KR20140018371A - 물질대사된 조건화 성장 배지 및 이용 방법 - Google Patents

물질대사된 조건화 성장 배지 및 이용 방법 Download PDF

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KR20140018371A
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제임스 빈센트 그루버
스미타 라오
라훌 메타
수자타 손티
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알러간, 인코포레이티드
아치 퍼스널 케어 프로덕츠, 엘.피.
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Abstract

물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물 및 이용 방법이 기술된다. 물질대사된 조건화 성장 배지 및 물질대사된 세포 추출물 조성물은 허용되는 담체로 주사가능 또는 국소 제제, 예를 들면, 크림, 로션 또는 겔로 조제될 수 있고, 그리고 약용 화장품 또는 약제 적용에 이용될 수 있다. 물질대사된 조건화 성장 배지 및 물질대사된 세포 추출물은 또한, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물 내에 내포된 하나 또는 그 이상의 인자 또는 성분을 농축하거나 감소시키기 위해 더욱 가공 처리될 수 있다. 성장 배지는 임의의 진핵 세포에 의해 조건화될 수 있다. 물질대사된 조건화 성장 배지 및 물질대사된 세포 추출물은 질환, 예를 들면, 피부 질환을 예방하거나 치료하는데 이용될 수 있다.

Description

물질대사된 조건화 성장 배지 및 이용 방법{METABOLIZED CONDITIONED GROWTH MEDIUM AND METHODS OF USE}
교차 참조
본 출원은 2010년 11월 12일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/413,166에 우선권을 주장하고, 이것은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물, 그리고 개체에 이들 조성물을 투여함으로써, 질환, 예를 들면, 피부 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법에 관계한다.
발명의 배경 기술
배양 배지 조성물은 전형적으로, 필수 아미노산, 염, 비타민, 무기물, 미량 금속, 당, 지질 및 뉴클레오시드를 포함한다. 세포 배양 배지는 제어된, 인공 시험관내 환경에서 세포를 성장시키는데 요구되는 영양 요구를 충족시키는데 필요한 성분을 공급하는 것을 꾀한다. 영양 제제, pH, 그리고 오스몰농도는 세포 유형, 세포 밀도, 그리고 이용된 배양 시스템과 같은 파라미터에 따라 변한다. 많은 세포 배양 배지 제제는 기존 문헌에서 상세히 보고되고, 그리고 다수의 배지가 상업적으로 이용가능하다. 일단 배양 배지가 세포와 함께 배양되면, 이것은 당업자에게 "사용후" 또는 "조건화 배지"로서 알려져 있다. 조건화 배지는 배지의 본래 성분 중에서 다수뿐만 아니라, 예로써 성장 인자, 염증성 매개체 및 기타 세포외 단백질을 비롯한 다양한 세포 대사산물과 분비된 단백질을 내포한다.
발명의 요약
한 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 조건화 성장 배지 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 효모 세포에 의해 물질대사된 조건화 성장 배지이다. 일부 구체예에서, 조건화 성장 배지는 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양함으로써 제조된다. 다른 구체예에서, 조성물은 국소 또는 주사가능 조성물이다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 조성물은 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다. 한 구체예에서, 조성물은 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 감촉, 색상과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 환경적 손상을 예방하거나 감소시키고; 피부를 부드럽게 및 팽팽하게 하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 미세하고 거친 주름과 주름살을 감소시키고; 미세하고 거친 눈주위 주름살의 외관을 개선하고; 팔자 주름의 외관을 개선하고; 입주위 주름살을 개선하고; 얼굴의 미세하고 거친 주름을 개선하고; 피부 색상, 광휘와 반반함을 개선하고; 피부 탄성을 개선하고; 촉각적 거?을 감소시키고; 피부 감촉, 전반적인 광손상, 전반적인 과색소침착을 개선하고; 전체적인 개선; 암점 및/또는 패치의 외관에서 감소; 피부 증백의 외관과 발랄한 외관을 개선하고; 피부의 전반적인 상태를 개선하고; 광손상된 피부의 외관을 개선하고; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부의 외관을 개선하고; 피부 세포 전도를 개선하고; 피부 장벽을 개선하고; 피부의 수분 유지 능력을 개선하고; 갈색과 적색 부스럼투성이, 적열 상태의 외관을 감소시키고; 피부 상피 두께를 증가시키고; 진피 상피 접합을 강화시키고; 구멍 크기와 구멍의 외관을 감소시키고; 부드러움을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다.
일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 적어도 2-배 개선을 유발할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 배수적 개선에는 3-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 75-배, 100-배 또는 그 이상, 또는 이들 사이에 임의의 수치가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 50%의 개선을 유발할 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 100%, 약 125%, 약 150% 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 개선을 유발할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한, 물질대사된 세포 추출물 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 효모 세포에 의해 물질대사된 세포 추출물이다. 일부 구체예에서, 세포 추출물은 동물 세포, 피부 세포 또는 섬유아세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 조성물은 국소 또는 주사가능 조성물이다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다.
한 구체예에서, 본 발명은 (a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계; (b) 효모 세포를 배양하는 단계; (c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계; (d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계; (b) 효모 세포를 배양하는 단계; (c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계; (d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계를 포함하는, 물질대사된 조건화 성장 배지를 제조하기 위한 방법을 제시한다:
다른 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 조건화 성장 배지, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 조건화 성장 배지, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시하고, 여기서 국소 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 조건화 성장 배지, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시하고, 여기서 국소 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용되고, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재하고, 그리고 물질대사된 조건화 성장 배지는 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 효모 세포를 배양함으로써 제조된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 피부 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다.
*한 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 탈모를 치료하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 모발 성장을 촉진하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 선천적 결함을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 미용적 결함을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 미용적 결함의 치료는 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 후천적 결함을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 상기 방법은 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 피부 색상, 감촉 및/또는 탄성을 개선하고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 감촉, 색상과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 환경적 손상을 예방하거나 감소시키고; 피부를 부드럽게 및 팽팽하게 하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고, 미세하고 거친 주름과 주름살을 감소시키고, 미세하고 거친 눈주위 주름살의 외관을 개선하고, 팔자 주름의 외관을 개선하고, 입주위 주름살을 개선하고, 얼굴의 미세하고 거친 주름을 개선하고, 피부 색상, 광휘와 반반함을 개선하고, 피부 탄성을 개선하고, 촉각적 거?을 감소시키고, 피부 감촉, 전반적인 광손상, 전반적인 과색소침착을 개선하고, 전체적인 개선, 암점 및/또는 패치의 외관을 감소시키고, 피부 증백의 외관과 발랄한 외관을 개선하고, 피부의 전반적인 상태를 개선하고, 광손상된 피부의 외관을 개선하고, 내적으로 및 외적으로 노화된 피부의 외관을 개선하고, 피부 세포 전도를 개선하고, 피부 장벽을 개선하고, 피부의 수분 유지 능력을 개선하고, 갈색과 적색 부스럼투성이, 적열 상태의 외관을 감소시키고, 피부 상피 두께를 증가시키고, 진피 상피 접합을 강화시키고, 구멍 크기와 구멍의 외관을 감소시키고, 부드러움을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 미세 주름과 주름살의 외관을 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 피부 감촉, 색상과 탄력성을 개선하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 거?과 광 손상을 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 피부의 재생 능력을 강화시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 환경적 손상을 예방하거나 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 피부를 부드럽게 및 팽팽하게 하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 조건화 성장 배지를 투여하는 단계를 포함하는, 검버섯을 증백하고 밝게 하기 위한 방법을 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 세포 추출물을 제공하는 단계; (b) 효모 세포를 배양하는 단계; (c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계; (d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고 (e) 물질대사된 조건화 세포 추출물을 수집하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물을 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 세포 추출물을 제공하는 단계; (b) 효모 세포를 배양하는 단계; (c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계; (d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고 (e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계를 포함하는, 물질대사된 세포 추출물을 제조하기 위한 방법을 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 세포 추출물, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 세포 추출물, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시하고, 여기서 국소 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 세포 추출물, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시하고, 여기서 국소 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용되고, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재하고, 그리고 물질대사된 세포 추출물은 효모 세포에 의해 물질대사된 세포 추출물이다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 미용적 결함의 치료는 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 피부 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 탈모를 치료하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 모발 성장을 촉진하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 선천적 결함을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 미용적 결함을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 미용적 결함의 치료는 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 후천적 결함을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다. 상기 방법은 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 피부 색상, 감촉 및/또는 탄성을 개선하고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 감촉, 색상과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 환경적 손상을 예방하거나 감소시키고; 피부를 부드럽게 및 팽팽하게 하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고, 미세하고 거친 주름과 주름살을 감소시키고, 미세하고 거친 눈주위 주름살의 외관을 개선하고, 팔자 주름의 외관을 개선하고, 입주위 주름살을 개선하고, 얼굴의 미세하고 거친 주름을 개선하고, 피부 색상, 광휘와 반반함을 개선하고, 피부 탄성을 개선하고, 촉각적 거?을 감소시키고, 피부 감촉, 전반적인 광손상, 전반적인 과색소침착을 개선하고, 전체적인 개선, 암점 및/또는 패치의 외관을 감소시키고, 피부 증백의 외관과 발랄한 외관을 개선하고, 피부의 전반적인 상태를 개선하고, 광손상된 피부의 외관을 개선하고, 내적으로 및 외적으로 노화된 피부의 외관을 개선하고, 피부 세포 전도를 개선하고, 피부 장벽을 개선하고, 피부의 수분 유지 능력을 개선하고, 갈색과 적색 부스럼투성이, 적열 상태의 외관을 감소시키고, 피부 상피 두께를 증가시키고, 진피 상피 접합을 강화시키고, 구멍 크기와 구멍의 외관을 감소시키고, 부드러움을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 미세 주름과 주름살의 외관을 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 피부 감촉, 색상과 탄력성을 개선하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 거?과 광 손상을 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 피부의 재생 능력을 강화시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 환경적 손상을 예방하거나 감소시키기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 피부를 부드럽게 및 팽팽하게 하기 위한 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에 치료 효과량의 물질대사된 세포 추출물을 투여하는 단계를 포함하는, 검버섯을 증백하고 밝게 하기 위한 방법을 제시한다.
한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물 역시 제시되고, 여기서 물질대사된 조건화 성장 배지는 효모 세포에 의해 물질대사된 조건화 성장 배지이다. 한 구체예에서, 조건화 성장 배지는 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양함으로써 제조된다. 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 또 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건 성장 배지는 봉합제 내에 캡슐화된다. 한 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림 및 로션 중에서 적어도 하나이다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 조성물은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 다른 구체예에서, 미용적 결함의 치료는 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다. 일부 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후 또는 감염후 발생하는 의학적 장애이다. 다른 구체예에서, 후천적 결함은 의학적 시술후 결함이다. 또 다른 구체예에서, 후천적 결함은 함몰된 흉터, 피하 위축, 각화 병소, 적출된 눈에서 안구함몰, 얼굴의 여드름 흉터, 피하 위축을 동반하는 선상공피증, 안비기형, 롬버그병 또는 편측 성대마비이다.
또한, 물질대사된 세포 추출물 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제시되고, 여기서 물질대사된 세포 추출물은 효모 세포에 의해 물질대사된 세포 추출물이다. 일부 구체예에서, 세포 추출물은 동물 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 피부 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 일부 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건 성장 배지는 봉합제 내에 캡슐화된다. 한 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림 및 로션 중에서 적어도 하나이다. 일부 구체예에서, 조성물은 피부 질환을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 일부 구체예에서, 미용적 결함의 치료는 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다. 일부 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후 또는 감염후 발생하는 의학적 장애이다. 다른 구체예에서, 후천적 결함은 의학적 시술후 결함이다. 또 다른 구체예에서, 후천적 결함은 함몰된 흉터, 피하 위축, 각화 병소, 적출된 눈에서 안구함몰, 얼굴의 여드름 흉터, 피하 위축을 동반하는 선상공피증, 안비기형, 롬버그병 또는 편측 성대마비이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합을 치료하거나 예방하는데 이용된다.
또한, (a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지가 제시된다. 일부 구체예에서, 상기 방법에 이용되는 효모는 피치아 (Pichia) 속의 효모이다. 다른 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 피부 세포이다. 또 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포이다. 또 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 동물 세포이다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지를 제조하는 방법은 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 (a) 또는 (b)의 배양 단계에서 연속 흐름 시스템 또는 생물반응기 시스템을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이들 세포는 성장 배지에서 현탁되거나 부유된다.
본원에서는 상기 물질대사된 조건화 성장 배지를 제조하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계. 한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제시된다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 10% 내지 약 20%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01%, 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 한 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 봉합제 내에 캡슐화된다. 일부 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림, 그리고 로션 중에서 적어도 하나이다.
또한, 본원에서는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물이 제시된다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 세포 추출물을 수집하는 단계. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 (Pichia) 속의 효모이다. 다른 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 또 다른 구체예에서, 세포 추출물은 피부 세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 세포 추출물은 동물 세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 세포 추출물을 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 배양은 연속 흐름 시스템 또는 생물반응기 시스템을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 물질대사된 세포 추출물을 제조하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 세포 추출물을 수집하는 단계.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 포함하는 조성물이 제시된다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 (Pichia) 속의 효모이다. 다른 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 일부 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 피부 세포이다. 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포이다. 또 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 동물 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 단계 (a) 또는 (b)의 배양은 연속 흐름 시스템 또는 생물반응기 시스템을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이들 세포는 성장 배지에서 현탁되거나 부유된다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01%, 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 또 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 봉합제 내에 캡슐화된다. 한 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림, 그리고 로션 중에서 적어도 하나이다.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물이 제시된다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 (Pichia) 속의 효모이다. 다른 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 피부 세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 세포 추출물은 동물 세포로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 세포 추출물을 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 다른 구체예에서, 배양은 연속 흐름 시스템 또는 생물반응기 시스템을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 10% 내지 약 20%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 0.01%, 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 또 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 봉합제 내에 캡슐화된다. 다른 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림, 그리고 로션 중에서 적어도 하나이다.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 피부 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제시된다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계. 한 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함이다. 다른 구체예에서, 질환은 탈모이다. 다른 구체예에서, 질환은 선천적 결함 또는 후천적 결함이다. 한 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후 또는 감염후 발생하는 의학적 장애이다. 다른 구체예에서, 후천적 결함은 의학적 시술후 결함이다. 또 다른 구체예에서, 후천적 결함은 함몰된 흉터, 피하 위축, 각화 병소, 적출된 눈에서 안구함몰, 얼굴의 여드름 흉터, 피하 위축을 동반하는 선상공피증, 안비기형, 롬버그병 또는 편측 성대마비이다. 한 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 일정한 구체예에서, 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다. 일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 적어도 2-배 개선을 유발할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 배수적 개선에는 3-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 75-배, 100-배 또는 그 이상, 또는 이들 사이에 임의의 수치가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 50%의 개선을 유발할 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 100%, 약 125%, 약 150% 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 개선을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 (Pichia) 속의 효모이다. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 한 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 피부 세포이다. 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포이다. 일부 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 동물 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 단계 (a) 또는 (b)의 배양은 연속 흐름 시스템 또는 생물반응기 시스템을 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 성장 배지에서 현탁되거나 부유된다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 10% 내지 약 20%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.01%, 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 봉합제 내에 캡슐화된다. 일부 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림, 그리고 로션 중에서 적어도 하나이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 세포외 기질 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5% 내지 약 100% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 10% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 60% 내지 약 100% 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 콜라겐 단백질 또는 리실 수산화효소 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 COL4A1 유전자 또는 PLOD1 유전자에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 복구 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 한 구체예에서, 복구 단백질은 약 10% 내지 약 70% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 복구-단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 복구 단백질은 피브로넥틴 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 복구 단백질은 FN1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 세포 연결 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5% 내지 약 200% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 10% 내지 약 80% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 30% 내지 약 50% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190% 또는 약 200% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 인볼루크린 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 IVL 유전자에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 항산화 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5% 내지 약 300% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 항산화 단백질은 약 10% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 200% 내지 약 250% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250% 또는 약 300% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 항산화 단백질은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 단백질이다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 SOD2 유전자에 의해 인코딩된다.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 피부 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제시된다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계.
한 구체예에서, 질환은 미용적 결함이다. 다른 구체예에서, 질환은 탈모이다. 다른 구체예에서, 질환은 선천적 결함 또는 후천적 결함이다. 한 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후 또는 감염후 발생하는 의학적 장애이다. 다른 구체예에서, 후천적 결함은 의학적 시술후 결함이다. 또 다른 구체예에서, 후천적 결함은 함몰된 흉터, 피하 위축, 각화 병소, 적출된 눈에서 안구함몰, 얼굴의 여드름 흉터, 피하 위축을 동반하는 선상공피증, 안비기형, 롬버그병 또는 편측 성대마비이다. 한 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 일정한 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 의학적 결함이다. 추가의 구체예에서, 피부 질환은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이다. 일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 적어도 2-배 개선을 유발할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 배수적 개선에는 3-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 75-배, 100-배 또는 그 이상, 또는 이들 사이에 임의의 수치가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 50%의 개선을 유발할 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 100%, 약 125%, 약 150% 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 개선을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 (Pichia) 속의 효모이다. 일부 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 한 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 피부 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 동물 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 세포 추출물을 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 단계 (a) 또는 (b)의 배양은 연속 흐름 시스템 또는 생물반응기 시스템을 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 성장 배지에서 현탁되거나 부유된다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 10% 내지 약 20%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물의 중량으로 약 0.01%, 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 한 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물은 봉합제 내에 캡슐화된다. 일부 구체예에서, 봉합제는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림, 그리고 로션 중에서 적어도 하나이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 세포외 기질 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5% 내지 약 100% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 10% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 60% 내지 약 100% 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 콜라겐 단백질 또는 리실 수산화효소 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 COL4A1 유전자 또는 PLOD1 유전자에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 복구 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 한 구체예에서, 복구 단백질은 약 10% 내지 약 70% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 복구-단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 복구 단백질은 피브로넥틴 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 복구 단백질은 FN1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 세포 연결 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5% 내지 약 200% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 10% 내지 약 80% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 30% 내지 약 50% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190% 또는 약 200% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 인볼루크린 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 IVL 유전자에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 항산화 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5% 내지 약 300% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 항산화 단백질은 약 10% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 200% 내지 약 250% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250% 또는 약 300% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 항산화 단백질은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 단백질이다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 SOD2 유전자에 의해 인코딩된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 3차원 조직 산물 TranscyteTM과 Dermagraft®에 의해 시간의 흐름에서 내려 놓인 글리코사미노글리칸과 콜라겐의 침적의 동역학을 나타내는 그래프이다. 글리코사미노글리칸의 침적 용적은 성장의 기간에 좌우되는 반면, 콜라겐의 침적은 성장의 기간에 좌우되지 않는다.
도 2는 인간 섬유아세포와 케라틴생성세포의 단층 배양액에 1:2, 1:5, 1:10, 그리고 1:100의 희석액으로 첨가된 세포외 기질 (TranscyteTM으로부터 제거됨)의 효과를 나타내는 그래프이다. 도시된 가장 유의미한 효과는 기질의 1:10 희석액에서 관찰된다.
도 3은 조건화 배지 (TranscyteTM에서 세포의 성장을 사전에 지지하는 세포 배양 배지)에 노출된 인간 섬유아세포와 케라틴생성세포의 상대적 증식을 나타내는 그래프이다. 세포 반응에서 증가는 작게는 3일 내에 노출되었다.
도 4는 미세하고 거친 주름살의 조사자 평가를 보여주는 그래프이다. 평균 스코어에서 유의미한 감소는 모든 방문에서 미세하고 거친 주름살에 대해 관찰되었다 (모두 P<0.0001). 각 데이터 세트에서, 미세 주름살 평가는 왼쪽에 도시되고, 그리고 거친 주름살 평가는 오른쪽에 도시된다.
도 5는 피부 색상, 탄성과 광휘의 조사자 평가를 보여주는 그래프이다. 모든 방문에서 피부 탄성, 피부 색상과 광휘에 대한 평균 스코어에서 유의미한 개선 (모두 P≤0.02). 각 데이터 세트에서, 4주 결과는 왼쪽에 도시되고, 8주 결과는 중간에 도시되고, 그리고 12주 결과는 오른쪽에 도시된다.
도 6은 촉각적 거?의 조사자 평가를 보여주는 그래프이다. 모든 방문에서 피부 탄성, 피부 색상과 광휘에 대한 평균 스코어에서 유의미한 개선 (모두 P<0.0001). 4주에서, 8주에서, 그리고 12주에서 기준선으로부터 변화 비율은 각각, 왼쪽 칼럼, 중간 칼럼에, 그리고 오른쪽 칼럼에 도시된다.
도 7은 실시예 18에서 기술된 12-주 임상적 용법 (합동된/합동 산물) 연구로부터 12주의 개체 자기-평가 조사표에서 결과를 제공하는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 임의의 진핵 세포 유형 또는 3차원 조직 구조체를 이용하여 배양된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 신규한 조성물, 그리고 이들 조성물을 이용하기 방법에 관계한다. 이들 세포는 단층 또는 3차원에서 배양된다. 이들 세포는 바람직하게는, 인간 세포이고 간질 세포, 실질 세포, 간엽 줄기 세포, 간 예비 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및/또는 배아 줄기 세포를 포함한다. 세포와 조직 배양액에 의한 배지 조건화는 다양한 자연 분비된 단백질, 예를 들면, 생물학적 활성 성장 인자를 내포할 것이다. 또한, 조건화 세포 배지로부터 유래된 산물을 포함하는 신규한 조성물 및 이들 조성물에 대한 용도가 개시된다.
"전조건화" 세포 배양 배지는 배양되는 세포의 영양 요구를 적절하게 해소하는 임의의 세포 배양 배지일 수 있다. 세포 배지의 실례에는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM), Ham의 F12, RPMI 1640, Iscove 배지, McCoy 배지, 그리고 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 Methods For Preparation of Media , Supplements and Substrate For Serum - Free Animal Cell Culture Alan R. Liss, New York (1984) and Cell & Tissue Culture : Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996에서 발견되는 것들을 비롯한 당업자에게 명백한 기타 배지 제제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 배지는 원하는 세포 또는 조직 배양액을 지지하는데 필요한 임의의 성분으로 보충될 수 있다. 부가적으로, 알부민, 글로불린, 성장 증진제와 성장 억제제의 복합 용액인 혈청, 예를 들면, 소 혈청이 원하는 경우에 첨가될 수 있다. 혈청은 병원체가 없어야 하고 마이코플라즈마 박테리아, 균류, 그리고 바이러스 오염에 대해 면밀히 스크리닝되어야 한다. 또한, 혈청은 일반적으로 미국으로부터 수득되고, 그리고 토착 가축류가 전염성 병원체를 보균하는 국가로부터 수득되지 않아야 한다. 배지 내로 호르몬 첨가는 바람직할 수도 그렇지 않을 수도 있다. 배지는 또한, 무혈청일 수 있다, 다시 말하면, 세포는 혈청 보충물의 부재에서 성장된다.
"조건화 성장 배지"는 본원에서 개시된 바와 같이 조건화된 임의의 성장 배지일 수 있고, 그리고 예로써 U.S. 특허 번호 6,372,494; 7,118,746; 7,160,726에서 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 이들 모두 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
다른 성분, 예를 들면, 비타민, 성장과 부착 인자, 단백질 등은 특정한 필요에 따라서 당업자에 의해 선별될 수 있다. 일부 구체예에서, 원하는 조건화 배지를 달성하는데 적합한 임의의 세포 유형이 이용될 수 있다. 유전자 조작된 세포가 배지를 배양하는데 이용될 수 있다. 이런 세포는 예로써, 배지 내에 발현된 단백질 또는 단백질의 농도가 특정한 원하는 적용을 위해 최적화되도록 원하는 단백질 또는 단백질을 발현하기 위해 변형될 수 있다. 본 발명에 따라서, 배지를 조건화하는데 이용되는 세포와 조직 배양액은 생리학적 반응과 닮은 단백질의 발현에서 개선된 성질, 특정한 적용, 예를 들면, 상처 치유 또는 프로테아제, 젖산 등과 같은 일정한 단백질의 억제에 유용한 특정 단백질의 증가된 발현이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 매우 다양한 기능을 부여할 수 있는 표적 유전자 산물을 발현하도록 조작될 수 있다.
이들 세포는 선택된 생물학적 기능을 제공하는, 선택된 생리학적 장애의 리포터로서 기능하는, 유전자 산물의 결핍성 또는 결함성 발현을 증가시키는, 또는 항-바이러스, 항-박테리아, 항균, 또는 항암 활성을 제공하는 생물학적 활성의 표적 유전자 산물을 발현하도록 조작될 수 있다. 본 발명에 따라서, 표적 유전자 산물은 펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 효소, 호르몬, 사이토킨, 항원, 또는 항체, 조절 단백질, 예를 들면, 전사 인자 또는 DNA 결합 단백질, 구조 단백질, 예를 들면, 세포 표면 단백질이거나, 또는 표적 유전자 산물은 핵산, 예를 들면, 리보솜 또는 안티센스 분자일 수 있다. 표적 유전자 산물에는 세포 성장을 향상시키는 유전자 산물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 유전자 변형은 이종기원성 이온 채널을 발현하거나 내인성 이온 채널 기능을 변화시킴으로써, 내인성 단백질을 상향 조절하거나, 새로운 단백질을 도입하거나, 또는 이온 농도를 조절할 수 있다. 실례에는 전신적으로 전달되는 유전자 산물 (가령, 분비된 유전자 산물, 예를 들면, 성장 인자, 호르몬, 인자 VIII, 인자 IX, 신경전달물질, 그리고 엔카팔린을 비롯한 단백질)을 발현하는 조작된 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일부 구체예에서, 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따라 2차원 단층에서 성장된다. 예로써, Sambrook J et al. (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition); Goeddel, ed. (1990) Methods in Enzymology 185, Current Protocols In Molecular Biology; F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994, supplemented through 1999); Animal Cell Culture: A Practical Approach (Freshney ed. 1986)에서 기술된 것들과 같은 세포 배양 기술을 참조한다.
일부 구체예에서, 세포는 3차원 간질 서포트에서 성장되고 다층에서 성장하여 세포 기질을 형성한다. 이러한 기질 시스템은 기존에 기술된 단층 조직 배양 시스템보다 더욱 높은 정도로, 생체에서 발견되는 생리학적 조건에 접근한다. 3차원 배양액, 예를 들면, Dermagraft® (Advanced Tissue Sciences, Inc., La Jolla, CA) "Dermagraft®", 그리고 TransCyteTM (Smith & Nephew, PLC, United Kingdom) "TranscyteTM은 생리학적 비율과 농도에서 배지 내로 분비되는 다수의 성장 인자와 기타 단백질을 생산한다. Dermagraft®은 생물분해성 폴리글락틴 상에서 배양된 동종이계 신생아 섬유아세포로 구성된다. TransCyteTM은 U.S. 특허 5,460,939에서 기술된 바와 같이 일시적인 덮개에 결합된 3차원 간질 조직을 포함하는 일시적인 생존 피부 대체제이다. 부가적으로, 세포 배지를 조건화하는 3차원 조직 배양액은 골수, 피부, 간, 췌장, 신장, 부신과 신경 조직뿐만 아니라 위장관과 비뇨생식관, 그리고 순환계의 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 많은 조직 유형에서 발견되는 간엽 줄기 세포, 간 예비 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 및/또는 배아 줄기 세포 및/또는 실질 세포 및/또는 실질 줄기 세포를 내포할 수 있다. United States 특허 번호 4,721,096; 4,963,489; 5,032,508; 5,266,480; 5,160,490; 그리고 5,559,022를 참조하고, 이들은 각각 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
I. 정의
본원에서 이용된 하기 용어는 지시된 의미를 가질 것이다:
세포: 동물, 식물, 균류, 원생생물, 또는 모네라계를 비롯한 임의의 생물체로부터 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 세포의 공급원은 동물 또는 식물이다. 다른 구체예에서, 동물은 포유동물이다. 다른 구체예에서, 포유동물은 인간이다.
세포 추출물: 세포 부유성 고형물을 포함하거나 포함하지 않는 용해된 또는 단편화된 세포 내용물을 포함한다.
점착 층: 3차원 서포트에 직접적으로 부착되거나, 또는 그 자체가 서포트에 직접적으로 부착되는 세포에 부착에 의해 간접적으로 연결된 세포.
조건화 배지: 임의의 원하는 진핵 세포 유형의 성장을 사전에 지지하는 세포외 단백질(들)과 세포 대사산물을 내포하는 제제, 상기 세포는 2차원 또는 3차원에서 배양된다. 또한, "조건화 세포 배지" 또는 "조건화 세포와 조직 배양 배지"로 일컬어진다.
간질 세포: 내피 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵구, 혈장 세포, 비만 세포, 지방세포, 간엽 줄기 세포, 간 예비 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 연골세포, 전연골세포 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 느슨한 연결 조직에서 발견되는 다른 세포 및/또는 요소가 있거나 없는 섬유아세포.
조직-특이적 또는 실질 세포: 지지성 프레임워크로부터 구별되는, 장기의 본질적이고 독특한 조직을 형성하는 세포.
2차원 세포 배양: 단층, 예를 들면, 편평한 표면 등에서 배양된 세포.
3차원 프레임워크: (a) 세포가 여기에 부착할 수 있도록 하고 (또는 세포가 여기에 부착할 수 있도록 변형될 수 있고); 그리고 (b) 세포가 하나 이상의 층에서 성장할 수 있도록 하는 임의의 물질 및/또는 형상으로 구성되는 3차원 스카폴드. 이러한 서포트는 생존 3차원 간질 조직을 형성하기 위해 간질 세포로 접종된다. 프레임워크의 구조는 그물눈, 스펀지를 포함하거나, 또는 하이드로겔로부터 형성될 수 있다.
3차원 간질 조직 또는 생존 간질 기질: 서포트 상에서 성장되는 간질 세포로 접종된 3차원 프레임워크. 간질 세포에 만들어진 세포외 기질 단백질은 프레임워크 상에 침적되고, 따라서 생존 간질 조직을 형성한다. 생존 간질 조직은 3차원 세포 배양액을 형성하기 위해 후기에 접종되는 조직-특이적 세포의 성장을 지지할 수 있다.
조직-특이적 3차원 세포 배양액 또는 조직-특이적 3차원 구조체: 조직-특이적 세포로 접종되고 배양되는 3차원 생존 간질 조직. 일반적으로, 3차원 간질 기질을 접종하는데 이용되는 조직 특이적 세포는 상기 조직에 대한 "줄기" 세포 (또는 "예비" 세포); 다시 말하면, 조직의 실질을 형성하는 특수한 세포로 성숙하는 새로운 세포를 산출하는 세포를 포함할 것이다.
하기 약어는 지시된 의미를 가질 것이다:
BCS = 우아 혈청
BFU-E = 방출 형성 단위-적혈구
TGF-β = 전환 성장 인자-β
CFU-C = 콜로니 형성 단위-배양
CFU-GEMM = 콜로니 형성 단위-그라눌로이드 (granuloid), 적혈구, 단핵구, 거핵구
CSF = 콜로니-자극 인자
DMEM = Dulbecco의 변형된 Eagle 배지
EDTA = 에틸렌 디아민 테트라아세트산
FBS = 소 태아 혈청
FGF = 섬유아세포 성장 인자
GAG = 글리코사미노글리칸
GM-CSF = 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자
HBSS = Hank의 균형 염 용액
HS = 말 혈청
IGF = 인슐린-유사 성장 인자
LTBMC = 장기 골수 배양
MEM = 최소 필수 배지
PBL = 말초혈 백혈구
PBS = 인산염 완충된 염수
PDGF= 혈소판-유래된 성장 인자
RPMI 1640 = Roswell Park Memorial Institute 배지 번호 1640 (GIBCO, Inc., Grand Island, N.Y.)
SEM = 주사 전자 현미경법
VEGF = 혈관 내피 성장 인자
II. 물질대사된 조건화 성장 배지 및 물질대사된 세포 추출물
한 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 제시한다: (a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계; (b) 효모 세포를 배양하는 단계; (c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계; (d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계. 일부 구체예에서, 이들 세포는 인간을 비롯하여, 식물 및/또는 동물 공급원으로부터 기원할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물을 제시한다: (a) 세포 추출물을 제공하는 단계; (b) 효모 세포를 배양하는 단계; (c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계; (d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고 (e) 물질대사된 조건화 세포 추출물을 수집하는 단계. 일부 구체예에서, 세포 추출물은 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 성장 배지로부터 결과의 세포 추출물을 제거함으로써 수득된다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 인간을 비롯하여, 식물 및/또는 동물 공급원으로부터 기원할 수 있다.
조건화 성장 배지 또는 세포 추출물에서 세포외 단백질, 예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 그리고 스트레스 단백질을 물질대사하는 것은 예로써, 상처 및 다른 조직 결함, 예를 들면, 미용적 결함의 치료에서 조직 복구를 비롯한 매우 다양한 분야에서 이용을 위한 산물뿐만 아니라 인간과 동물 공급 보충물의 제조에서 새로운 가능성을 연다. 가령, 성장 인자는 상처 치유 과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이들 성장 인자의 적어도 하나의 활성은 본 발명의 물질대사 과정을 통해 조건화 세포 배지 또는 세포 추출물에 부여된다.
세포 사이토킨과 성장 인자는 세포 증식, 유착, 형태학적 외관, 분화, 이동, 염증성 반응, 혈관신생, 그리고 세포 사멸을 비롯한 다수의 중요한 세포 과정에 관여한다. 여러 연구에서 세포에 대한 저산소 스트레스와 손상은 성장 인자, 예를 들면, PDGF (혈소판-유래된 성장 인자), VEGF (혈관 내피 성장 인자), FGF (섬유아세포 성장 인자), 그리고 IGF (인슐린-유사 성장 인자)에 상응하는 mRNA와 단백질의 증가된 수준을 포함하는 반응을 유도하는 것으로 증명되었다 (Gonzalez-Rubio, M. et al., 1996, Kidney Int. 50(1):164-73; Abramovitch,R.et al., 1997, Int J Exp. Pathol. 78(2):57-70; Stein, I. et al., 1995, Mol Cell Biol. 15(10):5363-8; Yang,W.et al., 1997, FEBS Lett. 403(2):139-42; West,N.R.et al., 1995, J. Neurosci. Res. 40(5):647-59).
성장 인자, 예를 들면, TGF-β로 알려져 있는 전환 성장 인자-β는 상처 치유 동안 일정한 스트레스 단백질에 의해 유도된다. 2가지 공지된 스트레스 단백질은 GRP78과 HSP90이다. 이들 단백질은 세포 구조를 안정화시키고 세포가 불리한 조건에 저항하도록 만든다. 이합체성 단백질의 TGF-β 패밀리는 TGF-β1, TGF-β2와 TGF-β3을 포함하고, 그리고 많은 세포 유형의 성장과 분화를 조절한다. 게다가, 이러한 단백질 패밀리는 다양한 생물학적 효과를 나타내고, 일부 세포 유형의 성장을 자극하고 (Noda et al., 1989, Endocrinology 124:2991-2995), 그리고 다른 세포 유형의 성장을 억제한다 (Goey et al., 1989, J. Immunol. 143:877-880; Pietenpol et al., 1990, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87:3758-3762). TGF-β는 또한, 콜라겐과 피브로넥틴을 비롯한 세포외 기질 단백질의 발현을 증가시키고 (Ignotz et al., 1986, J. Biol . Chem. 261:4337-4345), 그리고 상처의 치유를 가속하는 (Mustoe et al., 1987, Science 237:1333-1335) 것으로 밝혀졌다.
다른 이와 같은 성장 인자는 PDGF이다. PDGF는 초기에, 간엽-유래된 세포에 대한 강력한 유사분열물질인 것으로 발견되었다 (Ross R. et al., 1974, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 71(4):1207-1210; Kohler N. et al., 1974, Exp . Cell Res. 87:297-301). 추가의 연구에서 PDGF는 조직 형성에서 세포질의 비율 및 과립형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. PDGF로 처리된 상처는 상처 부위에서 호중구와 대식세포 세포 유형에서 증가를 비롯한 초기 단계 염증성 반응의 외관을 갖는다. 이들 상처는 또한, 향상된 섬유아세포 기능 (Pierce, G.F. et al., 1988, J. Exp . Med. 167:974-987)을 보인다. PDGF와 TGF-β 둘 모두 동물 연구에서 콜라겐 형성, DNA 함량, 그리고 단백질 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Grotendorst, G.R. et al., 1985, J. Clin . Invest. 76:2323-2329; Sporn, M.B. et al., 1983, Science (Wash DC) 219:1329). PDGF는 인간 상처의 치료에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 인간 상처에서, PDGF-AA 발현은 치유되고 있는 욕창 내에서 증가된다. PDGF-AA의 증가는 활성화된 섬유아세포의 증가, 세포외 기질 침적, 그리고 상처의 능동적 혈관화에 상응한다. 게다가, PDGF-AA에서 이런 증가는 만성적인 비-치유 상처에서 관찰되지 않는다 (Principles of Tissue Engineering, R. Lanza et al. (eds.), pp. 133-141 (R.G. Landes Co. TX 1997). 혈관신생과 상처 치유를 유도하는 능력을 갖는 다수의 다른 성장 인자에는 VEGF, KGF 및 염기성 FGF가 포함된다.
A. 성장 배지
세포 배양을 위한 성장 배지 제제는 기존 문헌에서 널리 공지되어 있고 다수가 상업적으로 구입가능하다.
전조건화 배지 성분에는 하기에서 기술된 것들이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 부가적으로, 이들 성분의 농도는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예로써, Methods For Preparation Of Media , Supplements and Substrate for Serum -free Animal Cell Cultures , supra를 참조한다. 이들 성분에는 아미노산 (D 및/또는 L-아미노산 둘 모두), 예를 들면, 글루타민, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 그리고 발린 및 이들의 유도체; 산 용해성 부분군, 예를 들면, 티아민, 아스코르브산, 제2철 화합물, 제1철 화합물, 퓨린, 글루타티온 및 일염기성 인산나트륨이 포함된다.
추가의 성분에는 당, 데옥시리보오스, 리보오스, 뉴클레오시드, 수용성 비타민, 리보플라빈, 염, 미량 금속, 지질, 아세테이트 염, 포스페이트 염, HEPES, 페놀 레드, 피루베이트 염 및 완충액이 포함된다.
배지 제제에 종종 이용되는 다른 성분에는 지용성 비타민 (A, D, E와 K 포함), 스테로이드 및 이들의 유도체, 콜레스테롤, 지방산과 지질 Tween 80, 2-메르캅토에탄올 피라미딘뿐만 아니라 혈청 (태아, 말, 소 등), 단백질 (인슐린, 트랜스페린, 성장 인자, 호르몬 등), 항생제 (젠타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B 등), 전란 초여과액, 그리고 부착 인자 (피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 테나신 등)를 비롯한 다양한 보충물이 포함된다.
배지는 성장 인자 및 기타 단백질, 예를 들면, 부착 인자로 보충되거나 보충될 필요가 없는데, 그 이유는 많은 세포 구조체, 특히 본원에서 기술된 3차원 세포와 조직 배양 구조체 그 자체가 이런 성장과 부착 인자 및 기타 산물을 배지 내로 만들기 때문이다.
B. 세포 배양액
1. 세포
임의의 세포가 세포 배양액에서 이용될 수 있다. 가령, 세포는 간질 세포, 실질 세포, 간엽 줄기 세포 (계통 수임되거나 수임되지 않은 전구 세포), 간 예비 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 및/또는 배아 줄기 세포일 수 있다. 세포에는 몇몇 예로써, 골수, 피부, 간, 췌장, 신장, 신경 조직, 부신, 점막 상피, 그리고 평활근이 포함될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다. 섬유아세포와 섬유아세포-유사 세포 및 간질을 포함하는 기타 세포 및/또는 요소는 태아 또는 성체 기원일 수 있고, 그리고 편의한 공급원, 예를 들면, 피부, 간, 췌장, 점막, 동맥, 정맥, 탯줄, 그리고 태반 조직 등으로부터 유래될 수 있다. 이런 조직 및/또는 장기는 적절한 생검에 의해 또는 부검 시에 수득될 수 있다. 실제로, 사체 장기는 간질 세포와 요소의 고결한 공급을 제공하는데 이용될 수 있다.
배아 줄기 세포 및/또는 간질을 포함하는 기타 요소는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 단리될 수 있다. 가령, 최근에 인간 배아 줄기 세포 집단 및 이들 세포를 단리하고 이용하는 방법이 Keller et al., Nature Med., 5:151-152 (1999), Smith Curr. Biol. 8:R802-804 (1998); isolated from primordial germ cells, Shamblatt et al., PNAS 95:13726-1373 (1998), isolated from blastocytes, Thomason et al., Science 282:1145-1147 (1988)에서 보고되었다. 간엽 줄기 세포의 단리와 배양은 당분야에 공지되어 있다. Mackay et al., Tissue Eng. 4:415-428 (1988); William et al ., Am Surg. 65:22-26 (1999)을 참조한다. 이들 세포의 접종은 하기 섹션 5.3에서 기술된다. 유사하게, 신경 줄기 세포는 Flax et al., Nature Biotechnol., 16:1033-1039 (1998); 그리고 Frisen et al., Cell . Mol . Life Sci., 54:935-945 (1998)에서 기술된 방식으로 단리될 수 있다.
세포는 단층, 구슬 또는 3차원을 비롯한 당분야에 공지된 임의의 방식으로, 그리고 임의의 수단 (즉, 배양 접시, 회전병, 연속 흐름 시스템 등)에 의해 배양될 수 있다. 세포와 조직 배양의 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 예로써, Cell & Tissue Culture : Laboratory Procedures, supra, Freshney (1987), Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Techniques, infra에서 기술된다.
일반적으로, 이용되는 세포주는 인간과 동물 병원체에 대해 면밀히 스크리닝된다. 적용에 따라, 이런 스크리닝은 병원체 없는 세포만 허용되는 경우에 (가령, 상처 치유, 식품 첨가제 등의 경우에) 매우 중요할 수 있다. 병원체에 대해 스크리닝하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 세포 유형은 2차원 또는 3차원에서 배양되는 지에 상관없이, 조건화 배지의 성질에 영향을 줄 것이다. 일부 구체예에서, 세포는 2차원에서 배양된다. 다른 구체예에서, 세포는 3차원에서 배양된다.
a. 유전자 조작된 세포
일부 구체예에서, 세포는 예로써, 조직 결함의 복구 및/또는 재생을 증진하는 유전자 산물을 배지 또는 추출물 내로 도입하기 위한 운반제로서 기능할 수 있다. 세포는 예로써, 염증성 매개체, 예를 들면, IL-6, IL-8 및 G-CSF를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 세포는 더욱 또는 부가적으로, 소염성 인자, 예를 들면, 항-GM-CSF, 항-TNF, 항-IL-1, 항-IL-2 등을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다.
다른 구체예에서, 세포는 예로써, 연골 생산을 자극하는 TGF-β, 또는 기타 인자, 예를 들면, 연골형성을 증진하는 BMP-13 또는 간질 세포의 이동 및/또는 기질 침적을 증진하는 자극 인자의 생산에서 치료 효과를 발휘하는 유전자를 배지 또는 추출물 내로 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 구조체가 진핵 세포를 포함하기 때문에, 유전자 산물은 적절하게 발현되고 가공 처리되어 활성 산물이 형성될 것이다. 바람직하게는, 이용된 발현 제어 요소는 산물이 배양 동안 과다-합성될 수 있도록 유전자의 조절된 발현을 허용해야 한다. 전반적으로, 선택된 전사 프로모터, 그리고 구체적으로, 프로모터 요소는 부분적으로, 배양되는 조직과 세포의 유형에 좌우된다. 단백질을 분비할 수 있는 세포와 조직이 바람직하다 (가령, 풍부한 조면소포체 및 골지복합체 세포소기관을 갖는 것들). 과다-생산된 유전자 산물은 이후, 조작된 세포에 의해 조건화 배지 내로 분비될 것이다.
세포는 하나 또는 그 이상의 유전자를 조절하기 위해 유전자 조작될 수 있다; 또는 유전자 발현의 조절은 일시적 또는 장기적일 수 있다; 또는 유전자 활성은 비-유도성 또는 유도성일 수 있다.
세포는 또한, 염증을 증진하는 인자의 발현을 "적중 (knock out)"하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 산물 활성 수준의 감소를 위한 음성적 조절 기술은 하기에 논의된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "음성적 조절"은 조절 치료의 부재에서 표적 유전자 산물의 수준 및/또는 활성에 비하여 표적 유전자 산물의 수준 및/또는 활성에서 감소를 지칭한다. 세포에 고유한 유전자의 발현은 다수의 기술을 이용하여 감소되거나 적중될 수 있다, 예를 들면, 발현은 표준 상동성 재조합 기술을 이용하여 유전자를 완전하게 비활성화 (통상적으로, "적중 (knockout)"으로 지칭됨)시킴으로써 억제될 수 있다. 일반적으로, 단백질의 중요한 영역을 인코딩하는 엑손 (또는 상기 영역의 5'에 엑손)은 양성 선별가능 마커 (가령, neo)가 중간에 끼어들어, 표적 유전자로부터 정상 mRNA의 생산을 예방하고 상기 유전자의 비활성화를 유발한다. 유전자는 또한, 유전자의 일부에서 결실 또는 비활성화 삽입을 발생시킴으로써, 또는 전체 유전자를 결실시킴으로써 비활성화될 수 있다. 게놈 내에서 멀리 떨어진, 표적 유전자에 상동한 2개의 영역을 갖는 구조체를 이용함으로써, 이들 두 영역을 개재하는 서열이 결실될 수 있다. Mombaerts et al ., 1991, Proc . Nat . Acad . Sci . U.S.A. 88:3084-3087. 대안으로, 유전자는 또한, 상류 또는 하류 발현 요소의 결실에 의해 비활성화될 수 있다.
표적 유전자의 발현을 억제하는 안티센스와 리보자임 분자 역시 표적 유전자 활성의 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다. 가령, 주요 조직적합성 유전자 복합체 (HLA)의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 분자는 면역 반응에 관하여 가장 다능한 것으로 밝혀졌다. 게다가, 적절한 리보자임 분자는 예로써, Haseloff et al ., 1988, Nature 334:585-591; Zaug et al ., 1984, Science 224:574-578; 그리고 Zaug and Cech, 1986, Science 231:470-475에 의해 기술된 바와 같이 설계될 수 있다. 더 나아가, 삼중 나선 분자가 표적 유전자 활성의 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다. 이들 기술은 L.G. Davis et al ., eds, Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994에 의해 상세하게 기술된다.
이들 세포를 유전자 조작하는데 유용할 수 있는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고 공동-소유된 United States 특허 4,963,489와 5,785,964에서 더욱 상술되고, 이들의 개시는 본원에서 참고문헌으로 편입된다. 가령, 재조합 DNA 구조체 또는 예로써, 관심되는 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 핵산을 내포하는 벡터가 작제되고 간질 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 이용될 수 있다. 외인성 핵산을 보유하고, 그리고 상기 핵산을 발현할 수 있는 이런 형질전환된 또는 형질감염된 세포가 선별되고 본 발명의 3차원 구조체에서 클론에 의해 확장된다.
관심되는 유전자를 내포하는 DNA 구조체를 제조하고, 세포를 형질전환 또는 형질감염시키고, 그리고 관심되는 유전자를 보유하고 발현하는 세포를 선별하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예로써, Maniatis et al ., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al ., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y.; 그리고 Sambrook et al ., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y에서 기술된 기술을 참조한다.
이들 세포는 통합 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터; 또는 비-통합 복제 벡터, 예를 들면, 유두종 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터; 또는 복제-결함성 바이러스 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 다양한 벡터를 이용하여 조작될 수 있다. 일시적 발현이 바람직한 경우에, 비-통합 벡터 및 복제 결함성 벡터가 선호될 수 있는데, 그 이유는 유도성 또는 구조성 프로모터가 관심되는 유전자의 발현을 제어하기 위해 이들 시스템에 이용될 수 있다. 대안으로, 관심되는 유전자가 유도성 프로모터에 의해 제어된다면, 통합 벡터가 일시적 발현을 달성하는데 이용될 수 있다. 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법에는 리포좀의 이용, 리포펙션 (lipofection), 전기천공 (electroporation), 입자 건 (particle gun), 또는 직접 DNA 주입이 포함된다.
이들 세포는 바람직하게는, 하나 또는 그 이상의 적절한 발현 제어 요소, 예를 들면, 그 중에서도 특히, 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 그리고 선별가능 마커에 의해 제어되는, 다시 말하면, 이들과 작동적 결합 상태에 있는 핵산, 예를 들면, DNA로 형질전환 또는 형질감염된다. 외래 DNA의 도입 이후에, 조작된 세포는 농축 배지에서 성장하도록 허용되고, 이후 선별성 배지로 전환될 수 있다. 외래 DNA 내에 선별가능 마커는 선별에 대한 내성을 공여하고, 그리고 세포가 예로써, 플라스미드 상에서 외래 DNA를 그들의 염색체 내로 안정적으로 통합하고 성장하여 초점을 형성할 수 있도록 하고, 이들은 차례로, 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있다. 이러한 방법은 유전자 산물을 배지 내로 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 이용될 수 있다.
삽입된 유전자의 발현을 유도하기 위해 임의의 프로모터가 이용될 수 있다. 가령, 바이러스 프로모터에는 CMV 프로모터/인핸서, SV40, 유두종바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 엘라스틴 유전자 프로모터 및 β-글로빈이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 바람직하게는, 관심되는 유전자의 발현을 제어하는데 이용되는 제어 요소는 산물이 생체내에서 필요할 때에만 합성되도록 상기 유전자의 조절된 발현이 가능해야 한다. 일시적 발현이 바람직한 경우에, 구조성 프로모터는 바람직하게는, 비-통합 및/또는 복제-결함성 벡터에서 이용된다. 대안으로, 유도성 프로모터는 필요할 때, 삽입된 유전자의 발현을 유도하는데 이용될 수 있다. 유도성 프로모터는 통합 및/또는 복제 벡터 내로 구축될 수 있다. 가령, 유도성 프로모터에는 메탈로치오닌 및 열 쇼크 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에 따라, 관심되는 외인성 유전자를 발현하는데 이용되는 유도성 프로모터는 냉동 보존 및 차후 해동의 결과로서 유도되는 본원에서 개시된 바와 같은 조절 단백질의 고유 프로모터인 것들이다. 가령, TGF-β, VEGF, 또는 다양한 공지된 열 쇼크 단백질의 프로모터가 발현 제어 요소로서 이용될 수 있다, 다시 말하면, 세포 배지를 조건화하는 조직 구조체 내에서 원하는 유전자 산물을 발현하기 위해 관심되는 외인성 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
세포 내로 조작된 유전자 산물의 구조적 또는 일시적 발현을 획득하는데 다양한 방법이 이용될 수 있다. 가령, Seldon et al ., 1987, Science 236:714-718에 의해 기술된 핵형전환 이식 기술이 이용될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "핵형전환 (transkaryotic)"은 이식된 세포의 핵이 안정적 또는 일시적 형질감염에 의한 DNA 서열의 부가에 의해 변화되었음을 암시한다. 바람직하게는, 이들 세포는 일시적으로 및/또는 수술후 회복 기간 동안 유도성 제어 하에, 또는 간질 세포에 고정된 키메라 융합 단백질로서, 예를 들면, 세포외 도메인으로서 유전자 산물에 융합된, 수용체 또는 수용체-유사 분자의 세포내 및/또는 막통과 도메인으로 구성되는 키메라 분자로서 이런 유전자 산물을 발현하도록 조작된다.
게다가, 외래 유전자 산물, 성장 인자, 조절 인자 등을 내포하는 세포외 기질을 갖는 구조체를 제조하는 것이 바람직할 수 있고, 이것은 이후, 조건화 배지 내에서 발견된다. 이러한 구체예는 3차원 서포트 프레임워크 상에서 인간 간질 세포의 성장 동안, 이들 세포가 정상적인 인간 조직에서 생산될 때처럼 프레임워크 상에서 인간 세포외 기질을 합성하고 침적한다는 발견에 기초된다. 세포외 기질은 세포에 의해 국지적으로 분비되고, 그리고 세포와 조직에 동시 결합할 뿐만 아니라 접촉되는 세포의 발달과 행태에 영향을 준다. 세포외 기질은 다양한 연결 조직 단백질, 예를 들면, 글리코사미노글리칸 사슬의 네트워크로 구성되는 수화된 겔 내에서 뒤섞인 섬유-형성 단백질을 내포한다. 글리코사미노글리칸은 길고, 음으로 하전된 다당류 사슬의 이종성 기인데, 히알루론산을 제외하고 이것은 단백질에 공유 연결되어 프로테오글리칸 분자를 형성한다. 이러한 구체예에 따라서, 간질 세포는 원하는 유전자 산물, 또는 변화된 형태의 유전자 산물을 발현하도록 유전자 조작될 수 있고, 이들은 세포외 기질 내에 및 궁극적으로 세포 배지 내에 존재할 것이다.
2. 세포 배양
일부 구체예에서, 세포는 2차원 세포 배양액에서 성장된다. 다른 구체예에서, 세포는 3차원 세포 배양액에서 성장된다. 예로써, 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입되는 U.S. 특허 번호. 6,372,494를 참조한다. 세포 배양액에 이용되는 간질 세포는 바람직하게는, 본원에서 더욱 상세하게 기술되는 추가의 세포 및/또는 요소와 함께 또는 이들 없이, 섬유아세포, 간엽 줄기 세포, 간 예비 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 및/또는 배아 줄기 세포를 포함한다.
세포는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 배양될 수 있다. 바람직하게는, 이들 세포는 무균 가공 처리와 취급을 가능하게 하는 환경에서 배양된다. 세포와 조직 배양의 전통적인 수단은 배지의 인간 감독과 제어에 대한 필요성에 의해 제한되었다. 이것은 단일 시기에서 배양될 수 있는 세포와 조직의 양, 그리고 결과적으로, 단일 시기에서 수득될 수 있는 조건화 세포 배지의 용적을 제한한다. 이런 이유로, 배지는 예로써, 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입되는 공동-소유된 U.S. 특허 5,763,267 ('267 특허)에서 기술된 것과 같은 무균 대규모 배양을 위한 기구를 이용한 대규모 성장 (대규모 조건화 배지를 산출)을 가능하게 하는 방식으로 조건화되는 것이 바람직하다. '267 특허에서 기술된 무균 밀폐된 시스템을 이용하여, 전조건화 배양 배지는 유체 저장소에서 입구 매니폴드 (inlet manifold)로 운반되고, 연속 흐름 시스템 내에 배양액에 균등하게 분배되고, 그리고 3차원 세포와 조직 배양액, 예를 들면, Dermagraft®을 배양하는데 유용하다. 특히, '267 특허에서 기술된 기구는 하나 또는 그 이상의 개별 배양 포켓을 포함하는 복수의 유연성 또는 반유연성 처리 챔버, 복수의 강직 스페이서 (spacer), 입구 유체 매니폴드 (inlet fluid manifold), 출구 유체 매니폴드 (outlet fluid manifold), 유체 저장소 (fluid reservoir), 그리고 시스템 내에서 유체를 운반하기 위한 수단을 포함한다.
처리 동안, 액체 배지는 유체 저장소에서 입구 매니폴드로 운반되고, 이것은 차례로, 각각의 연결된 처리 챔버 및 내부 배양 포켓에 배지를 균등하게 분배한다. 각 처리 챔버가 균등하게 채워지도록 담보하고, 그리고 처리 동안 형성된 임의의 기포가 처리 챔버로부터 제거되도록 담보하기 위해 출구 유체 매니폴드 역시 제공된다. 처리 챔버는 배양된 이식물의 헹굼과 적용 동안 최종 소비자에게 힘들지 않은 취급을 제공하기 위해, 유연성 또는 반-유연성이다. 처리 챔버의 유연성으로 인하여, 처리 동안 챔버 내에서 균등한 유체 분배를 담보하는 강직 스페이서 역시 제공된다.
다른 구체예에서, 조직은 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입되는 United States 특허 번호. 5,843,766 ('766 특허)에서 기술된 바와 같은 조직 배양액의 무균 성장을 위한 기구에서 배양된다. '766 특허는 조직 배양 챔버를 개시하고, 여기서 상기 챔버는 성장되고, 동결 형태로 보존되고, 그리고 동일한 무균 용기에 담겨 최종 소비자에 전달될 수 있는 조직의 성장을 제공하는 케이싱이다. 조직 배양 챔버는 기층의 표면 상에 3차원 조직 성장을 조장하도록 설계된, 케이싱 내에 기층이 포함되는 케이싱을 포함한다. 케이싱은 배지의 유입과 유출을 지원하는 입구와 출구 포트를 포함한다. 케이싱은 또한, 적어도 하나의 흐름 분배기를 포함한다. 한 구체예에서, 흐름 분배기는 배플 (baffle)인데, 이것은 챔버 내에서 배지의 흐름을 분배하여 조직의 연속적이고 균일한 조각을 산출하는데 이용된다. 두 번째 구체예에서, 흐름 분배기는 디플렉터 플레이트, 분배 채널, 그리고 흐름 채널의 합동이다. 각 구체예에서, 케이싱은 조직 성장과 보관 동안 챔버 내에서 무균 환경을 담보하기 위한 봉인을 더욱 포함한다.
섬유아세포는 3차원 배양 시스템에서 많은 상이한 세포와 조직의 성장을 지지할 것이고, 따라서 임의의 다양한 세포와 조직을 배양하기 위한 "포괄적" 간질 서포트 기질을 형성하기 위해 기질 위에 접종될 수 있다. 하지만, 일정한 경우에, "포괄적"보다는 "특이적" 간질 서포트 기질을 이용하는 것이 바람직할 수 있는데, 이런 경우에 간질 세포와 요소는 특정 조직, 장기, 또는 개체로부터 수득될 수 있다. 게다가, 섬유아세포 및 기타 간질 세포 및/또는 요소는 3차원 시스템에서 배양되는 동일한 유형의 조직으로부터 유래될 수도 있다. 이것은 특수한 간질 세포, 예를 들면, 동맥의 평활근 세포, 신경 조직의 교질 세포, 간의 쿠퍼 세포 등이 특정한 구조적/기능적 역할을 수행할 수 있는 조직을 배양할 때, 유리할 수 있을 것이다.
일단 3차원 서포트 상에 접종되면, 간질 세포는 프레임워크 상에서 증식하고, 그리고 간질 세포에 의해 자연 분비된 연결 조직 단백질, 예를 들면, 성장 인자, 조절 인자 및 세포외 기질 단백질을 침적할 것이다. 간질 세포 및 이들의 자연 분비된 연결 조직 단백질은 프레임워크를 실질적으로 둘러싸고, 따라서 본 발명의 3차원 배양 시스템 내로 접종된 조직-특이적 세포의 성장을 지지하는 생존 간질 조직을 형성한다. 실제로, 조직-특이적 세포로 접종될 때, 3차원 간질 조직은 오랜 기간 동안 배양액의 능동적 증식을 유지할 것이다. 중요하게는, 그물눈에서 구멍이 배양 동안 간질 세포의 퇴출을 허용하기 때문에, 합류성 간질 배양액은 접촉성 억제를 나타내지 않고, 그리고 간질 세포는 지속적으로 성장하고, 분화하고, 그리고 기능적 활성 상태로 남아있다.
성장과 조절 인자는 간질 조직에 의해 배지 내로 만들어진다. 성장 인자 (가령, 예로써 αFGF, βFGF, 인슐린 성장 인자 또는 TGF-베타), 또는 자연 또는 변형된 혈액 산물 또는 기타 생물활성 생물학적 분자 (가령, 예로써 히알루론산 또는 호르몬)는 3차원 프레임워크 또는 스카폴딩의 콜로니화, 또는 배양 배지의 조건화를 향상시킨다.
생체내에서 배양액의 이용에 앞서, 간질 세포가 성장되는 정도는 3차원 조직 배양에서 성장되는 조직의 유형에 따라 달라질 것이다. 배지를 조건화하는 생존 간질 조직은 이들을 생체내 이식함으로써 교정 구조로서 이용될 수 있다. 대안으로, 생존 간질 조직은 다른 세포 유형으로 접종되고 생체내 이식될 수 있다. 간질 세포는 배양 배지 내로 분비된 단백질 산물의 수준을 조정하여 조건화 배지로부터 수득된 회수 산물의 농도를 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 가령, 간질 세포는 조건화 배지로부터 획득된 하기 산물 중에서 하나 또는 그 이상의 농도를 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 소염성 인자, 예를 들면, 항-GM-CSF, 항-TNF, 항-IL-1, 항-IL-2 등. 대안으로, 간질 세포는 염증을 증진하는 고유 유전자 산물, 예를 들면, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2의 발현을 "적중 (knock out)"하거나, 또는 거부 반응의 위험을 낮추기 위해 MHC의 발현을 "적중"하도록 유전자 조작될 수 있다.
3차원에서 간질 세포의 성장은 단층 시스템에서보다 더욱 긴 기간의 배양 동안 간질 세포와 조직-특이적 세포 둘 모두의 능동적 증식을 유지할 것이다. 게다가, 3차원 시스템은 시험관내 배양 동안 세포의 성숙, 분화, 그리고 격리를 지지하여 생체내에서 발견되는 대응물과 유사한 성체 조직의 성분을 형성하고 생리학적 비율에 더욱 가깝게 단백질을 조건 배지 내로 확보한다.
a. 3차원 간질 조직의 확립
3차원 서포트 또는 프레임워크는 (a) 세포가 여기에 부착할 수 있도록 하고 (또는 세포가 여기에 부착할 수 있도록 변형될 수 있고); 그리고 (b) 세포가 하나 이상의 층에서 성장할 수 있도록 하는 임의의 물질 및/또는 형상을 가질 수 있다. 비-생물분해성 물질, 예를 들면, 나일론 (폴리아미드), 데이크론 (폴리에스테르), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물 (가령, 폴릴비닐염화물), 폴리카보네이트 (PVC), 폴리테트라플루오르에틸렌 (PTFE; 테플론), Thermanox (TPX), 니트로셀룰로오스, 목화; 그리고 생물분해성 물질, 예를 들면, 폴리글리콜산 (PGA), 콜라겐, 콜라겐 스펀지, 장선봉합, 셀룰로오스, 젤라틴, 덱스트란, 폴리알카노에이트 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다수의 상이한 물질이 프레임워크를 형성하는데 이용될 수 있다. 이들 물질 중에서 임의의 물질이 예로써, 3차원 프레임워크를 형성하기 위해 그물눈 내로 땋아지거나, 짜이거나, 기타 등등일 수 있다. 프레임워크는 차례로, 교정 구조로서 원하는 임의의 형상, 예를 들면, 튜브, 로프, 필라멘트 등으로 형성될 수 있다. 일정한 물질, 예를 들면, 나일론, 폴리스티렌 등은 세포 부착을 위한 불량한 기층이다. 이들 물질이 3차원 프레임워크로서 이용될 때, 서포트에 간질 세포의 부착을 향상시키기 위하여 간질 세포의 접종에 앞서 프레임워크를 전처리하는 것이 바람직하다. 가령, 간질 세포로 접종에 앞서, 나일론 프레임워크는 0.1M 아세트산으로 처리되고, 그리고 나일론을 코팅하기 위해 폴리리신, FBS, 및/또는 콜라겐에서 항온처리될 수 있다. 폴리스티렌은 황산을 이용하여 유사하게 처리될 수 있다.
배양액이 생체내 이식될 때, 예로써 폴리글리콜산, 콜라겐, 콜라겐 스펀지, 직물 콜라겐, 장선봉합 물질, 젤라틴, 폴리젖산, 또는 폴리글리콜산 및 이의 코폴리머와 같은 생물분해성 기질을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 배양액이 오랜 기간 동안 유지되거나, 또는 냉동 보존되는 경우에, 비-분해성 물질, 예를 들면, 나일론, 데이크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 테플론, 목화 등이 바람직할 수 있다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 편의한 나일론 그물눈은 NITEX®, 210 μm의 평균 구멍 크기 및 90 μm의 평균 나일론 섬유 직경을 갖는 나일론 여과 그물눈 (#3-210/36, Tetko, Inc., N.Y.)이다.
하기에서 기술된 다른 세포와 요소와 함께 또는 이들 없이, 섬유아세포, 간엽 줄기 세포, 간 예비 세포, 신경 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및/또는 배아 줄기 세포를 포함하는 간질 세포가 프레임워크 상에 접종된다. 또한, 느슨한 연결 조직에서 발견되는 세포는 섬유아세포와 함께, 3차원 서포트 상에 접종될 수 있다. 이런 세포에는 평활근 세포, 내피 세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵구, 혈장 세포, 비만 세포, 지방세포 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 앞서 설명된 바와 같이, 태아 섬유아세포가 다양한 상이한 세포 및/또는 조직의 성장을 지지하는 "포괄적" 3차원 간질 기질을 형성하는데 이용될 수 있다. 하지만, "특이적" 간질 조직은 배양되는 동일한 유형의 조직으로부터 및/또는 3차원 시스템에 따른 배양 동안 성장되는 세포 및/또는 조직을 후기에 수용하는 특정 개체로부터 유래되는 섬유아세포로 3차원 프레임워크를 접종함으로써 제조될 수 있다.
따라서 한 구체예에서, 특정 조직에 대해 전문화된 간질 세포가 배양될 수 있다. 가령, 섬유아세포, 내피 세포, 대식세포/단핵구, 지방세포 및 망상 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 조혈 조직의 간질 세포가 시험관내에서 골수의 장기 배양을 위한 3차원 합류 이하 간질을 형성하는데 이용될 수 있다. 조혈 간질 세포는 낮은 힘, 예를 들면, 3000xg에서 원심분리에 의해 골수 현탁액에서 형성된 "연막 (buffy coat)"으로부터 용이하게 수득될 수 있다. 동맥의 내부 벽을 구성하는 간질 층에서, 높은 비율의 분화되지 않은 평활근 세포가 단백질에 탄력성을 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 간의 간질 세포는 섬유아세포, 쿠퍼 세포, 그리고 혈관과 담관 내피 세포를 포함할 수 있다. 유사하게, 교질 세포는 신경 세포와 조직의 증식을 지지하기 위한 간질로서 이용될 수 있다; 이러한 목적을 위한 교질 세포는 배아 또는 성체 뇌의 트립신처리 또는 콜라게나아제 분해에 의해 수득될 수 있다 (Ponten and Westermark, 1980, in Federof, S. Hertz, L., eds, "Advances in Cellular Neurobiology," Vol. 1, New York, Academic Press, pp. 209-227). 3차원 간질 세포 배양에서 세포의 성장은 프레임워크에 첨가함으로써, 또는 단백질 (가령, 콜라겐, 탄성 섬유, 세망 섬유) 당단백질, 글리코사미노글리칸 (가령, 헤파린 황산염, 콘드로이틴-4-황산염, 콘드로이틴-6-황산염, 데르마탄 황산염, 케라틴 황산염 등), 세포 기질, 및/또는 기타 물질로 서포트를 코팅함으로써 더욱 향상될 수 있다.
게다가, 간엽 줄기 세포 (계통 수임되거나 수임되지 않은 전구 세포)는 프레임워크 상에 접종을 위한 유리한 "간질" 세포이다. 이들 세포는 내인성 또는 보충된 성장과 조절 인자, 그리고 증식 및/또는 분화를 조절하는 프로스타글란딘, 인터류킨과 자연 발생 칼론을 비롯한 기타 인자에 따라, 골세포, 힘줄과 인대의 섬유아세포, 골수 간질 세포, 지방세포 및 연결 조직의 다른 세포, 연골세포로 분화할 수 있다.
섬유아세포는 섬유아세포의 공급원 역할을 하는 적절한 장기 또는 조직을 성분으로 분해함으로써 용이하게 단리될 수 있다. 이것은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 용이하게 달성될 수 있다. 가령, 조직 또는 장기는 기계적으로 성분으로 분해되고 및/또는 이웃하는 세포 간에 연결을 약화시켜 감지가능한 세포 파괴 없이 조직이 개별 세포의 현탁액 내로 분산될 수 있도록 하는 소화 효소 및/또는 킬레이트화제로 처리될 수 있다. 효소적 분리는 조직을 잘게 썰고 잘게 썰어진 조직을 단독으로 또는 합동으로 임의의 다양한 소화 효소로 처리함으로써 달성될 수 있다. 이들에는 트립신, 키모트립신, 콜라게나아제, 엘라스타아제, 및/또는 히알루로니다아제, DNase, 프로나아제, 디스파아제 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 기계적 파괴 역시 예로써, 분쇄기, 배합기, 체, 균질기, 압력 셀, 또는 인소네이트 (insonator)의 이용이 포함되지만 이에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 조직 성분 분해 기술의 검토를 위하여, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126을 참조한다.
일단 조직이 개별 세포의 현탁액으로 축소되면, 현탁액은 아집단 (subpopulation)으로 분획화될 수 있고, 이들로부터 섬유아세포 및/또는 기타 간질 세포 및/또는 요소가 수득될 수 있다. 이것은 또한, 특이적 세포 유형의 클로닝과 선별, 원치 않는 세포의 선별적 파괴 (음성 선별), 혼성 집단에서 차별적 세포 응집력에 기초된 분리, 동결-해동 절차, 혼성 집단에서 세포의 차별적 부착 성질, 여과, 전통적인 띠 원심분리, 원심 세정 (역류 원심분리), 단위 중력 분리, 역류 분배, 전기영동 및 형광-활성화된 세포 분류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포 분리를 위한 표준 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 클론 선별 및 세포 분리 기술의 검토를 위하여, Freshney, Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11과 12, pp. 137-168을 참조한다.
섬유아세포의 단리는 예로써, 하기와 같이 수행될 수 있다: 새로운 조직 시료는 혈청을 제거하기 위해 철저하게 세척되고 Hanks 균형 염 용액 (HBSS)에서 잘게 썰어진다. 잘게 썰어진 조직은 분리 효소, 예를 들면, 트립신의 새로 제조된 용액에서 1-12시간 동안 배양된다. 이런 배양 후, 분리된 세포는 현탁되고, 원심분리에 의해 펠릿화되고, 그리고 배양 접시 위에 도말된다. 모든 섬유아세포는 다른 세포에 앞서 부착하고, 따라서 적절한 간질 세포가 선별적으로 단리되고 성장될 수 있다. 단리된 섬유아세포는 이후, 합류까지 성장되고, 합류 배양액으로부터 제거되고, 그리고 3차원 기질 상에 접종될 수 있다 (Naughton et al., 1987, J. Med. 18 (3 and 4) 219-250을 참조한다). 높은 농도, 예를 들면, 대략 106 내지 5X107 세포/ml의 간질 세포로 3차원 프레임워크의 접종은 더욱 짧은 기간 내에 3차원 간질 조직의 확립을 유발할 것이다.
간질 세포의 접종 후, 3차원 프레임워크는 적절한 영양 배지에서 배양되어야 한다. 앞서 언급된 바와 같이, 많은 상업적으로 구입가능한 배지, 예를 들면, RPMI 1640, Fisher 배지, Iscove 배지, McCoy 배지 등이 이용하기 적합하다. 중요하게는, 3차원 간질 세포 배양액은 증식 활성을 극대화시키기 위하여 배양 기간 동안 배지에서 현탁되거나 부유될 수 있다. 배양액은 주기적으로 "공급되고", 그리고 조건화 배지는 하기 섹션 5.6과 5.7에서 기술된 바와 같이 회수되고 가공 처리된다. 따라서 배양되는 조직 및 원하는 콜라겐 유형에 따라, 적절한 간질 세포(들)가 3차원 기질을 접종하기 위해 선별될 수 있다.
3차원 간질 세포 배양액의 배양 동안, 증식 세포는 기질로부터 방출될 수 있다. 이들 방출된 세포는 배양 용기의 벽에 들러붙을 수 있고, 여기서 이들은 지속적으로 증식하고 합류 단층을 형성할 수 있다. 이것은 예로써, 공급 동안 방출된 세포의 제거에 의해, 또는 3차원 간질 배양액을 새로운 배양 용기로 이전함으로써 예방되거나 최소화되어야 한다. 용기 내에 합류 단층의 존재는 3차원 기질 및/또는 배양액 내에서 세포의 성장을 "정지 (shut down)"시킬 것이다. 합류 단층의 제거 또는 새로운 용기 내에 새로운 배지에 배양액의 이전은 3차원 배양 시스템의 증식 활성을 복구할 것이다. 주의할 점은 조건화 배지가 임의의 전체 세포를 내포하지 않도록 (특정한 적용을 위해 전체 세포가 이용되지 않는 경우에), 필요하면, 조건화 배지가 가공 처리된다는 것이다. 이런 제거 또는 이전은 25% 합류를 초과하는 간질 단층을 갖는 임의의 배양 용기에서 수행되어야 한다. 대안으로, 배양 시스템은 방출된 세포가 들러붙는 것을 예방하기 위해 교반될 수 있고, 또는 배양액을 주기적으로 공급하는 대신에, 배양 시스템은 새로운 배지가 시스템을 연속적으로 관류하도록 설정될 수 있다. 유속은 3차원 배양액 내에서 증식을 극대화시키고, 그리고 배양액으로부터 방출된 세포를 씻어내고 제거하여 이들이 용기의 벽에 들러붙고 합류까지 성장하지 않도록 조정될 수 있다.
다른 세포, 예를 들면, 실질 세포가 3차원 생존 간질 조직 상에 접종되고 성장될 수도 있다.
b. 세포 배양액 내로 추가 세포의 접종
일단 세포 배양액이 성장의 특정한 단계에 도달하면, 추가의 세포가 세포 배양액 내로 접종되고 세포 배양액의 세포와 함께 배양될 수 있다. 추가의 세포는 시험관내에서 생존 조직에서 성장되어 고유 조직의 배양된 대응물을 형성하고, 그리고 생리학적 수준과 유사한 비율에서 세포외 산물을 배지 내로 생산함으로써 배지를 조건화한다. 접종물 내에 세포의 높은 농도는 낮은 농도에서보다 훨씬 빨리, 배양 동안 증가된 증식을 유리하게 결과할 것이다.
접종을 위해 선택되는 세포는 배양되는 조직에 좌우되는데, 여기에는 예로써, 골수, 피부, 간, 췌장, 신장, 신경 조직, 부신, 점막 상피, 그리고 평활근이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 세포는 특징적인 세포외 단백질, 예를 들면, 일정한 성장 인자를 배지 내로 생산하여 일정한 조직 특이적 적용을 위해 최적화된 배지를 산출할 것이다.
예로써, 그리고 제한 없이, 다양한 상피 세포가 생존 조직에서 배양될 수 있다. 이런 상피 세포의 실례에는 케라틴생성세포, 경구 점막 및 위장 (G.I.) 관 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 상피 세포는 당분야에 공지된 방법에 따른 조직의 효소적 처리, 그 이후에 배양 동안 이들 세포의 확장 및 예로써, 3차원 간질 서포트 세포 기질에 상피 세포의 적용에 의해 단리될 수 있다. 간질 서포트의 존재는 성장 인자 및 기타 단백질을 제공하고, 이들은 상피 세포의 정상적인 분열과 분화를 증진한다.
일반적으로, 이러한 접종물은 상기 조직에 대한 "줄기" 세포 (일명, "예비" 세포); 다시 말하면, 조직의 다양한 성분을 형성하는 특수한 세포로 성숙하는 새로운 세포를 산출하는 세포를 포함해야 한다.
접종물에서 이용되는 실질 또는 기타 표면 층 세포는 간질 세포를 수득하기 위한 앞서 기술된 표준 기술을 이용하여 원하는 조직을 성분으로 분해함으로써 제조된 세포 현탁액으로부터 수득될 수 있다. 전체 세포 현탁액 그 자체가 3차원 생존 간질 조직을 접종하는데 이용될 수 있다. 결과적으로, 균질액 내에 포함된 재생 세포는 기질 상에서 증식하고, 성숙하고, 그리고 적절하게 분화하는 반면, 비-재생 세포는 그렇지 못할 것이다. 대안으로, 특정 세포 유형은 간질 세포를 분획하기 위한 앞서 기술된 표준 기술을 이용하여 세포 현탁액의 적절한 분획물로부터 단리될 수 있다. "줄기" 세포 또는 "예비" 세포가 용이하게 단리될 수 있는 경우에, 이들은 3차원 간질 서포트를 접종하는데 우선적으로 이용될 수 있다. 가령, 골수를 배양할 때, 간질은 새로운 또는 냉동 보존된 시료로부터 유래된 골수 세포로 접종될 수 있다. 피부를 배양할 때, 3차원 간질은 멜라닌세포 및 케라틴생성세포로 접종될 수 있다. 간을 배양할 때, 3차원 간질은 간세포로 접종될 수 있다. 췌장을 배양할 때, 3차원 간질은 췌장 내분비 세포로 접종될 수 있다. 다양한 조직으로부터 실질 세포를 수득하는데 이용될 수 있는 방법의 검토를 위하여, Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 20, pp. 257-288을 참조한다.
실제로, 접종에 앞서 간질 기질 상에 침적된 다양한 유형의 콜라겐의 상이한 비율이 후기-접종된 조직-특이적 세포의 성장에 영향을 줄 수 있다. 가령, 조혈 세포의 최적 성장을 위하여, 기질은 바람직하게는, 최초 기질에서 6:3:1의 근사 비율에서 콜라겐 타입 III, IV와 I를 내포해야 한다. 3차원 피부 배양 시스템의 경우에, 콜라겐 타입 I과 III이 최초 기질에서 가급적 침적된다. 침적되는 콜라겐 타입의 비율은 적절한 콜라겐 타입을 만드는 섬유아세포를 선별함으로써 조작되거나 향상될 수 있다. 이것은 보체를 활성화시킬 수 있고, 그리고 특정 콜라겐 타입을 정의하는 적절한 아이소타입 또는 하위부류의 단일클론 항체를 이용하여 달성될 수 있다. 이들 항체와 보체는 원하는 콜라겐 타입을 발현하는 섬유아세포를 음성적으로 선별하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 기질을 접종하는데 이용되는 간질 세포는 원하는 적절한 콜라겐 타입을 합성하는 세포의 혼합물일 수 있다. 다양한 유형의 콜라겐의 분포와 기원은 표 1에 제시된다.
다양한 유형의 콜라겐의 분포와 기원
콜라겐타입 주요 조직 분포 기원 세포
I 느슨하고 치밀한 일반연결 조직; 콜라겐 섬유 섬유아세포 및 망상 세포; 평활근 세포
섬유연골
골 골아세포
상아질 치아모세포
II 히알린과 탄성 연골 연골세포
눈의 유리체 망막 세포
III 느슨한 연결 조직; 세망 섬유 섬유아세포 및 망상 세포
진피의 유두층
혈관 평활근 세포; 내피 세포
IV 기저 막 상피와 내피 세포
눈의 수정체낭 수정체 섬유
V 태막; 태반 섬유아세포
기저 막
골
평활근 평활근 세포
섬유아세포
VI 연결 조직
VII 상피 기저 막, 고정 원섬유 섬유아세포, 케라틴생성세포
각막 각막 섬유아세포
VIII 연골
IX 비후성 연골
X 연골
섬유아세포
XI 유두 진피 섬유아세포
XII 망상 진피 섬유아세포
XIV,운둘린 P 170 수포성유천포창 항원 케라틴생성세포
배양 동안, 세포 배양 시스템은 영양 배지에서 현탁되거나 부유되어야 한다. 배양액은 새로운 배지가 주기적으로 공급되어야 한다. 이번에도, 배양액으로부터 방출된 세포가 용기의 벽에 들러붙는 것을 예방하기 위해 주의가 요구되는데, 여기서 이들은 증식하고 합류 단층을 형성할 수 있다. 배양액으로부터 세포의 방출은 구조화된 조직과는 대조적으로, 확산성 조직을 배양할 때 더욱 쉽게 발생하는 것으로 보인다. 가령, 피부 배양액은 조직학적으로 및 형태학적으로 정상이다; 별개의 진피와 상피 층은 주변 배지 내로 세포를 방출하지 않는다. 대조적으로, 골수 배양액은 성숙 비-부착 세포가 생체내 골수에서 방출되는 방식으로, 이들 세포를 배지 내로 방출한다. 앞서 설명된 바와 같이, 방출된 세포가 배양 용기에 들러붙고 합류 단층을 형성한다면, 3차원 배양액의 증식이 "정지"될 것이다. 이것은 공급 동안 방출된 세포의 제거, 새로운 용기로 배양액의 이전, 용기 벽에 방출된 세포의 들러붙음을 예방하기 위한 배양액의 교반, 또는 배양액에서 영양소를 새로 보충하고 방출된 세포를 제거할 만큼 충분한 속도로 새로운 배지의 연속 흐름에 의해 회피될 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 조건화 배지는 전체 세포 및 세포 잔해가 없도록, 필요하면, 가공 처리된다.
배양 동안 세포의 성장과 활성은 다양한 성장 인자, 예를 들면, 인슐린, 성장 호르몬, 간장 호르몬, 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 상피 성장 인자, 간 적혈구생성 인자 (hepatopoietin), 그리고 간-세포 성장 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 증식 및/또는 분화를 조절하는 다른 인자에는 프로스타글란딘, 인터류킨, 그리고 자연 발생 칼론이 포함된다.
C. 조건화 성장 배지 및 세포 추출물
1. 세포 배양액으로부터 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물의 회수
결과의 조건화 성장 배지는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 세포 배양액으로부터 분리될 수 있다. 한 구체예에서, 조건화 성장 배지는 세포 배양 시스템으로부터 펌핑 (pumping)되고 이용을 위해 가공 처리된다. 일부 구체예에서, 조건화 성장 배지는 일단 세포 배양액이 성장 배지를 충분한 정도까지 조건화하면 (즉, 일단 세포외 단백질, 예를 들면, 성장 인자가 배지 내에서 바람직한 수준에 도달하도록 배지가 조건화되면), 회수된다. 바람직하게는, 조건화 성장 배지는 일정한 성장 인자와 연결 조직 단백질 분비의 수준이 최고 수준에 있을 때, 조직의 성장의 후기 단계에서 회수된다 (도 1을 참조한다). 바람직한 구체예에서, 조건화 성장 배지는 배양의 10일자 내지 14일자에서 세포에 성장 배지의 노출 후 회수된다.
세포 배양액에 의해 생산된 세포 추출물은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 조건화 성장 배지로부터 단리될 수 있다.
2. 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물의 가공 처리
조건화 성장 배지 또는 세포 추출물의 회수 이후에, 결과의 상층액을 더욱 가공 처리하는 것이 필요할 수 있다. 이런 가공 처리에는 유수량 여과 장치에 의한 농축, 또는 Cell & Tissue Culture : Laboratory Procedures, supra, pp 29 D:0.1-29D:0.4에서 기술된 방법을 이용한 탈여과 (defiltration)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
부가적으로, 배지는 10,000 ml 컷오프를 갖는 필터가 구비된 양압 농축 장치 (Amicon, Beverly, MA)를 이용하여 10 내지 20배 농축될 수 있다.
또한, 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물은 예로써, 원치 않는 프로테아제를 제거하는 산물 단리와 정제를 위해 더욱 가공 처리될 수 있다. 최적 생물학적 활성이 유지되도록 산물 단리와 정제에 이용되는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 가령, 성장 인자, 조절 인자, 펩티드 호르몬, 항체 등을 정제하는 것이 바람직하다. 이런 방법에는 조건화 배지의 겔 크로마토그래피 (세파덱스와 같은 기질을 이용), 이온 교환, 불용성 기질, 예를 들면, 가교된 아가로오즈를 이용한 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, HPLC 정제 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 기술은 Cell & Tissue Culture : Laboratory Procedures, supra에서 더욱 상세하게 기술된다. 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물, 및/또는 이로부터 유래된 산물의 원하는 적용에 따라, 무균성을 유지하기 위해 적절한 조치가 취해져야 한다. 대안으로, 멸균이 필요할 수도 있고, 그리고 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 원하는 생물학적 활성을 보존하기 위해 주의를 요하는 가열 및/또는 필터 멸균에 의해 달성될 수 있다.
3. 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물에서 발견되는 일부 산물
하기 표 2에서는 Dermagraft® 조직 배양액에서 성장된 세포의 성장을 이전에 지지했던 출원인의 조건화 배지 내에 있는 것으로 ELISA (효소 흡착 면역 검정)에 의해 결정된 다양한 성장 인자의 농도를 열거한다. 본 발명에 따른 세포 추출물 역시 이들 성장 인자를 내포할 것으로 생각된다. 하기 목록은 인자의 전체 포괄적인 목록이 아니고, 그리고 본 발명의 배지 내에 존재하는 생물학적 활성 인자 중에서 일부의 농도를 제공함으로써 조건화 배지를 더욱 특징짓기 위한 목적으로만 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
ELISA에 의해 측정된, 조건화 배지 내에 성장 인자 농도
VEGF 3.2 ng/ml
G-CSF 2.3 ng/ml
IL-8 0.9 ng/ml
IL-8 3.2 ng/ml
KGF 1.67 ng/ml
TGF-β 0.8 ng/ml
3차원 조직 배양액 (TransCyteTM 및 Dermagraft®)에서 발견되는 섬유아세포에 의해 분비된 주요 분자 성분을 정량하고 특징짓기 위해 다양한 방법이 이용되었다. TransCyteTM 및 Dermagraft® 내에 존재하는 인간 기질 단백질과 글리코사미노글리칸 (GAGs)에는 콜라겐 I, III, 피브로넥틴, 테나신, 데코린, 베르시칸, 베타글리칸, 신데칸, 그리고 기타 성분 (데이터 제시되지 않음)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 분비된 단백질과 GAGs는 주요 구조 기능을 제공할 뿐만 아니라 세포 분열, 이동, 유착과 신호 전달을 자극한다. 3차원 성장 시스템에서 글리코사미노글리칸 (침적 용적이 성장의 기간에 의존한다)과 콜라겐 (침적 용적이 성장의 기간에 의존하지 않는다)의 침적은 도 1에 도시된다. 이들 성분은 ELISA, 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학 및 PCR에 의해 측정되었다. 가령, TransCyteTM에서 발견되는 성분 중에서 일부는 콜라겐 I, III과 VII (RNA), 피브로넥틴, 테나신, 트롬보스폰딘 2, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 데코린, 베르시칸, 그리고 기타 성분 (데이터 제시되지 않음)을 포함한다. 조직 발달, 치유, 그리고 정상적인 기능에서 이들 성분의 활성은 충분히 보고되었다. 부가적으로, 출원인은 시험관내에서 세포 기능에 대한 인간 생물공학 기질의 일정한 효과를 기술한다. 가령, 출원인은 세포 증식이 생물공학 기질을 첨가함으로써 증가된다는 점에 주목하였다. 세포 증식에 대한 이의 효과를 조사하기 위해, 기질은 TransCyteTM 및 Dermagraft®로부터 물리적으로 제거되고 다양한 희석도에서 인간 섬유아세포와 케라틴생성세포의 단층 배양액에 첨가되었다. 증가된 세포 증식의 결과는 도 2에 도시된다.
게다가, 출원인은 3차원 조직의 제조물과 조성물에 대한 3차원 조건화 배지의 효과가 무혈청 배지, 배지 또는 3차원 조건화 배지의 존재에서 배양된 조직의 세포외 기질 내로 분비된 콜라겐의 양을 측정함으로써 조사되었다는 점에 주목한다. 3차원 조직의 제조물과 조성물에 대한 3차원 조건화 배지의 효과는 무혈청 배지, 배지 또는 3차원 조건화 배지의 존재에서 배양된 조직의 세포외 기질 내로 분비된 콜라겐의 양을 측정함으로써 조사되었다. 본 발명의 조건화 배지는 시험관내에서 조직의 콜라겐 침적을 유의미하게 증가시킨다.
D. 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물의 물질대사
1. 효모
조건화 성장 배지 또는 세포 추출물을 물질대사하는 과정은 다양한 미생물, 예를 들면, 효모, 바실루스, 곰팡이, 식물 세포 등으로 발생할 수 있다. 효모를 이용하여 만들어진 발효조가 본 발명에 특히 바람직하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "효모"는 단일 효모 세포, 복수 효모 세포 및/또는 효모 세포의 배양액을 포함하는 것으로 의도된다. 효모는 뉴로스포라 (Neurospora), 세라토스토멜라 (Ceratostomella), 클라비셉스 (Claviceps), 자일라리아 (Xylaria), 로셀리니아 (Rosellinia), 헬로티움 (Helotium), 스클레로티니아 (Sclerotinia), 툴로스토마 (Tulostoma), 리조포곤 (Rhizopogon), 트룬코콜루멜라 (Truncocolumella), 무코르 (Mucor), 리조푸스 (Rhizopus), 엔토모프토라 (Entomophthora), 딕토스틸리움 (Dictostylium), 블라스토클라디아 (Blastocladia), 신키트리움 (Synchytrium), 사프롤레그니아 (Saprolegnia), 페로노스포라 (Peronospora), 알부고 (Albugo), 피티움 (Pythium), 피코프토라 (Phytophthora), 플라스모디오포라 (Plasmodiophora), 투베르 (Tuber), 히드눔 (Hydnum), 레카노라 (Lecanora), 로첼라 (Roccella), 퍼투사리아 (Pertusaria), 우스네아 (Usnea), 에베르니아 (Evernia), 라말리나 (Ramalina), 알렉토리아 (Alectoria), 클라도니아 (Cladonia), 파르멜리아 (Parmelia), 세트라리아 (Cetraria), 아가리쿠스 (Agaricus), 칸타렐루스 (Cantharellus), 옴팔로투스 (Omphalotus), 코프리누스 (Coprinus), 락타리우스 (Lactarius), 마라스미우스 (Marasmius), 플레우로투스 (Pleurotus), 폴리오타 (Pholiota), 루술라 (Russula), 락타리우스 (Lactarius), 스트로파리아 (Stropharia), 엔톨로마 (Entoloma), 레피오타시에 (Lepiotaceae), 코르티시움 (Corticium), 펠리쿨라리아 (Pellicularia), 트리콜로마 (Tricholoma), 볼바리아 (Volvaria), 클리토시베 (Clitocybe), 플람물리나 (Flammulina), 사카로미세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces), 사카로미세타시에 (Saccharomycetaceae), 유로티움 (Eurotium), 아스페르길루스 (Aspergillus), 티엘라비아 (Thielavia), 페지자 (Peziza), 플렉타니아 (Plectania), 모르첼라 (Morchella), 윈네아 (Wynnea), 헬벨라 (Helvella), 지로미트라 (Gyromitra), 팔라레스 (Phallales), 딕티오페라 (Dictyophera), 무티누스 (Mutinus), 클라트루스 (Clathrus), 슈도콜루스 (Pseudocolus), 리코페르돈 (Lycoperdon), 칼바티아 (Calvatia), 지아스트룸 (Geastrum), 라디게라 (Radiigera), 아스트레우스 (Astreus), 니둘라리아 (Nidularia), 가스트로시베 (Gastrocybe), 마코와니테스 (Macowanites), 가스트로볼레투스 (Gastroboletus), 알바트렐루스 (Albatrellus), 네올렌티누스 (Neolentinus), 니그로포루스 (Nigroporus), 올리고포루스 (Oligoporus), 폴리포루스 (Polyporus), 피스툴리나 (Fistulina), 포메스 (Fomes), 볼레투스 (Boletus), 푸스코볼레티누스 (Fuscoboletinus), 레시눔 (Leccinum), 필로포루스 (Phylloporus), 수일루스 (Suillus), 스트로빌로미세스 (Strobilomyces), 볼레텔루스 (Boletellus), 트레멜라 (Tremella), 아우리쿨라리아 (Auricularia), 다크리미세스 (Dacrymyces), 멜람프소라 (Melampsora), 크로나르티움 (Cronartium), 푸시니아 (Puccinia), 짐노스포란지움 (Gymnosporangium), 틸레티아 (Tilletia), 우로시스티스 (Urocystis), 셉토바시디움 (Septobasidium), 히그로시베 (Hygrocybe), 히그로포루스 (Hygrophorus), 히그로트라마 (Hygrotrama), 네오히그로포루스 (Neohygrophorus), 코르티나리우스 (Cortinarius), 짐노필루스 (Gymnopilus), 트리코피톤 (Trichophyton), 마이크로스포룸 (Microsporum), 모닐리아 (Monilia), 칸디다 (Candida), 써코스포렐라 (Cercosporella), 페니실륨 (Penicillium), 블라스토미세스 (Blastomyces), 써코스포라 (Cercospora), 우스틸라지노이데아 (Ustilaginoidea), 튜베르 쿨라리아 (Tuber cularia), 푸사리움 (Fusarium), 리족토니아 (Rhizoctinia), 오조늄 (Ozonium), 균핵 (Sclerotium), 지오글로슘 (Geoglossum), 또는 아밀라리아 (Armillaria)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 균류 과의 효모일 수 있다. 사카로미세타시에 (Saccharomycetaceae) 과에 속하는 균류가 특히 관심된다. 피치아 (Pichia) 속에 속하는 균류가 더욱 관심된다. 파스토리스 (pastoris) 종에 속하는 균류가 가장 관심된다. 바람직한 구체예에서, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)가 발효 과정에서 이용된다. 일부 구체예에서, 효모는 호기성으로 성장된다.
2. 발효 과정
효모 발효 과정은 교반된 탱크 생물반응기에서 수행될 수 있다. 이런 생물반응기의 실례에는 예로써, New Brunswick Scientific, Edison NJ 또는 Applikon Biotechnology Foster City CA로부터 구입가능한 발효기가 포함될 수 있다.
본 발명의 효모 추출물은 영양 액체배지, 세포 단백질 물질, 세포 핵 물질, 세포 원형질 물질 및/또는 세포 벽 성분이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 효모의 세포질과 세포외 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 추출물은 상대적으로 수용성이다, 예를 들면, 1-그램 또는 그 이상의 효모 추출물이 1-그램의 물에 용해된다. 추출물은 또한, 물/유기 용매 혼합물, 예를 들면, 수용성 글리콜 및 수용성 글리세롤에서 용해성일 수 있다.
3. 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물의 회수/가공 처리
물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물을 회수하고 가공 처리하기 위한 앞서 기술된 절차에 따라 회수되고 및/또는 가공 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 가공 처리는 여러 단계를 포함하고, 그리고 연속 흐름 원심분리, 바이오매스의 정화를 위한 렌즈 막다른 여과, 그리고 무균과 한외여과 능력을 갖는 접선 유동 여과가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 기술의 이용을 수반할 수 있다, 한 구체예에서, 최종 가공 처리 단계는 생물활성 성분을 선별적으로 표적화하기 위한 특정한 분자량 컷오프의 접선 유동 여과를 포함한다. 예로써, 본원에서 참고문헌으로 편입되는 "Yeast Protocols" W. Xiao ed. (Humana Press 2006)을 참조한다.
E. 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물의 활성/특성화
앞서 기술된 효모 물질대사 동안, 효소, 호르몬, 사이토킨, 항원, 항체, 응고 인자, 그리고 조절 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 조건화 성장 배지와 세포 추출물 내에 존재하는 치료 산물이 효모에 의해 물질대사된다. 용어 "물질대사된"은 당업자에게 알려져 있지만, 효모가 조건화 영양 배지 또는 세포 추출물의 성분을 분해하는 과정을 시작한다는 것을 본질적으로 의미한다. 물질대사의 과정은 큰 분자를, 물질대사되지 않은 조건화 성장 배지 또는 세포 추출물보다 본 발명의 적용에 더욱 유용한 작고 더욱 쉽게 이용가능한 성분으로 만들 수 있다. 물질대사될 수 있는 치료 단백질에는 염증성 매개체, 혈관신생 인자, 인자 VIII, 인자 IX, 에리트로포이에틴 (EPO), 알파-1 항트립신, 칼시토닌, 글루코세레브로시다아제, 인간 성장 호르몬과 유도체, 저밀도 지단백질 (LDL), 그리고 아포리포단백질 E, IL-2 수용체와 이의 길항제, 인슐린, 글로빈, 면역글로불린, 촉매성 항체, 인터류킨 (ILs), 인슐린-유사 성장 인자, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 면역 대응체 조절제, BMP (골격 형태형성 단백질) 부갑상선 호르몬과 인터페론, 신경 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성자, 그리고 콜로니 자극 인자 (CSFs)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 물질대사된 성분은 그들의 전구체의 활성을 유지하거나, 또는 예로써, 피부 유지와 상태에 영향을 주는 다양한 생리학적 시스템의 하향 조절 또는 상향 조절을 비롯하여, 더욱 향상된 활성을 갖도록 형질전환될 수 있다.
배지 또는 추출물은 본원에서 기술되는 바와 같은 소정의 적용을 위하여, 배지 또는 추출물 내에 포함된 하나 또는 그 이상의 물질대사된 인자 또는 성분을 농축하거나 감소시키기 위한 추가의 가공 처리, 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피를 이용한 물질대사된 성장 인자의 농축 또는 정반대로, 덜 바람직한 성분의 제거가 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 영양 액체배지, 세포 단백질 물질, 세포 핵 물질, 세포 원형질 물질 및/또는 세포 벽 성분이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 효모의 하나 또는 그 이상의 세포질과 세포외 성분을 내포한다.
III. 조성물
한 구체예에서, 본 발명은 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물, 그리고 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제시한다. 일부 구체예에서, 조성물은 개인 위생 조성물이다.
일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 5% 내지 약 30%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10% 내지 약 20%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 13% 내지 약 17%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다.
다른 구체예에서, 조성물은 물, 보존제, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 습윤제, 보습제, 안정제, 희석제, 용매 및 방향제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 조성물의 추가 성분의 무-제한적 실례에는 팔미토일 트리펩티드 5, 가수분해된 실크 (Sericin), 디팔미토일 히드록시프롤린, 에르고티오네인 (EGT), 유비퀴논 (조효소 Q10), 차나무 (Camellia Sinensis) (Green Tea) 잎 추출물, 테트라헥실데실 아스코르베이트, 토코페릴 아세테이트, 서양산 딸기 (Rubus Fruticosus) (Blackberry) 잎 추출물, 사카로미세스 (Saccharomyces) 발효 여과 용해물, 알파-아르부틴, 감마 아미노부티르산, 및/또는 히알루론산 충전 구체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 조성물은 적어도 하나의 보존제를 더욱 포함한다. 적절한 보존제에는 산, 알코올, 글리콜, 파라벤, 4가-질소 내포 화합물, 이소티아졸리논, 알데히드-방출 화합물 및 할로겐화된 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예시적인 알코올에는 페녹시에탄올, 이소프로필 알코올 및 벤질 알코올이 포함된다; 예시적인 글리콜에는 프로필렌, 부틸렌과 펜틸렌 글리콜이 포함된다; 예시적인 파라벤에는 (일명, 파라히드록시벤조산) 메틸, 프로필과 부틸 파라벤이 포함된다; 예시적인 4가 질소 내포 화합물에는 벤잘코늄 염화물 및 Quartenium 15가 포함된다; 예시적인 이소티아졸에는 메틸이소티아졸린 및 메틸클로로이소티아졸린이 포함된다; 예시적인 알데히드 방출 작용제에는 DMDM 히단토인, 이미아돌리디닐 우레아 및 디아졸리디닐 우레아가 포함된다; 예시적인 항산화에는 부틸화된 히드록시톨루엔 및 토코페롤이 포함되고, 그리고 예시적인 할로겐화된 화합물에는 트리클로산 및 클로로헥시덴 디글루코네이트가 포함된다. 본 발명의 목적에 유용한 보존제의 실례는 Steinberg, D. "Frequency of Use of Preservatives 2007". Cosmet. Toilet. 117, 41-44 (2002), 그리고 "Preservative Encyclopedia" Cosmet. Toilet. 117, 80-96 (2002)에서 찾아볼 수 있다. 이에 더하여, 효소 보존제 시스템, 예를 들면, Ciccognani D. Cosmetic Preservation Using Enzymes, in "Cosmetic and Drug Microbiology", Orth DS ed., Francis & Taylor, Boca Raton, FL (2006)에 의한 논문에서 기술된 것들 역시 본 발명의 조성물과 함께 이용하는데 효과적일 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 활성 성분을 더욱 포함한다. 적절한 활성 성분에는 식물성 약품, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 스테로이드, 진통제, 항종양 약물, 조사 중인 약물, 또는 물질대사된 조건화 배지 또는 물질대사된 세포 추출물 내에 인자와 우호적 또는 상승적 합동을 유발하는 임의의 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
조성물은 정제, 캡슐, 피부 패치, 흡입기, 점안약, 점비약, 귀약, 좌약, 크림, 연고, 주사가능물질, 하이드로겔 및 당업자에게 공지된 임의의 다른 적절한 제제의 형태일 수 있다. 경구 투여의 경우에, 제약학적 조성물은 예로써, 허용되는 부형제 또는 담체, 예를 들면, 결합 작용제 (가령, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제 (가령, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (가령, 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제 (가령, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (가령, 나트륨 라우릴 설페이트)를 이용한 전통적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 코팅될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제조물은 예로써, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취하거나, 또는 이들은 사용에 앞서 물 또는 기타 적절한 운반제로 구성을 위한 건성 산물로서 제공될 수 있다. 이런 액상 제조물은 허용되는 부형제 또는 담체, 예를 들면, 현탁제 (가령, 소르비톨 시럽 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (가령, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 운반제 (가령, 알몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별된 식물성 오일); 그리고 보존제 (가령, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 이용한 전통적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 이들 제조물은 또한, 적절하면 완충제 염, 풍미제, 착색제 및 감미료를 내포한다.
한 구체예에서, 조성물은 로션, 연고, 크림, 스프레이, 스프릿츠, 수성 또는 수성-알코올성 혼합물 겔, 무스, 패치, 패드, 마스크, 축축한 천, 와입스, 고형 스틱, 투명 스틱, 립스틱, 에어로졸 크림, 무수성 분말, 탤크, 강장약, 오일, 에멀젼 또는 목욕 염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 미용적 적용에 적합한 형태이다.
한 구체예에서, 조성물 내에 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 화학적 전달 운반제 내에 존재한다. 화학적 전달 운반제에는 리포좀, 니오좀, 마이크론 이하 에멀젼, 폴리머성 캡슐화제, 겔, 크림, 로션, 그리고 이들의 합동이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 봉합제 내에 캡슐화된다.
본 발명의 조성물은 당업자에게 널리 공지된 표준 절차를 이용하여 다양한 루트를 거쳐 개체에 전달될 수 있다. 가령, 이런 전달은 부위-특이적, 경구, 코, 정맥내, 피하, 피내, 경피, 근육내 또는 복막내 투여일 수 있다. 또한, 이들은 제어된 또는 느린 방출 운반제로서 기능하도록 조제될 수 있다.
물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 임의의 상태에서, 다시 말하면, 액체 또는 고체에서, 냉동 건조되거나 건조된 분말로서, 국소 상처 치료와 항-유착 적용을 위한 필름으로서, 주사가능물질로서 이용될 수 있고, 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입되는 PCT WO 96/39101을 참조한다.
대안으로, 본 발명의 조건화 세포 배지는 U.S. 특허 번호 5,709,854; 5,516,532; 5,654,381; 그리고 WO 98/52543에서 기술된 바와 같은 폴리머화가능 또는 가교 하이드로겔을 이용하여 조제될 수 있고, 이들 각각은 본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 하이드로겔을 형성하는데 이용될 수 있는 물질의 실례에는 변형된 알기네이트가 포함된다. 알기네이트는 해초로부터 단리된 탄수화물 폴리머인데, 이것은 예로써, 본원에서 참고문헌으로 편입되는 WO 94/25080에서 기술된 바와 같이, 이가 양이온, 예를 들면, 칼슘에 노출에 의해 가교되어 하이드로겔을 형성할 수 있다. 알기네이트는 실온에서 물 내에 이가 양이온의 존재에서 이온으로 가교되어 하이드로겔 기질을 형성할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "변형된 알기네이트"는 변형된 하이드로겔 성질을 갖는 화학적으로 변형된 알기네이트를 지칭한다.
부가적으로, 박테리아 다당류, 예를 들면, 겔란 검, 그리고 식물 다당류, 예를 들면, 카라게닌을 비롯하여, 일가 양이온에 노출에 의해 겔화되는 다당류는 앞서 기술된 알기네이트의 가교에 가용한 것들과 유사한 방법을 이용하여 가교되어 하이드로겔을 형성할 수 있다.
변형된 히알루론산 유도체가 특히 유용하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "히알루론산"은 자연 및 화학적으로 변형된 히알루론산을 지칭한다. 변형된 히알루론산은 가교와 생물분해의 속도와 정도를 조정하기 위한 미리 선별된 화학적 변형으로 설계되고 합성될 수 있다.
공유 가교가능 하이드로겔 전구체 역시 유용하다. 가령, 수용성 폴리아민, 예를 들면, 키토산은 수용성 디이소티오시아네이트, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 디이소티오시아네이트와 가교될 수 있다.
대안으로, 라디칼 개시인자 (radical initiator)와의 접촉 직후 라디칼 반응에 의해 가교되는 치환기를 포함하는 폴리머가 이용될 수 있다. 가령, 본원에서 참고문헌으로 편입되는 WO 93/17669에서 개시된 바와 같이, 광화학적으로 가교될 수 있는 에틸렌적으로 불포화된 기를 포함하는 폴리머가 이용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 적어도 하나의 수용성 영역, 생물분해성 영역, 그리고 적어도 2개의 유리 라디칼-폴리머화가능 영역을 포함하는 수용성 마크로머 (macromer)가 제시된다. 이들 마크로머의 실례는 PEG-올리고락틸-아크릴레이트이고, 여기서 아크릴레이트 기는 라디칼 개시 시스템, 예를 들면, 에오신 염료를 이용하여, 또는 자외선 또는 가시광선에 짧은 노출에 의해 폴리머화된다. 부가적으로, 광화학적으로 가교될 수 있는 신나모일 기를 포함하는 수용성 폴리머가 Matsuda et al ., ASAID Trans ., 38: 154-157 (1992)에서 개시된 바와 같이 이용될 수 있다.
바람직한 폴리머화가능 기는 아크릴레이트, 디아크릴레이트, 올리고아크릴레이트, 디메타크릴레이트, 올리고메타크릴레이트, 그리고 기타 생물학적으로 허용되는 광폴리머화가능 기이다. 아크릴레이트는 가장 바람직한 활성 종 폴리머화가능 기이다.
자연 발생 및 합성 폴리머는 당분야에서 가용한 화학 반응을 이용하여 변형될 수 있고, 그리고 예로써, March, "Advanced Organic Chemistry", 4th Edition, 1992, Wiley-Interscience Publication, New York에서 기술된다.
폴리머화는 바람직하게는, 광 개시인자를 이용하여 개시된다. 유용한 광 개시인자는 세포독성 없이, 그리고 짧은 시간 프레임, 많아야 수분, 가장 바람직하게는 수초 내에, 마크로머의 폴리머화를 개시하는데 이용될 수 있는 것들이다.
다수의 염료가 광폴리머화에 이용될 수 있다. 적절한 염료는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 염료에는 에리트로신 (erythrosin), 플록심 (phloxime), 로즈 벵갈, 토닌 (thonine), 캄포르퀴논, 에틸 에오신, 에오신, 메틸렌 블루, 리보플라빈, 2,2-디메틸-2-페닐아세토페논, 2-메톡시-2-페닐아세토페논, 2,2-디메톡시-2-페닐 아세토페논, 기타 아세토페논 유도체, 그리고 캄포르퀴논이 포함된다. 적절한 보조촉매에는 아민, 예를 들면, N-메틸 디에탄올아민, N, N-디메틸 벤질아민, 트리에탄올 아민, 트리틸아민, 디벤질 아민, N-벤질에탄올아민, -이소프로필 벤질아민이 포함된다. 트리에탄올아민이 선호되는 보조촉매이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물, 또는 대안으로, 배지 내로 생산된 특정의 물질대사된 세포외 기질 단백질은 봉합선을 코팅하는 우수한 물질을 제공하는데 이용된다. 물질대사된, 자연 분비된 세포외 기질은 조건화 배지에 타입 I과 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 테나신, 글리코사미노글리칸, 산성과 염기성 FGF, TGF-α와 TGF-β, KGF, 베르시칸, 데코린 및 다양한 기타 분비된 인간 진피 기질 단백질의 활성을 제공한다. 유사하게, 본 발명의 조건화 세포 배지 또는 조건화 배지로부터 유래된 세포외 기질 단백질은 체내에 결함을 교정하기 위한 외과적 접근법에서 인조 혈관을 비롯한 전통적인 이식 장치를 코팅하여 우수한 이식 장치를 산출하는데 이용될 수 있다. 이식물은 결함성 기능을 대체하거나 대신하고 비-생물분해성 물질 또는 생물분해성 물질로 만들어진 생체적합성, 비활성 물질로 만들어져야 한다. 이식 장치를 이들 세포외 단백질을 내포하는 배지로 코팅함으로써, 이식물은 적절한 세포 부착을 야기하고 이식 부위에서 우수한 조직을 결과한다. 따라서 조건화 세포 배지, 또는 상기 배지로부터 유래된 단백질로 코팅된 봉합선, 붕대, 그리고 이식물은 세포, 예를 들면, 백혈구와 섬유아세포의 손상된 구역으로의 동원을 향상시키고 개선된 상처 치유로 귀결되는 세포 증식과 분화를 유도한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 제약학적으로 허용되는 담체를 내부 투여를 위한 운반제로서 이용하여 조제될 수 있다. 또한, 상기 배지는 본원에서 기술되는 바와 같은 소정의 적용을 위하여, 배지 내에 포함된 하나 또는 그 이상의 인자 또는 성분을 농축하거나 감소시키기 위한 추가의 가공 처리, 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피를 이용한 성장 인자 또는 기타 단백질의 농축 또는 정반대로, 덜 바람직한 성분의 제거가 수행될 수 있다.
IV. 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법
한 구체예에서, 본 발명은 허용되는 담체 및 물질대사된 조건화 성장 배지를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 허용되는 담체 및 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제시한다.
치료되는 질환에는 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 및 후천적 결함을 비롯한 피부 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 치료되는 질환에는 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
A. 피부 질환
일부 구체예에서, 치료되거나 예방되는 질환은 피부 질환이다. 다른 구체예에서, 피부 질환은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함이다. 피부 질환에는 또한, 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
무-제한적 실례에서, 본원에서 기술된 국소 조성물은 피부에 적용된다. 본원에서 개시된 조성물의 적용은 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 검버섯과 색소이상의 외관을 감소시키고; 피부 색상, 감촉과 탄력성을 개선하고; 거?과 광 손상을 감소시키고; 환경적 손상을 예방하고 감소시키고; 피부를 오동통하게 하고; 피부를 증백하고; 피부를 밝게 하고; 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 검버섯을 증백하고 밝게 하고; 피부 탄성, 탄력성, 회복력을 개선하고; 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하거나, 팽팽하게 하거나, 또는 채우고; 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키고; 입술 감촉 또는 상태를 개선하고; 자연 입술 색상을 향상시키고; 입술 볼륨을 증가시키고; 수술후 피부의 상피화를 증진하고; 피부의 장벽 또는 수분 균형을 복구하고; 검버섯의 외관을 개선하고; 피부 색소침착의 외관을 개선하고, 또는 이들의 조합을 달성한다.
일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 적어도 2-배 개선을 유발할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 배수적 개선에는 3-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배, 25-배, 75-배, 100-배 또는 그 이상, 또는 이들 사이에 임의의 수치가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 50%의 개선을 유발할 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에서 기술되는 조성물의 투여는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 100%, 약 125%, 약 150% 또는 그 이상의 개선을 유발할 수 있다.
인간 피부에 영향을 주는 앞서 기술된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물의 효과는 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 특히, 앞서 기술된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 특정한 피부 세포, 예를 들면, 케라틴생성세포 또는 섬유아세포에서 분석 기술, 예를 들면, 인간 게놈 마이크로어레이를 이용함으로써, 또는 개별 피부 세포, 조직 모델 또는 탈체 또는 생체내 피부 모델에서 단백질 발현 분석에 의해 피부에 대한 그들의 효과에 대해 스크리닝될 수 있다. 이들 검사 모델에서, 특정한 유전자 및/또는 단백질은 추출물 처리의 결과로서 상향-조절되거나 하향-조절될 수 있다. 피부 질환을 조절할 수 있는 유전자와 단백질이 스크리닝에서 특히 관심된다. 염증, 세포외 기질 발현, 멜라닌 조절, 피부 보습, 박리 등에 관련되는 유전자와 단백질이 본 발명의 목적을 위해 특히 관심된다. 시클로옥시게나아제 발현, 특히 시클로옥시게나아제-1과 2 및 세포외 기질 단백질 발현, 특히 타입 I, IV와 VI 콜라겐 발현, 그리고 엘라스틴과 피브로넥틴 발현에 관련된 단백질이 특히 관심된다. 이에 더하여, 피부 멜라닌 발현에 대한 추출물의 영향 역시 관심있게 고려된다.
이들 및 기타 중요한 피부 단백질의 발현에 대한 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물의 효과는 인간 게놈 마이크로어레이 분석과 단백질 발현뿐만 아니라 개선된 보습, 주름살 감소, 감소된 색소침착, 개선된 피부 색상 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 당업자에게 널리 공지된 비-침해성 검사 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물의 적용은 예로써, SiIFIo 실리콘 모델링, PRIMOS 및 VISIO 사진 시스템 등과 같은 기술에 의해 측정될 때, 피부 주름에서 측정된 감소로 나타날 수 있다. 이에 더하여, 보습은 경표피 물 손실 (TEWL) 또는 피부 탄력도 측정기 (cutometer) 또는 코르네오메트릭 (corneometric) 측정을 이용하여 측정될 수도 있다. 유사하게, 피부 색소침착은 비색계 (chromometer)를 이용하여 측정될 수 있다. 이런 검사 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고 "Handbook of Non-Invasive Methods and the Skin", 2nd edition, Serup J, Jemec GBE, Grove GL (ed.), Taylor and Francis Boca Raton FL 2006에서 찾아볼 수 있다.
인간 상피 케라틴생성세포에서 인간 유전자 마이크로어레이 분석은 물질대사된 조건화 성장 배지가 다양한 피부 기능에 관여하는 여러 유전자를 상향-조절한다는 것을 지시한다. 실시예 18을 참조한다. 따라서 본 발명에 따른 효모-물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물은 피부 질환의 치료를 위한 개인 위생 조성물에 이용될 수 있는 것으로 인식된다.
B. 상처 치유 적용
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 상처와 화상 치유를 증진하기 위해 가공 처리될 수 있다. 조직이 손상될 때, 일련의 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드 성장 인자가 치유를 증진하기 위해 상처 내로 방출된다. 상처 치유는 여러 단계를 수반하고 외피의 파괴를 제어된 방식으로 밀봉하여 기능적으로 적격성 조직을 형성할 수 있는 복잡한 과정이다. 이러한 과정은 지혈로 시작되고 호중구와 대식세포를 수반하는 염증 단계가 뒤를 잇는다. 상기 과정은 과립형성 조직의 발달 및 상처를 차단하는 재-상피화로 지속한다. 차후에, 흉터 조직이 형성되고 다음의 수개월에 걸쳐 본래 해부학 구조에 가깝게 재형성된다. 이상적으로는, 흉터 조직은 조직학적으로 및 생리학적으로 본래 정상 조직과 닮은 건강한 기능적으로 적격성 조직이 형성될 수 있도록 최소이다.
치유 과정의 각 단계는 조절 단백질, 예를 들면, 사이토킨, 성장 인자, 그리고 염증성 매개체를 통한 세포 상호작용뿐만 아니라 세포 접촉 기전에 의해 제어된다. 가령, 염증성 매개체, 예를 들면, IL-6, IL-8, 그리고 G-CSF는 림프구 분화와 급성기 단백질뿐만 아니라, 상처 치유의 염증 단계에서 중요한 과정인 호중구 침윤, 성숙과 활성화를 유도한다. 상처 치유 과정에 관여하는 조절 단백질의 다른 실례는 염증과 과립형성 조직 형성 동안 혈관신생을 유도하는 VEGF, 골 형성을 유도하는 BMP, 케라틴생성세포를 활성화시키는 KGF 및 세포외 기질의 침적을 유도하는 TGF-β1이다.
만성적인 상처에서, 치유 과정은 지혈 이후에 및 재상피화에 앞서 어느 시점에서 중단되고, 그리고 겉보기에 재개될 수 없다. 상처 층 (wound bed)에서 관찰되는 대부분의 염증은 감염에 관련되지만, 염증은 조절 단백질을 분해하고 따라서, 상처 치유 과정을 간섭하는 프로테아제가 풍부한 환경을 발생시킨다.
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 상처 치유에 중요한 것으로 생각되고 상처 치유의 생체내 모델에서 고갈되는 것으로 밝혀진 활성을 내포한다. 가령, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 치유 과정을 지지하는 다수의 성장 인자, 예를 들면, VEGF, G-CSF, IL-8, KGF, 그리고 TGF-β 중에서 하나 또는 그 이상의 활성을 내포할 수 있다. 게다가, 일부 의학적 장애, 예를 들면, 당뇨병에서, 상처 치유를 위해 필요한 조절 단백질 중에서 일부는 공급이 부족하다. 가령, 비-인슐린-의존성 당뇨병의 생쥐 모델 (가령, db/db 생쥐)에서, VEGF와 PDGF의 분비 및 PDGF 수용체의 발현 모두 정상 생쥐의 상처에서 수준과 비교하여, 상처에서 감소하는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 조직 결함 또는 손상의 복구 및/또는 재생이 요망되는 다른 유형의 조직 손상, 예를 들면, 외상성 또는 선천성 조직 손상의 치료에 유용한데, 그 이유는 예로써, 섬유아세포 성장 인자 (FGFs), 혈소판 유래된 성장 인자 (PDGFs), 상피 성장 인자 (EGFs), 골 형태발생 단백질 (BMPs) 및 전환 성장 인자 (TGFs)뿐만 아니라 혈관화를 조절하는 것들, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 케라틴생성세포 성장 인자 (KGF) 및 염기성 FGF; 혈관신생 인자, 그리고 항혈관신생 인자를 비롯하여, 이들 성장 인자 중에서 다수의 활성이 출원인의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물 내에서 발견되기 때문이다. 스트레스 단백질, 예를 들면, GR 78과 MSP90은 TGF-β와 같은 성장 인자를 유도한다. TGF β-1, TGF β-2, TGF β-3, TGF β-4와 TGF β-5를 비롯한 TGF-β는 성장과 분화를 조절하고 상처 치유를 가속한다 (Noda et al . 1989, Endocrin. 124: 2991-2995; Goey et al . 1989, J. Immunol . 143: 877-880, Mutoe et al . 1987, Science 237: 1333-1335). 유사분열물질, 예를 들면, PDGF는 조직 형성에서 세포질과 과립형성의 속도를 증가시킨다 (Kohler et al . 1974, Exp . Cell . Res . 87: 297-301). 앞서 언급된 바와 같이, 이들 세포는 바람직하게는, 면역원성 문제를 최소화하기 위해 인간 세포이다.
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물이 일련의 상처 치유 인자의 활성을 내포하기 때문에, 조건화 배지는 피부 상처, 골절, 위궤양, 췌장, 간, 신장, 비장, 혈관 손상 및 기타 내부 상처를 비롯하여, 상처와 화상 치유의 치료에서 유리하게 이용된다. 게다가, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 다른 의학적 성분, 예를 들면, 항생제 및 진통제와 합동될 수 있다. 구체예는 국소 적용을 위한 고약 또는 연고로 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물의 조제를 포함한다.
대안으로, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 상처 치유를 증진하고 및/또는 가속하기 위해 붕대 (점착성 또는 비-점착성)와 합동될 수 있다.
특수한 조직에서 상처는 상기 특수한 조직에 의한 배지 조건화를 필요로 할 수 있다. 가령, 뉴런 조직에 대한 손상은 뉴런 세포 배양액에 의해 조건화된 배지에 내포된 단백질을 필요로 할 수 있다. 특이적 산물은 유래되거나, 또는 대안으로, 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 특이적 배지, 예를 들면, NGF로부터 원하는 단백질의 면역친화성 크로마토그래피 또는 향상된 발현에 의해 농축될 수 있다. NGF-제어된 특징에는 콜린성 신경전달물질 기능 (아세틸콜린에스테라아제 (AChE) 및 아세틸콜린-합성 효소 (ChAT)), 뉴런 세포 크기, 그리고 타입 II NGF 수용체의 발현이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다; NGF는 3차원 간질 조직에서 배양된 교질 세포 및 기타 뉴런 세포에 의해 조건화된 조건화 배지 내로 분비되고, 이것은 이후, 신경 치유를 위한 조성물에 이용될 수 있다.
내인성 NGF의 결핍은 일정한 인간 신경퇴행성 질환을 악화시키고, 그리고 손상된 성체 CNS 뉴런의 재생하는 능력 없음이 명백하게 나타난다. 구체적으로, 신경 손상은 세포체로부터 축삭의 단리의 결과인, 손상의 원위에서 신경 섬유의 퇴행이 뒤따른다. 중추신경계에서, 손상의 부위에서 유의미한 성장이 없고 전형적으로, 손상된 뉴런의 사멸로 귀결된다. NGF는 세포체 수준 (가령, 중격), 개재성 조직 공간 (가령, 신경 다리) 및 신경재분포 (reinervation) 구역 (가령, 해마 형성)에서 성체 CNS 콜린성 뉴런의 재생 능력에서 결정적인 역할을 수행한다. 부가적으로, NGF는 인지 결함을 개선하는데 유익할 수 있다. 예로써, 교질 세포로 조건화된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 새로운 축삭이 손상된 신경의 절단 단부로부터 성장하여 (가령, 성장 원뿔을 발달시켜) 연결의 본래 부위로 신장할 수 있는 외인성 NGF 및 기타 신경 성장 인자의 활성을 공급할 수 있다.
게다가, 뇌와 척수에 대한 손상은 종종, 공동 축삭 퇴행에 대한 교질 반응을 동반하고, 흉터 조직을 유발한다. 이러한 흉터 조직은 초기에, 신경 성장에 대한 물리적 장벽인 것으로 생각되었지만, 뉴런외 환경에서 향신경성 인자의 존재 또는 부재가 더욱 중요하다. 성상세포는 손상에 대응하여 라미닌을 합성할 수 있는 것으로 보인다 (라미닌 역시 물질대사된 조건화 성장 배지에서 발견될 수 있다). 콜라겐과 피브로넥틴, 그리고 특히 라미닌은 시험관내에서, 배양된 뉴런 또는 뉴런 외식체로부터 신경돌기의 성장을 증진하는 것으로 밝혀졌다. 이들 세포외 기질 단백질은 성장 원뿔의 전방 움직임 및 축삭의 신장을 조장하는 점착성 기층을 제공하는 것으로 보인다. 따라서 향신경성 인자와 지지성 기층의 존재가 성공적인 신경 재생을 위해 요구되는데, 그 이유는 재생이, 뉴런 세포체가 적절한 생합성 반응을 시작할 수 있고; 그리고 손상 부위를 둘러싸는 환경이 축삭의 신장과 궁극적인 기능적 재접속을 지지할 수 있어야 한다는 것을 요구하는 것으로 보이기 때문이다. 신경 세포, 예를 들면, 성상세포와 교질 세포에 의해 조건화된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 뇌와 척수 손상에서 신경 재생에 필요한 향신경성 성장 인자와 세포외 기질 단백질의 활성을 내포한다. 따라서 한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 이런 손상의 치료를 위해 조제된다.
다른 구체예에서, 피부, 골, 간, 췌장, 연골, 그리고 기타 특수한 조직의 치료는 그들 각각의 특수한 세포 유형에 의해 조건화된 배지로 처리되어, 바람직하게는 3차원에서 배양되어, 개별 조직 유형에 대한 상처를 치료하는데 유용한 상기 조직 유형의 하나 또는 그 이상의 특징적인 세포외 단백질 및 기타 대사산물의 활성을 내포하는 조건화 배지를 산출할 수 있다.
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 또한, 균일한 조직 복구를 증진하기 위해, 생물분해성 콘택트렌즈, 각막 방어물 또는 골 이식편을 제공하기 위해, 외과적 공간 충전제를 제공하기 위해, 특히 피부 주름살을 감소시키는 목적으로 피부에서 연한 조직 증대를 증진하기 위해, 그리고 요실금을 제어하기 위한 목적으로 요도 괄약근 증대로서 심미 보철 (periodontal surgery)에 이용되는 장치에 첨가될 수 있다.
다른 구체예에서, 조성물은 냉동 건조되고/동결-건조되고, 그리고 상처 충전제 (가령, 이식을 위해 모발 플러그로부터 남겨진 구멍을 채운다)로서 첨가되거나, 또는 상처 치유를 가속하기 위해 기존의 상처 충전 조성물에 첨가될 수 있다. 다른 구체예에서, 배지는 배지 내에 상처 치유 단백질의 농도를 증가시키기 위해 유전자 조작된 세포로 조건화된다. 가령, 세포는 유전자 산물, 예를 들면, 앞서 열거된 임의의 성장 인자를 발현하도록 조작될 수 있다.
C. 선천적 이상, 후천적 결함 및 미용적 결함의 복구와 교정
앞서 개시된 바와 같이, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 또한, 선천적 및 후천적인 다양한 이상뿐만 아니라 표면적 및 침해적인 미용적 결함을 복구하고 교정하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 미세 주름과 주름살; 검버섯과 색소이상; 감소된 피부 감촉, 색상과 탄력성; 거?과 광 손상; 피부의 감소된 재생 능력; 환경적 손상; 피부의 감소된 부드러움과 팽팽함; 검버섯; 미세하고 거친 주름과 주름살; 미세하고 거친 눈주위 주름살; 팔자 주름; 얼굴의 미세하고 거친 주름; 감소된 피부 광휘와 반반함; 감소된 피부 탄성; 과색소침착; 암점 및/또는 패치; 감소된 피부 증백과 발랄한 외관; 광손상된 피부; 내적으로 및 외적으로 노화된 피부; 비정상적 피부 세포 전도; 감소된 피부 장벽; 피부의 수분 유지 능력의 감소; 갈색과 적색 부스럼투성이; 적열 상태; 비정상적 피부 상피 두께; 진피 상피 접합의 감소; 증가된 구멍 크기와 구멍의 숫자; 또는 이들의 조합을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 일광 손상된 피부와 노화 피부의 원기를 회복하고; 미세 주름과 주름살의 외관을 개선하고; 세포 재생을 증진하고; 및/또는 피부 색상, 감촉 및/또는 탄성을 개선하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 피부를 오동통하게 하고 및/또는 증백하고 및/또는 피부를 밝게 하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 피부의 재생 능력을 강화시키고; 검버섯의 외관을 개선하고; 및/또는 피부 탄성, 탄력성, 및/또는 회복력을 개선하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 피부 상에 미세 주름을 부드럽게 하고, 팽팽하게 하고, 및/또는 채우는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 눈 아래 다크 서클의 외관을 감소시키는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 입술 감촉 및/또는 상태를 개선하고, 자연 입술 색상을 향상시키고, 및/또는 입술 볼륨을 증가시키는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 수술후 피부의 상피화를 증진하고 및/또는 피부의 장벽 및/또는 수분 균형을 복구하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 검버섯의 외관 및/또는 색소침착을 개선하는데 이용될 수 있다.
가령, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물은 임의의 형태로 첨가될 수 있고, 그리고 하이드로겔, 주사가능, 크림, 연고에서 이용될 수 있고, 그리고 피부를 국소적으로 강화하기 위해 아이 섀도, 펜케이크 화장, 컴팩트 또는 기타 화장품에도 첨가될 수 있다.
다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지의 국소 투여 또는 임의의 공지된 방법, 예를 들면, 주사 경구 등에 의한 적용은 예로써, UV 광, 다양한 오염물질에 노출 및 정상적인 노화에 의해 유도된 주름 및 다수의 유해한 효과를 반전시키고 및/또는 예방하기 위해 만들어진다.
부가적으로, 다른 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 세포 노화를 감소시키고 피부 암을 유발하는 인자의 활성을 억제하는데 이용된다. 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물이 항산화 활성을 갖는다는 것은 실시예에서 증명된다. 이번에도, 포유동물에 적용은 국소 투여 또는 임의의 공지된 방법, 예를 들면, 주사, 경구 등에 의한 적용일 수 있다. 출원인들은 대략 50 퍼센트의 세포내 산화에서 통계학적으로 유의미한 (p<0.003) 감소가 출원인의 물질대사된 조건화 성장 배지에 노출된 인간 케라틴생성세포에서 관찰된다는 것을 발견하였다.
따라서 시험관내에서 상피와 진피 세포 증식 및 콜라겐 분비를 유도하는 것 이외에, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 항산화 활성을 갖는다. 실시예 18을 참조한다.
이러한 무균 농축된 영양 용액은 다량으로 쉽게 구입가능한 생물공학 약용 화장품을 대표하고, 그리고 인간 피부, 모발, 그리고 손발톱에서 성장 인자와 기질 분자의 수준을 보충하기 위한 다양한 피부, 화장품, 그리고 피부과 산물에 대한 첨가제로서 유용할 수 있다. 산물은 성장 인자와 기타 생물분자의 피부 내로의 침투를 잠재적으로 최적화하는 알파 히드록시산 박리 및 치유를 잠재적으로 가속하고 염증을 감소시키는 화학적 박피와 함께 이용이 구상된다.
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 실리콘 또는 기타 산물을 이용하는 대신에, 주름, 파인 주름, 흉터형성 및 기타 피부 질환을 제거하기 위해 조제될 수 있다. 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 성장 인자 및 염증성 매개체, 예를 들면, VEGF, HGF, IL-6, IL-8, G-CSF와 TFGβ뿐만 아니라, 세포외 기질 단백질, 예를 들면, 타입 I과 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 테나신, 글리코사미노글리칸, 산성과 염기성 FGF, TGF-α와 TGF-β, KGF, 베르시칸, 데코린, 베타글리칸, 신데칸 및 신체적 이상과 미용적 결함을 복구하는데 유용한 다양한 기타 분비된 인간 진피 기질 단백질의 활성을 내포한다.
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 주사가능 제조물로 조제될 수 있다. 대안으로, 조건화 배지로부터 유래된 산물이 조제될 수 있다. 가령, 생물학적 활성 물질, 예를 들면, 단백질과 약물이 조성물의 주사 후, 이들 활성 물질의 방출 또는 제어된 방출을 위해 본 발명의 조성물 내에 함입될 수 있다. 전형적인 생물학적 활성 물질에는 주사 부위에서 치유와 조직 복구를 증진하는 조직 성장 인자, 예를 들면, TGF-β 등이 포함될 수 있다. 산물 정제의 방법에는 조건화 배지의 SEPHADEX®와 같은 기질을 이용한 겔 크로마토그래피, 이온 교환, 가교된 아가로오즈와 같은 불용성 기질을 이용한 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, HPLC 정제, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 기술은 Cell & Tissue Culture ; Laboratory Procedures, supra; Sanbrook et al ., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY에서 더욱 상세하게 기술된다.
주사가능 구체예에서, 수성 현탁액이 이용되고, 그리고 수성 현탁액의 제제는 생리학적 pH (즉, 약 pH 6.8 내지 7.5)를 가질 수 있다. 부가적으로, 국지 마취제, 예를 들면, 리도카인 (통상적으로, 중량으로 약 0.3%의 농도에서)이 주사 시에 국지 통증을 감소시키기 위해 첨가된다. 최종 제제는 또한, 유체 윤활제, 예를 들면, 말토오스를 내포할 수 있는데, 이것은 신체에 의해 관용되어야 한다. 전형적인 윤활제 성분에는 글리세롤, 글리코겐, 말토오스 등이 포함된다. 유기 폴리머 염기 물질, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 히알루론산, 그리고 비-미소섬유 콜라겐, 바람직하게는 숙시닐화된 콜라겐 역시 윤활제로서 기능할 수 있다. 이런 윤활제는 일반적으로, 조성물의 점도를 변화시킴으로써 주사 부위에서 주사된 생물물질의 주사가능성 (injectability), 관입성 (intrudability)과 분산을 개선하고 스파이킹 (spiking)의 양을 감소시키는데 이용된다. 최종 제제는 정의에 따르면, 제약학적으로 허용되는 담체에 담긴 가공 처리된 물질대사된 조건화 성장 세포 배지이다.
본 발명의 가공 처리된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 차후에, 조직 결함의 부위에서 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물의 정확한 배치를 위해 주사기 또는 다른 주사 기구 내에 배치된다. 진피 증대를 위한 제제의 경우에, 용어 "주사가능"은 제제가 실질적인 스파이킹 없이, 정상 조건 및 정상 압력 하에 낮게는 25의 게이지를 갖는 주사기로부터 분배될 수 있다는 것을 의미한다. 스파이킹은 조성물이 조직 내로 주사되기 보다는 주사기로부터 흘러나오도록 유발할 수 있다. 이러한 정확한 배치를 위하여, 27 게이지 (200μ I.D.) 또는 심지어 30 게이지 (150μ I.D.) 정도의 가는 바늘이 바람직할 수 있다. 이런 바늘을 통해 압출될 수 있는 최대 입자 크기는 적어도 하기의 복잡한 함수일 것이다: 입자 최대 치수, 입자 형상비 (길이:너비), 입자 강직성, 입자의 표면 거? 및 입자:입자 유착에 영향을 주는 관련된 인자, 현탁 유체의 점탄성, 그리고 바늘을 통한 유속. 뉴우튼 유체에서 현탁된 강직성 구형 구슬은 가장 단순한 사례를 나타내고, 반면 점탄성 유체에서 섬유상 또는 가지형 입자는 아마도 더욱 복잡할 것이다.
본 발명의 주사가능 분비된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물을 제조하는 과정에서 앞서 기술된 단계는 바람직하게는, 무균 조건 하에 무균 물질을 이용하여 수행된다. 제약학적으로 허용되는 담체에 담긴 본 발명의 가공 처리된 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 연한 조직을 증대시키고, 선천적 이상, 후천적 결함 또는 미용적 결함을 복구하거나 교정하기 위해 피내 또는 피하 주사될 수 있다. 이런 질환의 실례는 선천적 이상, 예를 들면, 반안면 왜소증, 뺨과 광대뼈 형성부전, 편측 유방 형성부전, 함몰흉, 흉근 발육부전 (Poland's anomaly) 및 구개열 복구 또는 점막하 구개열에 부차적인 연인두 폐쇄부전 (인후 이식물로서); 후천적 결함 (외상후, 수술후, 감염후), 예를 들면, 함몰된 흉터, 피하 위축 (가령, 원판상 홍반성 낭창에 부차적인), 각화 병소, 적출된 눈에서 안구함몰 (또한, 상고랑 증후군), 얼굴의 여드름 흉터, 피하 위축을 동반하는 선상공피증, 안비기형, 롬버그병 및 편측 성대마비; 그리고 미용적 결함, 예를 들면, 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 및 유방 형성부전이다. 본 발명의 조성물은 또한, 내부 조직, 예를 들면, 이런 조직을 증대시키기 위해 신체 괄약근 (body sphincter)을 한정하는 조직 내로 주사될 수 있다.
배지를 조건화하는데 이용되는 다른 조직 유형에는 제한 없이, 골수, 피부, 상피 세포, 그리고 연골이 포함되지만, 3차원 배양 시스템은 다른 유형의 세포와 조직과 함께 이용될 수 있는 것으로 명백히 이해된다.
대안으로, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 상처 치료에 관한 이전 섹션에서 기술된 바와 같이 폴리머화가능 또는 가교 하이드로겔로 조제될 수도 있다.
D. 제약학적 적용
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 본 명세서 전반에서 기술된 바와 같이 다양한 유용한 제약학적 인자와 성분, 예를 들면, 성장 인자, 조절 인자, 펩티드 호르몬, 항체 등을 내포하고, 따라서 다양한 제약학적 적용에 유용하다. 또한, 첨가될 수 있는 산물에는 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 스테로이드, 진통제, 항종양 약물, 조사 중인 약물, 또는 조건화 배지 내에 인자와 우호적 또는 상승적 합동을 유발하는 임의의 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 앞서 논의된 바와 같이, 이들 세포는 배양되고, 그리고 배지는 무균 조건 하에 회수된다. 부가적으로, 배지는 병원체에 대해 조사될 수 있다. 멸균이 수행되면, 이것은 상기에서 기술된 바와 같이 원하는 생물학적 활성에 최소의 영향을 주는 방식으로 수행되어야 한다. 배지는 본원에서 기술되는 바와 같은 소정의 적용을 위하여, 배지 내에 포함된 하나 또는 그 이상의 인자 또는 성분을 농축하거나 감소시키기 위한 추가의 가공 처리, 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피를 이용한 성장 인자의 농축 또는 정반대로, 덜 바람직한 성분의 제거가 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제는 3차원 세포 구조체에 의해 조건화된 배지로부터 만들어진다. 3차원 배양액은 최적 생리학적 비율과 농도에서 배지 내로 분비되는 다양한 성장 인자와 단백질을 생산한다. 예로써, 표 2를 참조한다. 상기 배지는 이런 이유로, 생체내에서 발견되는 것들에 가까운 인자의 독특한 합동 및 특정된 비율을 제공한다. 소 혈청은 일반적으로, 본 출원에서 선호되지 않는다. 세포 잔해 또는 기타 입자성 물질뿐만 아니라 프로테아제, 젖산 및 세포 성장에 잠재적으로 유해한 기타 성분을 제거하는 것이 바람직하다.
당업자에 의해 통상적으로 이용되는 검정은 특정 인자 또는 인자들의 활성을 조사하여, 생물학적 활성의 허용되는 수준 (가령, 치료적으로 효과적인 활성)이 부착된 분자 또는 캡슐화된 분자에 의해 유지되도록 담보하는데 이용될 수 있다.
따라서 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물 및 상기 배지로부터 유래된 산물은 예로써, 당뇨의 치료에서 인슐린, 알츠하이머병의 치료에서 신경 성장 인자, 혈우병의 치료에서 인자 VIII 및 기타 응고 인자, 파킨슨병의 치료에서 도파민, 만성 통증의 치료에서 부신 크롬친화 세포를 통한 엔카팔린, 근이영양증의 치료에서 디스트로핀, 그리고 비정상적 성장의 치료에서 인간 성장 호르몬을 제공하는데 이용될 수 있다.
이런 치료 단백질 작용제의 용량은 당업자에게 널리 공지되어 있고 제약학적 약전, 예를 들면, PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.; GOODMAN & GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill Publ., THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams and Wilkens Publishers에서 찾아볼 수 있다.
앞서 기술된 임의의 약물 또는 작용제의 치료적으로 효과적인 용량은 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 일과적으로 결정될 수 있다. "치료적으로 효과적인" 용량은 치료되는 과정 및/또는 질환의 적어도 하나의 증상의 완화를 유발할 만큼 충분한 화합물의 양을 지칭한다.
약물의 독성과 치료 효능은 예로써, LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간에 용량 비율은 치료 지수이고, 그리고 이것은 비율 LD50/ED50으로서 표시될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 이용될 수 있긴 하지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화시켜 부작용을 감소시키기 위해, 이런 화합물을 병든 조직의 부위로 표적화시키는 전달 시스템이 설계되도록 주의해야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 이용을 위한 용량의 범위를 공식화하는데 이용될 수 있다. 이런 화합물의 용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 일정한 범위의 순환 농도 (circulating concentration) 내에 있다. 용량은 이용되는 제형 (dosage form) 및 이용된 투여 루트에 따라, 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 이용된 임의의 화합물의 경우에, 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 산정될 수 있다. 순환 혈장 농도 범위는 세포 배양에서 측정될 때, IC50 (즉, 증상의 반-극대 억제를 달성하는 검사 화합물의 농도)을 포함한다. 이런 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장에서 수준은 예로써, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
부가적으로, 이들 세포와 조직은 원하는 산물, 예를 들면, 인슐린의 발현을 향상시키고, 및/또는 표적 유전자 발현 및/또는 활성에 대한 억제 효과를 가질 수 있는 앞서 열거된 유전자 산물, 예를 들면, 리보자임, 안티센스 분자 및 삼중 나선을 표적으로 하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 모이어티를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 이것은 배지 내에 특수한 간질 세포가 특정의 구조적/기능적 역할을 수행할 수 있는 조직, 예를 들면, 신경 조직의 교질 세포, 간의 쿠퍼 세포 등을 배양할 때, 아마도 유리할 것이다.
E. 모발 성장의 자극
배지는 예로써, 인간 모발 유두 세포를 이용하여 조건화될 수 있다. 바람직하게는, 이런 세포에 의해 조건화된 배지는 3차원에서 성장된다. 모발 유두 세포는 모발 형성, 성장과 복구에서 중추적인 역할을 수행하는 간엽 줄기 세포의 한 유형이다 (Matsuzaki et al ., Wound Repair Regen, 6:524-530 (1998)). 차후에 물질대사된 조건화 성장 배지는 바람직하게는 농축되고 국소 제제로서 적용된다. 물질대사된 조건화 배지 조성물은 피부, 예를 들면, DMSO 내로 화합물의 침투를 조장하는 작용제를 이용한 국소 적용을 위해 조제되고, 그리고 모발 성장을 자극하기 위한 국소 적용제로서 적용된다.
본 발명의 조성물은 모낭으로 상피 세포 이동을 증가시키는 인자를 제공함으로써 국소 적용될 때, 모발 성장을 증진하거나 복구한다. 물질대사된 조건화 배지 내에서 발견되는 인자에 더하여, 다른 화합물, 예를 들면, 미녹시딜 및 항생제가 이용될 수 있다. 모발 성장 동안, 퇴행기 (성장기와 휴지기 사이에 모낭의 과도기) 및 휴지기 동안 혈류 공급이 감소한다. 물질대사된 조건화 세포 배지로부터 유래된 생물학적 활성 분자는 남성 탈모 (male-patterned baldness)에 대한 짧은 꼬리 마카크 (stump-tailed macaque) 모델을 비롯한 당분야에 공지된 검정을 이용하여 모발 성장의 이들 국면 동안 이용을 위해 결정되고 최적화될 수 있다. 예로써, Brigham, P.a., A. Cappas, and H. Uno, The Stumptailed Macaque as a Model for Androgenetic Alopecia: Effects of Topical Minoxidil Analyzed by Use of the Folliculogram, Clin Dermatol, 1988,6(4): p. 177-87; Diani, A.R. and C.J. Mills, Immunocytochemical Localization of Androgen Receptors in the Scalp of the Stumptail Macaque Monkey, a Model of Androgenetic Alopecia, J Invest Dermatol, 1994,102(4): p. 511-4; Holland, J. M., Animal Models of Alopecia, Clin Dermatol, 1988,6(4): p. 159-162; Pan, H.J., et al ., Evaluation of RU58841 as an Anti-Androgen in Prostate PC3 Cells and a Topical Anti-Alopecia Agent in the Bald Scalp of Stumptailed Macaques, Endocrine, 1998, 9(1): p. 39-43; Rittmaster, R.S., et al ., The Effects of N, N-diethyl-4-methyl-3-oxo-4-aza-5 alpha-androstane-17 beta-carboxamide, a 5 alpha-reductase Inhibitor and Antiandrogen, on the Development of Baldness in the Stumptail Macaque, J. Clin Endocrinol Metab, 1987, 65(1): p. 188-93을 참조한다 (이들은 각각 전체로서 참고문헌으로 편입된다). 추가의 모델은 탈모 구역과 모발 구역으로부터 배양된 모낭, 신생 쥐 모델, 그리고 원형 탈모증의 쥐 모델로부터 모낭 증식에서 차이를 측정하는 것을 포함한다. Neste, D.V., The Growth of Human hair in Nude Mice, Dermatol Clin ., 1996, 14(4): p. 609-17; McElwee, K.J., E. M. Spiers, and R.F. Oliver, In Vivo Depletion of CD8+T Cells Restores Hair Growth in the DEBR Model for Alopecia Areata, Br J Dermatol, 1996, 135(2): p. 211-7; Hussein, A.M., Protection Against Cytosine Arabinowide-Induced Alopecia by Minoxidil in a Rat Animal Model, Int J Dermatol, 1995, 34(7): p. 470-3; Oliver, R.F., et al ., The DEBR Rat Model for Alopecia Areata, J Invest Dermatol, 1991, 96(5): p. 978; Michie, H.J., et al., Immunobiological Studies on the Alopecic (DEBER) Rat, Br J Dermatol, 1990, 123(5): p. 557-67을 참조한다 (이들은 각각 전체로서 참고문헌으로 편입된다).
V. 다른 용도
A. 식품 첨가제 및 식이 보충물
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 식품 첨가제로서 이용되고 식이 보충물로 조제될 수 있다. 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 개별 식품 또는 상품 군에서 발견되지 않는 존재비와 다양성으로, 필수 아미노산, 무기물, 그리고 비타민을 비롯한 많은 유용한 영양소를 내포할 수 있다. 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 체중 감소를 위한, 또는 대안으로, 특히 제3세계에 대한 식품의 영양 함량을 향상시키기 위한 균형 영양 보충물에 대한 저렴한 공급원으로서 이용될 수 있다. 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 멸균되고 인간 병원체에 의한 오염이 없다 (즉, 무균). 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 농축되고 및/또는 냉동 건조되고, 그리고 바람직하게는, 섭취를 위한 캡슐 또는 정제로 투여될 수 있다. 대안으로, 이들 조성물은 영양 함량을 향상시키기 위해 성인식 (adult food) 또는 유아식 (baby food)에 직접적으로 첨가될 수도 있다. 영양소의 이러한 풍부한 공급원은 상대적으로 저렴하게 가공 처리될 수 있고 영양부족의 노인, 그리고 특히, 감염에 대한 불량한 반응에 기인한 증가된 사망률이 영양실조와 연관되는 저개발 국가의 아이들에게 매우 귀중할 수 있다.
부가적으로, 많은 미량 원소, 예를 들면, 철과 마그네슘은 포유동물 생존과 번식에 중요하고, 그리고 한계 미량 원소 결핍이 보건 문제가 될 수 있다는 우려가 있다. 다양한 필수 미량영양소의 섭취는 발암 (carcinogenesis)의 특정 국면을 변화시킴으로써 감염뿐만 아니라 암 위험을 감소시키는 것으로 제안되었다. 또한, 미량영양소는 구체적으로, 침입 병원체에 대한 식세포와 세포독성 작용을 조장하고 및/또는 다양한 중요 장기에서 출현하는 전암성 세포를 파괴하는 다양한 사이토킨의 생산을 향상시킴으로써, 면역계의 기능적 활동 및 이의 T 세포와 B 세포, Mos, 그리고 NK 세포 상호작용 기전을 향상시킨다. Chandra, R.K. ed. (1988), Nutrition and Immunology . Contemporary Issues in Clinical Nutrition, Alan R. Liss, New York을 참조한다. 따라서 균형 영양소의 상대적으로 저렴한 공급원이 요구된다. 조건화 배지로 농축을 위한 이상적인 식품 산물은 빵, 곡류 및 기타 곡물 산물, 예를 들면, 파스타, 크래커 등이다. 또한, 물질대사된 배지는 본 섹션에서 기술되는 바와 같은 소정의 적용을 위하여, 배지 내에 포함된 하나 또는 그 이상의 인자 또는 성분을 농축하거나 감소시키기 위한 추가의 가공 처리, 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피를 이용한 성장 인자의 농축 또는 정반대로, 덜 바람직한 성분의 제거가 수행될 수 있다.
B. 동물 공급 보충물
본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 동물 공급에 대한 보충물로서 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 단백질의 공급원 및 포유동물, 예를 들면, 소 및 기타 반추 동물, 예를 들면, 젖소, 사슴 등에 유익한 기타 인자를 제공하는 소 혈청을 내포한다. 배지는 병원체에 대해 스크리닝되고 소 병원체 및 마이코플라즈마가 없다. 본 발명의 물질대사된 조건화 성장 배지 및/또는 물질대사된 세포 추출물은 바람직하게는, 병원체의 가능성이 현저하게 감소하도록 미국에서 사육된 젖소로부터 수득된다.
한 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제시되고, 여기서 물질대사된 조건화 성장 배지는 효모 세포에 의해 물질대사된 조건화 성장 배지이다. 일부 구체예에서, 조건화 성장 배지는 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양함으로써 제조된다. 일부 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 일부 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 다른 구체예에서, 조성물은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 다른 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 일부 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후, 감염후 또는 의학적 시술 결함후 발생하는 의학적 장애이다.
다른 구체예에서, 물질대사된 세포 추출물 및 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제시되고, 여기서 물질대사된 세포 추출물은 효모 세포에 의해 물질대사된 세포 추출물이다. 일부 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 또 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 미용적 결함, 선천적 결함, 탈모 또는 후천적 결함을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 또 다른 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후, 감염후 또는 의학적 시술 결함후 발생하는 의학적 장애이다.
또 다른 구체예에서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지가 제시된다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계.
일부 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포이다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다.
또 다른 구체예에서, 청구항 15 내지 18중 어느 한 항의 물질대사된 조건화 성장 배지를 제조하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계.
일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 허용되는 담체와 합동된다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%의 양, 조성물의 중량으로 약 0.01 % 내지 약 50%, 또는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 일부 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다.
또한, 본원에서는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물이 제시된다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계.
일부 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 세포 추출물을 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다.
한 구체예에서, 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 포함하는 조성물이 제시된다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계.
일부 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 다른 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포이다. 일부 구체예에서, 조성물은 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%, 또는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 다른 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 또 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물이 제시된다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계.
한 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 일부 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 세포 추출물을 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%, 또는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 또 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제시된다:
(a) 조건화 성장 배지를 형성하기 위해 세포를 시험관내에서 성장시키는데 필요한 영양 요구를 충족시키는데 충분한 성장 배지에서 세포를 배양하고, 그리고 배양된 세포로부터 조건화 성장 배지를 제거하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 조건화 성장 배지에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 조건화 성장 배지의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 수집하는 단계.
한 구체예에서, 질환은 미용적 결함, 탈모, 선천적 결함 또는 후천적 결함이다. 다른 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후, 감염후 또는 의학적 시술 결함후 발생하는 의학적 장애이다. 또 다른 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 또 다른 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 일부 구체예에서, 단계 (a)에서 세포는 섬유아세포이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 조건화 성장 배지를 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%, 또는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 세포외 기질 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 60% 내지 약 100% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 콜라겐 단백질 또는 리실 수산화효소 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 COL4A1 유전자 또는 PLOD1 유전자에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 복구 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 약 10% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 50%, 또는 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 피브로넥틴 단백질이다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 FN1 유전자에 의해 인코딩된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 세포 연결 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5% 내지 약 200%, 약 10% 내지 약 80%, 또는 약 30% 내지 약 50% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 인볼루크린 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 IVL 유전자에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 항산화 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5% 내지 약 300%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 200% 내지 약 250% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 SOD2 유전자에 의해 인코딩된다.
또한, 본원에서는 허용되는 담체 및 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 물질대사된 세포 추출물을 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제시된다:
(a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
(b) 효모 세포를 배양하는 단계;
(c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
(d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
(e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계.
일부 구체예에서, 질환은 미용적 결함, 탈모, 선천적 결함 또는 후천적 결함이다. 일부 구체예에서, 후천적 결함은 외상후, 수술후, 감염후, 또는 의학적 시술 결함후 발생하는 의학적 장애이다. 다른 구체예에서, 미용적 결함은 미간 주름, 깊은 팔자 주름, 입둘레 지리적 주름살, 홀쭉한 볼 또는 유방 형성부전이다. 한 구체예에서, 효모는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 섬유아세포로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 (e) 물질대사된 세포 추출물을 가공 처리하는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 가공 처리는 농축, 여과, 정제, 또는 이들의 조합이다. 또 다른 구체예에서, 물질대사된 조건화 성장 배지는 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 0.0001% 내지 약 95%, 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 50%, 또는 조성물의 중량으로 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로 존재한다. 무-제한적 실례에서, 물질대사된 세포 추출물은 조성물 내에, 조성물의 중량으로 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%의 양으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 물, 계면활성제, 유화제, 조정제, 연화제, 왁스, 오일, 폴리머, 농후제, 염착제, 착색제, 약효 식품, 약용 화장품, 치료제, 약제, 항진균제, 항균제, 스테로이드성 호르몬, 비듬방지제, 항-여드름 성분, 자외선차단제, 그리고 보존제 중에서 적어도 하나를 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 주사가능 조성물 또는 국소 조성물이다. 다른 구체예에서, 국소 조성물은 연고, 크림, 하이드로겔, 또는 로션이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 세포외 기질 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 60% 내지 약 100% 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 콜라겐 단백질 또는 리실 수산화효소 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 COL4A1 유전자 또는 PLOD1 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 복구 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 한 구체예에서, 복구 단백질은 약 10% 내지 약 70%, 또는 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 피브로넥틴 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 복구 단백질은 FN1 유전자에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 세포 연결 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5% 내지 약 200%, 약 10% 내지 약 80%, 또는 약 30% 내지 약 50% 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 인볼루크린 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 IVL 유전자에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 항산화 단백질은 개체에 조성물의 투여에 의해 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5% 내지 약 300%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 200% 내지 약 250% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 SOD2 유전자에 의해 인코딩된다.
실시예
실시예 1: 섬유아세포 단층 세포 배양
인간 포피로부터 단리된 정상적인 인간 진피 섬유아세포는 37℃, 5% CO2 배양기 내에, 10% 우아 혈청 (Hyclone Laboratories, Logan, Utah), 비필수 아미노산 (GibcoBRL), 그리고 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신-250 ng/ml 암포테리신 B (GibcoBRL)로 보충된 전조건화 세포 배양 배지 (본 실시예에서, 높은 글루코오스 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM; GibcoBRL, Grand Island, N.Y.) ("DMEM 1")를 이용한 단층 배양에서 150 cm2 조직 배양 플라스크 (Corning, Corning, N.Y.)에서 배양되었다. 단층 배양액은 새로운 전조건화 배지가 주2회 공급되고, 그리고 기술된 바와 같이, 1 내지 10 스플릿 (split)을 이용하여 주1회 계대되었다. 전반적으로, Pinney et al ., J. Cell . Physio., 183:74 82 (2000)를 참조한다. 진피 섬유아세포는 또한, DMEM 1을 갖는 회전병에서 확장될 수 있다. 이들 단층 배양액으로부터 조건화 배지는 수집되고 추후 이용을 위해 보관된다.
섬유아세포가 본 실시예에서 예시의 목적으로 이용되긴 했지만, 당업자는 다른 상피 세포 유형, 내피 세포, 평활근 세포, 근세포, 케라틴생성세포, 연골세포 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 많은 다른 유형의 세포가 단층 배양 및 3차원 배양에서 성장될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 2: 배지의 조건화
인간 진피 섬유아세포는 '766 특허에서 기술되고 상기에서 상세하게 기술된 기구의 기층 위에 파종되었다. 기층은 표면 상에서 3차원 조직 성장을 조장하도록 설계된 케이싱 내에 있고, 그리고 세포는 37℃에서 가습된 5% CO2 공기 하에, 밀폐 시스템 내에 높은 글루코오스 DMEM (2 mM L-글루타민 및 50 mg/ml 아스코르브산으로 보충된 10% BCS)에서 배양되었다. 10일후, 세포 배양액은 제거되고, 새로운 배지가 첨가되었다. 세포는 앞서 기술된 바와 같이, 추가로 4일 동안 배양되었다. 4일 (10-14일자) 동안 세포와 조직 배양액에 노출된 결과의 조건화 배지는 이후, 개별 챔버로부터 이전되고 함께 모아졌다. 조건화 배지 (대략 5 내지 10 리터/풀 (pool))는 200ml 분취량으로 분배되고, 그리고 10,000 MW 컷-오프 (cut-off)를 갖는 필터가 구비된 양압 농축 장치 (Amicon, Beverly, MA)를 이용하여 10- 내지 20-배 더욱 농축되었다. 결과의 10 내지 20 ml의 농축되고 조건화 배지는 1 ml 분취량으로 분배되고 분석을 위해 -20℃에서 동결되었다. 1X 농도의 조건화 배지는 10% (vol/vol) 용액으로서 기본 배지에 첨가된 10X 조건화 배지로부터 발생한다. 유사하게, 1X 농도의 "배지" 또는 "무혈청 배지"는 10% (vol/vol) 용액으로서 기본 배지에 첨가된 10X 배지 (즉, 기본 배지) 또는 10X 무혈청 배지 (혈청이 없는 기본 배지)로부터 발생하고, 이들은 이후, 대조로서 이용된다.
실시예 3: 물질대사된 조건화 성장 배지의 제조
a. 생물체와 배지
피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (야생형 균주)가 발효 작업을 위한 효모 세포 배양액으로서 이용되었다. 스톡 배양액은 효모-펩톤-덱스트로스 (YPD) 한천 평판 상에 유지되었다. 부모 스톡 배양액은 YPD 액체배지에서 성장되고 -20℃에서 유지되었다. 발효는 효모 질소-염기 (YNB) 성장 배지에서 수행되고 2.7% H3PO4, 0.09% CaSO4, 1.8% K2SO4, 1.5% MgSO4, 0.41% KOH, 4% 글리세롤 (Sigma St. Louis, MO)을 내포하는 글리세롤로 보충되었다. 조건 성장 배지는 SkinMedica (California)에 의해 공급되었다.
b. 발효기
발효 과정은 상기 효모에 대한 표준 성장 조건을 이용하여 2L와 15L 발효 단계로 정률 증가되었다 (2L New Brunswick Scientific, Edison NJ 및 15L Applikon Biotechnology Foster City CA).
c. 조건화 성장 배지 물질대사 조건
유가식 배양액 (fed-batch culture)은 29℃에서, 효모 질소-염기 (YNB) 성장 배지에서 성장되고 글리세롤 (2.7% H3PO4, 0.09%CaSO4, 1.8%K2SO4, 1.5% MgSO4, 0.41% KOH, 4% 글리세롤)로 보충되었다. pH는 2M NH4OH로 적정에 의해 5.0 ± 0.5에서 일정하게 유지되었다. 용존 산소 수준은 멸균가능 DO 프로브에 의해 측정되고, 그리고 산소 포화도는 교반 속도를 100과 600 rpm 사이에서 조절함으로써 30%로 유지되었다. 조건화 성장 배지는 효모의 능동적 성장기 동안 액체 배지를 발효기 내로 접종함으로써 영양 보충물로서 발효 과정에 도입되었다. 유가식 과정은 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 대수 성장기 동안 개시되었다. 성장은 발효 동안 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 광학 밀도를 모니터링함으로써 측정되었다. 발효는 대수기에서 정지기로 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 성장기에서 변화에 의한 측정에서, 조건화 성장 배지가 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에 의해 물질대사되는 시점까지 수행되었다. 발효는 완결 때까지 수행될 수 있는데, 여기서 조건화 성장 배지는 완전하게 물질대사되거나, 또는 부분적으로 발효될 수 있다, 다시 말하면, 부분적으로 물질대사될 수 있다.
조건화 성장 배지는 물질대사된 조건화 성장 배지를 적절한 운반제와 합동하기에 앞서, 농축되고, 여과되고 및/또는 정제될 수 있다.
실시예 4: 물질대사된 세포 추출물의 제조
a. 세포 추출물
완전한 세포 추출물은 예로써, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 동물 세포 또는 식물 세포로부터 수득된다.
b. 생물체와 배지
피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (야생형 균주)가 발효 작업을 위한 효모 세포 배양액으로서 이용된다. 스톡 배양액은 효모-펩톤-덱스트로스 (YPD) 한천 평판 상에 유지된다. 부모 스톡 배양액은 YPD 액체배지에서 성장되고 -20℃에서 유지된다. 발효는 효모 질소-염기 (YNB) 성장 배지에서 수행되고 2.7% H3PO4, 0.09% CaSO4, 1.8% K2SO4, 1.5% MgSO4, 0.41% KOH, 4% 글리세롤 (Sigma St. Louis, MO)을 내포하는 글리세롤로 보충된다.
b. 발효기
발효 과정은 상기 효모에 대한 표준 성장 조건을 이용하여 2L와 15L 발효 단계로 정률 증가된다 (2L New Brunswick Scientific, Edison NJ 및 15L Applikon Biotechnology Foster City CA).
c. 세포 추출물 물질대사 조건
유가식 배양액 (fed-batch culture)은 29℃에서, 효모 질소-염기 (YNB) 성장 배지에서 성장되고 글리세롤 (2.7% H3PO4, 0.09%CaSO4, 1.8%K2SO4, 1.5% MgSO4, 0.41% KOH, 4% 글리세롤)로 보충된다. pH는 2M NH4OH로 적정에 의해 5.0 ± 0.5에서 일정하게 유지된다. 용존 산소 수준은 멸균가능 DO 프로브에 의해 측정되고, 그리고 산소 포화도는 교반 속도를 100과 600 rpm 사이에서 조절함으로써 30%로 유지되었다. 세포 추출물은 효모의 능동적 성장기 동안 액체 배지를 발효기 내로 접종함으로써 영양 보충물로서 발효 과정에 도입된다. 유가식 과정은 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 대수 성장기 동안 개시된다. 성장은 발효 동안 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 광학 밀도를 모니터링함으로써 측정된다. 발효는 대수기에서 정지기로 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)의 성장기에서 변화에 의한 측정에서, 세포 추출물이 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에 의해 물질대사되는 시점까지 수행된다. 세포 추출물은 물질대사된 세포 추출물을 적절한 운반제와 합동하기에 앞서, 농축되고, 여과되고 및/또는 정제될 수 있다.
d. 3차원-조건화 배지의 증식 활성
실시예 2-4의 조건화 배지와 물질대사된 조건화 성장 배지 및 물질대사된 세포 추출물은 인간 섬유아세포와 케라틴생성세포의 증식을 증진하는 능력에 대해 선택적으로 조사될 수 있다. 인간 섬유아세포 또는 인간 기저 케라틴생성세포는 96 웰 평판 (~5,000 세포/웰) 내로 파종되고, 그리고 1X 최종 농도의 무혈청-배지, 배지, 또는 실시예 2-4에서 앞서 기술된 바와 같은 3차원 조건화 배지, 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물로 보충된 높은 글루코오스 DMEM (2 mM L-글루타민 및 1X 항생제/항진균제로 보충된 10% BCS)에서 배양된다. 배양액은 37℃에서 가습된 5% CO2 공기 하에 3일 동안 유지된다.
세포 증식은 세포 증식의 추정으로서 총 핵산 함량을 측정하는 상업적으로 구입가능한, 형광-기초된 염료 검정 (CyQuant 세포 증식 검정 키트, Molecular Probes, Eugene, Or)을 이용하여 측정된다. 모든 검정은 제조업체의 사용설명서에 따라 수행된다. 배지는 블롯팅 (blotting)에 의해 제거되고, 그리고 세포는 녹색 형광 염료, CyQuant GR 염료를 내포하는 용해 완충액을 이용하여 용해된다. 상기 염료는 세포 핵산에 결합될 때 강한 형광 향상을 나타내고, 그리고 형광의 양은 시료 내에 존재하는 핵산의 양에 비례한다. 시료는 빛의 부재에서 5분 동안 배양되고, 그리고 시료 형광은 ~480 nm 여기와 ~520 nm 방출 극대에 적합한 필터를 갖는 마이크로역가 평판 판독기를 이용하여 결정된다. 각 시료 내에 핵산의 양은 공지된 농도의 송아지 흉선 DNA를 표준으로서 이용하여 도출된 표준 곡선에 대하여 각 웰에서 관찰된 형광의 양을 비교함으로써 계산된다.
예시적인 결과는 도 3에 도시되고, 여기서 조건화 배지를 내포하는 배지에서 배양된 세포는 2가지 대조와 비교할 때, 섬유아세포와 케라틴생성세포 세포 둘 모두의 증가된 세포 증식을 유발하였다.
실시예 5: 물질대사된 조건화 성장 배지에 의한, 조직 내로 콜라겐 침적의 조절
a. 상처 치유 적용
3차원 조직의 제조물과 조성물에 대한 물질대사된 조건화 성장 배지의 효과는 무혈청 배지, 배지 또는 3차원 조건화 배지의 존재에서 배양된 조직의 세포외 기질 내로 분비된 콜라겐의 양을 측정함으로써 조사된다.
나일론 스카폴드는 11 mm x 11 mm 스퀘어로 레이저-절단되고, 0.5M 아세트산에서 세척되고, FBS에서 광범위하게 헹굼되고, 그리고 계대 8 (~38,000/cm2)에서 12F 임상적 섬유아세포로 파종된다. 배양액은 각 공급 시점에서 50mg/ml 아스코르베이트의 첨가와 함께, 1X 최종 농도의 무혈청-배지, 배지, 또는 앞서 기술된 바와 같이 물질대사된 조건화 성장 배지로 보충된 1 ml의 DMEM (2mM L-글루타민 및 1x 항생제/항진균제로 보충된 10% BCS)에서 성장된다. 황산구리가 2.5 ng/ml의 최종 농도로 첨가되고, 그리고 높은 산소 (40%, 대기의 약 2배)가 표준 배양기의 조절된 가스발생에 의해 유지된다. 배양액 (n=3 또는 그 이상)은 37℃에서 가습된 5% CO2 공기 하에 10일 동안 유지된다. 아스코르베이트 업음 대조 역시 포함된다.
b. 콜라겐 단리
콜라겐은 1X 최종 농도의 무혈청 배지, 배지 또는 앞서 기술된 물질대사된 조건화 성장 배지로 보충된 기본 배지의 존재에서 성장된 3차원 조직 배양액으로부터 거의 균질하게 단리되고 정제된다. 최종 시료 제조물의 순도는 정제된 콜라겐 시료를 구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 종속시키고, Coomassie blue를 이용하여 별개의 단백질 띠를 가시화시키고, 그리고 총 단백질 (하기)과 비교하여 콜라겐-특이적 알파-, 베타-와 감마-띠의 양을 산정함으로써 추정된다. 정제 방법은 모든 시료에서 유사한 패턴을 산출해야 한다.
시료는 PBS에서, 이후 무균 물에서, 그 이후에 0.5M 아세트산에서 2-6시간 헹굼된다. 이들 시료는 이후, 4℃에서 0.012N HCl에서 1 mg/ml 펩신 (Worthington, Inc.)에서 하룻밤 동안 절단된다. 시료는 4℃에서 13000 rpm으로 원심분리에 의해 정화된다. 콜라겐은 0.7M의 최종 농도로 5 M NaCl의 첨가후 4℃에서 30-60분 동안 침전된다. 침전된 콜라겐은 4℃에서 30 내지 60분 동안 13000 rpm으로 원심분리에 의해 분리되고, 그리고 0.012N HCl에서 재현탁된다.
c. 분석
총 단백질은 상업적으로 구입가능한 비색 검정 키트 (Pierce, Inc. BCA 검정 키트)를 이용하여 결정되고, 그리고 검정은 제조업체의 사용설명서에 따라 수행된다. 소 피부 콜라겐은 총 단백질을 정량하기 위한 표준 (InVitrogen, Carlsbad, CA; Cohesion Technologies, Inc., Palo Alto, CA)으로서 이용된다.
시료 (10 mg)는 이후, 3-8% 구배 겔에서 전기영동과 함께 SDS-PAGE 분석에 종속된다. 단리된 콜라겐의 시료는 이후, 환원 시료 완충액에서 95℃로 가열된다. 겔은 Coomassie Blue로 염색되고, 탈색되고, 그리고 시각화를 위해 컴퓨터-스캐닝된다.
생체내에서 콜라겐의 향상된 침적은 상처 치유, 연령이 증가함에 따라 나타나는 주름과 등고선의 치료를 비롯한 다수의 적용을 가질 뿐만 아니라, 마비되거나 누워 지내는 환자에서 욕창에 걸리기 쉬운 뼈 돌기 (bony-prominence) 위에 기질 침적을 증진할 수 있다.
실시예 6: 물질대사된 조건화 성장 배지의 생체내 효과를 평가하는 폐쇄성 패치 검사
a. 실험 설계:
건강한 6명의 동의한 성인 여성 (30-60세)이 등록된다. 배제 기준은 단백질에 대한 민감성, 피부 질환, 검사 부위 내에 또는 검사 부위 인근에 손상된 피부, 당뇨병, 신장, 심장 또는 면역학적 질환, 소염성, 면역억제성, 항히스타민 또는 국소 약물 또는 화장품의 이용 및 임신을 포함한다. 검사 물품은 위치 또는 순서 선입견을 최소화하기 위한 회전 계획에 따라 각 개체의 오른쪽 또는 왼쪽 전완에서 검사 부위 (2개 부위, 3.8 cm2)에 지정된다. 부위 1은 운반제 대조에 대해 지정되고, 그리고 부위 2는 치료 (즉, 물질대사된 조건화 성장 배지)에 대해 지정된다. 폐쇄 패치는 0.2 ml의 운반제 또는 치료제를 갖는 Webril 부직 목화 패드의 것이다. 패치는 3M 폐쇄성, 가소성, 저알레르기 유발성 테이프에 의해 덮어지고 유지된다. 폐쇄 패치는 5일 연속, 24-시간 동안 3명의 개체의 전완에 매일 부착된다. 나머지 3명의 개체는 12일 연속, 24-시간 동안 패치가 매일 부착된다. 마지막 패치 부착 다음날, 2-mm 생검이 각 부위로부터 채취된다. 이러한 프로토콜은 연구 기관, California Skin Research Institute (San Diego, Ca.)에 대한 IRB의 승인을 받고, 그리고 CFR, Parts 50과 56의 Title 21을 준수한다.
b. 평가:
육안적 관찰 (gross observation)은 그레이징 (glazing), 벗겨짐, 딱지, 갈라짐, 과색소침착, 그리고 저색소침착에 대해 등급이 매겨진다. 자극은 5 포인트 척도를 이용하여 시각적으로 채점되고, 그리고 홍반, 부종, 구진 및 수포 (> 25% 패치 부위), 그리고 인식가능 반응 (< 25% 패치 부위), 즉, 삼출, 확산, 그리고 경화를 동반하거나 이들이 없는 물집 반응에 수치적으로 등급이 매겨진다. 검증된 병리학자에 의한 H & E 조직학적 평가는 생존 상피 두께, 상피 과형성 (극세포증), 과립 세포 층 두께, 염증성 침윤물, 분열상 (mitotic figure), 콜라겐과 탄성 섬유의 외관, 그리고 맥관구조에 대한 파라미터를 포함한다.
실시예 7: 인간 내피 세포 행태의 조절
혈관신생 및 내피 세포 운동성에 대한 물질대사된 조건화 성장 배지의 효과가 결정된다. 물질대사된 조건화 성장 배지는 농축되거나 (10X) 또는 냉동 건조된다.
a. 내피 세포 세관 형성 검정
인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 이용한 내피 세포 세관 형성 검정이 혈관신생을 평가하는데 이용된다.
b. 상해 검정
내피 세포의 합류 층은 긁혀지고, 그리고 결과의 "상처"의 닫힘의 속도가 측정되고 세포 운동성을 평가하는데 이용된다. "상해" 검정은 mm/시간 (millimeter/hour)에서 닫힘의 속도로서 측정된다.
실시예 8: 효모 추출물의 제조
a. 생물체와 배지
효모 세포 배양액은 ATCC (피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) # 60372)로부터 수득되었다. 스톡 배양액은 효모-펩톤-덱스트로스 (YPD) 한천 평판 상에 유지되었다. 부모 스톡 배양액은 YPD 액체배지에서 성장되고 -20℃에서 유지되었다. 발효는 효모 질소-염기 (YNB) 성장 배지에서 수행되고 2.7% H3PO4, 0.09% CaSO4, 1.8% K2SO4, 1.5% MgSO4, 0.41% KOH, 4% 글리세롤 (Sigma St. Louis, MO)을 내포하는 글리세롤로 보충되었다. 항기포 시그마-에멀젼 B가 전체 과정 동안 이용되었다 (Sigma, St. Louis, MO).
b. 발효기
진탕 플라스크 시행에 의한 처리의 최적화 후, 발효 과정은 2L와 15L 발효 단계로 정률 증가되었다 (2L New Brunswick Scientific, Edison NJ 및 15L Applikon Biotechnology Foster City CA).
c. 스트레스 조건
유가식 배양액 (fed-batch culture)은 29℃에서, 효모 질소-염기 (YNB) 성장 배지에서 성장되고 글리세롤 (2.7% H3PO4, 0.09%CaSO4, 1.8%K2SO4, 1.5% MgSO4, 0.41% KOH, 4% 글리세롤)로 보충되었다. pH는 2M NH4OH로 적정에 의해 5.0 ± 0.5에서 일정하게 유지되었다. 용존 산소 수준은 멸균가능 DO 프로브에 의해 측정되고, 그리고 산소 포화도는 교반 속도를 100과 600 rpm 사이에서 조절함으로써 30%로 유지되었다. 통기율 (aeration rate)은 IVVM에서 설정되었다.
실시예 9: 전 두께 평가
앞서 개시된 물질대사된 세포 추출물은 MatTek 전 두께 피부 조직 모델에서 조사된다. 상기 피부 모델은 1) 배양되면 인간 표피의 다층의 고도로 분화된 모델을 형성하는 정상적인 인간-유래된 상피 케라틴생성세포, 그리고 2) 콜라겐 기질 내로 파종되어 진피를 형성하는 인간 섬유아세포로 구성된다. 도착 직후, 이들 조직은 이용 때까지 4℃에서 보관된다. 이용을 위하여, 이들 조직은 아가로오즈-적재 트레이로부터 이전되고, 4 ml의 검정 배지를 내포하는 6-웰 평판 내로 배치되고, 그리고 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 하룻밤 동안 평형화된다. 하룻밤 평형화 후, 배지는 4 ml의 새로운 배지로 대체되고, 그리고 50 μl의 검사 물질 (즉, 물질대사된 세포 추출물)이 이후, 이들 조직에 국소 적용된다. 이들 조직은 이후, 37+2℃ 및 5+1% CO2에서 24시간 동안 배양되고 시간의 흐름에서 치료의 생리학적 효과가 측정된다.
실시예 10: 리포좀성 캡슐화된 물질대사된 조건화 성장 배지의 제조
물질대사된 조건화 성장 배지의 시료는 콩으로부터 수득된 인지질과 레시틴 층을 포함하는 리포좀 내로 통합된다. 용해물은 Hydraulic Engineering Corporation (Brea, California)으로부터 구입된 고압 균질기를 이용하여 리포좀과 함께 슬러리화된다. 유백색 혼합물은 리포좀성 성분으로 캡슐화된 물질대사된 조건화 성장 배지를 내포한다.
실시예 11: 말토덱스트린 -캡슐화된 물질대사된 세포 추출물의 제조
물질대사된 세포 추출물의 시료는 WO2003/068161에서 방법을 이용하여 말토덱스트린에서 캡슐화되고 분무-건조되어, 말토덱스트린-캡슐화된 물질대사된 세포 추출물의 무수성 분말을 본질적으로 제공한다.
실시예 12: 유중수 에멀젼
본 실시예는 앞서 개시된 바와 같은 물질대사된 조건화 성장 배지를 통합하는 높은 내상 유중수 에멀젼을 예시한다.
성분 Wt %
1,3-디메틸-2-이미다졸리디온 0.2
폴리옥실렌 (2) 올레일 에테르1 (Oleth-2) 5.0
디스테아디모늄 헥토라이트 0.5
MgSO4-7H2O 0.3
보존제 0.01
물질대사된 조건화 성장 배지 10.0
물 총합 100
실시예 13: 유중수 크림
본 실시예는 앞서 개시된 바와 같이 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 통합하는 유중수 크림을 예시한다.
성분 Wt %
무기물 오일 4
1,3-디메틸-2-이미다졸리디온 1
Ceteth-10 4
세틸 알코올 4
트리에탄올아민 0.75
부틸렌 글리콜 3
잔탄 검 0.3
메틸, 프로필과 부틸 파라벤 0.01
물질대사된 조건화 성장 배지 10
물 총합 100
실시예 14: 알코올성 로션
본 실시예는 앞서 개시된 바와 같이 제조된 물질대사된 세포 추출물을 통합하는 알코올성 로션을 예시한다.
성분 Wt %
1,3-디메틸-2-이미다졸리디온 0.3
에틸 알코올 40.0
물질대사된 세포 추출물 10.0
*물 총합 100
실시예 15: 마이크론 이하 에멀젼 농축액
본 실시예는 앞서 개시된 바와 같이 제조된 물질대사된 조건화 성장 배지를 내포하는 마이크론 이하 에멀젼 농축액을 예시한다.
성분 Wt %
트리메틸로프로판 트리카프릴레이트/트리카프레이트 18.0
글리세린 8.0
세테아릴 알코올 2.0
Cetcareth 20 2.0
글리세릴 스테아레이트 2.0
부틸화된 히드록시톨루엔 0.01
물질대사된 조건화 성장 배지 10
물 총합 100
실시예 16: 물질대사된 세포 추출물의 희석액
본 실시예는 앞서 개시된 바와 같이 제조된 물질대사된 세포 추출물을 내포하는 희석액을 예시한다.
성분 Wt %
물 89
물질대사된 세포 추출물 10
보존제 1.0
실시예 17: 정상적인 인간 진피 섬유아세포에 대한 인간 DNA 마이크로 어레이 연구
정상적인 인간 진피 섬유아세포는 아래와 같이 24-시간 노출 동안 처리되었다: (i) 대조 1: Nouricel (10X), 즉, 조건화 성장 배지 (예로써, 실시예 2를 참조한다); (ii) 대조 2: 피치아 (Pichia) 발효 여과액 (20X), 즉, 효모 발효 추출물 (실시예 8을 참조한다); (iii) 부분적으로 발효된 Nouricel (20X), 즉, 부분적으로 물질대사된 조건화 성장 배지 (실시예 3을 참조한다); 그리고 (iv) 완전하게 발효된 Nouricel (20X), 즉, 완전하게 물질대사된 조건화 성장 배지 (실시예 3을 참조한다).
획득된 결과는 하기 표에 제공되고 처리된 시료와 처리되지 않은 시료 간에 중앙값의 비율로서 표시된다. 중앙값의 비율 > 1.3은 유전자의 강한 상향-조절을 지시하고, 그리고 <는 유전자의 강한 하향-조절을 지시한다.
Figure pat00001

이차 검정으로부터 결과는 하기 표에 제공되고 처리된 시료와 처리되지 않은 시료 간에 중앙값의 비율로서 표시된다. 중앙값의 비율 > 1.3은 유전자의 강한 상향-조절을 지시하고, 그리고 <는 유전자의 강한 하향-조절을 지시한다.
Figure pat00002

한 구체예에서, 개체에 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물의 투여는 적어도 하나의 세포외 기질 단백질의 상향-조절을 유발한다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 10% 내지 약 50% 또는 약 60% 내지 약 100% 상향-조절된다. 또 다른 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 상향-조절되는 세포외 기질 단백질은 콜라겐 또는 리실 수산화효소 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포외 기질 단백질은 COL4A1 또는 PLOD1에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 개체에 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물의 투여는 적어도 하나의 복구 단백질의 상향-조절을 유발한다. 일부 구체예에서, 복구 단백질은 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 복구 단백질은 약 10% 내지 약 70% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 복구-단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 복구 단백질은 피브로넥틴이다. 일부 구체예에서, 복구 단백질은 FN1에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 개체에 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물의 투여는 적어도 하나의 세포 연결 단백질의 상향-조절을 유발한다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5% 내지 약 200% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 10% 내지 약 80% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 30% 내지 약 50% 상향-조절된다. 한 구체예에서, 세포 연결 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190% 또는 약 200% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 세포 연결 단백질은 인볼루크린 단백질이다. 일부 구체예에서, 세포 연결 단백질은 IVL 유전자에 의해 인코딩된다.
한 구체예에서, 개체에 물질대사된 조건화 성장 배지 또는 물질대사된 세포 추출물의 투여는 적어도 하나의 항산화 단백질의 상향-조절을 유발한다. 일부 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5% 내지 약 300%, 약 5% 내지 약 200%, 약 5% 내지 약 150%, 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 25% 내지 약 50% 상향-조절된다. 다른 구체예에서, 항산화 단백질은 약 10% 내지 약 50% 또는 약 200% 내지 약 250% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 항산화 단백질은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125%, 약 150%, 약 175%, 약 200%, 약 250% 또는 약 300% 상향-조절된다. 일부 구체예에서, 상향-조절되는 항산화 단백질은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제이다. 일부 구체예에서, 상향-조절되는 항산화 단백질은 SOD2에 의해 인코딩된다.
실시예 18: 시험관내 연구 및 임상 연구
환자와 방법
방법: 시험관내 연구
유전자 어레이 분석
인간 진피 섬유아세포는 96-웰 평판 (세포독성 검정) 또는 T-25 플라스크 (사이토킨 어레이) 내로 파종되고, 그리고 섬유아세포 성장 배지 (FGM)를 이용하여 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 성장되었다. 각 검사 물질에 대한 안전한 작업 농도는 MTT 검정을 이용하여 측정되었다. 합류에 도달한 직후, 이들 세포는 24시간 동안 검사 물질로 처리되었다. 24시간 처리 후, 제조업체의 사용설명서에 따라 RNAqueous® 키트 (Ambion)를 이용하여 전체 RNA가 단리되었다. 정제 후, 전체 RNA는 제조업체의 사용설명서에 따라, 먼저, MessageAmpTM aRNA 키트 (Ambion)를 이용하여 RNA를 증폭하고, 이후 ASAP 표지화 키트 (Perkin Elmer)를 이용하여 Cy3 또는 Cy5로 aRNA를 형광 표지화함으로써 어레이 이용을 위해 준비되었다. 형광 표지화된 aRNA는 DNA 마이크로어레이 칩 (Agilent Technologies)에 적용되고, 그리고 이들 칩은 제조업체의 권장된 프로토콜에 따라 하룻밤 동안 혼성화되고 세척되었다. 세척 후, 마이크로어레이는 Axon GenePix 4100A 스캐너로 스캐닝되고 GenePix Pro 소프트웨어로 분석되었다. 이들 마이크로어레이에 대한 형광 강도는 전체적 정규화 (global normalization)에 종속되었다. 양쪽 염료에 대한 전체 형광 신호는 양쪽 염료에 대한 전체 강도의 비율을 1로 동등하게 만드는 보정 인자로 정규화되었다. 본 연구를 위하여, 1.3 이상 또는 0.7 이하의 Cy3/Cy5 (처리되지 않은/처리된) 형광 강도 비율 (이것은 유전자 발현에서 적어도 30%의 변화와 관계한다)은 각각, 상향-조절된 유전자와 하향-조절된 유전자에 대한 컷오프로서 이용되었다. 이에 더하여, 유전자 마커의 형광 강도는 배경 강도보다 높아야 했다
단백질 어레이 분석
인간 진피 섬유아세포는 96-웰 평판 (세포독성 검정) 또는 T-25 플라스크 (사이토킨 어레이) 내로 파종되고, 그리고 섬유아세포 성장 배지 (FGM)를 이용하여 37±2℃ 및 5±1% CO2에서 성장되었다. 각 검사 물질에 대한 안전한 작업 농도는 MTT 검정을 이용하여 측정되었다. 합류에 도달한 직후, 이들 세포는 24시간 동안 검사 물질로 처리되고, 그 이후 배양 배지 내로 사이토킨 방출이 사이토킨 어레이 (Ray Biotechnology)를 이용하여 평가되었다. 마이크로어레이는 Axon GenePix 4100A 스캐너로 스캐닝되고 GenePix Pro 소프트웨어로 분석되었다.
방법: 12-주, 임상적-용법 연구 (합동 산물)
12-주 오픈-라벨 임상 연구는 경등도 내지 중증도 얼굴 광손상을 갖는 개체에서 합동 치료 혈청의 효능과 내성을 조사하였다. 연구 참가의 기준은 눈주위 구역에서 임상적으로-결정된 경등도 내지 중증도의 미세하고 거친 주름살을 갖는 30 내지 60세의 여성 개체 (I-IV의 피츠페트릭 피부 표현형을 가짐)를 포함하였다. 개체는 그들이 연구 시작의 3개월 이내에 국소 레티노이드를 이용한 적이 있거나, 진피 필러 또는 보툴리눔 독소의 주사를 받은 적이 있거나, 또는 연구 시작의 6개월 이내에 얼굴 박피 또는 얼굴 재생 시술을 받은 적이 있거나, 또는 연구 시작의 30일 이내에 얼굴에 다른 형태의 항-노화 산물을 이용한 적이 있으면, 연구로부터 배제되었다. 얼굴 제품 섭생에 대한 공지된 알레르기를 갖는 개체 역시 배제되었다.
개체는 12주 동안 하루 2회 (아침과 저녁), 그들의 전체 얼굴 피부에 치료 혈청을 바르도록 지시되었다. 치료 혈청 이외에, 개체는 클렌저, 가벼운 보습제 및 자외선차단제를 비롯한 기초 피부관리 섭생의 이용에 동의하였다. 개체는 또한, 연구의 지속 기간 동안, 제공된 물질 이외에 임의의 새로운 얼굴 제품을 이용하지 않는데 동의하였다.
본 오픈-라벨, 단일-기관 연구에 대한 IRB 승인은 IntegReview of Austin, Texas로부터 획득되었다. 본 연구는 International Conference on Harmonization로부터 윤리적 규정적 원리 및 임상시험 실시기준 (good clinical practices)에 따라 진행되었다.
임상 평가는 기준선 (방문 1), 4주 (방문 2), 8주 (방문 3) 및 12주 (방문 4) 시점에 수행되었다. 하기 시술이 각 방문 시점에서 수행되었다.
효능 평가: 미세하고 거친 주름살은 각 개체의 오른쪽과 왼쪽 눈주위 구역에서, 10 포인트 척도를 이용하여 임상적으로 등급이 매겨졌다 (여기서 0=없음, 0.5-3.5=경등도, 4-6.5=중등도 및 7-9=중증도). 10 포인트 척도는 또한, 피부 촉각적 거? (여기서 0=매끈함, 9=거?), 피부 색상 (0= 얼룩짐/불균일, 9= 투명/균일), 피부 탄성 (여기서 0= 피부가 느슨하고 처져 보인다, 9= 피부가 탄탄해 보인다) 및 피부 광휘 (0= 흐림/무광, 9= 밝음/발광/환함)를 평가하는데 이용되었다. 모든 등급 매기기 평가는 등급 매기기 일관성을 담보하기 위해 각 방문 시점에서 동일한 조사자에 의해 수행되었다.
안정성 평가: 치료 산물의 내성은 부작용의 보고에 의해, 그리고 객관적 및 주관적 평가에 의해 모든 방문 시점에서 평가되었다. 객관적 자극 (홍반, 부종 및 스케일링)은 조사자에 의해 평가되는 반면, 주관적 자극 (작열/따끔거림, 가려움 및 저림)은 개체에 의해 평가되었는데, 이들 모두 4-포인트 척도 (여기서 0=없음, 1=경등도, 2=중등도 및 3=중증도)를 이용하였다.
표준화된 사진술: 표준화된 디지털 이미지는 측광 (raking light) (표준 색상)을 이용하여 개체의 얼굴 왼쪽, 오른쪽 및 정면에서 촬영되었다.
자기-평가 조사표: 개체는 12주 시점에서 자기-평가 조사표를 작성하였는데, 여기서 그들은 4 포인트 척도 (강하게 동의, 동의, 동의하지 않음, 강하게 동의하지 않음)에서 그들의 얼굴 피부 상태 및 치료 혈청의 효능을 평가하였다. 개체는 4 포인트 척도 (여기서 1=매우 우수함, 2=우수함, 3=무난함 및 4=불량함)에서 치료 혈청에 대한 그들의 전반적인 만족도를 평가하였다.
통계학적 분석: 4주, 8주와 12주 시점에서 평균 임상적 등급매기기 스코어는 스튜던트 짝비교 t 검증 (student's paired t-test)을 이용하여 평균 기준선 스코어와 비교되었다. 기준선으로부터 변화는 p<0.05 수준에서 유의미한 것으로 간주되었다. 개체 자기-평가 조사표의 경우에, 치료 혈청의 효능과 심미적 속성 섹션에 대한 긍정적 응답자의 발생률 퍼센트 (percent incidence)가 보고되었다.
결과
결과: 시험관내 연구
Biometa Complex (효모 물질대사된 조건화 성장 배지)로 인간 진피 섬유아세포의 처리 후, 유전자 발현 프로필은 항-노화 캐스케이드에 관여하는 유전자에 특히 중점을 두고 분석되었다. 하기 표에서는 Biometa complex에 의해 조절되는 핵심 유전자 중에서 일부를 열거한다: Biometa complex는 세포외 기질 재생에 관여하는 다수의 유전자를 자극한다.
Figure pat00003

부가적으로, MMP (콜라겐과 엘라스틴의 파괴를 책임지는 효소)의 하향-조절이 관찰되었다. MMP의 이러한 하향-조절은 TIMPS (MMP의 자연 억제제)의 상향조절과 충분히 상관하였다. Biometa complex는 또한, 스트레스 단백질 (HSP), 항산화 단백질 (SOD1), 그리고 피부 장벽을 유지하는데 중요한 단백질 (TJ1)을 비롯하여, 피부의 전반적인 건강을 유지하는데 필요한 다른 유전자를 상향 조절하였다.
Biometa Complex는 또한, 처리 후 배지 내로 방출된 단백질의 분석에 기초하여, bFGF (섬유아세포 성장 인자), TIMP-1 (메탈로프로테이나아제의 조직 억제제), 그리고 VEGF (혈관 내피 성장 인자)를 비롯하여, 피부 복구와 재형성에 관여하는 것으로 알려진 핵심 단백질 (사이토킨, 성장 인자 등)을 발현하고 합성하도록 섬유아세포를 자극하였다. 이러한 데이터는 유전자 발현과 단백질 합성 사이의 우수한 상관관계를 보여준다. 이들 결과는 Biometa complex가 섬유아세포를 자극하여 노화의 징후를 감소시키는 능력을 갖는다는 것을 증명한다.
결과: 12주 임상적-용법 연구
경등도 내지 중증도의 미세하고 거친 눈주위 주름살을 갖는 33명의 35-56세 여성 개체가 등록되었고 12주 연구를 완결하였다.
4주, 8주와 12주 시점에서, 모든 광노화 파라미터에 대한 평균 스코어에서 통계학적으로 유의미한 개선이 합동 치료 혈청의 하루 2회 국소 이용 이후에 달성되었다. 조사자 평가는 도 4에 도시된 바와 같이, 4주 시점에서 미세하고 거친 눈주위 주름살에 대한 평균 스코어에서 유의미한 감소, 그리고 12주까지 지속된 유의미한 감소를 증명하였다 (모두 P<0.0001). 그 중에서도 특히, 거친 눈주위 주름에 대한 평균 스코어가 12주 시점에서 30% 감소하였다. 이에 더하여, 피부 탄성, 피부 색상, 광휘 및 촉각적 거?에 대한 평균 스코어가 도 5와 도 6에서 도시된 바와 같이, 기준선으로부터 및 모든 차후 후속 방문에서 유의미하고 점진적인 개선을 유사하게 반영하였다 (모두 P≤0.02). 평균 촉각적 거? 스코어에서 유의미한 감소 (79.5%)에 의해 증명되는, 빠르면 4주 시점에서 달성되는 피부의 감촉에서 개선이 특히 현저하였다 (P<0.0001).
12주 시점에서 자기-평가 조사표에서 개체 반응은 조사자 평가에서 관찰된 개선을 강하게 뒷받침하는데, 개체의 85% 이상이 모든 질문에 긍정적으로 응답하였다. 12주 시점에서 조사표에 대한 응답에서 강하게 동의 또는 동의를 선택한 개체의 백분율은 도 7에 제공된다.
표준화된 디지털 사진 (데이터 제시되지 않음)은 합동 치료 혈청의 하루 2회 이용 이후에 임상적 반응의 실례를 나타낸다. 간단히 말하면, 눈주위 미세하고 거친 주름살 및 피부 색상에서 개선은 단지 4주간의 산물 이용 후, 49세 백인 여성 개체에서 증명되었다. 이에 더하여, 46세 라틴계 여성 개체는 4주 시점에서 미세한 눈주위 주름살, 피부 색상, 촉각적 거? 및 광휘의 가시적인 개선을 보였다. 46세 한국계/백인 여성 개체는 미세하고 거친 눈주위 주름살 및 불균일한 피부 색상이 4주간의 산물 이용 후, 눈에 띄게 개선되었다.
합동 치료 혈청은 충분히 내약성이고, 그리고 연구 과정 동안 치료-관련된 부작용이 보고되지 않았다. 부종, 스케일링, 작열/따끔거림, 가려움 및 저림에 대한 평균 스코어는 전체 연구 기간 내내 경등도 이하에 머물렀다 (0-4 척도에서 모든 스코어 <0.09). 그 중에서도 특히, 홍반에 대한 평균 스코어가 모든 후속 방문에서 기준선으로부터 감소하였는데, 8주 시점에서 통계학적으로 유의미한 감소가 관찰되었다 (P<0.03).
결론
본 발명의 치료 혈청은 의사와 환자에게, 피부 노화의 징후를 개선하는 독특하고 효과적인 국소 합동 산물을 제공한다.
본 발명은 본원에서 기술되는 특정한 구체예에 의해 범위가 한정되지 않는다. 실제로, 본원에서 기술된 것들 이외에 다양한 변형은 상기 상세한 설명 및 첨부한 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이런 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물이 본원에서 인용되고, 이들의 개시는 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

Claims (2)

  1. (a) 세포 추출물을 제공하는 단계;
    (b) 효모 세포를 배양하는 단계;
    (c) 효모 세포를 세포 추출물에 노출시키는 단계;
    (d) 효모 세포를 배양하여 세포 추출물의 적어도 일부분을 물질대사하는 단계; 그리고
    (e) 물질대사된 세포 추출물을 수집하는 단계를 포함하는, 물질대사된 세포 추출물을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (e)의 수집된 물질대사된 세포 추출물은 농축되고, 여과되고 및/또는 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
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