KR20140027219A - 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 복합체는 생체외 생물학적 분석 방법(in vitro biological assay)에 있어서 분석 도구로 사용될 수 있으며, 접합 물질의 특이적 반응성 및 생물학적 기능과, 항체의 고유 특성인 보체 매개 세포 독성(CDC), 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있다.

Description

접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도{COMPLEX IN WHICH ANTI-COTININE ANTIBODY IS BOUND TO CONJUGATE OF COTININE AND BINDING SUBSTANCE, AND USE THEREOF}
본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
수많은 펩타이드 및 앱타머 바이오 의약품은 후보 약물(drug candidate)로서 유망한 특성을 지니고 있으나, 단백질 분해효소 (proteinase), 펩타이드 분해효소(peptidase) 및 핵산 분해 효소 (nuclease) 등에 의해 몸 안에서 쉽게 분해되거나 또는 신장을 통해 빠르게 배출되기 때문에 수 분 내지 수 시간 정도로 체내 반감기가 짧은 것으로 알려져 있다 (Sato A.K. et al., Curr Opin Biotechnol, 17, 638-642, 2006). 이러한 불안정성 및 짧은 약효지속시간에 따른 문제점을 해결하기 위하여 일반적으로 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)을 접합시켜(Veronese, F.M. ＆ Pasut G., Drug Discov Today, 10, 1451-1458, 2005), 체내 효소에 의한 분해를 저해하고 신장과 혈관에서의 흡수를 억제하여 혈중 체류시간을 연장하는 기술이 시행되고 있다. 그러나, 이러한 페길화는 시간이 오래 걸리고, 접합 물질에 따라 특정한 최적화(specific optimization)가 요구될 뿐만 아니라, PEG가 매우 이질적(heterogenous)으로 접합하기 때문에 다양한 분자 결합체가 생산된다는 문제점이 있다.
신규한 전달 플랫폼(Novel delivery platform)으로 사용하기 위한 목적에 비추어 볼 때, 합텐(hapten)은 동물과 사람에게 반드시 무독해야 하고, 생리적 활성이 없어야 한다는 조건을 만족시켜야 한다. 코티닌(cotinine)은 니코틴의 주요한 대사산물로서 인류는 오랜 기간 니코틴에 노출되어 왔다. 따라서, 코티닌은 신규한 전달 플랫폼에 적용하기에 적합한 합텐이다. 또한 코티닌은 쥐에서의 LD50가 2-4 g/kg 정도로 상대적으로 매우 안전한 물질이며(Riah O. et al., Toxicol . Lett., 109, 21-29, 1999), 하루에 1.8 g씩 4 일간 복용하였을 경우에도 별다른 부작용이 보고되지 않았다(Bowman, E.R. ＆ Mc, K.H., Jr., J. Pharmacol . Exp . Ther., 135, 306-311, 1962). 또한, 포유동물에서 코티닌의 물질대사과정이 잘 밝혀져 있고, 혈청 반감기가 약 16 시간이라는 사실도 잘 알려져 있다(Benowitz N.L. et al., 3 rd Handb. Exp . Pharmacol., 29-60, 2009). 더불어 인간에게 있어 코티닌은 생리적 활성을 나타내지 않으며 3일 동안 최대 160 mg의 코티닌을 흡수할 경우에도 어떠한 생리적 및 행동 변화도 보고된 바 없다 (Hatsukami, D.K. et al., Pharmacol . Biochem. Behav., 57, 643-650, 1997).
한편, 앱타머는 특이적이고 삼차원적인 형태로 폴딩될 수 있어 항체와 유사하게 표적에 고-친화적, 특이적 결합이 가능하므로 다양한 분석과 실험에 사용되어 왔다. 앱타머를 이용한 항체와의 복합체를 제조하는 기존의 방법들은 주로 앱타머를 바이오틴(biotin) 및 디그옥시게닌(digoxigenin)에 접합시킴으로써 아비딘(avidin) 및 항-디그옥시게닌 항체와 복합체를 이루는 방식이었다.
본 발명자들은 코티닌을 합텐으로 이용하여 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제조하였으며, 상기 복합체가 접합 물질의 특이적 반응성 및 생물학적 기능과, 항체의 고유 특성인 보체 매개 세포 독성(complement-mediated cell cytoxicity, CDC), 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체외 생물학적 분석 방법(in vitro biological assay)에 있어서, 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성을 야기하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체외 생물학적 분석 방법에 있어서, 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
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본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다.
도 1 은 실시예 2 에서 정제된 항-코티닌 항체에 대해 쿠마시 염색을 수행한 겔 사진이다.
도 2 및 3 은 실시예 (3-1)에서 합성한 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체, 및 실시예 (3-2)에서 합성한 코티닌-AS1411 및 코티닌-페갑타닙 접합체의 구조식을 나타낸 것이다.
도 4 는 시험예 1 에서 수행한 코티닌에 대한 항-코티닌 IgG 항체의 친화성을 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5 는 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체의 FPR2 세포 수용체에 대한 특이적 결합력을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 6 내지 8 은 각각 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체의 세포 내 칼슘 농도 변화, 초과산화물 발생 정도 및 주화성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9 는 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체, 및 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체의 마우스에서의 체내 반감기를 비교한 그래프 및 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 10 은 항-코티닌 IgG 의 혈청내 체내 반감기를 나타낸 그래프이다.
도 11 은 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체의 패혈증 모델에서의 개선된 치료 효율을 보여주는 그래프이다.
도 12 는 마우스에서 코티닌-페갑타닙 접합체, 및 코티닌-페갑타닙/항-코티닌 IgG 복합체의 체내 반감기를 비교한 그래프이다.
도 13 및 도 14 는 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체의 뉴클레올린 세포 수용체에 대한 특이적 결합력 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15 는 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 16 은 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 이용한 뉴클레올린의 면역 침강 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 17 은 코티닌-페갑타닙/항-코티닌 IgG 복합체의 VEGF 에 대한 결합성을 나타낸 그래프이다.
도 18 은 앱식시맙, 앱식시맙-코티닌 접합체 및 코티닌-앱식시맙/항-코티닌 IgG 복합체의 인테그린 알파 2b 베타 3 에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다.
도 19 는 코티닌-앱식시맙/항-코티닌 IgG 복합체의 혈소판에 대한 결합력 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 20 은 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체의 MCF-7 및 SK-Br-3 세포에 대한 결합력 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 21 은 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체의 보체 의존성 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22 는 접합물질과 코티닌의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 나타내는 것이다.
도 23 은 세포배양액으로부터 사람 보체 C5 에 대한 ScFv 항체를 정제하기 위하여 protein A agarose 를 이용한 affinity chromatography 를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명에 대해서 보다 상세하게 설명한다.
본원에서 "항체"는, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 항체는 동물 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편, 예컨대, Fab 도 포함한다.
본원에서 "키메릭 항체" 는, 항체 가변영역 (variable region) 또는 이의 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)이 항체의 나머지 부분과 상이한 동물에서 기원된 항체를 말한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 항체 가변 영역은 인간 이외의 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역 (constant region)은 인간에서 유래한 항체일 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
본원에서 "중쇄" 는, 항원에 대한 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인인 CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본원에서 "경쇄" 는, 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL 을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본원에서 "상보성 결정 영역" 은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본원에서 "접합체" 는, 이형성 분자로서, 폴리머 분자, 친유성 화합물, 탄수화물 부분 또는 유기 유도화(derivatizing)제와 같은 한 개이상의 비-폴리펩티드 부분, 특히 폴리머 부분에 한 가지 이상의 폴리펩티드, 전형적으로는 하나의 폴리펩티드를 공유적으로 부착시켜 만들 수 있다. 추가적으로, 접합체는 하나 이상의 탄수화물 부분에, 특히 N- 또는 O- 글리코실화를 이용하여 부착될 수 있다. 공유적으로 부착시킨다는 의미는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분을 직접적으로 서로 공유결합시키거나 연결 다리, 스페이스, 연결 부분, 또는 부분과 같은 중개부분 또는 부분등을 통하여 서로 간접적으로 공유결합적으로 연결된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 개시된 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체가 본 정의에 포함된다.
본 발명은 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제공한다(도 22).
또한, 본 발명은 생체외 생물학적 분석 방법(in vitro biological assay)에 있어서, 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 생체외 생물학적 분석 방법은 유동 세포 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 면역침강 분석법 및 효소-링크된 면역화학 분석법으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체는 코티닌을 합텐으로 이용함으로써 접합 물질 및 항체 고유의 특성을 모두 보유할 수 있다. 구체적으로, 상기 복합체는 분자의 특이적 반응성 및 기능과, 항체의 특성인 보체-매개 세포 독성(CDC), 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있다.
따라서, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성을 야기하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 복합체는 한 종의 항체와 코티닌으로 이루어지기 때문에, 짧은 서열의 접합 물질을 코티닌에 단순히 접합시킴으로써 제조될 수 있으므로, 고집약적이며 개발이 쉽고 간단한 형태의 전달 플랫폼으로 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 복합체는 코티닌에 접합된 접합 물질에 의해 항원 반응성(antigenic reactivity)이 결정되는 신규 항체로서, 분자 고유의 생물학적 또는 화학적 기능을 나타내는 치료 항체로서 사용될 수 있다.
코티닌은 담배 연기의 주 성분인 니코틴의 주요한 대사산물로서, 인간이 오랜 세월 담배 연기에 장시간 노출되어 왔음에도 불구하고 아주 적은 양의 즉각적인 독성만이 현재까지 보고되어 왔기 때문에 상당히 안정한 분자로 알려져 있다. 코티닌의 이러한 상대적인 비독성 특성은 코티닌이 생체내(in vivo)에서 사용될 이상적인 분자용 접합체가 되도록 만들어 준다. 본 발명에서는 코티닌을 접합 물질과 접합시킴으로써, 상기 접합 물질의 짧은 반감기를 월등히 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 접합 물질이라 함은, 특정 치료활성 혹은 결합반응성 등을 나타내는 다양한 생물적, 화학적 물질일 수 있다.
상기 접합 물질은 예를 들어, 펩타이드, 앱타머, 호르몬, 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는, WKYMVm-NH2 펩타이드 (WKYMVm-NH2), wkymvm-NH2 펩타이드 (wkymvm-NH2), AS1411 앱타머, 페갑타닙(pegaptanib), 앱식시맙 및 인슐린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 앱식시맙(abciximab, ReoPro)은 혈소판의 표면에서 광범위하게 발현되는 인테그린 알파2b 베타3(integrin alpha2b beta3)에 반응성을 나타내는 마우스/인간 키메릭 Fab이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 앱식시맙을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-앱식시맙 접합체, 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체(이하, 코티닌-앱식시맙/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며, 상기 복합체는 인테그린 알파2b 베타3 및 혈소판에 대하여 앱식시맙과 동일한 수준으로 반응성을 유지함을 알 수 있다(본원 시험예 9, 도 18 및 19 참고).
본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 인슐린은 생체 내에서 탄수화물 및 지방의 물질 대사를 조절하는 데 중요한 호르몬이다. 인슐린은 2종의 폴리펩타이드 체인으로 구성되고, 21개의 아미노산 잔기로 구성되는 A 체인 내에 하나의 세포간 분자 이황화 결합(intra molecular disulfide bond), 및 30개의 아미노산 잔기로 구성되는 B 체인에 A 체인을 연결하는 2개의 세포내 분자의 이황화 결합(inter-molecular disulfide bond)을 갖는다(Nicol DS, Smith, LF., Nature. 1960 Aug 6, 187:483-5, PubMed PMID: 14426955).
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 인슐린을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-인슐린 접합체, 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체(이하, 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며, 상기 복합체가 인슐린 수용체를 발현하는 세포에 대하여 인슐린의 수용체 결합력을 유지함을 알 수 있다 (본원 시험예 10, 도 20 및 21 참고).
본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 WKYMVm-NH2 펩타이드는 항-패혈증 치료학적 펩타이드로서, 포르밀 펩타이드 수용체(Formyl peptide receptors, FPRs)에 대한 길항제이며, 포식세포(phagocyte)에서 화학 주성 이동(chemotactic migration)을 유도하고 단핵세포(monocyte)와 호중구(neutrophil)의 초과산화물(superoxide) 발생을 증가시켜 항생작용을 한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 WKYMVm-NH2 펩타이드를 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체(도 2), 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체(이하, 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 WKYMVm-NH2 펩타이드 (문헌[Baek SH, et al ., J Biol Chem., 1996 Apr 5;271(14):8170-5. PubMed PMID: 8626507]; 및 [Kim SD, et al ., J Immunol. 2009 Nov 1, 183(9): 5511-7. PubMed PMID: 19843937] 참고)는 PEG(mini-PEG)를 링커로 사용하여 코티닌과 결합한다. 이 후, 항-코티닌 항체(Park S, et al ., Clin Chim Acta. 2010 Sep 6, 411(17-18): 1238-42. Epub 2010 May 11. PubMed PMID: 20438723)와 복합체를 형성할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 복합체는 유동 세포 분석법(flow cytometry analysis)에서 포르밀 펩타이드 수용체를 발현하는 세포에 대해 반응성을 나타내며, 이를 통해 WKYMVm-NH2의 결합력이 보존되었음을 알 수 있다(도 5 참고). 또한, 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체가 세포로부터 칼슘을 성공적으로 방출하는 것으로 보아 코티닌과 접합한 후에도 WKYMVm-NH2의 생물학적 기능은 유지되었음을 알 수 있다 (도 6 내지 8 참고). 뿐만 아니라, 패혈증 마우스 모델에서, 상기 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 항체 복합체를 투여한 군은 복용-의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 패혈증으로부터 마우스를 회복시킨 반면, 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체만을 단독으로 투여한 군에서는 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 상기 복합체 내에서 WKYMVm-NH2 펩타이드의 생물학적 치료 효능이 유지되었을 뿐만 아니라, 상기 항-코티닌 항체의 생체내 긴 반감기로 인하여 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체의 반감기가 연장되었음을 나타낸다 (도 9 참고).
본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 페갑타닙은 PEG화된 항-VEGF 앱타머로서, 혈관신생에 중요한 역할을 하는 VEGF 165에 결합한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 페갑타닙의 핵산부분을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-페갑타닙의 접합체(도 3 참고), 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체(이하, 코티닌-페갑타닙/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며, 상기 복합체는 생체내 반감기가 상당히 개선됨을 알 수 있다 (시험예 7 참고).
본 발명에서 접합 물질로 사용될 수 있는 AS1411 앱타머는 G-rich 올리고뉴클레오타이드로 암세포의 표면에 발현하는 뉴클레올린(nucleolin)에 결합하여 암세포 내로 흡수(uptake)되어 DNA 복제와 세포 증식 등의 뉴클레올린 의 정상적인 기능을 파괴하는 특징이 있다.
본 발명에서는 상기 앱타머의 5' 에 코티닌을 접합시킴으로써 항체와 안정적인 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 AS1411을 코티닌과 접합시켜 제조한 코티닌-AS1411의 접합체(도 3 참고), 및 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체(이하, 코티닌-AS1411/항-코티닌 항체 복합체)를 제조할 수 있으며, 상기 복합체는 AS1411 앱타머와 마찬가지로 VEGF에 대한 결합력을 유지함을 알 수 있다 (시험예 8 참고).
본 발명에서는 상기 접합 물질이 코티닌과 PEG 링커(미니 PEG-12) 또는 아미노 C6 링커로 연결되는 것을 특징으로 한다.
상기 코티닌과 접합 물질의 접합체는 항-코티닌 항체에 결합함으로써 본 발명의 복합체를 형성하는데, 이때 접합체는 항체의 중쇄 또는 경쇄에 결합될 수 있으며, 특히 항-코티닌 항체의 항원결합부위에 결합되는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에서 항-코티닌 항체는 고친화도의 항-코티닌 Fab 항체(미국 특허 US 8,008,448 B2 참고)를 IgG 형태로 제조 및 발현한 항체를 사용할 수 있다.
예를 들어, 상기 항-코티닌 항체는 다음과 같은 방식에 따라 제조될 수 있다. 상기 미국 특허 제 US 8,008,448 호에 기재된 방식을 변형하여 제조한 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 각각 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3.1)에 삽입한다. 이어, 포유동물 세포에 형질전환시킴으로써 항체 단백질을 발현시킨 다음, 배양액을 통상의 방법으로 정제함으로써 본 발명에 따른 항-코티닌 IgG 항체를 얻을 수 있다.
이때 상기 포유동물 세포로는 포유동물 CHO DG44 세포(인비트로젠, 미국)을 사용할 수 있고, 정제 방법으로는 배양액을 농축한 다음, 단백질 A 컬럼 (protein A column; Repligen, 미국)으로 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 항-코티닌 항체는 상기 항체; Fab, ScFv 및 도메인 항체로부터 선택되는 항체 분절; 및 상기 항체 및 항체 분절을 구성성분으로 포함하고 있는 복합 단백질(fusion protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체는, 1) 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체를 제조하는 단계; 2) 항-코티닌 항체를 제조하는 단계; 및 3) 상기에서 제조한 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체 및 항-코티닌 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 a) 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 코딩하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하는 단계; b) 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체를 제조하는 것은, 임상단계에서 항-코티닌 항체 생산 시스템을 설정할 때 치료학적 항체를 만들어내는 유용한 방법이 될 수 있다. 새로운 치료학적 항체를 새롭게(de novo) 개발하는 데에는 상당한 시간이 소요되지만, 본 발명의 복합체 제조방법을 이용하면 임상 단계에서 고속대량 방식으로 빠르고 쉽게 합성될 수 있는 소분자의 형태로 치료학적 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 코티닌과 접합 물질을 접합시키고 나면, 제조된 접합체에 항-코티닌 항체가 결합되어 복합체를 형성한다. 상기 항체의 항원 반응성은 코티닌에 접합된 접합 물질에 의해 생산될 수 있다. 이렇게 제조된 본 발명의 복합체는 보체-매개 세포 독성, 항체-의존성 세포 독성, 및 긴 생체내 반감기를 포함하는 상기 항체의 모든 특징들을 유지한다.
접합 분자를 직접적으로 항체와 결합시키는 기존의 분자-항체 접합체와 비교하여, 본 발명의 복합체는 면역학적 측면에서 추가의 이점을 나타낼 것으로 예상된다.
구체적으로, 기존의 치료학적 분자와 항체의 접합체는 합텐-캐리어(hapten-carrier)로 이용될 수 있고, 항체에 직접적으로 결합된 분자에 대하여 면역학적 반응이 즉시 발생될 수 있다. 상기 분자-항체 접합체가 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 의해 둘러 싸여지면, 상기 항체는 짧은 펩타이드로 분해될 것이다. 이러한 상황 하에서 수많은 치료학적 분자는 여전히 상기 짧은 펩타이드에 화학적으로 교차-링크될 것이다. 만일 상기 치료학적 분자에 링크된 펩타이드들 중 하나가 특정 MHC 분자에 높은 친화성을 갖는다면 항원 제시 세포의 세포 표면에 잘 나타날 것이다. 이것은 치료학적 분자에 대한 면역성을 효율적으로 유도시킬 것이다.
하지만, 본원 발명의 복합체의 경우에는 항원 제시 세포에 의해 둘러 싸여지는 경우, 항체가 짧은 펩타이드로 분해되기 때문에 코티닌과 접합 물질의 접합체는 항-코티닌 항체로부터 즉각적으로 분리될 것이다. 이것은 코티닌 접합된 치료학적 분자에 대한 면역원성 반응의 발달을 어렵게 만들어 장점으로 작용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 항- 코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 유전자 제조
(1-1) 항- 코티닌 토끼 scFv 로부터 항체 가변영역의 증폭
토끼의 항체 가변영역(VL 및 VH)을 증폭하기 위하여, 항-코티닌 토끼 scFv 유전자(미국 특허 제8,008,448호 참고)를 주형으로 하고 각각 60 pmole의 VL용 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 11 및 12), 및 VH용 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 13 및 14)를 사용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하였다
구체적으로, PCR 반응을 수행하기 위하여 미국 특허 제8,008,448호에서 합성한 cDNA (약 0.5 ㎍) 1㎕, 각각 60 pmol의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, 10 ㎕ 10×PCR 버퍼, 8 ㎕ 2.5 mM dNTP 혼합물 및 0.5 ㎕ Taq 폴리머라제(polymerase)를 혼합하고, 여기에 증류수 100 ㎕를 첨가하였다. 상기 혼합물을 94℃에서 10분간 변성(denaturation)시키고, 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초의 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 정치하였다.
상기 과정을 거쳐 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 한 후 QIA퀵 겔 추출키트(QIAquick gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(1-2) 인간의 항체 불변영역의 증폭
인간 경쇄 불변영역 (Cκ) 및 인간 중쇄 불변영역(CH1-CH3)의 항체 불변영역 (Constant region)을 증폭하기 위하여, 20 ng의 pComb3XTT 벡터 (Barbas et al., Proc. Natl . Acad. Sci., USA, (1991), 15:88(18), 7978-7982)를 주형으로 하고 각각 60 pmole의 Cκ용 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 15 및 16) 및 CH1-CH3용 정방향 및 역방향 프라이머(서열변호: 17 및 18)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 PCR을 수행한 후, 증폭된 DNA를 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-3) 경쇄(light chain)의 증폭
경쇄를 증폭하기 위한 PCR을 수행하기 위하여, 상기 실시예 (1-1) 및 (1-2)에서 제조 및 정제한 토끼의 항체 경쇄 가변영역 (VL) 및 인간의 항체 경쇄 불변영역 (Cκ)을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 경쇄 유전자를 제조하였다.
구체적으로, PCR 반응을 위하여 각각 100 ng의 VL 및 Cκ PCR 산물, 각각 60 pmol의 항-코티닌 토끼/인간 키메릭 항체 경쇄의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 7 및 8)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 (1-1)와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 이후 증폭된 DNA를 상기 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-4) 중쇄(heavy chain)의 증폭
중쇄를 증폭하기 위한 PCR을 수행하기 위하여, 상기 실시예 (1-1) 및 (1-3)에서 제조 및 정제한 토끼의 항체 중쇄 가변영역 (VH) 및 인간의 항체 중쇄 불변영역 (CH1-CH3)을 중첩 연장 PCR로 결합시켜 중쇄 유전자를 제조하였다.
구체적으로, PCR 반응을 위하여 각각 100 ng의 VH 및 CH1-CH3 PCR 산물, 각각 60pmol의 항-코티닌 토끼/인간 키메릭 항체 중쇄의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 9 및 10), 10 ㎕ 10×PCR 버퍼, 8 ㎕ 2.5 mM dNTP 혼합물 및 0.5 ㎕ Taq 폴리머라제를 혼합하고, 여기에 증류수 100 ㎕을 첨가하였다. 상기 혼합물을 94℃에서 10분간 변성(denaturation)시키고, 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 180초의 반응을 20회 반복한 후, 72℃에서 10 분간 정치하였다.
이후 증폭된 DNA를 상기 실시예 (1-1)과 동일한 방법으로 아가로스 겔 전기영동 및 정제하였다.
(1-5) 항- 코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제작
상기 실시예 (1-3)에서 제조 및 정제한 경쇄 PCR 산물, 및 상기 실시예 (2-4)에서 제조 및 정제한 중쇄 PCR 산물을 각각 제한효소 HindIII/XbaI (NEB, 미국) 및 제한효소 BamHI/NheI (NEB, 미국)으로 절단하여, 순수 분리한 다음 발현 벡터 (pcDNA3.1) multiple clonining site (MCS)의 부위에 삽입하였다.
실시예 2: 항- 코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 발현 및 시험관내 분석을 위한 정제
항-코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 유전자를 포함하는 발현 벡터 DNA로 포유동물 CHO DG44 (invitrogen, 미국) 세포를 형질주입시켰다. 형질주입된 세포를 100 U/ml 페니실린 및 100 g/ml 스트렙토마이신 (GIBCO, 미국)을 포함하는 CD OptiCHO™ 발현 배지 (GIBCO)에 500 ug/ml G418을 첨가하여 37℃ 및 135 rpm의 조건으로 배양하였다. 배양액의 상층액을 Labscale TFF 시스템 (Millipore, 미국)으로 농축하고 단백질 A 컬럼 (Repligen Co., 미국)으로 정제하였다. 정제된 150 KDa의 IgG를 쿠마시 염색으로 확인하였으며(도 1 참고), 이후의 실험(시험예)에 사용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 레인 1은 사이즈 마커이고, 레인 2는 환원시키지 않은 항-코티닌 IgG (150 KDa)이고, 레인 3은 환원시킨 항-코티닌 IgG로서 경쇄 (25KDa) 및 중쇄 (50 KDa)임을 알 수 있었다.
실시예 3: 코티닌 및 접합 물질의 접합체의 제조
(3-1) 코티닌 및 펩타이드의 접합체
펩타이드로 WKYMVm-NH2 펩타이드(WKYMVm-NH2, 서열번호: 1) 및 wkymvm-NH2 펩타이드(wkymvm-NH2, 서열번호: 2)를 사용하였다. WKYMVm-NH2 및 wkymvm-NH2는 고체상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis) 방법으로 ASP48S 펩타이드 자동 합성기에서 합성하였다. 이 후 Vydac Everest C18 컬럼 (250 mm × 22 mm, 10 μm)을 이용하여 역상 HPLC (reverse phase HPLC)로 정제하였고(＞ 95% 순도), LC/MS (Agilent HP1100 series)로 펩타이드의 크기를 확인하였다 (＞95% 순도).
한편, 코티닌 및 펩타이드의 접합체로서 코티닌-WKYMVm-NH2 및 코티닌-wkymvm-NH2는, 펩타이드의 마지막 합성과정에서 PEG 링커와 코티닌을 도입하는 것을 제외하고는, 상기의 방법과 동일한 방법으로 수행함으로써 합성하였다.
코티닌 및 펩타이드의 접합체의 제조 방법은 우선 기본적인 펩타이드는 ASP48S 펩타이드 자동합성기를 이용하여 합성 후 C-말단 아미드화(C-terminal amidation)를 위하여 MBHA 링크 아미드 레진(link amide Resin)에 첫번째 서열인 Fmoc-m-OH(8당량)와 커플링제 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 이 후 DMF 중 20% 피페리딘을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하여 Fmoc을 분해하였다. 상기의 과정을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 NH2-W(Boc)-K(Boc)-Y(tBu)-M-V-m-MBHA 링크 아미드 레진을 만들고 펩타이드가 붙은 레진을 소량 덜어서 절단 칵테일(cleavage cocktail, TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5)을 가하여 펩타이드를 레진에서 분리 후, 과량의 디에틸 에테르를 가하여 펩타이드를 침전하였다. 얻어진 소량의 조질 펩타이드를 DW/CAN(1/1)에 녹여서 LC/MS로 합성하고자 하는 펩타이드(WKYMVm-NH2)의 분자량이 나오는지 확인 후 상기의 과정과 동일하게 Fmoc-미니PEG12-OH를 커플링하였고 다시 레진을 덜어서 LC/MS로 분자량을 확인하였다. 다시 트랜스-4-코티닌카복실산 을 상기의 과정과 같이 커플링하고 절단 칵테일(TFA/TIS/H2O = 95/2.5/2.5)을 가하여 펩타이드를 레진으로부터 분리 후, 과량의 디에틸 에테르를 가하여 펩타이드를 침전 후 HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결 건조하였다.
상기에서 합성한 WKYMVm-NH2 및 wkymvm-NH2 펩타이드와, 코티닌-펩타이드 접합체들은 DMSO에 녹인 후 -20℃에서 보관하였다. 이렇게 제조한 코티닌-WKYMVm-NH2 접합체의 구조를 도 2에 나타내었다.
(3-2) 코티닌 및 앱타머의 접합체
앱타머로 AS1411 DNA 앱타머(5' -dTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' , 서열번호: 3), CRO26 DNA 앱타머(5' -dCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC-3' , 서열번호: 4) 및 페갑타닙 RNA 앱타머(5' -pCfpGmpGmpArpArpUfpCfpAmpGmpUfpGmpAmpAmpUfpGmpCfpUfpUfpAmpUfpAmpCfpAmpUfpCfpCfpGm3' -p-dT-3, 서열번호: 5)를 사용하였다.
한편, 코티닌 및 앱타머의 접합체로서 코티닌-AS1411, 코티닌-CRO26 및 코티닌-페갑타닙은, 고체상 올리고펩타이드 합성(solid phase oligonucleotide synthesis) 방법으로 올리고펩타이드 합성기(oligonucleotide synthesizer)에서 3' 에서 5' 으로 합성한 후, 합성 마지막 과정에서 아미노 C6 링커 (ST Pharm, 한국)를 붙여주었다. 이후 Xbridge Prep C18 컬럼 (5 μm, 10 × 150 mm, Waters Corp., 미국)를 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피(reversed-phase high-pressure liquid chromatography)로 정제 (＞95% 순도)하였고, MS (mass spectrometry)로 앱타머의 크기를 확인하였다.
상기에서 합성한 코티닌-AS1411 및 코티닌-CRO26은 증류수에 녹이고, 코티닌-페갑타닙은 RNA이므로 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)를 처리한 증류수에 녹인 후 95℃에서 5분간 정치한 후, 상온에서 30분간 천천히 식힌 뒤 -20℃에서 보관하였다. 이렇게 제조한 코티닌-AS1411 및 코티닌-페갑타닙의 구조를 도 3에 나타내었다.
(3-3) 코티닌 및 앱식시맙의 접합체
앱식시맙 (Reopro)을 이용하여 코티닌 및 앱식시맙의 접합체(코티닌-앱식시맙)를 제조하였다.
코티닌 및 앱식시맙의 접합체는 활성 에스테르 방법(active ester method)을 이용하여 제조하였다. DMF 1ml에 코티닌 0.1 mmol을 넣고 상온에서 녹인 뒤 DMAP 극소량, DCC 0.118 mmol와 NHS 0.12 mmol을 넣고 상온에서 4시간 가량 로테이션(rotation)하였다. 10000 xg에서 30분간 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 20mg의 앱식시맙을 카보네이트 버퍼(carbonate buffer) 2ml에 넣어 녹이고 DMF 1ml을 첨가한 후 상기 상층액을 천천히 넣어주고 3시간 가량 상온에서 로테이션 하였다. 이후 4℃에서 6시간 이상 투석(dialysis)하고 다시 원심 분리하여 상층액만 얻음으로써 접합체를 제조하였다.
(3-4) 코티닌 및 인슐린의 접합체
인슐린(서열번호: 6)을 이용하여 코티닌 및 인슐린의 접합체(코티닌-인슐린)를 제조하였다.
코티닌 및 인슐린의 접합체는 상기 실시예 3-3의 코티닌 및 앱식시맙의 접합체 제조방법과 동일하게 진행하여 제조하였다.
실시예 4: 코티닌과 접합 물질의 접합체 및 항- 코티닌 항체를 포함하는 복합체의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 코티닌과 접합 물질의 접합체와 실시예 2에서 제조한 항-코티닌 항체를 포함하는 복합체로서 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체를 제조하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.
시험예 1: 코티닌에 대한 항- 코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 의 친화성 분석
코티닌에 대한 항-코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG의 친화성은, BIAcore 3000 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명기술 (Surface plasmon Resonance, SPR)로 분석하였다.
구체적으로, 10 mM 소듐 아세테이트 완충용액 (pH 4.0)을 5 ㎕/분의 속도로 흘려주면서 아민 커플링 키트(Biacore AB)와 함께 키트에 내재된 설명서에 따라 CM5 (carboxymethyldextran-modified) 센서 칩 (Biacore AB)에 코티닌-OVA(ovalbumin)를 고정시켰다. 0.005% 트윈 20 (sigma, 미국)을 포함하는 PBS (pH 7.4)에 녹인 항-코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 항체를 25℃에서 30 ㎕/분의 속도로 칩에 주입하였다. 항-코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 항체는 0.15625-10 nM의 농도로 희석되었다.
표면은 1M NaCl/50mM NaOH로 재생하였으며, 분석 소프트웨어 (BIA evaluation software)를 이용하여 운동속도상수 (kon 및 koff)와 평형해리상수 (Kd)를 얻었다. 그 결과를 표 1에 나타내었고 도 4에 그래프를 표시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 항-코티닌 토끼/인간 키메릭 IgG 항체의 주입량이 증가할수록 CM5 칩에 고정되어 있는 코티닌에 결합하는 항-코티닌 IgG 항체의 양이 증가함을 알 수 있었다.
Figure pct00001
시험예 2: 세포 수용체에 대한 코티닌 - WKYMVm - NH 2 /항- 코티닌 IgG 복합체의 반응성 실험
코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체가 WKYMVm-NH2의 세포수용체인 FPR2에 결합하는지 확인하기 위해 유속세포분석법 (flow cytometry)을 수행하였다.
FPR2 또는 벡터 (pcDNA3.1)를 형질주입한 RBL-2H3 세포 (Yoe-Sik Bae et alJ Immunol 2004; 173; 607-614)를 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 RPMI 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양하였다. 이후, 96-웰 플레이트의 각 웰 당 1×105 개의 세포를 분주한 후 PBS로 두 번, 분석 버퍼(assay buffer)(1% FBS 및 PBS 중에 0.02% 아지드 나트륨 포함)로 1번 세척하였다.
FPR2를 형질주입한 RBL-2H3 세포의 각 웰에 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체를 분석 버퍼에 희석하여 50μl씩 첨가하고 4℃에서 30분 간 반응시켰다. 이 경우 코티닌-WKYMVm-NH2는 0, 1, 10 및 100 nM의 4 가지 농도에 대하여 실험하였으며 항-코티닌 IgG는 100 nM로 고정하였다.
이때 비교를 위해 벡터를 형질주입한 RBL-2H3 세포에 대해서도 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체를 이용하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다.
또 다른 비교군으로 FPR2를 형질주입한 RBL-2H3 세포에 코티닌-WKYMVm-NH2/비특이적 IgG (Palivizumab; 시나지스(Synagis)®; Abbot Laboratories, 영국)를 상기와 동일한 농도 조건으로 처리한 실험군 1, 및 WKYMVm-NH2에 대한 음성 펩타이드(negative peptide)인 wkymvm-NH2을 이용하여 100 nM 코티닌-wkymvm-NH2/100 nM 항-코티닌 항체를 처리한 실험군 2를 사용하였다.
세포를 분석 버퍼로 두 번 세척한 후 FITC가 표지된 단일클론 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 50 μl씩 첨가한 후, 4℃에서 20분 간 반응시켰다. 이어, 세포를 분석 버퍼로 2번 세척한 후 PBS로 재현탁(resuspension)하고, 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(1:1 (v/v))로 고정 후 FACSCanto™ II 유속세포분석기 (BD Bioscience, 독일)로 측정한 뒤 flowJo 데이터 분석 소프트웨어 (Treestar, 미국)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 FPR2가 형질주입된 RBL-2H3 세포에 특이적으로 결합하며, 코티닌-WKYMVM-NH2의 농도가 증가할수록 결합력이 증가하는 것을 알 수 있었다.
반면, 벡터가 형질주입된 RBL-2H3 세포에는 상기 복합체가 결합하지 않는 것을 확인하였다. 또한 코티닌-WKYMVm-NH2/비특이적 IgG 복합체 및 코티닌-wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체 역시 FPR2가 형질주입된 RBL-2H3 세포에 결합하지 않는 것을 확인하였다.
시험예 3: 코티닌 - WKYMVm - NH 2 /항체 복합체의 WKYMVM - NH 2 펩타이드에 대한 기능적 활성 유지 여부 측정( in vitro assays )
(3-1) 세포 내 칼슘 ( calcium ) 농도 변화
세포 내 칼슘 농도 ([Ca2 +]i)는 Fura-2/AM를 이용한 Grynkiewicz의 방법(문헌 [Grynkiewicz G. et al., J Biol Chem., 260, p3440-3450 1985] 참조)을 이용하여 측정하였다.
인간 말초 혈액으로부터 덱스트란 침강(dextran sedimentation), 적혈구 저장성 용해(hypotonic lysis of erythrocytes), 및 림프구 분리 배지 조성(lymphocyte separation medium gradient)을 이용하여 중성구를 신선하게 분리하였다. 이후, 여기에 4 mL 신선한 무-혈청 RPMI 1640에 희석한 3 μM Fura-2/AM을 첨가하고, 37℃에서 50분 동안 지속적으로 교반하며 배양하였다. 무-혈청 RPMI 1640로 세 번 세척한 후, 1 ml 무-Ca2 + Locke 용액(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5 mM HEPES [pH 7.3], 10 mM 글루코스, 및 0.2 mM EGTA)에 2×106 개의 세포를 분주하였다. 분주한 세포에 WKYMVm-NH2 (1, 2.5, 5, 10 및 100 nM), 코티닌-WKYMVm-NH2 (1, 2.5, 5, 10 및 100 nM), 코티닌-WKYMVm-NH2 (1, 2.5, 5, 10 및 100 nM)/항-코티닌 IgG 복합체 (몰농도 2:1)를 각각 첨가하였다.
이 때 비교군으로 비특이적 펩타이드인 wkymvm-NH2 (100 nM), 코티닌-wkymvm-NH2 (100 nM), 코티닌-wkymvm-NH2 (100 nM)/50 nM 항-코티닌 IgG를 각각 처리한 실험군을 사용하였다.
RF-5301PC 분광형광광도계(spectrofluorophotometer, Shimadzu Instruments Inc., 일본)를 사용하여 340 nm와 380 nm의 두 여기(excitation) 파장에 대한 500 nm에서의 형광값 (fluorescence)를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 세포 내 칼슘 농도의 증가는 380 nm 여기 효율(excitation efficiency)에 대한 340 nm 여기 효율의 형광값 비의 증가를 나타낸다.
도 6에 나타난 바와 같이, WKYMVm-NH2, 코티닌-WKYMVm-NH2 및 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 농도 의존성 (concentration-dependencies)이 비슷하였다. 또한, 코티닌-WKYMVm-NH2 및 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 WKYMVm-NH2와 같이 세포 내 칼슘농도 증가를 강력하게 유도하였다. 반면, wkymvm-NH2, 코티닌-wkymvm-NH2 및 코티닌-wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 특이적인 칼슘의 증가를 나타내지 않았다.
(3-2) 초과산화물 발생( superoxide generation )
초과산화물 발생은 초과산화물에 의존적인 시토크롬(cytochrome) c의 환원값을 측정함으로써 측정할 수 있다 (문헌 [Bae et al., Blood, 97, p2854-2862, 2001] 참조).
구체적으로, RPMI 1640 배지에 2×106 개로 분주한 인간 중성구를 50 μM 시토크롬 c와 37℃에서 1 분간 전배양한 다음, WKYMVm-NH2 (0, 10, 100 및 1,000 nM), 코티닌-WKYMVm-NH2 (0, 10, 100 및 1,000 nM), 및 코티닌-WKYMVm-NH2 (0, 10, 100 및 1,000 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)와 각각 반응시켰다.
이 때 비교군으로 wkymvm-NH2 (0, 10, 100 및 1,000 nM), 코티닌-wkymvm-NH2 (0, 10, 100 및 1,000 nM), 및 코티닌-wkymvm-NH2 (0, 10, 100 및 1,000 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)를 각각 처리한 실험군을 사용하였다.
시토크롬 c 환원에 따른 550 nm에서의 흡광도의 변화를 분광광도계(spectrophotometer, EL312e; Bio-Tek instruments, Winooski, VT)를 사용하여 1 분 간격으로 5 분간 측정하였다. 0분에서의 흡광도 값을 이후 측정값의 흡광도에서 빼준 뒤 흡광계수(extinction coefficient)인 0.022 μM-1cm-1로 나눔으로써 나노몰(nanomole) 단위로 나타내었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, WKYMVm-NH2, 코티닌-WKYMVm-NH2 및 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 농도-의존도가 비슷했으며, 코티닌-WKYMVm-NH2 및 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 WKYMVm-NH2와 같이 초과산화물 발생을 강력하게 유도하는 것을 확인하였다. 반면, wkymvm-NH2, 코티닌-wkymvm-NH2 접합체 및 코티닌-wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 특이적인 초과산화물 발생을 나타내지 않았다.
(3-3) 주화성 ( chemotaxis ) 분석
인간 중성구를 1×106/ml로 RPMI 1640 배지에 분주한 후, 멀티웰 챔버(multiwall chamber, Neuroprobe, 미국)의 위쪽 웰에 상기 세포 현탁액 25μl를 첨가하였다 (문헌 [Bae et al., Blood, 97, p2854-2862, 2001] 참조). 멀티웰 챔버의 위쪽 웰은 WKYMVm-NH2 (0, 10 또는 100 nM), 코티닌-WKYMVm-NH2 (0, 10 또는 100 nM) 및 코티닌-WKYMVm-NH2 (0, 10 또는 100 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)가 담겨있는 아래쪽 웰과 3μm 폴리히드로카본 필터(polyhydrocarbon filter)에 의해 분리되어있다.
이 때 비교군으로 wkymvm-NH2 (0, 10 및 100 nM), 코티닌-wkymvm-NH2 (0, 10 및 100 nM) 및 코티닌-wkymvm-NH2 (0, 10 및 100 nM)/항-코티닌 IgG (몰비 2:1)를 각각 처리한 실험군을 사용하였다.
37℃에서 90 분간 정치한 후 이동하지 않은 세포를 스크래핑(scraping)으로 제거하고 난 뒤, 필터를 통과하여 이동한 세포를 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 밤새 고정하였다. 고정된 필터를 90%, 80% 및 70%의 에탄올, 및 이온제거수를 순서대로 처리하고 난 후 공기중에서 건조시킨 뒤 헤마톡실린 (Sigma-Aldrich, 미국)을 이용하여 건조된 필터를 염색하였다. 각 웰로부터의 염색된 세포는 high-power fields (400×)에서 5번 무작위적으로 선택되어 카운팅되었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, WKYMVm-NH2, 코티닌-WKYMVm-NH2 및 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 비슷한 농도-의존도를 보이며 중성구의 이동(migration)을 강력히 촉발하였다. 반면, wkymvm-NH2, 코티닌-wkymvm-NH2 접합체 및 코티닌-wkymvm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 특이적인 세포의 이동을 나타내지 않았다.
시험예 4: 코티닌 - WKYMVm - NH 2 와 코티닌 - WKYMVm - NH 2 /항- 코티닌 IgG 복합체의 약동학 실험
4-6 주령의 수컷 야생형 알비노 ICR 쥐 (Institute of Cancer Research Center, ORIENT BIO Inc. 한국)에게 코티닌-WKYMVm-NH2 (0.5 mg/kg), 및 코티닌-WKYMVm-NH2 (0.5 mg/kg)/항-코티닌 IgG (10 mg/kg) 복합체를 각각 100 μl의 PBS에 희석하여 꼬리 정맥에 주사하였다.
코티닌-WKYMVm-NH2를 주사한 쥐의 경우 주사 후 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20 및 24 시간일 때 안와총을 시행하여 말초혈액을 얻고, 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체를 주사한 쥐의 경우 주사 후 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 시간일 때 안와총을 시행하여 말초혈액을 얻었다. 각 말초혈액을 상온에서 30분 동안 정치한 후 800 g로 15 분간 원심분리하여 상층액만 모아서 혈청을 얻고 각 혈청을 유속세포분석법을 이용하여 분석하였다.
각각의 혈청을 분석 버퍼(1% FBS, 및 0.02% 아지드화 나트륨(NaN3) in PBS)에 희석한 후 200 nM의 항-코티닌 IgG를 동량으로 첨가하여 혈청 속의 코티닌-WKYMVm-NH2가 모두 항-코티닌 IgG와 복합체를 형성하도록 하여 측정될 수 있도록 하였다.
FPR2 형질주입한 RBL-2H3 세포 1×105 개를 상기 혼합물과 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 분석 버퍼로 두 번 세척한 뒤, FITC가 표지된 단일클론 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 첨가하여 4℃에서 20분 간 반응시켰다.
세포를 분석 버퍼로 두 번 세척한 후 FITC가 표지된 단일클론 항 인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 50 μl씩 첨가한 후 4℃에서 20분 간 반응시켰다. 세포를 분석 버퍼로 2번 세척한 후 PBS로 재현탁하고, 2% 파라포름알데히드 (1:1 (v/v))로 고정 후 FACSCanto™ II 유동세포분석기(BD Bioscience, 독일)로 측정한 뒤 flowJo 데이터 분석 소프트웨어(Treestar, 미국)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 평균형광강도(mean fluorescence intensity) 값을 비교하여 볼 때 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체를 주사한 쥐의 혈청의 경우 대략 8 시간 동안 그 피크의 절반보다 더 높게 유지되고 16 시간 동안 백그라운드(background)보다 높게 유지되었다. 반면, 코티닌-WKYMVm-NH2를 주사한 쥐의 혈청은 1시간이 지나면 백그라운드보다 낮아짐을 알 수 있었다.
시험예 5: 항- 코티닌 IgG 의 약동학 실험
4-6 주령의 수컷 야생형 알비노 ICR 쥐(ORIENT BIO Inc. 한국)에게 항-코티닌 IgG (10 mg/kg)을 100 μl의 PBS에 희석하여 꼬리 정맥에 주사 후 0, 1, 3, 6, 12 시간, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 28 일일 때 안와총을 시행하여 말초혈액을 얻었다. 각 말초혈액을 상온에서 30 분 동안 정치한 후 800 g로 15 분간 원심분리하여 상층액만 모아서 혈청을 얻은 뒤 혈청 내 항-코티닌 IgG의 양을 측정하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS에 녹인 5 ㎍/㎖의 코티닌-BSA를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅하고 PBSB (3% BSA in PBS)로 블로킹하였다. 상기에서 얻은 혈청을 PBSB에 희석 (1:10 내지 1:1000)한 후 코팅된 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하였다. 이어, 상온에서 1시간 동안 방치하고 PBS-T(0.02% tween 20 in PBS)로 세척하였다. 각 웰에 ABTS (one-step ABTS 용액, 시그마)를 기질로 사용하여 HRP가 결합된 양 (sheep) 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 상온에서 30 분간 방치한 다음, 405 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 항-코티닌 IgG의 혈청 내 반감기는 6일 이상임을 알 수 있었다.
시험예 6: 마우스 패혈증 모델에서의 코티닌 - WKYMVm - NH 2 /항- 코티닌 IgG 복합체의 치료 효과
ICR 쥐를 2 cm 복벽 절개 후 맹장을 빼내어 회맹판(ileocecal valve) 직하방에서 25%의 맹장을 결찰하였으며, 22 게이지(gauge) 바늘로 한 차례 관통한 후 대변이 복강 내로 나오도록 처치하였다. 복벽 근육 및 피부층을 봉합하였다. 샴-수술한(Sham-operated) 쥐 실험군은 2 cm 복벽 절개 후 맹장을 빼낸 후 아무런 처치도 시행하지 않고 복강 내로 다시 집어넣었다. CLP를 시행한 쥐를 각 그룹당 20마리씩 6 그룹으로 나누고 CLP 후 2 시간 후부터 12시간 간격으로 2일간 코티닌-WKYMVm-NH2 (0.4 mg/kg 및 0.04 mg/kg)/항-코티닌 IgG(18 mg/kg 및 1.8 mg/kg) 복합체 실험군, 코티닌-WKYMVm-NH2 (0.4 mg/kg) 실험군, WKYMVm-NH2 단독 (0.2 mg/kg) 실험군, 항-코티닌 IgG(18 mg/kg) 단독 실험군 및 PBS 비히클 대조군 (모두 100 ul를 투여)각각을 꼬리 정맥으로 주입하고 사육시설에 넣어 물과 사료를 주고 10일간 관찰하였다. 이어 생존율을 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 코티닌-WKYMVm-NH2/항-코티닌 IgG 복합체를 주입한 실험군은 80% 가량의 생존율을 나타냈었다. 이는 코티닌-WKYMVm-NH2 실험군의 생존율(40%), WKYMVm-NH2 실험군의 생존율(45%), 및 PBS 비히클 대조군의 생존율(20%)과 비교하여 상대적으로 개선된 것임을 알 수 있었다.
시험예 7: 코티닌 - 페갑타닙 및 코티닌 - 페갑타닙 /항- 코티닌 IgG 복합체의 약동학 실험
4-6 주령의 수컷 야생형 ICR 쥐에게 코티닌-페갑타닙 (0.135 mg/kg) 및 코티닌-페갑타닙 (0.135 mg/kg)/항-코티닌 IgG (1 mg/kg) 복합체를 각각 100 μl의 PBS에 희석하여 꼬리 정맥에 주사하였다. 0, 0.5, 1, 1.5 및 2 시간 후 안와총을 시행하여 각각의 말초혈액을 얻고 상온에서 30분 동안 정치한 후 800 g로 15 분간 원심분리하여 상층액만 모아서 혈청을 얻은 뒤 ELISA로 분석하였다.
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS에 녹인 50 ng의 인간 VEGF를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅하고 PBSB로 블로킹하였다. 이후 각각의 혈청을 PBSB에 1:100으로 희석한 후 100 nM의 항-코티닌 IgG와 함께 각 웰에 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 방치하고 PBS-T로 세척 후 각 웰에 HRP가 결합된 토끼(rabbit) 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이어, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), Thermo Fisher Scientific)을 기질로 첨가하고 상온에서 15분 방치한 후 650 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 코티닌-페갑타닙/항-코티닌 IgG 복합체의 혈청 내 반감기가 코티닌-페갑타닙에 비하여 상당히 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, 0 시간에서의 농도 역시 큰데, 이는 코티닌-페갑타닙은 체내에 들어오자마자 분해(degradation)되는 반면, 코티닌-페갑타닙/항-코티닌 IgG 복합체로 주사할 경우 코티닌-페갑타닙의 급격한 분해를 저해하는 것을 예측할 수 있었다.
시험예 8: 코티닌 - 앱타머 /항- 코티닌 IgG 의 생물학적 분석
(8-1) 코티닌 - 앱타머 /항- 코티닌 IgG 세포 표면의 뉴클레올린(nucleolin)에 대한 코티닌 - AS1411 /항- 코티닌 IgG 복합체의 결합
Raji (인간 버킷림프종, American Type Culture Collection, 미국) 세포를 각 웰 당 1×105 개의 세포로 분주한 뒤 코티닌-AS1411 (1, 10, 50 및 100 nM)/항-코티닌 IgG (100 nM) 복합체를 50ul/sample의 양으로 처리하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 이후 분석 버퍼(1% FBS, 및 0.02% 아지드화 나트륨 (NaN3) in PBS)로 두 번 세척한 뒤 FITC가 표지된 단일클론 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 분석 버퍼에 1:100으로 희석하여 각 웰에 첨가하여 4℃에서 15분간 반응시켰다.
이 때 비교군으로 비특이적 앱타머인 CRO26 (ST Pharm. Korea)를 이용하여 제조한 코티닌-CRO26/항-코티닌 IgG 복합체, 및 대조 항체로서 비특이적 항체인 팔리비주맙(palivizumab)(Abbot Laboratories, Kent, UK)을 이용하여 제조한 코티닌-AS1411/팔리비주맙 복합체를 이용하여 상기와 동일한 방식으로 수행하였다.
또한 background control로 세포에 FITC가 표지된 단일클론 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)만 반응시키고 이후의 반응은 상기와 동일한 방식으로 수행하였다.
상기에서 수득된 세포들을 분석 버퍼로 2번 세척한 후 PBS로 재현탁하고, 2% 파라포름알데히드(1:1 (v/v))로 고정하였다. 이후 FACSCanto™ II 유동세포분석기(BD Bioscience, 독일)로 측정한 뒤 flowJo 데이터분석 소프트웨어(Treestar, 미국)을 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체는 코티닌-AS1411의 농도가 증가함에 따라 세포 표면의 뉴클레올린에 대한 결합력이 높아졌다. 반면, 비특이적 앱타머(CRO26) 또는 비특이적 항체(팔리비주맙)를 포함하는 복합체의 경우 뉴클레올린에 대한 결합력이 관찰되지 않았다.
또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 인간 간세포 암종 세포 (human hepatocellular carcinoma, HepG2), 인간 교모세포종 세포 (human glioblastoma, U87MG), 및 마우스 배아섬유아세포 (mouse embryonic fibroblast, NIH3T3) (American Type Culture Collection, 미국)에 대하여 코티닌-AS1411(50 nM)/항-코티닌 IgG(100 nM) 복합체를 처리하여 세포간 뉴클레올린 발현율의 차이를 확인하였다. 그 결과, Raji 세포에 비해 HepG2 및 U87MG 세포는 강력한 결합을 나타내는 반면, NIH3T3 세포는 약한 결합을 나타냄을 알 수 있었다.
(8-2) 코티닌 - AS1411 /항- 코티닌 IgG 복합체를 이용한 웨스턴블롯
Raji 세포를 PBS로 세 번 세척 후 1 ml의 용해 버퍼 (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.25 mM 합성 덱스트로스 컴플리트 배지 (synthetic dextrose complete medium), 1 mM PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride), 1 μg/mL 아프로티닌(aprotinin), 1 μg/mL 류펩틴(leupeptin), 및 1 μg/ml 펩스타틴(pepstatin) A)를 넣고 음속 디스멤브레이터 모델 500(sonic Dismembrator model 500, Thermo Fisher Scientific) 기계를 이용하여 방출 세팅(output setting) 7의 조건으로 10 초씩 세 번 음파처리(sonication)하였다. 17,000×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액만 모으고 브래드포드 분석(bradford assay, Bio-Rad, 미국)을 시행하여 농도를 측정하였다.
용해물 50 μg을 4×SDS 로딩 버퍼(50 mM MES, 50 mM Tris-base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 및 50 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, pH 7.3)를 넣고 95℃에서 10 분간 끓여 단백질을 변성시킨 뒤 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)하였다. XCell SureLock™ Novex Mini-Cell (Invitrogen)를 사용하여 니트로셀룰로오스 막 (Whatman, 독일)으로 단백질을 이동시켰다. 이후 5% 탈지유(BD Biosciences Diagnostic Systems, 미국)가 포함된 TBST (10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 0.1% Tween-20)로 상온에서 30 분간 흔들어주며 배양하고, 코티닌-AS1411(100nM)/항-코티닌 IgG(50 nM) 복합체와 상온에서 2시간 동안 흔들어주며 배양하였다.
이 때 비교를 위하여 블로킹 버퍼에 1:100으로 희석한 쥐 항-뉴클레올린 IgG (Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 이용하여 상기 실험과 동일한 실험을 반복하였다.
또한, 비교군으로 코티닌-AS1411(100 nM)/비특이적 항체(팔리비주맙)(50 nM) 복합체와 코티닌-CRO26(100 nM)/항-코티닌 IgG(50 nM) 복합체 실험군을 사용하였다.
막을 TBST로 세 번 세척 후, HRP가 결합된 토끼 항-인간 IgG (Thermo Fisher Scientific) 및 HRP가 결합된 항-마우스 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 TBST에 1:5,000으로 희석하여 첨가하고 상온에서 1시간 동안 흔들어주며 배양하였다. 막을 TBST로 세 번 세척한 후, SuperSignal Pico West 화학발광기질(chemiluminescent substrate)(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 단백질 밴드를 가시화하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체를 처리한 레인 1에서는 100 kDa의 전체 길이의 뉴클레올린 밴드뿐만이 아니라, 40 kDa 이하에서도 몇 개의 밴드들이 관찰되었다. 이것은 기존 보고에 따르면 뉴클레올린의 자가 분해 활성(autolytic activity)에 의해 뉴클레올린이 잘려서 생기는 작은 사이즈의 단편들이며, 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체가 전체 길이뿐만 아니라 작은 단편까지 검출할 수 있음을 보여주었다.
반면, 레인 4의 쥐 항-뉴클레올린 IgG는 전체 길이의 뉴클레올린만 검출 가능하였다. 비교군인 레인 2의 코티닌-AS1411(100 nM)/팔리비주맙(50 nM) 복합체와 레인 3의 코티닌-CRO26(100 nM)/항-코티닌 IgG 복합체는 어떠한 밴드도 보여지지 않았다.
(8-3) 코티닌 - AS1411 /항- 코티닌 IgG 복합체를 이용한 뉴클레올린의 면역 침강법 ( immunoprecipitation ) 가능 여부 확인
Raji 세포 용해물 1 mg을 코티닌-AS1411(40 nM)/항-코티닌 IgG(20 nM) 복합체, 코티닌-CRO26(40 nM)/항-코티닌 IgG(20 nM) 복합체, 및 코티닌-AS1411(40 nM)/비특이적 항체(20 nM) 복합체와 4℃에서 밤새 로테이션(rotation)하며 방치하였다.
단백질 A-세파로스(sepharose) 비드를 각 샘플에 40 μl씩 넣어주고 로테이션하며 4℃에서 2시간 동안 방치한 후 800 × g로 1 분간 원심분리하였다. 이후, 면역침강된 펠렛을 세척 버퍼(20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 1% Triton X-100)로 세 번 세척하였다. 4×SDS 로딩 버퍼를 넣고 95℃에서 10 분간 끓여 단백질을 변성시킨 뒤 면역블롯(immunoblot)을 시행하였다. 1차 항체로 마우스 항-뉴클레올린 IgG(Santa Cruz Biotechnology, 미국)을 0.2% TBST에 1:100으로 희석하여 첨가하여 상온에서 2시간을 방치하였고, 2차 항체로 HRP가 붙어있는 토끼 항-마우스 IgG를 1:5,000으로 희석하여 첨가하여 상온에서 1시간 방치하였다. 막을 세척 후 SuperSignal Pico West 화학발광기질을 첨가하여 블롯을 가시화하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 첫 번째 레인의 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체로 면역침강한 경우 100KDa에서 뉴클레올린의 밴드가 확인된 반면, 두 번째 레인의 코티닌-CRO26/항-코티닌 IgG 복합체, 및 세 번째 레인의 코티닌-AS1411/비특이적 항체로 면역침강한 경우 밴드가 확인되지 않았다. 이것으로 볼 때, 코티닌-AS1411/항-코티닌 IgG 복합체가 Raji 세포의 용해물에서 성공적으로 뉴클레올린을 면역 침강했음을 알 수 있었다.
(8-4) VEGF 에 대한 코티닌 - 페갑타닙 /항- 코티닌 IgG 복합체의 특이적 결합력 측정
96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS에 녹인 50 ng의 인간 VEGF를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅하고 PBSB로 블로킹하였다. 100 nM 코티닌-페갑타닙/50 nM 항-코티닌 항체 복합체를 PBSB에 희석한 후 10배씩 희석하여 코팅된 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하였다. 이어, 상온에서 1시간 동안 방치하고 PBS-T로 세척하였다. 이 때 비교를 위해, VEGF에 대한 항체인 100 nM 베바시주맙(bevacizumab)을 상기 복합체 대신 이용하여 상기와 동일한 실험을 반복하였다.
이 후, 각 웰에 TMB(Thermo Fisher Scientific)를 기질로 사용하여 HRP가 결합된 토끼(rabbit) 항-인간 Fc 특이적 IgG (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 방치한 다음, 650 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 코티닌-페갑타닙/항-코티닌 IgG 복합체는 VEGF에 대하여 0.1 내지 1,000 pM 구간에서 코티닌-페갑타닙의 농도-의존적 방식으로 결합력이 증가하였다. 이는 항-VEGF 항체인 베바시주맙의 농도-의존적 방식의 VEGF에 대한 결합도와 유사하였다.
시험예 9: 코티닌 - 앱식시맙 /항- 코티닌 IgG 복합체의 반응성
(9-1) 코티닌 - 앱식시맙 /항- 코티닌 IgG 복합체, 코티닌 - 앱식시맙 , 및 앱식시맙의 반응성을 확인하기 위한 효소-링크된 면역원성 분석( Enzyme - linked immunosorbent assay )
0.001 nM~1000 nM 의 앱식시맙 및 코티닌-앱식시맙을 이용하여 인테그린 알파 2b 베타 3 에 대한 반응성을 측정하였다. 이때 1uM 의 항-코티닌 IgG 항체를 사용하였다.
구체적으로, 20 μl의 금속 버퍼 (25mM Tris-Cl, 137mM NaCl, 1mM MgCl2, 1ml CaCl2, 1mM MnCl2 및 1mM KCl; pH 7.5)에 용해된 100 ng 의 인테그린 알파 2b 베타 3 을 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 2 시간 동안 배양함으로써 96-웰 절반(half-area) 마이크로타이터 플레이트의 웰들을 인테그린 알파 2b 베타 3 로 코팅시켰다. 상기 웰을 150 μl PBSB(PBS 중에 3% BSA)로 37℃에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 항-코티닌 항체를 포함하거나 포함하지 않은 앱식시맙/코티닌, 및 앱식시맙을 3% PBSB 중에서 다양한 농도로 조절하여 최종 50μl 을 각 웰에 적용하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 배양하고 0.05% Tween 20 을 포함하는 PBS (PBST)로 3 회 세척한 후, 항-인간 Fc-HRP 로 처리하여 코티닌-앱식시맙/항-코티닌 IgG 항체 복합체를 검출하고, 항-인간 Fab-HRP 로 처리하여 코티닌-앱식시맙 및 앱식시맙을 각각 검출하였다. 37℃에서 45 분 동안 배양시키고 0.05% PBS-T 로 4 회 세척한 후, 각 웰을 100μl 의 ABTS 기질 용액으로 37℃에서 30 분 동안 배양하고, 흡광도를 405 nm 에서 측정하였다. 그 결과를 도 18 에 나타내었다.
도 18 에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 코티닌-앱식시맙/항-코티닌 항체 복합체는 인테그린 알파 2b 베타 3 에 대해 앱식시맙과 동일한 반응성을 유지함을 알 수 있었다.
(9-2) 코티닌 - 앱식시맙 /항- 코티닌 항체 복합체의 인간 혈소판에 대한 특이적 결합 시험
0, 5 및 50nM 의 코티닌-앱식시맙을 0, 0.1uM 및 1uM 의 항-코티닌 항체로 활성화된 인간 혈소판에 처리한 후, 항-인간 Fc-FITC (Thermo Fisher Scientific, 미국)를 1:75 로 희석 후 혈소판에 처리하고 20 분간 배양하였다. 이어 수득된 세포를 상기 시험예 8 과 동일한 방식으로 유동 세포 분석법으로 분석하였다.
구체적으로, 1.5 ml 혈액을 0.84 ml 의 산-구연산-덱스트로스(ACD) 및 10 mM 의 EDTA 를 포함하는 5 ml 베스큐테이너(vacutainer) 튜브에 모았다. 상기 혈액을 원심분리 튜브로 이동시킨 후 상온에서 250 ×g 로 10 분 동안 회전시켰다. 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma, PRP)을 새로운 튜브로 이동시킨 후 상온에서 1500 rpm 으로 10 분 동안 회전시켰다. 상층액을 제거하고, 혈소판을 1ml 의 티로드 버퍼(Tyrode's buffer; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl, 0.5 mM NaH2PO4, 5 mM 글루코스, 10 mM HEPES 및 0.2% BSA; pH 7.4)로 세척하였다. 1500 rpm 으로 7 분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 펠렛을 0.1% BSA 로 보충된 금속 버퍼 (25mM Tris-Cl, 137mM NaCl, 1mM MgCl2, 1ml CaCl2, 1mM MnCl2 및 1mM KCl; pH 7.5) 300μl 에서 재현탁하였다. 제조된 PRP 현탁액 50 μl 를 FACS 분석에 적용하였다. 다양한 농도의 앱식시맙-코티닌 25μl, 및 항-코티닌 항체 또는 시나지스(Synagis®) 25 μl 를 0.1% BSA 보충된 금속 버퍼 중에서 실온에서 45 분 동안 적용시켰다. 동일한 버퍼로 2 회 세척한 후, 0.1% BSA 로 보충된 금속 버퍼 50μl 에 1ug/ml 농도로 2 차 항체, 항-인간 Fc-FITC 를 적용하여 암 조건 하에서 실온에서 30 분 동안 방치하였다. 이어, 수득한 세포를 동일한 버퍼로 2 회 세척하고 100 μl 의 PBS 로 재현탁하였다. 두가지의 세포주를 FACScan 형광 활성화 세포 분석기 (BD Biosciences)를 이용하여 형광 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 19 에 나타내었다.
이때, 음성 항체 대조군으로는 시나지스(Synagis)를 항-코티닌 항체와 동일한 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 앱식시맙(0 nM, 5 nM 및 50 nM)을 사용하였다.
도 19 에 나타난 바와 같이, 코티닌-앱식시맙/항-코티닌 항체 복합체는 혈소판에 대해 앱식시맙과 동일한 반응성을 유지하였으며, 코티닌-앱식시맙 또는 항-코티닌 항체의 농도가 증가함에 따라 결합도 역시 증가함을 알 수 있었다. 반면, 항-코티닌 항체(10uM) 처리된 FBL-코티닌은 혈소판에 결합하지 않았다.
시험예 10: 코티닌 -인슐린/항- 코티닌 항체 복합체의 반응성
(10-1) 코티닌 -인슐린/항- 코티닌 항체 복합체의 MCF -7 및 SK - Br -3 세포에 대한 특이적 결합 시험
구체적으로, SK-Br-3 또는 MCF-7 세포(인슐린 수용체 양성 유방암 세포주)(ATCC, 미국)(1 × 106/반응)를 FACS 버퍼 (PBS, 1% FBS 및 0.02% 아지드 나트륨)로 3회 세척하였다. 다양한 농도(0~5000nM)의 코티닌-인슐린 25μl, 및 항-코티닌 항체(1,000nM) 또는 시나지스(1,000nM) 25μl를 FACS 버퍼 중에서 실온에서 45분 동안 적용시켰다. 이때 시나지스는 음성 항체 대조군으로 사용하였다. FACS 버퍼로 2회 세척한 후에, FACS 버퍼 50μl 중에서 2차 항체인 항-인간 Fc-FITC 1ug/ml를 적용하여 암 조건 하에서 실온에서 30분 동안 방치하였다. 이어 세포들을 FACS 버퍼로 2회 세척하고, PBS 100μl 중에서 재현탁하였다. 두 가지의 세포주를 FACScan 형광 활성화 세포 분석기(BD Biosciences)를 이용하여 유동 세포 분석법으로 형광 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 20의 A에 나타내었다.
한편, 5000nM의 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체, 및 코티닌-음성 펩타이드 /항 코티닌 항체 복합체를 이용하여 상기와 동일한 방식으로 항-인간 Fc-FITC를 이용하여 배양한 후 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 이때 코티닌-음성 펩타이드 접합체로는 난포 B 림포사이트(follicular B lymphocyte) 결합 펩타이드인 코티닌-FBL (서열번호: 19) 접합체, 아페린 수용체(apelin receptor) 결합 펩타이드인 코티닌-A13 (서열번호: 20) 접합체, 및 코티닌-F13A 접합체 (서열번호: 21)를 이용하였다. (ST Pharm, 한국) 그 결과를 도 20의 B에 나타내었다.
도 20에서 나타난 바와 같이, 인슐린-코티닌/항-코티닌 항체 복합체는 인슐린 수용체를 발현하는 세포들에 대해 성공적으로 결합하는 것으로 보아, 상기 복합체가 인슐린의 수용체 결합력을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
(10-2) 코티닌 -인슐린/항- 코티닌 항체 복합체의 인간보체 의존성 독성( CDC ) 분석
보체 의존성 독성 분석을 수행하기 위하여, 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체를 세포 가시 인디케이터(cell viability indicator)인 WST-1(Takara)를 이용하여 시험하였다.
구체적으로, 인슐린 수용체를 발현하는 MCF-7 세포(ATCC, 미국)를 분석 배지(DMEM, 1% FBS)로 세척하고, 1 × 105 /ml로 희석하였다. 상기 세포 현탁액 100μl를 멸균 96-웰 조직 배양 플레이트 중에서 각 웰에 투입하고, 5% CO2 배양기에서 37℃로 밤새 배양하여 세포들이 잘 부착되게 하였다. 상기 세포로부터 분석 배지를 제거하고 난 후에 25μl 코티닌-인슐린, 25μl의 다양한 농도(0, 0.1 및 1 uM)의 항-코티닌 항체, 및 50 μl 1/12 인간 보충 희석제(complement dilution)를 포함하는 웰 세트를 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양하여 인간보체-매개 세포 용해(complement-mediated cell lysis)를 촉진시켰다. 밤새 배양한 후, 10μl of WST-1 (Takara)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 추가로 배양하고 나서, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 1% 트리톤 X-100 및 배지를 인간혈청과 함께 고-대조군(high-control) 및 저-대조군(low-control) 세포에 각각 적용시켰다. 또한, 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체를 인간혈청과 함께 세포 없이 웰에 적용시킨 것을 보완 대조군(supplement control)으로 하였다. 각각의 분석을 3회씩 수행하였고 그 결과를 도 21에 나타내었다. 고-대조군은 1% 트리톤 X-100에 의해 세포가 100% 사멸한 경우를 의미하며, 저-대조군은 보체에 의한 세포사면이 유도되지 않은 경우를 의미하며, 버퍼 대조군(bf control)은 다른 조건과 상관없이 버퍼에 의한 결과값의 차이가 있는지 확인하기 위한 경우를 의미한다.
도 21에 나타난 바와 같이, 본 발명의 코티닌-인슐린/항-코티닌 항체 복합체는 유방암 세포를 과발현시키는 인슐린 수용체에 대해 특이적인 세포 독성제(cytotoxic agent)로서 작용하게 하는 항-코티닌 항체의 인간보체 의존성 독성 능력을 유지시킴을 알 수 있었다.
시험예 11
사람 보체 C5 (complement component C5) 에 결합력을 가지는 이뮤노글로불린 eculizumab 의 아미노산 서열(US 6,355,245 B1)로부터 VH, VL 서열만을 이용하여 scFv 를 조합하고 이를 cotinibody (코티닌에 결합하는 항체 ScFv)의 첫 번째 scFv에 위치하도록 하였다. 이 벡터를 293F 세포주에 형질전환시켜 단백질을 발현시킨 후, 세포배양액으로부터 항체를 정제하기 위하여 protein A agarose 를 이용한 affinity chromatography를 시행하였다. 사람 혈청을 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 (레인 1, 2, 3, 4) 희석한 것 20μL와 정제된 사람 보체 C5 100ng (레인 5)을 SDS-PAGE 시행하고, 전기 영동한 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인에 전도시켰다. 사람 보체 C5-cotinibody 단백질을 2μg/mL 되도록 5% skim milk in Tris-buffered saline 용액에 희석한 후 멤브레인에 접촉한 상태로 4℃, 16시간 동안 반응시켰다. 멤브레인은 0.2% Tween 20 이 함유된 TBS 용액으로 세척하고, horseradish peroxidase 가 결합된 코티닌을 1/1000 희석한 용액을 상온에서 2시간 동안 멤브레인과 반응시켰다. 이 후 멤브레인을 0.2% Tween 20 이 함유된 TBS 용액으로 세척하고, chemiluminescent 물질을 처리한 후 필름에 감광하였다. 사람 보체 C5-cotinibody 가 선택적으로 사람 보체 C5 에 결합함을 확인하였다(도 23).
본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 당 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.
<110> SNU R & DB FOUNDATION <120> COMPLEX PREPARED BY COMBINING A CONGUGATE OF CONJUGATION MATERIAL AND COTININE WITH ANTI-COTININE ANTIBODY AND USE THEREOF <130> PCB104028SNU <150> US 61/476,018 <151> 2011-04-15 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WKYMVm-NH2 peptide <400> 1 Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wkymvm-NH2 peptide <400> 2 Trp Lys Tyr Met Val Met 1 5 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS1411 DNA aptamer <400> 3 dttggtggtg gtggttgtgg tggtggtgg 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRO26 DNA aptamer <400> 4 dcctcctcct ccttctcctc ctcctcc 27 <210> 5 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pegaptanib RNA aptamer <220> <221> modified_base <222> (1)..(27) <223> C and U are 2'-fluoro, G and A are 2'-methyl, wherein A4 and A5 are 2'-hydroxyl <400> 5 cggaaucagu gaaugcuuau acauccg 27 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin <400> 6 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gly 50 55 60 Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu 65 70 75 80 Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser 85 90 95 Ile Cys Ser Leu Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for anti-cotinine rabbit/human chimeric antibody light chain <400> 7 acttaagctt gcgccaccat gggctggtcc tgcatcatcc tgttcctg 48 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for anti-cotinine rabbit/human chimeric antibody light chain <400> 8 gcaagctcta gactagcact cgcc 24 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for anti-cotinine rabbit/human chimeric antibody heavy chain <400> 9 acatcggcta gccgccacca tgggctggtc ctgcatcatc ctgttcctg 49 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for anti-cotinine rabbit/human chimeric antibody heavy chain <400> 10 gagctcggat cccttgccgg ccgt 24 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for light chain variable region from anti-cotinine rabbit scFV <400> 11 atcctgttcc tggtggccac cgccaccggc gagctcgatc tgacccag 48 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for light chain variable region from anti-cotinine rabbit scFV <400> 12 taggatctcc agctcggtcc ctcc 24 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for heavy chain variable region from anti-cotinine rabbit scFV <400> 13 atcctgttcc tggtggccac cgccaccggc cagtcggtga aggagtcc 48 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for heavy chain variable region from anti-cotinine rabbit scFV <400> 14 tgaagagatg gtgaccaggg tgcc 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for light chain constant region from human <400> 15 gagctcggat cccttgccgg ccgt 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for light chain constant region from human <400> 16 gcaagctcta gactagcact cgcc 24 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for heavy chain constant region from human <400> 17 gtcaccatct cttcagcctc caccaagggc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for heavy chain constant region from human <400> 18 gagctggaga tcctacggac cgtggccgcc 30 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FBL peptide <400> 19 Glu Tyr Val Asn Cys Asp Asn Leu Val Gly Asn Cys Val Ile Arg Gly 1 5 10 15 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A13 peptide <400> 20 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F13A peptide <400> 21 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Ala 1 5 10

Claims (12)

  1. 코티닌과 접합 물질의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 접합 물질이 펩타이드, 앱타머, 호르몬, 단백질 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 접합 물질이 WKYMVm-NH2 펩타이드, AS1411 앱타머, 페갑타닙, 앱식시맙 및 인슐린으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 접합 물질이 코티닌과 PEG 링커 또는 아미노 C6 링커로 연결되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 접합체가 항-코티닌 항체의 항원 결합부위에 결합된 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항-코티닌 항체가 상기 항체; Fab, ScFv 및 도메인 항체로부터 선택되는 항체 분절; 및 상기 항체 및 항체 분절을 구성성분으로 포함하고 있는 복합 단백질(fusion protein)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 생체외 생물학적 분석 방법(in vitro biological assay)에 있어서, 코티닌과 접합 물질의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 생체외 생물학적 분석 방법이 유동 세포 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 면역침강 분석법 및 효소-링크된 면역화학 분석법으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 생체내 반감기(in vivo half-life)를 증가시키는 방법.
  10. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 보체 의존성 독성(complement-mediated cell cytoxicity, CDC)을 야기하는 방법.
  11. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질이 결합하는 세포에 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)을 야기하는 방법.
  12. 접합 물질을 코티닌과 접합시킨 접합체에 항-코티닌 항체를 결합시킴으로써 상기 접합 물질의 체내 분포를 일반적인 항체의 체내 분포 양상으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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