TW201242602A - Phaleria macrocarpa extract, extraction process and its use as Cholesteryl Ester Transferase Protein (CETP) inhibitor - Google Patents

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201242602 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種皇冠樹之萃取物，該萃取物就本發明之 目的而言係稱為DLBS1449藥物，包括其萃取方法以及該萃取 物之生物活性’所述生物活性顯示了其對膽固醇酯轉移蛋白的 表現與活性之抑制活性。 【先前技術】 膽固醇醋轉移蛋白(Cholesteryl Ester Transferase Protein， CETP)是一個分子量為74 k〇a的醣蛋白，且其具有疏水性的 性質。膽固醇酯轉移蛋白主要是由肝臟合成而來，並分泌至 血漿中。此外，膽固醇酯轉移蛋白也在淋巴、脂肪組織、心臟、 腎臟及小腸中有較低濃度的表現。2膽固醇酯轉移蛋白在反向 膽固醇運輸(Reverse Cholesterol Transport，RCT)的過程中，扮 演了將高密度脂蛋白(HDL)顆粒中的膽固醇酯交換成低密度 脂蛋白(LDL)及極低密度脂蛋白(VLDL)顆粒中的三酸甘油脂 之媒介角色。W許多先前的研究已顯示出，膽_§旨轉移蛋 白會加速在低密度脂蛋白顆粒中的膽固_旨堆積過程，這導致 膽固醇從血液循環的排除過程的抑制。4在流行病學研究中已 報導帶有基因性膽固_旨轉移蛋白缺陷的個體會具有較高量 的高密度脂蛋__她低量的低密度脂蛋蝴固醇。因 此，在企脂異常症及動脈粥狀硬化症治賴藥物開發中，膽固 醇酯轉移蛋白成為了-種可朗治療標的。 現今，著重於膽固醇酉旨轉移蛋白的研究，係以研究膦固醇 醋轉移蛋㈣活性，从其在人麻漿帽於高密度脂蛋白膽 201242602 固醇與三酸甘油脂的交換之效用等研麵行。5,6由於膽固醇醋 轉移蛋白表現量減少而導致之高數量高密度脂蛋白膽固醇是 非常重要的，且已有報導高紐脂蛋白膽_數频動脈粥狀 硬化危險因子之間有負相關_。7高密度脂蛋白的保護特性 是在其於反向膽_運輸過財所扮演的肖色，邊细胞中 ㈣有—些__轉移蛋白 抑制物被製造及研究，例如膽固醇轉移㈣㈣性胜狀 _esteiyl ester tran_ ^ 酉旨轉移蛋白反義寡去氧核苦酸（CETp oligodeoxynucleotides, ODNs) 〇 研究當中。此外’有-種作為膽固醇_移蛋白抑制物的藥 物’ t__ib，已發展至臨床試驗上。然而，鑒於服用該藥 物的病人之高壯數，此tGrcetrapib產品在臨賴驗中並沒有 產生正面的結果。1D在進—步的研究之後，㈣伽帥產品會 造成病人血壓的升高，並導致死亡的情形。 +在本毛明巾’教示了草本植物皇冠樹 的萃取方法及使时式。皇冠樹是—種印尼本土植物，在當地 也稱作Mahkota Dewa ’其通常在庭院中作為觀賞植物，或在 化園中作為耐紐物。出人意外地，此植物可藉由利用其根 部、果肉或葉子而作為膽固醇酯轉移蛋白抑制物。在本發明之 月J並未有任何說明本發明所要求保護皇冠樹萃取物作為膽固 醇醋轉移蛋白抑制物的使用或效益之研究。 【發明内容】 本發明所提供之目的和/或解決方案將於較佳實施例中提 201242602 ^該等所示之實施例的目的_來 他實施例在轡仆卜4人，< 4β並不限制其 而得之可Ί 士 良上可藉由本發明的實施 "Ία/ 本發㈣崎τ之目_σ/鑛財帛將可由申 凊專利範_詳述之元件及其組合而實現。案將了由申 样日轉狄目贼解財案，城等實施渐述以及 -%所廣泛描述内容，本發明之第一目的在提供 =的萃取物，該萃取物係勤在有機溶射進行萃取而製 且有效作為膽固醇酯轉移蛋白(CETp)抑制物。 本發$之帛二目的在提供—種皇職的萃 物或由其化合物群組，鮮取物在—有效數量_^= ;θ加回达度脂蛋白膽固醇表現量，以及降低低密产 白膽固醇麵量之單—有效成分或複方成分。 本發明之第三目的在提供一種醫藥組合物，其包括： (1) 皇冠樹之萃取物，或其分餾物，且其係為—有效數量 或劑量之單一活性成分或複方成分 ;以及 (2) 醫藥上可接受及生理上需要之載體、賦形劑或添加 劑’其係做為但不限於膽固醇酯轉移蛋白抑制物。 【實施方式】 以下將藉由提供多個實例來詳細討論本發明’但並不限制 本發明之範圍於該等實例中。 根據本發明所教示之萃取物及/或分餾物，係由皇冠樹所 侍到。以下將描述其萃取方法以&DLBS1449藥物作為膽固醇 酯轉移蛋白抑制物的效用。 5 201242602 Α·皇冠樹之萃取方法 本發明將教示皇冠樹之萃取方法，其中，係可得到具有膽 固醇酯轉移蛋白抑制物活性之萃取物。本發明所教示之萃取^ 法係以有機溶劑使用浸泡法(macerati〇n)及/或展透系統。皇冠 樹的乾燥切片，優選其果肉，係以重量為原材料8_12倍之有 機溶劑進行萃取’以及/或在萃取器中以10-6(TC的溫度浸透， 優選溫度為25-5(TC。在此方法中所使用的有機溶劑包括但不 P艮於酒精’所職精包括但不限於㈣齡(％%)下的甲醇及 乙醇，或是在比較下具有水作為稀釋液之甲醇及乙醇，其中， 優選的有機鋪濃度為70_96°/〇。萃取棘係持續2_6小時， 並在轉速6Grpm _件下精獅，娜讀祕可受調整改 變。液態萃取物係藉由過滤而自黏漿狀物質中分離出來。為了 得到乾燥料取物，液態萃取物係在胸叱的溫度及壓力範 圍在70·55〇毫巴的條件下，藉由旋轉蒸發器㈣咖㈣而去除 其水份，而所述條件係可受調整改變。再者，得到的濃縮物係 以真空方式進打2-4小時的乾燥，以得到乾燥的萃取物。該乾 燥的萃取魏本發明之目邮言係稱為则浦9藥物。 藉由本發明所教示之方法所得到的DLBS1449藥物已受 進步的疋性，且其結果顯示了 DLBS1449藥物至少包含了脂 肪酸、皂甘(saponin)及酚(phenol)化合物所組成的化合物群 組’加上其他二次代謝物或其可具有特定生物效應之組合物。 此外’ DLBS1·藥物亦可藉由薄層色層分析法(Thin [啊

Chr〇matography，TLC)而進行定性之確認。此薄層色層分析法 係使用石夕膠板作為層析固定相(麵_沖㈣，以及使用三氯 6 201242602 甲燒.甲醇=10:1的展開液作為流動相(m〇biiephase)。薄層色層 分析的結果顯示DLBS1449藥物包含了 Rf值為0.16-0.35的化 合物群組，且其具有特定生物活性，本發明將進一步描述其生 物活性。 B· DLBS1449藥物對於膽固醇酯轉移蛋白的表現及活性之影 響 本發明所使用的細胞係為人類肝癌細胞HepG2,而膽固醇 醋轉移蛋白係在肝臟細胞中所合成。細胞係培養在添加有10〇/〇 血清、100微克/宅升盤尼西林_鏈徽素〇5eniCillin_Strept〇myCin) 抗生素以及1毫體積莫耳濃度(mM)丙嗣酸納(sodium pyruvate) 之最低必需培養液(Minimum Essential-alpha medium)内。這些 細胞接著在37°C及5% C02的條件下培養24小時。 方法 DLBS1449藥物在體外(in vitro)對於膽固醇酯轉移蛋白的基因 表現量之影響

HepG2細胞係培養在6孔的培養盤中，直到細胞密度達 到70%。接著以無血清之培養液更換培養液，並再培養24小 時。這些細胞係接著以不同濃度的DLBS1449藥物處理24小 時：〇(控制組）、25、50、75、及1〇〇微克/毫升(μβ/Γη1)。 RNA之分離與即時聚合酶鏈鎖反應儀(Rea丨Time pcr)結果 以DLBS1449藥物處理的HepG2細胞的組織核糖核酸 (Total RNA)係藉由Trizol溶液，並根據其使用步驟而分離出 201242602 來。接著以超微量核酸蛋白質定量光譜儀(Nano-Drop machine) 測1E該組織核糖核酸’並以電泳法顯現該核糖核酸。此外，品 質佳的核糖核酸係藉由反轉錄聚合酶鏈鎖反應方法及聚合酶 鏈鎖反應儀（PCR Thermocycler machine) ’在特定的最佳條件 下合成其互補去氧核糖核酸(cDNA)。 膽固醇酯轉移蛋白活性的測量 此測量係使用膽固醇酯轉移蛋白抑制物藥物篩選試劑組 (CETP Inhibitor Drug Screening Kit，BioVision，USA) ’ 並根據其 使用手冊而進行。所使關DLBSM49藥物濃度係為〇、^、 5〇 75、及100微克/毫升，並以三重複㈣iicate)的方式進行 測量’而未添加膽固醇酯轉移蛋白的DLBS1449藥物樣本係作 為控制組。 結果與討論 使用聚合酶鍵鎖反應方法的研究顯示了 DLBsi449 係可在降低__旨轉移蛋自_八（訊息錄嫩)的其 表現量。在DLBS需藥物施用量增加時，膽固醇醋轉移^ 基因表現量的減少程度舰之增高（如第丨圖所示）。 低膽固醇酯轉移蛋白mRNA的基因表現量之外，降 藥物也具有作為膽_轉移蛋白之蛋白活性抑制物3 力，如第2圖所示。此抑制活性係具有劑量 = (dose-dependent manner)。先前的研穿扣山 i 寺r生 的抑制是提升高密度脂蛋白膽 膽固醇S旨轉移蛋自躲乏會造成__轉移過財，從内密 8 201242602 度脂蛋白到健度脂蛋白及極絲度脂蛋自的_醇受到抑 制’因此，储度脂蛋自及極減度脂蛋白驗會減少，且高 密度脂蛋㈣表齡增加。_高密度脂蛋白膽_數量增加 的清况產生與抑制動脈粥狀瘤形成以及動脈管壁上的班塊有 關之抗動脈粥狀硬化性(antiatherogenicity)。6因此，本發明藉 由對於膽固醇s旨轉移蛋白的表現及活性之抑制，而x認^ =LBS1449藥物可提高血液中高密度脂蛋白膽固醇的表現 量’並在低密度脂蛋白膽_的表現減少時防止動脈粥狀硬化 的可能性。所述膽_數量的提高係進—步進行體内⑼—ο) 分析。 C· DLBS1449 Μ物在體内對於膽轉醋轉移蛋白的活性高密 度月曰蛋白和低密度脂蛋白的膽固醇及三酸甘油脂表現量之 影響 為了確認DLBS1449藥物的施用對於膽固醇酯轉移蛋白 活性、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及三酸甘油脂表現量之影 響，係在雄性紐西蘭白兔内進行體内研究。 方法 試驗動物係被分配為控制組以及施以DLBS1449藥物之 治療組。控制組的紐西蘭白兔並未被施以DLBS1449藥物，而 其他在治療組中的紐西蘭白兔則係以35毫克/15公斤體重的 劑量口服餵食DLBS1449藥物。該等紐西蘭白兔係被施以四星 期的DLBS1449藥物。膽固醇酯轉移蛋白活性、高密度脂蛋白

9 S 201242602 和低密度脂蛋自的膽畴及三酸甘油絲現量的量測係 藥前及投藥後進行。所使用的樣本係為由兔子耳朵所採集的: 漿。該測量係以特定的試劑組進行，以得到每一個療效指標。 結果與討論 ★如表2所不，上述研究結果顯示出施以沉細449藥物於 該等兔子四個星期後，會造成膽_酯轉移蛋白的活性減少 3%，而控制組中其膽固醇轉移蛋白的活性則增加了 5视。 亦發現到低密度脂蛋自咖_減讀形，其巾在治療組中°係 減少6.8%，而這係高於控制組的3 2%減少量。可由表2中看 到控制組的兔子之⑥密度脂蛋白膽固醇表現量減少了 13.3% ;另-方面，在治療組的兔子中其高密度脂蛋白膽固醇 表現量則增加了丨5·9%。此外，係發現到每一試驗動物中的三 酸甘油腊表現量增加’然而，治療組增加的量係較控制組為 低’治療組及控制_增加量分別為3 5%及16 5%。 、這結果顯示了 DLBS1449藥物係可有效控繼等兔子的 血液中之膽固醇表現量，其中該高密度脂蛋白的表現量係為增 加曰膽固醇g旨轉移蛋白的活性、低密度脂蛋白及三酸甘油脂表 現里則為減4。此體内研究結果係與上述體外研究結果—致， 且顯不了 DLBS1449藥物係可作為膽固醇醋轉移蛋白的抑制 物。 201242602 表1.在試驗兔子中各種療效指標的指數及初始表現量 指標之指數及初始表現量 _L 未處理 已處理 兔子數1 6 6 體重 2.4 ± 0.52 2.43 土 0.48 性別（雄性比例） 100 100 高密度脂蛋白膽固醇 (μ^ΙΟΟ n\) 0.83 ± 0.69 1.26 ±0.24 低密度脂蛋白膽固醇 (μ^ΙΟΟ μ1) 1.56 ±0.34 1.90 ±0.85 二酸甘油脂（nmol/ΙΟΟμΙ) 28.83 ±20.16 48.93 ±9.27 ' 膽固醇酯轉移蛋白活性 (pmol/ μΐ/hour) 133.72 ± 15.47 142.06 ±6.75 表2.施以或未施卩DLBSIW藥物的試驗兔子中，其膽固醇 膽固醇及三酸甘油鱗各種療姑標_絲現量改變 比率

醋轉移蛋自活性、綠度脂蛋域_、低密度脂蛋白

三酸甘油脂(ng/l〇〇 μΐ) 膽固醇酯轉移蛋白活性 16.5 3.5

-0.3 原Α1的蛋 D.DLBS1449藥物對於膽固醇酯轉移蛋白及脂 白質表現量之影響 3 ’直到細胞密度 清的培養液，並

HepG2細祕在Τ·75轉瓶+進行培養 達到70%。該等生長培養轉著都換成不;血 201242602 培養18-24小時’使細胞密度達到8〇_9〇%。細胞係接著施以〇、 50及100微克/毫升的DLBS1449藥物。 方法 細胞外蛋白質的分離 收集該等經處理過的培養液，並使用具有可依據分子量而 分離蛋白質的馳之細管，將該培養液濃縮為初始體積的十 分之一。在這種情況下，所使用的薄膜係可分離出分子量大於 10 KDa及小於1〇 KDa的蛋白質。所述分離係以5〇〇〇 離 心15分鐘而進行。所要收集的蛋白質是分子量大於10 KDa 的蛋白質。濃縮液巾的蛋自質濃度絲著以Bfadfofd ^量方法 進行測量。 膽固醇自旨轉移蛋白及脂蛋白原A1之西方點墨法蛋白質分析 已分離的蛋白質係接著根據其分子量而以10%的丙烯醯 胺(acrylamide)膠片進行分離。SDS_pAGE (十二烷基硫酸鈉聚 丙稀酿胺膠體)電泳法係以勘伏特的電壓進行15〇分鐘。膠 片中的蛋白質係利用西方點墨法試劑組，以5〇〇毫安培的電流 轉印75分鐘，而轉印至pv〇F(聚二氟乙烯)轉印膜上。在移轉 步驟後’ PVDF轉印膜係浸潤在含5%脫月旨牛奶之pBS_t阻斷 液(blocking buffer, 5% skimmed milk in PBS-t buffer)中 2 小 日夺°接著將PVDF轉印膜與含有會辨認人類脂蛋白原A」 (ApoA-l)及膽固醇轉移蛋白的蛋白質之多株抗體浸泡一起 進仃過夜反應。而會辨認微管蛋白(tubuline)之多株抗體係用作 為内部對照組(lntemal C〇ntr〇1)。接著將該p轉印膜與會辨 12 201242602 認並結合該錄抗體之二次抗體浸潤—起，其巾衫株抗體先 前係已結合脂蛋白原A1與膽固醇酯轉移蛋白的蛋白質。此次 二次抗體制步職進行2小時。接著在該PVDF轉印膜上加 入發光胺試劑(luminol reagent)。該二次抗齡打斷發光胺試劑 中的基質而發出光線，在暗射係可於底片上_到發出的光 線。 結果與討論 西方點墨法的絲_，DLBS1449藥物射減少h印G2 細胞分泌到培養液中的膽固醇酉旨轉移蛋白蛋白質。在第3圖中 可發現到膽固_旨轉移蛋白蛋白質的色帶係隨著DLBS1449 藥物的濃度增加而變細。這結果係與第i圖顯示膽固醇酉旨轉移 蛋白=mRNA表現量減少之結果一致。膽固醇醋轉移蛋白的 表現罝愈減少’其蛋白質的生成數量會較少。 由體内研究的結果可發現到，高密度脂蛋白膽轉的表現 量=ΒΓ49祕的處理後會增加。因此，_方點墨法 勿析㈣度脂蛋白難之蛋白質主要部分輕白原A1 圖:白原A1蛋白質的數量增加’特別是在卿i449 樂t濃度為100微克/毫升的時候。這結果顯示出高密度脂蛋 白=所增加的數量，是細胞所合蝴蛋白原“二 果。血襞中的絲度脂蛋白藉由將膽固醇由週 t嘯峨細翻_旨爾護動脈 術㈣—晴嶋制接收膽固 醇並將其移轉至向密度脂蛋白。π因此，月旨蛋白原A1的辦加 疋增加南密度脂蛋白膽固醇表現量最重要的因素之-，而高0密 201242602 度脂蛋白膽贿在防止動脈粥狀硬化發生巾麟演了重要的 角色。 E· DLBS1449藥物對於膽固醇酯轉移蛋白的轉譯過程膽固醇 的運送及血壓之影響 方法 此基因分析係使用經過各種濃度的DLBS1449藥物處理 之HepG2細胞。由所述HepG2細胞分離出的RNA係接著以 即時定量聚合酶鏈鎖反應儀進行分析，其中，每一基因 (LXR-α、SREBP-卜 SR-B1、LDL-R、ApoB、CYP11B2 及 CYP11Β1)係以内部對照組肌動蛋白基因的表現量做標準化。 在這步驟中，係使用了特定於所使用每一基因的引子^^⑺沉) 及溫度。此方法的結果係直接顯示在聚合酶鏈鎖反應儀上使用 相對表現量定量方法之軟體。 結果及討論 DLBS1449藥物對於調控膽固醇酯轉移蛋白轉譯的基因表現 之影響 膽固醇酯轉移蛋白的轉譯係受到影響其啟動子(promoter) 之調控基因所調控。在本發明實驗中，係研究了會影響該轉譯 過程之基因’包括LXR-α (Liver X Receptor alpha,肝異受體α) 及 S肪BP-1 (Sterol Regulatory Element Binding Protein-1，固醇 調節元素結合蛋白-1)。如第4圖所示，在以DLBS1449藥物 處理後會減少該LXR-α及SREBP-1基因二者之表現量。 201242602 LXR-α基因是一個會誘導膽固醇酯轉移蛋白轉譯及讓反 向膽固醇運輸過絲持之細胞核受體。此LXR_a基因在結合 至視網酸X受體時會形成異源二《，該複合物在體内膽固 醇表現量調節巾係具有4要的角色。在肝射，LXR_a係藉由 誘導SREBP-1基因表現而媒介膽固醇的代謝。因此，本發明 實驗顯示了 LXR_a基因的表現減少也會造成 SREBP-1基因的 表現減少。 SREBP-1是一個藉由活化其他基因而調控膽固醇合成之 轉譯因子’其巾—種基因即為膽固醇轉移蛋自。再者， SREBP-1顧表現量的減少即顯示㈣瞒瞒移蛋白基因 表現量的減少。這之間的關係表示出一種負回饋系統，該負回 饋系統係與要分散到肝臟之内質網過量膽固醇有關。u在先前 的研究中’膽固_旨轉移蛋自表現量的減少健_醇醋轉移 蛋白轉譯因子的表現量〉咸少結果一致，而膽固醇酷轉移蛋白轉 澤因子的表現量減少會導致體内的膽固醇酯轉移蛋白本身受 到抑制或減少。這發現清楚地顯示出DLBS1449藥物會藉由抑 制膽固醇轉移蛋自的轉譯表現及其蛋白質合成，而控制膽固 醇的數量。 DLBS1449藥物對於涉及膽固醇運輸過程的基因的表現之影 響 除了對於膽固醇酯轉移蛋白的效果，DLBS1449藥物亦被 認為可影響其他與體内膽固醇代謝有關之其他基因。在這種情 況下’係進一步研究DLBS1449藥物對於膽固醇的分佈與組成 基因的影響。反向膽固醇運輸包括了將細胞的膽固醇移轉至動 15 201242602 脈管壁、由血漿到肝臟的膽固醇分散、以及利用膽之排出過 程。這過程係與促進膽固醇運輸的基因有關。6這些基因包括 了 SR-B1(B類壹型清道夫受體）、LDLR(低密度脂蛋白受體) 及ΑροΒ(脂蛋白原B)基因。 實驗結果顯不，DLBS1449藥物係可控制這些參與膽固醇 運輸的SR-B1、LDL-R及ΑροΒ基因之表現量。由第5圖可看 出SR-B1及ΑροΒ基因表現量會隨著DLBS1449藥物施加劑 量(25_ιοο微克/毫升)增加而減少，*LDL_R基因的基因表現 則為增加。此LDL-R基因表現在5〇微克/毫升的DLBSM49 藥物下係具有最高的增加量，且該增加量係較控制組高出34 倍，而在較咼濃度(75及1〇〇微克/毫升)的DLBS1449藥物下， LDL-R基因表現量仍為升高，但其增加量較少，分別為控制 組的2.6及1.5倍(如第5圖所示）。此外，在第5圖中亦可看 到低密度脂蛋白膽固醇組成物Ap〇B基因的表現，會隨著施加 劑量(25-100微克/毫升)增加而減少。 SR-B1基因表現量的減少係與血液中的高密度脂蛋白膽 固醇表現成反比’其中，高密度脂蛋白的代謝減少，因而導致 血液中之鬲密度脂蛋白膽固醇數量增加。已知SR_B1係可媒 介低密度縣㈣麟棘，但其未參與減倾蛋白降解過 程，且並未作為高密度脂蛋白的組成物。此外，一些已發現到 的證據顯示，幫助反向膽固醇運輸之膽固醇醋轉移蛋白的活性 減少係可增加純度脂蛋自選擇性麵SR_B1路徑代謝。藉 由減少SR-B1基因表現與膽固醇醋轉移蛋白性 蛋白膽固醇會接著增加。另-方面^ 201242602 及ap〇b基因表現降低的情況下’顯示出由肝臟進行之低密度 脂蛋白膽固醇代謝會經由LDL受體而增加，且不會有新的低 密度脂蛋白顆粒合成由ApoB基因媒介。因此，血液中的膽固 醇數量會減少。 DLBS1449藥物對CYP11B2及CYP11B1基因的影響 在多種膽固醇酯轉移蛋白的抑制物當中，t〇rcetrapib係已 進入臨床試驗階段。然而，torcetrapib藥物因為服用該藥物的 病人之高死亡數而無法通過臨床試驗。上述病人之死亡係因為 血壓的增高而造成。一些相關文獻指出，上述血壓增高的發 生’疋因為CYP11B2(皮質搭酮合成酶)及CYPllBi(np·羥化 酶)基因的表現，以及與人類血壓相關的皮質固酮(ald〇ster〇ne synthase)數量的增加所導致。CYp11B2及cyp11b1基因是兩 種分別作用在皮質固醇(cortis〇1)和醛固酮(ald〇ste_合成過程 最後步驟之酵素。M為了聽近似絲的發生，係接著分析 DLBS1449藥物分別對於CYP11B2及CYP11B1基因的影響。 實驗分析結果顯示，DLBS1449藥物係可減少cypilB2及 CYP11B1基因的表現。CYp贈·的表現量在增加 DLBS1449藥物劑量直至5〇微克/毫升時會減少，並於增加 DLBSI449藥物濃度到1〇〇微克/毫升時，cypilB2基因的表 現量似乎麵定*再有變化’此時所減少的基因表現量係減少 到正常情⑽6G% (如第6騎示）。此外，上述基因表現量的 減少情況’也可在施以1〇〇微克/毫升DLBS1449藥物之 CYP11B1基因上觀察到，且其減少的表現量達到π·，。（如 第7圖所不）。因此’依照本發明所教示CYP11B2及CYP11B1 17 201242602 基因表現減少果，可制DLBS1449難不會增加血壓而 可安全做為膽固醇酯轉移蛋白的抑制物使用之結論。 F.雙鍵不飽和脂肪酸及DLBS1449藥物對於膽固醇酯轉移蛋 白的基因表現之結合效用 已知道具有各種不_結長度和不麵程度的飽和脂肪 酸’在脂肪代謝過程中係對於酵素及蛋白質的表現具有影響效 果。在本發明實驗中，，亦研究了雙鍵不飽和脂肪酸與 DLBS1·藥物的結合對於膽_轉移蛋自的基因表現之 效用。已知道雙鍵不飽和脂肪酸係可減少膽固醇酯轉移蛋白的 基因表現。在本發明實射所個的猶酸係為花生四稀酸 (arachidonicacid’AA)和亞麻油酸(iinoleicacid LA)，這些形式 的脂肪酸储有高度的不飽和減，且已知其高錢和程度對 於膽固醇酯轉移蛋白基因的減少表現係具有明顯的效果。 方法

HepG2細胞係培養在6孔的培養盤中，直到細胞密度達 到60%。接著以無血清之培養液更換培養液’並再培養％小 時。這些細胞係接著以4種不同方式進行24/]、時的處理:3〇μΜ 的把生四稀酸、30μΜ的亞麻油酸、花生四烯酸與75微克/毫 升的DLBS1449 §物的組合物、以及亞麻油酸與75微克/毫升 的DLBS1449藥物的組合物。 RNA之分離與即時聚合酶鏈鎖反應 以DLBS1449藥物處理# HepG2細胞的組織核糖核酸係 201242602 藉由Trizol溶液並根據其使用步驟而分離出來。接著以超微量 核酸蛋白質疋量光譜儀測量該組織核糖核酸，並以電泳法顯現 該核糖核酸。此外’品質佳的核糖核酸係藉由反轉錄聚合酶鏈 鎖反應方法及聚合酶鏈鎖反應儀（pCR Therm〇cyder machine) ’捕定的最佳條件下合成其去氧核糖核酸。 結果與討論 在30μΜ的》f度下’花生四烯酸及亞麻油酸這兩種雙鍵不 飽和脂肪酸係可減少膽固醇g旨轉移蛋白的基因表現，其中，亞 麻油酸造成了較大的減少量(如帛8騎示）。當這些不飽和脂 肪酸與75微克/毫升的DLBSU49藥物結合後，所減少的膽固 醇醋轉移蛋白基因表現更高(如第8圖所示）。脂蛋白顆粒中的 脂肪酸濃度會f彡響由膽轉轉移蛋自所齡的_醇酿轉 移過权’其巾’低濃度的脂则《侧激並提高膽_目旨轉移蛋 白的活性’而在另-方面，脂肪酸濃度增加到最大程度時則會 抑制膽固醇酯轉移蛋白的活性。2 mRNA制分析是膽固醇酯轉移蛋白之蛋白質排出過程 中的-個主要決定因子。在本發明實驗中，已知道膽固醇酿轉 移蛋白在mRNA方面係因為不飽和脂肪酸而減少。在先前的 研究中發現到，膽固醇_移蛋白的表現減少也影響了其所形 成的膽固醇轉移蛋白數量。此外，本發日月也教示了不飽和脂 肪酸與DLBS1449藥物組合物對於膽固醇醋轉移蛋白的基^ 表現之々響。S據顯* 了雙鍵*飽和脂細績翻醇目旨轉移 白在減少細_旨轉移蛋自基因表現上，储有正 (如第8圖所示），其中，藉由腦議藥物的添加，膽= 19 201242602 酯轉移蛋白的基因表現會具有更大的衰滅。 G組合物、醫藥製《及營養製劑 本發明包括含有DLBS1449藥物之醫藥細入私制* DLBS1449藥物之單一及複方成八i古"物製劑，該 么有效數量或劑量下传 為一活性成分，該複域分包料紅可接讀生理上 載體、賦形劑或添加劑。 而要之 在本發明所教示的醫藥組合物製備方法中，活性成分 DLBS1449藥物係可與賦形劑混合、溶解在賦形劑中、^人 式 在載體内’而可製成膠囊、藥囊、含藥紙及其他包裝材料= 若醫藥上認可的賦形劑係當作溶劑而使用，則該溶劑可為 固體、半固體或液體（口服或注射用）形式，以做為活性成分 之載體或介質。因此，本發明所述之醫藥組合物係可製成藥 丸、膠囊、藥錠、藥粉、藥囊、藥液、糖漿劑、藥乳、懸液劑、 發泡錠、凝膠、軟膏、乳膏、以及漱口水、按摩油、栓劑或注 射液等形式。除此之外，包含本發明之DLBS1449藥物的醫藥 、、且5物亦可製成補充品、維他命、食品及飲料產品。 、 舉例來說，合適的賦形劑有結晶牲纖維素、明膠、乳糖、 葡萄糖、蔗糖、山梨醇、己六醇、殿粉、構酸妈鹽、石夕酸約鹽 及其他。合適本發明的配方亦可含有潤滑物質（如滑石粉、硬 脂鎂、礦物油）、潤濕劑、防腐劑、甜味劑及調味料。 本發明之組合物係以製藥業中讓病人在接受此劑量型式 後，會讓活性成分直接地、持續地或受控制地釋出的配方製 201242602 ，。本發明所述之驗或藥丸絲面係有_處理，以延 萃取物之半衰期，進而降低其使用頻率。 " 配製此一組合物成固體形式（如藥錠）的方法係將 DL3S1449 而與賦形劑混合而成，以形成含 1本發明組合物之均質混合物_始配方。該初始配方係為一 含有均勻擴散的DLBS1449藥物活性成分之混合物，故其可依 據適當的劑量而製成如膠囊、藥錠或藥丸等形式。 又 額二卜的保縣係可細至本發明所述之藥錠或藥丸，以降 低或覆蓋該組合物或該活性物質的苦味。 本發明中該有效濃度或劑量下# DLBS1449藥物係為可 作為膽固醇酯轉移蛋白抑制物之萃取物。有效的濃度係根據病 人之生理狀況（包括體重、年齡和其他因素；以及癌細胞的種 類、大小和數量，與其他針對性的病理狀態）。液體形式製劑， 諸如自草本配方而得的飲〇口口，係可藉由將则浦9藥物活性 成分與水或其他表面活性劑混合而製備，上述表面活性劑例如 為經丙纖維素或其他相容材料。 為製備草本配方之糖歸式製劑，麵要諸如上述用以生 產飲品之材料。然而，亦需要其他用以製備糖漿的成分，例如 增稠劑、穩定劑或其他材料。 —半固體形式製劑的製備’例如凝膠物，係可將见脱物 藥物活性成分與某些食用膠混合一起，例如明膠、鹿角菜膠、 果膠、阿拉伯膠、關華豆膠及/或其他材料。 固體形式製歉草本配方，例如餅乾、麵包及蛋糕，係可 藉由將DLBS1449藥物活性成分作為對身體健康有效的重要 21 201242602 成分來製備。本發明所述之餅乾、麵白芬！…》 的製備，係由一般使用奶油、蛋、 製備。

Η·工業上的應用 DLBS1449藥物之萃取物或醫藥組合物係可叫取 粉萃取物及/或醫藥組合物的工業級規模生產，尤其是以用4 L 固體、半固體或液體之口服形式製劑，或是以食品或飲品H 方式生產，而作為膽固醇酯轉移蛋白抑制物之用途，藉以增加 高密度脂蛋自膽_的表現’並減少低密度脂蛋白膽^醇^ 現。 參考資料 1. Cho KH, Shin YW, Choi MS, Bok SH, Jang SH, Park YB. In vivo effects of CETP inhibitory peptides in hypercholesterolemic rabbit and cholesteryl ester transfer protein-transgenic mice. J Biochem Mol Biol. 2002; 35(2):172-177. 2. Hirano R, Igarashi O, Kondo K, Itakura H, Matsumoto A. Regulation by long-chain fatty acids of the expression of cholesteryl ester transfer protein in HepG2 cell. Lipids. 2010;36(4):401-6. 3. Goff WL, Guerin M, Petit L, Chapman MJ, Thillet J. Regulation of human CETP gene expression: role of SP1 and SP3 transcription factors at promoter sites -690, -692, and -37. J Lipid Res. 2003;44(7):1322-1331. 4. Klerkx AH, El Harchaoui K, van der Steeg WA, Boekholdt SM, Stroes ES, Kastelein JJ, Kuivenhoven JA. Cholesterol ester transfer protein 22 201242602 (CETP) inhibition beyond raising high-density lipoprotein cholesterol levels: Pathways by which modulation of CETP activity may alter atherogenesis. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006;26(4):706-15. 5. Barter PJ, Brewer BH. Chapman MJ, Hennekens, CH, Rader DJ, Tall AR. Cholesterol ester transfer protein, a novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerotic. Atherioscler Thromb Vase Biol. 2003;23:160-167. 6. Shah PK. Inhibition of CETP as a novel therapeutic strategy for reducing the risk of atherosclerotic disease. Eur Heart J. 2007. 28:5-12. 7. Fusegawa Y, Kelley KL, Sawyer JK, Shah RN, Rudel LL. Influence of dietary fatty acid composition on the relationship between CETP activity and plasma lipoprotein in monkeys. J Lipid Res. 2001;42(ll):1849-57. 8. Liu K, Ou J, Saku K, Jimi S, Via DP, Sparrow JT, Zhang B, Pownall HJ, Smith LC, Arakawa K. Efficient nuclear delivery of antisense oligodeoxynucleotides and selective inhibition of CETP expression by Apo E peptide in a human CETP-stably transfected CHO cell line. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999;19:2207-2213. 9. Buchko GW, Rozek A, Kanda P, Kennedy MA, Cushley RJ. Structural studies of a baboon (Papio sp.) plasma protein inhibitor of cholesteryl ester transferase. Protein Sci. 2000;9:1548-1558. 10. Tall AR. CETP inhibitors to increase HDL cholesterol levels. N Eng J Med. 2007;356:1364-1366. 11. Huang Z, Inazu A, Kawashiri M, Nohara A, Higashikata T, Mabuchi H. Dual effects on HDL metabolism by cholesteryl ester transfer protein inhibition in HepG2. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009;284:E1210-E1219. 12. Honzumi S, Shima A, Hiroshima A, Koieyama T, Ubukata N, Terasaka N. LXRa regulates human CETP expression in vitro and in transgenic 23 201242602 mice. Cardiovasc Prev Rehabil. 2010;212( 1):139-145. 13. Fidge NH. High density lipoprotein receptors, binding proteins and ligands. J Lipid Res. 1999;40:187-201. 14. Hu Xiao, Dietz JD, Xia C, Knight DR, Loging WT,Smith AH, Yuan H, Perry DA, Keiser J. Torcetrapib induces aldosterone and cortisol production by an intracelllar calcium-mediated mechanism independently of cholesteryl ester transfer protein inhibition. Endocrinol. 2009;150:2211-2219. 【圖式簡單說明】 下列圖式係用以說明本發明中的圖式。 第1圖係為顯示DLBS1449藥物在0-100微克/毫升的濃 度下，其對於膽固醇酯轉移蛋白(CETP)的基因表現量的影響之 基因表現量比較圖。 第2圖係為顯示DLBS1449藥物對於膽固醇酯轉移蛋白活 性在蛋白質表現量上的影響之活性曲線圖。 第3圖係為DLBS1449藥物對於膽固醇酯轉移蛋白及脂蛋 白原A-l(ApoA-l)在蛋白質表現量上的影響之西方點墨分析法 蛋白質色帶結果圖。 第4圖係為顯示以DLBS1449藥物處理後其對於參與膽固 醇醋轉移蛋白轉譯調控過程之LXR-a及SREBP-1的基因表現 量影響之基因表現量比較圖。 第5圖係為顯示以DLBS1449藥物處理後其對於參與反向 膽固醇運輸過程之LDI^SR-Bl及ApGB基因表現量影響之 基因表現量比較圖。 第6圖係為顯示DLBS1449藥物對於（^丨啦基因表現 24 201242602 里的影響之基因表現量比較圖。 第7圖係為顯示DLBS1449 量的影響之基因表現量比較圖。 藥物斟於CYP11B1基因表現 第8圖係為顯示不飽和脂肪酸花生四烯酸、亞麻油酸、以 及其與DLBS1449藥物之組合物對於膽固醇酯轉移蛋白的基 因表現量影響之基因表現量比較圖。 【主要元件符號說明】 25

Claims (1)

1. 201242602 七、申請專利範圍： 1、 一種皇冠樹的萃取物及/或其分減或由其衍生的化合物群 組，其係藉由以下列製程而得到： (a) 以有機溶劑萃取皇冠樹，並在1〇_6〇它溫度下進行攪拌； (b) 蒸發步驟(a)中所使用的有機溶劑。 2、 如申請專利範圍第1項所述之萃取物，其中該萃取方法所使 用的有機溶劑包括但不限於濃度介於70%至96。/。之間的酒 精。 3、 如申睛專利範圍第1項所述之萃取物’其至少包括脂肪酸、 皂甘及酚化合物組成的化合物群組，以及其他二次代謝物或 其具有特定生物效應之組合物。 4、 如申請專利範圍第1項所述之萃取物，其係為在一有效數量 或劑量下，可有效抑制膽固醇酯轉移蛋白(CETP)基因表現與 活性之單一有效成分或複方成分。 5、 如申請專利範圍第1項所述之萃取物，其係為在一有效數量 或劑量下’可有效增加高密度脂蛋白膽固醇(HDL cholesterol) 的表現之單一有效成分或複方成分。 6、 如申請專利範圍第5項所述之萃取物，其中該皇冠樹萃取物 係增加脂蛋白原A-l(ApoA-l)的蛋白質表現，並抑制b類壹 型清道夫受器(SR-B1)基因的表現。 7、 如申請專利範圍第1項所述之萃取物，其係為在一有效數量 或劑量下，可有效降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol) 的表現之單一有效成分或複方成分。 8、 如申請專利範圍第7項所述之萃取物’其中該皇冠樹萃取物 26 201242602 係增加低密度脂蛋白受體(LDL-R)基因的表現，並抑制脂蛋白 原B(ApoB)基因的表現。 9、如申請專利範圍第1項所述之萃取物，其中該皇冠樹萃取物 係不造成血壓的增加。 10、如申請專利範圍第9項所述之萃取物，其中該萃取物係抑制 皮質醛酮合成酶(CYP11B2)及11β-羥化酶(CYP11B1)基因的 表現。 Π、一種如申請專利範圍第1項所述之萃取物之使用方法，其係 在一有效數量下可作為單一有效成分或複方成分，包括醫藥 上可接受與生理上需要之載體、賦形劑或添加劑，以用於醫 藥組合物、補充品、食品或飲品的製備，而作為與抑制動脈 粥狀硬化形成有關的抗動脈粥狀硬化劑。 Α-種包括如申請專利範圍第！項所述的萃取物之醫藥組合物， 其係以單-成分或複方成分作為有效成分使用，並包括醫藥 上可接受與生理上需要之載體、賦糊或添加劑，盆中 藥組合物係㈣體、半_魏體職製成之無㈣非無菌 產品。 其包括如申請專利範 以作為其中的單一活 13、一種用以促進健康益處之食物或飲品 圍第1項所述之萃取物及/或其分铜物 性成分或複方成分。 27