KR20140038501A - Shk-기초된 제약학적 조성물 및 이들을 제조하고 이용하는 방법 - Google Patents

Shk-기초된 제약학적 조성물 및 이들을 제조하고 이용하는 방법 Download PDF

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KR20140038501A
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쇼운 피. 이아도나토
에릭 제이. 타르차
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키네타 원, 엘엘씨
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Abstract

본원에는 서열 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (서열 번호:1)를 갖는 제약학적 조성물이 개시된다. 이들 개시된 조성물은 서열 번호: 1의 C-말단에서 산 또는 아미드를 포함할 수 있고, 그리고 상기 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 진단적 목적으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 이들 제약학적 화합물을 제조하고 이용하는 방법 역시 개시된다.

Description

SHK-기초된 제약학적 조성물 및 이들을 제조하고 이용하는 방법{SHK-BASED PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS OF MANUFACTURING AND USING THE SAME}
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2011년 6월 6일자 제출된 U.S. 특허가출원 61/493,868 및 2012년 4월 17일자 제출된 U.S. 특허가출원 61/625,578에 우선권을 주장하고, 이들 둘 모두 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
발명의 분야
본원에서 개시된 조성물과 방법은 전반적으로, 자가면역 질환 및 대사 장애를 비롯하여, 기억 T 세포가 일정한 역할을 하는 질환과 장애를 치료하고, 이들을 예방하고 및/또는 이들과 연관된 증상을 경감하기 위한 ShK-기초된 제약학적 조성물의 용도에 관계한다.
정부 지분의 진술
미국 정부는 National Institutes of Health National Institute of Allergy and Infectious Disease Grants R43AI085691과 NIH R01 NS48252에 의하여, 본 발명에서 권리를 갖는다.
발명의 요약
많은 면역-관련된 인간 질환과 대사 장애는 기억 T 세포의 작용에 기인한다. 이런 면역-관련된 질환에는 특히, 자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, 1형 진성 당뇨병, 류머티스성 관절염, 그리고 건선이 포함된다. 대사 장애의 실례에는 비만, 2형 당뇨병, 과콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군, 대사 증후군 X, 인슐린 저항, 과지질혈증, 지방이영양증, 이상지질혈증, 과트리글리세리드혈증, 글루코오스 과민증 및 고혈압이 포함된다.
기억 T 세포의 2가지 부류가 알려져 있다: 중심 기억 T 세포 (TCM) 및 작동체 기억 T 세포 (TEM). 활성화 직후에, TEM 세포는 Kv1.3 K+ 이온 채널을 상향 조절한다. TEM 세포의 항원-주동된 증식은 Kv1.3 K+ 이온 채널 차단제에 민감하고 (Wulff et al., J. Clin. Invest. 111 :1703-1713, 2003), 그리고 카리브해 말미잘 (Stichodactyla helianthus)로부터 최초 단리된 폴리펩티드 ShK는 이런 차단제로서 기능한다. Kv1.3 채널을 차단함으로써, ShK는 TEM 세포의 증식을 피코몰 농도에서 억제한다.
본원에서 개시된 한 구체예는 서열 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (서열 번호:1, 여기서 Xaa는 Met 또는 Nle이다)를 갖는 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다.
다른 구체예는 화학식 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2를 갖는 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다.
다른 구체예는 화학식 p-포스포-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (ShK-186)를 갖는 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다.
다른 구체예는 화학식 L-시스테인아미드, 4-포스포노-L-페닐알라닐-2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]아세틸-L-아르기닐-L-세릴-L-시스테이닐-L-이소류실-L-α-아스파르틸-L-트레오닐-L-이소류실-L-프롤릴-L-리실-L-세릴-L-아르기닐-L-시스테이닐-L-트레오닐-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-시스테이닐-L-리실-L-히스티딜-L-세릴-L-노르류실-L-리실-L-티로실-L-아르기닐-L-류실-L-세릴-L-페닐알라닐-L-시스테이닐-L-아르기닐-L-리실-L-트레오닐-L-시스테이닐글리실-L-트레오닐-, 환상 (5→37),(14→30),(19→34)-트리스(이황화물) (본원에서 ShK-192로 지칭됨, CAS 등록 번호 1159528-26-3)을 갖는 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 포함하고, 여기서 ShK-192 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, 그리고 C-말단은 산 또는 아미드이다.
다른 구체예는 화학식 PpA-Phe-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (ShK-198)를 갖는 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다.
다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착된다. 다른 구체예에서, C-말단은 산 또는 아미드이다. 다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, 그리고 C-말단은 산 또는 아미드이다.
다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 화학 엔티티는 ShK 폴리펩티드의 N 말단에 부착된다. 다른 구체예에서, 화학 엔티티는 연결 분자 또는 연결 기를 통해, ShK 폴리펩티드의 N-말단에 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, 화학 엔티티는 아미노에틸옥시에틸옥시-아세틸 링커에 의해, ShK 폴리펩티드의 N-말단에 부착된다.
다른 구체예에서, 화학 엔티티는 L-Pmp(OH2); D-Pmp(OH2); D-Pmp(OHEt); L-Pmp(Et2); D-Pmp(Et2); L-Tyr; L-Tyr(PO3H2); L-Phe(p-NH2); L-Phe(p-CO2H); L-아스파르테이트; D-아스파르테이트; L-글루타메이트; 그리고 D-글루타메이트로 구성된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 화학 엔티티/링커 조합은 AEEAc-L-Pmp(OH2); AEEAc-D-Pmp(OH2); AEEAc-D-Pmp(OHEt); AEEAc-L-Pmp(Et2); AEEAc-D-Pmp(Et2); AEEAc-L-Tyr; AEEAc-L-Tyr(PO3H2); AEEAc-L-Phe(p-NH2); AEEAc-L-Phe(p-CO2H); AEEAc-L-아스파르테이트; AEEAc-D-아스파르테이트; AEEAc-L-글루타메이트; 그리고 AEEAc-D-글루타메이트로 구성된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 제약학적 조성물 내에서 이의 제약학적으로 허용되는 염으로서 제공된다. 다른 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 아세테이트이다. 다른 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 칼륨 아세테이트 또는 나트륨 아세테이트이다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 수성 담체에 담겨 제공된다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물의 pH는 5 내지 7이다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물의 pH는 6.0이다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 ShK 폴리펩티드를 수성 담체에서 용해시키는데 효과적인 양으로 계면활성제를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 다른 구체예에서, 계면활성제는 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20이다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 10 mM 인산나트륨을 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 150 mM NaCl을 더욱 포함한다.
다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 0.01 mg/ml 내지 500 mg/ml의 양으로 존재한다. 부가적인 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 0.01, 0.1, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 mg/ml의 양으로 제공될 수 있다.
다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 자연 공급원으로부터 획득된다. 다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 합성이다. 다른 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 자연과 합성 ShK 폴리펩티드의 혼합물을 포함한다.
본원에서 설명된 구체예는 또한, 본원에서 설명된 조성물로 시작하여 생산된 냉동 건조된 제약학적 조성물을 포함한다. 한 구체예에서, 냉동 건조된 제약학적 조성물은 중량으로 8-12% 아세테이트 함량을 포함한다. 다른 구체예에서, 냉동 건조된 제약학적 조성물은 중량으로 10-11 % 아세테이트 함량을 포함한다.
냉동 건조된 제약학적 조성물의 다른 구체예에서, 제약학적 조성물의 수분 함량은 5% 미만이다. 냉동 건조된 제약학적 조성물의 다른 구체예에서, 수분 함량은 4.0% 미만이다. 냉동 건조된 제약학적 조성물의 다른 구체예에서, 수분 함량은 3.5% 미만이다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 포장 물질에 담겨 제공된다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 장기 보관용으로 조제된다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 무균 유리 바이알 내에 포함되고, 그리고 -70℃에서 보관되도록 지시된다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 피하 투여용으로 조제된다. 다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 무균 주사기 내에 포함된다.
한 구체예는 서열 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (서열 번호:1, 여기서 Xaa는 Met 또는 Nle이다)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물을 포함하고, 여기서 ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, C-말단은 산 또는 아미드이고, 그리고 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
다른 구체예는 화학식 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (서열 번호:1, 여기서 Xaa는 Met이다)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물을 포함하고, 여기서 ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, 그리고 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
다른 구체예는 화학식 p-포스포-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (ShK-186)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물을 포함하고, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
다른 구체예는 화학식 Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (ShK-198)를 갖는 ShK 폴리펩티드; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물을 포함하고, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
본원에서 개시된 구체예는 또한, 제약학적 이용을 위한 제조 단위를 포함한다. 이런 제조 단위의 한 구체예는 본원에서 설명된 제약학적 조성물을 내포하는, 무균 조건 하에 제조된 적어도 하나의 유리 바이알을 포함한다. 다른 구체예에서, 유리 바이알 내에서 제약학적 조성물은 -70℃에서 적어도 6개월 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 제조 단위는 인간에 투여를 위한 제약학적 조성물을 희석하고 제조하기 위한 설명서를 더욱 포함한다.
다른 구체예에서, 제약학적 이용을 위한 제조 단위는 본원에서 설명된 제약학적 조성물을 내포하는 적어도 하나의 무균 주사기를 포함한다. 다른 구체예에서, 제조 단위는 제약학적 조성물을 인간에 투여하기 위한 설명서를 더욱 포함한다.
본원에서 개시된 구체예는 또한, 설명된 제약학적 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 한 가지 이와 같은 구체예는 하기 단계를 포함하는, 제약학적 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함한다: (a) 수성 담체 내에 미리 결정된 농도에서 0.05% 폴리소르베이트 20의 용액을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)의 용액에 서열 번호:1을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염의 미리 결정된 양을 첨가하는 단계, 여기서 C 말단은 산 또는 아미드이고, 그리고 여기서 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고; (c) 폴리펩티드가 용액에서 용해될 때까지 단계 (b)의 용액의 pH를 조정하는 단계; 그리고 (d) 필요하면, 단계 (C)의 용액의 pH를 5-7의 pH로 조정하여 제약학적 조성물을 제조하는 단계.
본원에서 개시된 구체예는 또한, 자가면역 또는 대사 장애를 예방하거나, 자가면역 또는 대사 장애를 치료하거나 또는 자가면역 또는 대사 장애의 증상을 경감하는 방법을 포함한다. 한 구체예는 자가면역 또는 대사 장애를 예방하거나, 자가면역 또는 대사 장애를 치료하거나 또는 자가면역 또는 대사 장애의 증상을 경감하는 것이 필요한 인간에, 자가면역 또는 대사 장애를 예방하거나, 자가면역 또는 대사 장애를 치료하거나 또는 자가면역 또는 대사 장애의 증상을 경감하는데 효과적인 양으로 본원에서 설명된 제약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 질환은 다발성 경화증, 1형 진성 당뇨병, 류머티스성 관절염, 건선, 염증성 장 질환, 접촉-매개된 피부염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 레스티노시스, 전신성 경화증, 섬유증, 경피증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 재흡수, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 그리고 홍반성 낭창으로 구성된 군에서 선택되는 자가면역 질환이다.
다른 구체예에서, 질환은 비만, 2형 당뇨병, 과콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군, 대사 증후군 X, 인슐린 저항, 과지질혈증, 지방이영양증, 이상지질혈증, 과트리글리세리드혈증, 글루코오스 과민증, 고혈압, 과체중, 그리고 에너지 대사의 질환으로 구성된 군에서 선택되는 대사 장애이다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 매일, 매주, 매월, 2개월 마다, 3개월 마다, 또는 6개월 마다 투여된다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 피하 투여된다.
추가의 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 방사성표지된다.
한 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 111In으로 표지된다.
추가의 구체예에서, ShK 폴리펩티드는 111In-표지된 ShK-221이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 쥐와 다람쥐원숭이에서 방사성표지된 ShK를 이용한 생물분포 연구를 도시한다. 111In-표지된 ShK-221이 각 동물의 어깨 영역에 단일 피하 주사로서 Sprague Dawley 쥐 (100 μg/kg; 0.7mCi) 및 다람쥐원숭이 (35 μg/kg; 0.84mCi)에 투여되었다. SPECT와 CT 스캔은 첫 시간 (4 x 15분 간격) 동안, 그리고 투약후 4, 8, 24, 48, 72, 120, 그리고 160시간 시점에 연속적으로 수집되었다. 3D 재건의 편평 2D 이미지가 원숭이 (A)의 경우에 4, 24, 72와 160시간 시점, 그리고 쥐 (C)의 경우에 1, 8과 24시간 시점에서 도시된다. 양쪽 동물은 주사 부위로부터 약물의 느린 흡수, 그리고 신장 및 다소 덜하긴 하지만 간에 유의미한 초기와 지속된 분포를 보여준다. 쥐 이미지는 1시간 시점의 방광, 4와 8시간 시점의 십이지장과 소장, 그리고 8과 24시간 시점의 부신에서 유의미한 방사성을 드러냈다. 양쪽 종에서 신장 연관된 방사성은 주로, 피질에서 확인되었다 (B와 D). 원숭이 (위쪽)와 쥐 (아래쪽)에서 주사 부위에서 111In-ShK-221의 정량은 대략 1-1.5시간의 초기 반감기 및 >48시간의 말단 반감기를 갖는 이상 감쇠를 드러냈다 (E). 원숭이 (위쪽)와 쥐 (아래쪽) 전혈에서 약물 농도는 대략 1.5시간의 초기 반감기 및 >64시간의 말단 반감기를 갖는 유사한 이상 감쇠를 추종하였다 (F). 혈액 농도는 전체 연구 기간 동안 Kv1.3에 대한 Kd를 초과하고, 그리고 전체 연구 기간 동안 주사 부위로부터 느린 연속적 분포와 일치하는 첫 120시간 내내 80% 포화 농도 (233pM)를 초과하여 남아 있었다.
도 2는 ShK-186의 방사성표지된 유사체의 개발을 도시한다. ShK-186의 방사성표지화는 ShK-221을 형성하기 위한 링커를 거쳐 ShK-198의 아미노 말단에 DOTA의 고형-상 커플링에 의해 수행되었다 (A). DOTA 고리 내로 인듐 함입은 나트륨 아세테이트 pH 5에서 95℃에서 배양에 의해 수행되었다. 인듐-표지된 ShK-221은 이온-교환 크로마토그래피에 의한 별개의 이동 패턴을 산출하고 (B), 결과의 킬레이트는 예상된 질량을 가졌다 (C).
도 3은 ShK-186 및 2개의 표지된 유사체, ShK-221-가돌리늄 (ShK-221-Gd)과 ShK-221-인듐 (ShK-221-ln)의 Kv1.3 채널-차단 효능의 비교를 도시한다: (A) ShK-221-Gd의 부재와 존재에서 대표적인 전체-세포 Kv1.3 전류. (B) Kv1.3 전류에 대한 ShK-186, ShK-221-Gd와 ShK-221-In의 효과를 보여주는 용량-반응 곡선. 안정된 Kv1.3-형질감염된 세포주가 본 연구에 이용되었다 (Beeton, et al. Mol Pharmacol 67:1369-1381 (2005), 이것은 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입됨). 전자생리학적 기록은 기존 문헌 (Beeton, et al. 2005 및 Wolff, H, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:8151-6 (2000), 이들은 관련된 교시에 대하여 본원에 참고문헌으로 편입됨)에서 설명된 바와 같은 패치-클램프 기술의 전체-세포 배치에서 수행되었다. 외부 용액은 나트륨 링거이고, 그리고 피펫 용액은 KF (300mOsm)이었다. Kv1.3 전류는 -80 내지 40 mV의 유지 전위로부터 200-ms 탈분극 펄스에 의해 유도되었다. ShK-186, ShK-221-Gd와 ShK-221-In은 각각, 여러 농도에서 조사되었다. 각 농도에 대한 40 mV에서 피크 전류의 감소는 Origin 소프트웨어 (OriginLab Corp., Northampton, MA)를 이용하여 용량-반응 곡선을 산출하는데 이용되었다. IC50 값은 하기와 같았다: ShK-186 = 68.99 ± 4.01 pM (n=5), ShK-221-Gd = 58.23 ± 1.38 pM (n=5), 그리고 ShK-221-In = 63.80 ± 2.25 pM (n=3).
상세한 설명
본 발명은 ShK-기초된 제약학적 조성물, 그리고 이들을 제조하고 이용하는 방법을 제시한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "ShK 폴리펩티드"는 본원에서 고려되는 모든 자연과 합성 ShK 폴리펩티드, 그리고 이들의 유도체, 유사체와 변형을 지칭한다. 이런 변형과 유사체에는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티가 아미노에틸옥시에틸옥시-아세틸 링커를 거쳐 부착되는 서열 번호:1의 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적 조성물"은 선택된 투여 양식에 적합한, 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 본원에서 개시된 적어도 하나의 ShK 폴리펩티드를 포함한다. "적어도 하나의 ShK 폴리펩티드"는 자연과 합성 ShK 폴리펩티드 둘 모두를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 많은 면역-관련된 인간 질환과 대사 장애는 기억 T 세포의 작용에 기인한다. 기억 T 세포의 2가지 부류가 알려져 있다: 중심 기억 T 세포 (TCM) 및 작동체 기억 T 세포 (TEM). 활성화 직후에, TEM 세포는 Kv1.3 K+ 이온 채널을 상향 조절한다. TEM 세포의 항원-주동된 증식은 Kv1.3 K+ 이온 채널 차단제에 민감하고 (Wulff et al., J. Clin. Invest. 111 :1703-1713, 2003), 그리고 카리브해 말미잘 (Stichodactyla helianthus)로부터 최초 단리된 폴리펩티드 ShK는 이런 차단제로서 기능한다. Kv1.3 채널을 차단함으로써, ShK는 TEM 세포의 증식을 피코몰 농도에서 억제한다.
MS 환자에서 미엘린-특이적 자기반응성 T 세포는 우세하게 활성화된 TEM 세포이고 (Wulff et al., J. Clin. Invest. 111 :1703-1713, 2003), 따라서 비록 본원에서 개시된 조성물이 특정한 기전에 의해 구속되지 않지만, 다발성 경화증 환자에서 치료, 예방 또는 증상의 경감에서 TEM 세포의 활성화를 감소시키거나 소멸시키기 위한 제약학적 조성물로서 Kv1.3 차단제를 제조하기 위한 견고한 기초가 있다.
고유 ShK 폴리펩티드는 예로써, 이러한 폴리펩티드에 관한 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입되는 Pennington, M.W. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 46:354-358 (1995)에서 설명된다. 본 발명의 범위 내에 있는 예시적인 ShK 구조는 또한, Beeton, C. et al., Targeting Effector Memory T Cells with a Selective Peptide Inhibitor of Kv1.3 Channels for Therapy of Autoimmune Diseases, Molecular Pharmacology, Vol. 67:1369 (2005), 그리고 U.S. Patent No. 8,080,523 (U.S. Patent Publication 20080221024)에서 공개되고, 이들 모두 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입된다.
본원의 조성물에서 이용되는 폴리펩티드에 대한 기초를 형성하는 예시적인 폴리펩티드는 서열 번호:1에 도시된다. 특정 구체예에서, C-말단은 산 (가령, COOH) 또는 아미드 (가령, CONH2)이고, 그리고 상기 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착된다. "아미드"는 NH2로 산의 C-말단 히드록실 기 (OH)의 치환을 의미한다. 이런 치환은 본원에서, 용어 "아미드"를 이용하여, 또는 "-Cys-NH2"에서처럼 C-말단 아미노산-NH2로서 명명된다.
ShK의 안정성, 효능, 그리고 특이성이 조사되었고, 그리고 상기 폴리펩티드를 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착하는 것은 제약학적 조성물에서 이용을 위한 ShK의 적합성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
당업자는 증강된 성질을 갖는 ShK 폴리펩티드를 설계하기 위한 기술, 예를 들면, 알라닌 스캐닝, 공지된 ShK 폴리펩티드 서열을 이용한 정렬 매개된 돌연변이유발에 기초된 합리적인 설계 및/또는 분자 모데링을 인지한다. 가령, ShK 폴리펩티드는 ShK 폴리펩티드-내포 조성물에서 프로테아제 개열 부위 (가령, K 또는 R 잔기에서 트립신 개열 부위 및/또는 F, Y, 또는 W 잔기에서 키모트립신 개열 부위)를 제거하도록 설계될 수 있다.
서열 번호:1 폴리펩티드의 다양한 변형이 적합하다. 폴리펩티드는 본원에서 개시된 변형의 임의의 조합을 가질 수 있다. ShK 구조의 약동학적 및 약역학적 (PK/PD) 성질을 향상시키기 위해, 분해 성질에 민감한 잔기가 대체되거나 치환될 수 있다. 가령, 위치 21에서 Met 잔기는 산화에 대항하는 안정화 효과를 부여하기 위해 치환될 수 있다. 한 구체예에서, 위치 21에서 Met는 Nle로 치환된다. 아미드로 C-말단 산 기능기의 치환 역시 안정성을 부여할 수 있다. ShK의 일차 구조에 이들 2가지 치환은 안정된 선별성 Kv1.3 차단제를 생산하기 위한 N-말단에서 음이온성 모이어티와 합동될 수 있다. 따라서 본원에서 개시된 한 구체예는 위치 21에서 메티오닌이 Nle로 치환되고, 아미드가 C-말단에 존재하고 및/또는 음이온성 모이어티가 N-말단에서 존재하는 서열 번호: 1을 포함한다.
비가수분해성 인산염 치환 역시 인산염 기에 대한 안정화 효과뿐만 아니라 포스파타아제 효소에 대항하는 안정성을 부여한다.
전술한 바와 같이, 일정한 구체예는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착을 포함한다. 부착의 부위는 N-말단 (서열 번호:1에서 첫 번째 Arg)일 수 있지만, 변형은 이러한 부위에서 부착에 한정되지 않는다. 예시적인 화학 엔티티는 링커, 예를 들면, 아미노에틸옥시에틸옥시-아세틸 링커 (본원에서 Aeea 또는 AEEAc로서 교체가능하게 지칭됨)에 의해, 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 부착될 수 있다.
적절한 화학 엔티티의 무제한적 실례에는 L-Pmp(OH2); D-Pmp(OH2); D-Pmp(OHEt); Pmp(Et2); D-Pmp(Et2); L-Tyr; L-Tyr(PO3H2) (p-포스포-티로신); L-Phe(p-NH2); L-Phe(p-CO2H); L-아스파르테이트; D-아스파르테이트; L-글루타메이트; 그리고 D-글루타메이트가 포함된다. 이용된 약어는 하기와 같이 정의된다: Pmp (p-포스포노메틸-페닐알라닌); 그리고 Ppa (p-포스파티틸-페닐알라닌). PmP와 Ppa에 대한 대안에는 제한 없이, Pfp (p-포스포노(디플루오르-메틸)-페닐알라닌) (Pfp)와 Pkp (p-포스포노-메틸케토-페닐알라닌)가 포함된다.
화학 엔티티/링커 조합의 무제한적 실례에는 AEEAc-L-Pmp(OH2); AEEAc-D-Pmp(OH2); AEEAc-D-Pmp(OHEt); AEEAc-L-Pmp(Et2); AEEAc-D-Pmp(Et2); AEEAc-L-Tyr; AEEAc-L-Tyr(PO3H2); AEEAc-L-Phe(p-NH2); AEEAc-L-Phe(p-CO2H); AEEAc-L-아스파르테이트; AEEAc-D-아스파르테이트; AEEAc-L-글루타메이트; 그리고 AEEAc-D-글루타메이트가 포함된다. 화학 엔티티에서 일반적으로, 아미노산 잔기가 키랄 중심을 갖는 경우에, 아미노산 잔기의 D 및/또는 L 거울상이성질체가 이용될 수 있다.
개시된 제약학적 조성물에서 이용을 위하여, ShK 폴리펩티드는 자연 발생 또는 합성일 수 있고 또는 자연 발생과 합성 ShK의 혼합물로서 제공될 수 있다.
ShK 폴리펩티드는 염으로서 제조될 수 있다. 본원에서 예시적인 염에서, RP-HPLC 단계로부터 획득된 재접힘된 폴리펩티드 (실시예 1)는 칼럼으로 반환되고 용리될 수 있다. 건조에 앞서, 50 mM에서 나트륨 또는 칼륨 아세테이트가 단백질 용액에 첨가될 수 있다. 이러한 단계는 단백질의 염 형태를 산출하고, 이것은 건조된 형태로부터 재구성 직후에 쉽게 용해될 수 있다. 실시예에서 이용된 예시적인 제제 (ShK-186)에서, 나트륨 아세테이트가 첨가되고, 그리고 제제의 아세테이트 함량이 화학적 분석에 의해 중량으로 10.4%이었다. ShK-186은 말미잘 (Stichodactyla) 독소의 37개 아미노산 합성 펩티드 유도체이다. ShK-186은 또한, 기존 문헌에서 SL5로 지칭되었고 CAS 등록 번호 1081110-69-1에 의해 확인된다.
제약학적 조성물로서 이용되는 폴리펩티드-내포 조성물의 경우에, 이것은 안정성, 용해성, 그리고 pH의 관점에서 몇몇 규준을 충족해야 하고, 그리고 바람직하게는 단지, 포유동물, 그리고 특히 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 동물에 투여와 일치하는 물질만을 내포해야 한다. 조성물은 투여 방식, 예를 들면, 피하, 정맥내 등에 따라 변할 수 있다.
비록 치료적 ShK 폴리펩티드의 일부 제제가 당분야에 공지되긴 했지만 (가령, 앞서 참조된 Beeton, C. et al.,; 그리고 U.S. Patent No. 7,833,979), 어떤 것도 본원에서 개시된 ShK-기초된 제약학적 조성물의 안정성과 용해성을 갖지 못한다. 본원에서 개시된 안정된 가용성 Shk-기초된 제약학적 조성물은 계면활성제 농도, pH, 기존 제제에서 이용된 성분의 제거, 그리고 하기 실시예에서 더욱 충분하게 설명된 기타 파라미터를 비롯한 다수의 인자를 변화시킴으로써 달성되었다. 최적 안정성과 용해성을 갖는 한 가지 특정 제제에는 하기가 포함된다:
P6N 제제의 제약학적 조성물
성분 농도 목적
ShK-186 폴리펩티드 500 mg/ml까지 활성 작용제
나트륨 인산염 10 mM 완충 작용제
NaCl 150 mM 토니시티 조절제
폴리소르베이트 20 0.05%(w/v) 계면활성제
6.0의 pH
개시된 제약학적 조성물의 치료적 및 예방적 효과량뿐만 아니라 자가면역 질환 또는 대사 장애를 치료하고, 자가면역 질환 또는 대사 장애를 예방하고 및/또는 자가면역 질환 또는 대사 장애의 증상을 경감하기 위한 투약 계획 (dosage regimen)은 환자의 연령, 상태, 체중, 성별과 식이, 치료되는 질환의 심각도, 투여 기간, 그리고 기타 임상적 인자와 같은 다양한 인자를 고려하여, 담당 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 매일 양 또는 계획은 체중 킬로그램 (kg)당 1 내지 10,000 마이크로그램 (μg)의 ShK 폴리펩티드의 범위, 체중 킬로그램당 1 내지 5,000 μg의 범위, 체중 킬로그램당 1 내지 1,000 μg의 범위 또는 체중 킬로그램당 1 내지 100 μg의 범위 내에 있어야 한다.
본원에서 개시된 제약학적 조성물은 자가면역-관련된 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, 1형 진성 당뇨병, 류머티스성 관절염, 건선, 염증성 장 질환, 접촉-매개된 피부염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 레스티노시스, 전신성 경화증, 섬유증, 경피증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 재흡수, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환 및 홍반성 낭창, 그리고 대사 장애, 예를 들면, 비만, 2형 당뇨병, 과콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군, 대사 증후군 X, 인슐린 저항, 과지질혈증, 지방이영양증, 이상지질혈증, 과트리글리세리드혈증, 글루코오스 과민증, 고혈압, 과체중, 그리고 에너지 대사의 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.
제약학적 조성물의 장기 보관을 위하여, 이들을 냉동 건조된 형태로 보관하는 것이 유용할 수 있다. 본 발명은 하기에 설명된 공정에 의해 제조된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 이런 냉동 건조된 제약학적 조성물을 포함한다.
냉동 건조의 한 가지 공정은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 제약학적 조성물의 온도를 -40℃로 낮추는 단계; (b) 온도를 -40℃에서 미리 결정된 시간 동안 유지하는 단계; (c) 용액의 온도를 20℃까지 올리는 단계; (d) 온도를 20℃에서 미리 결정된 시간 동안 유지하는 단계; 그리고 e) 단계 (d)에서 압력을 냉동 건조에 적합한 압력으로 감소시키고, 그리고 온도를 20℃에서 미리 결정된 시간 동안 유지하여 제약학적 조성물을 냉동 건조하는 단계.
냉동 건조의 이러한 공정에서, 단계 (a)는 2시간 내에 수행될 수 있다; 단계 (b)는 3시간 이내에 수행될 수 있다; 단계 (C)는 13시간에 걸쳐, 그리고 110 μbar의 압력에서 수행될 수 있다; 단계 (d)는 13시간에 걸쳐, 그리고 110 μbar의 압력에서 수행될 수 있다; 그리고 단계 (e)는 5시간에 걸쳐 수행될 수 있고, 그리고 압력은 10 μbar로 감소된다.
제약학적 조성물을 냉동 건조하는 공정은 또한, 하기 단계를 포함한다: (a) 제약학적 조성물의 온도를 -45℃로 낮추는 단계; (b) 온도를 -45℃에서 미리 결정된 시간 동안 유지하는 단계; (c) 용액의 온도를 -20℃로 상승시키는 단계; (d) 용액의 온도를 25℃로 상승시키는 단계; 그리고 (e) 온도를 25℃에서 미리 결정된 시간 동안 유지하여 제약학적 조성물을 냉동 건조하는 단계.
이러한 공정에서, 단계 (a)는 6시간 이내에 수행될 수 있다; 단계 (b)는 3시간 이내에 수행될 수 있다; 단계 (C)는 19시간에 걸쳐, 그리고 150 μbar의 압력에서 수행될 수 있다; 단계 (d)는 13시간에 걸쳐, 그리고 150 μbar의 압력에서 수행될 수 있다; 그리고 단계 (e)는 8시간에 걸쳐, 그리고 150 μbar의 압력에서 수행될 수 있다.
냉동 건조된 제약학적 조성물은 포장 물질 내에 포함될 수 있고, 그리고 포장은 의료 전문가, 환자, 또는 연구원에 의한 최종 이용을 위한 제약학적 조성물의 재구성에 대한 설명서를 더욱 포함할 수 있다.
냉동 건조된 제약학적 조성물은 5% 미만, 4% 미만, 또는 3.5% 미만의 수분 함량을 가질 수 있다.
하기 실시예에서 지시된 바와 같이, 제약학적 조성물은 -70℃, -20℃, 또는 4℃에서, 예로써 무균 유리 바이알에서 수개월 동안 보관될 수 있다. 바이알은 1 ml의 조성물 P6N (표 1을 참조한다) 또는 본원에서 개시된 다른 제약학적 조성물을 내포할 수 있고, 따라서 바이알은 10 mM 인산나트륨과 150 mM NaCl에서 용해되고, 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하고, 그리고 6.0으로 조정된 최종 pH를 갖는 50 mg ShK 폴리펩티드 (한 구체예에서 아세테이트 염으로서)의 용액을 물리적으로 내포할 것이다.
바이알은 제약학적 제조의 단위로서 더욱 제조될 수 있는데, 하나 또는 그 이상의 바이알은 또한, 보관을 위한, 그리고 의료 전문가, 환자, 또는 연구원에 의한 최종-이용을 위해 제약학적 조성물을 희석하고 투여하기 위한 설명서를 내포하거나 이들 설명서가 인쇄될 수 있는 포장에 담긴다. 적절한 희석 방식에는 본원에서 WFI로서 지칭되는 주사용수의 이용이 포함된다. 희석제의 적절한 양은 예로써, 선택적 사용 설명서를 갖는 그 자체의 무균 용기 내에서 제조 단위의 일부일 수 있다.
제약학적 조성물은 본 발명에 따라서, 0.1, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55, 또는 500 mg/ml까지의 ShK 폴리펩티드 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 정확한 농도는 원하는 분량 및 의도된 치료적 또는 연구적 용도에 따라, 제조업체 및/또는 최종 사용자의 통제 내에 있는 인자에 좌우될 것이다. 농도는 또한, 상기 범위 내에서 임의의 모든 중간 숫자, 예를 들면, 1.5 mg/ml, 2.5 mg/ml 등을 포괄한다.
제약학적 조성물의 투여를 위하여, 적절한 루트는 피하 주사이다. 의사는 환자 및 치료 방식, 예를 들면, 피하, 정맥내 등에 따른 투여 방법에 익숙할 것이다. U.S. Patent No. 7,918,824는 환자 이용에 적합한 주사기를 개시하고 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입된다. 정맥내 투여 역시 고려된다. 가령, 미리-채워진 바늘 없는 주사기, 예를 들면, 바늘 없는 정맥내 접근 시스템과 함께 이용을 위한 유리 주사기가 이용될 수 있다. 또한, 제약학적 조성물의 시한 방출을 위한 이식가능 장치가 고려된다. 조성물은 투여의 임의의 특정한 선택에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 가령, 액체 형태, 예를 들면, 0.5 cc의 제약학적 조성물을 주사기, 예를 들면, 26G x 5/8 인치 바늘 (BD Part # 309597)이 구비된 Becton Dickinson (BD) Slip-Tip Sub-Q1 cc 주사기 내로 빨아들이는 것을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 주사기는 포장 및 의료 전문가, 환자, 또는 연구원에 의한 최종-이용을 위한 선택적 설명서를 포함하는 제조 단위 내로 통합될 수 있다.
제약학적 조성물은 제한 없이, 고체 형태 (과립, 분말 또는 좌약 포함) 또는 액체 형태 (가령, 용액, 현탁액, 또는 유화액)으로 만들어질 수 있다. 제약학적 조성물은 전통적인 제약학적 조작, 예를 들면, 멸균에 종속될 수 있고 및/또는 전통적인 어쥬번트, 예를 들면, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 완충액 등을 내포할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 약형에는 캡슐, 정제, 알약, 분말, 그리고 과립이 포함될 수 있다. 이런 고형 약형에서, 활성 ShK 폴리펩티드는 적어도 하나의 비활성 희석제, 예를 들면, 수크로오스, 락토오스, 또는 전분과 혼합될 수 있다. 이런 약형은 또한, 통상의 관례에서처럼, 비활성 희석제 이외에 추가의 물질, 예를 들면, 윤활 작용제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 그리고 알약의 경우에, 이들 약형은 또한, 완충 작용제를 포함할 수 있다. 정제와 알약은 부가적으로, 장용 코팅 (enteric coating)으로 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 약형은 제약학적으로 허용되는 유화액, 용액, 현탁액, 시럽, 그리고 당분야에서 통상적으로 이용되는 비활성 희석제, 예를 들면, 물을 내포하는 엘릭시르를 포함할 수 있다. 이런 조성물은 또한, 어쥬번트, 예를 들면, 습윤제, 감미료, 풍미제, 그리고 방향제를 포함할 수 있다. 제약학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 구체예를 내포할 수 있다. 경구 투여를 위한 제조물은 활성 ShK 폴리펩티드의 통제된 방출을 제공하도록 적절하게 조제될 수 있다.
협측 투여를 위하여, 조성물은 전통적인 방식으로 조제된 정제 또는 마름모꼴정제의 형태를 취할 수 있다.
ShK 폴리펩티드는 주사, 예를 들면, 볼러스 주사 또는 주입에 의한 비경구 투여용으로 조제될 수 있다. 주사를 위한 제제는 단위 약형, 예를 들면, 유리 앰플, 또는 다중 분량 용기, 예를 들면, 유리 바이알에서 제공될 수 있다. 주사를 위한 조성물은 유성 또는 수성 운반제에서 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 취할 수 있고, 그리고 제제화제 (formulatory agent), 예를 들면, 현탁제, 안정화제, 보존제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 이용에 앞서, 적절한 운반제, 예를 들면, 무균 발열원-없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
앞서 설명된 제제 이외에, ShK 폴리펩티드는 또한, 데포 제조물 (depot preparation)로서 조제될 수 있다. 이런 장기 작용 제제는 이식에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.
코 또는 폐 투여, 또는 흡입에 의한 임의의 다른 투여를 위하여, 본 발명에 따른 이용을 위한 ShK 폴리펩티드는 적절한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로플루오르메탄, 디클로로테트라플루오르에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스 또는 가스의 혼합물의 이용으로, 가압된 팩 또는 분무기를 위한 에어로졸 스프레이 제공의 형태에서 편의하게 전달된다.
무제한적 실례에서, 본원에서 개시된 ShK 폴리펩티드는 폴리펩티드 상에서 티로신 또는 포스포티로신 모이어티에 접합된 인듐-111 (In111) 또는 기타 방사성표지된 금속의 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)-킬레이트를 이용하여 표지될 수 있다. 이런 방법은 예로써, Schultz, M.K. et al., "Synthesis of a DOTA-Biotin Conjugate for Radionuclide Chelation via Cu-Free Click Chemistry," Organic Letters 12:2398-2401 (2010)에서 설명되고, 이것은 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입된다. 예로써 MRI에 의한 진단에 적합한 실례에서, 본원에서 개시된 ShK 폴리펩티드는 인듐 (In), 가돌리늄 (Gd) 또는 기타 상자성 이온의 DOTA-킬레이트를 이용하여 표지될 수 있다. 기타 킬레이트화 또는 접합 화학 역시 이용될 수 있다.
실시예 6에서 설명되고 도 1-3에서 도시된 바와 같이, ShK의 방사성표지된 유사체 (ShK-221)가 전혈 내에 전체 약물 농도 (결합되지 않음 + 결합됨)를 측정하는데 이용되었다. 기존 연구는 약물의 단지 10%만 혈장에서 결합되지 않은 상태로 이용가능하다는 것을 암시한다 (Chi et al., Toxicon 59:529-46, 2011). 이것은 다람쥐원숭이에 35 μg/kg 분량의 방사성표지된 ShK-221의 투여 후 1시간 시점에서, 대략 15 nM의 약물이 전혈에서 측정된다는 관찰 결과와 일치하고, 이러한 방법에 의한 ~7%의 결합되지 않은 분율을 암시한다. 상기 약물의 유리 분율은 비-인간 영장류와 비교하여 쥐에서 훨씬 낮을 수 있다. 쥐에서 100 μg/kg의 투약후 1시간 시점에, 대략 14 nM의 ShK-221이 전혈에서 관찰되었다. 이것은 다른 혈액 구성물, 예를 들면, 혈소판에 약물 결합에 기인할지도 모르는데, 이들은 그들의 표면 상에 Kv1.3을 발현하고 쥐 전혈 내에 과도하게 높은 숫자 (5-10 x 인간)로 존재하는 것으로 밝혀졌다 (McCloskey et al., J. Physiol. 588:1399-406, 2010; Trowbridge et al., Clin. Phys. Physiol. Meas. 5:145-70, 1984).
민감한 방사성표지화 방법은 급속한 초기 국면 및 매우 긴 말단 국면에 의해 특징되는 쥐와 다람쥐원숭이 종에서 ShK에 대한 이상 말단 소실 프로필의 검출을 가능하게 한다. 111In-ShK-221을 이용하여 계산된 말단 반감기는 원숭이에서 >64시간이었는데, 지속된 혈액 수준이 7일 동안 Kd를 초과하였다. 혈액 농도는 주사 부위로부터 이상 (빠르다가 이후 느려진) 흡수를 모방한다. 요약하면, 쥐와 다람쥐원숭이에서 방사성표지된 ShK-221의 생물분포는 주사 부위로부터 매우 느린 분포, 주사 부위, 신장과 간 주변에서 약물의 유의미한 농도, 그리고 전혈에서 긴 말단 소실 국면에 의해 특징된다. 약물 수준은 원숭이에서 대략 7일 동안, 그리고 쥐에서 3일 동안 혈액에서 ~200 pM을 초과하여 남아 있었다. 실시예 1에서 데이터는 생체내에서 약물의 분포를 연구하기 위한 방사성표지된 ShK 폴리펩티드의 이용의 한 구체예를 제공한다. DOTA가 본원에서 예시되지만, 다른 금속 킬레이터, 예를 들면, DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산)가 이용될 수 있다. 따라서 치료적 용도 이외에, 본원에서 개시된 ShK 폴리펩티드는 또한, 그들의 연관된 목적 단백질의 기능장애에 의해 특징되는 질환을 진단하거나 모니터링하는데 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 생물학적 샘플에서 목적 단백질, 예를 들면, 영향을 받을 수 있는 수용체 또는 이온 채널을 검출하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 샘플을 ShK 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 그리고 (b) 목적 단백질에 대한 펩티드의 효과를 검출하는 단계. 생물학적 샘플에는 조직 표본, 본래 세포, 또는 이들의 추출물이 포함된다. 본원에서 개시된 조성물은 생물학적 샘플에서 그들의 연관된 목적 단백질의 존재를 검출하기 위한 진단적 키트의 일부로서 이용될 수 있다. 이런 키트는 본원에서 개시되고 검출을 가능하게 하는 부착된 라벨을 갖는 조성물을 이용할 수 있다. 이들 펩티드는 정상적인 또는 비정상적인 목적 단백질을 확인하는데 유용하다.
하기 실시예는 본원에서 개시된 방법의 최적화를 기술한다. 하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예증하기 위해 포함된다. 당업자는 본 발명에 비추어, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 많은 변화가 본원에서 개시된 특정 구체예에 만들어지고 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예
실시예 1 . (pTyr)-AEEA-Arg-35-Cys-NH 2 (ShK-186)의 합성
선형 폴리펩티드 전구체의 합성은 하기와 같이 수행되었다. 선형 펩티드는 링크 아미드 (MBHA) Rx (서브: 0.4 mmol/g)에서 조립되고, 그리고 하기 보호 기가 Fmoc-화학에 이용되었다: Arg (Pbf), Ser (tBu), Cys (Trt), Asp (OtBu), Thr (tBu), Lys (Boc), Arg (Pbf), Gln (Trt), His (Trt), Tyr (tBu), 그리고 Tyr (P(OH)O2Bzl). 모든 아미노산은 CS536 자동화 합성장치를 이용하여 2 mmol의 규모에서 DIC/HOBt 활성화에 의해 커플링되었다. 이들 파라미터는 200 mmol까지 정률 증가되었다.
개열 단계를 위하여, DeFmoc 펩티드는 실온에서 교반하면서, 시약 'K' [TFA/TIS/1,2-에탄디티올 (EDT)/H2O/페놀 (89/2/2/2/5)]의 4시간 처리에 의해 수지로부터 최종적으로 개열되었다. (TIS는 트리이소프로필실란을 지칭한다.) 비율은 개열이 달성되기만 하면 변할 수 있고, 그리고 페놀은 선택적으로 제거될 수 있다. 페놀이 없는 제조물에서, TFA/TIS/EDT/H2O의 비율은 예로써, 47/1/1/1이었다. 가공되지 않은 펩티드는 SPE 튜브 여과에 의해 수지로부터 분리되고, 그리고 수지는 최초 여과액과 합동된 TFA로 연속적으로 헹굼되었다.
여과액으로부터 TFA 용매의 증발 (최초 개열 칵테일의 1/5 부피까지) 후, 가공되지 않은 펩티드는 이후, 차가운 에틸 에테르의 첨가에 의해 침전되고 진공에서 건조되어 추가 산화를 위한 선형 폴리펩티드가 제공되었다.
선형 가공되지 않은 폴리펩티드가 물에서 0.3 mg/mL의 농도 (제조에 기초하여 약간 변화됨)로 용해된 후, NH4OH가 이후, 산화를 pH 8 (후기 배치 기록은 더욱 낮은 pH (7-7.5)를 보여준다)에서 30시간 동안 수행하기 위해 첨가되었다. 산화의 완결은 ESI 질량 스펙트럼에 의해 검사되었다. 부가적으로, HPLC 분석은 선형 펩티드의 산화된 형태로의 전환을 보였다. 산화는 TFA (또는 아세트산)에 의해 pH (2-)3으로 산성화되었다. 공기 산화는 이황화 가교 형성을 달성하는 한 가지 방법이다. 하기 실시예 2는 이황화 결합을 갖는 폴리펩티드를 획득하는 대안적 방법을 보여준다.
정제를 위하여, 산화된 펩티드는 직접적으로 부하되고, 그리고 아세토니트릴을 이동 상으로서 이용하여 예비 C-18 칼럼에서 RP-HPLC에 의해 정제되었다. 충분한 순도를 갖는 분획물은 합쳐지고 선택적으로 냉동 건조되어 백색 분말 (ShK-186), 1.5 g (TFA 염)이 제공되었다.
염 교환 단계가 뒤를 이었다. 재-용해된 펩티드 (TFA 염)는 TEAP (트리에틸아민 인산염) 20mM에 의해 균형된 예비 C-18 칼럼에서 부하되었다. TEAP로 3x 허공 용적 세척 후, 완충액이 NH4OAc (50 mM)로 교체되었다. NH4OAc의 3x 허공 용적 세척 및 pH 검사 (pH 6-7) 후, 완충액이 HOAc (0.5%)로 교체되었다. HOAc (0.5%)의 3x 허공 용적 세척 및 pH 검사 (pH 2-3) 후, 아세테이트 염을 갖는 최종 폴리펩티드, 500 mg을 제공하기 위해 가파른 구배가 시작되었다.
선택적 정제 단계가 수행될 수 있다. 폴리펩티드는 최종 폴리펩티드를 더욱 높은 수율로 제공하기 위해, 아세트산 시스템을 이용하여 직접 정제될 수 있다. 상기 공정에서 모든 개별 단계는 더욱 큰 전체 규모를 산출하기 위해 배치 (batch)에서 수행될 수 있다. 최종 산물은 냉동 건조되거나 또는 용해 상태로 유지될 수 있다.
실시예 2 . ShK 폴리펩티드의 제조
음이온성 아미노산 잔기는 링커, 예를 들면, 아미노에틸옥시에틸옥시-아세틸 링커 (Aeea)에 의해, 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 자연 또는 합성 ShK 폴리펩티드의 N 말단에 부착될 수 있다. 초기에, Fmoc-Aeea-OH는 예로써, Beeton, C. et al., 2005의 방법에 의해, 자연 또는 합성 ShK 독소의 N-말단에 커플링된다.
Fmoc-Tyr(PO4Bzl)-OH, Fmoc-d-Tyr(PO4Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(PO4Me2)-OH, Fmoc-Pmp-OH, Fmoc-d-Pmp-OH, Fmoc-Pmp(Et)-OH, Fmoc-Pmp(Et)2-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 또는 Fmoc-Amp(Boc)-OH가 이후, DIC와 HOBT를 이용하여 커플링된다.
블록 제거된 펩티드 수지는 이후, 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입되는 King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990에서 설명된 바와 같이, 실온에서 2시간 동안 5% 트리이소프로필실란을 내포하는 시약 K로 개열되고 탈보호되었다. Met(O)는 t-15분에서 개열 칵테일에 고형 NH4I의 첨가에 의해 환원된다 (Nicolas, E. et al., Tetrahedron 51 :5701-5710,1995, 이것은 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입된다). Tyr(PO4Me2)-OH를 내포하는 펩티드의 경우에, 티오아니솔을 스캐빈저로서 내포하는 TFA에서 1 M TMSBr을 내포하는 개열 칵테일은 4℃에서 18시간 동안 이용된다 (Tian, Z. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 42:155-158, 1993, 이것은 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입된다). 메틸 보호 기의 불완전한 제거는 이러한 방법을 이용할 때 흔하고, 그리고 2가지 종류 (Tyr(PO4)와 Tyr(PO4Me))는 RP-HPLC에 의해 쉽게 정제된다.
Tyr(PO4Me2)-내포 폴리펩티드는 표준 시약 K 개열에 의해 개열되고 양쪽 Me 기를 본래대로 유지한다. 각 경우에, 개열 혼합물은 여과되고, 그리고 가공되지 않은 펩티드는 얼음같이 차가운 디에틸 에테르 내로 침전된다. 침전물은 수집되고, 200 mg의 수지로부터 대략 75 mg의 펩티드를 산출한다. 가공되지 않은 산물은 20 ml의 50% 수성 AcOH에서 용해되고 0.75 l의 H2O내로 희석된다. 용액의 pH는 NH4OH로 8.2로 조정되고, 그리고 이것은 글루타티온 (2 mM:1 mM) (환원됨:산화됨)의 첨가로 하룻밤 동안 접힘되었다.
모든 폴리펩티드는 Pennington, M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 546:354-358,1995; Pennington, M. et al., Biochemistry 35: 16407-16411, 1996a; 그리고 Pennington, M. et al., Biochem. Biophys. Commun. 219:696-701, 1996b에서 설명된 바와 같이 RP-HPLC를 이용하여 정제되고, 이들 각각은 관련된 교시에 대하여 본원에서 참고문헌으로 편입된다. 순수한 분획물은 모아지고 냉동 건조된다. 각 샘플은 RP-HPLC, AAA (아미노산 분석) 및 MALDI-TOF MS에 의해 확증되고, 그리고 생물검정에 앞서 펩티드 함량을 설명하기 위해 조정된다.
하기 실시예에서, C-말단에서 아미드 및 Cys3-Cys35, Cys12-Cys28, 그리고 Cys17-Cys32) 사이에 이황화 결합을 갖는 ShK-186 ((포스포-Tyr)-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2로서 확인된 ShK 폴리펩티드 (서열 번호:2)가 적절한 제약학적 조성물의 성분을 확인하기 위해 제조되고 선택되었다; 이들 성분은 ShK-198과 ShK-192 (CAS 등록 번호 1159528-26-3)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 제조하는데 이용될 수 있다.
실시예 3 . 계면활성제 스크리닝
제약학적 조성물에서 포함 가능한 계면활성제(들)를 확인하기 위하여, 폴리펩티드는 검사 계면활성제가 개별적으로 첨가된 완충액에서 조제되고, 그리고 계면활성제가 없는 샘플과 비교된다. 검사된 계면활성제에는 0.01 %에서 시작하는 농도에서 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 그리고 플루로닉 F68이 포함된다.
계면활성제의 효과를 결정하기 위하여, 검사 샘플 및 대조는 휘저음 또는 휘저음 없음에 종속된다. 검사 샘플 및 대조는 이후, 가용성 집합 및 단위체 회복의 상실을 비롯한 특징에서 변화를 모니터링하기 위해 크기-배제-HPLC (SEC-HPLC 또는 SE-HPLC)에 의해 분석된다.
이러한 방법을 이용하여, ShK-186 폴리펩티드 제조물은 폴리소르베이트 20 (0.01%), 폴리소르베이트 80 (0.01%), 또는 플루로닉 F68 (0.10%) (Sigma-Aldrich)의 존재에서 pH 5.8에서 최대 4시간 동안 일정한 휘저음에 종속되었다. 놀랍게도, 모든 샘플은 계면활성제가 있든 없던, 증가된 탁도에서 흐릿함을 보였다. 이것은 ShK-186이 휘저음-유도된 침전에 민감하다는 것을 암시하였다.
추가의 실험은 비-전형적인 농도의 계면활성제가 상기 단백질을 보호한다는 것을 지시하였고, 그리고 차후 실험을 위하여, 폴리소르베이트 20이 0.05%의 농도에서 이용되었다. 계면활성제의 농도를 증가시키는 것에 더하여, pH를 5.8에서 5.1로 낮추는 것은 ShK-186의 안정성을 더욱 향상시켰다. 가용성 집합의 부재는 SEC-HPLC에 의해 확증되었다.
실시예 4 . 보관 동안 안정성
폴리펩티드의 안정성을 보호하는 제약학적 조성물의 성분을 선택하기 위해 몇몇 파라미터가 조사된다. 본 발명의 방법에 따라서, 이들 파라미터는 pH (4.0-7.0), 완충액/용매 (10 mM Na 아세테이트 또는 10 mM Na 인산염), 안정제/용해화제 (NaCl 0.8%; 소르비톨 5.0%; L-아르기닌 3.0%), 계면활성제, 보관과 스트레스 조건 (온도, 휘저음, 냉동/해동, 강제된 산화)이다.
이들 파라미터를 연구하기 위하여, ShK-186의 샘플이 Na 아세테이트 또는 Na 인산염에서 용해되고, 그리고 개별 제제가 앞서 설명된 바와 같이 제조되었다. 이들 펩티드는 이후, 역상 HPLC (RP-HPLC), 이온-교환 HPLC (IE 또는 IEX-HPLC), 그리고 크기-배제 HPLC (SE-HPLC)를 이용하여 0시에서 분석되었다. 추가의 분석은 2주, 4주, 그리고 8주 시점에 수행되었다. 제제의 평가는 약물 농도 모니터링, 육안 검사/탁도, 그리고 10과 25 mg/mL에서 시간의 흐름에서 pH 검사를 포함하였다.
0시에서, 샘플은 아르기닌을 갖는 인산염 완충액, pH 7에서 제조된 샘플을 제외하고, 유사한 SE-HPLC 크로마토그래프를 보였다.
2주 시점에, 아르기닌을 내포하는 제제는 침전물이 있는 탁한 용액을 보였다. 이러한 결과는 예상치 못한 것인데, 그 이유는 아르기닌이 다른 단백질 산물의 용해성을 증강시키는데 이용되고 있기 때문이다. 유사한 용해성 문제가 다른 온도에서 관찰되었고, 따라서 아르기닌-내포 제제는 추가 분석으로부터 배제되었다. 4주 시점에, SE-HPLC 분석은 모든 나머지 제제가 25℃ 미만의 온도에서 가용성 집합 또는 개열의 어떤 징후도 보이지 않는다는 것을 증명하였다.
8주 시점에, 하나를 제외한 모든 제제는 -70℃에서 보관 동안 우수한 안정성을 보였다.
8주 시점에 완전한 분석으로부터 결과는 RP-HPLC, IE-HPLC, 그리고 SE-HPLC에 의해 관찰될 때, 회복과 분해의 관점에서 최고 안정성을 제공하기 위한, 본원에서 "P6N"으로 지칭되는 제제의 선별로 이어졌다. 이러한 제제는 pH 6에서, 완충액으로서 10 mM Na 아세테이트; 안정제/토니시티 조절제로서 0.8% NaCl; 계면활성제로서 0.05% 폴리소르베이트 20; 그리고 RP-HPLC에 의해 측정될 때, 단백질 11.2 mg/mL의 농도를 내포한다. 단백질의 농도는 50 mg/mL까지 증가할 수 있다.
P6N 제제는 RP-HPLC와 IEX-HPLC에 의해 측정될 때, 5회 사이클의 냉동-해동 후, 변화의 어떤 징후도 보이지 않았다. 3시간의 활발한 볼텍스 스트레스 (vortex stress) 후, 이러한 제제는 RP-HPLC와 IE-HPLC를 이용하여 측정될 때, 분해의 어떤 징후도 없이 투명한 상태로 남아 있었다.
실시예 5. 임상 제제의 안정성
P6N에서 조제된 ShK-186의 단기 안정성은 임상적 이용을 모사하도록 설계된 3가지 세트의 조건에서 조사된다: 가변 온도에서 72-시간 보관, 그리고 무균 플라스틱 주사기에서 24-시간 보관. 장기 안정성은 냉장 온도 (가령, 5℃) 및 냉동 온도 (가령, -70℃, -20℃)에서 1, 3, 6과 12개월의 보관 동안 조사된다.
단기 연구를 위하여, ShK-186은 5% (w/v) 덱스트로스 또는 0.9% (w/v) 식염수, 또는 WFI 용액을 이용하여 1 mg/ml의 최종 농도로 희석된다. 단기 안정성 연구는 각 희석제에서 냉장 온도 (가령, 5℃) 및 상승된 온도 (가령, 40℃)에서 72시간의 보관에 걸친다. 보존제 없이 WFI에서 희석된 ShK-186은 대조로서 역할한다. 장기 연구를 위하여, ShK-186은 P6N에서 25 또는 50 mg/ml에서 조제되고, 이후 분량이 지시된 바와 같은 최종 농도 (mg/ml에서)를 갖는 샘플을 제조하는데 이용된다. 실험 파라미터는 표 2와 3에서 제시된다.
희석제 안정성 연구, 단기
최종
ShK-186 농도,
mg/ml		 희석제 보관 온도,
섭씨		 시점,
시간에서
1 WFI에서 5% (w/v) 덱스트로스 5, 25, 40 0, 24, 72
1 WFI에서 0.9% (w/v) NaCl
1 WFI (대조)
희석제 안정성 연구, 장기
최종
ShK-186 농도,
mg/ml		 pH 완충액, 10mM 안정제,
w/v		 보관 온도,
섭씨		 시점,
시간에서
25 6.0 Na
인산염		 0.8%
NaCl 		-70, -20, +5 0, 1, 3, 6, 12
10 6.0 Na
인산염		 0.8%
NaCl
표 3에서 제시된 바와 같이, 6개월 시점에 수행된 안정성 연구는 SEC-HPLC와 RP-HPLC에 기초하여 하기의 결과를 산출하였다. 이전의 시점과 비교하여, 6개월 시점에서 pH 또는 농도에서 유의미한 변화가 없었다. 전체 결과는 펩티드 농도가 제제의 안정성에 대한 유의미한 영향을 주지 않는다는 것을 지시하였다. 5℃에서 안정성은 -20℃ 및 -70℃와 비교하여 극히 미미한 감소를 보였다. 이런 결과는 적어도 냉동 온도 미만의 낮은 온도에서 폴리펩티드 제약학적 조성물을 보관하는 업계 표준과 일치한다.
무균 플라스틱 1 cc 주사기와 같은 전달 장치에서 안정성이 특징화된다. 이런 장치는 피하 전달에 적합하다. 예시적인 무제한적 장치는 26G x 5/8 인치 바늘 (BD Part # 309597)이 구비된 Becton Dickinson (BD) Slip-Tip Sub-Q 1 cc 주사기이다. 표 2에 제시된 희석제와 농도에서 0.5 ml 분량의 ShK-186 제제는 뽑혀지고 주사기 내에서 주위 조건 하에 배양된다. 안정성은 임상적 이용을 반영하는 시간, 예를 들면, 4시간에 걸쳐 조사된다.
냉장과 냉동 보관 온도 하에 3가지 농도, 10, 25, 그리고 50 mg/ml에서 ShK-186의 안정성이 측정된다. 냉동 건조된 ShK-186은 ShK-186의 이들 최종 농도를 달성하기 위해 P6N 제제에서 용해된다. 각 조제된 용액은 0.2 μm 필터로 멸균되고, 그리고 무균 조건 하에 적절한 무균 바이알, 예를 들면, 타입 I 붕규산염 유리 3 cc 바이알 내로 바이알당 0.5 ml의 충전 용적에서 이전된다. 이들 바이알은 0개월, 3개월과 6개월의 시점에서 조사를 위해, 5℃, -20℃, 그리고 -70℃에서 보관된다.
이들 샘플은 표 4에서 제시된 파라미터를 이용하여 지정된 시점에서 조사된다.
ShK-186 안정성을 모니터링하는 분석 방법
분석 방법 평가 결과
육안 검사 외관
pH pH 값
오스몰농도 오스몰농도 값
UV-Vis 분광 광도법 농도 (Abs 280 mm)
탁도 (Abs 500-700 nm)
크기 배제 HPLC 순도, 집합체, 개열
역상 HPLC 순도, 화학적 변형
생물검정 폴리펩티드의 효능/강도
요약. 상기 실시예는 치료적 이용을 위한 ShK 폴리펩티드를 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 제조하기 위한 적절한 성분과 조건을 결정하기 위한 방법을 제시한다. 이들 방법의 유효성은 우수한 용해성, 장기 보관 (6개월), 그리고 안정성을 제공하는 제제에서 ShK-186의 성공적인 제조에 의해 증명되었다.
실시예 6 - 12개월 안정성 연구
SkH-186은 0.8% NaCl과 0.05% 폴리소르베이트 20을 내포하는 10 mM 인산나트륨, pH 6.0에서 10 mg/ml과 25 mg/ml에서 조제되고, 그리고 5℃, -20℃, 그리고 -70℃에서 12개월 동안 배양되었다. SE-HPLC 분석은 제제의 농도가 그들의 안정성에 대한 명백한 영향을 주지 않는다는 것을 지시하였다. 배양 온도는 양쪽 제제의 안정성에 약간의 영향을 주었다. 5℃에서 배양된 샘플은 냉동된 샘플 (0.95%)과 비교하여 %HMV에서 약간 증가 (1.19%)를 드러냈다. LMW 종류의 백분율은 모든 온도에서 양쪽 제제에 대해 상대적으로 변화 없이 남아 있었다. SE-HPLC 결과에 기초하여, 연구의 종결 시점에서 양쪽 제제에 대한 단위체의 전체 백분율은 약 98%이었다.
이들 샘플의 RP-HPLC 분석 역시 제제의 농도가 제제의 안정성에 대한 명백한 영향을 주지 않는다는 것을 지시하였다. 5℃에서 배양된 샘플은 냉동된 제제 (0.3-0.7%)와 비교하여 피크-전과 피크-후 분해 (0.8-0.9%)에서 약간 증가를 드러냈다. 상기 데이터는 더욱 높은 배양 온도가 피크-전 분해와 비교하여 피크-후 분해의 더욱 높은 백분율을 유발한다는 것을 지시하였다. RP-HPLC 결과에 기초하여, 연구의 종결 시점에서 양쪽 제제에 대한 전체 순도는 약 99%이었다.
표 5에서는 12-개월 연구의 시기 동안 수집된 pH와 농도 데이터의 요약을 도시한다. 0시에서, 값은 하기와 같았다: 10P6N (10 mg/mL에서 ShK-186)의 경우에, pH는 6.1이고, 농도 (Cone, mg/mL)는 9.9 mg/mL이고, 그리고 오스몰농도 (mOsmo에서)는 317이었다. 25P6N (25 mg/mL에서 ShK-186)의 경우에, pH는 6.0이고, 농도는 25.1 mg/mL이고, 그리고 오스몰농도는 293이었다. 이들 결과에 기초하여, 샘플의 pH와 농도는 배양 온도에 상관없이, 연구 내내 상대적으로 변화 없이 남아 있었다.
Figure pct00001
실시예 7 - 방사성표지된 ShK -221의 생물분포
도입. 생체내 연구의 민감성을 증강시키고, ShK-186의 생물분포를 측정하고, 그리고 전혈에서 전체 (결합된 + 결합되지 않은) 약물 농도를 평가하기 위해, ShK-186의 방사성표지된 유사체가 제조되고 2가지 생체내 동물 모델, 쥐와 다람쥐원숭이에서 조사되었다. 본 실시예에서, 용어 "ADME"는 흡수, 분포, 대사, 배출을 지칭한다.
방법.
동물. Sprague Dawley [Crl:CD®SD] 쥐 (6-9주령)은 Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA)로부터 구입되고 온도 (64-79℃)와 습도 (30-70%) 통제된 시설에서 수용되었다. 사료와 물은 무제한으로 제공되었다.
비-미경험 다람쥐원숭이 (Saimiri boliviensis)는 2 내지 5세이고 MPI Research (Mattawan, Ml, USA) 스톡 콜로니로부터 이전되었다. 다람쥐원숭이는 볼리비아 기원이고 University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX USA)에 의해 제공되었다. 동물은 환경적으로 통제된 장소에서 스테인리스 스틸 케이지에서 개별적으로 수용되었다. 이들 원숭이는 환경 농축 (environmental enrichment)이 제공되었다; 형광 조명이 하루 12시간 제공되었다. 온도는 64 내지 84℃에 유지되었다; 습도는 30-70%이었다. 동물은 하루 2회, 검증된 영장류 규정식 (PMI Nutrition International, Inc., St. Louis, MO, USA)이 제공되었다. Primatreats® 및 기타 농축 식품이 정기적으로 제공되었다. 물은 무제한으로 가용하였다.
ShK-186의 DOTA-접합체 (ShK-221). "DOTA"는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산을 지칭한다. ShK-221 (MW 4442)은 Fmoc-tBu 고형-상 전략을 이용하여 합성되었다. 간단히 말하면, 펩티드는 Chem-매트릭스 아미드 수지를 0.2 mmol 규모에서 이용하여 조립되었다. 모든 커플링 단계는 디이소프로필 카르보디이미드의 존재에서 6-CI-HOBt (N-히드록시벤조트리아졸)로 매개되었다. Fmoc 제거는 피페리딘을 완충하고 6 Cys 잔기에서 잠재적 라세미화를 최소화시키기 위해 0.1 M HOBt를 내포하는 DMF (디메틸포름아미드)에서 20% 피페리딘으로 조장되었다. DOTA(tBu)3-OH는 전술한 동일한 커플링 프로토콜을 이용하여 N-말단에 커플링되었다. 조립 이후에, 펩티드는 수지로부터 개열되고 이와 동시에, 방향족 양이온성 스캐빈저를 내포하는 TFA (트리플루오르아세트산) 개열 칵테일 시약 K를 이용하여 실온에서 2시간 동안 탈보호되었다. 가공되지 않은 펩티드는 소모된 수지로부터 여과되고, 그리고 차후에 침전에 의해 얼음같이 차가운 디에틸 에테르 내로 단리되었다. 가공되지 않은 펩티드는 50% 아세트산에서 용해되고, 그리고 차후에, 0.1 mM GSSG와 0.2 mM GSH를 내포하는 3 L의 H2O 내로 희석되었다. 이러한 펩티드 용액의 pH는 NH4OH로 8.0으로 조정되고 하룻밤 동안 천천히 교반되었다. ShK는 열역학적으로 우선되는 주요 이성질체로 자발적으로 접힘되는데, 이것은 상기 펩티드의 생물학적으로 활성 형태이다. 접힘된 펩티드는 예비 RP-HPLC 칼럼 위에 부하되고 0.05% TFA를 내포하는 H2O와 대비하여 MeCN의 구배를 이용하여 정제되었다. 원하는 펩티드 순도를 내포하는 분획물은 함께 모아지고 냉동 건조되었다. 최종 수율은 0.2 mmol 합성으로부터 35 mg이었다; 출발 수지에 기초하여, 이것은 8%의 수율을 나타낸다.
방사성표지된 ShK-221의 SPECT/CT 스캐닝. ShK-221 (100 μg)은 50mM 나트륨 아세테이트, pH5.0을 내포하는 300μL 반응물에서 2 mCi 111인듐 염화물 (GE Healthcare, Arlington Heights, IL USA)로 95℃에서 30분 동안 방사성표지되었다. 반응은 50 mM의 최종 농도로 EDTA의 첨가에 의해 진정되고, 그리고 방사성표지화 효율은 IN/US Systems Gamma RAM 모델 4 방사성-HPLC 검출기 (LabLogic Systems, Brandon, FL USA)을 이용하여 Agilent 1100 시스템에서 역상 HPLC (Luna 5μ C18(2) 100A 250 x 4.6 mm 칼럼, Phenomenex, Torrance, CA USA)에 의해 평가되었다. 표지화 효율은 이러한 방법에 의해 89-98% 범위에서 변하였다. SPECT/CT 스캐닝 (NanoSPECT/CT Preclinical Imager, Mediso, Budapest, Hungary)은 첫 시간 동안 4회 15분 스캔, 그리고 투약후 4, 8, 24, 48, 72, 120과 160시간 시점에 각각 1회 스캔에서, 마취된 동물에서 수행되었다. 각 나선형 SPECT에 대한 개별 투영 기간은 각 스캔의 지속 기간이 대략 15 내지 45분 (동위원소 감쇠를 설명하기 위해 시점에 의해 변함) 동안 지속되고 각 프레임 내에서 통계의 유의미한 수집이 가능하도록 설정되었다. 111In에 대한 스펙트럼으로부터 검출된 특징적인 피크는 245와 171 keV (각각, 일차와 이차)이었다. 결과의 투영 데이터는 대략 2 mm의 해상도를 달성하는 핀홀 기하학 (pinhole geometry)을 이용하는 반복 모델을 이용하여 각 스캔 후 재구성되었다.
대략 10 μL 혈액 샘플은 각 스캔 후 수집되고, 그리고 샘플에서 방사성의 양은 Wallac Wizard 1470 섬광 계수기 (Perkin Elmer, Waltham, MA USA)를 이용하여 측정되었다. 약물 농도는 투여된 분량의 비활성 (specific activity), 111In의 반감기 (67.3시간) 및 기구의 계산 유효성을 고려함으로써 계산되었다.
통계학적 및 계산적 분석. 통계학적 분석은 짝비교 t-검정 (paired t-test)을 이용하여 수행되었다. 모델 적합도는 R2 통계치를 이용하여 결정되었다. 약동학적 계산은 하기와 같았다: Cmax와 Tmax는 데이터세트에서 관찰된 바와 같았다. AUC는 선형 사다리꼴 방법을 이용하여 계산되었다. 말단 소실 반감기는 최적 조정된 R2 값으로 회귀의 기울기로부터 계산되었다. AUCt -∞는 마지막 관찰된 약물 농도를 말단 소실 기울기로 나눗셈함으로써 계산되었다.
ShK-186의 방사성표지된 유사체를 이용한 ADME 연구의 결과. ShK-186은 위치 23에서 단일 요오드화가능 (iodinatable) 티로신을 내포한다. 하지만, Kv1.3 채널의 구멍 영역 내에서 상호작용하는 것으로 예측되는, 고리 내로 요오드 함입 (Pennington et al., Biochemistry 35:16407-16411, 1996)은 상기 약물의 채널 결합 성질의 파괴를 유발한다. 이런 이유로, ShK-198의 아미노 말단이 DOTA 킬레이트의 카르복실산 중의 하나에 펩티드 결합을 거쳐 부착된 6-탄소 링커로 변형되었다 (도 2A). ShK-221로 명명된 DOTA-접합체는 인듐 또는 가돌리늄과 쉽게 조화되고 (도 2B-C), 그리고 부모 분자의 완전한 활성을 유지하였다 (도 3). 111In-표지된 ShK-221이 제조되고 Sprague Dawley 쥐 (1.0 mCi, 100 μg/kg) 및 다람쥐원숭이 (0.83 mCi, 35 μg/kg)에 피하 주사에 의해 투여되었다. 방사성표지화 효율은 HPLC에 의해 측정될 때, 일련의 실험에 걸쳐 89-98% 범위에서 변하였다. 방사성표지된 ShK-221의 생물분포는 투약후 첫 시간 동안, 그리고 이후 4, 8, 24, 48, 72, 120, 그리고 160시간 시점에 연속적으로 SPECT 이미징에 의해 평가되었다. 검출 시스템에서 배경 수준은 대략 O.1μCi/m3 (최초 시점에서 ~5 ng/m3의 ShK-221 및 최후 시점에서 26 ng/m3). 혈액 샘플은 각 스캔 이후에 수집되고, 그리고 전혈에서 전체 방사성은 섬광 계수에 의해 측정되었다. 방사성라벨과 핵심 해부학적 구조의 공편재화 (colocalization)를 가능하게 하는 컴퓨터 단층촬영이 각 시점에서 수행되었다.
다람쥐원숭이에서 111In-ShK-221의 생물분포는 전체 160시간 시간에 걸쳐 주사 부위로부터 느린 흡수에 의해 주로 특징화되었다 (도 1A와 1E). 주사 부위에 존재하는 약물의 양은 대략 1-1.5시간의 초기 반감기 및 >48시간의 말단 반감기를 갖는 이상 지수적 감쇠 (R2 =0.95)를 추종하였다 (도 1E). 첫 시간 동안, 유의미한 방사성이 신장에서 관찰될 수 있었는데, 1시간 내내 강도가 증가하고 (~1% 주사된 분량(ID)/g, 표 1), 그리고 48시간까지 대략 기준선으로 천천히 감소하였다. 원숭이 신장에서 방사성은 모든 시점 동안 피질과 연수 영역에서 주로 관찰되었고, 그리고 첫 시간을 제외하고 신우에서 비교적 부재하였다 (도 1B). 유의미한 방광 연관된 방사성 (Tmax =0.75-1시간, 0.34 %ID/g)은 단지, 첫 4시간 동안만 관찰되고, 그 이후 상대적으로 적은 방사성라벨이 방광에서 검출되었다. 투약후 0.75-1시간 시점에 정점에 도달한 간 (0.166 %ID/g)을 제외한 어떤 다른 장기도 유의미한 수준의 방사성을 보이지 않았다. 근육, 심장과 뇌는 모든 시점에서 <0.1 %ID/g를 가졌다 (표 6).
Figure pct00002
쥐에서 111In-ShK-221의 생물분포는 원숭이에서와 유사하고 주사 부위로부터 약간 더 빠른 흡수 및 첫 24시간에 걸쳐 소변을 통한 배출에 의해 특징되었다 (도 1C와 1E). 유의미한 방사성 라벨은 첫 시간 동안 쥐 방광 (9.4 %ID/g), 신장 (2.9 %ID/g) 및 간 (0.4 %ID/g)에서 관찰되었다 (도 1C). 후기 시점에서 방광에서 라벨은 거의 확인되지 않는 반면, 간과 신장에서 약물의 양은 첫 24시간 내내 상대적으로 일정하였다. 쥐 신장의 횡단면도는 첫 시간을 제외하고, 방사성이 원숭이에서와 유사하게 피질 영역에 주로 집중된다는 것을 보여주었다 (도 1D).
각 시점에서 원숭이에서 혈액-연관된 방사성의 평가 역시 대략 1시간의 초기 반감기 및 >64시간의 말단 반감기를 갖는 이상 지수적 감쇠 (R2 =0.99)를 증명하였다 (도 1F). 원숭이에서, 대부분의 말단 소실 국면은 기존 방법의 정량 수준 미만으로, 하지만 ShK-186에 대한 Kd를 충분히 초과하는 혈액 농도에 의해 반영되었다. 전혈에서 Kv1.3 채널의 80%는 투약후 대략 5일 내내 약물에 의해 결합될 것으로 예상되고, 그리고 농도는 전체 160시간 기간 동안 Kd를 초과하여 남아 있다.
쥐에서 전혈-연관된 방사성 역시 대략 1.7시간의 초기 반감기 및 >72시간의 말단 반감기를 갖는 이상 지수적 감쇠 (R2 =0.99)를 보였다 (도 1F). 약물 농도는 원숭이에서와 유사하게, 투약후 5일까지 ShK-186에 대한 Kd를 충분히 초과하였다. 전혈에서 Kv1.3 채널의 80%는 투약후 대략 3-5일 동안 약물에 의해 결합될 것으로 예상된다.
상기 데이터는 쥐와 다람쥐원숭이에서 방사성표지된 ShK-221의 생물분포가 주사 부위로부터 매우 느린 분포, 주사 부위, 신장과 간 주변에서 약물의 유의미한 농도, 그리고 전혈에서 긴 말단 소실 국면에 의해 특징된다는 것을 보여준다. 약물 수준은 원숭이에서 대략 7일 동안, 그리고 쥐에서 3일 동안 혈액에서 ~200 pM을 초과하여 남아 있었다.
유의미한 양의 방사성이 111In-ShK-221의 투여 후 가장 이른 시점에서 쥐 (~17% 주사된 분량)와 원숭이 (~1% 주사된 분량) 둘 모두의 방광에서 관찰되었는데, 이것은 사구체 여과가 주사 직후에 상기 펩티드에 대한 주요 소실 경로라는 것을 암시하였다. 첫 시간 이내에 쥐에 의해 배출된 다량의 약물은 아마도, 원숭이와 비교하여 쥐의 증가된 대사의 반영이다. 쥐에서 1시간 및 원숭이에서 대략 4시간 이후에, 방광에서 방사성이 거의 관찰되지 않는 반면, 유의미한 양의 방사성이 신장 피질에서 여전히 관찰되었다. 피질 농도는 옥트레오티드, 봄베신, 엑센딘, 그리고 가스트린을 비롯한, 펩티드 약물의 다양한 방사성표지된 이형에 대해 보고되었다 (Gotthardt et al., J. Nucl. Med. 48:596-601, 2007). 피질 유지의 기전은 옥트레오티드에 대해 가장 충실하게 설명되었다. 양이온성 옥타펩티드의 관상 재흡수는 근위 신장 세뇨관에서 발현된 스캐빈저 수용체인 메갈린에 의해 매개된다 (de Jong et al., J. Nucl. Med. 46:1696-1700, 2005). 수용체의 신장-특이적 파괴를 갖는 생쥐는 야생형 생쥐에서 관찰되는 방사성표지된 옥트레오티드의 피질 유지를 결여한다. 옥트레오티드의 신장 흡수는 전하에 의해 부분적으로 매개되고, 그리고 양으로 하전된 아미노산 L-리신과 L-아르기닌의 공동-주입에 의해 파괴될 수 있다 (Bodei et al., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 30:207-216, 2003). ShK-186은 생리 pH에서 순 +6 전하를 보유하고, 따라서 이의 피질 유지가 유사한 기전에 의해 매개될 수 있다.
요약하면, 방사성표지된 ShK로 ADME 연구는 단일 분량의 약물이 쥐에서 최대 5일 동안, 그리고 원숭이에서 7일 동안, 치료적으로 의미 있는 혈액 농도를 제공할 수 있다는 것을 암시한다. 이들 관찰 결과는 ShK-186을 비롯한 ShK-기초된 펩티드 치료제의 임상적 개발에 타당한데, 그 이유는 최적화된 투약 빈도가 치료적 효능을 담보하고, 환자 순응도를 향상시키고, 그리고 장기 투여 동안 약물 축적에 대한 가능성을 감소시킬 것이기 때문이다.
달리 지시되지 않으면, 본 명세서와 청구항에서 이용되는 성분의 양, 성질, 예를 들면, 분자량, 반응 조건 등을 표시하는 모든 숫자는 모든 경우에, 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해된다. 따라서 반대로 지시되지 않으면, 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 진술된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 획득이 추구되는 원하는 성질에 따라, 변할 수 있는 근사치이다. 청구항의 범위에 균등론의 적용을 결코 한정하지 않으면서, 각 수치 파라미터는 최소한, 보고된 유의미한 숫자의 총수에 비추어, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위를 진술하는 수치 범위와 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정한 실시예에서 진술된 수치 값은 가능한 정확하게 보고된다. 하지만, 임의의 수치 값은 그들의 개별 검사 치수에서 관찰되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 일정한 오차를 본질적으로 내포한다.
본 발명을 기술하는 문맥에서 (특히, 하기 청구항의 문맥에서) 이용된 부정관사, 정관사 및 유사한 지시 대상은 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석된다. 본원에서 값의 범위의 열거는 단순히, 상기 범위 내에 속하는 각 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 기능하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않으면, 각 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된다. 본원에서 개시된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 실례, 또는 예시의 어법 (가령, "예를 들면")의 이용은 본 발명을 더욱 충실하게 조명하기 위한 것으로 의도되고, 그리고 만약 그렇지 않으면 청구되는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서에서 어떤 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 지시하는 것으로 해석되지 않는다.
본원에서 개시된 발명의 대안적 요소 또는 구체예의 집단화는 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 각 집단 구성원은 개별적으로, 또는 본원에서 개시된 집단의 다른 구성원 또는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 집단의 하나 또는 그 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성의 이유로 집단 내에 포함되거나, 또는 집단으로부터 제외될 수 있을 것으로 예기된다. 이런 포함 또는 제외가 발생할 때, 본 명세서는 변형된 군을 내포하고, 따라서 첨부된 청구항에 이용되는 모든 마쿠쉬 그룹 (Markush group)의 서면으로 된 설명을 충족하는 것으로 여겨진다.
본 발명을 수행하기 위한 발명자들에게 공지된 최적 양식을 비롯한 본 발명의 일정한 구체예가 본 명세서에서 개시된다. 당연히, 이들 기술된 구체예에서 변화는 상기 설명을 읽어보면 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들은 당업자가 적절하면 이런 변화를 이용할 것으로 예상하고, 그리고 본 발명자들은 본 발명이 본원에서 구체적으로 개시된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 의도한다. 따라서 본 발명은 적용 법률에 의해 허용되는, 본 명세서에 첨부된 청구항에서 언급된 요부의 모든 변형과 등가물을 포함한다. 게다가, 모든 가능한 변화에서 앞서 기술된 요소의 임의의 조합은 본 명세서에서 달리 지시되거나, 또는 문맥에 의해 달리 명백하게 부정되지 않으면 본 발명에 포함된다.
본원에서 개시된 특정 구체예는 어법 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"을 이용하여 청구항에서 더욱 한정될 수 있다. 청구항에서 이용될 때, 출원 시점에 제출되거나, 또는 보정에 의하여 추가되는 지에 상관없이, 연결 어구 (transition term) "구성되는"은 청구항에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 연결 어구 "본질적으로 구성되는"은 청구항의 범위를 특정된 물질 또는 단계, 그리고 기본적이고 신규한 특성(들)에 현저한 영향을 주지 않는 것들에 한정한다. 이렇게 청구된 발명의 구체예는 본원에서 내재적으로 또는 명백히 기술되고 가능해진다.
결어로서, 본원에서 개시된 발명의 구체예는 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 이해된다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서 무제한의 실례로서, 본 발명의 대안적 배열 (configuration)이 본원의 교시에 따라서 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 도시되고 기술된 바에 엄밀하게 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Kineta One, LLC Iadonato, Shawn Tarcha, Eric <120> SHK-Based Pharmaceutical Compositions and Methods of Manufacturing and Using the Same <130> 2068061-00005 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SHK polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is Met or Nle <400> 1 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Xaa Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SHK polypeptide <400> 2 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SHK polypeptide ShK-186 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is 2-aminoethoxy-2-ethoxy acetic acid <400> 3 Tyr Xaa Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala 1 5 10 15 Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys 20 25 30 Thr Cys Gly Thr Cys 35 <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SHK polypeptide ShK-192 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is 4-phosphono-L-phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is 2-aminoethoxy-2-ethoxy acetic acid <220> <221> DISULFID <222> (5)..(37) <220> <221> DISULFID <222> (14)..(30) <220> <221> DISULFID <222> (19)..(34) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Nle <400> 4 Xaa Xaa Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala 1 5 10 15 Phe Glu Cys Lys His Ser Xaa Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys 20 25 30 Thr Cys Gly Thr Cys 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> SHK polypeptide ShK-198 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> para-phosphonophenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> 2-aminoethoxy-2-ethoxy acetic acid <400> 5 Xaa Phe Xaa Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr 1 5 10 15 Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg 20 25 30 Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35

Claims (60)

  1. 서열 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (서열 번호:1)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 진단적 생체내 이용에 적합한 제약학적 조성물, 여기서 ShK 폴리펩티드는 검출가능 라벨 및 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, 그리고 여기서 C-말단은 산 또는 아미드이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 검출가능 라벨은 인듐-111 (In111)의 킬레이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 검출가능 라벨은 인듐-111 (In111)의 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)-킬레이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 검출가능 라벨은 가돌리늄 (Gd)의 킬레이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 검출가능 라벨은 가돌리늄 (Gd)의 DOTA-킬레이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 ShK 폴리펩티드는 서열 Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (ShK-198)를 갖고, 그리고 검출가능 라벨은 아미노 말단에 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 검출가능 라벨은 인듐-111 (In111)의 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)-킬레이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  8. 서열 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (서열 번호:1)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 제약학적 조성물, 여기서 ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, 그리고 여기서 C-말단은 산 또는 아미드이다.
  9. 청구항 8에 있어서, 수성 담체 내에 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 5 내지 7의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, ShK 폴리펩티드를 수성 담체에서 용해시키는데 효과적인 양으로 계면활성제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 청구항 9에 있어서, ShK 폴리펩티드는 0.01 mg/ml 내지 500 mg/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 계면활성제는 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  15. 청구항 10에 있어서, pH는 6.0인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  16. 청구항 12에 있어서, 0.01, 0.1, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 500 mg/ml의 ShK 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  17. 청구항 8에 있어서, ShK 폴리펩티드는 자연 공급원으로부터 획득되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  18. 청구항 8에 있어서, ShK 폴리펩티드는 합성인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  19. 청구항 8에 있어서, 화학 엔티티는 ShK 폴리펩티드의 N 말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 화학 엔티티는 연결 분자 또는 연결 기를 통해 ShK 폴리펩티드의 N-말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 화학 엔티티는 아미노에틸옥시에틸옥시-아세틸 링커에 의해 ShK 폴리펩티드의 N-말단에 부착되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  22. 청구항 11에 있어서, 화학 엔티티는 AEEAc-L-Pmp(OH2); AEEAc-D-Pmp(OH2); AEEAc-D-Pmp(OH, Et); AEEAc-L-Pmp(Et2); AEEAc-D-Pmp(Et2); AEEAc-L-Tyr; AEEAc-L-Tyr(PO3H2); AEEAc-L-Phe(p-NH2); AEEAc-L-Phe(p-CO2H); AEEAc-L-아스파르테이트; AEEAc-D-아스파르테이트; AEEAc-L-글루타메이트; 그리고 AEEAc-D-글루타메이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  23. 화학식 p-포스포-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 제약학적 조성물.
  24. 청구항 23에 있어서, 수성 담체 내에 있고, 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 더욱 포함하고, 여기서 조성물은 5 내지 7의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.5 mg/ml 내지 50 mg/ml의 ShK-186을 더욱 포함하고, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  26. 화학식 Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 제약학적 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 수성 담체 내에 있고, 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20 및 0.5 mg/ml 내지 50 mg/ml의 범위에서 ShK-198을 더욱 포함하고, 여기서 조성물은 5 내지 7의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.5 mg/ml 내지 50 mg/ml의 ShK-198을 더욱 포함하고, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  29. 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; p-포스포-Tyr-AEEA에 부착된 화학식 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (서열 번호:1, 여기서 Xaa는 Met이다)를 갖는 폴리펩티드의 0.5 mg/ml 내지 50 mg/ml의 제약학적으로 허용되는 아세테이트 염; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
  30. 청구항 8에 있어서, 제약학적으로 허용되는 염은 칼륨 아세테이트 또는 나트륨 아세테이트인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  31. 하기 단계를 포함하는, 제약학적 조성물을 제조하기 위한 방법: (a) 수성 담체 내에 미리 결정된 농도에서 0.05% 폴리소르베이트 20의 용액을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)의 용액에 서열 번호:1을 갖는 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염의 미리 결정된 양을 첨가하는 단계, 여기서 C 말단은 산 또는 아미드이고, 그리고 여기서 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고; (c) 폴리펩티드가 용액에서 용해될 때까지 단계 (b)의 용액의 pH를 조정하는 단계; 그리고 (d) 필요하면, 단계 (C)의 용액의 pH를 5-7의 pH로 조정하여 제약학적 조성물을 제조하는 단계.
  32. 청구항 31의 방법에 의해 제조된 제약학적 조성물.
  33. 서열 번호:1의 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 냉동 건조된 제약학적 조성물, 여기서 C 말단은 산 또는 아미드이고, 그리고 여기서 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착된다.
  34. 청구항 33에 있어서, 제약학적으로 허용되는 염은 칼륨 아세테이트 또는 나트륨 아세테이트인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  35. 청구항 33에 있어서, 제약학적으로 허용되는 염은 나트륨 아세테이트인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  36. 청구항 33에 있어서, 중량으로 8-12% 아세테이트 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서, 중량으로 10-11 % 아세테이트 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  38. 청구항 33에 있어서, 포장 물질에 담겨 제공되는 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  39. 청구항 33에 있어서, 제약학적 조성물의 수분 함량은 5% 미만인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  40. 청구항 33에 있어서, 제약학적 조성물의 수분 함량은 4.0% 미만인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  41. 청구항 33에 있어서, 제약학적 조성물의 수분 함량은 3.5% 미만인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 제약학적 조성물.
  42. 청구항 1에 있어서, 장기 보관용으로 조제되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  43. 청구항 42에 있어서, 조성물은 무균 유리 바이알 내에 포함되고, 그리고 -70℃에서 보관되도록 지시되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  44. 청구항 8에 있어서, 피하 투여용으로 조제되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 조성물은 무균 주사기 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  46. 청구항 1, 16, 19 또는 22중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 내포하는, 무균 조건 하에 제조된 적어도 하나의 유리 바이알을 포함하는 제약학적 이용을 위한 제조 단위, 여기서 유리 바이알 내에 제약학적 조성물은 -70℃에서 적어도 6개월 동안 안정하고, 그리고 인간에 투여를 위한 제약학적 조성물을 희석하고 제조하기 위한 설명서를 더욱 포함한다.
  47. 청구항 1, 16, 19 또는 22중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 내포하는 적어도 하나의 무균 주사기를 포함하는 제약학적 이용을 위한 제조 단위, 여기서 제조 단위는 제약학적 조성물을 인간에 투여하기 위한 설명서를 더욱 포함한다.
  48. 치료 또는 증상 경감이 필요한 인간에서 자가면역 질환을 예방하거나, 자가면역 질환을 치료하거나 또는 자가면역 질환의 증상을 경감하는 방법에 있어서, 자가면역 질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 자가면역 질환의 증상을 경감하는데 효과적인 양으로 청구항 8, 23, 26 또는 29중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 인간에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 질환은 다발성 경화증, 1형 진성 당뇨병, 류머티스성 관절염, 건선, 염증성 장 질환, 접촉-매개된 피부염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 레스티노시스, 전신성 경화증, 섬유증, 경피증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 재흡수, 이식 거부, 이식편-대-숙주 질환, 그리고 홍반성 낭창으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 48에 있어서, 질환은 다발성 경화증이고, 그리고 방법은 청구항 16의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 청구항 48에 있어서, 제약학적 조성물은 매일, 매주, 매월, 2개월 마다, 3개월 마다, 또는 6개월 마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 청구항 48에 있어서, 제약학적 조성물은 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 인간 개체에서 대사 장애를 예방하거나, 치료하거나 또는 경감하는 방법에 있어서, 인간 개체에서 대사 장애를 예방하거나, 대사 장애를 치료하거나, 또는 대사 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 경감하는데 효과적인 양으로 청구항 8, 23, 36 또는 29중 어느 한 항의 제약학적 조성물을 인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 청구항 53에 있어서, 대사 장애는 비만, 2형 당뇨병, 과콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환, 대사 증후군, 대사 증후군 X, 인슐린 저항, 과지질혈증, 지방이영양증, 이상지질혈증, 과트리글리세리드혈증, 글루코오스 과민증, 고혈압, 과체중, 그리고 에너지 대사의 질환 중에서 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 청구항 53에 있어서, 제약학적 조성물은 매일, 매주, 매월, 2개월 마다, 3개월 마다, 또는 6개월 마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 53에 있어서, 제약학적 조성물은 피하 또는 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 서열 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Xaa-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys (서열 번호:1, 여기서 Xaa는 Met 또는 Ile이다)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물, 여기서 ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, C-말단은 산 또는 아미드이고, 그리고 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
  58. 화학식 Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2 (서열 번호:1, 여기서 Xaa는 Met이다)를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물, 여기서 ShK 폴리펩티드는 음이온성 전하를 갖는 유기 또는 무기 화학 엔티티에 부착되고, C-말단은 산 또는 아미드이고, 그리고 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
  59. 화학식 p-포스포-Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2를 갖는 ShK 폴리펩티드의 제약학적으로 허용되는 염; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
  60. 화학식 Tyr-AEEA-Arg-Ser-Cys-Ile-Asp-Thr-Ile-Pro-Lys-Ser-Arg-Cys-Thr-Ala-Phe-Gln-Cys-Lys-His-Ser-Met-Lys-Tyr-Arg-Leu-Ser-Phe-Cys-Arg-Lys-Thr-Cys-Gly-Thr-Cys-NH2를 갖는 ShK 폴리펩티드; 10 mM 인산나트륨; 150 mM NaCl; 그리고 0.05 w/v%에서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약학적 조성물, 여기서 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
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