JP5838486B2 - 接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体およびその用途に関するものである。

数多いペプチドおよびアプタマーバイオ医薬品は、候補薬物（ｄｒｕｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅ）として有望な特性を持っているが、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、ペプチド分解酵素（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）および核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）などによって体内で容易に分解されるか、または腎臓を介して急速に排出されるため、数分乃至数時間程度と、体内半減期が短いことが知られている（非特許文献１）。このような不安定性および短い薬効持続時間による問題点を解決するために、一般的にポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）を結合させ（非特許文献２）、体内の酵素による分解を阻害し、腎臓と血管における吸収を抑制して、血中滞留時間を延長する技術が実施されている。しかし、このようなペグ化は時間が長くかかり、接合物質に応じて特定の最適化（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を必要とするだけでなく、ＰＥＧが非常に異質的（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）に接合するため、様々な分子結合体が生成されるという問題がある。

新規の伝達プラットフォーム（Ｎｏｖｅｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ）として使用するための目的に照らしてみると、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）は、動物とヒトに必ず無毒でなければならず、生理的活性があってはならないという条件を満たさなければならない。コチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）は、ニコチンの主要代謝産物であって、人類は長い間ニコチンにさらされてきた。したがって、コチニンは、新規の伝達プラットフォームに適用するのに適したハプテンである。また、コチニンは、マウスにおけるＬＤ_５０が２ｇ／ｋｇ−４ｇ／ｋｇ程度と、比較的安全性の高い物質であり（非特許文献３）、１日に１．８ｇずつ４日間服用した場合でも、特別な副作用は報告されなかった（非特許文献４）。また、哺乳動物においてコチニンの代謝過程は明らかにされており、血清半減期が約１６時間であることもよく知られている（非特許文献５）。加えて、人間にとってコチニンは生理活性を示さず、３日間、最大１６０ｍｇのコチニンを吸収しても、生理的および行動の如何なる変化も報告されたことがない（非特許文献６）。

一方、アプタマーは、特異的で三次元的な形で組むことができ、抗体のように、ターゲットと親和性高く特異的結合が可能なので、様々な分析や実験に使用されてきた。アプタマーを用いた抗体との複合体を調製する従来の方法は、主にアプタマーをビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）およびジグオキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）に接合させることによりアビジン（ａｖｉｄｉｎ）および抗−ジゴキシゲニン抗体と複合体を構成する方式であった。

本発明者らは、コチニンをハプテンとして用いて接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体を調製し、前記複合体が結合物質の特異的反応性および生物学的機能と、抗体の固有特性である、補体媒介細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）および長い生体内半減期を保持することを発見し本発明を完成した。

Sato A.K. et al., Curr Opin Biotechnol, 17, 638-642, 2006 Veronese, F.M. & Pasut G., Drug Discov Today, 10, 1451-1458,2005 Riah O. et al., Toxicol.Lett., 109, 21-29, 1999 Bowman, E.R. & Mc, K.H.,Jr., J. Pharmacol. Exp. Ther., 135, 306-311, 1962 Benowitz N.L. et al., 3rd Handb. Exp. Pharmacol., 29-60, 2009 Benowitz N.L. etal., 3rd Handb.Exp.Pharmacol., 29-60, 2009

したがって、本発明の目的は、接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体を提供することである。

本発明の他の目的は、生体外の生物学的分析方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ）において、コチニンと接合物質との接合体を分析ツールとして使用することを特徴とする方法を提供することである。

本発明のまた他の目的は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質の生体内半減期を増加させる方法を提供することである。

本発明のまた他の目的は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質が結合する細胞に補体依存性の毒性を引き起こす方法を提供する。

本発明のまた他の目的は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質が結合する細胞に抗体依存性細胞毒性を引き起こす方法を提供することである。

本発明のまた他の目的は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質の体内分布を一般的な抗体の体内分布の様相に変化させることを特徴とする方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体を提供する。

前記他の目的を達成するために、本発明は、生体外の生物学的分析方法において、コチニンと接合物質との接合体を分析ツールとして使用することを特徴とする方法を提供する。

前記また他の目的を達成するために、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質の生体内半減期を増加させる方法を提供する。

前記また他の目的を達成するために、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質が結合する細胞に補体依存性毒性を引き起こす方法を提供する。

前記また他の目的を達成するために、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質が結合する細胞に抗体依存性細胞毒性を引き起こす方法を提供する。

前記また他の目的を達成するために、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質の体内分布を一般的な抗体の体内分布の様相に変化させることを特徴とする方法を提供する。

本発明における上述のものおよび他の目的並びに特徴は、添付の図面とともに以下の説明から明らかになることである。

図１は、実施例２で精製された抗−コチニン抗体に対してクーマシー染色を行ったゲルの写真である。 図２は、実施例（３−１）で合成したコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体の構造式を示す。 図３は、実施例（３−２）で合成したコチニン−ＡＳ１４１１およびコチニン−ペガプタニブ接合体の構造式を示す。 図４は、試験例１で行ったコチニンに対する抗−コチニンＩｇＧ抗体の親和性を分析したグラフを示す。 図５は、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体のＦＰＲ２細胞受容体に対する特異的結合力を示すグラフを示す。 図６は、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の細胞内カルシウム濃度変化の分析結果を示す。 図７は、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体のスーパーオキシド発生程度の分析結果を示す。 図８は、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の走化性分析の結果を示す。 図９は、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の、マウスにおける体内半減期を比較したグラフとヒストグラムを示す。 図１０は、抗−コチニンＩｇＧの血清中の体内半減期を示したグラフである。 図１１は、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の敗血症モデルにおける改善された治療効果を示すグラフである。 図１２は、マウスにおいて、コチニン−ペガプタニブ接合体およびコチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の体内半減期を比較したグラフである。 図１３は、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体の、ヌクレオリン細胞受容体に対する特異的結合力の試験結果を示す。 図１４は、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体の、ヌクレオリン細胞受容体に対する特異的結合力の試験結果を示す。 図１５は、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体をウェスタンブロッティングした結果である。 図１６は、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体を利用したヌクレオリンの免疫沈降試験の結果を示す。 図１７は、コチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の、ＶＥＧＦに対する結合性を示すグラフである。 図１８は、アブシキシマブ、アブシキシマブ−コチニン接合体、およびコチニン−アブシキシマブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体のインテグリンアルファ２ｂベータ３に対する反応性を示したグラフである。 図１９は、コチニン−アブシキシマブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の、血小板に対する結合力の試験結果を示す。 図２０は、コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体の、ＭＣＦ−７およびＳＫ−Ｂｒ−３細胞に対する結合力の試験結果を示す。 図２１は、コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体の補体依存性毒性の分析結果を示す。 図２２は、接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体を示すものである。 図２３は、細胞培養液から、ヒト補体Ｃ５のＳｃＦｖ抗体を精製するためにプロテインＡアガロースを用いた親和性クロマトグラフィーを行った結果を示す。

以下、本発明についてより詳細に説明する。

本明細書において「抗体」は、免疫系内の抗原の刺激によって作られる物質を意味するもので、その種類は特に限定されない。本明細書中において抗体は、動物抗体、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体の全てを含む。また、本明細書中において抗体とは、抗原結合能を有する抗体の断片、例えば、Ｆａｂも含む。

本明細書において「キメラ抗体」とは、抗体の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）またはその相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、 ＣＤＲ）が抗体の残りの部分と異なる動物から由来した抗体を指す。このような抗体は、例えば、抗体可変領域はヒト以外の動物（例えば、マウス、ウサギ、家禽類など）に由来し、抗体不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒトに由来する抗体であり得る。このようなキメラ抗体は、当業界に公知の遺伝子組換えなどの方法で調製することができる。

本明細書において「重鎖」は、抗原に対する特異性を付与するために十分な可変領域のアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｈおよび３つの不変領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む完全長重鎖およびその断片すべてを指す。

本明細書において「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域のアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶ_Ｌおよび不変領域ドメインＣ_Ｌを含む完全長軽鎖およびその断片すべてを指す。

本明細書において「相補性決定領域」は、抗体の可変領域中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。

本明細書において「接合体」とは、異種性分子として、ポリマー分子、親油性化合物、炭水化物部分または有機誘導体化剤（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）のような一つ以上の非ポリペプチド部分、特にポリマー部分に１つ以上のポリペプチド、典型的には一つのポリペプチドを共有結合的に付着させて作ることができる。さらに、接合体は、一つ以上の炭水化物部分に、特にＮ−またはＯ−グリコシル化を利用して付着できる。共有結合的に付着させるという意味は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分を互いに直接共有結合させたり、リンキングブリッジ（ｌｉｎｋｉｎｇ ｂｒｉｄｇｅ）、スペース、リンキングパート（ｌｉｎｋｉｎｇ ｐａｒｔ）、または仲介部分などを介して、互に間接的に共有結合的に結合されることを意味する。例えば、本明細書に開示された接合物質をコチニンと接合させた接合体がこの定義に含まれる。

本発明は、接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体を提供する（図２２）。

また、本発明は、生体外生物学的分析方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ）において、コチニンと接合物質との接合体を分析ツールとして使用することを特徴とする方法を提供する。前記生体外生物学的分析方法は、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット分析法、免疫沈降分析法および酵素−リンクされた免疫化学分析法からなる群より選択されることを特徴とする。

本発明による接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体は、コチニンをハプテンとして利用することにより、接合物質および抗体固有の特性全てを保持することができる。具体的に前記複合体は、分子の特異的反応性および機能と、抗体の特性である、補体−媒介細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体−依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および長い生体内半減期を保持することができる。

したがって、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質の生体内半減期を増加させる方法を提供する。

また、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質が結合する細胞に補体依存性毒性を引き起こす方法を提供する。

また、本発明は、コチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質が結合する細胞に抗体依存性細胞毒性を引き起こす方法を提供する。

また、本発明は、接合物質をコチニンと接合させた接合体に抗−コチニン抗体を結合させることにより、前記接合物質の体内分布を一般的な抗体の体内分布の様相に変化させることを特徴とする方法を提供する。

本発明の複合体は、一種の抗体とコチニンからなるため、単に短い配列の接合物質をコチニンに接合させることにより調製することができるので、高集約的であり、開発が容易で簡単な形態の伝達プラットフォームとして作用することができる。

したがって、本発明による複合体は、コチニンに接合された接合物質によって抗原反応性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が決定される新規抗体であり、分子固有の生物学的または化学的機能を示す治療用抗体として使用することができる。

コチニンは、タバコの煙の主成分であるニコチンの主要代謝産物であり、人間が長年タバコの煙に長時間さらされてきたにもかかわらず、非常に少量の即時毒性のみがこれまで報告されてきたため、非常に安定した分子として知られている。コチニンのこのような相対的非毒性特徴は、コチニンが生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用される理想的分子用接合体になるように働く。本発明では、コチニンを接合物質と接合させることにより、前記接合物質の短い半減期をはるかに向上させることができる。

本発明において接合物質とは、特定の治療活性または結合反応性等を示す様々な生物的、化学的物質であり得る。

前記接合物質は、例えば、ペプチド、アプタマー、ホルモン、タンパク質および化学物質からなる群より選択することができ、好ましくは、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチド（ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２）、ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２ペプチド（ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２）、ＡＳ１４１１アプタマー、ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）およびインスリンからなる群より選択することができる。

本発明において、接合物質として使用することができるアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））は、血小板の表面にて広範囲に発現されるインテグリンアルファ２ｂベータ３（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ２ｂ ｂｅｔａ３）に反応性を示すマウス／ヒトキメラＦａｂである。

本発明の一実施態様によると、前記アブシキシマブをコチニンと接合させて調製したコチニン−アブシキシマブ接合体、および抗−コチニン抗体を含む複合体（以下、コチニン−アブシキシマブ／抗−コチニン抗体複合体）を調製することができ、前記複合体は、インテグリンアルファ２ｂベータ３および血小板に対してアブシキシマブと同じレベルで反応性を維持することが分かる（本願試験例９、図１８および図１９を参照）。

本発明において接合物質として使用することができるインスリンは、生体内において炭水化物と脂肪の物質代謝を調節するのに重要なホルモンである。インスリンは、２種のポリペプチド鎖で構成され、２１個のアミノ酸残基で構成されるＡ鎖内に一つの細胞間分子ジスルフィド結合（ｉｎｔｒａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）、および３０個のアミノ酸残基で構成されるＢ鎖にＡ鎖を接続する２つの細胞内分子ジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を持つ（Ｎｉｃｏｌ ＤＳ、Ｓｍｉｔｈ、ＬＦ．、Ｎａｔｕｒｅ １９６０ Ａｕｇ ６、１８７：４８３−５、ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１４４２６９５５）。

本発明の一実施態様によると、前記インスリンをコチニンと接合させて調製したコチニン−インスリン接合体、および抗−コチニン抗体を含む複合体（以下、コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体）を調製することができ、前記複合体がインスリン受容体を発現する細胞に対して、インスリンの受容体結合力を維持することが分かる（本願試験例１０、図２０および図２１を参照）。

本発明において、接合物質として使用することができるＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチドは、抗−敗血症の治療学的ペプチドとして、ホルミルペプチド受容体（Ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＦＰＲｓ）に対する拮抗剤であり、貪食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）にて化学走性移動（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を誘導し、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）と好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）のスーパーオキシド（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）の発生を増加させ抗生作用をする。

本発明の一実施態様によると、前記ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチドをコチニンと接合させて調製したコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体（図２）および抗−コチニン抗体を含む複合体（以下、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニン抗体複合体）を調製することができる。具体的には、前記のＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチド（文献［Ｂａｅｋ ＳＨ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、１９９６ Ａｐｒ ５、２７１（１４）：８１７０−５．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：８６２６５０７］および［Ｋｉｍ ＳＤ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９ Ｎｏｖ １、 １８３（９）：５５１１−７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１９８４３９３７］参照）は、ＰＥＧ（ｍｉｎｉ−ＰＥＧ）をリンカーとして用いてコチニンと結合する。以後、抗−コチニン抗体（Ｐａｒｋ Ｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１０ Ｓｅｐ ６、 ４１１ （１７〜１８）：１２３８−４２． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｍａｙ １１ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０４３８７２３）と複合体を形成することができる。

このように調製された本発明の複合体は、フローサイトメトリー分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）においてホルミルペプチド受容体を発現する細胞に対して反応性を示し、これによりＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２の結合力が保持されたことが分かる（図５参照）。また、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体が細胞からカルシウムを正常に放出することから、コチニンと接合した後にも、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ２の生物学的機能は保持されたことが分かる（図６〜図８を参照）。さらに、敗血症マウスモデルにおいて、前記コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニン抗体複合体を投与した群は、服用−依存的な方法（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）で敗血症からマウスを回復させたことに対し、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体のみを単独で投与した群では効果を示さなかった。このような結果は、前記複合体内においてＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチドの生物学的治療効果が保持されているだけでなく、前記抗−コチニン抗体の生体内における長い半減期によってコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体の半減期が延長されたことを示す（図９参照）。

本発明において、接合物質として使用することができるペガプタニブは、ＰＥＧ化された抗−ＶＥＧＦアプタマーとして、血管新生に重要な役割を果たすＶＥＧＦ１６５に結合する。

本発明の一実施態様によると、前記ペガプタニブの核酸部分をコチニンと接合させて調製したコチニン−ペガプタニブの接合体（図３参照）、および抗−コチニン抗体を含む複合体（以下、コチニン−ペガプタニブ／抗−コチニン抗体複合体）を調製することができ、前記複合体は、生体内半減期が非常に向上することが分かる（本願試験例７を参照）。

本発明において接合物質として使用することができるＡＳ１４１１アプタマーは、Ｇ−ｒｉｃｈオリゴヌクレオチドであって、がん細胞の表面に発現するヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）に結合してがん細胞内に吸収（ｕｐｔａｋｅ）され、ＤＮＡの複製や細胞増殖などのヌクレオリンの正常な機能を破壊する特徴がある。

本発明では、前記アプタマーの５’にコチニンを接合させることにより、抗体と安定した複合体とを形成することができる。本発明の一実施態様によると、前記ＡＳ１４１１をコチニンと接合させて調製したコチニン−ＡＳ１４１１の接合体（図３参照）、および抗−コチニン抗体を含む複合体（以下、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニン抗体複合体）を調製することができ、前記複合体はＡＳ１４１１アプタマーと同様、ＶＥＧＦに対する結合力を保持することが分かる（本願試験例８を参照）。

本発明において前記接合物質は、コチニンとＰＥＧリンカー（ミニＰＥＧ−１２）またはアミノＣ６リンカーで接続されることを特徴とする。

前記コチニンと接合物質との接合体は、抗−コチニン抗体に結合することにより、本発明の複合体を形成するが、この際、接合体は、抗体の重鎖または軽鎖に結合することができ、特に抗−コチニン抗体の抗原結合部位に結合することが望ましい。

一方、本発明において抗−コチニン抗体は、高親和性の抗−コチニンＦａｂ抗体（米国特許ＵＳ８，００８，４４８ Ｂ２参照）をＩｇＧの形態で調製および発現した抗体を使用することができる。

例えば、前記抗−コチニン抗体は、以下のような方法によって調製することができる。前記米国特許ＵＳ８，００８，４４８号に記載された方法を変えることによって調製した軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子をそれぞれ発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）に挿入する。続いて、哺乳動物細胞に形質転換させることによって抗体タンパク質を発現させた後、通常の方法で培養液を精製することにより、本発明による抗−コチニンＩｇＧ抗体を得ることができる。

このとき、前記哺乳動物細胞として、哺乳動物ＣＨＯ ＤＧ４４細胞（インビトロジェン社、米国）を使用することができ、精製方法としては、培養液を濃縮した後、タンパク質Ａカラム（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｏｌｕｍｎ；Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、米国）で精製することが望ましい。

本発明において、前記抗−コチニン抗体は、前記抗体、Ｆａｂ、ＳｃＦｖおよびドメイン抗体から選択される抗体フラグメントと、前記抗体および抗体フラグメントを構成成分として含む複合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）とからなる群より選択されることを特徴とする。

接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体は、
１）接合物質をコチニンと接合させた接合体を調製する段階と、
２）抗−コチニン抗体を調製する段階と、
３）前記で調製した接合物質をコチニンと接合させた接合体および抗−コチニン抗体を結合させる段階とを含む方法によって調製することができる。

具体的に、前記方法は、
ａ）接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体をコードする核酸分子をベクターに挿入するステップと、
ｂ）前記ベクターを宿主細胞に導入するステップと、
ｃ）前記宿主細胞を培養するステップとを含むことができる。

接合物質とコチニンとの接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体を調製することは、臨床段階において抗−コチニン抗体の生産システムを設定する際、治療学的抗体を作り出す有効な方法となり得る。新しい治療学的抗体を新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）開発するには相当の時間を要するが、本発明の複合体の調製方法を用いると、臨床段階において高速大量の方式で迅速かつ容易に合成することができる小分子の形で治療学的抗体を調製することができる。

本発明では、コチニンと接合物質を接合させると、調製された接合体に抗−コチニン抗体が結合され複合体を形成する。前記抗体の抗原反応性は、コチニンに接合された接合物質によって生産することができる。このように調製された本発明の複合体は、補体−媒介細胞毒性、抗体−依存性細胞毒性、および長い生体内半減期を含む、前記抗体の全ての特徴を保持する。

接合分子を直接抗体と結合させる従来の分子−抗体接合体と比較して、本発明の複合体は、免疫学的面において追加の利点を示すことが予想される。

具体的に、従来の治療学的分子と抗体の接合体は、ハプテン−キャリア（ｈａｐｔｅｎ−ｃａｒｒｉｅｒ）として利用することができ、抗体に直接結合された分子に対して免疫学的反応が直ちに発生し得る。前記分子−抗体接合体が抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）によって囲まれると、前記抗体は短いペプチドに分解されることになる。このような状況下で数多い治療学的分子は、依然として前記短いペプチドに化学的にクロスリンクされることとなる。仮に、前記治療学的分子にリンクされたペプチドのいずれかが特定のＭＨＣ分子に高い親和性を持つとなると、抗原提示細胞の細胞表面に十分現われることであろう。これは、治療学的分子の免疫性を効率的に誘導することになる。

しかし、本願発明の複合体の場合では、抗原提示細胞によって囲まれることになると、抗体が短いペプチドに分解されるため、コチニンと接合物質の接合体は、抗−コチニン抗体から直ちに分離されることになる。これは、コチニン接合された治療的分子に対する免疫原性反応の発達を難しくさせ、利点として作用することができる。

以下、本発明を下記の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するためのもののみであり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

（実施例１：抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ遺伝子の調製）
（１−１）抗−コチニンウサギｓｃＦｖから抗体可変領域の増幅
ウサギの抗体可変領域（Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ）を増幅するために、抗−コチニンウサギｓｃＦｖ遺伝子（米国特許第８，００８，４４８号参照）を鋳型とし、それぞれ６０ｐｍｏｌのＶ_Ｌ用の順方向および逆方向プライマー（配列番号：１１および１２）、およびＶ_Ｈ用の順方向および逆方向プライマー（配列番号：１３および１４）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。

具体的に、ＰＣＲ反応を実行するために、米国特許第８，００８，４４８号において合成したｃＤＮＡ（約０．５μｇ）１μｌ、それぞれ６０ｐｍｏｌの順方向プライマーと逆方向プライマー、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー、８μｌ ２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物および０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を混合し、これに蒸留水１００μｌを添加した。前記混合物を９４℃で１０分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒の反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間静置した。

前記の過程を経て増幅されたＤＮＡを１％のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて精製した。

（１−２）ヒトの抗体不変領域の増幅
ヒト軽鎖不変領域（Ｃκ）およびヒト重鎖不変領域（ＣＨ１−ＣＨ３）の抗体不変領域（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を増幅するために、２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、 ＵＳＡ、（１９９１）、 １５：８８（１８）、７９７８−７９８２）を鋳型とし、それぞれ６０ｐｍｏｌのＣκ用順方向および逆方向プライマー（配列番号：１５および１６）およびＣＨ１−ＣＨ３用の順方向および逆方向プライマー（配列番号：１７および１８）を使用したことを除いては、前記実施例（１−１）と同様の方法でＰＣＲを行った後、増幅されたＤＮＡのゲル電気泳動および精製を行った。

（１−３）軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の増幅
軽鎖を増幅するためのＰＣＲを実行するために、前記実施例（１−１）および（１−２）において調製および精製したウサギの抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）およびヒトの抗体軽鎖不変領域（Ｃκ）を重複伸長ＰＣＲによって結合させ軽鎖遺伝子を調製した。

具体的に、ＰＣＲ反応のために、それぞれ１００ｎｇのＶ_ＬおよびＣκＰＣＲ産物、それぞれ６０ｐｍｏｌの抗−コチニンウサギ／ヒトキメラ抗体軽鎖の順方向および逆方向プライマー（配列番号：７および８）を使用したことを除いては、前記実施例（１−１）と同様の方法でＰＣＲを行った。以後、増幅されたＤＮＡを前記実施例（１−１）と同じ方法で、アガロースゲル電気泳動および精製を行った。

（１−４）重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）の増幅
重鎖を増幅するためのＰＣＲを実行するために、前記実施例（１−１）および（１−３）において調製および精製した、ウサギの抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）およびヒトの抗体重鎖不変領域（ＣＨ１−ＣＨ３）を重複伸長ＰＣＲによって結合させ重鎖遺伝子を調製した。

具体的に、ＰＣＲ反応のために、それぞれ１００ｎｇのＶ_ＨおよびＣＨ１−ＣＨ３ ＰＣＲ産物、それぞれ６０ｐｍｏｌの抗−コチニンウサギ／ヒトキメラ抗体重鎖の順方向および逆方向プライマー（配列番号：９および１０）、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー、８μｌ ２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物および０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、これに蒸留水１００μｌを添加した。前記混合物を９４℃で１０分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で１８０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間静置した。

以後、増幅されたＤＮＡを前記実施例（１−１）と同じ方法で、アガロースゲル電気泳動および精製を行った。

（１−５）抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ遺伝子を含む発現ベクターの作製
前記実施例（１−３）において調製および精製した軽鎖ＰＣＲ産物および前記実施例（１−４）において調製および精製した重鎖ＰＣＲ産物を、それぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ（ＮＥＢ、米国）および制限酵素ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＩ（ＮＥＢ、米国）により切断して純粋分離した後、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１） ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）の部位に挿入した。

（実施例２：抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ発現およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のための精製）
抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ遺伝子を含む発現ベクターＤＮＡにより、哺乳動物ＣＨＯ ＤＧ４４（インビトロジェン、米国）細胞を形質注入させた。形質注入された細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、米国）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）発現培地（ＧＩＢＣＯ）に５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加し、３７℃および１３５ｒｐｍの条件で培養した。培養液の上清液をＬａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）で濃縮して、タンパク質Ａカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏ．、 米国）により精製した。精製された１５０ＫＤａのＩｇＧをクーマシー染色で確認し（図１参照）、その後の実験（試験例）に使用した。

図１に示すように、レーン１はサイズマーカーであり、レーン２は還元していない抗−コチニンＩｇＧ（１５０ＫＤａ）であり、レーン３は還元された抗−コチニンＩｇＧとして軽鎖（２５ＫＤａ）および重鎖（５０ＫＤａ）であることが分かった。

（実施例３：コチニンおよび接合物質の接合体の調製）
（３−１）コチニンおよびペプチドの接合体
ペプチドとして、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチド（ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２、配列番号：１）およびｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２ペプチド（ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２、配列番号：２）を使用した。ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２は、固相ペプチド合成（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法によって、ＡＳＰ４８Ｓペプチド自動合成器において合成した。その後、Ｖｙｄａｃ Ｅｖｅｒｅｓｔ Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×２２ｍｍ、１０μｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）で精製し、（９５％より高い純度）、ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ ｓｅｒｉｅｓ）でペプチドのサイズを確認した（９５％より高い純度）。

一方、コチニンおよびペプチドの接合体としてコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２は、ペプチドの最後の合成過程において、ＰＥＧリンカーとコチニンを導入することを除いては、前記方法と同様の方法で行うことにより合成した。

コチニンおよびペプチド接合体の調製方法は、まず、基本的なペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓペプチド自動合成器を用いて合成した後、Ｃ−末端アミド化（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｍｉｄａｔｉｏｎ）のためにＭＢＨＡリンクアミド樹脂（ｌｉｎｋ ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ）に、最初の配列であるＦｍｏｃ−ｍ−ＯＨ（８当量）とカップリング剤ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）をＤＭＦに溶解して添加した後、常温で２時間反応させた。その後、ＤＭＦ中のピペリジンの２０％を加え、常温で５分間２回反応させＦｍｏｃを分解した。前記の過程を繰り返して、ペプチドの基本骨格となるＮＨ_２−Ｗ（Ｂｏｃ）−Ｋ（Ｂｏｃ）−Ｙ（ｔＢｕ）−Ｍ−Ｖ−ｍ−ＭＢＨＡリンクアミド樹脂を作り、ペプチドがついた樹脂を少量取って切断カクテル（ｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ＝９５／２．５／２．５）を加えペプチドを樹脂から分離した後、過量のジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させた。得られた少量の粗ペプチドをＤＷ／ＣＡＮ（１／１）に溶解して、合成しようとするペプチド（ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２）の分子量が取れるのかＬＣ／ＭＳにより確認した後、前記の過程と同様にＦｍｏｃ−ミニＰＥＧ１２−ＯＨをカップリングし、再び樹脂を取りＬＣ／ＭＳで分子量を確認した。再度、トランス−４−コチニンカルボン酸を上記の手順と同様にカップリングし、切断カクテル（ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ＝９５／２．５／２．５）を加えてペプチドを樹脂から分離した後、過量のジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、ＨＰＬＣにより精製した後ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結乾燥した。

前記で合成したＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチドおよびｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２ペプチドと、コチニン−ペプチド接合体とは、ＤＭＳＯに溶解した後−２０℃で保存した。このように調製されたコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２接合体の構造を図２に示す。

（３−２）コチニンおよびアプタマーの接合体
アプタマーとして、ＡＳ１４１１ＤＮＡアプタマー（５’−ｄＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ−３’、配列番号：３）、ＣＲＯ２６ＤＮＡアプタマー（５’−ｄＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ−３’、配列番号：４）およびペガプタニブＲＮＡアプタマー（５’−ｐＣｆｐＧｍｐＧｍｐＡｒｐＡｒｐＵｆｐＣｆｐＡｍｐＧｍｐＵｆｐＧｍｐＡｍｐＡｍｐＵｆｐＧｍｐＣｆｐＵｆｐＵｆｐＡｍｐＵｆｐＡｍｐＣｆｐＡｍｐＵｆｐＣｆｐＣｆｐＧｍ３’−ｐ−ｄＴ−３，配列番号：５）を使用した。

一方、コチニンおよびアプタマーの接合体としてコチニン−ＡＳ１４１１とコチニン−ＣＲＯ２６およびコチニン−ペガプタニブは、アプタマーを、固相オリゴヌクレオチド合成（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法によりオリゴヌクレオチド合成装置（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）において３’から５’に合成した後、合成最後の過程で、アミノＣ６リンカー（ＳＴ Ｐｈａｒｍ、韓国）を付けて、活性エステル法（ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてコチニンと接合し調製した。その後、Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８カラム（５μｍ、１０×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、米国）を用いた逆相高圧液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で接合体を精製（９５％より高い純度）し、マススペック（ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）でサイズを確認した。

前記において合成したコチニン−ＡＳ１４１１およびコチニン−ＣＲＯ２６は蒸留水に溶解し、コチニン−ペガプタニブはＲＮＡであるためジエチルピロカーボネート（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）で処理した蒸留水に溶解して、９５℃で５分間静置した後、常温で３０分間ゆっくり冷やしてから、−２０℃で保存した。このように調製されたコチニン−ＡＳ１４１１およびコチニン−ペガプタニブの構造を図３に示す。

（３−３）コチニンとアブシキシマブの接合体
アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ）を利用して、コチニンおよびアブシキシマブの接合体（コチニン−アブシキシマブ）を調製した。

コチニンおよびアブシキシマブの接合体は、活性エステル法を用いて調製した。ＤＭＦ１ｍｌにコチニン０．１ｍｍｏｌを入れて常温で溶解した後、ＤＭＡＰ極少量、ＤＣＣ０．１１８ｍｍｏｌとＮＨＳ０．１２ｍｍｏｌを入れ、常温で４時間ほどローテーション（ｒｏｔａｔｉｏｎ）を行った。１００００ｘｇにおいて３０分間遠心分離し、上清液のみを分離した。２０ｍｇのアブシキシマブを炭酸バッファー（ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）２ｍｌに入れて溶解し、ＤＭＦ１ｍｌを添加した後、前記上清液を徐々に入れて３時間ほど常温でローテーションした。その後、４℃で６時間以上の透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）をして、再び遠心分離し、上清液のみを得ることにより接合体を調製した。

（３−４）コチニンおよびインスリンの接合体
インスリン（配列番号：６）を使用して、コチニンおよびインスリンの接合体（コチニン−インスリン）を調製した。

コチニンおよびインスリンの接合体は、前記実施例３−３のコチニンおよびアブシキシマブの接合体の調製方法と同様に行って調製した。

（実施例４：コチニンと接合物質の接合体および抗−コチニン抗体を含む複合体の調製）
前記実施例１で調製したコチニンと接合物質との接合体と、実施例２で調製した抗−コチニン抗体を含む複合体として、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体を調製するために次のように実施した。

＜試験例１：コチニンに対する抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧの親和性分析＞
コチニンに対する抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、 Ｕｐｐｓａｌａ、 スウェデン）を使用して表面プラズモン共鳴技術（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、 ＳＰＲ）より分析した。

具体的に、１０ｍＭナトリウム酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を５μｌ／分の速度で流しながら、アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）に添付された説明書に従って、ＣＭ５（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）にコチニン−ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を固定した。０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（ｓｉｇｍａ、米国）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ抗体を２５℃で３０μｌ／分の速度でチップに注入した。抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ抗体は、０．１５６２５−１０ｎＭの濃度に希釈された。

表面は、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生し、分析ソフトウェア（ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を利用して結合・解離速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）と平衡解離定数（Ｋｄ）を得た。その結果を表１に示し、図４にグラフで示す。

図４に示すように、抗−コチニンウサギ／ヒトキメラＩｇＧ抗体の注入量が増加するにつれ、ＣＭ５チップに固定されているコチニンに結合する抗−コチニンＩｇＧ抗体の量が増加することが分かった。

＜試験例２：細胞受容体に対するコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の反応性テスト＞
コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体が、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２の細胞受容体であるＦＰＲ２に結合することを確認するためにフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行った。

ＦＰＲ２またはベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を形質注入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞（Ｙｏｅ−Ｓｉｋ Ｂａｅ ｅｔ ａｌＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ２００４；１７３；６０７−６１４）を、１０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が添加されたＲＰＭＩ培地において３７℃および５％のＣＯ_２条件で培養した。その後、９６−ウェルプレートの各ウェル当たり１×１０^５個の細胞を分注した後、ＰＢＳで２回、分析バッファー（ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）（１％のＦＢＳおよびＰＢＳ中に０．０２％のアジ化ナトリウムを含む）で１回洗浄した。

ＦＰＲ２を形質注入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞の各ウェルに、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体を、分析バッファーで希釈して５０μｌずつ添加し４℃で３０分間反応させた。この場合、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ２は、０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭの４つの濃度について実験し、抗−コチニンＩｇＧは１００ｎＭで固定した。

この際、比較のために、ベクターを形質注入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞に対しても、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体を用いて前記と同じ実験を繰り返した。

また、他の比較群としてＦＰＲ２を形質注入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞に、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／非特異的ＩｇＧ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ；シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ、登録商標）；Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）を、前記と同様の濃度条件で処理した実験群１およびＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２に対する陰性ペプチド（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）であるｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ２を利用して１００ｎＭコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２／１００ｎＭ抗−コチニン抗体を処理した実験群２を使用した。

細胞を分析バッファーで２回洗浄した後、ＦＩＴＣが標示されたモノクローナル抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を分析バッファーにて１：１００に希釈し、各ウェルに５０μｌずつ添加した後、４℃で２０分間反応させた。続いて、分析バッファーで細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳで再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、２％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（１：１（ｖ／ｖ））で固定した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）で測定して、ｆｌｏｗＪｏデータ分析ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、米国）を利用してデータを分析した。その結果を図５に示す。

図５に示すように、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、ＦＰＲ２が形質注入されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞に特異的に結合し、コチニン−ＷＫＹＭＶＭ−ＮＨ_２の濃度が増加するほど結合力が増加することが分かった。

一方、ベクターが形質注入されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞には、前記複合体が結合しないことを確認した。また、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／非特異的ＩｇＧ複合体およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体もやはり、ＦＰＲ２が形質注入されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞に結合しないことを確認した。

＜試験例３：コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗体複合体のＷＫＹＭＶＭ−ＮＨ_２ペプチドに対する機能的活性を保持するか否かの測定（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ）＞
（３−１）細胞内カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ）の濃度変化
細胞内のカルシウムの濃度（［Ｃａ^２＋］ｉ）は、Ｆｕｒａ−２／ＡＭを利用したＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚの方法（文献［Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６０，ｐ３４４０−３４５０ １９８５］参照）を用いて測定した。

ヒト末梢血からデキストラン沈降（ｄｅｘｔｒａｎ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、赤血球の低張性溶解（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）およびリンパ球分離培地勾配（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を利用して好中球を新鮮に分離した。その後、これに４ｍＬの新鮮な無−血清ＲＰＭＩ１６４０に希釈した３μＭのＦｕｒａ−２／ＡＭを添加し、３７℃で５０分間持続的に攪拌しながら培養した。無−血清ＲＰＭＩ１６４０により３回洗浄した後、１ｍｌの無−Ｃａ^２＋Ｌｏｃｋｅ溶液（１５４ｍＭのＮａＣｌ、５．６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．３］、１０ｍＭのグルコースおよび０．２ｍＭのＥＧＴＡ）に２×１０^６個の細胞を分注した。分注した細胞にＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（１ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（１ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（１ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ複合体（モル濃度２：１）をそれぞれ添加した。

このとき、比較群として、非特異的ペプチドであるｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（１００ｎＭ）、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（１００ｎＭ）、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（１００ｎＭ）／５０ｎＭ抗−コチニンＩｇＧをそれぞれ処理した実験群を使用した。

ＲＦ−５３０１ＰＣ分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、日本）を用いて３４０ｎｍと３８０ｎｍの２つの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）波長に対する５００ｎｍでの蛍光値（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。その結果を図６に示す。この時、細胞内カルシウム濃度の増加は、３８０ｎｍ励起効率（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に対する３４０ｎｍ励起効率の蛍光値比の増加を示す。

図６に示すように、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、濃度依存性（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｉｅｓ）が類似であった。また、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２のように細胞内カルシウム濃度の増加を強く誘導している。一方、ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、特異的なカルシウムの如何なる増加も示さなかった。

（３−２）スーパーオキシドの発生（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）
スーパーオキシドの発生は、スーパーオキシドに依存的なシトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃの還元値を測ることにより測定することができる（文献［Ｂａｅ ｅｔ． ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９７，ｐ２８５４−２８６２，２００１］を参照）。

具体的に、ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０^６個に分注したヒト好中球を３７℃、５０μＭのシトクロムｃで１分間全培養した後、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）、およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（モル比２：１）とそれぞれ反応させた。

この際、比較群として、ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）、およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（モル比２：１）をそれぞれ処理した実験群を使用した。

シトクロムｃ還元による５５０ｎｍにおける吸光度の変化を、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，ＥＬ３１２ｅ，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、１分間隔で５分間測定した。０分における吸光度値を以後の測定値の吸光度から引いて算出した後、吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）である０．０２２μＭ^−１ｃｍ^−１で割ることにより、ナノモル（ｎａｎｏｍｏｌｅ）単位で示した。その結果を図７に示す。

図７に示すように、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、濃度−依存度が似ていて、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２のように、スーパーオキシド発生を強力に誘導することを確認した。一方、ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２接合体およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、特異的スーパーオキシドの如何なる発生も示さなかった。

（３−３）走化性（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）分析
ヒト好中球を１×１０^６／ｍｌでＲＰＭＩ１６４０培地に分注した後、マルチウェルチャンバー（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、米国）の上部ウェルに前記細胞懸濁液２５μｌを添加した（文献［Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、９７、ｐ２８５４−２８６２、２００１］を参照）。マルチウェルチャンバーの上部ウェルは、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭ）、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭ）およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（モル比２：１）が含まれている下部ウェルと、３μｍのポリ炭化水素フィルター（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）とによって分離されている。

この際、比較群として、ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２（０ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（モル比２：１）をそれぞれ処理した実験群を使用した。

３７℃で９０分間静置した後、移動していない細胞をスクラッピング（ｓｃｒａｐｉｎｇ）で除去した後、フィルターを介して移動した細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを添加して一晩固定した。固定されたフィルターを、９０％、８０％および７０％のエタノールおよび脱イオン水の順に処理した後、空気中で乾燥させて、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を利用して乾燥されたフィルターを染色した。各ウェルからの染色された細胞は、ｈｉｇｈ−ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄｓ（４００×）においてランダムに５回選択されカウントされた。その結果を図８に示す。

図８に示すように、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、類似の濃度−依存度を示し、好中球の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を強く触発した。一方、ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２、コチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２接合体およびコチニン−ｗｋｙｍｖｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、どのような特異的細胞の移動も示さなかった。

＜試験例４：コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２とコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の薬物動態試験＞
４週〜６週齢の雄の野生型アルビノＩＣＲマウス（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ Ｉｎｃ． 韓国）に、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０．５ｍｇ／ｋｇ）、およびコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０．５ｍｇ／ｋｇ）／抗−コチニンＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）複合体をそれぞれ１００μｌのＰＢＳで希釈し、尾静脈に注射した。

コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２を注射したマウスの場合、注射後０、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１６、２０および２４時間の時に眼窩静脈叢採血を実施して末梢血を得て、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体を注射したマウスの場合、注射後０、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間の時には眼窩静脈叢採血を実施して末梢血を得た。各末梢血を、常温で３０分間静置した後、８００×ｇで１５分間遠心分離し上清液のみを集めて血清を得て、各血清をフローサイトメトリー用いて分析した。

それぞれの血清を分析バッファー（１％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）ｉｎ ＰＢＳ）により希釈した後、２００ｎＭの抗−コチニンＩｇＧを同量加えて、血清中のコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２がすべて抗−コチニンＩｇＧと複合体とを形成するようにして、測定できるようにした。

ＦＰＲ２形質注入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞１×１０^５個を、前記混合物と４℃で３０分間反応させた。その後、分析バッファーで２回洗浄した後、ＦＩＴＣが標示されたモノクローナル抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を分析バッファーにより１：１００で希釈し各ウェルに添加して、４℃で２０分間反応させた。

細胞を分析バッファーで２回洗浄した後、ＦＩＴＣが標示されたモノクローナル抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を分析バッファーにて１：１００で希釈し各ウェルに５０μｌずつ添加した後、４℃で２０分間反応させた。細胞を分析バッファーにて２回洗浄した後ＰＢＳで再懸濁し、２％のパラホルムアルデヒド（１：１（ｖ／ｖ））で固定して、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）で測定した後、ｆｌｏｗＪｏデータ分析ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、米国）を用いて、データを分析した。その結果を図９に示す。

図９に示すように、平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の値を比較して見ると、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体を注射したマウスの血清の場合、約８時間の間そのピークの半分よりも高く維持されて、１６時間の間バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）よりも高く維持された。一方、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２を注射したマウスの血清は、１時間が経過するとバックグラウンドよりも低くなることが分かった。

＜試験例５：抗−コチニンＩｇＧの薬物動態試験＞
４週〜６週齢の雄の野生型アルビノＩＣＲマウス（ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ Ｉｎｃ． 韓国）に、抗−コチニンＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）を１００μｌのＰＢＳで希釈して尾静脈に注射した後、０、１、３、６、１２時間目、および１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、２８日目の時に眼窩静脈叢採血を実施して末梢血を得た。各末梢血を、常温で３０分間静置した後、８００×ｇで１５分間遠心分離し上清液のみを集めて血清を得て、血清中の抗−コチニンＩｇＧ量を測定するためにＥＬＩＳＡを行った。

９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、ＰＢＳに溶解した５μｇ／ｍｌのコチニン−ＢＳＡを用いて４℃で一晩中コーティングしＰＢＳＢ（３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ）でブロッキングした。前記で得られた血清をＰＢＳＢに希釈（１：１０乃至１：１０００）した後、コーティングされた各ウェルに５０μｌずつ添加した。続いて、常温で１時間放置して、ＰＢＳ−Ｔ（０．０２％ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した。各ウェルにＡＢＴＳ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＡＢＴＳ溶液、シグマ）を基質として用いてＨＲＰが結合された羊（ｓｈｅｅｐ）抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、常温で３０分間放置した後、４０５ｎｍにおける光学密度を測定した。その結果を図１０に示す。

図１０に示すように、抗−コチニンＩｇＧの血清中半減期は６日以上であることが分かった。

＜試験例６：マウス敗血症モデルにおけるコチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体の治療効果＞
ＩＣＲマウスを２ｃｍ腹壁切開し盲腸を取り出して、回盲弁（ｉｌｅｏｃｅｃａｌ ｖａｌｖｅ）直下にて２５％の盲腸を結紮し、２２ゲージ（ｇａｕｇｅ）の針で一回貫通した後大便が腹腔内に出てくるように処置した。腹壁の筋肉および皮膚層を縫合した。シャム−手術を施した（Ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）マウス実験群は、腹壁を２ｃｍ切開して盲腸を取り出した後、何の処置も行わずに腹腔内に再び戻した。ＣＬＰを施したマウスを、各グループ当り２０匹ずつ６グループに分け、ＣＬＰの後２時間後から１２時間間隔で２日間、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０．４ｍｇ／ｋｇおよび０．０４ｍｇ／ｋｇ）／抗−コチニンＩｇＧ（１８ｍｇ／ｋｇおよび１．８ｍｇ／ｋｇ）複合体の実験群、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２（０．４ｍｇ／ｋｇ）実験群、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２単独（０．２ｍｇ／ｋｇ）実験群、抗−コチニンＩｇＧ（１８ｍｇ／ｋｇ）単独実験群およびＰＢＳビヒクル対照群（全１００ｕｌを投与）をそれぞれ尾静脈に注入し、飼育施設に入れて水と飼料を与え１０日間観察した。続いて生存率を分析し、その結果を図１１に示す。

図１１に示すように、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２／抗−コチニンＩｇＧ複合体を注入した実験群では８０％程度の生存率を示した。これは、コチニン−ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２実験群の生存率（４０％）、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２実験群の生存率（４５％）、およびＰＢＳビヒクル対照群の生存率（２０％）に比べ相対的に改善されたことであることが分かった。

＜試験例７：コチニン−ペガプタニブおよびコチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の薬物動態試験＞
４週〜６週齢の雄の野生型ＩＣＲマウスに、コチニン−ペガプタニブ（０．１３５ｍｇ／ｋｇ）およびコチニン−ペガプタニブ（０．１３５ｍｇ／ｋｇ）／抗−コチニンＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ）複合体をそれぞれ１００μｌのＰＢＳに希釈し尾静脈に注射した。０、０．５、１、１．５、および２時間後に眼窩静脈叢採血を施しそれぞれの末梢血を得て、常温で３０分間静置した後、８００×ｇで１５分間遠心分離し、上清液のみを集めて血清を得た後、ＥＬＩＳＡにより分析した。

９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルをＰＢＳに溶解した５０ｎｇのヒトＶＥＧＦを用いて４℃で一晩コーティングしＰＢＳＢでブロッキングした。その後、それぞれの血清をＰＢＳＢに１：１００で希釈した後、１００ｎＭの抗−コチニンＩｇＧと一緒に各ウェルに添加した。常温で１時間放置しＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰが結合されたウサギ（ｒａｂｂｉｔ）抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加し、常温で１時間放置した。次いで、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（３、３’、５、５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として添加し、常温で１５分間放置した後６５０ｎｍにて光学密度を測定した。その結果を図１２に示す。

図１２に示すように、コチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の血清中半減期がコチニン−ペガプタニブに比べて相当増加したことが分かった。また、０時間での濃度もやはり大きいが、これは、コチニン−ペガプタニブは体内に入って来るなり分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される反面、コチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体で注射する場合、コチニン−ペガプタニブの急激な分解を阻害することが予測できた。

＜試験例８：コチニン−アプタマー／抗−コチニンＩｇＧの生物学的分析＞
（８−１）コチニン−アプタマー／抗−コチニンＩｇＧ細胞表面のヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）に対するコチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体の結合
Ｒａｊｉ（ヒトバケットリンパ腫、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）細胞を各ウェル当たり１×１０^５個の細胞で分注した後、コチニン−ＡＳ１４１１（１、１０、５０および１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（１００ｎＭ）複合体を５０ｕｌ／ｓａｍｐｌｅの量で処理し、４℃で２０分間反応させた。その後の分析バッファー（１％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）ｉｎ ＰＢＳ）により２回洗浄した後、ＦＩＴＣが標示されたモノクローナル抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を分析バッファーに１：１００で希釈し各ウェルに添加し、４℃で１５分間反応させた。

このとき、比較群として非特異的アプタマーであるＣＲＯ２６（ＳＴ Ｐｈａｒｍ．韓国）を用いて調製したコチニン−ＣＲＯ２６／抗−コチニンＩｇＧ複合体、および対照抗体として非特異的抗体であるパリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｅｎｔ、英国）を用いて調製したコチニン−ＡＳ１４１１／パリビズマブ複合体を用いて、前記と同様の方法で行った。

また、ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌとして、細胞にＦＩＴＣが標示されたモノクローナル抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のみを反応させ、その後の反応は前記と同じ方法で行った。

上記で得られた細胞を分析バッファーで２回洗浄した後ＰＢＳで再懸濁し、２％のパラホルムアルデヒド（１：１（ｖ／ｖ））で固定した。その後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）で測定した後、ｆｌｏｗＪｏデータ解析ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、米国）を用いてデータを分析した。その結果を図１３および図１４に示す。

図１３に示すように、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、コチニン−ＡＳ１４１１の濃度が増加するにつれ、細胞表面のヌクレオリンに対する結合力が高くなった。一方、非特異的アプタマー（ＣＲＯ２６）または非特異的抗体（パリビズマブ）を含む複合体の場合、ヌクレオリンに対する結合力は観察されなかった。

また、図１４に示すように、ヒト肝細胞癌の癌細胞（ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨｅｐＧ２）、ヒト膠芽腫の細胞（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｕ８７ＭＧ）、およびマウス胚線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＮＩＨ３Ｔ３）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）に対してコチニン−ＡＳ１４１１（５０ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（１００ｎＭ）複合体を処理して細胞間のヌクレオリン発現率の差を確認した。その結果、Ｒａｊｉ細胞に比べてＨｅｐＧ２細胞およびＵ８７ＭＧ細胞は強力な結合を示す反面、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は弱い結合を示すことが分かった。

（８−２）コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体を用いたウェスタンブロット
Ｒａｊｉ細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２５ｍＭ合成デキストローズコンプリート培地（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１μｇ／ｍＬアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、１μｇ／ｍＬロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、および１μｇ／ｍｌのペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａ）を入れ、音速ディスメンブレーターモデル５００（ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒｍｏｄｅｌ５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）機械を用いて放出セッティング（ｏｕｔｐｕｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）７の条件で１０秒ずつ３回音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）をした。１７，０００×ｇで１０分間遠心分離し上清液のみを集め、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ、 Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を行い、濃度を測定した。

溶解物５０μｇを、４×ＳＤＳローディングバッファー（５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｐＨ７．３）を入れ９５℃で１０分間沸騰させタンパク質を変性させた後、４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してニトロセルローズ膜（Ｗｈａｔｍａｎ、ドイツ）でタンパク質を移動させた。以後、５％のスキムミルク（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を含むＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）において、常温で３０分間振りながら培養し、コチニン−ＡＳ１４１１（１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（５０ｎＭ）複合体とともに常温で２時間振りながら培養した。

この際、比較のために、ブロッキングバッファーに１：１００で希釈したマウス抗−ヌクレオリンＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を用いて上記実験と同じ実験を繰り返した。

また、比較群としてコチニン−ＡＳ１４１１（１００ｎＭ）／非特異的抗体（パリビズマブ）（５０ｎＭ）複合体とコチニン−ＣＲＯ２６（１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（５０ｎＭ）複合体との実験群を使用した。

膜をＴＢＳＴにより３回洗浄した後、ＨＲＰが結合されたウサギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＨＲＰが結合された抗−マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＴＢＳＴに１：５，０００で希釈して添加し、常温で１時間振りながら培養した。膜をＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｗｅｓｔ化学発光基質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加してタンパク質バンドを可視化した。その結果を図１５に示す。

図１５に示すように、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体を処理したレーン１では、１００ｋＤａの完全長のヌクレオリンバンドだけでなく、４０ｋＤａ以下においてもいくつかのバンドが観察された。これは、従来の報告によると、ヌクレオリンの自己分解活性（ａｕｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）によってヌクレオリンが切断されて生じる小さいサイズの断片であり、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体が完全長だけでなく、小さい断片までも検出できることを示している。

一方、レーン４のマウス抗−ヌクレオリンＩｇＧは、完全長のヌクレオリンのみ検出可能であった。比較群であるレーン２のコチニン−ＡＳ１４１１（１００ｎＭ）／パリビズマブ（５０ｎＭ）複合体と、レーン３のコチニン−ＣＲＯ２６（１００ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、どのようなバンドも観察できなかった。

（８−３）コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体を利用したヌクレオリンの免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）の可否確認
Ｒａｊｉ細胞溶解物１ｍｇを、コチニン−ＡＳ１４１１（４０ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（２０ｎＭ）複合体、コチニン−ＣＲＯ２６（４０ｎＭ）／抗−コチニンＩｇＧ（２０ｎＭ）複合体、およびコチニン−ＡＳ１４１１（４０ｎＭ）／非特異的抗体（２０ｎＭ）複合体とともに４℃で一晩中回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）させながら放置した。

タンパク質Ａ−セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズを各サンプルに４０μｌずつ入れて回転させながら４℃で２時間放置した後、８００×ｇで１分間遠心分離した。その後、免疫沈降されたペレットを、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）により３回洗浄した。４×ＳＤＳローディングバッファーを入れ、９５°Ｃで１０分間沸騰させタンパク質を変性させた後、免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）を実施した。１次抗体として、マウス抗−ヌクレオリンＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を０．２％ＴＢＳＴに１：１００で希釈して添加し常温で２時間放置して、２次抗体として、ＨＲＰが付いているウサギ抗−マウスＩｇＧを１：５，０００に希釈して添加し常温で１時間放置した。膜を洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｗｅｓｔ化学発光基質を添加してブロットを可視化した。その結果を図１６に示す。

図１６に示すように、第１レーンのコチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体をもって免疫沈降した場合、１００ＫＤａにおいてヌクレオリンのバンドが確認される反面、第２レーンのコチニン−ＣＲＯ２６／抗−コチニンＩｇＧ複合体、および第３レーンのコチニン−ＡＳ１４１１／非特異的抗体をもって免疫沈降した場合は、バンドが確認されなかった。これから見ると、コチニン−ＡＳ１４１１／抗−コチニンＩｇＧ複合体がＲａｊｉ細胞の溶解物において正常にヌクレオリンを免疫沈降したことが分かった。

（８−４）ＶＥＧＦに対するコチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の特異的結合力の測定
９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルをＰＢＳに溶解した５０ｎｇのヒトＶＥＧＦを用いて４℃で一晩中コーティングしＰＢＳＢによりブロッキングした。１００ｎＭコチニン−ペガプタニブ／５０ｎＭの抗−コチニン抗体複合体をＰＢＳＢに希釈した後、１０倍ずつ希釈してコーティングされた各ウェルに５０μｌずつ添加した。続いて、常温で１時間放置し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。この際比較のために、ＶＥＧＦに対する抗体である１００ｎＭベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）を前記複合体の代わりに用いて、上記と同じ実験を繰り返した。

その後、各ウェルにＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、ＨＲＰが結合されたウサギ（ｒａｂｂｉｔ）抗−ヒトＦｃ特異的ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して常温で１時間放置した後、６５０ｎｍにて光学密度を測定した。その結果を図１７に示す。

図１７に示すように、コチニン−ペガプタニブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体は、ＶＥＧＦに対して０．１ｐＭ〜１，０００ｐＭ区間においてコチニン−ペガプタニブの濃度−依存的やり方で結合力が増加した。これは、抗−ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブの濃度−依存的な方式のＶＥＧＦに対する結合度と類似していた。

＜試験例９：コチニン−アブシキシマブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体の反応性＞
（９−１）コチニン−アブシキシマブ／抗−コチニンＩｇＧ複合体、コチニン−アブシキシマブ、およびアブシキシマブの反応性を確認するための酵素−リンクされた酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
０．００１ｎＭ〜１０００ｎＭのアブシキシマブおよびコチニン−アブシキシマブを用いて、インテグリンアルファ２ｂベータ３に対する反応性を測定した。この時、１ｕＭの抗−コチニンＩｇＧ抗体を使用した。

具体的に、２０μｌの金属バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、 １３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｌ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２および１ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ７．５）に溶解した１００ｎｇのインテグリンアルファ２ｂベータ３を各ウェルに添加した後、３７℃で２時間培養することにより、９６−ウェルの半分（ｈａｌｆ−ａｒｅａ）マイクロタイタープレートのウェルをインテグリンアルファ２ｂベータ３でコーティングした。前記ウェルを１５０μｌのＰＢＳＢ（ＰＢＳ中にＢＳＡ３％）によって３７℃で１時間ブロッキングした。抗−コチニン抗体を含むか、または含まないアブシキシマブ／コチニンおよびアブシキシマブを３％のＰＢＳＢ中で様々な濃度に調節して、最終の５０μｌを各ウェルに適用した。前記プレートを３７℃で１時間培養して０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により３回洗浄した後、抗−ヒトＦｃ−ＨＲＰおもって処理しコチニン−アブシキシマブ／抗−コチニンＩｇＧ抗体の複合体を検出し、抗−ヒトＦａｂ−ＨＲＰをもって処理してコチニン−アブシキシマブおよびアブシキシマブをそれぞれ検出した。３７℃で４５分間培養して０．０５％ＰＢＳ−Ｔにより４回洗浄した後、各ウェルを１００μｌのＡＢＴＳ基質の溶液をもって３７℃で３０分間培養し、４０５ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図１８に示す。

図１８に示すように、本発明のコチニン−アブシキシマブ／抗−コチニン抗体複合体は、インテグリンアルファ２ｂベータ３に対してアブシキシマブと同じ反応性を保持することが分かった。

（９−２）コチニン−アブシキシマブ／抗−コチニン抗体複合体のヒトの血小板に対する特異的結合試験
０、５ｎＭおよび５０ｎＭのコチニン−アブシキシマブを、０、０．１μＭと１μＭの抗−コチニン抗体で活性化されたヒト血小板に処理した後、抗−ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を１：７５に希釈した後、血小板に処理し２０分間培養した。続いて得られた細胞を、前記試験例８と同様にフローサイトメトリーにより分析した。

具体的には、１．５ｍｌの血液を０．８４ｍｌの酸−クエン酸−デキストロース（ＡＣＤ）および１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５ｍｌバキュテナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブに集めた。前記血液を遠心分離管に移動した後、常温において２５０×ｇで１０分間回転させた。多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）を新しいチューブに移動した後、常温において１５００ｒｐｍで１０分間回転させた。上清液を除去し、血小板を１ｍｌのタイロードバッファ（Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．２％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）により洗浄した。１５００ｒｐｍで７分間の遠心分離後、上清液を除去し、ペレットを０．１％ＢＳＡで補充された金属バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｌ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２および１ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ７．５）３００μｌにおいて再懸濁した。調製されたＰＲＰ懸濁液５０μｌをＦＡＣＳ分析に適用した。様々な濃度のアブシキシマブ−コチニン２５μｌ、および抗−コチニン抗体またはシナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ、登録商標）２５μｌを、０．１％ＢＳＡ補充済みの金属バッファー中において常温で４５分間適用した。同じバッファーにより２回洗浄した後、０．１％ＢＳＡで補充された金属バッファー５０μｌに１ｕｇ／ｍｌ濃度で２次抗体、抗−ヒトＦｃ−ＦＩＴＣを適用し、癌の条件下の常温において３０分間放置した。続いて、得られた細胞を同じバッファーにより２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳにより再懸濁した。２つの細胞株を、ＦＡＣＳｃａｎ蛍光活性化細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて蛍光分析を行った。その結果を図１９に示す。

このとき、陰性抗体対照群としては、シナジスを抗−コチニン抗体と同じ濃度で処理し、陽性対照群としては、アブシキシマブ（０ｎＭ、５ｎＭおよび５０ｎＭ）を使用した。

図１９に示すように、コチニン−アブシキシマブ／抗−コチニン抗体複合体は、血小板に対してアブシキシマブと同じ反応性を維持し、コチニン−アブシキシマブまたは抗−コチニン抗体の濃度が増加するにつれ、結合度もやはり増加することが分かった。一方、抗−コチニン抗体（１０ｕＭ）処理されたＦＢＬ−コチニンは血小板に結合しなかった。

＜試験例１０：コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体の反応性＞
（１０−１）コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体のＭＣＦ−７およびＳＫ−Ｂｒ−３細胞に対する特異的結合試験
具体的には、ＳＫ−Ｂｒ−３またはＭＣＦ−７細胞（インスリン受容体陽性乳癌細胞株）（ＡＴＣＣ、米国）（１×１０^６／反応）をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム）により３回洗浄した。様々な濃度（０ｎＭ〜５０００ｎＭ）のコチニン−インスリン２５μｌ、および抗−コチニン抗体（１０００ｎＭ）またはシナジス（１０００ｎＭ）２５μｌを、ＦＡＣＳバッファー中において常温で４５分間適用した。このとき、シナジスは、陰性抗体対照群として使用した。ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファー５０μｌ中で２次抗体である抗−ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ １μｇ／ｍｌを適用し、癌の条件下の常温において３０分間放置した。次いで細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＢＳ１００μｌ中において再懸濁した。２つの細胞株を、ＦＡＣＳｃａｎ蛍光活性化細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーで蛍光分析を行った。その結果を図２０Ａに示す。

一方、５０００ｎＭのコチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体、およびコチニン−陰性ペプチド／抗コチニン抗体複合体を用いて前記と同様の方法で抗−ヒトＦｃ−ＦＩＴＣを用いて培養した後、フローサイトメトリーで分析した。この時、コチニン−陰性ペプチド接合体としては、卵胞Ｂリンパ球（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）結合ペプチドであるコチニン−ＦＢＬ（配列番号：１９）接合体、アペリン受容体（ａｐｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合ペプチドであるコチニン−Ａ１３（配列番号：２０）接合体、およびコチニン−Ｆ１３Ａ接合体（配列番号：２１）を用いた。（ＳＴ Ｐｈａｒｍ、韓国）、その結果を図２０Ｂに示す。

図２０に示すように、インスリン−コチニン／抗−コチニン抗体複合体は、インスリン受容体を発現する細胞に対して正常に結合することから、前記複合体がインスリンの受容体結合力を保持していることが分かった。

（１０−２）コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体のヒト補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の分析
補体依存細胞毒性分析を行うために、コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体を細胞可視インジケータ（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）のＷＳＴ−１（タカラ）を用いてテストした。

具体的には、インスリン受容体を発現するＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ、米国）を分析培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ）により洗浄し、１×１０^５／ｍｌに希釈した。前記細胞懸濁液１００μｌを、滅菌９６−ウェル組織培養プレート中において各ウェルに投入し、５％ＣＯ_２インキュベーター内において３７℃で一晩培養して細胞がよく付着するようにした。前記細胞から分析培地を除去した後、２５μｌコチニン−インスリン、２５μｌの様々な濃度（０ｕＭ、０．１ｕＭおよび１ｕＭ）の抗−コチニン抗体、および５０μｌの１／１２ヒト補充希釈剤（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を含むウェルセットを３７℃および５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて培養してヒト補体−媒介細胞溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）を促進させた。一晩培養した後、１０μｌのＷＳＴ−１（Ｔａｋａｒａ）を各ウェルに添加し、３７℃で３時間追加培養してから、４５０ｎｍにて吸光度を測定した。１％トリトンＸ−１００および培地を、ヒト血清とともに高−対照群（ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒｏｌ）および低−対照群（ｌｏｗ−ｃｏｎｔｒｏｌ）の細胞にそれぞれ適用した。また、コチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体を、ヒト血清とともに細胞なしでウェルに適用したものを補完対照群（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。それぞれの分析を３回ずつ行い、その結果を図２１に示す。高−対照群は１％トリトンＸ−１００によって細胞が１００％死滅した場合を意味し、低−対照群は補体による細胞死滅が誘導されていない場合を意味し、バッファー対照群（ｂｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、他の条件に関係なくバッファーによる結果の違いがあるか否かを確認するための場合を意味する。

図２１に示すように、本発明のコチニン−インスリン／抗−コチニン抗体複合体は、乳癌細胞を過発現させるインスリン受容体に対して特異的な細胞毒性剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）として作用させる抗−コチニン抗体のヒト補体依存細胞毒性能力を保持させることが分かった。

＜試験例１１＞
ヒト補体Ｃ５（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ５）に結合力を有する免疫グロブリンエクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）のアミノ酸配列（ＵＳ６，３５５，２４５ Ｂ１）から、ＶＨ、ＶＬ配列のみを用いてｓｃＦｖを組み合わせて、これをｃｏｔｉｎｉｂｏｄｙ（コチニンに結合する抗体ＳｃＦｖ）の最初のｓｃＦｖに位置するようにした。このベクターを２９３Ｆ細胞株に形質転換させタンパク質を発現させた後、細胞培養液から抗体を精製するためにプロテインＡアガロース（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｇａｒｏｓｅ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。ヒト血清を１／１０、１／２０、１／４０、１／８０（レーン１、２、３、４）希釈したもの２０μＬと、精製されたヒト補体Ｃ５ １００ｎｇ（レーン５）とをＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施し、電気泳動を行ったタンパク質をニトロセルローズメンブレンに伝導させた。ヒト補体Ｃ５−ｃｏｔｉｎｉｂｏｄｙタンパク質を、２μｇ／ｍＬになるように５％スキムミルク入りトリス緩衝生理食塩液（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に希釈した後、メンブレンに接触した状態で４℃、１６時間反応させた。メンブレンは、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０が含まれたＴＢＳ溶液をもって洗浄し、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅが結合されたコチニンを１／１０００希釈した溶液を、常温で２時間メンブレンと反応させた。その後、メンブレンを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０が含まれているＴＢＳ溶液により洗浄し、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）物質を処理した後フィルムに感光した。ヒト補体Ｃ５−ｃｏｔｉｎｉｂｏｄｙが選択的にヒト補体Ｃ５に結合することを確認した（図２３）。

本発明を前記具体的実施例に関連して記述したが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で当分野の熟練者は、本発明を多様に改変および変化させることができる。

Claims (13)

1. コチニンと接合物質との接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体であって、
   前記接合物質がペプチド、アプタマー、抗体、ホルモン、および化学物質からなる群より選択されることを特徴とする複合体。
2. 前記接合物質は、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ_２ペプチド、ＡＳ１４１１アプタマー、ペガプタニブ、アブシキシマブおよびインスリンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
3. 前記接合物質は、コチニンとＰＥＧリンカーまたはアミノＣ６リンカーで接続されることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
4. 前記接合体は、抗−コチニン抗体の抗原結合部位に結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
5. 前記抗−コチニン抗体は、前記抗体と、Ｆａｂ、ＳｃＦｖおよびドメイン抗体から選択される抗体分節と、前記抗体および抗体分節とを構成成分として含んでいる複合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
6. 前記接合物質の生体内半減期（ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
7. 補体依存性毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を有することを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
8. 抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）を有することを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
9. 生体外生物学的分析方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ）において、コチニンと接合物質との接合体を分析ツールとして用いることを特徴とする方法であって、
   前記接合物質がペプチド、アプタマー、抗体、ホルモン、および化学物質からなる群より選択されることを特徴とする方法。
10. 前記生体外の生物学的分析方法は、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット分析法、免疫沈降分析法および酵素−リンクされた免疫化学分析法からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. コチニンと接合物質との接合体に抗−コチニン抗体が結合した複合体の製造方法であって、
    前記接合物質をコチニンと結合させた複合体に前記抗−コチニン抗体を結合させることを含み、
    前記接合物質がペプチド、アプタマー、抗体、ホルモン、および化学物質からなる群より選択されることを特徴とする、製造方法。
12. 前記接合物質の生体内半減期（ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
13. 前記接合物質は、ＷＫＹＭＶｍ−ＮＨ _２ ペプチド、ＡＳ１４１１アプタマー、ペガプタニブ、アブシキシマブおよびインスリンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。