KR102506288B1 - 디그옥시제닌에 대한 항체를 포함하는 복합체, 및 이들의 용도 - Google Patents

디그옥시제닌에 대한 항체를 포함하는 복합체, 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시는 디그옥시제닌과 접합 물질의 접합체에 항-디그옥시제닌 항체가 결합된 복합체, 해당 복합체를 제조하는 방법 및 해당 복합체의 용도에 관한 것이다. 본 개시의 일측면에 따른 디그옥시제닌을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 항원결합 단편; 및 디그옥시제닌과 생리활성 물질 또는 검출 표지를 포함하는 접합체(Drug- conjugated Oligomer; DOligomer)를 포함하는 복합체(Drug-conjugated Oligobody; DOligobody)를 통하여 필요에 따라 생리활성 물질 또는 검출 표지의 인체 내 농도를 조절하거나 약물의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

디그옥시제닌에 대한 항체를 포함하는 복합체, 및 이들의 용도 {A complex comprising an antibody to Digoxigenin and use thereof}
본 개시는 디그옥시제닌과 접합 물질의 접합체에 항-디그옥시제닌 항체가 결합된 복합체, 해당 복합체를 제조하는 방법 및 해당 복합체의 용도에 관한 것이다.
화합물, 리간드, 세포 독성물질 등 다양한 생리활성 성분들이나 검출 표지들은 체내에서 분해되거나 다른 성분으로 전환되는 등 다양한 기작을 통해 효능를 상실하게 된다. 특히 대다수의 물질들이 분해되어 신장을 통해 배출됨으로써 효능이 상실되기 때문에, 생체내 반감기를 증가시켜 생리활성 성분들이나 검출 표지들의 생체 이용률을 증진시키기 위한 연구가 계속 진행되고 있다.
이와 관련하여, 항체와 약물의 접합체(antibody-drug conjugate)를 개발하는 시도가 있어 왔다. 예를 들어 목적하는 조직이나 세포, 단백질 등에 결합하는 항체에 해당 조직 등에 전달하고자 하는 약물을 공유적으로 연결시켜 전달하는 것이다(Antibody-drug conjugates―an emerging class of cancer treatment. Nikolaos Diamantis, Udai Banerji. Br J Cancer. 2016 Feb 16; 114(4): 362-367.). 이러한 와중에 약물의 체내 반감기도 함께 증가시키기 위하여 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 접합시키는 시도도 함께 진행되어 왔다(PEGylation, successful approach to drug delivery. Francesco M. Veronese, Gianfranco Pasut. Drug Discovery Today. 2005 Nov 1; 10(21): 1451-1458.).
그러나 항체나 폴리에틸렌글리콜에 직접 연결되어 목적 조직이나 세포 등에 도달한 약물은 이들과 연결된 형태로는 매우 큰 분자가 되기 때문에 모세혈관을 투과하여 원하는 조직 안쪽까지 원하는 약물을 전달하는 것이 매우 어렵다. 이에 약물의 인체 내 체류시간을 증가시키고 동시에 목적하는 조직이나 세포 등에 약물을 잘 전달할 수 있는 새로운 형태의 약물 전달체를 개발할 필요성이 있다.
한편, 디그옥시제닌(Digoxigenin)은 디기탈리스(Digitalis purpurea)라는 식물로부터 추출되어 발견된 스테로이드의 일종으로, 디곡신(Digoxin)의 배당체에서 비당질부분인 아글리콘에 해당한다. 디그옥시제닌은 면역원성을 가지지 않는 물질인 합텐(hapten)으로 일반적으로 알려져 있으며, 이러한 성질을 이용해 분자생물학 분야에서 자주 활용된다.
디그옥시제닌은 다른 널리 사용되는 합텐인 2,4-다이나이트로페놀 (2,4-Dinitrophenol), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein) 등과 유사한 용도로 사용되며, 통상적으로 실험에서 단백질, 핵산 등과 같은 바이오 분자를 측정해내기 위해 해당 바이오 분자에 화학적으로 결합된다. 그 중 비오틴, 플루오레세인과 디그옥시제닌이 일반적으로 가장 많이 사용되는 합텐으로 알려져 있다.
비오틴은 아비딘(avidin)과의 결합으로 이들 중 가장 강한 결합력을 가진다는 장점이 있지만, 간과 같은 일부 조직이 내생(endogenous) 비오틴을 포함할 수 있기 때문에 아비딘과의 비특이적 결합이 생길 수 있는 단점이 있다.
또한, 플루오레세인 합텐의 경우 형광 현미경으로 결합된 바이오 분자를 직접 확인하거나 항-플루오레세인 항체를 이용하여 간접적으로 확인할 수 있는 장점이 있지만, 현미경을 사용하여 데이터를 볼 때 배경 문제가 발생할 수 있으며 신호가 오래 지속되지 않는다는 것이다.
한편, 디그옥시제닌이 분자생물학 분야 등에서 널리 사용되는 바, 이를 타겟하는 다양한 항체가 이미 상업화되어 있다. 높은 결합력과 특이적 결합성을 가지는 항-디그옥시제닌 항체는 다양한 생물학적 면역측정법(예를 들어, ELISA)에 사용된다. 항체는 물질의 가시화나 측정을 위해 직접 또는 간접적으로 염료, 효소 또는 형광물질로 표지된다.
이러한 측면에서 디그옥시제닌은 다양한 종류의 면역-표지로 사용되고, 특히나 in situ 혼성화(in situ hybridization) 실험을 위한 표준 면역 조직화학적 표지로 사용된다. 해당 실험에서 디그옥시제닌은 RNA 뉴클레오시드 삼인산의 특정 종(일반적으로 우리딘)에 접합되어 RNA에 포함된다.
한편, 분자생물학 분야에서 합텐의 용도로만 사용되고 있는 디그옥시제닌에 대한 항체에 대해서는 인체에서의 사용을 전제로 한 개질화는 이루어진 바 없다.
대한민국 등록특허 제10-1648960호 대한민국 등록특허 제10-1827962호
본 개시의 발명자들은 약물전달 시스템에서 체류시간을 증가시킬 수 있는 시스템을 검토하던 중 종래 생화학적 검출 수단으로 사용되던 디그옥시제닌에 주목하였고, 디그옥시제닌과 이에 대한 인간화 항체 시스템을 인체에 투여된 약물의 반감기를 증가시키는 약물전달 시스템 용도로 사용될 수 있음을 발견하였다. 이를 위해 종래의 항-디그옥시제닌 마우스 항체를 인간화한 항체로 개발하고 이를 이용한 약물전달 시스템을 구축하기 위해 예의 노력한 결과, 본 개시의 발명을 개발하여, 인체 반감기 증가 효과를 확인하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 개시의 일 측면은 항-디그옥시제닌 항체, 구체적으로 디그옥시제닌을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 항원결합 단편; 및 디그옥시제닌과 약물을 포함하는 접합체를 포함하는 복합체를 제공한다.
본 개시의 일측면에 따른 디그옥시제닌을 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 항원결합 단편; 및 디그옥시제닌과 생리활성 물질 또는 검출 표지를 포함하는 접합체(Drug- conjugated Oligomer; DOligomer)를 포함하는 복합체(Drug-conjugated Oligobody; DOligobody)를 통하여 필요에 따라 생리활성 물질 또는 검출 표지의 인체 내 농도를 조절하거나 약물의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1(도 1a 내지 도 1c)은 본 개시에서 제조한 마우스 항체 (mAb[21H8]), 키메라 항체 (chimeric[21H8]), 인간화 항체 (humab[21H8]-v1, humab[21H8]-v2, humab[21H8]-v3, humab[21H8]-v4, humab[21H8]-v5, humab[21H8]-v6, humab[21H8]-v7, humab[21H8]-v8, humab[21H8]-v9, humab[21H8]-v10, humab[21H8]-v11, humab[21H8]-v12, humab[21H8]-v13, humab[21H8]-v14, humab[21H8]-v15, humab[21H8]-v16)의 디그옥시제닌(DIG)과의 결합력을 ELISA 실험으로 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 개시에서 제조된 항체와 DIG-aptamer-MMAE 접합체를 결합시켜 복합체(Drug-conjugated Oligobody; DOligobody)의 구조를 표현한 도면이다.
도 3의 A는 디그옥시제닌과 압타머가 링커를 통해 연결된 화합물 구조(DIG-aptamer)에 대한 도면이고, B는 해당 DIG-aptamer에 MMAE이 결합된 DIG-aptamer-MMAE 접합체 구조에 대한 도면이다.
도 4는 합텐-압타머 화합물과 합성된 합텐-압타머-약물 접합체(DIG-aptamer-MMAE)의 순도를 역상(reversed-phase) 분석 HPLC를 이용하여 검출하여 분석한 도면이다. 구체적으로 도 4의 A는 합텐-압타머 화합물(DIG-SQ7-1(8)-SH)의 HPLC 분석 결과이고, 도 4의 B는 합텐-압타머-약물 접합체(DIG-SQ7-1(8)-MMAE)의 HPLC 분석 결과이다.
도 5는 합텐-압타머-약물 접합체 (DIG-aptamer-MMAE)의 췌장암 세포 사멸 효능을 확인한 것으로, 도 5a는 광학 현미경 이미징을 통해 확인하였고, 도 5b는 ATP assay를 통해 세포 사멸율을 확인한 결과 그래프이다.
도 6(도 6a 내지 도 6c)은 본 개시에서 제조된 항체와 DIG-aptamer-MMAE 접합체를 결합시켜 복합체(DOligobody)의 사람 췌장암 세포주인 CFPAC-1에 대한 결합력을 FACS 실험으로 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 FACS 결과를 바탕으로 본 개시의 복합체인 DOligobody의 결합률을 비교한 결과 그래프이다.
도 8은 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 약물동력학 실험의 개요를 설명한 개요도이다.
도 9는 디그옥시제닌과 압타머를 포함하는 접합체(DOligomer)와 humab[21H8]-v5 항체, humab[21H8]-v6 항체, 및 humab[21H8]-v8 항체의 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody에 대한 약물동력학 결과를 개시한 그래프이다.
도 10은 디그옥시제닌과 압타머를 포함하는 접합체(DOligomer)와 humab[21H8]-v5 항체, humab[21H8]-v6 항체, 및 humab[21H8]-v8 항체의 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody에 대한 약물동력학 결과를 통해 측정된 반감기를 정리한 표이다.
도 11은 humab[21H8]-v5 항체, humab[21H8]-v6 항체, 및 humab[21H8]-v8 항체의 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody에 대한 약물동력학 결과를 개시한 그래프이다.
도 12는 humab[21H8]-v5 항체, humab[21H8]-v6 항체, 및 humab[21H8]-v8 항체의 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody에 대한 약물동력학 결과를 통해 측정된 반감기를 정리한 표이다.
도 13a는 췌장암 동소이식 동물모델에 담체(Vehicle)를 투여하는 음성 대조군; 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody (DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8를 투여하는 실험군; 및 기존 항암제인 Gemcitabine을 투여하는 양성 대조군의 동물 실험의 조건과 췌장 종양 부피를 측정하는 방법을 설명한 도면이다. 도 13b는 상기 동소이식 동물모델의 실험에서 세포와 각 처리의 시기를 표시한 time frame 이다.
도 14는 췌장암 동소이식 동물모델에서 담체(Vehicle)를 투여하는 음성 대조군; 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody(DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8)를 투여하는 실험군; 및 기존 항암제인 Gemcitabine을 투여하는 양성 대조군의 췌장 종양의 크기(Luminesence intensity)를 5주간 IVIS 형광 이미징 장비를 통하여 측정한 도면이다. 도 14a는 IVIS 형광 이미징 장비를 통해 측정한 췌장 종양의 크기를 나타낸 그래프이고, 도 14b는 IVIS 형광 이미징 장비를 통해 30일차 음성 대조군, 실험군 및 양성 대조군에서 측정한 이미징 사진이다.
도 15a는 췌장암 동소이식 동물모델에서 담체(Vehicle)를 투여하는 음성 대조군; 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody (DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8)를 투여하는 실험군; 및 기존 항암제인 Gemcitabine을 투여하는 양성 대조군의 췌장 종양을 확인하기 위한 복부 MRI 측정 사진이고, 도 15b는 위에서 확인된 평균 췌장 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
도 16은 췌장암 동소이식 동물모델에서 담체(Vehicle)를 투여하는 음성 대조군; 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody (DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8)를 투여하는 실험군; 및 기존 항암제인 Gemcitabine을 투여하는 양성 대조군의 동물실험 종료 후, 췌장 조직을 적출하여 TUNEL assay를 수행한 결과를 보이는 도면이다.
도 17은 췌장암 동소이식 동물모델에서 담체(Vehicle)를 투여하는 음성 대조군; 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody (DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8)를 투여하는 실험군; 및 기존 항암제인 Gemcitabine을 투여하는 양성 대조군의 동물실험기간 동안 체중변화를 측정한 그래프이다.
도 18은 췌장암 동소이식 동물모델에서 담체(Vehicle)를 투여하는 음성 대조군; 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody (DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8)를 투여하는 실험군; 및 기존 항암제인 Gemcitabine을 투여하는 양성 대조군의 혈청으로 간독성지표(ALT, AST, TBIL)과 신장독성지표(BUN, CRE)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 18a는 각 투여군을 단회투여 후 3일 후 채취한 혈액을 분석한 결과이고, 도 18b는 각 투여군을 다회투여(5회) 후 채취한 혈액을 분석한 결과이다.
본 개시의 실시예 또는 일측면들은 본 개시의 기술적 사상을 설명하기 위한 목적으로 예시된 것이다. 본 개시에 따른 권리범위가 이하에 제시되는 실시예 또는 일측면들이나 이들에 대한 구체적 설명으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 개시에 기재된 본 개시의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 본 개시에 포함되는 것으로 의도된다.
본 개시에 사용되는 모든 기술적 용어들 및 과학적 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 개시에 사용되는 모든 용어들은 본 개시를 더욱 명확히 설명하기 위한 목적으로 선택된 것이며 본 개시에 따른 권리범위를 제한하기 위해 선택된 것이 아니다.
본 개시에서 사용되는 "포함하는", "구비하는", "갖는" 등과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 어구 또는 문장에서 달리 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 사용되는 해당 구성 "만으로 구성되는" 등과 같은 표현은, 해당 구성 외에 다른 구성을 포함할 가능성을 배제하는 폐쇄형 용어(closed-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 기술된 단수형의 표현은 달리 언급하지 않는 한 복수형의 의미를 포함할 수 있으며, 이는 청구범위에 기재된 단수형의 표현에도 마찬가지로 적용된다.
본 개시에서 "항체"는, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 항체는 동물 항체, 키메라(chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편, 예컨대, Fab 도 포함한다.
본 개시에서 "키메라 항체" 는, 항체 가변영역 (variable region) 또는 이의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이 항체의 나머지 부분과 상이한 동물에서 기원된 항체를 말한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 항체 가변 영역은 인간 이외의 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역 (constant region)은 인간에서 유래한 항체일 수 있다. 이러한 키메라 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 선택된 것일 수 있다. 상기 IgG 형태의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 예컨대 IgG1 또는 IgG2 서브타입 형태일 수 있다.
본 개시에 사용된, 항체 또는 면역글로불린의 사슬(중쇄 또는 경쇄)의 "항원 결합 단편"은 전장 사슬과 비교하여 일부 아미노산이 결여되었지만, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부를 포함하는 것이다. 이러한 항원 결합 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 또는 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 특정 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다는 측면에서 생물학적으로 활성이 있다고 할 수 있다. 구체적으로, 상기 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 이러한 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적 절단하여 생산될 수 있다.
본 개시에서 "중쇄" 는, 항원에 대한 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본 개시에서 "경쇄" 는, 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL 을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본 개시에서 "상보성 결정 영역" 은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본 개시에서 "항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 서열번호 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
e) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
f) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
g) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
h) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
i) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
j) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
k) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
l) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
m) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
n) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
o) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는
p) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편
일 수 있다.
본 개시에서 "인간화 항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 항체로, 비-인간 면역글로불린에서 항원에 대한 결합력을 결정하는 상보성 결정 영역(CDR)의 서열로 대체된 인간 면역글로불린이다. 한편, 상기 인간화 항체는 인간 면역글로불린 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 FR 잔기로 대체될 수 있고, 또는 비-인간 면역글로불린이나 인간 면역글로불린의 CDR 또는 FR 서열에서도 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형을 수행하여 항체 성능을 추가로 정력하고 최적화된 것일 수 있다. 일반적으로 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 영역과 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기가 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 잔기를 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 수 있다.
본 개시에서 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 개시는 일 측면에서 서열번호 2 내지 5, 또는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나와 약 80% 이상, 구체적으로 약 90% 이상, 보다 구체적으로는 약 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 약 97% 이상, 가장 구체적으로는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일하거나 상응하는 결합 활성을 가지는 항체를 구성하는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 개시의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 개시에서 "접합체"는, 디그옥시제닌과 다른 분자, 특히 후술하는 생리활성 물질 또는 검출 표지의 키메라 분자를 일컫는다. 본 개시에서 접합체는 디그옥시제닌과 다른 분자가 공유적으로 접합되어 있는 것을 의미하며, 상기 생리활성 물질은 예를 들어, 화학요법 약물, 효소, 펩타이드, 세포 독성물질(cytotoxin), 친화성 리간드일 수 있다. 구체적으로, 본 개시의 접합체는 디그옥시제닌과 생리활성 물질 또는 검출 표지가 압타머(aptamer)를 통해 공유적으로 접합되어 있을 수 있다. 공유적으로 접합된다는 의미는 분자들 간에 직접적으로 서로 공유결합된 것이거나, 링커, 스페이스, 연결 부분 등을 통하여 서로 간접적으로 공유 결합적으로 연결된다는 것을 의미한다. 본 개시의 디그옥시제닌과 생리활성 물질 또는 검출 표지가 결합된 접합체는 약물-결합 올리고머란 의미의 DOligomer(Drug-conjugated Oligomer)로도 지칭될 수 있다.
본 개시에서 압타머는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드로 높은 친화도와 특이성으로 대상 표적에 결합하는 특성을 가지며, 각기 독특한 3차원 구조를 가지는 것을 의미할 수 있다. 압타머는 목적으로 하는 표적 조직, 표적 세포, 표적 탄수화물, 표적 지질, 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 것으로, 해당 표적 조직, 표적 세포, 표적 탄수화물, 표적 지질, 또는 표적 단백질은 특정 병증에 특이적인 조직, 세포, 탄수화물, 지질, 또는 단백질일 수 있고, 예를 들어, 감염 조직, 감염 세포, 감염 특이적 탄수화물, 감염 특이적 지질, 감염 특이적 단백질; 염증 조직, 염증 세포, 염증 특이적 탄수화물, 염증 특이적 지질, 염증 특이적 단백질; 종양 조직, 종양 세포, 종양 특이적 탄수화물, 종양 특이적 지질, 또는 종양 단백질; 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시에서 압타머는 예를 들어, 암세포, 특히 췌장암 조직 또는 췌장암 세포에 결합하는 서열번호 11 내지 23 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.
한편, 압타머와 약물을 결합하는 기술은 본 개시가 속한 기술분야에서 다양하게 개발되어 왔다. 예를 들어, Gray, 등.(PNAS; 2018. 5. 1.; 115 (18) pp4761-4766)에서는 압타머(E3; RNA)와 MMAE/MMAF를 링커를 통해 결합하여 전립선암 치료에 사용하는 구성이 개시되어 있고, Kratschmer, 등. (Mol Ther Nucleic Acids; 2018. 3. 2.;10: pp227-236)에서는 EGFR이나 TfR을 타게팅하는 압타머(E07 또는 Waz; DNA)와 MMAE/MMAF를 링커를 통해 결합하여 췌장암 치료에 사용하는 구성이 개시되어 있으며, Yoon, 등. (Mol Ther Nucleic Acids; 2017. 3. 17.;6: pp80-88)에서는 -H2AX에 결합하는 압타머(P19; RNA)와 MMAE/DM1을 sticky sequence(SE)를 통해 결합하여 췌장암 치료에 사용하는 구성이 개시되어 있다. 또한, Liu, 등. (J Transl Med; 2012. 7. 20.;10: p148)에서는 HER2을 타게팅하는 압타머(HB5; DNA)와 DM1을 결합하여 유방암 치료에 사용하는 구성이 개시되어 있고, Dou, 등. (Int J Nanomedicine; 2018. 2. 5.;13: pp763-776)에서는 HER3을 타게팅하는 DNA 압타머와 독소루비신을 DSPE-PEG 또는 리포솜으로 연결하여 유방암 치료에 사용하는 구성이 개시되어 있으며, Huang, 등. (Chembiochem; 2009. 3. 23.;10(5): pp862-868)에서는 PTK7(protein tyrosine Kinase 7)을 타게팅하는 압타머(sgc8; DNA)와 독소루비신을 하이드라존 링커를 통해 결합하여 백혈병에 사용하는 구성이 개시되어 있고, Liu, 등. (Cell Prolif; 2019. 1.; 52(1): e12511)에서는 PTK7을 타게팅하는 압타머(sgc8-TDNs)와 독소루비신이 복합체를 이뤄 백혈병에 사용하는 구성이 개시되어 있다. 이를 정리하면 아래 표 1와 같다.
문헌 압타머 타겟 링커 약물 대상질환
Gray, 등. E3 (RNA) MC-VC-PAB MMAE,MMAF 전립선암
Kratschmer, 등. E07,Waz (DNA) EGFR, TfR MC-VC-PAB MMAE,MMAF 췌장암
Yoon, 등. P19 (RNA) -H2AX sticky sequence (SE) MMAE, DM1 췌장암
Liu, 등. HB5 (DNA) HER2 DM1 유방암
Dou, 등. (DNA) HER3 DSPE-PEG, 리포솜 독소루비신 유방암
Huang, 등. sgc8 (DNA) PTK7 하이드라존 링커 독소루비신 백혈병
Liu, 등. sgc8c-TDNs PTK7 Nano 독소루비신 백혈병
상기와 같은 해당 기술분야의 지식에 따라 목적에 따라 다양한 압타머를 취사 선택할 수 있으며, 목적에 맞는 약물을 선택하여 압타머에 결합할 수 있다.
본 개시의 발명자는 암 세포에 결합하는 압타머를 개발하고자 노력한 결과 서열번호 11 내지 40의 압타머가 암 세포에 결합하는 것을 확인하였다(대한민국 특허공개공보 제10-2020-0078303호 참고). 본 개시는 일 측면에서 서열번호 11 내지 40 중 어느 하나의 염기 서열과 약 80% 이상, 구체적으로 약 90% 이상, 보다 구체적으로는 약 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 약 97% 이상, 가장 구체적으로는 약 99%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함하는 DNA 압타머를 제공하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 서열번호 11 내지 40 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 DNA 압타머와 동일하거나 상응하는 결합 활성을 가지는 압타머를 구성하는 염기 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기 서열도 본 개시의 범위에 포함됨은 자명하다. 본 개시는 일 측면에서 서열번호 11 내지 40 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 압타머일 수 있다.
한편, 본 개시의 압타머는 필요에 따라 링커를 포함할 수 있으며, 해당 링커는 예를 들어, C6 링커, MC-VC-PAB, sticky sequence (SE), DSPE-PEG, 리포솜, 하이드라존 링커, Oligo dT, Oligo dA, DNA 헤어핀, 3GC repeat을 함유하는 Poly A 링커, 피리미딘 서열(4nt), 5S rRNA 3-way 결합, RCA, SH-매개, CopA-CopT 결합, Au®MgO nanoflowers, 구형 AuNPs, AuNP, AgNP, DNA 스캐폴드, biotin-sterptavidin 결합, 폴리U 링커, 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 링커는 압타머에 해당 기술분야에 널리 통용되고 있는 기술에 의해서 접합될 수 있다(Vorobyeva M, 등, Molecules. 2016.).
본 개시의 일 측면에서 화학요법 약물 또는 세포 독성물질은 DNA 생성 저해제 (예를 들어, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 듀오카마이신, 안트라사이클린/니모루비신(Anthracycline/Nemorubicin), 독소루비신, 이리노테칸, 아마톡신), 마이크로튜불 저해제 (아우리스타틴, 마이탄신, 튜불리신), 토포이소머라아제 I의 저해제(SN-38), 토포이소머라아제 II의 저해제, 백금 배위 화합물, 알킬화제, 광민감제 (예를 들어, 5-Aminolaevulinic acid (ALA), Benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), 클로린, Tetra (m-hydroxyphenyl) chlorin (mTHPC), Lutetium texaphyrin, MMAE (monomethyl auristatin E), MMAF (monomethyl auristatin F), DM4 및 DM1로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 일 측면에서 검출 표지는 형광성 물질, 예를 들어 형광 염료, 테트라시스테인 형광성 모티프, Cy3, Cy5, Cy5-FITC, GFP, YFP, CFP, 및 RFP 등을 포함하는 형광 단백질, 또는 형광을 내는 나노입자, 18F, 64Cu, 99mTc, 111In 124I, 125I, 131I, 188Re 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성동위원소를 포함하는 방사성 표지물질, 예를 들어 18F-FDG(2-deoxy-2-[18F]fluro-D-glucose), Magnetic NPs, 원자점(Quantum Dots), 미세기포(Microbubbles) 및 유리선량계 등으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 압타머에 직접적 혹은 간접적으로 결합되는 검출표지는 압타머에 해당 기술분야에 널리 통용되고 있는 기술에 의해서 접합될 수 있다(Bouvier-M
Figure 112020094476567-pat00001
ller A, 등, Adv Drug Deliv Rev Actions., 2018. 9.;134:94-106.).
본 개시에서 "복합체"는, 본 개시의 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 본 개시의 디그옥시제닌을 포함하는 접합체가 결합한 복합체를 의미한다. 복합체는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접합체가 비-펩티드성 공유 결합 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 비공유 상호작용 (예를 들어, 수소결합, 이온 결합, 반 데르 발스력, 및 소수성 상호작용 등)에 의해 결합된 것일 수 있다. 본 개시의 접합체와 항-디그옥시제닌 항체가 결합한 복합체는 약물-결합 올리고바디란 의미의 DOligobody (Drug-conjugated Oligobody)로도 지칭될 수 있다. 구체적으로, 본 개시에서 복합체는 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 디그옥시제닌, (c) 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출 표지, 및 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)를 포함하는 복합체로서, 상기 (b) 디그옥시제닌과 (c) 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출 표지는 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머를 통해 공유적으로 접합되어 있는 접합체의 형태인 복합체일 수 있다.
본 개시에서 "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 염기 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 백분율(%)은 공지의 서열 비교 프로그램(예를 들어, Blast(NCBI) 등)을 사용하여 결정될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 용어 "약"은 구체적 수치에 포함되는 제조 공정상의 오차나 본 개시의 기술적 사상의 범주에 포함되는 약간의 수치 조정을 포함하는 의도로 사용되었다. 예를 들어, 용어 "약"은 그것이 지칭하는 값의 ±10％, 일 측면에서 ±5％, 또 다른 측면에서 ±2％의 범위를 의미한다. 이 개시내용의 분야에 있어서, 값이 구체적으로 보다 좁은 범위를 요구하는 것으로 언급되지 않는다면 이 수준의 근사치가 적절하다.
본 개시에서 단백질 또는 항체는 본 개시가 속하는 기술 분야에 공지된 방법을 통해 발현 및 생산될 수 있다. 본 개시에서 단백질 또는 항체를 발현 및 생산하기 위해 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양액에서 척추동물 세포의 증식은 일반적인 기술이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로서, 원숭이 신장 세포(CV1), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7), 인간 배아 신장주 (293 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO), 마우스 세르톨리 세포(TM4), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포 (W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포, MRC 5 세포, 및 FS4 세포 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.본 개시의 단백질 또는 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄(Ham) F10 배지, 최소 필수 배지, RPMI-1640, Dulbecco 개질 Eagle 배지(DMEM) 등과 그 외 본 개시가 속하는 기술 분야에서 사용되는 임의의 배지를 숙주 세포 배양을 위해 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요하다면 호르몬 및/또는 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신 (GENTAMYCIN)TM 약물), 미량 원소, 및 글루코스 또는 동등 에너지원 등이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수/보조 보충물을 또한 관련 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 그 외 온도, pH, CO2 농도 등의 배양 조건은 단백질 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 관련하여 알려진 적절한 조건으로 설정될 수 있고, 이는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 개시에서 단백질 또는 항체는 본 개시가 속하는 기술 분야에 공지된 임의의 단백질 또는 항체 정제 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 소수성 상호작용, 면역 친화도 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 또는 음이온 또는 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 겔 여과, 또는 유전공학적 방법(tag 등) 등을 포함하는 다양한 공지의 정제방법을 사용할 수 있으며, 단백질의 순도를 높이기 위해 복수개의 정제방법을 임의로 조합하여 사용할 수 있다.
본 개시에서 상기 방법을 통해 정제된 단백질 또는 항체는 동물, 특히 인간에게 실험, 임상, 및 치료 목적으로 투여될 수 있는 수준으로 높은 순도를 가질 수 있다.
본 개시의 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 본 개시의 디그옥시제닌을 포함하는 접합체가 결합한 복합체 제작시 항-디그옥시제닌 인간화 항체와 디그옥시제닌을 포함하는 접합체가 결합한 항원의 몰수비는 1:2로 제작하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 복합체를 제조하는 방법은 예를 들어, i) (b) 디그옥시제닌과 (c) 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출 표지를 (d) 링커를 포함할 수 있고 압타머를 통해 공유적으로 접합시켜 접합체를 제조하는 단계; 및 ii) 상기 디그옥시제닌과 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출 표지가 압타머(aptamer)를 통해 공유적으로 접합되어 있는 접합체에 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시에서 상기 복합체를 포함하는 약제학적/검출용 조성물은 의료 실무에 일치하는 방식으로 제형화되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자는 치료 또는 검출되는 질환, 치료 또는 검출되는 특정 동물, 개별 대상체의 임상 병태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 임상의에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 본 개시에서 제형은 액체 제형, 또는 동결 건조 분말 제형 등을 포함할 수 있다. 본 개시의 약제학적/검출용 조성물은 앰플, 바이알, 병, 카트리지, 저장고, 리오젝트, 또는 사전충전형 주사기 등의 형태로 제조될 수 있고, 단회 투여형 또는 다회 투여형 등으로 제조될 수 있다.
투여되는 복합체의 "투여 용량", "약제학적 유효량", "치료 유효량" 또는 "효과 투여량"은 상기 고려사항에 의해 결정될 것이고, 특정 질환의 예방, 개선, 검출 또는 치료를 위해 필요한 최소량이다. 본 개시에서 상기 복합체의 "투여 용량", "약제학적 유효량", "치료 유효량" 또는 "효과 투여량"은 예를 들어 약 0.001 mg/kg 내지 약 500 mg/kg 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 약제학적/검출용 조성물은 경험이 있는 임상의의 판단에 의해 일 1회, 주3회, 주2회, 주1회, 월3회, 월2회, 또는 월1회 등으로 주기적으로 투여될 수 있고, 질환의 급성 진행, 검출 긴급성 등의 상황에 비주기적으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시에서 약제학적/검출용 조성물은 본 개시의 복합체를 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합되어 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 허용되는 담체는 염수 또는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드(약 10개 미만의 아미노산 잔기 포함); 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, PLURONICSTM, 또는 PEG를 포함한다.
본 개시의 약제학적/검출용 조성물은 제약상 허용되는 염을 대략 생리학적 농도로 함유할 수 있다. 임의로, 본 개시의 제형은 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 구체적으로, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0% (전형적으로 v/v)일 수 있다. 본 개시에서 보존제는 제약업계에 공지된 것일 수 있으며, 구체적으로 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 개시의 약제학적/검출용 조성물은 제약상 허용되는 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도로 포함할 수 있다.
본 개시에서 약제학적/검출용 조성물은 대상 질환 치료 또는 검출에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 구체적으로 본 개시의 복합체와 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 갖는 활성 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 상기 화합물은 조성물에 의도하는 목적을 달성하기 위한 효과적인 양으로 함유될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 디그옥시제닌과 화학요법 약물 또는 세포 독성물질(cytotoxin)이 암 세포에 결합하는 압타머(aptamer)를 통해 공유적으로 접합되어 있는 접합체;가 결합한 복합체를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 개시의 암 치료용 약제학적 조성물은 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 디그옥시제닌, (c) 세포 독성물질(cytotoxin), 및 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)를 포함하는 복합체로서, 상기 (b) 디그옥시제닌과 (c) 세포 독성물질(cytotoxin)은 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머를 통해 공유적으로 접합되어 있는 접합체의 형태인 복합체를 포함하는 것일 수 있다. 한편, 상기 압타머는 서열번호 11 내지 40 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 디그옥시제닌과 검출 표지가 암 세포에 결합하는 압타머(aptamer)를 통해 공유적으로 접합되어 있는 접합체;가 결합한 복합체를 포함하는 암세포 검출용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 개시의 암세포 검출용 조성물은 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 디그옥시제닌, (c) 검출 표지, 및 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)를 포함하는 복합체로서, 상기 (b) 디그옥시제닌과 (c) 검출 표지는 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머를 통해 공유적으로 접합되어 있는 접합체의 형태인 복합체를 포함하는 것일 수 있다. 한편, 상기 압타머는 서열번호 11 내지 40 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 복합체를 포함하는 약제학적/검출용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법 또는 암세포 검출 방법을 제공한다.
본 개시에서 상기 복합체를 포함하는 약제학적/검출용 조성물은 공지된 방법에 따라, 정맥 내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소, 피하, 또는 흡입 경로 등에 의해 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 수 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 개시의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 개시에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 개시의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
또한, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 개시의 실시예들을 설명한다. 첨부된 도면에서, 동일하거나 대응하는 구성요소에는 동일한 참조부호가 부여되어 있을 수 있다. 또한, 이하의 실시예들의 설명에 있어서, 동일하거나 대응하는 구성요소를 중복하여 기술하는 것이 생략될 수 있다. 그러나, 구성요소에 관한 기술이 생략되어도, 그러한 구성요소가 어떤 실시예에 포함되지 않는 것으로 의도되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1. 항-디그옥시제닌 항체의 인간화 항체 제조
본 개시의 발명자는 마우스 항체를 기반으로 인간화 항체를 제조하고자 하였다. 구체적으로 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6를 포함하는 경쇄 가변영역을 가지는 항-디그옥시제닌 마우스 항체를 수득하였다.
이러한 마우스 항체 서열을 분석하여 특정 서열은 인간화하고 특정 서열은 유지하여 면역원성의 가능성을 낮추면서 결합능력을 가능한 유지하는 인간화 과정을 수행하였다.
※ 마우스 지주 항체 최적화 방법
본 개시에서 지주 항체로 사용되는 마우스 단일클론 항체는 표적 항원을 다양하게 설정하여 제조할 수 있고 대량 생산이 가능하기 때문에 진단 시약이나 기초 연구에 매우 유용하게 사용되고 있으나, 질병의 치료를 목적으로 인체에 반복 투여하게 되면 인체에 면역반응 (HAMA, human anti-mouse antibody response)를 유발하여 부작용이 생기고 효과가 감소하게 된다. 따라서 치료제로의 사용이 불가능하다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 마우스 단일 클론 항체를 인간 항체와 유사하게 하여 인체에 투여하여도 문제가 생기지 않도록 하는 인간화 항체 제조 기술이 필요하다.
항체는 가변 영역(variable region)과 불변 영역(constant region)으로 이루어져 있고, 가변 영역은 다시 항원과 직접 결합하는 상보성 결정 영역 (CDRs, complementarity determining regions)과 CDR 루프를 지탱해주는 프레임워크 영역 (FRs, framework regions)로 구성되어 있다. 인간화 항체는 1차적으로 마우스 항체의 CDR 루프를 사람 항체에 이식시키는 CDR 그래프팅(grafting) 방법에 의해 제조되고 있다(chimerization). 그러나 단순히 CDR 그래프팅만 수행한 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 구조에 영향을 줄 것으로 생각되는 몇 개의 주요 프레임워크 영역 아미노산 잔기를 마우스 항체의 것으로 치환시킴으로써, 원래 마우스 항체의 친화도와 유사한 수준으로 친화도를 높이는 과정을 수행한다(humanization).
구체적인 수행은 Absolute antibody 사의 PrometheusTM 서비스에 의뢰하여 인간화하였고, 총 16종류의 인간화 항체 후보군을 제작하였다. 그렇게 제조된 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 서열을 정리하면 하기 표 2와 같다.
ID Format Human
Germline		 서열 인간 가변영역 서열과의
% 서열 동일성
VH-m(서열번호 1) 마우스 - QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLTTSGMGVGWIRQSSGKGLEWLANIWWYDTKYYNAALKSRLTISKDTSKNQVFLKIVSVDTADTATYYCGRIHYNGSRFGDYWGQGTTLTVSS 69.1
VH-h1(서열번호 2) 인간화 IGHV2-5*05 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTLSGFSLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWVLANIWWYDTKYYNASLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCGRIHYNGSRFGDYWGQGTLVTVSS 89.7
VH-h2(서열번호 3) 인간화 IGHV2-5*05 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTLSGFSLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWLANlWWYDTKYYNASLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCGRlHYNGSRFGDYWGQGTLVTVSS 89.7
VH-h3(서열번호 4) 인간화 IGHV4-38-2*02 QVTLQESGPGLVKPSETLSLTCTLSGFSLTTSGMGVGWIRQPPGKGLEWLANIWWYDTKYYNASLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCGRIHYNGSRFGDYWGQGTLVTVSS 77.8
VH-h4(서열번호 5) 인간화 IGHV4-38-2*02 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTLSGFSLTTSGMGVGWIRQPPGKGLEWIANIWWYDTKYYNASLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCGRIHYNGSRFGDYWGQGTLVTVSS 79.8
VL-m(서열번호 6) 마우스 - DVVMTQTPLTLSVTFGQPASISCKSSQSLLYTNGKTYLMWLLQRPGQSPKRLIYLVSTLDSGVPGRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCLOTIHFPYSFGGGTKLEIK 79.0
VL-h1(서열번호 7) 인간화 IGKV2D-30*01 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLYTNGKTYLMWLQQRPGQSPRRLIYLVSTLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQTTHFPYSFGQGTKLEIK 88.0
VL-h2(서열번호 8) 인간화 IGKV2D-30*01 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLYTNGKTYLMWLQQRPGQSPRRLIYLVSTWDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQTTHFPYSFGQGTKLEIK 89.0
VL-h3(서열번호 9) 인간화 IGKV4-1*01 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYTNGKTYLMWLQQKPGQPPKRLIYLVSTLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQTTHFPYSFGQGTKLEIK 82.2
VL-h4(서열번호 10) 인간화 IGKV4-1*01 DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYTNGKTYLMWLQQKPGQPPKRLIYLVSTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQTTHFPYSFGQGTKLEIK 82.2
이에 상기 표 2의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 조합하여 1개의 키메라 항체와 16개의 인간화 항체를 제조하였다. 제조한 인간화 항체의 가변영역 조합은 하기 표 3에 정리하였다.
클론명 Format 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
mAb[21H8] 마우스 IgG1 VH-m VL-m
chimeric[21H8] 키메라 IgG1 VH-m VL-m
humab[21H8]-v1 인간화 인간 IgG1 VH-h1 VL-h1
humab[21H8]-v2 인간화 인간 IgG1 VH-h1 VL-h2
humab[21H8]-v3 인간화 인간 IgG1 VH-h1 VL-h3
humab[21H8]-v4 인간화 인간 IgG1 VH-h1 VL-h4
humab[21H8]-v5 인간화 인간 IgG1 VH-h2 VL-h1
humab[21H8]-v6 인간화 인간 IgG1 VH-h2 VL-h2
humab[21H8]-v7 인간화 인간 IgG1 VH-h2 VL-h3
humab[21H8]-v8 인간화 인간 IgG1 VH-h2 VL-h4
humab[21H8]-v9 인간화 인간 IgG1 VH-h3 VL-h1
humab[21H8]-v10 인간화 인간 IgG1 VH-h3 VL-h2
humab[21H8]-v11 인간화 인간 IgG1 VH-h3 VL-h3
humab[21H8]-v12 인간화 인간 IgG1 VH-h3 VL-h4
humab[21H8]-v13 인간화 인간 IgG1 VH-h4 VL-h1
humab[21H8]-v14 인간화 인간 IgG1 VH-h4 VL-h2
humab[21H8]-v15 인간화 인간 IgG1 VH-h4 VL-h3
humab[21H8]-v16 인간화 인간 IgG1 VH-h4 VL-h4
상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 조합을 코딩하는 염기서열을 갖는 유전자를 항체 발현 플라스미드(Absolute Antibody cloning and expression vector)에 클로닝하여, 인간 세포에서 발현이 잘 일어날 수 있도록 코돈 최적화를 시켰다. 정확한 서열은 DNASTAR Lasergene software를 이용한 Sanger 시퀀싱을 통해 확인하였고, 플라스미드 DNA prep을 통해 사이즈를 한번 더 확인하고, 형질감염을 위한 충분한 양의 고순도 플라스미드 DNA를 수득하였다.
제조된 고순도 플라스미드 DNA를 HEK 293 (인간 태아 신장세포 293) 세포주에 일시적 형질감염(transient transfection)시켰다. 세포들은 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터로 일시적 형질감염되어, 6일간 배양되었다. 배양물은 4000 rpm으로 원심분리하고 0.22 μM 필터로 필터링하였다. 항체는 일단 Protein A 친화도 크로마토그래피를 통해 pH 3.0 시트레이트 완충액과 이어진 pH 9.0 0.5M Tris 중화 완충액으로 용출하였다. 용출된 단백질은 제염(desalting) 컬럼을 이용해 PBS로 완충액 교환하였다. 수득한 항체 농도는 UV spectroscopy로 확인하였고, 필요에 따라 항체를 농축하였다.
상기 제조한 마우스 항체 (mAb[21H8]), 키메라 항체 (chimeric[21H8]), 인간화 항체 (humab[21H8]-v1, humab[21H8]-v2, humab[21H8]-v3, humab[21H8]-v4, humab[21H8]-v5, humab[21H8]-v6, humab[21H8]-v7, humab[21H8]-v8, humab[21H8]-v9, humab[21H8]-v10, humab[21H8]-v11, humab[21H8]-v12, humab[21H8]-v13, humab[21H8]-v14, humab[21H8]-v15, humab[21H8]-v16)에 대해 디그옥시제닌과의 결합력을 확인하고자 하였다.
실시예 2. 항-디그옥시제닌 인간화 항체의 결합력 확인
상기 제조한 마우스 항체 (mAb[21H8]), 키메라 항체 (chimeric[21H8]), 인간화 항체 (humab[21H8]-v1, humab[21H8]-v2, humab[21H8]-v3, humab[21H8]-v4, humab[21H8]-v5, humab[21H8]-v6, humab[21H8]-v7, humab[21H8]-v8, humab[21H8]-v9, humab[21H8]-v10, humab[21H8]-v11, humab[21H8]-v12, humab[21H8]-v13, humab[21H8]-v14, humab[21H8]-v15, humab[21H8]-v16)에 대해 ELISA 실험을 통해 디그옥시제닌과의 결합력을 확인하였다. ELISA 실험을 하기 조건으로 진행하였다.
※ ELISA 실험 방법
1) 4 μg/mL 농도의 디그옥시제닌-BSA(CellMosaicTM, Cat.No. CM52107) 100 μL씩을 Immuno Clear 플레이트(Thermo ScientificTM, Cat No. 468667)에 플레이팅하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 정치시킨다.
2) 상기 플레이트를 150 μL의 PBS + 0.05% Tween-20 (PBS-T)로 4차례 세척한다.
3) 상기 플레이트에 100 μL의 Blocking 용액(PBS + 3% BSA (Calbiochem®, Cat.No. 126609))을 처리하여 상온에서 2시간 정치시킨다.
4) 상기 플레이트에서 Blocking 용액을 제거한 후, 각각의 항체 (mAb[21H8], chimeric[21H8], humab[21H8]-v1~v16)를 다양한 농도(53.33 nM 부터 1/3씩 serial dilution, 즉, 17.7 nM, 5.92 nM, 1.97 nM, 0.66 nM, 0.22 nM, 0.07 nM, 0.024 nM)로 50 μL 처리하여 상온에서 1시간 정치시킨다.
5) 상기 플레이트를 150 μL의 PBS-T로 4차례 세척한다.
6) 50 μL의 2차 항체 (HRP-접합 IgG)를 처리하여 상온에서 1시간 정치시킨다. 구체적으로, 양 항-마우스 IgG (whole molecule), HRP (Sigma, Cat.No. A6782)와 토끼 항-인간 IgG Fc 2차 항체, HRP (invitrogen, Cat.No. 31423)을 각각 1/5000로 희석하여 사용한다.
7) 상기 플레이트를 150 μL의 PBS-T로 4차례 세척한다.
8) 상기 플레이트에 100 μL의 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate (ThermoFisher Scientific, Cat.No. 34029)를 처리하여 10분간 배양한다.
9) 40 μL의 2.5 N H2SO4를 이용하여 반응을 정지시킨다.
10) SynergyTM H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek)을 이용하여 450 nm 흡광도에서 OD값 측정한다.
상기 결과를 도 1(도 1a 내지 도 1c) 및 아래 표 4로 정리하였다.
mAb[21H8] chimeric[21H8] humab[21H8]-v1 humab[21H8]-v2 humab[21H8]-v3 humab[21H8]-v4 humab[21H8]-v5 humab[21H8]-v6 humab[21H8]-v7
KD 값(nM) 28.42 11.21 5.75 8.99 6.77 7.21 7.04 9.03 13.24
humab[21H8]-v8 humab[21H8]-v9 humab[21H8]-v10 humab[21H8]-v11 humab[21H8]-v12 humab[21H8]-v13 humab[21H8]-v14 humab[21H8]-v15 humab[21H8]-v16
KD 값(nM) 4.84 14.48 9.55 10.88 17.89 14.31 17.05 9.09 12.14
*KD : 평형 해리 상수 (값이 작을 수록 표적에 대한 리간드의 결합친화도가 큼)
상기 실험에서 확인할 수 있듯이, 인간화한 항체의 결합력이 현저히 우수해지는 것을 알 수 있다. 예를 들어, humab[21H8]-v1은 mAb[21H8]에 비해 결합력이 약 5배 강해지고, humab[21H8]-v3은 약 3배 강해지는 것을 알 수 있다. 특히나, humab[21H8]-v8은 mAb[21H8]에 비해 결합력이 약 6배 강해졌다는 것을 확인할 수 있었다.
타 동물의 항체를 인간화하는 목적은 인체 내 면역원성을 줄이는데 있고, 일반적인 그 과정에서 결합력이 낮아진다. 본 개시의 인간화 항체는 마우스 항체보다 우수한 결합력을 가지는 예외적인 특성을 보였다. 이는 본 개시에서 지주 항체로 사용된 마우스 항체가 결합력 최적화 과정을 거치지 않은 것이었기 때문에 이를 인간화 및 최적화 과정에서 결합력이 높아진 것으로 보인다. 이에 본 개시에서는 예상치 못하게 인간화된 항체이면서도 항원 결합력은 오히려 우수해지는 항체를 수득하였다.
실시예 3. 디그옥시제닌-압타머-MMAE 접합체(DOligomer) 제조 및 확인
실시예 3-1. 디그옥시제닌-압타머-MMAE 접합체(DOligomer) 제조
압타머는 췌장암 세포에 결합하는 압타머 SQ7-1(8) (서열번호 11) 및 대조군 압타머로 반대 방향 서열인 SQ7-1(8)-Rev(서열번호 41)를 사용하였다. 상기 압타머의 5' 말단엔 디그옥시제닌을, 3' 말단엔 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE)를 결합시킨 접합체를 제조하였다. 구체적인 제조 방법은 아래와 같다.
5' 말단에 디그옥시제닌을 결합하고, 3' 말단은 S-S로 변형된 압타머를 Integrated DNA Technology (IDT; 미국)에서 합성하여 제공받았다(도 3의 A).
압타머의 3' 티올 C3 S-S 링커를 끊어주기 위하여, 0.1 M TEAA (Triethylammonium acetate)와 1 mM TCEP (Tris-(2-carboxylethyl) phosphine hydrochloride)을 첨가하여 70℃에서 5분 동안 반응 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. Amicon Ultra 3K spin columns (Milipore, Billerica, MA)을 이용하여 PBS와 2 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)로 남아있는 TCEP을 제거하였다.
상기 DIG-압타머와 압타머 농도(molar)의 5배의 MC-Val-Cit-PAB-MMAE (Levena Biopharma, San Diego, CA)를 상온에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후 Amicon Ultra 3K spin columns (Milipore, Billerica, MA)을 사용하여 PBS로 잔여 MMAE를 제거하였다.
실시예 3-2. 디그옥시제닌-압타머-MMAE 접합체(DOligomer)의 합성 확인
합성한 디그옥시제닌-압타머-MMAE(도 3의 B)는 reversed-phase analytical HPLC on a 4.6 x 50 mm Xbridge C18 column (Waters, Milford, MA)을 이용하여 e2695(Waters, USA) high-performance liquid chromatography (HPLC) 기기를 이용하여 UV detector (Waters, USA) 260 nm에서 검출하여 분석하였다.
분석 시 컬럼 온도는 65℃를 유지하였으며, 이동상으로는 0.1 M TEAA at pH 7.0 (eluent A)와 Acetonitrile (eluent B)을 사용하였다. 분석 조건은 초기에서 5분까지 90% A 및 10% B 흘려준 뒤, 5-15분 동안 eluent B를 20 ~ 70%까지 linear gradient로 1 mL/minute 흘려주었다.
30 μM의 DIG-SQ7-1(8)-SH 압타머를 10 μL volume으로 주입하여 분석 결과, Retension time 6.21분에 Peak 확인되었고(도 4의 A), 상기 제조한 30 μM의 DOligomer를 10 μL 부피로 주입하여 분석 결과, Retention time 10.02분에 Peak를 확인하였다(도 4의 B). 이는 MC-Val-Cit-PAB-MMAE (Levena Biopharma, San Diego, CA)와 DIG-SQ7-1(8)-SH 사이의 합성이 잘 이루어졌음을 의미하며, 디그옥시제닌-압타머-MMAE (DIG-SQ7-1(8)-MMAE) 접합체가 순도 98%로 합성되었음을 확인하였다.
한편, 압타머와 약물을 결합하는 기술은 본 개시가 속한 기술분야에서 다양하게 개발되어 왔다. 해당 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시에 개시된 내용(표 1)에 개시된 구체적인 예시와 접합 방법, 및 해당 기술분야아 알려진 지식을 통하여, 목적에 따라 다양한 압타머와 물질(생리활성 물질 또는 검출 표지 등)을 선택할 수 있고 연결할 수 있다.
실시예 3-3. 디그옥시제닌-압타머-MMAE 접합체(DOligomer)의 결합력 및 세포 사멸 효과 확인
합성한 디그옥시제닌-압타머-MMAE 접합체(DOligomer)의 췌장암 세포 증식 억제 또는 사멸능을 아래의 방법으로 확인하였다.
※합텐-압타머-약물 접합체 (DIG-aptamer-MMAE)의 췌장암 세포 증식 억제 효능 실험방법
1) 췌장암 세포주 (CFPAC-1)을 96-well-plate에 3,000 cells/well로 seeding 후, 24시간 배양한다.
2) Serum free media로 washing 후, 1 mg/ml의 salmon sperm ssDNA로 37℃에서 1시간 blocking 한다.
3) 합텐-압타머-약물 접합체 (DIG-aptamer-MMAE)를 농도별 (0.5, 1, 2 μM)로 처리 후, 37℃ CO2 incubator에서 48시간 배양 후, 동일 농도로 재 처리하여, 48시간 배양한다.
4) 광학 현미경을 통해 세포 모양 관찰 및 ATP assay (Cell Titer Glo, Promega)로 분석한다.
그 결과, 도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 췌장암 타겟팅하는 SQ7-1(8) 압타머를 포함하는 DIG- SQ7-1(8)-MMAE의 경우 1 μM 이상의 농도로 처리하였을 때, 췌장암 세포 증식 억제 및 사멸을 일으키는 반면, 췌장암 타겟팅하지 못하는 reverse 서열 압타머인 SQ7-1(8)-Rev를 포함하는 DIG- SQ7-1(8)-Rev-MMAE의 경우에는 높은 농도(2 μM)에서도 췌장암 세포 증식 억제 및 사멸 효과를 유의하게 보이지 못했다. VC-MMAE는 VC부분이 암세포 내에 많이 발현된다고 알려진 단백질 분해효소 (protease)인 cathepsin B에 의해 잘려야만 free MMAE가 작용하여 암세포의 증식을 억제할 수 있으며, DIG-SQ7-1(8)-MMAE가 췌장암 세포막에 결합한 후, 세포안으로 내재화 되어, 라이소좀 내 cathepsin B 효소에 의해 VC 부분이 잘려, free MMAE에 의한 세포 증식 억제효과를 나타냄을 알 수 있다. 도 5a에서 1 μM의 free MMAE가 췌장암 세포 증식 억제 및 사멸 효과를 보인다는 것을 고려했을 때, 압타머에 의해 특정 타겟에 전달된 약물만이 특이적으로 약효를 보인다는 것을 알 수 있다. 즉, 본 개시의 DIG-압타머-약물 접합체를 통해 약물의 효과를 충분히 전달할 수 있으며, 특히나 압타머가 타겟하는 특정 세포나 조직에 특이적으로 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다 (타겟 특이적 약효 전달능).
실시예 4. 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody 제조 및 결합력 확인
실시예 4-1. 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody 제조
상기 실시예 1에서 제조한 마우스 항체 (mAb[21H8]), 키메라 항체 (chimeric[21H8]), 인간화 항체 (humab[21H8]-v1, humab[21H8]-v2, humab[21H8]-v3, humab[21H8]-v4, humab[21H8]-v5, humab[21H8]-v6, humab[21H8]-v7, humab[21H8]-v8, humab[21H8]-v9, humab[21H8]-v10, humab[21H8]-v11, humab[21H8]-v12, humab[21H8]-v13, humab[21H8]-v14, humab[21H8]-v15, humab[21H8]-v16)와 실시예 3-1에서 제조한 DIG-aptamer-MMAE 접합체(DOligomer)를 결합시켜 복합체(DOligobody)를 제조하였다.
구체적으로, 250 nM의 DIG-aptamer-MMAE 접합체와 125 nM의 상기 실시예 1에서 제조한 항체를 결합 완충액(Binding buffer: DPBS (Hyclone #SH30028.02)에 0.1% BSA (Merk #126593), 0.1 mg/mL yeast tRNA (Sigma #R9001), 및 5 mM MgCl2 (Biosesang #M3101) 포함)에 총 부피 100 μL가 되도록 녹인다. 상기 혼합물을 로테이터(rotator) 상에 상온에서 30분간 배양하여 항체와 DIG-aptamer-MMAE 접합체를 결합시켜 복합체(DOligobody)를 제조하였다. 이렇게 제조된 DOligobody의 구조는 도 2에 개시된 바와 같다.
실시예 4-2. FACS 실험을 통한 항-디그옥시제닌 인간화 항체를 포함하는 복합체(DOligobody)의 결합력 확인
상기 실시예 4-1에서 제조한 복합체 DOligobody에 대해 이에 포함된 압타머 SQ7-1(8) 가 타겟하는 사람 췌장암 세포주인 CFPAC-1을 이용하여 결합력을 확인하였다. 이는 유세포 분석기 (FACS, Fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 측정하였다. 췌장암 세포에 결합력을 가지는 것은 접합체 내의 압타머이고, FACS는 항-디그옥시제닌 항체(마우스 또는 인간)에 대한 2차 항체를 이용하여 분석하였기 때문에 본 결과를 통해 DIG-압타머-MMAE의 접합체와 항-디그옥시제닌 항체가 결합된 본 개시의 복합체(DOligobody)가 정상적으로 제조되었음을 확인할 수 있다.
구체적으로, CFPAC-1 세포를 트립신 처리하여 수득하여, 3 x 105 세포 농도로 round bottom 튜브에 준비하였다. 각 튜브에 실시예 3-2에서 제조한 복합체 DOligobody 혼합물을 100 μL 첨가한 후, 4 ℃에서 30분간 배양하였다.
이후, 상기 튜브의 세포를 500 μL의 세척 완충액(Washing buffer : 상기 실시예 3-2의 Binding buffer + 0.1 % NaN3 포함)으로 3차례 세척하였다.
상기 세척된 세포에 2차 항체를 붙였다. 구체적으로, 당나귀에서 제조한 Alexa FluorTM 488 anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen #A21202)를 1/500으로 희석하고, 염소에서 제조한 Anti-Human IgG (Fc specific)-FITC antibody (Sigma #F9512)를 1/500으로 희석하여 처리하고 4 ℃에서 15분간 배양하였다.
이후, 상기 튜브의 세포를 500 μL의 세척 완충액(Washing buffer : 상기 실시예 3-2의 Binding buffer + 0.1 % NaN3 포함)으로 3차례 세척하였다.
Binding buffer 300 μL에 7-AAD(BD PharmingenTM #559925: 1/100 희석) 첨가한 용액을 상기 세척된 세포에 처리하여 FACS를 위한 샘플을 준비하였다.
상기 준비된 샘플을 FACSVerseTM (BD Biosciences, San Jose, USA) 기기를 이용하여 분석하였다. 상기 분석한 결과는 도 6(도 6a 내지 6c)과 같다.
해당 FACS 결과를 바탕으로 본 개시의 복합체인 DOligobody의 결합률을 비교한 결과는 도 7과 같다. 해당 결과에 따르면 원래 마우스 항체를 DIG-aptamer-MMAE 접합체에 결합시킨 경우보다 인간화한 항체를 DIG-aptamer-MMAE 접합체에 결합시킨 경우 복합체의 사람 췌장암 세포주인 CFPAC-1에의 결합률이 우수한 것을 확인할 수 있고 특히 humab[21H8]-v6 등의 인간화 항체의 경우 복합체의 암세포에 대한 결합률이 키메라 항체보다도 우수함을 확인하였다. 이는 디그옥시제닌-압타머-MMAE 접합체와 항-디그옥시제닌 항체와의 결합력의 차이가 전체 복합체의 췌장암 세포 결합력에도 영향을 미치는 것을 보여준다. 즉, 마우스 및 키메라 항체는 접합체와의 결합력이 인간화 항체에 비해 약하므로 접합체 내의 압타머가 타게팅하는 췌장암 세포와도 결합력이 약해지는 것으로 보인다.
실시예 5. 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 약물동력학 실험
항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody에 대하여 동물 실험을 통해 약물동력학 분석을 진행하였다. Balb/c 마우스에 ① DIG-SQ7-1(8)-MMAE 접합체 DOligomer(대조군), ② humab[21H8]-v5 항체를 포함하는 DOligobody, ③ humab[21H8]-v6 항체를 포함하는 DOligobody, 또는 ④ humab[21H8]-v8 항체를 포함하는 DOligobody를 8 mg/kg 투여하였다. 투여시, 투여한 후 0.5 시간, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 및 72 시간에 헤파린이 코팅된 캐필러리 튜브를 이용하여 약 50 내지 100 μL의 혈액을 안와 정맥 채혈을 하였다(도 8).
상기 채취 혈액을 아이스에서 30분 정치 후, 원심분리를 통해 상층액(혈장)을 분리하여, 디그옥시제닌 ELISA 및 인간 IgG ELISA 키트를 이용하여, 혈액 내 압타머 농도와 인간화 항체의 농도를 분석하였다.
※ 디그옥시제닌 ELISA 방법
1) Immuno Clear plate (Thermo ScientificTM, Cat.No. 468667)에 2 μg/mL 농도의 Anti-digoxigenin (Abcam, cat. Ab420)을 플레이팅(각각 100 μL씩), 4℃, overnight.
2) PBS+0.05% Tween-20 (PBS-T) (150 μL)로 3회 세척 후, 100 μL 3% BSA (Calbiochem®, Cat.No. 126609)로 37℃에서 1시간 동안 블락킹(blocking).
3) 블락킹 용액(Blocking solution) 제거 후, 각각 1/10 희석한 혈액샘플의 50 μL를 37℃에서 1시간 동안 배양(incubation).
4) PBS-T (150 μL)로 3회 세척 후, 37℃에서 1시간 동안 50 μL HRP-conjugated digoxigenin (1/4000 희석) 배양.
5) PBS-T (150 μL)로 3회 세척 후, 100 μL 1-StepTM Ultra TMB-ELISA Substrate (Thermo Fisher Scientific, Cat.No. 34029)을 넣고, 15분간 배양.
6) 2.5 N H2SO4 (40 μL)를 넣음.
7) SynergyTM H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek)을 이용하여 450 nm 흡광도에서 OD값 측정.
※ 인간 IgG ELISA 방법
-Human IgG total ELISA Kit (Invitrogen, Cat. BMS2091)의 매뉴얼에 따라 실험하였다. 구체적으로는 다음과 같다.
1) 혈액 샘플을 assay dilution buffer로 1/10,000 희석함.
2) Standard는 assay dilution buffer로 연속 희석(serial dilution)하여, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.013, 및 0.003 μg/mL로 준비함.
3) HRP-conjugate는 assay dilution buffer로 1/100 희석함.
4) 세척 완충액으로 플레이트 1회 세척.
5) 각 well에 혈액 샘플 희석액 또는 standard 100 μL씩과 HRP-conjugate 100 μL씩 첨가하여, 실온에서 1시간 30분 반응함.
6) 세척 완충액으로 4회 세척
7) TMB 기질 100 μL 첨가하여, 실온에서 30분 반응함.
8) 정지 용액(stop solution) 100 μL 첨가 후, SynergyTM H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek)을 이용하여 450 nm 흡광도에서 OD값 측정.
상기 실험을 통해 분석한 결과, 디그옥시제닌을 포함하는 DOligomer에 대한 PK 그래프는 도 9와 같이 확인되었다. 한편, 정맥 투여 후 항체의 플라즈마 농도(plasma concentration)은 분포상(distribution phase) 및 제거상(elimination phase)로 구분되고, DOligomer의 반감기(t1/2)를 계산한 결과 ① DIG-SQ7-1(8)-MMAE 접합체 DOligomer(대조군)을 주입하였을 때는 0.02 시간에 불과한 반면, ② humab[21H8]-v5 항체를 포함하는 DOligobody에서의 DOligomer는 9.2 시간, ③ humab[21H8]-v6 항체를 포함하는 DOligobody에서의 DOligomer는 16.8 시간, ④ humab[21H8]-v8 항체를 포함하는 DOligobody에서의 DOligomer는 38.5 시간으로 확인되었다(도 10).
인간 IgG에 대한 PK 그래프는 도 11과 같으며, humab[21H8]-v5 항체, humab[21H8]-v6 항체, 및 humab[21H8]-v8 항체를 포함하는 DOligobody를 주입하였을 때 항-디그옥시제닌 항체의 반감기(t1/2)를 계산한 결과 ② humab[21H8]-v5 항체를 포함하는 DOligobody에서의 항-디그옥시제닌 항체는 35 시간, ③ humab[21H8]-v6 항체를 포함하는 DOligobody에서의 항-디그옥시제닌 항체는 32 시간, ④ humab[21H8]-v8 항체를 포함하는 DOligobody에서의 항-디그옥시제닌 항체는 143 시간으로 측정되었다(도 12).
상기 데이터를 통해 확인할 수 있듯이, 본 개시의 DOligobody 융합체에 의해서 DOligomer의 체내 반감기가 현저히 증가함을 확인하였다. 또한 항-디그옥시제닌 항체중에서 humab[21H8]-v8 항체의 체내 반감기가 가장 높음을 확인하였다.
실시예 6. 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 효능평가 및 안전성 평가
실시예 6-1. 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 효능평가 및 안전성 평가 동물 실험
항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody에 대하여 동물 실험을 통해 효능 및 안전성 평가를 진행하였다. 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.
※ 췌장암 동소전이 마우스 모델을 이용한 DOligobody 효과 확인 실험
1) 6주령의 암컷 Athymic 누드 마우스를 준비.
2) 마우스를 Isofluoran을 이용하여 흡입마취한 후, 왼쪽 비장(spleen)이 보이는 부위의 피부를 매우 작게 절개하고 비장이 노출되면 면봉으로 비장을 고정해서 붙어있는 췌장(pancreas)를 핀셋으로 꺼내어, 췌장의 꼬리(tail) 부분에 췌장암 세포(CFLAC-1/Luci, 1 x 106 cell/ 30 μL)를 주사함. 주사 후, 면봉으로 일정시간 지혈한 후, 장기를 제 위치로 복귀시키고 수술 부위를 클립으로 마무리한 후 소독.
3) IVIS imaging과 MRI를 통해 종양의 성장 정도를 측정.
4) 2주 경과 후, IVIS 형광 이미징 장비를 이용하여, Luminescence에 따라 각 그룹을 나눔.
5) 20 mg/kb의 농도로 DIG-압타머-약물/항-디그옥시제닌 항체 복합체(DOligobody [DIG-SQ7-1(8)-MMAE + humab[21H8]-v8])를 주 1회, 5주간 복강 내 투여함. 췌장암 환자 표준 치료제인 Gemcitabine은 DOligobody와 동일한 몰수인 52 μM을 주 2회 투여함(도 13b).
6) 5주 동안 IVIS 이미징과 MRI를 통해 종양 억제 효과를 관찰함.
7) 동물실험 종료 후, 안락사시켜 채혈 및 종양, 장기 적출하여 고정함.
※ TUNEL assay
1) 동물실험 종료 후, 종양을 적출함.
2) 적출된 종양 조직으로 동결 세포(Frozen block)을 제작함.
3) 동결 절편(Frozen section)을 4% 포름알데히드로 상온에서 10분간 고정한 후, 슬라이드를 건조하여 PBS로 5분씩 3회 세척함.
4) 투과 용액(Permeabilization solution; PBS 내 0.1% Triton X-100, 0.1% 구연산 나트륨)에 상온에서 3분 동안 반응시킨 후, PBS로 5분씩 3회 세척함.
5) TUNEL 반응 혼합물(TUNEL reaction mixture; Enzyme Solution : Label Solution = 1:9)을 고정된 조직 위에 50 μL씩 떨어뜨려 37 ℃ 인큐베이터에서 빛을 차단하여 1시간 동안 반응시킴.
6) 반응이 끝난 슬라이드를 PBS로 5분씩 2회 세척함. 핵 염색을 위하여 PBS에 1:500으로 희석한 Hoest 33342 (Beyotime, C1022, 중국)를 슬라이드 위에 50 μL씩 떨어뜨린 후, 상온에서 5분동안 반응시킴.
7) 반응이 끝난 샘플을 PBS로 세척 후, Mounting하여 형광 현미경(ZEISS, 독일)으로 확인함.
※ DOligobody의 간, 신장 독성 평가
동물실험 종료 후, 하대 정맥에서 얻은 혈액으로부터 얻은 혈청으로 Fuji Dri-chem 3500i (후지필름, 카나가와, 일본)를 이용하여 간독성 지표(ALT, AST, TBIL)과 신장독성 지표(BUN, CRE)를 분석하였다.
실시예 6-2. 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 효능평가 및 안전성 평가 동물 실험 결과
상기 실시예 6-1 방법으로 진행한 췌장암 동소이식 마우스 모델을 이용한 본 개시의 DOligobody 효과/독성 평가 결과는 아래와 같다.
※ 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 종양 억제 효능 평가
본 실시예에서 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체에 결합된 약물은 세포 독성물질인 MMAE이고, 결합된 압타머는 췌장암 세포를 타겟팅하는 압타머인 SQ7-1(8)이다. 따라서, 본 복합체가 압타머를 매개로 하는 조직 타겟팅이 적절히 일어나고 약물 전달이 제대로 이루어지는지를 확인하기 위해서는 상기 췌장암 동소이식 마우스 모델에서 동소 이식된 종양 조직의 부피가 억제되는지, 해당 종양 조직에서 세포 사멸이 일어나는지를 통해 확인할 수 있다.
먼저, 췌장암 동소이식 마우스 모델에서, 매주 IVIS 형광 이미징 장비를 통하여 종양 크기를 관찰하였고(이식된 췌장암 세포가 CFPAC-1/Luci로 루시퍼라제 발현 세포임), 30일 경과 후 MRI 장비를 이용하여 종양의 부피를 측정하였다.
5주간의 측정 기간 동안에 본 개시의 DOligobody를 투여한 실험군의 경우, 음성 대조군(Vehicle; 담체군)이나 Gemcitabine 투여군(DOligobody와 동일한 몰농도로 투여)보다 종양의 크기(Luminesence intensity)가 감소하는 양상을 보였다(도 14a 및 도 14b).
마지막 투여 후인 30일째에 MRI를 이용하여 측정한 결과, 음성 대조군에 비해 DOligobody 처리군에서 종양 부피가 50% 감소하는 것을 확인하였다(도 15a 및 15b).
즉, 췌장암 동소이식 마우스 모델을 통하여 DOligobody의 우수한 종양 억제 효능을 확인할 수 있었다.
※ 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 항암 효과의 작용기전 확인
상기 췌장암 동소이식 마우스 모델에서 본 개시의 DOligobody가 우수한 종양 억제 효능을 가짐을 확인할 수 있었다. 이에 본 개시의 발명자들은 DOligobody의 종양 억제 효능이 전달된 MMAE에 의한 세포 사멸(apoptosis)에 의한 것임을 확인하기 위하여, TUNEL assay를 수행하였다. TUNEL assay는 TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase)라는 효소를 이용해 UTP(우리딘 삼인산)를 DNA 조각 말단에 붙여 세포 사멸시 일어나는 현상인 DNA fragmentation이 일어났는지 여부를 확인하는 실험방법이다. DNA fragmentation이 일어나면 이중나선 구조에 분열이 생기고, N 말단이 노출되어 TUNEL이 결합하게 된다.
그 결과는 도 16에서 확인할 수 있듯이, 본 개시의 DOligobody가 투여된 실험군의 종양에서 많은 세포 사멸이 일어났음을 알 수 있다. 따라서, 본 개시의 DOligobody는 약물 전달 기능을 정상적으로 수행하며, 약물 전달 시스템으로서 우수한 효능을 나타냄을 확인하였다.
※ 항-디그옥시제닌 항체를 포함하는 복합체 DOligobody의 간, 신장 독성 평가
상기 췌장암 동소이식 마우스 모델에서 투여된 DOligobody가 간이나 신장 독성을 보이지 않는지 체중변화 및 지표를 통해 확인하였다. 체중은 투여기간 내 주 2회 측정하였으며 (도 17), 해당 지표는 단회 투여 후 3일 경과된 시점(도 18a), 및 다회 투여(5회) 후 실험 종료 시점(도 18b)에 측정되었다.
도 17에서 확인할 수 있듯이, 투여 기간 내 체중은 음성 대조군, 실험군 및 양성 대조군 모두에서 유의성 있는 차이나 변화를 나타내지 않았다.
간 독성 지표인 GPT/ALT, GOT/ALT 분석 결과 모두 기준치(각각 250 U/L 및 300 U/L) 미만으로 측정되었으며, TBIL 수치 또한 기준치(1.2 mg/dL) 미만으로 측정되어 간 독성이 없음을 확인하였다. 아울러, 신장 독성 지표인 BUN 수치 및 CRE 수치 분석 결과 모두 기준치 (각각 40 mg/dL 및 1.0 mg/dL) 미만으로 정상범위 내 측정됨을 확인하였다.
상기 실험을 통해, 본 개시의 항-디그옥시제닌 항체와 디그옥시제닌-압타머-약물로 이루어진 접합체(DOligomer)를 포함하는 복합체 DOligobody를 전달체(carrier)로 이용하여 약물의 목적 세포로의 타겟팅, 및 약물의 체내 반감기를 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 해당 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시의 항-디그옥시제닌 항체와 디그옥시제닌-압타머-약물 접합체가 결합한 복합체 DOligobody를 약물 전달 시스템으로 이용하여 목적 세포나 물질에 결합하는 압타머를 적절히 선택하고 전달하고자 하는 약물을 선택하여 약물을 체내에 효과적으로 전달할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 개시가 속하는 기술분야의 당업자는 본 개시의 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야 한다. 본 개시의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> National Cancer Center JP BIO A Inc. Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> A complex comprising an antibody to Digoxigenin and use thereof <130> KC201047 <160> 41 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus musculus VH-m <400> 1 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Thr Lys Tyr Tyr Asn Ala Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Val Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Arg Ile His Tyr Asn Gly Ser Arg Phe Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH-h1 <400> 2 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Val Leu Ala Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Thr Lys Tyr Tyr Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Gly Arg Ile His Tyr Asn Gly Ser Arg Phe Gly Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH-h2 <400> 3 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Leu Trp Trp Tyr Asp Thr Lys Tyr Tyr Asn Ala Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Arg Leu His Tyr Asn Gly Ser Arg Phe Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH-h3 <400> 4 Gln Val Thr Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Thr Lys Tyr Tyr Asn Ala Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Arg Ile His Tyr Asn Gly Ser Arg Phe Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH-h4 <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Ala Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Thr Lys Tyr Tyr Asn Ala Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gly Arg Ile His Tyr Asn Gly Ser Arg Phe Gly Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus musculus VL-m <400> 6 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Phe Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Met Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Thr Ile 85 90 95 His Phe Pro Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VL-h1 <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Met Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VL-h2 <400> 8 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Met Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Trp Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VL-h3 <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Met Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VL-h4 <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Met Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(8) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 1to 4 and 29 to 32) <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 1 to 4 <220> <221> modified_base <222> (29)..(32) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 29 to 32 <400> 11 guuggtatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 12 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ7 <400> 12 agcagcacag aggtcagatg atgttggtat atacttcttt agcttggaac caactcttgc 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ7-1 <400> 13 gttggtatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(1) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 1 to 6) <400> 14 guugguatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(2) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 7 to 11) <220> <221> modified_base <222> (7)..(11) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 7 to 11 <400> 15 gttggtauau acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(3) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 14 to 18) <220> <221> modified_base <222> (14)..(18) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 14 to 18 <400> 16 gttggtatat actucuuuag cttggaacca ac 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(4) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer (from 21 to 26) <220> <221> modified_base <222> (21)..(26) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 21 to 26 <400> 17 gttggtatat acttctttag cuuggaacca ac 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(5) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 27 to 32) <220> <221> modified_base <222> (27)..(32) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 27 to 32 <400> 18 gttggtatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(6) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 7 to 26) <220> <221> modified_base <222> (7)..(26) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 7 to 26 <400> 19 gttggtauau acuucuuuag cuuggaacca ac 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(1,5) <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamers (from 1 to 6 and 27 to 32) <220> <221> modified_base <222> (1)..(6) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 1 to 6 <220> <221> modified_base <222> (27)..(32) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 27 to 32 <400> 20 guugguatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(7) <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(5) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 1 to 5 <220> <221> modified_base <222> (27)..(32) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 27 to 32 <400> 21 guuggtatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 22 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(9) <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 1 to 3 <220> <221> modified_base <222> (30)..(32) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 30 to 32 <400> 22 guuggtatat acttctttag cttggaacca ac 32 <210> 23 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ7a <400> 23 agcagcacag aggtcagatg atgttggtat atacttcttt agcttggaac caactcttct 60 cctatgcgtg ctaccgtga 79 <210> 24 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ7b <400> 24 agcaacacag aggtcagatg atgttggtat atacttcttt agcttggaac ccactcttgt 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 25 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ1 <400> 25 agcagcacag aggtcagatg cttgggctat ctcttattca tgctgttcca ccgctctcgg 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 26 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ2 <400> 26 agcagcacag aggtcagatg aaccgcgatc tcatctgtac gctcacccgg tcgaagggac 60 ctatgcgtgc taccgtgaa 79 <210> 27 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ3 <400> 27 agcagcacag aggtcagatg tgggggcgat tacgacccgg cgaaattaat agatctgccg 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 28 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ4 <400> 28 agcagcacag aggtcagatg agtgtccaac gtcggcgaaa ttaataggtt ggaacgaacg 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 29 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ5 <400> 29 agcagcacag aggtcagatg tcatggcaaa acgtccctac gctacgatta gttaggtcga 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 30 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ6 <400> 30 agcagcacag aggtcagatg gcttgccaca acgtgcgacg ctatgactaa ttcggcgacc 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 31 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8 <400> 31 agcagcacag aggtcagatg cttgggctat ttcttattca tgctgttcca ccgctctcgg 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 32 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ9 <400> 32 agcagcacag aggtcagatg attcaacttt gaataagtcc agtgacttct aacatagtgg 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 33 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ10 <400> 33 agcagcacag aggtcagatg ctcttgaagg gatacattgc ccttcgatgc ttgtctgatc 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 34 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ11 <400> 34 agcagcacag aggtcagatg gtgccaacct gaagtgactg agatatcaac cggtaggcct 60 cctatgcgtg ctaccgtgaa 80 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8-1 <400> 35 cagcacagag gtcagatgct tgggctattt cttattcatg ctg 43 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8-2 <400> 36 cagcacagag gtcagatgct tgggct 26 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8-3 <400> 37 catgctgttc caccgctctc ggcctatgcg tg 32 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8-4 <400> 38 agcagcacag aggtcagatg cttgggct 28 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8-5 <400> 39 ctcggcctat gcgtgctacc gtg 23 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer SQ8-6 <400> 40 caccgctctc ggcctatgcg tgctaccgtg 30 <210> 41 <211> 32 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer SQ7-1(8)-Rev <220> <223> internal 2'-O-methyl-modified aptamer (from 1 to 4 and 29 to 32) <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 1 to 4 <220> <221> modified_base <222> (29)..(32) <223> 2'-O-methyl-modified bases from 29 to 32 <400> 41 caaccatata tgaagaaatc gaaccttggu ug 32

Claims (13)

  1. (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    (b) 디그옥시제닌,
    (c) 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출표지, 및
    (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)를 포함하는 복합체로서,
    상기 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 경쇄 가변영역으로 구성되며,
    상기 (c) 세포 독성물질(cytotoxin)은 DNA 생성 저해제, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 듀오카마이신, 안트라사이클린/니모루비신(Anthracycline/Nemorubicin), 독소루비신, 이리노테칸, 아마톡신, 마이크로튜불 저해제, 아우리스타틴, 마이탄신, 튜불리신, 토포이소머라아제 I의 저해제(SN-38), 토포이소머라아제 II의 저해제, 백금 배위 화합물, 알킬화제, 광민감제, 5-Aminolaevulinic acid (ALA), Benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), 클로린, Tetra (m-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC), Lutetium texaphyrin, MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristatin F), DM4 및 DM1로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 (c) 검출표지는 테트라시스테인 형광성 모티프, GFP, YFP, CFP, 또는 RFP인 형광 단백질, 18F, 124I, 125I, 131I, 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성동위원소를 포함하는 방사성 표지물질, 및 18F-FDG(2-deoxy-2-[18F]fluro-D-glucose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이며,
    상기 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)는 서열번호 11 내지 서열번호 40의 염기서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고,
    상기 (b) 디그옥시제닌 및 (c) 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출표지는 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer) 양쪽 말단에 각각 공유 결합으로 접합되어 있는 접합체의 형태인, 복합체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 중 하나인 것인, 복합체:
    a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    c) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    d) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    e) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    f) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    g) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    h) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    i) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    j) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    k) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    l) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    m) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    n) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    o) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및
    p) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역으로 구성되는 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-디그옥시제닌 인간화 항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형태인 것인, 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체의 항원 결합 단편이 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 암 세포에 특이적으로 결합하며,
    상기 암은 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 뇌종양, 구강암, 난소암 또는 유방암인 것인, 복합체.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 따른 복합체의 제조 방법으로서,
    i) (b) 디그옥시제닌 및 (c) 세포 독성물질(cytotoxin) 또는 검출표지는 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer) 양쪽 말단에 각각 공유 결합으로 접합시켜 접합체를 제조하는 단계; 및
    ii) 상기 접합체에 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 결합시키는 단계를 포함하며,
    상기 (c) 세포 독성물질(cytotoxin)은 DNA 생성 저해제, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 듀오카마이신, 안트라사이클린/니모루비신(Anthracycline/Nemorubicin), 독소루비신, 이리노테칸, 아마톡신, 마이크로튜불 저해제, 아우리스타틴, 마이탄신, 튜불리신, 토포이소머라아제 I의 저해제(SN-38), 토포이소머라아제 II의 저해제, 백금 배위 화합물, 알킬화제, 광민감제, 5-Aminolaevulinic acid (ALA), Benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), 클로린, Tetra (m-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC), Lutetium texaphyrin, MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristatin F), DM4 및 DM1로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 (c) 검출표지는 테트라시스테인 형광성 모티프, GFP, YFP, CFP, 또는 RFP인 형광 단백질, 18F, 124I, 125I, 131I, 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성동위원소를 포함하는 방사성 표지물질, 및 18F-FDG(2-deoxy-2-[18F]fluro-D-glucose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이며,
    상기 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)는 서열번호 11 내지 서열번호 40의 염기서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인, 제조 방법.
  12. (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    (b) 디그옥시제닌,
    (c) 세포 독성물질(cytotoxin), 및
    (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)를 포함하는 복합체로서,
    상기 (a) 항-디그옥시제닌 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 7 내지 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 경쇄 가변영역으로 구성되며,
    상기 (c) 세포 독성물질(cytotoxin)은 DNA 생성 저해제, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 듀오카마이신, 안트라사이클린/니모루비신(Anthracycline/Nemorubicin), 독소루비신, 이리노테칸, 아마톡신, 마이크로튜불 저해제, 아우리스타틴, 마이탄신, 튜불리신, 토포이소머라아제 I의 저해제(SN-38), 토포이소머라아제 II의 저해제, 백금 배위 화합물, 알킬화제, 광민감제, 5-Aminolaevulinic acid (ALA), Benzoporphyrin derivative monoacid ring A (BPD-MA), 클로린, Tetra (m-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC), Lutetium texaphyrin, MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristatin F), DM4 및 DM1로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer)는 서열번호 11 내지 서열번호 40의 염기서열로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이며,
    상기 (b) 디그옥시제닌 및 (c) 세포 독성물질(cytotoxin)은 (d) 링커를 포함할 수 있는 압타머(aptamer) 양쪽 말단에 각각 공유 결합으로 접합되어 있는 접합체의 형태인 복합체를 포함하는, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 뇌종양, 구강암, 난소암 또는 유방암 치료용 조성물.
  13. 삭제
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