KR20140025397A

KR20140025397A - 팔레리아 마크로카파 추출물, 추출 방법 및 콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 (cetp) 저해제로서의 이의 용도

Info

Publication number: KR20140025397A
Application number: KR1020137027541A
Authority: KR
Inventors: 드위 안군 셉티아나 수십턴; 아셉 아리핀; 레이몬드 알. 트얀드라위나타
Original assignee: 피티. 덱사 메디카
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2014-03-04
Also published as: CN103619345A; AU2012245964A1; US8999404B2; WO2012143872A1; TW201242602A; EP2701717A1; AR086180A1; US20140099392A1; JP2014512378A

Abstract

추출물 및/또는 허브 분획 및 약학 조제물은 본 발명에서 DLBS1449로 지칭되는 팔레리아 마크로카파 추출물을 포함한다. 본 발명의 교시 내용에 따른 허브 추출물은, 혈압을 상승시키지 않으면서, 콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 (CETP)의 발현 및 활성 저해, HDL 콜레스테롤 수준 증가, LDL 콜레스테롤 수준 감소를 위해 효과적으로 적용가능하며, 따라서 죽상동맥경화증 치료에도 적용가능하다.

Description

팔레리아 마크로카파 추출물, 추출 방법 및 콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 (CETP) 저해제로서의 이의 용도 {PHALERIA MACROCARPA EXTRACT, EXTRACTION PROCESS AND ITS USE AS CHOLESTERYL ESTER TRANSFERASE PROTEIN (CETP) INHIBITOR}

본 발명은, 본원에서 DLBS1449로 지칭되는, 팔레리아 마크로카파 (Phaleria macrocarpa)의 추출물, 추출 방법 및 콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 (CETP) 발현 및 활성에 대해 저해 활성을 나타내는 상기 추출물의 생물학적 활성에 관한 것이다.

콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 (CETP)은 74-kDa의 당단백질로서, 소수성 특성을 가진다.¹ 이 단백질은 주로 간에서 합성되어, 혈장으로 분비된다. 또한, CETP는 림프, 지방 조직, 심장, 신장 및 소장에서도 저농도로 발현된다.² CETP는 역방향 콜레스테롤 수송 (RCT) 프로세스에도 관여하는데, 이 프로세스에서, 고밀도 지단백질 (HDL) 입자의 콜레스테릴 에스테르를 저밀도 지단백질 (LDL) 및 극저밀도 지단백질 (VLDL) 입자의 트리글리세라이드로 교환하는 과정을 매개한다.^1,3-5 많은 종래 연구들에서, CETP가 LDL 입자에서의 콜레스테릴 에스테르 축적 과정을 가속화하여, 혈액 순환계로부터 콜레스테롤을 소거하는 과정을 저해하는 것으로 입증되었다.⁴ 역학 조사에서, 일반적으로 CETP 결핍 개체가 HDL 콜레스테롤 함량이 높고 LDL 콜레스테롤 함량이 낮은 것으로 보고되었다. 이에, CETP는 이상지질혈증과 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 약물 개발에 잠재적인 치료 타겟이 된다.

오늘날, CETP에서 두드러지는 연구들은 인간 혈장내 HDL 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수준 변화에 대한 CETP 활성과 효과를 연구하기 위한 시도로서 수행되고 있다.^5,6 CETP의 발현이 감소된 결과로서의 HDL 콜레스테롤의 다량 존재는 매우 중요하며, 이로써 HDL 콜레스테롤 수준과 죽상동맥경화증 위험 인자 간에 부정적인 상관관계가 보고되었다.⁷ HDL의 죽상동맥경화증 예방 특성은, 말초 세포내 과도한 콜레스테롤을 간으로 배분하여 배출시키는, RCP 프로세스로 작동한다.⁶ 콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 저해 펩타이드 및 CETP 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 등의, 몇가지 CETP 저해제들이 제조 및 인지되어 있다.^8,9 그러나, 이들 2가지 저해제들은 여전히 연구 중이다. 게다가, 임상 실험으로까지 진전된 CETP 저해제로서, 토르세트라핍 (torcetrapib)으로 지칭되는 약물도 있다. 하지만, 이 제품은, 약물을 복용한 환자들에서 사망률이 높은 것을 고려하면, 임상 실험에 긍정적인 성과를 달성하지 못하였다.¹⁰ 추가적으로 연구를 진행하였을 때, 토르세트라핍은 환자의 혈압을 증가시켜, 사망에 이르게 하였다.

본 발명에서는, 인도네시아 고유 식물로서, 통상 뜰에 장식용 식물로 또는 정원에서 음성 식물 (shade plant)로서 볼 수 있는, 지역적으로는 "막코타 데와(mahkota dewa)"로 알려져 있는, 한가지 허브 식물의 추출 방법과 용도를 기술한다. 이 식물은, 놀랍게도, 줄기, 과육 또는 잎을 이용함으로써, CETP 저해제로서 사용할 수 있다. 본 발명 이전에는, 본원에 청구된 CETP 저해제로서의 팔레리아 마크로카파의 용도나 이점을 기술하는 어떠한 연구도 이루어지지 않았다.

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본 발명에 제공되는 과제 및/또는 해결책은 바람직한 구현예들에서 기술될 것이다. 기술된 구현예들은 본 발명을 이해하기 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 실시를 통해 습득할 수 있는 다른 구현예들의 변형, 조합 및/또는 수정 가능성을 제한하진 않는다. 본 발명에 개시된 과제 및/또는 해결책들은 본원의 청구범위에 상세히 기술된 요소들과 조합들로부터 구현될 것이다.

본 발명의 과제에 따른 해결 방안을 얻기 위해, 구현예들에서 설명되고 본 출원에 광의적으로 기술된 바와 같이, 본 발명의 제1 측면은, 유기 용매 추출에 의해 제조되며, 콜레스테릴 에스테르 트랜스퍼라제 단백질 (CETP) 저해제로서 효과적으로 제공되는, 팔레리아 마크로카파 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 제2 측면은, HDL 콜레스테를 수치는 높이고 LDL 콜레스테롤 수치는 낮추는데 유용한 유효량 또는 용량의, 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서의, 팔레리아 마크로카파의 추출물, 또는 이의 분획(들) 또는 화합물 군에 관한 것이다.

본 발명의 제3 측면은, (1) 단독 활성 성분으로서 또는 조합물로서, 유효량 또는 용량의, 팔레리아 마크로카파 추출물 또는 이의 분획(들), 및 (2) 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체(들), 부형제(들) 또는 첨가제(들)를 포함하며, 비제한적인 예로서 CETP 저해제로서 기능하는, 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 도면에 대한 설명을 기술한다.
도 1은 0-100 ㎍/ml 농도에서 DLBS1449가 CETP 유전자 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 도표이다.
도 2는 DLBS1449가 단백질 수준에서 CETP 활성에 미치는 영향을 나타낸 도표이다.
도 3은 DLBS1449가 CETP 및 ApoA-1에 대해 단백질 수준에서 미치는 영향을 나타낸 웨스턴 블롯 분석의 결과인 단백질 밴드이다.
도 4는 CETP 전사 조절 프로세스에 관여하는 LXR-α 및 SREBP-1 유전자 발현에 대한 DLBS1449 처리 효과를 나타낸 도표이다.
도 5는 역방향 콜레스테롤 수송 (RCT) 프로세스에 관여하는 LDL-R, SR-B1 및 ApoB 유전자 발현에 대한 DLBS1449 처리 효과를 나타낸 도표이다.
도 6은 CYP11B2 유전자 발현에 대한 DLBS1449 효과를 나타낸 도표이다.
도 7은 CYP11B1 유전자 발현에 대한 DLBS1449 효과를 나타낸 도표이다.
도 8은 아라키돈산 및 리놀레산 불포화 지방산, 및 이들과 DLBS1449의 조합이, CETP 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도표이다.

본 발명은 제시된 실시예를 들어 상세히 기술되지만, 기술된 실시예들로 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 교시 내용에 따른 추출물 및/또는 분획은 팔레리아 마크로카파로부터 수득된다. 추출 방법과 CETP 저해제로서의 DLBS1449의 효과를 본원에 기술한다.

A. 팔레리아 마크로카파의 추출 방법

본 발명에서는 팔레리아 마크로카파의 추출 방법을 교시하며, 이를 통해 CETP 저해제로서의 활성을 가진 추출물을 수득할 수 있다. 본 발명에 교시된 추출 방법은 유기 용매를 이용한 침출 (maceration) 및/또는 삼출 (percolation) 시스템을 이용한다. 팔레리아 마크로카파의 건조 절편, 바람직하게는 이의 과육을, 원료에 대해 8-12 중량 배의 유기 용매로 추출하거나, 및/또는 10-60℃, 바람직하게는 25-50℃의 온도 하에 추출기에서 삼출하였다. 본 공정에 사용한 유기 용매로는, 비제한적인 예로서, 앱솔루트 상태(96%)이거나 다양한 비율로 희석제로서 물이 포함된 메탄올 및 에탄올 등의 알코올이 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 바람직한 유기 용매의 농도는 70-96%이다. 추출 공정은 60 rpm으로 교반하면서 2-6시간 지속하거나, 또는 조정할 수 있다. 액체 추출물은 여과를 통해 펄프에서 분리한다. 건조 추출물을 수득하기 위해, 액체 추출물을 회전증발기를 이용하여 40-80℃ 및 70-550 mba 압력 하에 증발시키거나, 또는 이를 조절할 수 있다. 아울러, 농축물을 2-4시간 동안 진공 오븐에서 건조시켜, 건조 추출물을 수득한다. 본 발명에서는 이 건조 추출물을 DLBS1449로 지칭한다.

본 발명에 기술된 방법으로 수득한 DLBS1449를 추가적으로 특정화하였으며, 그 결과, DLBS1449에는 적어도 지방산, 사포닌 및 페놀 등의 화합물 군(들)이, 특정 생물학적 효과를 제공할 수 있는 다른 이차 대사산물 또는 이의 조합과 함께 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 또한, DLBS1449를 박층 크로마토그래피 (TLC) 방법을 이용하여 정량적으로 동정하였다. TLC 방법에서는 정지상으로 실리카 겔 플레이트를 사용하였고, 이동상으로 클로로포름 : 메탄올 (10:1)을 사용하였다. TLC 결과, DLBS1449에는, 본 발명에서 나중에 기술되는 특정 생물학적 활성을 제공하는, Rf 0.16-0.35의 화합물 군(들)이 포함되어 있는 것으로 확인되었다.

B. DLBS1449가 CETP 발현과 활성에 미치는 영향

본 발명에서 사용한 세포 배양물은 인간 간세포 암종인 HepG2이며, 이 간 세포에서 CETP가 다량 합성된다. 세포를 10% 혈청, 100 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신 항생제 및 1 mM 소듐 피루베이트가 첨가된 최소 필수-α 배지에서 배양하였다. 그런 후, 세포를 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다.

방법

DLBS1449가 CETP 유전자 발현에 미치는 시험관내 효과

HepG2 세포를 6웰 플레이트에 세포 밀도가 70%가 될 때까지 배양하였다. 그런 후, 무-혈청 배지로 배지를 교체한 다음 24시간 배양하였다. 그 후, 이 세포에 DLBS1449를 0 (대조군), 25, 50, 75 및 100 ㎍/ml 농도로 24시간 처리하였다.

RNA 분리 및 실시간-PCR

DLBS1449 처리한 HepG2 세포의 총 RNA를 트리졸 용액을 용액 제품으로부터 입수가능한 방법에 따라 사용하여 분리하였다. 그런 후, 총 RNA를 NanoDrop 장치를 이용하여 측정하고, 전기영동 방법으로 가시화하였다. 아울러, 고품질의 RNA를 사용하여, 최적화된 특정 조건으로 PCR 써모사이클러 장치를 이용한 RT-PCR 공정을 통해 cDNA를 합성하였다.

CETP 활성 측정

본 측정은 키트에서 입수가능한 매뉴얼에 따라 CETP 저해제 약물 스크리닝 키트 (BioVision, USA)를 이용하여 수행하였다. DLBS1449의 사용 농도는 0, 25, 50, 75 및 100 ㎍/ml이었으며, 3세트로 사용하였고, CETP를 첨가하지 않은 동일한 DLBS1449 샘플을 대조군으로 사용하였다.

결과 및 고찰

PCR을 이용한 평가에서, DLBS1449는 CETP 유전자 발현을 mRNA 수준에서 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. CETP 유전자 발현 감소는 DLBS1449 투여량 증가에 따라 커졌다 (도 1). 또한, DLBS1449는, CETP 유전자 발현을 mRNA 수준으로 낮출 뿐만 아니라, 도 2에 나타낸 바와 같이, CETP 활성을 단백질 수준에서 저해하는 능력을 가지고 있다. 이러한 저해 활성은 용량-의존적인 방식으로 이루어진다. 종래 연구들에서, CETP 저해는 HDL 콜레스테롤 수준을 높이기 위한 한가지 전략으로 여겨졌다.^5,6 CETP 결핍은 HDL에서 VLDL 및 LDL 콜레스테롤로의 콜레스테릴 에스테르 수송 프로세스를 저해함으로써, VLDL와 LDL 입자의 형성은 감소되고 HDL 수준은 증가된다. 이러한 상태, 즉 HDL 콜레스테롤 양이 증가된 상태는, 동맥벽에 아테롬 (atheroma) 또는 플라크 형성 저해와 관련된 죽상동맥경화증의 발병 저해 (antiatherogenicity)를 제공한다.⁶ 따라서, 본원에 교시된 바와 같이, CETP 발현과 활성을 저해함으로써, DLBS1449는 혈중 HDL 콜레스테롤 수준을 높일 수 있으며, LDL 콜레스테를의 수준 감소로 인해 죽상동맥경화증의 발병 가능성을 예방할 수 있을 것으로 생각된다. 콜레스테를 수준 상승은 또한 생체내에서도 평가하였다.

C. DLBS1449가, CETP 활성, HDL 및 LDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준에 미치는 생체내 효과

CETP 활성, HDL, LDL 및 트리글리세라이드 수준에 대한 DLBS1449 투여 효과를 확인하기 위해, 백색의 뉴질랜드 수컷 토끼에 대해 생체내 실험을 수행하였다.

방법

실험 동물들을 2가지 그룹, 즉 대조군과 DLBS1449를 처리하는 처리군으로 나누었다. 대조군 토끼에는 DLBS1449를 처리하지 않고, 처리군 토끼에는 DLBS1449를 35 mg/1,5 kg bw 용량으로 경구 투여하였다. 토끼에게 DLBS1449를 4주간 투여하였다. 추출물을 투여하기 전과 투여한 후에, CETP 활성, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이트 수준을 측정하였다. 사용한 샘플은 각 토끼의 귀에서 채혈한 혈장이었다. 측정은 각 효능 파라미터에 대한 특수 키트를 이용하여 수행하였다.

결과 및 고찰

표 2에 나타낸 바와 같이, 실험 결과, 4주간 토끼에 DLBS1449를 처리하면 CETP 활성이 0.3% 까지 감소되는 반면, 대조군의 경우 CETP 활성이 5.13%로 증가되는 것으로 나타났다. 또한, 감소는 LDL 콜레스테롤에서도 관찰되었는데, 처리군에서의 감소는 6.8%이었으며, 이는 대조군 3.2% 감소 수준 보다 높았다. 표 2에서 볼수 있는 바와 같이, 대조군 토끼의 경우 HDL 콜레스테롤 수준이 13.3%까지 감소된 반면, 처리군 토끼의 경우 15.9%까지 증가하였다. 아울러, 각 처리군 동물 각각에서 트리글리세라이드 수준이 증가된 것으로 확인되었지만, 처리군에서의 증가 수준은 대조군 보다 낮았으며, 각각 3.5% 및 16.5%였다.

그 결과, DLBS1449가 토끼의 혈중 콜레스테롤 수준을 효과적으로 통제할 수 있으며, HDL 수준은 증가시키고, CETP 활성과 LDL 및 트리글리세라이드 수준들은 감소시키는 것으로, 확인되었다. 이러한 생체내 실험 결과는 시험관내 실험 결과와 일치하였으며, 이는 DLBS1449가 CETP 저해제로서 사용될 수 있음을 보여준다.

표 1. 실험 토끼에서의 다양한 효능 파라미터들의 특징 및 초기 수준

파라미터 특징 및 초기 수준
	무처리	처리
토끼의 수	6	6
체중	2.4 ± 0.52	2.43 ± 0.48
성별 (남성 대비 %)	100	100
HDL 콜레스테롤 (㎍/100 ㎕)	0.83 ± 0.69	1.26 ± 0.24
LDL 콜레스테롤 (㎍/100 ㎕)	1.56 ± 0.34	1.90 ± 0.85
트리글리세라이드 (nmol/100 ㎕)	28.83 ± 20.16	48.93 ± 9.27
CETP 활성 (pmol/ ㎕/hour)	133.72 ± 15.47	142.06 ± 6.75

표 2. DLBS1449 추출물을 처리하거나 처리하지 않은 토끼에서 CETP 활성, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준 등의 다양한 효능 파라미터들의 초기 수준을 기준으로 한 변화율 %.

파라미터	(초기 수준을 기준으로 변화율 %)
HDL 콜레스테롤 (㎍/100 ㎕)	-13.3	15.9
LDL 콜레스테롤 (㎍/100 ㎕)	-3.2	-6.8
트리글리세라이드 (ng/100 ㎕)	16.5	3.5
CETP 활성 (pmol/ ㎕/hour)	5.13	-0.3

D. DLBS1449가 CETP 및 ApoA-1에 단백질 수준에서 미치는 영향

HepG2 세포를 T-75 플라스크에 세포 밀도가 70%가 될 때까지 배양하였다. 그런 후, 무-혈청 배지로 배지를 교체한 다음 24시간 배양하였으며, 이때 세포 밀도는 80-90%에 도달하였다. 그 후, 이 세포에 DLBS1449를 0, 50 및 100 ㎍/ml로 처리하였다.

방법

세포외 단백질 분리

처리한 배지를 수집하고, 분자량을 기준으로 단백질을 분리할 수 있는 막이 장착된 원심분리관을 이용하여 초기 부피의 10배로 농축하였다. 이 경우, 사용한 막은 분자량이 10 kDa 초과와 미만인 단백질을 분리할 수 있는 막이었다. 분리는 15분간 5000 rpm으로 원심분리하여 수행하였다. 수집되는 단백질은 분자량이 10 kDa 보다 큰 단백질이었다. 그런 후, 농축시킨 배지내 단백질 농도를 브레드포드 방법으로 분석하였다.

웨스턴 블롯 방법을 이용한 CETP 및 ApoA-1 단백질의 분석

그 후, 분리한 단백질을 10% 아크릴아미드가 함유된 겔을 이용하여 분자량에 따라 분리하였다. SDS-PAGE 전기영동 과정을 100 V 전압에서 150분간 수행하였다. 겔내 단백질을 PVDF (폴리비닐리덴 플루오라이드)로 500 mA에서 75분간 작동시킨 블롯팅 키트를 이용하여 이동시켰다. 이동 공정 후, 막을 블롯킹 완충액 (PBS-t 완충액 중의 5% 탈지유)과 함께 2시간 인큐베이션하였다. 그런 후, 막을 인간 ApoA-1 및 CETP 단백질을 인지하는 다클론 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 내부 표준 물질로서, 튜불린 단백질을 인지하는 다클론 항체를 사용하였다. 그런 다음, 계속하여 막을 ApoA-1 및 CETP 단백질에 이미 결합되어 있는 다클론 항체를 인지하여 결합하는 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 과정을 2시간 수행하였다. 그 후, 막에 루미놀 시약을 투입하였다. 루미놀 시약 중에서 이차 항체가 기질을 파괴하여, 발광되며, 이를 암실에서 필름지 상에 검출할 수 있었다.

결과 및 고찰

웨스턴 블롯 결과, DLBS1449가 HepG2 세포가 배지로 분비하는 CETP 단백질을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, CETP 단백질 밴드는 DLBS1449 농도 증가에 따라 희미해졌다. 이러한 결과는 CETP 발현을 mRNA 수준에서 감소시키는 것으로 확인된 도 1의 결과와 일치하였다. 발현이 감소될 수록, 단백질은 적게 생산될 것이다.

생체내 실험 결과를 통해, DLBS1449 처리 후 HDL 콜레스테롤 수준 증가가 확인되었다. 따라서, 웨스턴 블롯 분석을 HDL 입자의 주 파트인 ApoA-1에 대해서도 수행하였다. 도 3은, ApoA-1 단백질 양이 특히 100 ㎍/ml 농도에서 증가되었음을 보여준다. 이러한 결과는, HDL 콜레스테롤의 양 증가가 세포에서 합성되는 ApoA-1 단백질 수준 증가의 결과임을 보여준다. HDL 혈장은, 말초 조직의 콜레스테롤을 담즙산으로 배출되는 간에서의 에스테르 콜레스테릴로 수송함으로써, 죽상동맥경화증을 예방한다. 이 경로의 1차 단계는 콜레스테롤을 받아 이를 HDL로 변환시키는 ApoA-1이다.¹¹ 따라서, ApoA-1 증가는 죽상동맥경화증을 예방하는데 중요한 역할을 하는 HDL 콜레스테롤 수준 증가에 가장 중요한 인자들 중 하나이다.

E. DLBS1449가 CETP 전사 프로세스, 콜레스테롤 수송 및 혈압에 미치는 영향

방법

본 유전자 분석에서는 DLBS1449를 다양한 농도로 처리한 HepG2 세포를 사용하였다. RNA를 HepG2 세포에서 분리한 다음, 정량적인 실시간 PCR 기법을 이용하여 분석하였으며, 이때 각 유전자의 발현 (LXR-α, SREBP-1, SR-B1, LDL-R, ApoB, CYP11B2 및 CYP11B1)을 내부 대조 유전자로서 액틴 유전자의 발현에 대해 정규화하였다. 이 과정에, 각 유전자에 특이적인 프라이머와 어닐링 온도를 사용하였다. 이 프로세스의 결과는 상대적인 발현 카운팅 방법을 이용하여 실시간 PCR 장치에서 소프트웨어로 직접 나타내었다.

결과 및 고찰

DLBS1449가 CETP 전사를 조절하는 유전자 발현에 미치는 영향

CETP 전사는 이의 프로모터에 영향을 미치는 조절자 유전자들에 의해 조절된다. 본 실험에서, 상기한 프로세스에 영향을 미치는 유전자들로는 간 X 수용체 α (LXR-α)와 스테롤 조절 인자 결합 단백질-1 (SREBP-1)이 있다는 것을 조사하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, DLBS1449 처리는 이들 2종의 유전자들의 발현을 감소시킨다.

LXR-α는 CETP 전사를 유도하며 역방향 콜레스테롤 수송 (RCT) 프로세스를 유지시키는, 핵 수용체이다.¹² 이 유전자는 레티노이드 X 수용체 (RXR)에 결합하였을 때 헤테로다이머를 형성하며, 이 복합체는 체내 콜레스테롤 수준을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 간에서, LXR-α는 SREBP-1 유전자 발현을 유도함으로써 콜레스테롤 대사를 매개한다. 따라서, LXR-α 유전자 감소는, 본 실험에서 확인된 바와 같이, 또한 SREBP-1 유전자 감소를 야기할 것이다.

SREBP-1은 CETP를 비롯하여 다른 유전자를 활성화함으로써 콜레스테롤 합성을 조절하는 전사 인자이다. 아울러, SREBP-1 유전자의 발현 감소는 CETP 유전자 발현 감소를 의미한다. 이러한 상관성은 간으로 배분되는 소포체내 과도한 콜레스테롤의 양과 관련된 네거티브 피드백 시스템을 발동시킨다.¹¹ 기존에 연구된 CETP 발현 감소는 체내 CETP 유전자 자체의 저해 또는 감소를 유도하는 CETP 전사 인자의 발현 감소와 일치한다. 본 발명에서는, DLBS1449가 CETP를 전사 수준과 단백질 합성 수준에서 저해함으로써 콜레스테롤 수준을 조절한다는 것을 명확하게 입증해준다.

DLBS1449가 콜레스테롤 수송 프로세스에 참여하는 유전자 발현에 미치는 영향

DLBS1449는, CETP에 대한 영향 외에도, 체내 콜레스테롤 대사와 관련된 다른 유전자에도 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다. 이 경우, DLBS1449가 콜레스테롤 분배와 이의 구성 유전자들에 미치는 영향을 추가로 연구하였다. 역방향 콜레스테롤 수송 (RCT)은 세포에서 동맥벽으로의 콜레스테롤 수송, 혈장을 통한 간으로의 콜레스테롤 분배 뿐만 아니라 담즙을 통한 배출 프로세스를 포함한다. 이러한 프로세스는 콜레스테롤 수송을 촉진시키는 유전자들과 관련되어 있다.⁶ 이러한 유전자로는 스캐빈져 수용체 클래스 B 타입 1 (SR-B1), LDL 수용체 (LDL-R), 아포리포단백질-B (ApoB)를 포함한다.

실험 결과, DLBS1449가 콜레스테롤 수송에 작용하는 유전자들의 수준을 조절할 수 있는 것으로 확인되었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, SR-B1 유전자, 즉 HDL 콜레스테롤 수용체의 발현은 투여 용량 증가 (25-100 ㎍/ml)에 따라 감소되는 반면, LDL-R 유전자는 유전자 발현 수준에서 증가되었다. 이러한 LDL-R 유전자 발현은 DLBS1449 50 ㎍/ml일 경우에 최대 증가를 보였는데, 이는 대조군 발현의 최대 3.4배였으며, DLBS1449가 75 및 100 ㎍/ml인 좀더 높은 농도에서는, 유전자 발현이 여전히 높았지만, 대조군에 비해 각각 2.6 및 1.5배로 좀더 낮았다 (도 5). 그 외에도, 도 5에서, LDL 콜레스테롤 구성 성분인 ApoB 유전자 발현은 투여 용량 증가 (25-100 ㎍/ml)에 따라 감소되는 것으로 나타났다.

SR-B1 유전자 발현 감소는 혈중 HDL 콜레스테롤 수준과 반비례하였으며, 따라서 HDL 대사가 감소되어, 혈중 이용가능한 HDL 콜레스테를의 수준 증가를 유도하였다. SR-B1은 LDL 대사 과정을 매개함으로써 작동하는 것으로 알려져 있지만, 분해 과정에 기능하지도 HDL 구성 성분으로서 이용되지도 않는다.^11,13 게다가, RCT 프로세스를 보조하는 CETP 활성 감소가 SR-B1 경로를 통해 선택적으로 HDL 대사를 증가시킬 수 있음을 보여주는 몇가지 증거들이 발견되었다. SR-B-1 유전자 발현과 CETP 활성의 감소에 의해, HDL 콜레스테롤은 증가하게 된다. 한편, LDL-R 유전자 발현이 증가하고 ApoB 유전자 발현이 감소되는 조건에서는, 간에 의한 LDL 콜레스테롤 대사가 LDL 수용체를 통해 증가되며, ApoB 유전자에 의해 매개되는 새로운 LDL 입자 합성은 없는 것으로 나타났다. 즉, 혈중 콜레스테롤 수준은 감소하게 된다.

DLBS1449가 CYP11B2 및 CYP11B1 유전자에 미치는 영향

임상 실험 단계에 돌입한 한가지 CETP 저해제는 토르세트라핍이다. 그러나, 이 약물은 약물을 복용한 환자에서의 많은 사망 건수로 인해 임상 실험을 통과하지 못하였다. 환자 사망은 혈압 증가에 의한 것이었다. 일부 문헌들에서는, CYP11B2와 CYP11B1의 발현 증가, 뿐만 아니라 인간 혈압과 관련된 알도스테론 신타제의 양 증가로 인해 발생되는 것으로, 기술되어 있다. CYP11B2와 CYP11B1은 코르티솔 및 알도스테론 생합성의 최종 단계에 각각 작용하는 2가지 효소이다.¹⁴ 유사한 현상을 피하기 위해, DLBS1449가 CYP11B2 유전자와 CYP11B1 유전자에 미치는 영향을 분석하였다. 이러한 실험의 결과, DLBS1449가 CYP11B2와 CYP11B1의 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 것으로 확인되었다. CYP11B2 유전자 발현은 DLBS1449 용량이 50 ㎍/ml이 될 때까지 감소되었으며, DLBS1449 용량이 100 ㎍/ml이 될 때까지 발현 수준은 일정한 것으로 보였으며 (도 6), 이때 감소 수준은 정상 조건의 60%였다. 그 외에도, 유전자 발현 감소는 DLBS1449를 최대 100 ㎍/ml로 처리한 CYP11B1 유전자에서도 확인되었으며, 이때 감소 수준은 75-80%였다 (도 7). 따라서, CYP11B2와 CYP11B1의 유전자 발현 감소를 포괄하는, 본 발명의 교시 내용에 따른, DLBS1449가, 혈압 증가 없이도 CETP 저해제로서 안전하게 사용할 수 있는 것으로 결론지어졌다.

F. CETP 유전자 발현에 대한 이중 불포화된 지방산과 DLBS1449의 조합 효과

다양한 체인 길이와 불포화 수준을 가진 지방산이 지질 대사에서 효소 및 단백질의 발현에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서, 이중 불포화된 지방산과 이와 DLBS1449의 조합이 CETP 유전자 발현에 미치는 영향도 조사하였다. 이중 불포화된 지방산은 CETP 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 실험에 사용된 지방산은 아라키돈산 (AA)과 리놀레산 (LA)인데, 이러한 타입의 지방산은 CETP 유전자 감소에 유의한 효과를 가진 것으로 알려져 있는 높은 불포화 수준을 가지고 있다.

방법

HepG2 세포를 6웰 플레이트에 세포 밀도가 60%가 될 때까지 배양하였다. 그런 후, 무-혈청 배지로 배지를 교체한 다음 24시간 배양하였다. 그 후, 이 세포에 아라키돈산 30 μM, 리놀레산 30 μM, 아라키돈산 + DLBS1449 75 ㎍/ml의 조합물, 및 리놀레산 + DLBS1449 75 ㎍/ml의 조합물인 4가지 다른 처리를 처리하였다. 이들 처리는 24시간 동안 수행하였다.

RNA 분리 및 실시간-PCR

LBS1449 처리한 HepG2 세포의 총 RNA를 트리졸 용액을 용액 제품으로부터 입수가능한 방법에 따라 사용하여 분리하였다. 그런 후, 총 RNA를 NanoDrop 장치를 이용하여 측정하고, 전기영동 방법으로 가시화하였다. 아울러, 고품질의 RNA를 사용하여, 최적화된 특정 조건으로 PCR 써모사이클러 장치를 이용한 RT-PCR 공정을 통해 cDNA를 합성한다.

결과 및 고찰

농도 30 μM에서, 이중 불포화된 지방산 타입인 아라키돈산과 리놀레산은 CETP 유전자 발현을 감소시킬 수 있었으며, 리놀레산에 의한 감소율이 더 높게 나타났다 (도 8). 이들 불포화된 지방산들을 DLBS1449 75 ㎍/ml과 조합한 경우, CETP 유전자의 발현 감소율이 더 증가하였다 (도 8). 지단백질 입자내 지방산의 농도는 CETP에 의해 매개되는 에스테르 콜레스테릴 수송에 영향을 미치는데, 지방산의 농도가 낮을 경우 CETP 활성을 자극하여 증가시킬 것이며, 반면, 지방산 농도가 최적 수준으로 증가된 경우 CETP 활성을 저해하게 될 것이다.²

mRNA 수준에서의 분석은 CETP 단백질 분비 프로세스에 중요한 결정인자이다. 본 실험에서, CETP의 발현은 불포화 지방산에 의해 mRNA 수준에서 감소되는 것으로 확인되었다. 또한, CETP 발현 감소는 기존 연구들에서 확인된 바와 같이, 생성되는 CETP 매스(mass)에 영향을 미친다.² 게다가, 본 발명은, CETP 유전자 발현에 대한 불포화 지방산과 DLBS1449의 조합물이 미치는 효과를 기술한다. 데이타에 따르면, 이중 불포화 지방산과 DLBS1449의 조합이, CETP 유전자의 발현을 감소시키는데 긍정적인 상관성이 있었으며 (도 8), DLBS1449 첨가시 CETP 유전자 발현의 감소 폭이 더 커졌다.

G. 조성물, 약학 조제물 및 기능 식품

본 발명은, DLBS1449를 단일 성분 및 조합물 2가지 형태의 활성 성분으로서 유효량 또는 유효 용량으로 포함하며, 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체, 부형제 또는 첨가제를 포함하는, 약학 조성물을 포함한다.

본원에 기술된 약학 조성물의 제조 방법에 있어서, 활성 성분 DLBS1449는 부형제(들)와 혼합되거나, 부형제(들)에 용해되거나 또는 캡슐제, 사세제(sachet), 페이퍼 또한 기타 패키징 물체 포장 형태로 제조될 수 있는 담체(들)내에 혼합될 수 있다.

약제학적으로 승인된 부형제가 용매로 사용되는 경우, 부형제는 활성 성분에 대한 담체 또는 매질로서 작용하는, 고체, 반고체 또는 액체(경구 및 주입) 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은, 환제, 캡슐제, 정제, 산제, 사세제, 용액제, 시럽제, 에멀젼제, 현탁제, 발포성 정제, 겔, 연고제, 크림 및 구강청결제, 마사지 오일, 좌제 또는 주사제의 형태로 제조할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 DLBS1449를 포함하는 약학 조성물은 보충제, 비타민, 뿐만 아니라 식품 및 음료 제품으로도 제조할 수 있다.

적합한 부형제의 일부 예로는 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트 등이 있다. 또한, 본 발명의 교시 내용에 적합한 제형은 윤활제(예, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일), 습윤제, 보존제, 감미제 및 향료도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 약학 산업에서 사용되고 있는 방법을 이용하여, 환자가 상기한 제형을 복용한 후, 활성 성분이 즉시 방출되거나, 서서히 방출되거나 또는 조절된 형태로 방출되는 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 정제 또는 환제는 추출물의 반감기를 길게 하기 위해 코팅하여, 사용 횟수를 줄일 수 있다.

상기 조성물을 정제와 같은 고체 형태로 제형화하는 방법으로, 활성 성분으로서 EDLBS1449를 부형제(들)와 혼합하여, 본 발명에 따른 조성물로부터 균질한 혼합물을 포함하는 초기 제형을 제조할 수 있다. 이 초기 제형은 활성 성분, 즉 DLBS1449가 균질적으로 분산되어 있는 혼합물이므로, 이 제형을 적절한 투여량에 따라, 캡슐, 정제 또는 환제 등의 형태로 공급할 수 있다.

본 발명에 따른 정제 또는 환제에는, 상기 조성물, 또는 활성 성분인 DLBS1449로 인한 쓴 맛을 줄이거나 감추기 위해, 추가적인 보호층을 부가할 수 있다.

본 발명에 따른 DLBS1449의 유효 농도 또는 용량은, CETP 저해제로서 추출물을 사용하는 농도 또는 용량이다. 상기 유효 농도는 환자의 신체 상태 (체중, 나이 및 기타 인자 등); 뿐만 아니라 암 세포의 타입, 크기 및 수, 그리고 기타 타겟화된 병리학적 상태에 따라 결정된다. 허브 포뮬레이션 유래의 음료 등의 액체 제형은, 활성 성분인 DLBS1449를 물 또는 기타 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스 또는 기타 혼용가능한 물질 등과 혼합함으로써 제조할 수 있다.

시럽 제형의 제조에는, 허브 포뮬레이션에서, 앞서 설명한 음료 제조에서와 같은 물질들이 요구된다. 그러나, 시럽을 제조하기 위해서는, 증점제, 안정화제 및 기타 물질 등의 다른 성분(들)도 요구된다.

젤리와 같은 반-고체 제형의 제조는 활성 성분 DLBS1449를 젤라틴, 카라기난, 펙틴, 아라비아 검, 구아르 검 및/또는 기타 물질 등의 특정한 친수성 콜로이드와 혼합함으로써 수행할 수 있다.

비스킷, 빵 및 케? 등의 고체 식품 제품에서의 허브 포뮬레이션은, 활성 성분 DLBS1449를 신체 건강에 중요한 효과를 가진 성분으로서 사용함으로써, 수행할 수 있다. 본원에 교시된 바에 따른 비스킷, 빵 및 케? 등의 고체 식품의 제조는 버터, 당, 난, 염 및 기타 지지 물질(supporting material)과 같은 물질을 이용하여 통상적인 제조 방법에서와 같이 수행한다.

DLBS1449의 추출물 또는 약학 조성물은, HDL 콜레스테롤 수준을 증가시키고 LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 CETP 저해제로서 사용되는, 추출물, 건조 분말 추출물, 및/또는 약학 조성물, 특히 고체, 반-고체 또는 액체일 수 있는 경구 투약 형태의 약학 조성물, 또는 식품 및 음료 조제물의 제조시, 산업적인 규모로 생산할 수 있다.

Claims

하기 단계를 포함하는 공정에 의해 수득되는, 팔레리아 마크로카파 (Phaleria macrocarpa) 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군:
(a) 팔레리아 마크로카파를 유기 용매를 이용하여 10-60℃의 온도에서 교반하면서 추출하는 단계, 및
(b) 상기 단계 (a)에서 이용된 상기 유기 용매를 증발시키는 단계.
제1항에 있어서, 상기 추출 단계에서 이용되는 상기 유기 용매가 70 - 96% 농도의 알코올을 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제1항에 있어서, 적어도 지방산과 사포닌 및 페놀로 이루어진 화합물 군, 및 특정한 생물학적 효과를 제공하는 기타 이차 대사산물 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제1항에 있어서, CETP 유전자의 발현과 활성을 억제하기 위한 유효량 또는 유효 용량의, 단일 활성 성분 또는 조합물 형태인 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제1항에 있어서, HDL 콜레스테롤 수준을 높이기 위한 유효량 또는 유효 용량의, 단일 활성 성분 또는 조합물 형태인 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제5항에 있어서, 상기 팔레리아 마크로카파 추출물이 ApoA-1 단백질 수준을 증가시키고 SR-B1 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제1항에 있어서, LDL 콜레스테롤 수준을 낮추기 위한 유효량 또는 유효 용량의, 단일 활성 성분 또는 조합물 형태인 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제7항에 있어서, 상기 팔레리아 마크로카파 추출물이 LDL-R 유전자 발현을 증가시키고 ApoB 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제1항에 있어서, 상기 팔레리아 마크로카파 추출물이 혈압 상승을 유발하지 않는 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
제9항에 있어서, 상기 추출물이 CYP11B2와 CYP11B1의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 추출물 및/또는 이로부터 유래된 분획 또는 화합물 군.
죽상동맥경화증 발병 저해와 관련있는 항-죽상동맥경화증 제제로서, 약학 조성물, 보충제, 식품 또는 음료를 제조하기 위한,
약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체(들), 부형제(들) 또는 첨가제(들)를 포함하는, 단독 형태 또는 조합물 형태의 활성 성분으로서, 유효량의, 제1항에 따른 추출물의 용도.
단독 형태 또는 조합물 형태의 활성 성분으로서 사용되는 제1항에 따른 추출물과, 약제학적으로 허용가능하며 생리학적으로 적합한 담체(들), 부형제(들) 또는 첨가제(들)를 포함하며,
고체, 반고체 또는 액체 형태로 멸균 제품 또는 비-멸균 제품으로 제조되는, 약학 조성물.
단독 활성 성분 또는 조합물로서, 제1항에 따른 추출물 및/또는 분획을 포함하는, 건강에 유익한 식품 또는 음료 제품.