가적인 항-염증제 또는 면역치료제, 가령 케모카인 또는 사이토카인 (가령 IL-2)이다.
바람직한 구체예에서, 상기 추가적인 약제는 히스티딘 또는 히스티딘 유사체, 박테리아 균주에 의해 히스타민의 생산을 지원하는 적절한 탄소원, 또는 이의 조합을 포함한다.
상기 추가적인 약제는 본 발명의 균주와 함께 투여될 수 있거나 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 추가로, 상기 추가적인 약제는 본 발명의 균주와 동시에 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다. 적합한 투여 요법 및 시기선택(timing)은 논의가 되고 있는 추가적인 약제에 따라 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 또한 제공한다:
(i) 본 발명의 선별 방법으로 얻을 수 있는 젖산 박테리아 균주 (또는 본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한 히스타민을 생산할 수 있는 젖산 박테리아 균주), 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있음; 그리고
(ii) 상기 균주에 의한 히스타민의 생산을 지원하는 적절한 탄소원, 히스티딘 또는 히스티딘 유사체의 공급원, 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 추가적인 성분.
본 명세서에서 기술된 바와 같은 본 발명의 산물, 조성물 및 용도에서, 바람직한 상기 히스티딘 또는 히스티딘 유사체는 히스티딘 또는 히스티딘 유사체 함유 식품 또는 식품 보충제의 형태이고, 또는 상기 탄소원은 글루코오스를 포함한다. 바람직하게 상기 탄소원은 수크로오스를 포함하지 않을 것이고, 또는 적어도, 균주에 의한 히스타민 생산을 유의적으로 약화시키지 않을 그런 수준으로만 수크로오스를 포함할 것이다. 선택적으로 다른 아미노산의 공급원이 또한 제공될 수 있다.
대안적인 구체예에서, 파트 (i)에서 정의된 바와 같은 균주는 논의가 되고 있는 질병의 치료에서 유용한 추가적인 성분, 즉 추가적인 치료제, 가령 추가적인 항-염증제 또는 면역치료제, 가령 케모카인 또는 사이토카인 (가령 IL-2)과 병용될 수 있다.
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)는 자연적으로 인간과 동물의 장을 저해하는 헤테로발효(heterofermentative) 젖산 박테리아 종이다. 특이적인 프로바이오틱 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 인간 TNFα 생산을 강력하게 억제하지만 다른 프로바이오틱 락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 인간 TNFα 생산을 증진시킨다.
본 명세서에서의 발명은 프로바이오틱 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 6475 및 활성화된 인간 골수 세포에 이들 효과가 입증된 다른 균주의 기계론적인 연구에 의해 가능해진다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 대사물질은 HILIC-HPLC를 이용하여 단리되었고, 그리고 히스타민은 NMR 분광법 및 질량 분석법에 의해 식별되었다. 삼중 4극 MS에 의한 히스타민의 정량화는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 6475가 글루코오스-기반 최소 배지에서 성장한 경우 상대적으로 고농도의 히스타민을 생산한다는 점을 보여주었다. 이전의 전사체학 연구는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 히스티딘 오페론내 2개의 유전자는 균주 6475에 의해 TNF를 저해하는 데에 한 역할을 할 수 있다는 점을 제시하였다. 이들 유전자의 표적된 돌연변이유발은 히스티딘 오페론내 각각의 유전자, 히스티딘/히스타민 역수송체, HdcA, 및 HdcB가 균주 6475의 TNF-저해성 표현형에 중요하다는 점을 보여주었다. 기계론적인 연구는 히스타민이 H1 수용체가 아닌 H2를 통한 신호전달을 통해 TNF를 저해한다는 점을 입증하였다. H2 수용체를 통한 신호전달은 PKA를 활성화하는 세포간 cAMP를 증가시킨다. PKA 활성도는 히스타민에 의한 TNF 억제를 위해 필수적이다. 히스타민은 MEK-ERK MAPK 신호전달 경로의 활성화를 차단한다.
히스타민은 알러지 및 아나필락시스에서 이의 전-염증 효과로 더 잘 공지되지만, 여러 가지 연구가 히스타민의 항-염증 기능을 입증하였다. 시험관내 연구는 히스타민이 LPS-자극 인간 단핵구 및 대식세포로부터의 전-염증성 사이토카인, IL-1, IL-12, 및 TNF의 생산을 저해할 수 있다는 점을 보여주었고 이 효과는 H2 수용체 길항제에 의해 반전될 수 있다. 추가적으로, 히스타민은 H2 수용체를 통해 항-염증성 사이토카인, IL-10의 생산을 자극할 수 있다. H2 수용체를 통한 신호전달은 인간 단핵구의 표면 상에서 LPS 인식에 관련된 수용체, CD14 수용체의 감소된 발현을 야기한다. TNF 수용체는 또한 히스타민에 의해 영향을 받을 수 있다. H1 수용체를 통한 신호전달은 TNFR1 및 TNFR2 둘 모두의 박리를 유도한다. 생체내 연구도 또한 히스타민에 대한 항-염증 역할을 보여주었다. 특이적인 H2 수용체 작용제, 디마프리트(dimaprit)로의 치료는 내독소 쇼크 (LPS 공격) 및 간염 (LPS와 갈락토사민 공격)의 생쥐 모델에서 혈장 TNF 수준을 감소시켰다. 히스타민은 LPS-유도된 간손상 생쥐 모델에서 보호적이었고, 이들 효과는 H2 수용체 넉아웃(knock-out) 생쥐에서 약화되었다. 장에서, 히스타민은 박테리아 감염에 대항하여 보호하는 데에 도움이 될 수 있다. 페이에르 판(Peyer's patch)에서 H2 수용체를 통한 신호전달은 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)에 의한 감염을 방지하는 데에 도움이 된다.
히스타민의 효과는 표적 세포 상에서 히스타민 수용체의 발현에 의해 결정될 수 있다. T-세포에서, 히스타민의 효과는 히스타민 수용체가 활성화 되는 것에 의존한다.
H1 수용체를 통한 신호전달에 의하여, 히스타민은 TH1-유형 반응을 증진시키지만 H2 수용체를 통해 TH1 및 TH2 둘 모두의 반응을 억제한다. 인간 위장 관에서 히스타민 수용체 발현을 관찰하면서 연구가 수행되었다. 검사된 많은 세포 유형이 다수의 히스타민 수용체를 발현하였다. 예를 들어, 대식 세포를 비롯한, 면역 세포는 H1 및 H2 수용체를 고도로 발현하였고 그리고 H4 수용체의 낮은 발현을 입증하였다. 증가된 비만 세포 및 히스타민은 IBS와 연관된 내장 과민증과 관련되어 왔다. 결장 점막 신경분포 근처의 비만세포의 증가된 수 및 활성도는 고조된 복부 통증 인지를 야기할 수 있다. 비만 세포 안정화제, 케토티펜(ketotifen)으로의 연구는 IBS를 앓는 환자에서 증가된 통증 역치, 감소된 IBS 증상을 입증하였지만, 직장 생검 조직에서 비만세포의 수 또는 활성도 (히스타민 및 트립타아제에 의해 결정됨)에서는 변화가 없었다. IBS를 향상시키는 것에서 케토티펜의 효과는 비만 세포를 안정화시키는 결과가 아닐 수도 있지만, H1 수용체 길항제로서 이의 다른 역할에 기여했을 수도 있다. H1 수용체의 활성화가 전-염증 반응과 연관되어 있다면, 케토티펜으로 이의 활성을 차단하는 것은 비만 세포 또는 장 미생물총(microbiota), 가령 락토바실러스 루테리(L. reuteri)에 의해 생산된 히스타민이 오로지 H2 수용체를 통해서만 신호전달을 하게끔 허용할 수 있다. 입증된 바와 같이, H2 수용체를 통한 신호전달은 TNF 생산을 억제하고 항-염증 효과를 야기할 수 있다. 이 케토티펜 메커니즘은 H1 수용체 길항제를 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주의 일반적인 프로바이오틱 효과와 결합시킨 새로운 치료법을 위해 이용될 수 있다.
추가로 글루코오스에서 수크로오스로 성장 배지의 탄소원을 바꾸는 것은 선별된 균주, 예를 들어 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 6475의 TNF-저해성 표현형을 억제시키는 데에 충분하다. 추가로, 히스티딘 오페론에서 모든 세 가지 유전자의 유의적인 하향-조절이 수크로오스 성장 조건을 이용하여 관찰되었다.
선별된 프로바이오틱 락토바실러스(Lactobacillus) 균주에 의해 생산된 항-염증 화합물로서 히스타민의 식별은 이러한 균주의 치료학적 적용을 결정하는 데에 도움이 될 것이다. 기계론적인 연구는 히스타민으로 THP-1 세포 상의 H2 수용체의 활성화 그리고 ERK 활성화의 억제를 연결시켰다. ERK 활성화는 TNF 생산 외에도 많은 세포 기능에 관련된다. ERK 활성화는 증식, 종양형성, 분화, 그리고 세포 생존에 관련된다. 결과는 ERK 활성화의 저해를 통해 염증, 세포 증식, 그리고 아폽토시스(apoptosis)를 억제함으로써 암에 대항하여 보호하는 것에서 선별된 균주, 가령 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475에 대한 역할을 제시한다. 추가로, 히스타민은 공지된 신경 전달 물질이다. 선별된 균주에 의한 히스타민의 생산은 통증 인지 및 장 운동에 영향을 미치는, 장 신경 시스템내 신호전달에 영향을 줄 수 있다. 작용 부위에서 히스타민의 생산을 보장하기 위하여, 박테리아에 히스티딘을 제공하는 것이 이로울 수 있다. 히스티딘은 박테리아와 함께 또는 단독으로 투여될 수 있고, 히스티딘이 풍부한 규정식은 히스타민 생산량을 또한 증가시킬 수 있다.
본 발명은 젖산 박테리아의 특정한 균주 및 이러한 균주를 선별하는 방법 그리고 이러한 균주를 포함한 산물을 제공한다. 박테리아는 히스티딘 오페론에 대한 스크리닝을 이용하여 선별되고, 놀랍게도 활성 히스티딘 오페론의 존재는 여러 가지 유익한 효과, 가령 젖산 박테리아 균주의 면역조절 특성에 필수적인 것으로 나타났다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 독자에게 명확해질 것이고 이들 목적 및 이점은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본 발명은 추가적으로 다음 비-제한 실시예에 대한 참조로 기술될 것이다:
실시예
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 1:
선별된 락토바실러스(Lactobacillus)에 의한 히스타민의 생산
박테리아 균주 및 배양 조건
본 연구에서 이용된 모든 박테리아 균주는 표 1에서 기술된다. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) ATCC PTA 6475를 핀란드인 모유 (ATCC, Manassas, VA, USA로부터 이용가능함)로부터 단리시킨다. 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 균주 ATCC PTA 6475, ATCC 6475 JP577, ATCC 6475 1229, ATCC 6475 1230, 및 ATCC 6475 1231은 본 개시에서 전반적으로 각각, 균주 6475, JP577, 1229, 1230, 및 1231으로서 언급될 것이다. 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 균주를 deMan, Rogosa, Sharpe 배지 (Difco, Franklin Lakes, NJ)에서 16-18 시간 동안 혐기성 조건 하에 배양하였고, 그리고 이전에 기술되던, 2 L의 반-한정 배지, LDMIII (0.1까지 조정된 OD600)내로 접종시켰다. 탄소원은 글루코오스 LDMIIIG, 또는 수크로오스 LDMIIIS 중 하나였다. 배양물은 10% CO2, 10% H2, 및 80% N2의 혼합물로 제공된 혐기성 작업장소 (MACS MG-500, Microbiology International, Frederick, MD)에서 37℃로 24시간 동안 성장되었다. OD600을 측정함으로써 성장에 따라 상이한 시간에 샘플을 채취하였다. 정지상 (24 시간)에서, 2 L 배양물 (4000 x g, 10 분)로부터 세포를 펠렛화하였다. HPLC 분리를 위해 추가적인 가공처리 및 TNF 저해 바이오어세이(bioassay)에서 검사하기 전에 세포 펠렛(pellet) 및 박테리아 무-세포 상청액을 -20℃에서 저장하였다.
세포주 및 시약
RPMI (ATCC)에서 유지된 THP-1 세포 (인간 단핵구 모양 세포주, ATCC, Manassas, VA) 및 열-불활성화된 소 태아 혈청(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 37℃, 5% CO2에서 시험관내 실험을 수행하였다. MEK1/2, 포스포-MEK1/2, ERK1/2, 및 포스포-ERK1/2 항체 및 MEK 저해제 U0126은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 받았고, 그리고 β-액틴 항체는 Abcam (Cambridge, MA)으로부터 받았다. 모든 다른 시약은 달리 명시되지 않는 한 Sigma (St. Louis, MO)로부터 받았다.
세포 벽 연관 인자의 HILIC-HPLC 분리
LDMIIIG 또는 LDMIIIS 중 하나에서 성장한 균주 6475로부터의 세포 펠렛 (7 g)을 30 mL의 매우 차가운 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 세척하였다. 세포 현탁액을 4℃에서 4000 x g으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폴리비닐리덴 불소 (PVDF) 막 여과기 (0.45 μm 구멍 크기, Millipore, Bedford, MA)를 통해 여과시키고, 동결건조시키고, 그리고 10 mL 0.1% 포름산에서 재현탁시켰다. 울트라셀(ultracel)-3 막 (Millipore, Bedford, MA)을 이용하여 Amicon Ultra-15 원심분리 여과기 단위로 재현탁 샘플을 크기별로 분류하였다. 여과액 (9 mL)을 고속 진공으로 1 mL 아래까지 건조시켰고, 그리고 0.75 mL는 HILIC-HPLC를 위해 사용하였다. 100-0% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 구배로 PolyLC 하이드록시에틸 칼럼 상에서 작동시키기 전 샘플을 100% 아세토니트릴로 녹였다. 샘플을 25분 동안 작동시켰고 25개 분획물 (A1-C1)을 10 mL/분/튜브에 수집하였다. 각각의 분획물로부터 3 밀리리터를 동결건조시키고, 3 mL 0.1% 아세트산에서 재현탁시키고, 그리고 TNF 저해 바이오어세이에서 검사하기 위해 다시 동결건조시켰다.
TNF 저해 바이오어세이 및 TNF ELISA
24시간 LDMIII 배양으로부터의 박테리아 상청액 (10 mL)을 PVDF 막 여과기 (0.22 μm 구멍 크기, Millipore)를 이용하여 여과기-멸균시켰고 그리고 상기 기술된 바와 같이 크기별로 분류하였다. 1 밀리리터의 <3 kDa 여과액을 고속 진공 건조시켰고 그리고 RPMI 배지에서 재현탁시켰다. 이들 가공처리된 상청액 샘플은 조건화 배지라고 불린다. 모든 상청액을 OD600 = 1.0까지 부피로 정상화하였다. HILIC-HPLC 분리로부터의 동결건조된 분획물을 400 μL 10 mg/mL 암모늄 비카르보네이트에서 재현탁시키고, 고속 진공 건조시키고, 그리고 400 μL RPMI 배지에서 재현탁시켰다. 조건화 배지 및 세척된 세포 펠렛 분획물을 단핵구 모양 세포에서 TNF 생산을 조절하는 그들 능력에 대해 검사하였다. 간략하게, 이전에 기술된 바와 같이 100 ng/mL Pam3Cys-SKKKK x 3 HCl (EMC Microcollections, Tuebingen, Germany)을 첨가함으로써 TNF를 생산하기 위해 THP-1 세포 (대략 5x104 개 세포)를 자극하였다. 저해제 - H2 수용체 길항제, 라니티딘 및 시메티딘 (10-4 - 10-6 M), H1 수용체 길항제, 인도메타신 (10-5 - 10-6 M), MEK 저해제, U0126 (10 μM), 및 PKA 저해제, H89 (N-[2-(p-브로모신나밀아미노)에틸]-5-이소퀴놀린설폰아미드 디하이드로클로라이드) (10-5 M) -를 THP-1 세포에 첨가하였고 그 다음 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 조건화 배지 또는 세척된 세포 펠렛 분획물 (5% v/v), 히스타민 (10-5 M), 또는 디부티릴 cAMP (10-3 - 10-7 M)를 첨가하였다. 평판을 3.5시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. THP-1 세포를 펠렛화하였고 (3000 x g, 5 분, 4℃), 그리고 정량적 ELISA를 제조자의 지시에 따라 THP-1 세포 상청액내 TNF 수량을 결정하는 데에 이용하였다 (R&D Systems, Minneapolis, MN).
락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475 TNF-저해성 화합물(들)은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 - 고성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-HPLC)을 이용하여 단리되었음
박테리아 세포 펠렛을 세척하여 세포 표면에 느슨하게 연결된 화합물을 제거하였다. 세척된 세포 펠렛의 성분은 HILIC-HPLC를 이용하여 소수성에 기반하여 분리시켰고, TNF-저해성 화합물의 보유에 대해 결과적 25개 분획물을 검사하였다. 유일한 탄소원으로서 글루코오스가 있는 최소 배지에서 성장한 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475는 3개의 분리된 HILIC-HPLC 분획물물 (B3, B5 및 B6, 데이터는 나타나지 않음)에서 보유되었던 TNF-저해성 인자를 생산한다. 유일한 탄소원으로서 수크로오스로 성장한 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475는 TNF-저해성 표현형을 상실하고 그리고 음성 대조군의 역할을 하였다. 세척된 6475 수크로오스 세포 펠렛으로부터의 HILIC-HPLC 분획물물 중 어떠한 것도 유의적인 TNF 저해를 입증하지 않았다 (데이터는 나타나지 않음).
히스타민은 NMR 분광법 및 질량 분석법에 의해 TNF-저해성 HILIC-HPLC 분획물물에서 식별되었음
TNF-저해성 HILIC-HPLC 분획물물 B3을 1H NMR로 분석하였고 이웃한 비-TNF 저해성 분획물 B4와 비교하였다. 방향족 화합물의 특징인, 7.0-7.5 ppm에서의 화학적 이동(chemical shift)이 있는 독특한 일련의 피크가 분획물 B3에서 관찰되었지만, 분획물 B4에서는 관찰되지 않았다 (데이터는 나타나지 않음). 이 방향족 화합물 집합체는 이의 성분을 식별하기 위하여 이종핵 단일 양자 코히어런스(single quantum coherence (HSQC)) 2-차원 (2D) NMR로 추가 분석되었다. 방향족 화합물은 트립토판, 페닐알라닌, 히스타민, 및 식별되지 않았던 한 가지 화합물로 구성되었다. 트립토판 및 페닐알라닌은 박테리아 성장 배지의 성분인 반면, 히스타민은 그렇지 않다. 추가적인 2D NMR 방법, 전체 상관 분광법(total correlation spectrometry (TOCSY))을 이용하여 이들 결과를 확인하였다. 히스타민은 락토바실리(lactobacilli)를 비롯한 몇몇 발효 박테리아에 의해 히스티딘 탈카르복실화효소를 통하여 히스티딘으로부터 생산되는 생체 아민이다. 히스타민은 전기분무 비행시간형(time-of-flight) 질량 분석법 (ESI TOF MS)을 이용하여 분획물 B3에서 또한 식별되었다. 히스타민은 MS/MS 분석에서 이의 발효 패턴에 기반하여 공유원자가로 변형되지 않는다. ESI TOF MS를 이용하여 수크로오스 배지에서 성장한 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 6475의 해당 B3 분획물의 분석은 어떠한 히스타민을 보이지 않았다. 글루코오스 배지에서 성장한 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 6475는 TNF-저해성 HILIC-HPLC 분획물에서 존재하는 히스타민을 생산한다.
히스타민은 삼중 4극 질량 분석법을 이용하여 선별 HILIC-HPLC 분획물물에서 정량화되었음
삼중 4극 질량 분석법은 소분자 화합물을 정량화하는 확립된, 고감도 방법이다. 히스타민을 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 6475 글루코오스 (B2-B7) 및 수크로오스 (B2-B9) 그리고 박테리아 배양 상청액으로부터 HILIC-HPLC 분획물의 선별 범위에서 정량화하였다. 고수준의 히스타민 (>300 ng/mL)은 TNF를 저해하는 HILIC-HPLC 분획물의 능력과 관련이 있었다 (도 1). 저수준의 히스타민은 6475 수크로오스로부터의 분획물을 비롯한, 검사된 대부분의 분획물에서 측정되었다 (도 1). TNF 생산을 저해하는 히스타민의 능력은 농도 의존적인 것으로 나타난다.
합성 히스타민 및 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475에 의해 생산된 히스타민은 H 2 수용체를 통해 TNF 생산을 저해함
히스타민은 TLR2-활성화된 인간 단핵구 모양 세포 (THP-1)로부터 TNF 생산을 유의적으로 저해할 수 있다 (도 4A). 히스타민은 4개의 상이한 히스타민 수용체를 통해 신호를 보낼 수 있지만, 하지만 단핵구 모양 세포는 오로지 고수준의 H1 및 H2 수용체만 발현한다. 이전 연구는 H2 수용체를 통해 TNF 생산에서 히스타민의 효과를 보여주었다. 어떤 수용체가 THP-1 세포에서 히스타민의 효과를 매개하는지 결정하는 데에 H1 및 H2 수용체-특이적 길항제가 이용되었다. H2 수용체-특이적 길항제, 라니티딘 및 시메티딘은 농도 의존 방식으로 히스타민에 의한 TNF-저해를 차단할 수 있었다 (도 2A). H2 수용체-특이적인 항체를 이용한 유동 세포 분석은 THP-1 세포가 H2 수용체를 높게 발현한다는 점을 보여주었다 (데이터는 나타나지 않음). H1 수용체-특이적 길항제, 인도메타신은 히스타민에 의한 TNF-저해에서 효과가 없었다 (도 2A). 히스타민은 H2 수용체를 통한 신호전달을 통해 TLR2-활성화 THP-1 세포로부터 TNF 생산을 차단한다. 히스타민을 함유한 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475 조건화 배지는 대조 배지와 비교하여 TNF를 유의적으로 저해하고, 그리고 이 효과는 H1 수용체 길항제가 아닌 H2 수용체에 의해 부분적으로 차단된다 (도 2A). TNF 억제에서 부분적인 차단은 6475 조건화 배지에서 존재하는 히스타민이 H2 수용체를 통해 신호전달을 한다는 점 하지만 대안적인 메커니즘을 통해 작용하는 다른 TNF-저해성 인자도 또한 조건화 배지에서 존재할 수 있다는 점을 명시한다. 균주 6475 의 히스타민을 함유한 세척된 세포 펠렛도 또한 TNF 생산을 억제한다 (도 2B). 6475 조건화 배지에서 보여지는 바와 같이, H2 수용체 길항제는 세척된 6475 세포 펠렛의 효과를 부분적으로 차단하며 (도 2B), 이는 다수의 면역모듈린(immunomodulin)이 세척된 비분획 세포 펠렛에서 존재한다는 점을 제시한다. 다량의 정제된 히스타민을 함유한 TNF-저해성 분획물 B3의 효과는 H2 수용체 길항제의 첨가로 완전하게 차단되었다 (도 2B).
실시예 2
히스타민을 생산하는 균주의 선별
히스타민 생산 박테리아의 식별/선별
검사되어야 할 그리고 가능한 한 선별되어야 할 균주를 deMan, Rogosa, Sharpe media (Difco, Franklin Lakes, NJ)에서 16-18 시간 동안 혐기성 조건 하에 배양하였고, 그리고 2 L의 반-한정 배지, LDMIII (0.1까지 조정된 OD600)내로 접종시켰다. 탄소원은 글루코오스였다, LDMIIIG. 배양물 각각은 10% CO2, 10% H2, 및 80% N2의 혼합물로 제공된 혐기성 작업장소 (MACS MG-500, Microbiology International, Frederick, MD)에서 37℃로 24시간 동안 성장되었다. OD600을 측정함으로써 성장에 따라 상이한 시간에 샘플을 채취하였다. 정지상 (24 시간)에서, 실시간 PCR을 이용하는 분석을 위해 세포를 샘플로 만들어 세 가지 유전자, 히스티딘/히스타민 역수송체, HdcA, 및 HdcB의 존재에 대해 검사하였다.
세 가지 유전자에 대해 양성인 균주의 경우, 생산된 히스타민의 수준을 삼중 4극 질량 분석법으로 측정한다. 가장 높은 히스타민 생산 (>250 pg/ml)이 있는 균주를 선별한다. 또한 히스타민 생산은 ELISA 또는 면역분석법으로 평가하고 정량화할 수 있다.
실시예 3
면역조절의 입증
히스티딘 오페론은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475의 TNF-저해성 표현형에 기여함
오페론의 부분으로 나타나는 세 가지 유전자는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475에 의한 히스타민 생산에 관련된다. 이들 유전자는 히스티딘/히스타민 역수송체, 히스티딘 탈카르복실화효소 피루보일 유형 A (HdcA), 및 HdcB이다 (도 3A). 이전의 전사체학 연구는 히스티딘/히스타민 역수송체 유전자 및 HdcA가 균주 6475의 TNF-저해성 표현형에 잠재적으로 중요하다는 점을 제시하였다. 모든 3개의 유전자는 글루코오스 배지에서 성장한 6475와 비교하여 수크로오스 배지 (TNF 저해를 감소)에서 성장한 6475에서 강하게 하향-조절된다 (표 2). 추가로, 오페론에서 적어도 1개의 유전자는 TNF-저해가 감소한 2개의 돌연변이체에서 하향-조절된다 (표 2). 이들 돌연변이체는 이전에 조사되었으며, 그리고 유전자 산물이 TNF-저해 특성을 갖지 않았음에도 불구하고, 유전자는 6475의 항-염증 표현형에 중요한 것으로 나타났다. 대조적으로, TNF 저해가 감소하지 않은 2개의 돌연변이체는 히스티딘 오페론내 임의의 유전자의 하향-조절을 입증하지 않았다 (표 2). 비성숙 정지 코돈을 유전자 서열 내로 삽입함으로써 각각의 이들 3개 유전자에서 돌연변이를 일으켰다 (균주 1229, 1230 및 1231). 또한 돌연변이는 비관련 유전자, 리팜피신 저항 유전자에서 일어나 음성 대조군의 역할을 하였다 (균주 JP577). 히스티딘 오페론내 유전자 중 단지 하나에서의 돌연변이는 야생형 균주와 비교하여 TNF-저해의 부분적인 감소를 야기하는 데에 충분하였고 (도 3B), 이는 이들 유전자 각각이 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475의 TNF-저해성 표현형에 중요하다는 점을 제시한다. 활성도의 부분적인 감소는 다른 활성 면역모듈린이 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475에 의해 여전히 생산되고 있다는 점을 제시한다.
ERK1/2 활성화는 TLR2-자극된 단핵구 모양 세포에 의한 TNF 생산에 필수적임
ERK1/2는 업스트림 MAPKK, MEK1/2로부터 인산화에 의해 활성화되었고, 그리고 TNF 생산에 중요한 것으로 이전에 나타났다. TLR2 작용제로 자극하기에 앞서 변화하는 시간량 동안, THP-1 세포를 특이적인 MEK1/2 저해제, U0126으로 처리하여 ERK1/2 활성화를 억제하였다. 30분 동안 U0126으로 처리는 TNF 생산을 방지하는 데에 충분하였다 (데이터는 나타나지 않음). ERK1/2는 TLR2 자극 후 활성화되고 모델 시스템에서 TNF 생산을 자극하는 데에 중요하다.
H 2 수용체의 자극은 세포 내에서 증가된 cAMP를 야기함
H2 수용체는 아데닐산 고리화효소를 활성화하고 세포간 cAMP를 증가시킬 수 있는 G 단백질 연결 수용체이다. TNF는 cAMP 및 cAMP 유사체에 의한 전사 수준에서 저해될 수 있다. H2 수용체 길항제와 함께 또는 상기 길항제 없이 히스타민, 6475 상청액, 또는 대조 배지의 존재에서 TLR2 작용제로 THP-1 세포를 자극시켰고, 그리고 cAMP의 세포간 수준을 측정하였다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475는 cAMP에서 적지만 유의적인 증가를 야기하였다 (데이터는 나타나지 않음). H2 길항제로의 처리는 이 효과를 차단하였다. cAMP에서의 증가는 히스타민 처리에서 또한 볼 수 있었고, 그 효과는 H2 길항제에 의해 차단되었다 (데이터는 나타나지 않음). cAMP의 합성 유사체, 디부티릴 cAMP (dcAMP)를 TLR2-자극된 THP-1 세포에 첨가하였고 TNF 생산에서의 효과를 모니터링하였다. dcAMP의 첨가 (10-5 - 10-3 M)는 TNF 생산을 저해하는 데에 충분하였다 (데이터는 나타나지 않음). 히스타민 H2 수용체의 자극은 증가된 cAMP를 야기하며, 이는 활성화된 단핵구 모양 세포에서 다운스트림 TNF 생산을 차단할 수 있다.
단백질 키나아제 A (PKA) 활성도는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475, 히스타민, 및 dcAMP에 의한 TNF 저해에 중요함
증가된 농도의 cAMP는 PKA를 활성화할 수 있고 그 다음 다운스트림 ERK MAPK 신호전달 경로를 저해할 수 있다. PKA활성도가 균주 6475에 의해 생산된 히스타민에 의한 TNF 억제에 중요했는지를 결정하기 위해, 활성화 THP-1 세포를 6475 상청액, 분획물 B3, 히스타민 또는 다양한 농도의 dcAMP의 존재에서, 특이적인 PKA 저해제, H89로 처리하였다. H89의 첨가는 이들 정상적 TNF-저해성 화합물 모두에 의한 TNF 저해를 부분적으로 차단하였다 (데이터는 나타나지 않음). PKA 활성도는 히스타민 및 dcAMP에 의한 TNF의 억제에 중요하다.
H 2 수용체를 통한 신호전달은 MEK1/2 및 ERK1/2의 활성화를 차단함
이전 연구는 PKA가 MEK의 Ras/Raf 활성화를 그리고 차후에 ERK MAPK 신호전달을 저해할 수 있다는 점을 입증하였다. 6475 상청액, 히스타민 또는 U0126으로 활성화 THP-1 세포의 처리는 대조 배지와 비교하여 MEK1/2 및 다운스트림 ERK1/2 둘 모두의 인산화를 차단한다 (데이터는 나타나지 않음). H2 수용체 길항제로 처리는 MEK1/2 및 ERK1/2 둘 모두의 활성화를 복구한다 (데이터는 나타나지 않음). 임의의 치료 선택과 MEK1/2 및 ERK1/2 단백질 수준에서는 차이가 없었다. 균주 6475로부터의 히스타민은 MEK 및 다운스트림 ERK의 활성화를 저해하여 TLR2-자극된 골수 세포로부터의 감소된 TNF 생산을 야기한다.
따라서 이들 실험은 H2 수용체의 자극이 증가된 cAMP, 단백질 키나아제 A (PKA)의 활성화 및 MEK-ERK MAPK 신호전달 경로의 저해를 야기한다는 점을 보여준다. 상기 기술된 바와 같이, 기계론적 연구를 수행하여 미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 신호전달 경로에서 히스타민의 효과를 결정하였다. MEK-특이적 저해제로 MEK-ERK 신호전달 경로의 저해는 TNF 생산을 차단하는 데에 충분하다. 균주 6475 상청액 또는 히스타민으로 활성화 THP-1 세포의 처리는 세포간 cAMP를 증가시켰다. cAMP에서 증가는 특이적인 H2 수용체 길항제, 라니티딘에 의해 차단되었다. cAMP의 합성 유사체, dcAMP로 TLR2-자극된 THP-1 세포의 처리는 TNF 생산을 저해하는 데에 충분하다. PKA 활성도의 저해는 이전에 TNF-저해성 화합물 6475 조건화 배지, 분획물 B3, 히스타민, 및 dcAMP에 의한 TNF 억제를 부분적으로 차단한다. 6475 조건화 배지, 히스타민, 또는 U0126으로 활성화 THP-1 세포의 처리는 MEK1/2의 활성화를 억제하였고, 이는 라니티딘의 존재에서 차단된 효과였다. 6475 조건화 배지, 히스타민, 또는 U0126으로 활성화 THP-1 세포의 처리는 ERK1/2의 활성화를 억제하였고, 이는 라니티딘의 존재에서 차단된 효과였다.
실시예 4
웨스턴 블롯에 의한 MEK1/2 및 ERK1/2 탐지
50 mM 트리스, pH 7.4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1% v/v Nonidet P40, 0.2% v/v NaN3, 그리고 프로테아제와 포스파타아제 저해제로 구성된 매우 차가운 세포용해 완충액에서 THP-1 세포를 용해시켰다. 용해물을 30분 동안 얼음에서 인큐베이션하고, 매 10분 마다 와동시키고, 그리고 4℃에서 10분 동안 13,000 x g의 원심분리로 맑게 하였다. 제조자의 지시에 따라 Quant-iT™ 단백질 어세이 키트 (Invitrogen) 및 Qubit 형광계를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 전기영동 겔 상에 로딩하였다.
특이적인 포스포-ERK1/2 항체를 이용하여 ERK1/2 활성화의 분석을 수행하였다. 세포 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하였고 폴리비닐리덴 디불소 막으로 이동시켰다 (Bio-Rad, Hercules, CA). 차단 완충액(blocking buffer)에서 4℃로 하룻밤 동안 막을 차단시켰다 (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). 여러 번의 세척 후, 실온에서 1시간 동안 차단 완충액 (Li-Cor)으로 희석된 ERK1/2, 포스포-ERK1/2 또는 β-액틴 특이적 항체로 막을 프로빙하였다. 세척 후, 실온에서 1시간 동안 막을 적절한 겨자무 과산화효소-접합된 이차 항체와 인큐베이션하였고, 이후 화학발광 탐지를 이용하여 블롯을 현상하였다. 일차 항체 인큐베이션을 4℃에서 하룻밤 동안 했다는 점을 제외하고 상기 기술된 바와 같이 MEK1/2 활성화의 분석을 수행하였다.
실시예 5
hdcA 돌연변이체 수득은 결장염을 약화시키는 능력을 감소시켰음
박테리아 균주 및 배양
RecT-매개된 올리고뉴클레오티드 재조합공학(recombineering)을 이용하여 돌연변이체를 발생시켰다. RecT를 발현하는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) (균주 RPRB0000)를 rpoB내 돌연변이를 구축하는 데에 이용되었고 (유전자자리 표지 HMPREF0536_0828 (ZP_03961568)) 그리고 표적 유전자는 히스티딘 탈카르복실화효소 유전자 집합체 HMPREF0536_1229 (ZP_03961969), HMPREF0536_1230 (ZP_03961970) 및 HMPREF0536_1231 (ZP_03961971)에서 위치하여 각각, 균주 RPRB3002, RPRB3004, RPRB3005 및 RPRB3006을 수득하였다. PCR로 돌연변이를 확증하였고, 그리고 서열 분석으로 통합성을 확인하였다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475 및 히스티딘 탈카르복실화효소 유전자 (hdcA) 돌연변이체를 10% CO2, 10% H2, 및 80% N2의 혼합물로 제공된 혐기성 작업장소 (MACS MG-500, Microbiology International, Frederick, MD)에서 37℃로 deMan, Rogosa, Sharpe (Difco, Franklin Lakes, NJ)에서 배양하였다.
락토바실러스 루테리( L. reuteri ) 세포의 제조물 및 생쥐에게 투여
각각의 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주의 단일 콜로니(colony)를 10 ml의 MRS 배지에 접종시켰고 18-20시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 성장시켰다. OD600=0.03까지 조정된 박테리아를 40ml의 MRS 내로 접종시켜 발효를 시작하였고 그리고 5.5 시간 동안 혐기성 조건 하에 37℃에서 성장시켰다 (OD600≒2.5, 박테리아는 이 시점에서 대수증식기(exponential phase)에 있음). 세포를 조심스럽게 펠렛화하였고 (2500 x g, RT, 4 분) 그리고 25 x109 CFU/ml의 농도로 MRS에서 재현탁시켰다. 대조 배지로서, 멸균 MRS 배지를 이용하였다. 8-주령 암컷 BALB/c 생쥐 각각은 10일의 순응 후 입위관 영양법(orogastric gavage)으로 7일 동안 매일 1 용량의 신선하게 제조된 야생형 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475 또는 hdcA 돌연변이체 또는 MRS (각 시간에 0.2 ml)를 받았다. 승인된 프로토콜 (AN-4199; Baylor College of Medicine의 동물 시설)에 따라 모든 생쥐 실험을 수행하였다. 생쥐 (45일령)는 Harlan Laboratories (Houston, TX)로부터 받았고 필터-탑 케이지(filter-top cage) (케이지 당 5 마리 생쥐)에서 특이적인 무-병원체 조건 하에 유지되었고 그리고 증류수와 Harlan 설치류 사료 2918에 자유롭게 접근하였다. 무작위로 생쥐를 상이한 군으로 나누었다.
트리니트로벤젠 설폰산 (TNBS) 직장 관장을 이용한 급성 결장염의 유도. 6번째 위관 영양법 6시간 전에 결장염을 유도하였다. 지속적인 이소플루레인 흡입으로 생쥐를 마취시켰다. 물내 5% TNBS 용액 (Sigma-Aldrich, USA)을 동일한 부피의 무수 에탄올로 희석하였고 그리고 직장 내로 100 mg/체중 kg의 용량으로 투여하였다. 결장에서 관장제를 완전히 보유하게 하기 위해 생쥐를 관장 후 2분 동안 머리를 아래로 하여 수직 자세로 두었다. 절차 대조군 생쥐는 PBS내 50% 에탄올을 받았다. TNBS 투여에 앞서 그리고 TNBS 투여 후 2일에 생쥐의 무게를 쟀다. 이후 생쥐를 희생시켰다. 결장 염증 및 손상은 무게 감소, 거시적인 점수 및 혈청 SAA 농도에 의해 결정되었다.
결장염의 거시적인 평가
결장을 수집하여 세로로 개방하였고 그리고 디지털 카메라로 이미지를 기록하였다. 월리스 기준 (Morris et al., 1989)에 따라 결장 염증 및 손상을 결정하였다. 결장 각각은 맹검으로 점수를 매겼다. GraphPad Prism 버전 5.01 (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 이용하여 통계를 수행하였다. 분석에 포함된 모든 군 중 유의적인 차이를 탐지하는 데에 크러스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검사를 이용하였다. 결과를 중앙값과 사분 범위로 요약하였다.
전신성 염증 마커로서 혈청 아밀로이드 단백질 A (SSA)의 측정
혈액 샘플을 심장 천자로 수집하고, 응고를 저지시키고 그리고 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 혈장을 단리시켰다. 제조자의 지시에 따라 ALPCO (Salem, NH)로부터의 ELISA 키트를 이용하여 혈장 샘플내 혈청 아밀로이드 A (SAA) 농도를 측정하였다. SAA는 결장염 중증도와 연관이 있는 생쥐내 전신성 염증을 나타내는 급성기 단백질이다.
결과
락토바실러스 루테리( L. reuteri ) 6475는 TNBS-유도된 급성 결장염에 대항하여 생쥐를 보호함
TNBS-유도된 급성 결장염 생쥐 모델에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475의 항-염증 효과를 검사하였다. 매일 입위관 영양법으로 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475를 받은 생쥐를 대조 배양액을 받은 생쥐와 비교하였다. 또한 TNBS 대신 PBS로 공격된 생쥐를 결장염 음성 대조군으로서 연구하였다.
도 4-6은 두 가지 독립된 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 직장으로 TNBS 대신에 PBS를 받은 결장염 음성 대조군은 매우 낮은 무게 감소 (또는 심지어 증가된 무게), 드문 결장 손상 및 낮은 혈청 SAA 농도를 가졌다. MRS 배양액 및 TNBS/ETOH를 받은 결장염 양성 생쥐는 다량의 무게 감소, 결장내 염증을 동반한 궤양 및 1cm보다 크게 확장된 손상의 주요 부위로 특징되는 중증 결장염을 발달시켰고, 그리고 혈청에서 SAA 농도를 유의적으로 상승시켰다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475로 입위관 영양법은 무게 감소, 결장내 거시적인 염증 및 혈청 SAA 농도를 유의적으로 감소시켰으며, 이는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475가 결장염을 유의적으로 약화시켰다는 점을 보여준다.
hdcA 돌연변이체 수득은 결장염을 약화시키는 능력을 감소시켰음
동일한 생쥐 모델을 이용하여, 히스티딘 탈카르복실화효소를 암호화하는 hdcA 유전자가 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 항-염증 효과를 위해 요구되는 지에 대해 검사하였다. 8주령 암컷 BALB/c 생쥐를 무작위로 3개의 군으로 나누었으고, 상기 군은 각각 야생형 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475 또는 hdcA 돌연변이체 또는 MRS 배양액을 받았다. 도 7 및 8은 2개의 독립된 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 다시 말해, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 6475로 입위관 영양법은 대조군 배지와 비교하여 무게 감소 및 결장 손상을 유의적으로 감소시켰다. hdcA 돌연변이체를 받은 생쥐는 야생형 박테리아를 받은 생쥐와 비교하여 무게 감소 및 결장내 거시적인 염증을 유의적으로 증가시켰으며, 이는 hdcA 돌연변이체 수득이 결장염을 약화시키는 능력을 감소시켰다는 점을 보여준다.
ATCC PTA-6475 20041221

Claims (14)

  1. 포유류내 히스타민의 국부적 생산에서의 용도를 위한 젖산 박테리아 균주를 선별하는 방법에 있어서, 상기 방법은 활성 히스티딘 오페론의 존재에 대해 박테리아를 스크리닝하는 단계 및 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 250 pg/ml보다 큰 수준에서 히스타민을 생산하는 능력에 대해 선별되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 포유류내 히스타민의 국부적 생산에서의 용도를 위해, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 선별 방법으로 얻을 수 있는 젖산 박테리아 균주의 세포를 포함하는 산물에 있어서, 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 산물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는, 산물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 히스타민의 국부적 생산은 상기 포유류의 GI 관, GU 관, 구강, 폐, 기도에서, 또는 피부 상에서 일어나는 것을 특징으로 하는, 산물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도는 염증 질환의 치료 및/또는 예방에서 일어나는 것을 특징으로 하는, 산물.
  8. 제7항에 있어서, 염증 질환은 결장염, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 게실증, 치은염 및 질염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 산물.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)인 것을 특징으로 하는, 산물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 6475인 것을 특징으로 하는, 산물.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도는 적어도 하나의 추가 치료제 또는 영양제의 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 산물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 추가 약제는 히스티딘 또는 히스티딘 유사체, 상기 균주에 의한 히스타민의 생산을 지원하는 적절한 탄소원, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 산물.
  13. 다음을 포함하는 조성물:
    (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 따른 선별 방법으로 얻을 수 있는 젖산 박테리아 균주, 여기서 상기 젖산 박테리아 균주는 활성 히스티딘 오페론을 갖고 그리고 히스타민을 생산할 수 있음; 그리고
    (ii) 상기 균주에 의한 히스타민의 생산을 지원하는 적절한 탄소원, 히스티딘 또는 히스티딘 유사체의 공급원, 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 추가적인 성분.
  14. 제12항에 따른 산물, 또는 제13항의 조성물에 있어서, 상기 히스티딘 또는 히스티딘 유사체는 식품 또는 식품 보충제를 함유한 히스티딘 또는 히스티딘 유사체의 형태로 있고, 또는 상기 탄소원은 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 산물 또는 조성물.
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