CN109554435A - 细菌组胺的产生和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种选择产生组胺的特定益生菌乳酸菌的方法和这些菌株对于哺乳动物具有有益效果的应用。本发明尤其涉及一种选择乳酸菌菌株的方法用于哺乳动物中局部产生组胺，其中，所述方法包括筛选存在活性组氨酸操纵子的细菌，和选择具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺的菌株，优选地，选择的所述细菌具有产生组胺大于250pg/ml的水平的能力。本发明还提供了包括由本发明的选择方法获得的菌株的产品，所述产品用于哺乳动物中局部产生组胺，尤其用于治疗或预防炎症情况。

Description

细菌组胺的产生和应用
技术领域
本发明涉及一种选择产生组胺的特定益生菌乳酸菌的方法和这些菌株的应用，以对宿主释放有益效果。
背景技术
联合国粮食和农业组织将益生菌定义为“当施用适当的数量时，有利于宿主的健康的活性微生物”。如今，许多不同的细菌作为益生菌使用，例如产生乳酸的细菌，比如乳酸杆菌(Lactobacillus)菌株和双歧杆菌(Bifidobacteria)菌株。
产生乳酸的细菌不仅用于对人类和动物健康的有益效果，而且它们还在食品工业中广泛地用于发酵过程。益生菌的有效性是菌株-特异性，每个菌株可以通过不同的机制有助于宿主的健康。益生菌可以阻止或约束病原体的增殖，抑制病原体致病因子的产生，或者以促炎方式或抗炎方式调节免疫反应。使用产生益生素乳酸的细菌的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的不同菌株是对于改善初期的婴儿腹痛、减轻湿疹、降低工作场所疾病的发作、和抑制幽门螺杆菌感染有前景的治疗方法。罗伊氏乳杆菌被认为是人类胃肠道固有的微生物，并存在于例如，胃体、胃窦、十二指肠和回肠的粘膜上。参见例如专利号为5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238和5,849,289 的美国专利。
当罗伊氏乳杆菌细胞在存在甘油的无氧条件下生长时，它们产生称为罗伊氏菌素([β]-羟基丙醛)的抗微生物物质。
宿主和其微生物之间的关系是复杂的，对于一些细菌，这个宿主：微生物的关系已经进行了许多年的共同进化。似乎对于罗伊氏乳酸菌尤为如此。我们关于肠道微生物和人类宿主之间的共生关系的知识还处于起步阶段，但是我们已经清楚地意识到肠道微生物在肠道和免疫系统的发育、营养中起着重要的作用，并且正在肠道微生物与大脑之间建立新的联系。生态失调，正常肠道微生物的扰动，已经涉及大范围的的疾病过程，其中包括那些影响局部肠道环境的疾病过程，比如炎症性肠病(IBD)和肠易激综合症(IBS)，以及远离肠道位置的疾病过程，比如代谢综合征。显著的治疗潜力在于肠道微生物组内，并且研究正在朝向改变微生物群落的未来目标努力以便阻止和/或治疗不同的疾病过程。
因此，有必要理解与特定疾病或影响宿主健康的其他情况有关的微生物和人类之间的这种特定的相互作用，以便能够选择和使用最合适的益生菌菌株以抵消这些发展。
发明内容
在此本发明提供了一种在哺乳动物中，尤其是在人类中局部产生组胺的特定方法，组胺的局部产生包括但不局限于通过选择某些乳酸菌菌株，在哺乳动物身体的胃肠道中、泌尿生殖(GU)道中，口腔中，肺部和呼吸道中，以及在皮肤上等产生。所述细菌可以和某些氨基酸和/或糖类一起传送，分别地施用于或已经存在于活性位点。
本发明的主要目的是选择能够在不同的位置局部产生组胺的菌株，不同的位置包括哺乳动物身体的胃肠道、泌尿生殖道，口腔，肺部和呼吸道中，皮肤上等等。
本发明的再一个目的是提供包含所述菌株的产品。
本发明的再一个目的是联合施用细菌和施用组氨酸、或包含组氨酸的食物或组合物，以确保局部产生组胺。
因此，本发明涉及一种用于选择乳酸菌细胞的新的方法，所述乳酸菌细胞作为益生菌和在治疗中是有益的。这个新方法包括对于具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺的乳酸菌菌株的筛选和选择。令人惊讶的是，由这种方法选择的乳酸菌菌株通过局部产生组胺，作为益生菌和在治疗中，尤其是在产生抗炎作用中是有益的。正如在其它地方所讨论的，细菌的这些作用是令人惊讶的，由于认识到健康风险，例如潜在的毒性作用，之前是主动避免在食物中存在产生组胺的细菌。因此，向哺乳动物施用能够局部产生组胺的乳酸菌，或甚至基于活性组氨酸操纵子的存在和能够产生组胺的能力来筛选和选择这些能够局部产生组胺的乳酸菌是与之前的教导相反的。事实上，之前从未报道过益生菌产生组胺。
因此，广泛地讲，本发明提供了一种选择用于在哺乳动物中局部产生组胺的乳酸菌菌株的方法，其中，所述方法包括筛选存在活性组氨酸操纵子的细菌和选择具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺的菌株。
所述组氨酸操纵子包括三个基因(组氨酸/组胺反向转运体、组氨酸脱羧酶丙酮酰A型(HdcA)，和组氨酸脱羧酶丙酮酰B型 (HdcB))。可以相信，这些基因中的每一个的活性对于本发明都是重要的。因此，在本发明的筛选方法中，评估候选的细菌存在全部三个基因，并且选择出对于所有三个基因均呈阳性的菌株。任何合适的方法都可以用来检测全部三种基因的存在，例如遗传方法，比如可以使用PCR。组胺的良好水平的产生也可以是存在全部三种基因和存在活性组氨酸操纵子的指示。因此，本发明的选择方法还包括选择能产生组胺的菌株的步骤。优选的是具有高组胺产生水平的菌株。因此，在优选的实施方式中选择产生组胺的能力在大于200pg/ml水平的菌株，优选地，大于250pg/ml，或更优选地，大于300pg/ml，例如大于350、400、450、或500pg/ml的水平。这些值一般是指组胺在菌株培养物上清液中测量的值。
测量组胺产生水平的合适方法是本领域技术人员熟知的。在此举例说明并优选质谱分析法，更具体地，三重四极杆质谱分析法。然而，酶联免疫吸附试验(ELISAs)或免疫测定可以同样地用来评估和量化组胺产生。因此，在本发明的一些实施方式中，所述选择方法还包括检测由候选菌株产生的组胺的量或水平的步骤。由于通过本发明的方法选择的菌株的下游用途，在选择或隔离产生组胺的菌株之后，其他实施方式还包含包括培养或繁殖这些菌株，或可能存储这些菌株以供将来使用的进一步的步骤。
这些进一步的步骤(甚至本发明的方法的选择步骤)通常需要在供养组胺产生的合适的培养基中进行。优选的培养基包含合适的碳源，所述碳源供养所述菌株产生组胺。在特别优选的实施方式中，所述培养基包括作为碳源的葡萄糖，并且优选地不包含蔗糖，或至少只包括处于不会显著危害菌株产生组胺水平的蔗糖。还可以提供与任选地其他氨基酸源一起的组氨酸或组氨酸类似物。
在优选的实施方式中，所述菌株是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。
通过使用本发明的方法一旦选择出合适的菌株，然后所述菌株可以用于在哺乳动物中局部产生组胺。因此，所述菌株也必须是能够在哺乳动物中局部产生组胺。
因此，本发明的另一个方面提供了一种包括通过本发明的选择方法获得的乳酸菌菌株的细胞的产品，其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺，用于在哺乳动物中局部产生组胺。如将在本文中其他地方进行概述的，优选的用途是炎症性疾病的治疗和/或预防，或受益于局部组胺产生的情况或疾病的治疗和/或预防。例如，这些局部产生的组胺可以产生抗炎效果。
本发明的可选择的实施方式提供了一种能够产生组胺的乳酸菌菌株，用于在哺乳动物中局部产生组胺，其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子。所述菌株的优选的特征及其用途将在本文中的其他地方描述。
本发明还提供了治疗方法或在哺乳动物中局部产生组胺的方法，所述方法包括以能够在所述哺乳动物中局部产生组胺的有效量向所述哺乳动物施用包括乳酸菌菌株细胞的产品，或者施用乳酸菌菌株，其中，所述乳酸菌菌株细胞通过本发明的选择方法获得，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺。所述菌株的优选的特征及其治疗用途将在本文中的其他地方描述。
本发明还提供了包括乳酸菌菌株细胞的产品在制备用于在哺乳动物中局部产生组胺的组合物或药物中的用途，所述乳酸菌菌株细胞由本发明的选择方法获得。其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺。可选择的实施方式提供了乳酸菌菌株在制备用于在哺乳动物中局部产生组胺的组合物或药物中的应用，其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺。所述菌株的优选的特征及其治疗用途将在本文中的其他地方描述。
附图简要说明
图1：HILIC-HPLC馏分中组胺的数量表示。三重四极杆质谱用于量化存在于选择范围的HILIC-HPLC馏分中的组胺。在所有检查的馏分中TNF-抑制馏分具有最高量的组胺。
图2：来自罗伊氏乳杆菌6475的纯化的组胺和组氨酸通过组胺 H2受体抑制TNF的产生。图2A：纯化的组胺显著地抑制TNF的产生，即通过特定的H2受体拈抗剂以剂量依赖的方式阻断的效果。包含来自菌株6475的分泌因子(包括组胺)的条件培养基(或上清液) 显著地抑制TNF的产生，即通过特定的H2受体拈抗剂部分阻断的效果。N＝3，与对照培养基相比*P值＜0.05，与组胺相比**P值＜0.05，与 ATCC 6475条件培养基(CM)相比***P值＜0.05。图2B：来自包含组胺的菌株6475的细胞颗粒洗液抑制TNF的产生，即通过特定的 H2受体拈抗剂部分阻断的效果。馏分B3，包含比较纯的组胺，抑制 TNF的产生，即通过特定的H2受体拈抗剂完全阻断的效果。N＝3，与对照培养基相比*P值＜0.05，与ATCC 6475细胞颗粒洗液(CP)相比**P值＜0.05，与馏分B3相比***P值＜0.05。
图3：组氨酸操纵子对于罗伊氏乳杆菌6475TNF抑制的表型是重要的。图3A：组氨酸操纵子包括三个基因，组氨酸/组胺反向转运体、hdcA、和hdcB。图3B：组氨酸操纵子中的任何一个基因的突变导致罗伊氏乳杆菌6475对TNF抑制的部分损失。N＝9，与对照培养基相比*P值＜0.05，与ATCC PTA 6475相比**P值＜0.05。
图4：罗伊氏乳杆菌6475显著地降低由TNBS刺激诱导的重量损失，该图表示来自两个独立实验的数据，*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。
图5：罗伊氏乳杆菌6475显著地降低由TNBS刺激诱导的宏观的结肠损伤，该图表示来自两个独立实验的数据，*P＜0.05， ***P＜0.001。
图6：罗伊氏乳杆菌6475显著地降低由TNBS刺激诱导的SAA 浓度，该图表示来自两个独立实验的数据，*P＜0.05，***P＜0.001。
图7：hdcA突变体对于减轻结肠炎产生减弱的能力，该图表示来自两个独立实验的数据，*P＜0.05，**P＜0.01。
图8：hdcA突变体对于减轻结肠炎产生减弱的能力，该图表示来自两个独立实验的数据，*P＜0.01，***P＜0.001。
优选具体实施方式详细说明
本发明人在此已发现选择的乳酸杆菌的组，包括某些在特定的生长条件下局部产生组胺的罗伊氏乳杆菌的菌株，并且这些产生的组胺通过例如减少炎症、减少某些癌症等而有益于宿主。
组胺
组胺是有机氮化合物，其参与几种哺乳动物的与健康相关的过程，包括局部免疫反应以及调节肠道中的生理机能并作为神经传递介质。作为对外来病原体的免疫反应的一部分，组胺由嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。组胺可以来自氨基酸组氨酸的脱羧，由L-组氨酸脱羧酶催化的反应。
细菌能够利用与那些在真核生物中发现的酶无关的组氨酸脱羧酶来产生组胺。到目前为止，这种由某些细菌菌株产生组胺已经被视为是健康风险而不是对人类的可能的益处。例如，鲭亚目鱼中毒，一种非传染性食物源疾病的形式，是由于变质食物中(尤其是鱼中)的细菌产生组胺。由于通过发酵细菌或酵母进行类似的转换，发酵食品和饮料自然地含有少量的组胺。令人惊讶的是，从选择的细菌处释放一定控制量的组胺，能够产生有益的效果，而不是如上述研究中预期的有害效果。
组胺受体是一类与组胺作为它们的内源性配体的G蛋白偶联受体。有四种已知的组胺受体；H1受体(H1R)、H2受体(H2R)、H3受体(H3R)和H4受体(H4R)。
Vannier等(组胺通过组胺H2受体抑制肿瘤坏死因子α的基因表达和合成；J ExpMed.1991 July 1；174(1)：281-4)显示了LPS诱导的在外周血单核细胞中的TNF-α的合成受到组胺的抑制，他们还表明从肥大细胞中释放的组胺可能通过抑制在H2受体承受细胞中的局部细胞因子的合成，限制炎症和免疫反应的程度。
组胺的抗炎性活性先前已经由Wang等(组胺通过刺激肿瘤坏死因子(TNF)受体从细胞表面和高尔基池脱落拈抗TNF发信号；J.Biol. Chem.278(24)：21751-21760)公开，其显示了在培养的人类上皮细胞中，组胺引起表面TNFR1的短暂损失，增加了TNFR1脱落，和TNFR1 分子从高尔基体的调动。组胺注射到嫁接在免疫缺陷的小鼠上的人类皮肤中，引起TNFR1的脱落并减弱了内皮粘附分子的TNF介导诱导。
Vannie等人和Wang等人没有涉及任何关于使用产生组胺的细菌菌株作为益生菌，也没有涉及怎样基于它们产生组胺的能力去选择菌株以确保对宿主的某些健康利益，例如抗炎性效果。
二盐酸组胺制剂(ceplene)，是一种药物级形式的组胺二盐酸盐，用于预防诊断为患有急性骨髓性白血病(AML)患者的复发。在AML 的后缓解期，也就是说，当患者已经完成了初始化疗，二盐酸组胺结合低剂量的免疫激活细胞因子白介素-2(IL-2)一起施用。研究表明二盐酸组胺/IL-2可以诱导免疫介导杀伤白血病细胞。由患者在家里 18个月中以三个星期为周期皮下注射进行治疗。二盐酸组胺的副作用包括短暂的面红和头痛。必要时，取代皮下注射，接受局部产生的组胺对患者是有利的；这个释放策略可以通过使用根据本发明选择的菌株向患者施用来源于细菌的组胺来实现。
此前已经了解革兰氏阴性细菌产生组胺，例如温度滥用后在生鱼和肉类中，并且革兰氏阳性菌引起发酵食品，如奶酪、香肠、大酱、酱油、啤酒和葡萄酒的组胺腐败变质。在食物中的组胺产生菌的识别很难。
罗伊氏乳杆菌之前也已经和组胺的产生相关，Casas等(益生菌概念的验证：罗伊氏乳杆菌给于人类和动物对抗疾病的广谱保护； 2000，ISSN 0891-060X)报道Straub等(ZLebensm Unters Forsch(1995) 201：79-82)掌握的两种罗伊氏乳杆菌菌株已显示了脱羧L-组氨酸以形成组胺并且作者提醒不要将这些菌株用于发酵食品和作为益生菌。
Trip等(HdcB，一种新颖的依赖丙酮酰的组氨酸脱羧酶的催化成熟酶；MolecularMicrobiology(2011)79(4)，861-871)涉及产生组胺的革兰氏阳性细菌中组氨酸脱羧基因座的三种类型的基因组织。在乳酸菌中发现最大的群组，所述乳酸菌包括海格乳杆菌(L.hilgardii)0006、布氏杆菌(L.buchneri)B301、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)F275和喜盐杆菌(T.halophilus)。Lucas等(Histamine-Producing Pathway Encoded on an UnstablePlasmid in Lactobacillus hilgardii 0006； APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，Mar.2005，Vol. 71，No.3，p.1417-1424)进行的研究中已经显示海格乳杆菌0006产生组胺，他们还指明组胺是在不良细菌生长过程中出现在几种产品中的污染物。Lucas等已经执行葡萄酒乳酸菌集合的筛选，以确认参与葡萄酒的革兰氏阳性细菌组胺产生路径的基因。
已经从被卷入爆发组胺中毒的瑞士乳酪中分离出产生组胺的布氏乳杆菌菌株(Summer等.“从卷入食品中毒爆发的瑞士奶酪中分产生组胺的布氏乳杆菌”；Applied andEnvironmental Microbiology (1985)，Vol.50，Issue 4，p.1094-1096)。
Calles-Enriquez等(“嗜热链球菌组胺合成基因簇的测序和转录分析”：影响hdcA差异表达的因素；APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Sept.2010，Vol 76，No.18，p. 6231-6238)描述了嗜热链球菌的产生组胺的菌株，一种用于产生酸奶和某些奶酪品种的嗜热启动器。他们还指出具有脱去组氨酸羧基能力的菌株的存在可能会导致包含组胺的产品，所述组胺在消耗之前在生产期间或存储期间产生，并且指出这是以在发酵乳制品的制造中只使用组胺阴性菌株的重要性为依据的。
尽管之前已经知道一些乳酸菌可以产生组胺，但是并不知道产生组胺的能力是确保对于其宿主的某些健康利益的关键因素，例如某些乳酸菌菌株的抗炎性性能。
在现有技术中既不已知也是显而易见地得出这可以用于筛选和选择某些乳酸菌菌株益生菌。
肥大细胞
肥大细胞(也被称为肥胖细胞mastocyte和labrocyte)是几种组织类型的常驻细胞，包含许多富含组胺和肝素的颗粒。尽管它们以在过敏症和过敏性反应中的作用而著称，肥大细胞还起到重要的防护作用，例如密切地参与伤口愈合和抵御病原体。
肥大细胞存在于典型地围绕血管和神经的大部分的组织中，并且在外界和内部环境之间的边界附近尤为突出，例如皮肤、肺和消化道的粘膜、以及口腔、结膜和鼻子中。
在过敏性反应中，肥大细胞保持不活跃，直到过敏原粘附于已经与细胞相联系的IgE。其他膜活化事件既可以指导肥大细胞随后的脱粒，也可以与FceRI信号传导协同作用。来自于这些造粒中的组胺扩张毛细血管小静脉，激活内皮组织并提高血管渗透性。组胺的释放导致局部水肿(肿胀)、发热、发红和向释放位点吸引其他的炎症细胞。它还刺激神经末梢(导致瘙痒或疼痛)。组胺释放的皮肤信号是“耀斑和水疱”反应。蚊虫叮咬后的肿块和发红是这个反应的一个很好的例子，其在过敏原刺激肥大细胞后立即发生。对肥大细胞的其他生理反应的了解是很少的。多种证据表明肥大细胞在先天免疫中具有相当重要的作用-它们能够详细阐明大量的重要的细胞因子和其他炎症介质(例如TNFα)，它们表达多种被认为是参与识别病原体大类的“模式识别受体”，而没有肥大细胞的小鼠看起来更容易感染各种传染病。
鉴于食品中细菌组胺的毒性和建议在发酵食品中避免产生组胺的菌株的事实(进一步参见Calles-Enriquez等的例子，嗜热链球菌组胺生物合成基因簇的测序和转录分析：影响hdcA差异表达的因素； APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Sept.2010，Vol.76，No.18，p.6231-6238)，不可能认为在多种疾病的治疗和/或预防中，使用某些选择的乳酸菌菌株用于局部产生组胺是显而易见的。
宿主和他的微生物之间的关系是复杂的，因为宿主也一定是哺乳动物自身的细胞类型，例如肥大细胞。这种宿主-微生物的关系已经进展了多年的共同进化，这包括各种代谢物的微生物的产生，其可以在营养上、免疫上等有利于宿主，并作为特定受体或其他过程的全部或部分的受体拈抗剂、拈抗剂、脱敏感剂等。因此，需要理解微生物和人之间的特定相互作用，以便可以挑选出最合适的益生菌菌株并将其用于抵消这些发展，该人与特定的疾病或影响宿主健康的其他情况有关。
发明人已发现包括某些罗伊氏乳杆菌菌株的选择的乳酸菌组，在特定的生长条件下局部产生组胺。与之前的观点相反，这些局部产生的组胺以包括减少炎症、减少某些癌症等的多种方式有益于宿主。
本发明的另一个目的是提供包含连同特定碳源的所述菌株的产品，以得到合生元产品。
其他的目的和优点将从下面公开的内容和所附的权利要求书中更充分地显现出来。
向哺乳动物施用根据本发明的方法选择的乳酸菌菌株将导致局部产生组胺，所述组胺可能对几个原因有益。
本发明的主要目的是提供一种选择确保良好抗炎性效果的乳酸菌菌株的方法。由于对于某些乳酸菌的抗炎能力组氨酸操纵子和产生组胺是必不可少的，这些菌株可优选地用于炎症情况的治疗和/或预防。优选地，所述菌株可以用于哺乳动物身体的胃肠道中、泌尿生殖道中，口腔中，肺部和呼吸道中，皮肤上等的炎症过程的治疗和/或预防，包括但不局限于结肠炎、IBD、IBS、肠憩室病、牙龈炎、阴道炎等。之前已经知道组胺通过H2受体可以降低TNF-α的基因表达。而且肥大细胞能够详细阐明大量的重要的细胞因子和其他炎症介质，例如TNF-α。但是之前并不知道的是这些选择的菌株的组氨酸操纵子和局部组胺的产生能够有益于宿主，例如不知道选择的罗伊氏乳杆菌菌株的抗炎性能力是关键因素。之前也不知道在需要组胺的治疗中使用根据本发明的方法选择的罗伊氏乳杆菌。
用于炎症情况的治疗和/或预防的优选产品和菌株是罗伊氏乳杆菌，尤其是，罗伊氏乳杆菌6475(ATCC PTA 6475)。在本发明的其他实施方式中使用的菌株不是罗伊氏乳杆菌6475(ATCC PTA 6475)。
如本文所定义的本发明的菌株、产品和组合物的治疗用途一般会导致相关疾病或相关疾病症状的减少或缓解，例如可以导致哺乳动物中炎症水平的显著降低。例如，局部产生的组胺可以在肠道上皮细胞以及免疫细胞上活化H2受体以抑制宿主的粘膜免疫，例如通过抑制促炎性的细胞因子。因此，本发明允许膳食成分(组氨酸)在宿主免疫反应的活性位点和局部调节(例如肠道中)转换为组胺。可以看出与例如口服给药或其他施用组胺的形式相比，这些由本发明提供的局部产生组胺可以提供真正的优势，尤其是建议由于公认的毒性作用和健康风险而不主张这种口服摄入。
特别是，就其中的肠道炎症疾病而言，本发明的菌株、产品和组合物的治疗用途可以导致显著减少例如通过比如Wallace评分的标准方法测量的溃疡和肠损伤(如结肠损伤)，显著减少体重的损失或显著降低肠道(例如结肠)的炎症。
这种疾病或其症状的减少或缓解可以通过任何适当的化验来测定。优选地，疾病或症状的减少或缓解是统计显著地，优选地具有＜0.05的概率值。这种疾病或症状的减少或缓解通常与适当的对照个体或群体(例如健康的哺乳动物或未经治疗的哺乳动物或安慰剂治疗的哺乳动物)进行比较而确定。
取决于期望局部产生组胺的位点来选择一种菌株的施用和配方等等的适当方式。优选的施用方式是口服，然而，同样对于一些局部治疗或其他形式的局部施用至皮肤、直肠、阴道或牙龈也是合适的，或静脉注射或肌肉注射也是合适的。
尽管本文的实施例表明本发明菌株的用途及其治疗结肠炎的适当的剂量，但应理解，这只是可以依照本发明治疗的炎症情况的一个实施例，取决于待治疗的疾病、施药的方式和涉及的配方，可以选择如本文所定义的本发明的菌株、产品和组合物的适当的剂量。
包括组氨酸的膳食混合物可以用来确保组氨酸的存在，从而增加了细菌的功效。组氨酸可以单独施用或连同细菌一起施用。
一种确保细菌的供应组氨酸的可能性是食用富含组氨酸的食物，包括但不限于大豆蛋白、奶酪、鸡蛋、鸡肉和猪肉。
细菌中的组氨酸操纵子已经显示在低pH或能量来源限制的情况下提高了生长能力(Calles-Enriquez等)但是组氨酸操纵子与某些罗伊氏乳杆菌菌株的抗炎性特征没有关联。
本发明的另一个目的是在癌症治疗中使用根据本发明的方法选择的菌株。组胺与IL-2组合已经被用于治疗AML。使用本发明的菌株将导致局部的产生与IL-2组合可以用于治疗AML的组胺。
本发明的另一个目的是使用所选择的菌株以减少食物过敏、其他的过敏反应或其他的自身免疫性疾病。如先前已知的全身性组胺增加是由肥大细胞的造粒过敏的结果。当向接收者施用根据本发明选择的菌株时，局部产生的组胺将会导致脱敏效果。这将减少过敏或其他自身免疫性疾病。
本发明再一个目的是使用产生组胺的乳酸菌菌株以降低旅行者腹泻的风险。使用组胺阻滞剂治疗的患者增加了患旅行者腹泻的风险，这种增加的风险可以通过施用根据本发明选择的乳酸菌中和。
本发明的另一个目的是在MS治疗中使用所选择的菌株。已经提出将组胺作为发展MS新疗法的重要分子，并根据本发明选择的菌株向患者提供组胺。
本发明的另一个目的是使用产生组胺的细菌作为皮肤抗炎治疗，该皮肤抗炎治疗在皮肤中使用可利用的组氨酸和组氨酸的类似物。因为组氨酸是尿刊酸的基质，UV照射时皮肤产生尿刊酸，并且尿刊酸对皮肤有抗炎的作用。
另外一个目的是使用这些选择的菌株以抑制ERK1/2的活化。
本发明的另一个目的是抑制TNF α。
本发明的另一个目的是局部地或全身地减少炎症。
本发明的另一个目的是通过抑制ERK1/2来提高突触小泡的胞外分泌。
本发明的另一个目的是通过抑制ERK1/2来促进人类胚胎干细胞的自我更新。
本发明的另一个目的是通过抑制ERK1/2来诱导巨噬细胞 ABCA1的表达和胆固醇外流。
本发明的另一个目的是通过抑制ERK1/2来减少心肌肥大和心脏衰竭。
本发明的另一个目的是降低某些癌症的扩散，这些癌症包括白血病(例如AML)或恶性黑色素瘤。因此，这些癌症是优选的可以使用本发明的菌株、产品和组合物治疗的疾病。
本发明的另一个目的是在一定条件下使用所选择的菌株来产生组胺作为神经递质，例如在泌尿生殖(GU)道和中枢神经系统(CNS) 的相互作用中，和在局部疼痛中。作为神经递质的角色可以延伸到对肠道蠕动的作用(治疗便秘或腹泻)和扩展到在肠道中发起疼痛信号。
由于选择的乳酸菌(LAB)会产生组胺并影响内脏疼痛知觉和在肠道神经系统中发信号，本发明的另一个目的是使用所选择的菌株用于影响肠道-大脑轴线。因此，可以看出本发明可以用于治疗和/或预防任何受益于局部组胺产生的疾病，或者治疗和/或预防可以通过局部施用组胺治疗的任何疾病。
本发明的再一个目的是提供包含所述菌株的产品。
本发明的再一个目的是提供包含连同特定碳源的所述菌株的产品，以得到合生元产品，这样可以通过产生组胺菌株的特定刺激来增强效果。
本发明的再一个目的是提供包括连同组氨酸的所述菌株的产品，组氨酸包括含有组氨酸类似物或组氨酸的产品或组合物。优选地，这样混合物在保护性胶囊中口服施用，为在下部胃肠道中释放内容物以确保组氨酸和细菌在作用位点存活。
本发明的另一个目的是结合施用所述菌株和富含组氨酸的饮食。
本发明的另外一个方面是提供一种产品，该产品用于如在本文的其他地方定义的治疗应用，其中，所述应用还包括至少一种进一步的治疗剂或营养剂的施用。在这些实施方式中，所述进一步的治疗剂可以是在讨论的疾病的治疗中有效的任意的进一步的治疗剂，例如是进一步的抗炎剂或免疫治疗剂，比如趋化因子或细胞因子(如IL-2)。
在优选的实施方式中，所述进一步的试剂包括组氨酸或组氨酸类似物，供养由细菌菌株产生组胺的合适的碳源，或它们的组合。
所述进一步的试剂可以连同本发明的菌株一起施用，或者可以单独施用。另外，所述进一步的试剂可以与本发明的菌株同时施用或在不同的时间点施用。取决于讨论中的进一步药剂，技术人员可以很容易地确定合适的施用方案和时间安排。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括：
(1)由本发明的选择方法获得的乳酸菌菌株(或如在本文的其他地方定义的能够产生组胺的乳酸菌菌株)，其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能产生组胺；和
(2)至少一个附加组分，所述附加组分选自由合适碳源、组氨酸或组氨酸类似物源所组成的组，以及它们的组合，所述合适碳源供养由所述菌株产生组胺。
如在本文中描述的本发明的产品、组合物和用途中，所述组氨酸或组氨酸类似物优选地是包含组氨酸或组氨酸类似物的食品或食品添加剂的形式，或所述碳源包括葡萄糖。优选地，所述碳源不包括蔗糖，或至少仅包括处于不会显著地影响由菌株产生组胺水平的蔗糖。任选地，还可以提供其他氨基酸源。
在可选择的实施方式中，部分(1)中限定的菌株可以与在治疗讨论的疾病的治疗中有效的进一步组分组合，即进一步的治疗试剂，例如进一步的抗炎剂或免疫治疗剂，比如趋化因子或细胞因子(例如 IL-2)。
罗伊氏乳杆菌是天然地栖息于人类或哺乳动物肠道中的异型发酵的乳酸菌种类。特定的益生菌罗伊氏乳杆菌菌株强效地抑制人类 TNFα产生，而其他的益生菌罗伊氏乳杆菌菌株提高人类TNFα产生。
通过对益生菌罗伊氏乳杆菌菌株6475和其他菌株的机理研究， (该机理研究已经证明它们对活化的人类骨髓细胞的作用)，使得本发明成为可能。使用HILIC-HPLC分离罗伊氏乳杆菌代谢物，并通过 NMR光谱和质谱分析法鉴定组胺。通过三重四极杆质谱分析法的组胺的量化显示了当在葡萄糖基的基本培养基中生长时，罗伊氏乳杆菌菌株6475产生相对高浓度的组胺。之前转录物组学研究已经表明罗伊氏乳杆菌组氨酸操纵子中的两个基因通过菌株6475在TNF的抑制中起重要的作用。这些基因靶向诱变显示了组氨酸操纵子中的每个基因(组氨酸/组胺反向转运体、HdcA和HdcB)对于菌株6475的TNF 抑制表型均是重要的。机理研究表面组胺通过H2受体而不是H1受体经由发信号来抑制TNF。通过H2受体发信号增加了细胞内的cAMP，其活化了PKA。PKA的活性对于通过组胺的TNF抑制是必要的。组胺阻断MEK-ERK MAPK发信号路径的活化。
组胺以其在过敏症和过敏反应中的促炎效果而更加被熟知，但是一些研究也说明了组胺的抗炎性功能。体外研究中已经显示组胺可以抑制促炎性细胞因子，IL-1，IL-12，和来自LPS刺激的人单核细胞和巨噬细胞的TNF，并且这个作用通过H2受体拈抗剂逆转。此外，组胺经由H2受体能够刺激抗炎性细胞因子，IL-10的产生。人单核细胞的表面上，通过H2受体发信号导致CD14受体(参与LPS识别的受体)的表达下降。TNF受体也受组胺的影响。通过H1受体发信号诱导TNFR1和TNFR2的脱落。体内研究也揭示了组胺的抗炎作用。使用dimaprit(一种特定的H2受体激动剂)的治疗，降低了内毒素休克(LPS刺激)和肝炎(LPS加半乳糖胺的刺激)的小鼠模型中的血浆TNF水平。在LPS诱导的肝损伤小鼠模型中组胺起保护作用，并且这些作用在敲除H2受体的小鼠中减弱。在肠道中，组胺可以有助于防止细菌感染。通过淋巴集结中的H2受体发信号有助于防止感染小肠结肠炎耶尔森菌。
组胺的作用可以通过在靶细胞上的组胺受体的表达来决定。在T 细胞中，组胺的作用依赖于哪个组胺受体被激活。
通过H1受体发信号，组胺提高TH1型响应但通过H2受体抑制 TH1响应和TH2响应。正在进行一项观察在人体胃肠道中组胺受体表达的研究。检查的许多细胞类型表达多种组胺受体。例如免疫细胞，包括巨噬细胞，高表达的H1受体和H2受体，并证明H4受体的低表达。增加的肥大细胞和组胺涉及与IBS相关的内脏高敏感性。结肠粘膜神经支配附近肥大细胞的增加的数目和活性可以导致加剧腹痛的感觉。酮替芬(一种肥大细胞稳定剂)的研究，显示IBS患者中痛苦阈值增加，IBS症状减少，但是在直肠活检组织中肥大细胞的数目和活性(由组胺和类胰蛋白酶释放确定)没有改变。酮替芬改善IBS的作用可能不是稳定肥大细胞的结果，而可能归因于它作为H1受体拈抗剂的其他作用。如果H1受体的活化与促炎性响应相关联，用酮替芬阻断其活性可以允许由肥大细胞或肠道菌群(例如罗伊氏乳杆菌) 产生的组胺只通过H2受体发信号。正如我们已经讨论的，通过H2受体发信号可以抑制TNF的产生并引起抗炎性作用。此酮替芬机制可以用于新疗法，该新疗法将H1受体拈抗剂与罗伊氏乳杆菌的一般的益生菌作用结合在一起。
将生长培养基的碳源从葡萄糖进一步改变为蔗糖足以抑制所选菌株(例如罗伊氏乳杆菌6475)TNF抑制的表型。另外，在蔗糖的生长条件下观察到组氨酸操纵子中的全部三种基因的显著下调。
由所选益生菌罗伊氏乳杆菌菌株产生的作为抗炎性化合物的组胺的识别将有助于确定对于这些菌株的治疗应用。机理研究将THP-1 细胞上的H2受体的活化与组胺和ERK活化的约束联系起来。ERK 的活化参与除TNF产生外的很多细胞功能。ERK的活化参与增殖、肿瘤发生、分化和细胞存活。结果表明了所选菌株，例如罗伊氏乳杆菌6475，通过ERK活化的约束来抑制炎症、细胞增殖、细胞凋亡从而防治癌症的作用。另外，组胺是公知的神经递质。通过所选菌株产生组胺可以影响肠道神经系统中的信号发出，影响疼痛感觉和肠道蠕动。为了确保在作用位点产生组胺，为细菌提供组氨酸可能是有利的。组氨酸可以和细菌一起施用或单独施用，富含组氨酸的饮食也可以增加组胺产生。
本发明提供了某些乳酸菌菌株和选择这些菌株的方法以及包括这些菌株的产品。使用对于组氨酸操纵子的筛选而选择细菌，令人惊讶地是，活性组氨酸操纵子的存在显示出对多种有益效果，例如乳酸细菌菌株的免疫调节性能，是必不可少的。
本发明的其他目的和优点对读者来说很明显，这些目的和优点都属于本发明的保护范围。
本发明将参照以下非限制性的实施例作进一步描述的。
实施例
表1、本研究中使用的细菌菌株
表2、罗伊氏乳杆菌6475突变体中组氨酸操纵子的转录组分析
*与野生型菌株6475相比的失去了抑制TNF产生能力的插入突变体。CFAS：环丙烷脂肪酸合酶，THFS1：四氢叶酸合成酶1，THFS2：四氢叶酸合成酶2。
§与生长于LDMIIIG的野生型6475相比的生长于LDMIIIS的§野生型菌株6475。生长于LDMIIIS的野生型6475失去了抑制TNF 产生的能力。
实施例1：
通过所选的乳酸菌产生组胺
细菌菌株和培养条件
在这项研究中使用的所有细菌菌株已在表1中描述。罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475是来自芬兰母乳的分离菌(购自美国弗吉尼亚州马纳萨斯ATCC)。罗伊氏乳杆菌ATCC PTA6475、ATCC 6475 JP577、 ATCC 6475 1229、ATCC 6475 1230和ATCC 6475 1231贯穿本文分别称作菌株6475，JP577，1229，1230和1231。罗伊氏乳杆菌菌株在 MRS(deMan，Rogosa，Sharpe media)培养基(Difco，Franklin Lakes， NJ)中，无氧条件下培养16-18h，然后接种到2L的半确定成分培养基LDMIII(OD600调整至0.1)中，这在之前已经描述过。碳源为葡萄糖，LDMIIIG或蔗糖，LDMIIIS。培养物在厌氧工作站(MACS MG-500， MicrobiologyInternational，Frederick，MD)中37℃下生长24h，该厌氧工作站提供有10％二氧化碳、10％H2和80％N2的混合物。通过测量OD600，在不同的时间取样以跟随生长。在固定阶段(24h)，将自 2L培养物(4000x g，10min)的细胞颗粒化。在进一步HLPC分离处理和检测TNF抑制生物测定之前，细胞颗粒和无细胞的细菌上清液在-20℃下储存。
细胞系和试剂
在体外，使用THP-1细胞(人类单核细胞样细胞系，ATCC， Manassas，VA)进行实验，该THP-1细胞保持在37℃，5％CO2下的 PPMI(ATCC)和热灭活的牛胎儿血清(Invitrogen，Carlsbad，CA) 中。MEK1/2、磷酸-MEK1/2、ERK1/2，和磷酸-ERKl/2抗体以及MEK 抑制剂U0126购自Cell Signaling Technology(Dan vers，MA)，[β]- 肌动蛋白抗体购自Abeam(Cambridge，MA)。除非另有说明，所有的其他试剂购自Sigma(St.Louis，MO)。
细胞壁相关因素的HILIC-HPLC分离
来自生长于LDMIIIG或LDMIIIS中的菌株6475的细胞颗粒(7g)，用30ml冰冷的50％乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)洗涤。4℃下以4000x g离心该细胞悬浮液10min。上清液经聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜过滤器(0.45μm孔径，Millipore，Bedford，MA)过滤，冻干，并重悬浮于10ml的0.1％的甲酸中。该重悬浮的样品使用 ultracel-3膜(Millipore，Bedford，MA)的Amico Ultra-15离心过滤装置进行粒度分级。滤液(9ml)快速真空干燥至1ml，0.75ml用于HILIC-HPLC。该样品溶解在100％的乙腈中，然后在100-0％梯度的乙腈，0.1％甲酸的聚LC羟乙基柱中运行。样品运行25分钟，以10毫升/分钟/管收集25份馏分(Al-Cl)。每一馏分中取3ml冻干，重悬浮于3ml 0.1％的乙酸中，再一次冻干，用于在TNF抑制生物测定中进行测试。
TNF抑制生物测定和TNF ELISA
来自24h的LDMIII的培养物中的细菌上清液(10ml)使用PVDF 膜过滤器(0.22μm孔径，Millipore)进行过滤-消毒，并进行如上所述的粒度分级。1ml的＜3kDa的滤液快速真空干燥并重悬浮于RPMI 培养基中。这些处理的上清液样品被称为条件培养基。所有这些上清液按体积标准化为OD600＝1.0。HILIC-HPLC分离的冻干馏分重悬浮于400μl 10mg/ml的碳酸氢铵中，快速真空干燥，重悬浮于400μl RPMI 培养基中。测试条件培养基和细胞颗粒洗液馏分调节单核细胞中的 TNF产生的能力。简单地说，如之前描述的，通过添加100ng/mlPam3Cys-SKKKK x 3HC1(EMC Microcollections，Tuebingen， Germany)刺激THP-1细胞(约5x104个细胞)产生TNF。添加抑制剂-H2受体拈抗剂，雷尼替丁和西咪替丁(10-4-10-6M)，H1受体拈抗剂，吲哚美辛(10-5-10-6M)，MEK抑制剂，U0126(10μM)，和PKA 抑制剂，H89(N-[2-(对-溴肉桂基氨基)乙基]-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐)(10-5M)至THP-1细胞，随后是罗伊氏乳杆菌条件培养基或细胞颗粒洗液馏分(5％v/v)，组胺(10-5M)，或双丁酰基cAMP (10-3-10-7M)。在37℃和5％CO2条件下培养平板3.5小时。颗粒化 THP-1细胞(3000xg，5min，4℃)，并根据制造商的说明书(R&D Systems，Minneapolis，MN)使用量化的ELISA来确定THP-1细胞上清液中TNF的量。
使用亲水作用色谱-高效液相色谱(HILIC-HPLC)分离罗伊氏乳杆菌6475 TNF抑制化合物
洗涤细菌细胞颗粒以去除松散地附着在细胞表面的化合物。基于疏水性使用HILIC-HPLC分离细胞颗粒洗液的组分，检测得到的25 份馏分对TNF抑制化合物的保留。生长在葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基中的罗伊氏乳杆菌6475产生TNF抑制因子，该因子保留在 3份不同的HILIC-HPLC馏分(B3、B5和B6，数据未示)中，生长在蔗糖作为唯一碳源的罗伊氏乳杆菌6475失去了TNF抑制表型并作为阴性对照。没有任何来自6475蔗糖细胞颗粒洗液的 HILIC-HPLC馏分表明显著的TNF抑制作用(数据未显示)。
通过NMR光谱和质谱分析确定抑制TNF的HILIC-HPLC馏分中的组胺
通过1H NMR对TNF抑制的HILIC-HPLC馏分B3进行分析，并与邻近的无TNF抑制的馏分B4作比较。在馏分B3中观察到化学位移在7.0-7.5ppm之间的独特系列峰，这是芳香族化合物的特征，而这些在馏分B4中没有观察到(数据未示出)。使用异核单量子相关 (HSQC)2-二维(2D)NMR进一步分析该芳香族化合物群以鉴定其成分。该芳香族化合物由色氨酸、苯丙氨酸、组胺和一种未鉴定出的化合物组成。色氨酸和苯丙氨酸是细菌生长培养基的成分而组氨酸不是。使用一附加的2D NMR方法、全相关谱(TOCSY)确定这些结果。组胺是由组氨酸经由组氨酸脱羧酶通过包括乳酸杆菌的发酵细菌产生的生物胺。还使用电喷雾飞行时间质谱(ESI TOF MS)鉴定出馏分B3中的组氨酸。基于它在MS/MS分析中的裂解谱，组胺不是共价修饰的。使用ESI TOF MS分析生长在的蔗糖培养基中的罗伊氏乳杆菌6475的相应B3馏分没有显示任何组胺。生长在葡萄糖培养基中的罗伊氏乳杆菌6475产生组胺，其存在于TNF抑制HILIC-HPLC 馏分中。
使用三重四极杆质谱法量化选择的HILIC-HPLC馏分中的组胺
三重四极杆质谱法是一种量化小分子化合物的既定的、高灵敏度的方法。自罗伊氏乳杆菌6475葡萄糖(B2-B7)和蔗糖(B2-B9)以及细菌培养上清液的HILIC-HPLC馏分的选择范围中对组胺进行量化。高水平的组胺(＞300ng/mL)与HILIC-HPLC馏分抑制TNF的能力相对应(图1)。在大多数检测的馏分中，包括来自6475蔗糖的这些 (图1)，测量到低水平的组胺。组胺抑制TNF产生的能力似乎是依赖于浓度。
合成的组胺和由罗伊氏乳杆菌6475产生的组胺通过H2受体抑制 TNF产生
组胺能够显著地抑制来自TLR2激活的人体单核细胞(THP-1) 的TNF产生(图4)。组胺可以通过四种不同的组胺受体发信号，然而，单核细胞只表达高水平的H1受体和H2受体。之前的研究已经表明了组胺通过H2受体对TNF产生的作用。特定的H1和H2受体拈抗剂用于确定哪个受体介导组胺对THP-1细胞的作用。特定的H2受体拈抗剂，雷尼替丁和西咪替丁，能够通过组胺以依赖于浓度的方式阻断TNF的抑制(图2A)。使用特定的H2受体抗体的流式细胞术分析显示了THP-1高度表达H2受体(数据未示出)。特定的H1受体拈抗剂，吲哚美辛，对通过组胺的TNF抑制没有任何作用(图2A)。组胺通过H2受体发信号限制来自TLR2激活的THP-1细胞的TNF的产生。与对照培养基相比，包含组胺的罗伊氏乳杆菌6475条件培养基显著地抑制TNF，这个作用通过H2受体拈抗剂而不是H1受体拈抗剂部分阻断(图2A)。抑制TNF中的部分阻断表明存在于6475条件培养基中的组胺通过H2受体发信号，但是通过替代机制作用的其他TNF抑制因素也可能存在于条件培养基中。包含菌株6475的组胺的细胞颗粒洗液也抑制TNF产生(图2B)。从6475条件培养基可以看出，H2受体拈抗剂部分地阻断6475细胞颗粒洗液的作用(图2B)，这表明多种免疫调控蛋白存在于未分馏的细胞颗粒洗液中。TNF抑制馏分B3包含大量的纯化的组胺的作用由H2受体拈抗剂的添加完全地阻断(图2B)。
实施例2
产生组胺的菌株的选择
产生组胺的细菌的识别/选择
要检测的和可能被选择的菌株在MRS(deMan，Rogosa，Sharpe) 培养基(Difco，Franklin Lakes，NJ)中无氧条件下培养16-18小时，然后接种到2L的半确定成分的培养基LDMIII(OD600调整至0.1)中。碳源为葡萄糖，LDMIIIG。每一个培养物在厌氧工作站(MACSMG-500，国际微生物学，Frederick，MD)中37℃下生长24h，该厌氧工作站提供有10％二氧化碳、10％H2和80％N2的混合物。通过测量 OD600，在不同的时间取样以跟随生长。在固定阶段(24h)，对细胞进行取样用于分析(使用实时PCR)以检测三种基因，组氨酸/组胺反向转运体、HdcA和HdcB的存在。
对于三种基因呈阳性的菌株，产生组胺的水平由三重四极杆质谱法确定。选择出具有高组胺产量(＞250pg/ml)的菌株。组胺的产量还可以通过ELISAs或免疫测定来评估和量化。
实施例3
免疫调节的说明
组氨酸操纵子有助于罗伊氏乳杆菌6475的TNF抑制表型
似乎是操纵子的一部分的三种基因参与罗伊氏乳杆菌6475的组胺产生。这些基因是组氨酸/组胺反向转运体，组氨酸脱羧酶丙酮酰A 型(HdcA)和HdcB(图3A)。之前的的转录学研究表明组氨酸/组胺反向转运体基因和HdcA对于菌株6475TNF抑制表型可能很重要。与生长在葡萄糖基质中的6475相比，生长在蔗糖基质中的6475中的3 个基因全部被强烈地下调(失去TNF抑制作用)(表2)。另外，失去 TNF抑制作用的2个突变体中，操纵子中的至少1个基因被下调(表 2)。对这些突变体先前已进行了研究，尽管基因产物不具备TNF抑制性质，但是该基因似乎对6475的抗炎表型很重要。相反地，没有失去TNF抑制的2个突变体表明组氨酸操纵子中的任何基因没有被下调(表2)。通过向基因序列(菌株1229、1230和1231)中插入提前终止密码子，使得三个基因中的每一个发生突变。在无关的基因中也发生突变，利福平耐药基因，以用作阴性对照(菌株JP577)。和野生型菌株相比，组氨酸操纵子中仅一个基因的突变足以引起TNF 抑制的部分损失(图3B)，这表明这些基因中的每一个对于罗伊氏乳杆菌6475的TNF抑制表型都很重要。活性的部分损失表明其他活性免疫调节蛋白仍然由罗伊氏乳杆菌6475产生。
ERK1/2活化对于通过TLR2刺激的单核细胞的TNF产生是必需的
ERK1/2通过来自上游MAPKK和MEK1/2的磷酸化作用被活化，并且先前已经显示了ERK1/2对于TNF的产生很重要。使用特定的 MEK1/2抑制剂，U0126处理THP-1细胞，用于在使用TLR2激动剂刺激之前改变时间的量来抑制ERK1/2的活化。使用U0126处理30 分钟足以阻止TNF的产生(数据未示)。ERK1/2随着TLR2的刺激被活化并且对于刺激我们的模式体系中的TNF的产生很重要。
H2受体的刺激导致细胞内cAMP增加
H2受体是与G蛋白偶联的受体，其可以活化腺苷酸环化酶并且增加细胞内cAMP。TNF可以由cAMP和cAMP的类似物在转录水平抑制。在对照培养基中，用TLR2激动剂刺激THP-1细胞，对具有或不具有H，受体拈抗剂的6475上清液或组胺和cAMP的细胞内水平进行测定。罗伊氏乳杆菌6475上清液引起cAMP小的但显著的增加 (数据未示出)。使用H2拈抗剂的处理阻断了这种作用。使用组胺的处理也可以看到cAMP的增加，并且这种作用由H2拈抗剂被阻断(数据未示出)。在TLR2刺激的THP-1细胞中加入cAMP的合成类似物，联丁酰基cAMP(dcAMP)，监测其对于TNF的产生的影响。dcAMP 的添加(10-5～10-3M)足以抑制TNF的产生(数据未示出)。刺激组胺H2受体导致cAMP增加，这可以阻断在活化的单核细胞中的下游TNF的产生。
蛋白激酶A(PKA)的活性对于通过罗伊氏乳杆菌6475、组胺和 dcAMP对TNF的抑制很重要
cAMP增加的浓度可以活化PKA并且随后抑制下游ERK MAPK 发信号路径。为了确定PKA的活性对于通过组胺(由菌株6475产生) 对TNF的抑制作用是否重要，面对6475上清液、馏分B3、组胺或不同浓度的dcAMP情况下，使用特定的PKA抑制剂，H89，处理活化的THP-1细胞。H89的加入通过所有这些正常的抑制TNF的化合物而部分地阻断了TNF的抑制(数据未示)。PKA的活性对于通过组胺和dcAMP对TNF的抑制很重要。
通过H2受体发送的信号阻断MEKI/2和ERK1/2的活化
之前的研究已经证明PKA可以抑制MEK的Ras/Raf活化和随后的ERK MAPK发信号。与对照培养基相比，使用6475上清液、组胺或U0126活化的THP-1细胞的处理阻断了MEK1/2和下游的 ERK1/2的磷酸化作用(数据未示出)。使用H2受体拈抗剂的处理恢复了MEK1/2和ERK1/2的活化(数据未示出)。任何一个处理方案的MEK1/2和ERK1/2蛋白水平没有区别。来自菌株6475的组胺抑制MEK和下游ERK的活化以导致来自TLR2刺激的骨髓细胞的TNF 产生的降低。
因此，这些实验表明H2受体的刺激导致cAMP增加，蛋白激酶 A(PKA)的活化和MEK-ERK MAPK信号通路的抑制。如上所述，进行了机理研究以确定组胺对于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号路径的影响。使用特定MEK抑制剂抑制MEK-ERK信号路径足以阻断TNF的产生。使用菌株6475上清液或组胺活化THP-1细胞的处理增加细胞内cAMP。cAMP的增加由雷尼替丁(一种特定的H2受体拈抗剂)抑制。使用cAMP的合成类似物，dcAMP处理TLR2刺激的 THP-1细胞，足以抑制TNF的产生。PKA活性的约束通过前述的抑制TNF的化合物6475条件培养基、馏分B3、组胺和dcAMP而部分地阻断了TNF的抑制。使用6475条件培养基、组胺、或U0126活化THP-1细胞的处理抑制了MEK1/2的活化，即存在雷尼替丁时被阻断的效果。使用6475条件培养基、组胺、或U0126活化THP-1细胞的处理抑制ERK1/2的活化，即存在雷尼替丁时被阻断的效果。
实施例4
通过免疫印迹检测MEKl/2和ERKl/2
THP-1细胞溶解在冰冷的裂解缓冲液，该裂解缓冲液包含50mM 的Tris(pH 7.4)、250mM的NaCl、5mM的EDTA、50mM的NaF、 1mM的Na3VO4、1％v/v的诺乃清洁剂(Nonidet)P40、0.2％v/v的 NaN3以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂。裂解物在冰上培养30min，每10min 涡旋振荡，通过在4℃以13000xg离心10min来澄清。根据制造商的说明书使用Quant-iTTM蛋白分析试剂盒(Invitrogen)和量子比特荧光计测量蛋白质的浓度。等量的蛋白质加载到电泳凝胶上。
使用特定的磷酸-ERK1/2抗体进行ERK1/2活化的分析。细胞提取物加载到10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并转移到聚偏二氟乙烯膜 (Bio-Rad，Hercules，CA)。膜在封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences， Lincoln，NE)中4℃过夜阻断。洗涤几次后，用在封闭缓冲液(Li-Cor) 中稀释的ERK1/2，磷酸-ERK1/2或B-肌动蛋白特异性抗体在室温下探测膜1h。洗涤后，将膜在合适的辣根过氧化物酶结合的第二抗体中室温下培养1h，然后用化学发光检测来显影印迹。除了初级抗体在4℃过夜，进行如上所述的MEK1/2活化的分析。
实施例5
hdcA突变体对于减轻结肠炎产生减弱的能力
细菌菌株和培养物
使用RecT介导的寡核苷酸重组工程产生突变体。表达RecT的罗伊氏乳杆菌(菌株RPRB0000)用于在rpoB(locus tag HMPREF0536_0828(ZP_03961568))中构建突变，靶向基因位于组氨酸脱羧酶基因簇HMPREF0536_1229(ZP_03961969)， HMPREF0536_1230(ZP_03961970)和HMPREF0536_1231 (ZP_03961971)中以分别产生菌株RPRB3002，RPRB3004，RPRB3005和RPRB3006。突变通过PCR验证，并且由序列分析确认完整性。
罗伊氏乳杆菌ATCC PTA6475和组氨酸脱羧酶基因(hdcA)突变体在37℃下在厌氧工作站中的MRS中(Difco，Franklin Lakes，NJ) 培养，该无厌氧工作站提供有10％CO2、10％H2和80％N2的混合物。
制备罗伊氏乳杆菌细胞并施用给小鼠
每一个罗伊氏乳杆菌菌株的单菌落接种在10ml的MRS培养基中在37℃无氧条件下生长18-20h。调节OD600＝0.03的细菌接种到40ml 的MRS中以开始发酵，并在37℃无氧条件下生长5.5h(OD600≈2.5，在这个时间点细菌处于对数生长期)。将细胞轻轻地制成颗粒(2500x g，室温，4min)并以25x 109CFU/ml的浓度重悬浮于MRS中。作为培养基对照，使用无菌的MRS培养基。环境适应10天后，每个 8周龄的雌性BALB/c小鼠每天通过口胃强饲法接受一剂新鲜制备的野生型罗伊氏乳杆菌6475或hdcA突变体或MRS(每次0.2ml)七天。根据批准的协议(AN-4199；贝勒医学院动物设施)进行所有小鼠实验。小鼠(45日龄)来自Harlan实验室(休斯顿，德克萨斯州) 并保持在特定的无病原体条件下的顶端过滤器的笼子中(每笼5只小鼠)且具有蒸馏水和Harlan啮齿动物食物2918的自由通道。小鼠被随机地分成不同的组。
使用三硝基苯磺酸(TNBS)直肠灌肠剂诱导急性结肠炎。在第六次强饲法前六个小时诱导结肠炎。小鼠通过不断的异氟醚的吸入麻醉。A 5％的TNBS水溶液(Sigma-Aldrich，USA)用相同体积的无水乙醇稀释并以体重计100mg/kg的剂量直肠施用。灌肠后保持小鼠在垂直位置头部向下2min以确保结肠中肠灌剂的完整保留。过程控制小鼠在PBS中接受50％的乙醇。在TNBS施用之前和TNBS施用两天后对小鼠进行称重。然后，处死小鼠。通过重量损失，宏观评分和血清SAA浓度，确定结肠的炎症和损伤。
结肠炎的宏观评价
收集结肠，纵向切开，用数码相机记录图像。根据Wallace标准 (Morris等，1989)确定结肠的炎症和损伤。对结肠进行评分(盲评)。使用使用GraphPad Prism版本5.01(GraphPad Software，La Jolla， CA)进行数据统计。Kruskal-Wallis测试用来检测包括在分析中的所有组的显著区别。结果概括为中位数和四分位差。
作为全身炎症标记物的血清淀粉样蛋白A(SAA)的测量
血液样本通过心脏穿刺收集，抗凝并且以13,000rpm离心10min 以分离血浆。根据制造商说明书使用来自ALPCO的ELISA试剂盒测量血浆样品中的血清淀粉样蛋白A(SAA)浓度。SAA是指示与结肠炎严重程度相关的小鼠全身性炎症的急性期蛋白。
结论
罗伊氏乳杆菌6475保护小鼠对抗TNBS诱导的急性结肠炎
在TNBS诱导的急性结肠炎小鼠模型中检测罗伊氏乳杆菌6475 的抗炎作用。将每天通过口胃强伺法接受罗伊氏乳杆菌6475的小鼠与接受培养基对照的小鼠作比较。作为结肠炎的阴性对照，对用PBS 代替TNBS刺激小鼠也进行了研究。
图4～6代表来自两个独立实验的数据。结肠炎的阴性对照(直肠内接受代替TNBS的PBS)具有较低的重量损失(或甚至增重)，罕见的结肠损伤和低血清SAA浓度。接受MRS培养基和TNBS/ETOH 的结肠炎阳性的小鼠发展为严重的结肠炎，其以大幅的重量损失，结肠中伴有炎症的溃疡，较多的损伤扩展大于1cm的点和血清中显著提高的SAA浓度为特征。使用罗伊氏乳杆菌6475的口胃强伺法显著地减少了重量损失，结肠中的宏观炎症和血清SAA浓度，表明罗伊氏乳杆菌6475显著地减弱结肠炎。
hdcA突变体对于减轻结肠炎产生减弱的能力
使用同样的小鼠模型，我们检测对于罗伊氏乳杆菌6475的抗炎作用是否需要编码组氨酸脱羧酶的hdcA基因。将8周龄的雌性 BALB/c小鼠随机分成三组，三组分别接受野生型罗伊氏乳杆菌6475 或hdcA突变体或MRS培养基。图7和图8表示来自两个独立实验的数据。再次，与培养基对照组相比，使用罗伊氏乳杆菌6475的口胃强伺法显著地降低了体重损失和结肠损伤。与接受野生型细菌的小鼠相比，接受hdcA突变体的小鼠显著地提高了重量损失和结肠中的宏观炎症，这表明hdcA突变体对于减轻结肠炎产生减弱的能力。

Claims (14)

1.一种选择乳酸菌菌株的方法，所述乳酸菌菌株用于在哺乳动物中局部产生组胺，其中，所述方法包括筛选存在活性组氨酸操纵子的细菌和选择具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株选择为其产生组胺的能力在大于250pg/ml的水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌株是罗伊氏乳杆菌。
4.一种包括根据权利要求1至3中任一的选择方法获得的乳酸菌菌株细胞的产品，其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺，用于在哺乳动物中局部产生组胺。
5.根据权利要求4所述的产品，其中，所述哺乳动物是人类。
6.根据权利要求4或5所述的产品，其中，局部产生组胺是在所述哺乳动物的胃肠道中、泌尿生殖道中，口腔中，肺和呼吸道中，或在皮肤上。
7.根据权利要求4至6中任一所述的产品，其中，所述应用在炎症情况的治疗和/或预防。
8.根据权利要求7所述的产品，其中，所述炎症情况选自由结肠炎、炎症性肠病、肠易激综合症、肠憩室病、牙龈炎和阴道炎组成的组。
9.根据权利要求4至8中任一所述的产品，其中，所述菌株是罗伊氏乳杆菌。
10.根据权利要求9所述的产品，其中，所述菌株是罗伊氏乳杆菌6475。
11.根据权利要求4至10中任一所述的产品，其中，所述应用还包括施用至少一种治疗剂或营养剂。
12.根据权利要求11所述的产品，其中，所述试剂包括组氨酸或组氨酸类似物、合适的碳源，或它们的组合，所述碳源供养由所述菌株产生的组胺。
13.一种组合物，所述组合物包括：
(1)根据权利要求1至3中任一的选择方法获得的乳酸菌菌株，其中，所述乳酸菌菌株具有活性组氨酸操纵子并且能够产生组胺；和
(2)至少一个附加组分，所述附加组分选自由合适的碳源、组氨酸或组氨酸类似物源组成的组，以及它们的组合，所述碳源供养所述菌株产生的组胺。
14.根据权利要求12所述的产品或权利要求13所述的组合物，其中，所述组氨酸或组氨酸类似物是以包含组氨酸或组氨酸类似物的食品或食品添加剂的形式，或其中所述碳源包括葡萄糖。
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