CN103635198A - 经代谢的经调节的生长培养基和使用方法 - Google Patents

经代谢的经调节的生长培养基和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了包含经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的组合物和使用方法。经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物组合物可以与可接受的载体一起配制在可注射制剂或局部制剂中，例如，作为霜剂、洗剂或凝胶，且可以用于药妆或药物应用。经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物还可以被进一步处理以浓缩或减少包含在经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物内的一种或多种要素或组分。生长培养基可以通过任何真核细胞来调节。经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物可以用于防止或治疗病状，例如皮肤病状。

Description

经代谢的经调节的生长培养基和使用方法
交叉引用
本申请要求2010年11月12日提交的美国临时申请第61/413,166号的权益，通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本公开内容涉及包含经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的组合物，和用于通过向受试者施用组合物防止或治疗病状例如皮肤病状的方法。
发明背景
培养基组合物通常包含必需氨基酸、盐、维生素、矿物质、微量金属、糖、脂质和核苷。细胞培养基努力供应满足使细胞在控制的、人造的和体外的环境中生长所需要的营养需求必需的组分。营养素制剂、pH和同渗容摩根据参数例如细胞类型、细胞密度和采用的培养系统而改变。许多细胞培养基制剂在文献中被证明，且许多培养基是商购的。一旦培养基用细胞温育，其就被本领域技术人员称为“废的”或“经调节的培养基”。经调节的培养基包含培养基的许多原始组分，以及各种细胞代谢物和分泌的蛋白，分泌的蛋白包括，例如生长因子、炎性媒介物和其他胞外蛋白。
发明概述
在一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基是由酵母细胞代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，经调节的生长培养基通过在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基来制备。在其他实施方案中，组合物是局部的或可注射的组合物。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在一个实施方案中，组合物使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在一个实施方案中，组合物减淡细纹和皱纹的外观；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善皮肤纹理、肤色和弹性；减少粗糙度和光损伤；加强皮肤本身再生的能力；防止或减少环境损伤；使皮肤光滑和紧致；使老年斑变亮和减淡；减少细纹和粗纹以及皱纹；改善细的和粗的眼周皱纹的外观；改善鼻唇沟的外观；改善口周皱纹；改善面部细纹和粗纹；改善肤色、发光度和均匀度；改善皮肤紧致度；减少触觉粗糙度；改善皮肤纹理、总的光损伤、总的色素沉着过多；整体改善；减淡黑斑和/或斑纹的外观；改善皮肤亮度外观和年轻外观；改善皮肤的总病状；改善光老化皮肤的外观；改善内在和外在老化的皮肤的外观；改善皮肤细胞更新；改善皮肤屏障；改善皮肤保持水分的能力；减淡褐色和红色斑点、发红的外观；增加皮肤表皮厚度；加强真皮表皮连接；减少孔尺寸和孔的出现；改善光滑度，或其组合。
在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括但不限于，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约50％。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约100％、约125％、约150％或一种或多种症状或病状改善更多。
在其他实施方案中，本公开内容还提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物源自动物细胞、皮肤细胞或成纤维细胞。在其他实施方案中，组合物是局部的或可注射的组合物。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
在一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；(b)培养酵母细胞；(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于制备经代谢的经调节的生长培养基的工艺，该工艺包括：(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；(b)培养酵母细胞；(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物。在另一个实施方案中，公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在一些实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在，且经代谢的经调节的生长培养基通过在足以满足使酵母细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养酵母细胞以形成经调节的生长培养基来制备。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
在一个实施方案中，本公开内容提供用于治疗脱发的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于刺激毛发生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的先天性缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的外观缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的后天缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。所述方法可以使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；改善肤色、纹理和/或紧致度；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观；减淡细纹和皱纹的外观；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善皮肤纹理、肤色和弹性；减少粗糙度和光损伤；加强皮肤本身再生的能力；防止或减少环境损伤；使皮肤光滑和紧致；使老年斑变亮和减淡；减少细纹和粗纹以及皱纹；改善细的和粗的眼周皱纹的外观；改善鼻唇沟的外观；改善口周皱纹；改善面部细纹和粗纹；改善肤色、发光度和均匀度；改善皮肤紧致度；减少触觉粗糙度；改善皮肤纹理、总的光损伤、总的色素沉着过多；整体改善；减淡黑斑和/或斑纹的外观；改善皮肤亮度外观和年轻外观；改善皮肤的总病状；改善光老化皮肤的外观；改善内在和外在老化的皮肤的外观；改善皮肤细胞更新；改善皮肤屏障；改善皮肤保持水分的能力；减淡褐色和红色斑点、发红的外观；增加皮肤表皮厚度；加强真皮表皮连接；减少孔尺寸和孔的出现；改善光滑度，或其组合。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减淡细纹和皱纹的外观的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少老年斑和色素沉着异常的出现的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于改善皮肤纹理、肤色和弹性的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少粗糙度和光损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于加强皮肤本身再生的能力的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或减少环境损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使皮肤平滑和紧致的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使老年斑变亮和减淡的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。
在另一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：(a)提供细胞提取物；(b)培养酵母细胞；(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的细胞提取物。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于制备经代谢的细胞提取物的工艺，该工艺包括：(a)提供细胞提取物；(b)培养酵母细胞；(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的细胞提取物。
在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物。在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在，且经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在一个实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于治疗脱发的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于刺激毛发生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的先天性缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的外观缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在一个实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的后天缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。所述方法可以使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；改善肤色、纹理和/或紧致度；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，减淡细纹和皱纹的外观；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善皮肤纹理、肤色和弹性；减少粗糙度和光损伤；加强皮肤本身再生的能力；防止或减少环境损伤；使皮肤光滑和紧致；使老年斑变亮和减淡；减少细纹和粗纹以及皱纹；改善细的和粗的眼周皱纹的外观；改善鼻唇沟的外观；改善口周皱纹；改善面部细纹和粗纹；改善肤色、发光度和均匀度；改善皮肤紧致度；减少触觉粗糙度；改善皮肤纹理、总的光损伤、总的色素沉着过多；整体改善；减淡黑斑和/或斑纹的外观；改善皮肤亮度外观和年轻外观；改善皮肤的总病状；改善光老化皮肤的外观；改善内在和外在老化的皮肤的外观；改善皮肤细胞更新；改善皮肤屏障；改善皮肤保持水分的能力；减淡褐色和红色斑点、发红的外观；增加皮肤表皮厚度；加强真皮表皮连接；减少孔尺寸和孔的出现；改善光滑度，或其组合。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减淡细纹和皱纹的外观的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少老年斑和色素沉着异常的出现的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于改善皮肤纹理、肤色和弹性的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少粗糙度和光损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于加强皮肤本身再生的能力的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或减少环境损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使皮肤平滑和紧致的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使老年斑变亮和减淡的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。
在一个实施方案中，还提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中经代谢的经调节的生长培养基是由酵母细胞代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，经调节的生长培养基通过在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基来制备。在另一个实施方案中，组合物是可注射组合物或局部组合物。在又一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在另一个实施方案中，经代谢的调节生长培养基被封装在密封剂内。在一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在一些实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹(circum-oral geographical wrinkle)、双颊凹陷或乳房发育不全。在其他实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在一些实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在其他实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在其他实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。
还提供了包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物源自动物细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自皮肤细胞。在另一个实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在一些实施方案中，组合物是可注射组合物或局部组合物。在一些实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，经代谢的调节生长培养基被封装在密封剂内。在一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在一些实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在一些实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在一些实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在其他实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在其他实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
本文还提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，在以上工艺中使用的酵母是毕赤酵母(Pichia genus)。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是皮肤细胞。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是动物细胞。在其他实施方案中，制备经代谢的经调节的生长培养基的工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基包括(a)或(b)的培养步骤中的连续流系统或生物反应器系统。在其他实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。
本文提供了用于制备以上经代谢的经调节的生长培养基的工艺，该工艺包括：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，提供了包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％的量存在。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％至约20％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％、0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一些实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在一些实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。
本文还提供了通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，细胞提取物源自皮肤细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自动物细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一个实施方案中，培养包括连续流系统或生物反应器系统。
在其他实施方案中，用于制备以上经代谢的细胞提取物的工艺包括：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。
本文还提供了包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞是皮肤细胞。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在又一个实施方案中，步骤(a)中的细胞是动物细胞。在一些实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，步骤(a)或(b)的培养包括连续流系统或生物反应器系统。在其他实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％的量存在。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％、0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在其他实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。
本文还提供了包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，细胞提取物源自皮肤细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自动物细胞。在一个实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在另一个实施方案中，培养包括连续流系统或生物反应器系统。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％的量存在。在又一个实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在。在其他实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％至约20％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％、0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在一个实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在又一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在另一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。
本文还提供了用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，皮肤病状是外观缺陷。在另一个实施方案中，病状是脱发。在另一个实施方案中，病状是先天性缺陷或后天缺陷。在一个实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在另一个实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在又一个实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。在一个实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在某些实施方案中，病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括但不限于3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约50％。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约100％、约125％、约150％或一种或多种症状或病状改善更多。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案中，步骤(a)中的细胞是皮肤细胞。在另一个实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞是动物细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一个实施方案中，步骤(a)或(b)的培养包括连续流系统或生物反应器系统。在另一个实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％的量存在组合物中。在另一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在组合物中。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在组合物中。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％至约20％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％、0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在一些实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一个实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在另一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在一些实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，至少一种胞外基质蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％至约100％。在一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约10％至约50％。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约60％至约100％。在又一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被COL4A1基因或PLOD1基因编码。在其他实施方案中，至少一种修复蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，修复蛋白被上调约10％至约70％。在另一个实施方案中，修复蛋白被上调约25％至约50％。在一些实施方案中，修复蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一个实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在又一个实施方案中，修复蛋白被FN1基因编码。在一些实施方案中，至少一种细胞连接蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％至约200％。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约10％至约80％。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被上调约30％至约50％。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％或约200％。在其他实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。在一个实施方案中，至少一种抗氧化蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在又一个实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％至约300％。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约10％至约50％。在其他实施方案中，抗氧化蛋白被上调约200％至约250％。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％或约300％。在一个实施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白被SOD2基因编码。
本文还提供了用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。
在一个实施方案中，病状是外观缺陷。在另一个实施方案中，病状是脱发。在另一个实施方案中，病状是先天性缺陷或后天缺陷。在一个实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在另一个实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在又一个实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。在一个实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在某些实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天医疗缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括但不限于，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约50％。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约100％、约125％、约150％或一种或多种症状或病状改善更多。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案中，步骤(a)中的细胞源自皮肤细胞。在另一个实施方案中，步骤(a)中的细胞源自成纤维细胞。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞源自动物细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一个实施方案中，步骤(a)或(b)的培养包括连续流系统或生物反应器系统。在另一个实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。在其他实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.0001％至约95％的量存在组合物中。在另一个实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在组合物中。在一个实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在组合物中。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％至约20％的量存在。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％、0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在一些实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一个实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在另一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，经代谢的细胞提取物被封装在密封剂内。在一些实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，至少一种胞外基质蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％至约100％。在一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约10％至约50％。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约60％至约100％。在又一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被COL4A1基因或PLOD1基因编码。在其他实施方案中，至少一种修复蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，修复蛋白被上调约10％至约70％。在另一个实施方案中，修复蛋白被上调约25％至约50％。在一些实施方案中，修复蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一个实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在又一个实施方案中，修复蛋白被FN1基因编码。在一些实施方案中，至少一种细胞连接蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％至约200％。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约10％至约80％。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被上调约30％至约50％。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％或约200％。在其他实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。在一个实施方案中，至少一种抗氧化蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在又一个实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％至约300％。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约10％至约50％。在其他实施方案中，抗氧化蛋白被上调约200％至约250％。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％或约300％。在一个实施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白被SOD2基因编码。
附图简述
图1是表示由三维组织产品TranscyteTM和随时间沉积的氨基葡聚糖和胶原的沉积的动力学的图表。氨基葡聚糖的沉积体积取决于生长时间，而胶原的沉积不取决于生长时间。
图2是表示胞外基质(从TranscyteTM除去)和以1∶2、1∶5、1∶10和1∶100的稀释度加入到人成纤维细胞和角质形成细胞的单层培养物的效果的图表。所阐明的最显著的效果是以基质的1∶10稀释度。
图3是表示暴露于经调节的培养基(先前已经支持细胞在TranscyteTM中生长的细胞培养基)的人成纤维细胞和角质形成细胞的相对增殖的图表。在少至三天显示细胞响应的增加。
图4是表明细皱纹和粗皱纹的研究员评估的图表。在所有访问中观察到细皱纹和粗皱纹的平均分数的显著下降(全部P＜0.0001)。在每一个数据组，在左边示出细皱纹评估，且在右边示出粗皱纹评估。
图5是表明肤色、紧致度和发光度的研究员评估的图表。在所有访问中皮肤紧致度、肤色和发光度的平均分数显著改善(全部P≤0.02)。在每一个数据组，在左边示出第4星期结果，在中间示出第8星期结果，且在右边示出第12星期结果。
图6是表明触觉粗糙度的研究员评估的图表。在所有访问中皮肤紧致度、肤色和发光度的平均分数显著改善(全部P＜0.0001)。分别在左手列示出第4星期的从基线的百分数变化，在中间列示出第8星期的从基线的百分数变化和在右手列示出第12星期的从基线的百分数变化。
图7是提供来自实施例18中所描述的12星期临床使用(组合的/组合产品)研究的受试者自我评估问卷的第12星期的结果的图表。
发明详述
本公开内容涉及包含使用任何真核细胞类型或三维组织构建体培养的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的新的组合物、以及使用组合物的方法。以单层或以三维培养细胞。细胞优选地是人且包括基质细胞、实质细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞。由细胞和组织培养物调节的培养基将包含各种天然分泌的蛋白，例如生物学活性生长因子。还公开了包含源自经调节的细胞培养基的产品的新的组合物和这些组合物的用途。
“预调节的”细胞培养基可以是充分地解决正被培养的细胞的营养需求的任何细胞培养基。细胞培养基的实例包括(但不限于)达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、Ham′s F12、RPMI1640、Iscove′s、McCoy′s和本领域技术人员容易明白的其他培养基制剂，包括见于以下中的那些：Methods For Preparation of Media，Supplements andSubstrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss，New York(1984)和Cell & Tissue Culture：Laboratory Procedures，John Wiley &Sons Ltd.，Chichester，England1996，它们两者通过引用以其整体并入本文。培养基可以被补充有支持所需的细胞或组织培养物所需的任何组分。另外，如果需要的话，可以加入血清例如牛血清，其是白蛋白、球蛋白、生长促进剂和生长抑制剂的复合溶液。血清应是不含病原体的且针对支原体细菌、真菌和病毒污染而被仔细地筛过。此外，血清应通常从美国获得而不是从本地牲畜携带可递送的剂的国家获得。激素加入到培养基中可能是期望的或可能不是期望的。培养基还可以是不含血清的，即，细胞在没有血清补充物的情况下生长。
“经调节的生长培养基”可以是如本文所公开调节的任何生长培养基，且可以被制备，例如如在美国专利第6,372,494号；第7,118,746号；第7,160,726号中所公开的，它们全部通过引用以其整体并入本文。
其他成分例如维生素、生长和附着因子、蛋白等，可以由本领域技术人员根据他的或她的特定需要来选择。在一些实施方案中，可以使用适合于实现所需的经调节的培养基的任何细胞类型。基因工程细胞可以用于培养培养基。这样的细胞可以被修饰，例如，以表达一种或多种所需的蛋白，使得一种或多种被表达的蛋白在培养基中的浓度被优化用于特定的所需应用。根据本公开内容，用于调节培养基的细胞和组织培养物可以被设计为表达目标基因产物，该目标基因产物可以给予各种各样的功能，包括(但不限于)类似于生理反应的表达蛋白的改善的性质、可用于具体应用的特定蛋白的增加的表达，例如创伤愈合或抑制某些蛋白例如蛋白酶、乳酸等。
细胞可以被设计成表达目标基因产物，目标基因产物是生物学活性的，提供所选择的生物学功能，作为选择的生理情况的报告基因，增加基因产物的缺乏的或有缺陷的表达，或提供抗病毒、抗菌、抗微生物或抗癌活性。根据本公开内容，目标基因产物可以是肽或蛋白，例如酶、激素、细胞因子、抗原、或抗体、调节蛋白例如转录因子或DNA结合蛋白、结构蛋白例如细胞表面蛋白，或目标基因产物可以是核酸例如核糖体或反义分子。目标基因产物包括(但不限于)增强细胞生长的基因产物。例如，遗传修饰可以上调内源性蛋白，通过表达异种离子通道或改变内源性离子通道功能而引入新的蛋白或调节离子浓度。实例包括(但不限于)基因组织，其表达被全身递送的基因产物(例如，分泌的基因产物例如蛋白，包括生长因子、激素类、因子VIII、因子IX、神经递质和脑啡肽)。
在一些实施方案中，使细胞根据技术人员已知的任何方法以二维单层生长。参见，例如，细胞培养技术，诸如在以下中描述的那些：Sambrook J等人(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版)；Goeddel编辑(1990)Methods in Enzymology185，Current ProtocolsIn Molecular Biology；F.M.Ausubel等人编辑，Current Protocols，a jointventure between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley &Sons，Inc.(1994，增订直到1999)；Animal Cell Culture：A PracticalApproach(Freshney编辑1986)。
在一些实施方案中，细胞在三维基质支撑物上生长并以多层生长，形成细胞基质。该基质系统比先前所描述的单层组织培养系统在更大的程度上接近体内存在的生理状态。三维培养物例如
Figure BDA00003462061900291
(Advanced Tissue Sciences，Inc.，La Jolla，CA)
Figure BDA00003462061900292
和TransCyteTM(Smith & Nephew，PLC，UnitedKingdom)“TranscyteTM”，产生许多生长因子和以生理比率和浓度分泌到培养基中的其他蛋白。
Figure BDA00003462061900293
主要由在可生物降解的羟乙酸乳酸聚酯(polyglactin)上培养的异源新生成纤维细胞组成。TransCyteTM是包括结合至过渡覆盖物的三维基质组织的临时活的皮肤替换物，如美国专利5,460,939中所描述的。另外，调节细胞培养基的三维组织培养物可以包含许多组织类型中见到的间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、和/或胚胎干细胞和/或实质细胞和/或实质干细胞，组织类型包括(但不限于)骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾、肾上腺和神经组织，以及胃肠道和泌尿生殖道组织、和循环系统。参见美国专利第4,721,096号；第4,963,489号；第5,032,508号；第5,266,480号；第5,160,490号；和第5,559,022号，它们中的每一个通过引用以其整体并入本文。
I.定义
本文使用的以下术语将具有所指示的意思：
细胞：包括来自任何有机体的细胞，有机体包括动物、植物、真菌、原生生物或无核原虫类。在一个实施方案中，细胞源是动物或植物。在另一个实施方案中，动物是哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物是人。
细胞提取物：包括可以或不可以包括细胞微粒物质的溶解的或碎裂的细胞内容物。
粘附层：直接附接至三维支撑物或通过附着于本身直接附接至支撑物的细胞而间接连接的细胞。
经调节的培养基：包含胞外蛋白和细胞代谢物的制剂，其先前已经支持任何所需的真核细胞类型的生长，所述细胞已经以二维或三维被培养。还称为“经调节的细胞培养基”或“经调节的细胞和组织培养基”。
基质细胞：具有或不具有疏松结缔组织中存在的其他细胞和/或成分的成纤维细胞，包括(但不限于)内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、软骨细胞、前软骨细胞(prechondrocyte)等。
组织特有的或实质细胞：形成器官的不同于其支持骨架的必需和区别的组织的细胞。
二维细胞培养物：以单层(例如)在平旦表面等上培养的细胞。
三维骨架：三维支架主要由任何材料和/或形状组成，所述材料和/或形状(a)允许细胞附接至其(或可以被修饰为允许细胞附接至其)；和(b)允许细胞以多于一层生长。该支撑物接种有基质细胞以形成活的三维基质组织。骨架的结构可以包括网、海绵或可以由水凝胶形成。
三维基质组织或活的基质基质：已经接种有在支撑物上生长的基质细胞的三维骨架。由基质细胞加工的胞外基质蛋白沉积到骨架上，因此形成活的基质组织。活的基质组织可以支持稍后接种的组织特有的细胞的生长，以形成三维细胞培养物。
组织特有的三维细胞培养物或组织特有的三维构建体：已经接种有组织特有的细胞并被培养的三维活的基质组织。一般而言，用于接种三维基质的组织特有的细胞应包括该组织的“干”细胞(或“储备”细胞)；即，产生将成熟为形成组织实质的特有细胞的新细胞的那些细胞。
以下缩写将具有所指示的意思：
BCS＝小牛血清
BFU-E＝红系爆式形成单位
TGF-β＝转化生长因子-β
CFU-C＝培养集落形成单位
CFU-GEMM＝粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞集落形成单位
CSF＝集落刺激因子
DMEM＝达尔伯克改良伊格尔培养基
EDTA＝乙二胺四乙酸
FBS＝胎牛血清
FGF＝成纤维细胞生长因子
GAG＝葡胺聚糖
GM-CSF＝粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子
HBSS＝汉克平衡盐溶液
HS＝马血清
IGF＝胰岛素样生长因子
LTBMC＝长期骨髓培养
MEM＝最低必需培养基
PBL＝外周血白细胞
PBS＝磷酸盐缓冲盐水
PDGF＝血小板衍生生长因子
RPMI1640＝洛斯维帕克纪念研究所培养基编号1640(GIBCO，Inc.，Grand Island，N.Y.)
SEM＝扫描电子显微术
VEGF＝血管内皮生长因子
II.经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物
在一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；(b)培养酵母细胞；(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，细胞可以源自植物和/或动物源，包括人。
在另一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：(a)提供细胞提取物；(b)培养酵母细胞；(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物通过以下来获得：在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞和从生长培养基除去所得到的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞可以源自植物和/或动物源，包括人。
使胞外蛋白在经调节的生长培养基或细胞提取物例如生长因子、细胞因子和应激蛋白中代谢，在以下中打开了新的可能性：制备用于包括组织修复的各种各样领域的产品，例如，治疗创伤和其他组织缺陷例如外观缺陷以及人和动物供给补充物。例如，已知生长因子在创伤愈合过程中起到重要的作用。通过本公开内容的代谢工艺将这些生长因子的至少一种活性给予经调节的细胞培养基或细胞提取物。
细胞的细胞因子和生长因子涉及到许多关键的细胞过程，包括细胞增殖、粘附、形态学外观、分化、迁移、炎症反应、血管生成、和细胞死亡。研究已经证明，缺氧应激和对细胞的损伤诱导包括mRNA和蛋白的水平增加的响应，蛋白相应于生长因子例如PDGF(血小板衍生生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)和IGF(胰岛素样生长因子)(Gonzalez-Rubio，M.等人，1996，KidneyInt.50(1)：164-73；Abramovitch，R.等人，1997，Int J Exp.Pathol.78(2)：57-70；Stein，I.等人，1995，Mol Cell Biol.15(10)：5363-8；Yang，W.等人，1997，FEBS Lett.403(2)：139-42；West，N.R.等人，1995，J.Neurosci.Res.40(5)：647-59)。
生长因子，例如转化生长因子-β，还称为TGF-β，由某些应激蛋白在创伤愈合期间诱导。两种已知的应激蛋白是GRP78和HSP90。这些蛋白稳定细胞结构且使细胞对不利状态有抵抗力。二聚蛋白的TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3且调节许多细胞类型的生长和分化。此外，该蛋白家族展示各种生物效应，刺激一些细胞类型的生长(Noda等人，1989，Endocrinology124：2991-2995)和抑制其他细胞类型的生长(Goey等人，1989，J.Immunol.143：877-880；Pietenpol等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：3758-3762)。还示出TGF-β增加包括胶原和纤连蛋白的胞外基质蛋白的表达(Ignotz等人，1986，J.Biol.Chem.261：4337-4345)和加速创伤的愈合(Mustoe等人，1987，Science237：1333-1335)。
另一种这样的生长因子是PDGF。PDGF最初被发现是间叶细胞衍生的细胞的有效促细胞分裂剂(Ross R.等人，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.USA71(4)：1207-1210；Kohler N.等人，1974，Exp.Cell Res.87：297-301)。另外的研究已经表明，PDGF增加组织形成中的细胞构成和肉芽形成的速率。用PDGF治疗的创伤具有早期炎症反应的出现，包括中性白细胞和巨噬细胞类型在创伤部位处的增加。这些创伤还示出增强的成纤维细胞功能(Pierce，G.F.等人，1988，J.Exp.Med.167：974-987)。PDGF和TGF-β两者均已经在动物研究中被示出增加胶原形成、DNA含量和蛋白水平(Grotendorst，G.R.等人，1985，J.Clin.Invest.76：2323-2329；Spom，M.B.等人，1983，Science(Wash DC)219：1329)。已经表明PDGF在治疗人创伤中是有效的。在人创伤中，PDGF-AA表达在经历愈合的压力溃疡内增加。PDGF-AA的增加相应于创伤的活化成纤维细胞、胞外基质沉积和有效血管形成的增加。此外，在慢性非愈合创伤中没有看到PDGF-AA的这样的增加(Principlesof Tissue Engineering，R.Lanza等人(编辑)，第133-141页(R.G.LandesCo.TX1997)。具有诱导血管生成和创伤愈合的能力的许多其他生长因子包括VEGF、KGF和碱性FGF。
A.生长培养基
用于细胞培养的生长培养基制剂在文献中是熟知的，且许多是商购的。
预调节的培养基成分包括(但不限于)下面所描述的那些。另外，成分的浓度是本领域普通技术人员熟知的。参见，例如上文的MethodsFor Preparation Of Media，Supplements and Substrate for Serum-freeAnimal Cell Cultures，supra。成分包括氨基酸(D-氨基酸和/或L-氨基酸两者)，例如谷氨酸盐、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸以及它们的衍生物；酸溶性亚组例如硫胺、抗坏血酸、正铁化合物、亚铁化合物、嘌呤、谷胱甘肽和磷酸二氢钠。
另外的成分包括糖、脱氧核糖、核糖、核苷、水溶性维生素、核黄素、盐、微量金属、脂质、乙酸盐、磷酸盐、HEPES、酚红、丙酮酸盐和缓冲剂。
常常使用在培养基制剂中的其他成分包括脂溶性维生素(包括A、D、E和K)类固醇和它们的衍生物、胆固醇、脂肪酸和脂质、吐温80、2-巯基乙醇嘧啶以及各种补充物，包括血清(胎儿的，马、小牛等)、蛋白(胰岛素、转铁蛋白、生长因子、激素类等)、抗生素(庆大霉素、青霉素、链霉素、两性霉素B等)、全蛋超滤液和附着因子(纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、昆布氨酸、肌腱蛋白(tenascin)等)。
培养基可以需要或可以不需要补充有生长因子和其他蛋白例如附着因子，因为许多细胞构建体尤其是本申请中描述的三维细胞和组织培养物构建体本身将这样的生长因子和附着因子以及其他产物加工到培养基中。
B.细胞培养物
1.细胞
任何细胞可以使用在细胞培养物中。例如，细胞可以是基质细胞、实质细胞、间充质干细胞(血统定向或非定向的祖细胞)、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞。仅举几个例子，细胞可以包括(但不限于)骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾、神经组织、肾上腺、粘膜上皮和平滑肌。包括基质的成纤维细胞和成纤维细胞样细胞以及其他细胞和/或成分在来源上可以是胎儿的或成人的，且可以源自适宜的源例如皮肤、肝、胰腺、粘膜、动脉、静脉、脐带和胎盘组织等。这样的组织和/或器官可以通过适当的活组织切片或在尸体解剖之后获得。实际上，尸体器官可以用于提供基质细胞和成分的丰富供应。
包括基质的胚胎干细胞和/或其他成分可以使用本领域已知的方法来分离。例如，最近，人胚胎干细胞种群以及分离和使用这些细胞的方法已经被报告在Keller等人，Nature Med.，5：151-152(1999)，Smith Curr.Biol.8：R802-804(1998)中；已经从原生殖细胞被分离，Shamblatt等人，PNAS95：13726-1373(1998)；已经从胚细胞被分离，Thomason等人，Scienee282：1145-1147(1988)。间充质干细胞的分离和培养是本领域已知的。参见Mackay等人，Tissue Eng.4：415-428(1988)；William等人，Am Surg.65：22-26(1999)。这些细胞的接种在下文描述在部分5.3中。同样地，神经干细胞可以在以下中描述的方式被分离：Flax等人，Nature Biotechnol.，16：1033-1039(1998)；和Frisen等人，Cell.Mol.Life Sci.，54：935-945(1998)。
细胞可以本领域已知的任何方式来培养，包括以单层、珠或以三维和通过任何方式(即，培养容器、滚瓶、连续流系统等)。细胞和组织培养的方法是本领域熟知的，且被描述在例如上文的Cell & TissueCulture：Laboratory Procedures，supra，下文的Freshney(1987)，Cultureof Animal Cells：A Manual of Basic Techniques，infra。
一般而言，利用的细胞系被仔细地筛选人和动物病原体。取决于应用，当仅不含病原体的细胞是可接受的时(例如，对于创伤愈合、食物添加剂等)，这样的筛选可以具有关键的重要性。筛选病原体的方法是本领域熟知的。细胞类型，无论是以二维还是三维被培养，将影响经调节的培养基的性质。在一些实施方案中，细胞以二维被培养。在其他实施方案中，细胞以三维被培养。
a.基因工程细胞
在一些实施方案中，细胞可以作为用于将基因产物引入到促进例如组织缺陷的修复和/或再生的培养基或提取物中的媒介物。细胞可以被基因工程为表达(例如)炎性媒介物例如IL-6、IL-8和G-CSF。细胞还可以或可选择地被基因工程为表达抗炎因子，例如，抗GM-CSF、抗TNF、抗IL-1、抗IL-2等。
在另一个实施方案中，细胞可以被基因工程为将基因表达到将发挥治疗作用的培养基或提取物中，例如，在TGF-β的生产中以刺激软骨生产，或其他因子例如BMP-13以促进软骨形成、或促进基质细胞的迁移和/或基质沉积的刺激因子。因为构建体包括真核细胞，所以基因产物将被适当地表达和加工以形成活性产物。优选地，使用的表达控制成分应允许基因的调节表达，使得产物可以在培养物中被过度合成。通常，所选择的翻译启动子和具体地启动子成分，部分地取决于培养的组织和细胞的类型。能够分泌蛋白的细胞和组织是优选的(例如，具有大量糙面内质网和高尔基体细胞器的那些)。过渡生产的基因产物然后将由工程细胞分泌到经调节的培养基中。
细胞可以被基因工程为调节一个或多个基因；或基因表达的调节可以是短暂的或长期的；或基因活性可以是不可诱导的或可诱导的。
细胞还可以被基因工程为“破坏(knock out)”促进炎症的因子的表达。在下面讨论用于降低目标基因表达水平或目标基因产物活性水平的负调节技术。如本文使用的“负调节”是指相对于在没有调节处理的情况下的目标基因产物的水平和/或活性，目标基因产物的水平和/或活性下降。原产于该细胞的基因的表达可以使用许多技术来降低或破坏，例如，表达可以通过使用标准同源重组技术使完全基因失活(通常称为“击昏”)来抑制。通常，编码蛋白的重要的区的外显子(或该区的外显子5′)由阳性可选择的标记物(例如neo)间隔，阻止从目标基因生产正常mRNA且导致基因的失活。基因还可以通过在基因的一部分中产生缺失或失活插入，或通过删除整个基因而失活。通过将具有两个同源性的区域的构建体用于在基因组中远离的目标基因，插入两个区域的序列可以被删除。Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88：3084-3087。可选择地，基因还可以通过删除上游或下游表达成分而失活。
抑制目标基因的表达的反义分子和核酶分子还可以用于降低目标基因活性的水平。例如，抑制主要组织适合性基因群(HLA)的表达的反义RNA分子已经被表明关于免疫响应是最通用的。此外，适当的核酶分子可以被设计，如由例如Haseloff等人，1988，Nature334：585-591；Zaug等人，1984，Science224：574-578；和Zaug和Cech，1986，Science231：470-475所描述的。更进一步地，三链螺旋分子可以用于降低目标基因活性的水平。这些技术由L.G.Davis等人编辑，BasicMethods in Molecular Biology，第2版，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.1994详细地描述。
可用于对细胞进行基因工程的方法是本领域熟知的且在共同在审的美国专利4,963,489和5,785,964中进一步详述，两个专利的公开内容通过引用并入本文。例如，包含外源核酸例如编码所关心的基因产物的重组体DNA构建体或支撑物，可以被构建和用于转变或转染基质细胞。携带外源核酸且能够表达所述核酸的这样的转变的或转染的细胞，被选择且以本公开内容的三维构建体克隆扩展。
用于制备包含所关心的基因的DNA构建体的方法、用于转化或转染细胞的方法，和用于选择携带并表达所关心的基因的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，在以下中描述的技术：Maniatis等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Ausubel等人，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates & WileyInterscience，N.Y.；和Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.。
细胞可以使用任何各种载体中的任何来设计，载体包括但不限于，整合病毒载体，例如，还原病毒载体或腺相关病毒载体；或非整合复制载体，例如，乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或复制缺陷型病毒载体。当需要短暂表达时，非整合载体和复制缺陷型载体可能是优选的，因为可诱导的或构成的启动子可以在这些系统中用于控制所关心的基因的表达。可选择地，整合载体可以用于获得短暂表达，只要所关心的基因受可诱导的启动子控制。将DNA引入细胞中的其他方法包括使用脂质体、脂转染、电穿孔、基因枪、或通过直接的DNA注射。
细胞优选地用核酸例如DNA来转变或转染，通过一种或多种适当的表达控制成分例如启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸部位以及其他、和可选择的标记物来控制，即，与它们处于操作结合。在引入外来DNA之后，工程细胞可以允许在富集培养基中生长且然后转到选择的培养基。外来DNA中的可选择的标记物给予针对选择的抗性且允许细胞稳定地将外来DNA整合在诸如例如质粒上，进入它们的染色体并生长以形成灶，该灶又可以被克隆和扩展到细胞系。该方法可以有利地用于对将基因产物表达到培养基中的细胞系工程化。
任何启动子可以用于驱动插入的基因的表达。例如，病毒启动子包括(但不限于)CMV启动子/增强子、SV40、乳头状瘤病毒、埃-巴二氏病毒、弹性蛋白基因启动子和β-球蛋白。优选地，用于控制所关心的基因的表达的控制成分应允许基因的调节表达，使得产物仅当在体内需要时被合成。如果需要短暂表达，则构成的启动子优选地用于非整合和/或复制缺陷型载体中。可选择地，当需要时，可诱导的启动子可以用于驱动插入的基因的表达。可诱导的启动子可以建到整合和/或复制载体中。例如，可诱导的启动子包括但不限于，金属硫蛋白和热休克蛋白。
根据一个实施方案，用于表达所关心的的外源基因的可诱导的启动子是为如本文所公开的由于低温保存和随后的解冻而诱发的那些调节蛋白的天然启动子的那些。例如，TGF-β、VEGF、或各种已知的热休克蛋白的启动子可以用作表达控制成分，即，可以可操作地结合至所关心的外源基因以在调节细胞培养基的组织构建体中表达所需的基因产物。
各种方法可以用于获得被工程化到细胞中的基因产物的构成的或短暂的表达。例如，可以使用由Seldon等人，1987，Science236：714-718描述的转核移植技术。如本文使用的“转核”表明移植的细胞的核已经通过加入DNA序列通过稳定的或短暂的转染而被改变。优选地，细胞被工程化为短暂地和/或在可诱导的控制下在手术后恢复时间期间表达这样的基因产物，或被工程化为锚至基质细胞的嵌合融合蛋白，例如，被工程化为主要由受体或受体样分子的细胞内和/或横跨膜域组成的嵌合分子，作为胞外的域融合至基因产物。
此外，可能期望制备具有包含外来基因产物、生长因子、调节因子等的胞外基质的构建体，其然后在经调节的培养基中被发现。该实施方案是基于以下发现：在人基质细胞在三维支撑物骨架上生长期间，细胞在骨架上合成和沉积，原样产生的人胞外基质在正常人组织中。胞外基质局部地由细胞分泌且不仅将细胞和组织结合在一起，而且影响其接触的细胞的发育和行为。胞外基质包含各种结缔组织蛋白，例如，在主要由氨基葡聚糖链的网络组成的水合凝胶中交织的纤维形成蛋白。氨基葡聚糖是长的带负电荷的多糖链的多相群，其(除了透明质酸)共价地键合至蛋白以形成蛋白聚糖分子。根据该实施方案，基质细胞可以被基因工程为表达所需的基因产物，或改变的基因产物形式，其将存在胞外基质中和最终存在细胞培养基中。
2.培养细胞
在一些实施方案中，细胞在二维细胞培养物中生长。在其他实施方案中，细胞在三维细胞培养物中生长。参见，例如，通过引用以其整体并入本文的美国专利第6,372,494号。用于细胞培养物中的基质细胞优选地包括成纤维细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、和/或胚胎干细胞，具有或不具有本文更充分地描述的另外的细胞和/或成分。
细胞可以通过本领域已知的任何方式来培养。优选地，在能够实现无菌加工和处理的环境中培养细胞。细胞和组织培养的常规方式已经由于需要人监督和控制培养基而受限制。这限制了可以在单一时间培养的细胞和组织的量和从而限制了可以在单一时间获得的经调节的细胞培养基的体积。由于该原因，优选的是，培养基以允许大规模生长(产生大规模经调节的培养基)的方式使用(例如)用于无菌大规模培养的设备，比如共同所有的美国专利5,763,267(‘267专利)中描述的设备来调节，为了所有的目的，通过引用以其整体并入本文。使用‘267专利中描述的无菌封闭系统，将预调节的培养基从流体储器运输至入口歧管且均匀地分配至连续流系统中的培养物且可用于培养三维细胞和组织培养物，例如诸如
Figure BDA00003462061900411
特定地，‘267专利中描述的设备包括多个柔性的或半柔性的处理室，该处理室包括一个或多个个体培养袋、多个硬的隔离物、入口流体歧管、出口流体歧管、流体储器，和用于在系统内运输流体的装置。
在处理期间，将液体培养基从流体储器运输至入口歧管，入口歧管又将培养基均匀地分配至连接的处理室和内部培养袋中的每一个。还提供出口流体歧管以确保每一个处理室被均匀地填充和确保在处理期间形成的任何气泡被从处理室除去。处理室是柔性的或半柔性的，以便在冲洗和应用培养的移植物期间提供便于最终用户的处理。由于处理室的柔性，还提供硬的隔离物，硬的隔离物确保在处理期间在室内均匀的流体分布。
在另一个实施方案中，在用于组织培养物的无菌生长的设备中培养组织，如为了所有目的以其整体并入本文的美国专利第5,843,766(‘766专利)号中所描述的。‘766专利公开了组织培养室，其中室是提供用于组织的生长的套管，组织可以在相同的无菌容器中生长，以冷冻形式被保存，和运往最终用户。组织培养室包括套管，套管包括在套管内的基材，基材被设计为促进在基材的表面上的三维组织生长。套管包括帮助培养基的流入和流出的入口和出口。套管还包括至少一个流量分配器。在一个实施方案中，流量分配器是挡板，其用于分配在室内的培养基流以产生组织的连续的、均一的块。在第二实施方案中，流量分配器是偏转板、分配通道和流动通道的组合。在每一个实施方案中，套管还包括密封件以便确保在组织生长和储存期间在室内部的无菌环境。
成纤维细胞将支持许多不同的细胞和组织在三维培养系统中生长，且因此，可以被接种到基质上以形成“一般的”基质支持基体，用于培养各种细胞和组织中的任一种。然而，在某些情况下，使用“特殊的”而不是“一般的”基质支持基体可能是优选的，在该情况下，基质细胞和成分可以从特定的组织、器官或个体获得。此外，成纤维细胞和其他基质细胞和/或成分可以源自将在三维系统中培养的相同类型的组织。当培养组织时这可能是有利的，其中特殊的基质细胞可以起到特定的结构/功能作用，例如，动脉的平滑肌细胞、神经组织的神经胶质细胞、肝的库柏法细胞等。
一旦接种到三维支撑物上，基质细胞将在骨架上增殖并沉积由基质细胞天然分泌的结缔组织蛋白例如生长因子、调节因子和胞外基质蛋白。基质细胞和它们的天然分泌的结缔组织蛋白基本上包围骨架，因此形成活的基质组织，该活的基质组织将支持接种到本公开内容的三维培养系统中的组织特有的细胞的生长。实际上，当用组织特有的细胞接种时，三维基质组织将维持培养物的活跃增殖，持续长的时间段。重要地，因为网的开口允许培养物中的基质细胞离开，汇合的基质培养物没有展示接触抑制，且基质细胞继续生长、分裂和保持功能上是活性的。
生长因子和调节因子由基质组织加工到培养基中。生长因子(例如但不限于，αFGF、βFGF、胰岛素生长因子或TGF-β)、或天然的或改性的血液制品或其他生物活性的生物分子(例如但不限于，透明质酸或激素类)，增强三维骨架或支架的定植(colonization)并调节培养基。
在体内使用培养物之前可以改变基质细胞生长的程度，这取决于以三维组织培养生长的组织的类型。调节培养基的活的基质组织可以通过将它们植入体内而用作矫正结构。可选择地，活的基质组织可以用另一种细胞类型接种并植入体内。基质细胞可以被基因工程为调节分泌到培养基中的蛋白产物的水平以提高从经调节的培养基获得的回收产物的浓度。例如，基质细胞可以被基因工程为提高从经调节的培养基获得的以下产物中的一种或多种的浓度。抗炎因子例如抗GM-CSF、抗TNF、抗IL-1、抗IL-2等。可选择地，基质细胞可以被基因工程为“破坏”促进炎症的天然基因产物的表达，例如，GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2，或“破坏”MHC的表达以便降低排斥的风险。
基质细胞以三维生长将维持基质细胞和组织特有的细胞两者在培养物中的活跃增殖，持续比单层系统持续的时间更长的时间。此外，三维系统支持细胞在体外培养中的成熟、分化和分离，以形成类似于在体内发现的对应物的成人组织组分且将蛋白固定到更接近地类似生理比率的调节的培养基中。
a.三维基质组织的建立
三维支撑物或骨架可以是任何材料和/或形状，该材料和/或形状：(a)允许细胞附接至其(或可以被修饰为允许细胞附接至其)；和(b)允许细胞以多于一层生长。许多不同的材料可以用于形成骨架，包括但不限于：不可生物降解的材料，例如，尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯基化合物(例如，聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE；特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纤维素、棉花；和可生物降解的材料，例如，聚乙醇酸(PGA)、胶原、胶原海绵、肠线、纤维素、明胶、葡聚糖、聚链烷酸酯等。这些材料中的任何可以例如被纺织、编织、针织等为网，以形成三维骨架。骨架又可以被塑造成矫正结构所需的任何形状，例如管、绳、细丝等。某些材料例如尼龙、聚苯乙烯等是用于细胞附着的差的基材。当这些材料用作三维骨架时，可取的是在接种基质细胞之前预处理骨架以便增强基质细胞附着到支撑物。例如，在用基质细胞接种之前，尼龙骨架可以用0.1M乙酸来处理，并在聚赖氨酸、FBS和/或胶原中温育以包覆尼龙。聚苯乙烯可以同样地使用硫酸来处理。
当培养物被植入体内时，可以优选使用可生物降解的基质，例如诸如聚乙醇酸、胶原、胶原海绵、纺织胶原、肠线材料、明胶、聚乳酸、或聚乙醇酸和其共聚物。当培养物将被维持长的时间段或低温保存时，不可降解的材料例如尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯类聚合物、特氟隆、棉花等可以是优选的。可以根据本公开内容使用的方便的尼龙网是
Figure BDA00003462061900441
其是具有210μm的平均孔径和90μm的平均尼龙纤维直径的尼龙过滤网(#3-210/36，Tetko，Inc.，N.Y.)。
具有或不具有下面所描述的其他细胞和成分的包括成纤维细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞的基质细胞，被接种到骨架上。此外，在疏松结缔组织中存在的细胞连同成纤维细胞可以被接种到三维支撑物上。这样的细胞包括但不限于平滑肌细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、脂肪细胞等。如先前解释，胎儿成纤维细胞可以用于形成将支持各种不同的细胞和/或组织的生长的“一般的”三维基质基体。然而，“特殊的”基质组织可以通过用源自将被培养的相同类型的组织和/或源自稍后接收根据三维系统在培养物中生长的细胞和/或组织的特定个体的成纤维细胞接种三维骨架来制备。
因此，在一个实施方案中，可以培养专门用于特定组织的基质细胞。例如，造血组织的基质细胞，包括但不限于成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞/单核细胞、脂肪细胞和网状细胞，可以用于形成三维近汇合基质，用于在体外长期培养骨髓。造血基质细胞可以容易地通过以低的力例如3000xg离心从骨髓悬浮液中形成的“血沉棕黄层”获得。在构成动脉的内壁的基质层中，可以加入高比例的未分化的平滑肌细胞以为蛋白提供弹性。肝的基质细胞可以包括成纤维细胞、库柏法细胞、以及血管和胆管内皮细胞。同样地，神经胶质细胞可以用作基质来支持神经细胞和组织的增殖；用于该目的的神经胶质细胞可以通过胚胎或成年脑的胰蛋白酶化或胶原酶消化来获得(Ponten和Westermark，1980，在Federof，S.Hertz，L.编辑“Advances in CellularNeurobiology，”第1卷，New York，Academic Press，第209-227页中)。细胞在三维基质细胞培养物中生长可以通过向骨架加入以下物质或用这些物质包覆支撑物来进一步增强：蛋白(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖(例如硫酸肝素、硫酸软骨素-4、硫酸软骨素-6、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质、和/或其他材料。
此外，间充质干细胞(血统定向或非定向的祖细胞)是用于接种到骨架上的有利的“基质”细胞。细胞可以分化为骨细胞、腱和韧带的成纤维细胞、骨髓基质细胞、结缔组织的脂肪细胞和其他细胞、软骨细胞，这取决于内生的或补充的生长以及调节因子和其他因子，包括前列腺素、白细胞介素和天然存在的抑素，其调节增殖和/或分化。
成纤维细胞可以容易地通过分解作为成纤维细胞的源的适当的器官或组织而分离。这可以容易地使用本领域技术人员已知的技术来完成。例如，组织或器官可以用机械方法来分解和/或用消弱在邻近细胞之间的连接的消化酶和/或螯合剂处理，使得可以将组织分散成单个细胞的悬浮液，而没有明显的细胞破裂。酶促离解可以通过切碎组织和用许多消化酶中的任何单独地或组合地处理切碎的组织来完成。这些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、链酶蛋白酶、分散酶等。机械破坏还可以通过许多方法来完成，包括但不限于，仅举几个例子，使用研磨机、搅拌机、筛、匀浆器、压力室或绝缘子(insonator)。对于组织解聚技术的综述，参见Freshney，Culture of Animal Cells：AManual of Basic Techniques，第2版，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，第9章，第107-126页。
一旦组织已经简化为单个细胞的悬浮液，悬浮液就可以被分为亚群，可以从该亚群获得成纤维细胞和/或其他基质细胞和/或成分。这还可以使用用于细胞分离的标准技术来完成，包括但不限于，具体细胞类型的克隆和选择、不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)、基于混合种群中的差别的细胞可凝集性的分离、冻-融程序、混合种群中的细胞的差别附着性质、过滤、常规离心和区带离心、淘析离心法(逆流离心)、单位重力分离、逆流分布法、电泳和荧光活化细胞分选。对于无性选择和细胞分离技术的综述，参见Freshney，Culture ofAnimal Cells：A Manual of Basic Techniques，第2版，A.R.Liss，Inc.，NewYork，1987，第11和12章，第137-168页。
成纤维细胞的分离可以例如如下进行：将新鲜的组织样品彻底地洗涤并在汉克平衡盐溶液(HBSS)中切碎以除去血清。将切碎的组织在新制备的离解酶例如胰蛋白酶溶液中温育1-12小时。在这样的温育之后，离解的细胞被悬浮，通过离心做成丸并覆盖在培养容器上。所有成纤维细胞将在其他细胞之前附着，因此，适当的基质细胞可以被选择性地分离和生长。然后，分离的成纤维细胞可以生长成合流，从汇合的培养物中提起和接种到三维基质上(参见，Naughton等人，1987，J.Med.18(3和4)219-250)。用高浓度的基质细胞例如约106至5×107细胞/ml接种三维骨架将导致在较短的时间段内建立三维基质组织。
在接种基质细胞之后，应在适当的营养培养基中温育三维骨架。如前所述的，许多商购的培养基例如RPMI1640、Fisher′s、Iscove′s、McCoy′s等可以适于使用。重要的是，在温育期期间，三维基质细胞培养物被悬浮或漂浮在培养基中以使增殖活性最大化。培养物被定期地“进料”，且回收和加工经调节的培养基，如下面部分5.6和5.7所描述的。因此，取决于待被培养的组织和所需的胶原类型，可以选择适当的基质细胞来接种三维基质。
在温育三维基质细胞培养物期间，可以从基质释放增殖的细胞。这些释放的细胞可以粘住培养容器的壁，在该处它们可以继续增殖和形成汇合的单层。这应(例如)通过在进料期间除去释放的细胞，或通过将三维基质培养物转移至新的培养容器来防止或最小化。容器中存在汇合的单层将“停止”细胞在三维基质和/或培养物中的生长。除去汇合的单层或将培养物转移至新容器中的新鲜培养基将恢复三维培养系统的增殖活性。应注意，如果需要的话，对经调节的培养基进行加工，使得其不包含任何全细胞(除非全细胞用于特殊应用)。这样的除去或转移应在具有超过25％合流的基质单层的任何培养容器中进行。可选择地，培养系统可以被搅拌以防止释放的细胞粘住，或代替地定期地进料培养物，培养系统可以被设置为使得新鲜的培养基连续地流过系统。流速可以被调节为使在三维培养物内的增殖最大化，和洗出和除去从培养物释放的细胞，使得它们将不粘住容器的壁并生长至合流。
其他细胞例如实质细胞，可以在三维活基质组织上接种和生长。
b.将另外的细胞接种到细胞培养物中
一旦细胞培养物已经达到特定的生长程度，就可以将另外的细胞接种到细胞培养物中并连同细胞培养物的细胞一起培养。另外的细胞在活组织上在体外生长以形成自然组织的经培养的对应物，且通过以类似于生理水平的比率将胞外产物加工到培养基中来调节培养基。接种物中的高浓度细胞将有利地比低浓度更快地导致在培养物中增加的增殖。
选择用于接种的细胞将取决于待被培养的组织，所述组织可以包括但不限于，仅举几个例子，骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾、神经组织、肾上腺、粘膜上皮和平滑肌。这样的细胞将特有的胞外蛋白例如某些生长因子加工到培养基中，导致优化用于某些组织特殊应用的培养基。
例如且不是作为限制，可以在活组织上培养各种上皮细胞。这样的上皮细胞的实例包括(但不限于)角质形成细胞、口腔粘膜和胃肠(G.I.)道细胞。这样的上皮细胞可以通过以下来分离：根据本领域已知的方法酶促处理组织，随后使这些细胞在培养物中扩展和将上皮细胞应用至(例如)三维基质支撑物细胞基质。基质支撑物的存在提供了促进上皮细胞的正常分裂和分化的生长因子和其他蛋白。
一般而言，该接种物应包括该组织的“干”细胞(还称为“储备”细胞)；即，产生新细胞的那些细胞，新细胞将成熟为形成组织的各种组分的特殊细胞。
接种物中使用的实质细胞或其他表面层细胞可以从通过使用用于获得基质细胞的上述标准技术来分解所需的组织而制备的细胞悬浮液获得。整个细胞悬浮液本身可以用于接种三维活基质组织。因此，包含在匀浆内的再生细胞将在基质上适当地增殖、成熟和分化，而非再生细胞将不会。可选择地，特定的细胞类型可以使用用于分级基质细胞的上述标准技术从细胞悬浮液的适当部分分离。当“干”细胞或“储备”细胞可以容易地被分离时，这些可以用于优先地接种三维基质支撑物。例如，当培养骨髓时，基质可以用新鲜的或源自低温保存样品的骨髓细胞来接种。当培养皮肤时，三维基质可以用黑素细胞和角质形成细胞来接种。当培养肝时，三维基质可以用肝细胞来接种。当培养胰腺时，三维基质可以用胰腺内分泌细胞来接种。对于可以用于从各种组织获得实质细胞的方法的综述，参见，Freshney，Culture ofAnimal Cells.A Manual of Basic Technique，第2版，A.R.Liss，Inc.，NewYork，1987，第20章，第257-288页。
实际上，在接种之前沉积在基质基体上的不同比例的各种类型胶原可以影响稍后接种的组织特有细胞的生长。例如，为了造血细胞的最佳生长，基质应优选地在初始基质中包含6∶3∶1的近似比率的胶原类型III、IV和I。对于三维皮肤培养系统，胶原类型I和III优选地被沉积在初始基质中。被沉积的胶原类型的比例可以通过选择加工适当的胶原类型的成纤维细胞来操纵或增强。这可以使用能够激活补体且界定特定的胶原类型的适当的同种型或亚纲的单克隆抗体来完成。这些抗体和补体可以用于不利地选择表达所需的胶原类型的成纤维细胞。可选择地，用于接种基质的基质细胞可以是合成所需的适当的胶原类型的细胞的混合物。表I中示出各种类型的胶原的分布和来源。
表1
Figure BDA00003462061900491
Figure BDA00003462061900501
在温育期间，细胞培养系统应悬浮或漂浮在营养培养基中。培养物应定期地被进料有新鲜的培养基。再次，应谨慎地防止从培养物释放的细胞粘住容器的壁，在容器的壁处它们可以增殖和形成汇合的单层。当与结构化组织相比，培养扩散的组织时，似乎更容易出现从培养物释放细胞。例如，皮肤培养物在组织上和形态学上是正常；独特的真皮层和表皮层不会将细胞释放到周围的培养基中。相反，骨髓培养物将成熟的非粘连细胞释放到培养基中，这是以这样的细胞在体内在骨髓中被释放的方式。如先前解释，如果释放的细胞粘住培养容器和形成汇合的单层，三维培养物的增殖将“停止”。这可以通过以下来避免：通过在进料期间除去释放的细胞，将培养物转移至新的容器，通过搅拌培养物以防止释放的细胞粘至容器壁，或通过使新鲜的培养基以足以补充培养物中的营养素和除去释放的细胞的速率连续流动。如前所述的，如果需要的话，对经调节的培养基进行加工，使得其不含全细胞和细胞碎屑。
细胞在培养物中的生长和活性可以受各种生长因子影响，例如胰岛素、生长激素、生长调节素、集落刺激因子、红细胞生成素、表皮生长因子、肝促红因子(肝细胞生成素)、和肝细胞生长因子。调节增殖和/或分化的其他因子包括前列腺素类、自细胞介素、和天然存在的抑素。
C.经调节的生长培养基和细胞提取物
1.从细胞培养物回收经调节的生长培养基或细胞提取物
可以通过技术人员已知的任何方式从细胞培养物分离所得到的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，经调节的生长培养基被泵送出细胞培养系统并加工用于使用。在一些实施方案中，在细胞培养物已经调节生长培养基至足够的程度之后(即，在培养基被调节为使得胞外蛋白例如生长因子在培养基中已经达到所需的水平之后)，回收经调节的生长培养基。优选地，当某些生长因子和结缔组织蛋白分泌的水平处于其最高水平时(参见图1)，在组织的生长的后期回收经调节的生长培养基。在优选的实施方案中，在培养的第10天至第14天将生长培养基暴露于细胞之后，回收经调节的生长培养基。
可以通过技术人员已知的任何方式从经调节的生长培养基分离通过细胞培养物产生的细胞提取物。
2.加工经调节的生长培养基或细胞提取物
在回收经调节的生长培养基或细胞提取物之后，可能需要进一步加工所得到的上清液。这样的加工可以包括(但不限于)通过水通量过滤装置或通过使用在上文的Cell & Tissue Culture：LaboratoryProcedures，supra，第29D：0.1-29D：0.4页中描述的方法浸润来浓缩。
另外，可以使用带有具有10,000ml截留的过滤器的正压浓缩装置(Amicon，Beverly，MA)来将培养基浓缩10至20倍。
并且，经调节的生长培养基或细胞提取物可以被进一步加工用于产物分离和纯化以除去(例如)不需要的蛋白酶。用于产物分离和纯化使得最佳的生物活性被维持的方法对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。例如，可能期望纯化生长因子、调节因子、肽激素、抗体等。这样的方法包括(但不限于)经调节的培养基的凝胶色谱法(使用基质例如交联葡聚糖)离子交换、使用不溶性基质例如交联琼脂糖的金属螯合物亲和色谱法、HPLC纯化和疏水相互作用色谱法。这样的技术更详细地描述在上文的Cell & Tissue Culture：LaboratoryProcedures中。取决于经调节的生长培养基或细胞提取物和/或源自其的产物的所需的应用，必须采取适当的措施来维持无菌性。可选择地，灭菌可以是必需的且可以通过本领域普通技术人员已知的方法来完成，例如诸如热灭菌和/或过滤灭菌，务必保持所需的生物活性。
3.经调节的生长培养基或细胞提取物中出现的一些产物
下面的表2列出通过ELISA(酶联免疫测定法)确定申请人的经调节的培养基中的多种生长因子的浓度，申请人的经调节的培养基先前支持在
Figure BDA00003462061900521
组织培养物中生长的细胞的生长。可以认为，根据本发明的细胞提取物还将包含这些生长因子。应理解，下表不是各因子的全部总括性列表，且通过提供本公开内容的培养基中存在的生物活性因子中的一些的浓度，独自提供该表以便进一步表征经调节的培养基。
表2
Figure BDA00003462061900522
已经利用多种方法来量化和表征由三维组织培养物TransCyteTM和
Figure BDA00003462061900523
)中出现的成纤维细胞分泌的主要分子组分。TransCyteTM和
Figure BDA00003462061900524
中存在的人基质蛋白和氨基葡聚糖(GAG)包括但不限于胶原I、III、纤连蛋白、肌腱蛋白、核心蛋白聚糖、蛋白聚糖β聚糖、多配体蛋白聚糖以及其他组分(数据未示出)。这些分泌的蛋白和GAG充当主要结构功能以及刺激细胞分裂、迁移、粘附和信号转导。图1中阐明氨基葡聚糖在三维生长系统中的沉积(沉积体积取决于生长时间)和胶原(沉积体积不依赖于生长时间)。已经通过ELISA、蛋白印迹分析、免疫组织化学和PCR来测量组分。例如，TransCyteTM中出现的一些组分包括胶原I、III和VII(RNA)、纤连蛋白、肌腱蛋白、血小板反应蛋白2、弹性蛋白、蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、蛋白聚糖以及其他组分(数据未示出)。已经很好地描述了组织发展、愈合和正常功能中的这些组分中的活性。另外，申请人描述人生物工程基质在体外对细胞功能的影响。例如，申请人已经注意到，通过加入生物工程的基质，增加了细胞增殖。为了研究其对细胞增殖的影响，从TransCyteTM和
Figure BDA00003462061900531
物理移除基质并以改变的稀释度将其加入人成纤维细胞和角质形成细胞的单层培养物中。图2中示出增加的细胞增殖的结果。
此外，申请人注意到通过测量分泌到在无血清培养基、培养基或三维经调节培养基的存在下培养的组织的胞外基质中的胶原的量来检查三维经调节的培养基对三维组织的制备和组成的影响。通过测量分泌到在无血清培养基、培养基或三维经调节的培养基的存在下培养的组织的胞外基质中的胶原的量来检查三维经调节培养基对三维组织的制备和组成的影响。本公开内容的经调节的培养基在体外显著地增加组织的胶原沉积。
D.代谢经调节的生长培养基或细胞提取物
1.酵母
代谢经调节的生长培养基或细胞提取物的过程可以与多种微生物例如诸如酵母、杆菌、霉菌、植物细胞等一起出现。对于本公开内容来说尤其优选的是使用酵母制备的酵素。如本文使用的，术语“酵母”意味着包括单酵母细胞、多酵母细胞和/或酵母细胞的培养物。酵母可以是本领域技术人员已知的各种真菌家族，包括但不限于：脉孢菌(Neurospora)、黑斑病菌(Ceratostomella)、麦角菌属(Claviceps)、炭角菌属(Xylaria)、座坚壳属(Rosellinia)、盘菌属(Helotium)、核盘霉属(Sclerotinia)、柄灰包属(Tulostoma)、须腹菌属(Rhizopogon)、耳柱干真菌属(Truncocolumella)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、虫霉属(Entomophthora)、网柄菌属(Dictostylium)、芽枝莓属(Blastocladia)、集壶菌属(Synchytrium)、水霉属(Saprolegnia)、霜霉属(Peronospora)、白锈属(Albugo)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、根肿菌属(Plasmodiophora)、块菌属(Tuber)、齿菌属(Hydnum)、茶渍属(Lecanora)、石蕊属(Roccella)、鸡皮衣属(Pertusaria)、松萝属(Usnea)、扁枝衣属(Evernia)、石花属(Ramalina)、树发属(Alectoria)、山石蕊属(Cladonia)、梅衣属(Parmelia)、冰岛衣属(Cetraria)、伞菌属(Agaricus)、鸡油菌属(Cantharellus)、脐菇属(Omphalotus)、鬼伞属(Coprinus)、乳菇属(Lactarius)、小皮伞属(Marasmius)、侧耳属(Pleurotus)、鳞伞属(Pholiota)、红菇属(Russula)、乳菇属(Lactarius)、球盖菇属(Stropharia)、粉褶菌属(Entoloma)、环柄菇科(Lepiotaceae)、伏革菌属(Corticium)、薄膜革菌属(Pellicularia)、口蘑属(Tricholoma)、台蕈属(Volvaria)、杯伞属(Clitocybe)、火菇属(Flammulina)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、酵母菌科(Saccharomycetaceae)、散囊菌属(Eurotium)、曲霉菌属(Aspergillus)、梭孢壳属(Thielavia)、盘菌属(Peziza)、暗盘菌属(Plectania)、羊肚菌属(Morchella)、耳菌属(Wynnea)、马鞍菌属(Helvella)、鹿花菌属(Gyromitra)、鬼笔目Phallales)、竹荪属(Dictyophera)、蛇头菌属(Mutinus)、笼头菌属(Clathrus)、三叉鬼笔属(Pseudocolus)、马勃属(Lycoperdon)、秃马勃属(Calvatia)、地星属(Geastrum)、地星科(Radiigera)、Astreus、鸟巢菌科(Nidularia)、胄腹菌属(Gastrocybe)、地红菇属(Macowanites)、腹牛肝菌属(Gastroboletus)、地花菌属(Albatrellus)、新香菰属(Neolentinus)、黑孔菌属(Nigroporus)、稀孔菌属(Oligoporus)、多孔菌属(Polyporus)、牛舌菌属(Fistulina)、层孔菌属(Fomes)、南牛肝菌属(Boletus)、褐孔小牛肝菌属(Fuscoboletinus)、疣柄牛肝菌属(Leccinum)、褶孔菌属(Phylloporus)、乳牛肝菌属(Suillus)、松塔牛肝菌属(Strobilomyces)、条孢牛肝菌属(Boletellus)、银耳属(Tremella)、木耳属(Auricularia)、胶脑菌属(Dacrymyces)、栅锈菌属(Melampsora)、柱锈菌属(Cronartium)、柄锈菌属(Puccinia)、胶锈菌属(Gymnosporangium)、腥黑粉菌属(Tilletia)、条黑粉菌属(Urocystis)、隔担菌属(Septobasidium)、湿伞属(Hygrocybe)、蜡伞属(Hygrophorus)、湿菌髓(Hygrotrama)、新蜡伞属(Neohygrophorus)、丝膜菌属(Cortinarius)、裸伞属(Gymnopilus)、毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子癣菌属(Microsporum)、念珠菌属(Monilia)、假丝酵母属(Candida)、小尾孢属(Cercosporella)、青霉菌属(Penicillium)、芽生菌属(Blastomyces)、尾孢属(Cercospora)、绿核菌属(Ustilaginoidea)、瘤座孢属(Tuber cularia)、镰刀菌属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctinia)、菌丝束属(Ozonium)、菌核属(Sclerotium)、地舌菌属(Geoglossum)或蜜环菌属(Armillaria)。尤其关心的是属于酵母科家族的真菌。较关心的是属于毕赤酵母属的真菌。最关心的是属于毕赤酵母种的真菌。在优选的实施方案中，巴斯德毕赤酵母被用于发酵工艺。在一些实施方案中，酵母有氧生长。
2.发酵工艺
该酵母发酵工艺可以在搅拌罐生物反应器进行。这样的生物反应器的实例可以包括，例如，从New Brunswick Scientific，Edison NJ或Applikon Biotechnology Foster City CA可得到的发酵罐。
本公开内容的酵母提取物包括酵母的细胞质组分和胞外组分，其包括但不限于营养素肉汤、细胞蛋白材料、细胞核材料、细胞原生质材料和/或细胞壁组分。在一些实施方案中，提取物是相对水溶性的，例如，等于或多于1克的酵母提取物溶解在1克的水。该提取物还可以是可溶于水/有机溶剂混合物，例如但不限于含水二醇和含水甘油。
3.回收/加工经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞
提取物
根据上述用于回收和加工经调节的生长培养基或细胞提取物的程序，可以回收和/或加工经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，加工包括若干步骤，且可以包括使用以下技术：包括但不限于连续流离心、用于生物质的澄清的透镜死端过滤和具有无菌和超过滤能力的切向流过滤。在一个实施方案中，最终的加工步骤包括具体分子量截留的切向流过滤以便选择性地靶向生物活性组分。参见，例如，“Yeast Protocols”W.Xiao编辑(HumanaPress2006)，其通过引用并入本文。
E.经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞的活性/表征
提取物
在上述酵母代谢期间，存在经调节的生长培养基和细胞提取物中的治疗产物(包括(但不限于)酶、激素类、细胞因子、抗原、抗体、凝血因子和调节蛋白)被酵母代谢。术语被代谢的，是本领域技术人员已知的但基本上意指酵母开始消化经调节的营养培养基或细胞提取物的组分的过程。代谢过程可以使较大的分子变成小的更易于利用的组分，对于本发明的应用，该组分比未代谢的经调节的生长培养基或细胞提取物更有用。可以被代谢的治疗蛋白包括(但不限于)炎性媒介物、血管生成因子、因子VIII、因子IX、红细胞生成素(EPO)、α-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、人生长激素和衍生物、低密度脂蛋白(LDL)和载脂蛋白E、IL-2受体和其拮抗剂、胰岛素、球蛋白、免疫球蛋白、催化抗体、白细胞介素(IL)、胰岛素样生长因子、超氧化物歧化酶、免疫应答调节剂、BMP(骨形态发生蛋白)甲状旁腺激素和干扰素、神经生长因子、组织纤溶酶原激活物、和集落刺激因子(CSF)。这些经代谢的组分可以维持它们的前体的活性，或可以被转化为具有更大的增强活性，包括影响(例如)皮肤维持和状态的各种生理学系统的上调或下调。
培养基或提取物可以被进一步加工以浓缩或减少包含在培养基或提取物内的一种或多种经代谢的因子或组分，例如，使用免疫亲和色谱法富集经代谢的生长因子，或相反地，除去较不希望的组分，用于如本文描述的任何给定的应用。
在其他实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含酵母的一种或多种细胞质的和胞外的组分，包括(但不限于)营养素肉汤、细胞蛋白材料、细胞核材料、细胞原生质材料和/或细胞壁组分。
III.组合物
在一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，组合物是个人护理组合物。
在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.0001％至约95％的量存在组合物中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在组合物中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约5％至约30％的量存在组合物中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％至约20％的量存在组合物中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约13％至约17％的量存在组合物中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在组合物中。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。
在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、防腐剂、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、湿润剂、保温剂、稳定剂、稀释剂、溶剂和香料。组合物的另外成分的非限制性实例包括(但不限于)棕榈酰三肽5、水解蚕丝(Sericin)、二棕榈酰羟基脯氨酸、麦角硫因(EGT)、泛醌(辅酶Q10)、茶(Camellia Sinensis)(绿茶(Green Tea))叶提取物、四己基癸醇抗坏血酸酯、生育酚乙酸酯、黑莓(Rubus Fruticosus)(黑莓(Blackberry))叶提取物、酵母菌发酵滤液胞溶产物、α-熊果苷、γ氨基丁酸、和/或玻尿酸填充球。
在一个实施方案中，组合物还包括至少一种防腐剂。合适的防腐剂包括(但不限于)酸、醇、二醇、对羟基苯甲酸酯类、包含季氮的化合物、异噻唑啉酮、释放醛的化合物和卤代化合物。说明性的醇包括苯氧乙醇、异丙醇和苄醇；说明性的二醇包括丙二醇、丁二醇和戊二醇；说明性的对羟基苯甲酸酯类包括(还称为对羟基苯甲酸)对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯；说明性的包含季氮的化合物包括苯扎氯铵、Quartenium15；说明性的异噻唑包括甲基异噻唑啉、甲基氯异噻唑啉；说明性的释放醛的剂包括DMDM乙内酰脲、咪唑烷基脲和重氮咪唑烷基脲；说明性的抗氧化剂包括丁羟甲苯、生育酚，且说明性的卤代化合物包括三氯生和氯己定二葡糖酸盐。可用于本公开内容的目的的防腐剂的实例可以见于Steinberg，D.“Frequency of Use of Preservatives2007”.Cosmet.Toilet.117，41-44(2002)和“Preservative Encyclopedia”Cosmet.Toilet.117，80-96(2002)。此外，酶防腐剂系统例如在Ciccognani D.的论文Cosmetic PreservationUsing Enzymes，在“Cosmetic and Drug Microbiology”，Orth DS编辑，Francis & Taylor，Boca Raton，FL(2006)中所描述的那些，还可以有效与本公开内容的组合物一起使用。
在一个实施方案中，组合物还包括活性成分。合适的活性成分包括(但不限于)植物性药材、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂、抗生素、抗病毒素、抗真菌剂、类固醇、镇痛药、抗肿瘤药、将与经代谢的经调节的培养基或经代谢的细胞提取物中的因子导致互补或协同作用的试验药或任何化合物。
组合物可以是以片剂、胶囊剂、皮肤贴剂、吸入器、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳液、栓剂、霜剂、软膏剂、血管注射剂、水凝胶的形式，并进入本领域技术人员已知的任何其他适当的制剂中。对于口服施用，药物组合物可以采取(例如)通过常规方法用可接受的赋形剂或载体制备的片剂或胶囊的形式，可接受的赋形剂或载体例如粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充物(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以使用本领域熟知的方法来包覆。用于口服施用的液体制剂可以采取(例如)溶液剂、糖浆剂或混悬剂的形式，或它们可以被提供为用于在使用之前与水或其他合适的媒介物构建的干燥产物。这样的液体制剂可以通过常规方法用可接受的赋形剂或载体来制备，可接受的赋形剂或载体例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油质酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当的话，制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和增甜剂。
在一个实施方案中，组合物是以适合于化妆品应用的形式，包括(但不限于)洗剂、软膏剂、霜剂、喷雾剂、喷剂(spritze)、含水或含水酒精混合物凝胶、摩丝、贴剂、垫、面膜、湿布、湿巾、固体棒、清洁棒、唇膏、气溶胶霜剂、无水粉末、滑石、滋补剂、油、乳液或浴盐。
在一个实施方案中，组合物中的经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物存在化学递送媒介物中。化学递送媒介物包括(但不限于)脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂、洗剂、和其组合。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物被封装在密封剂内。
本公开内容的组合物可以经由各种途径使用本领域技术人员熟知的标准程序来递送至受试者。例如，这样的递送可以是部位特异性的，口服、鼻、静脉内、皮下、皮内、透皮、肌肉内或腹膜内施用。此外，它们可以被配制为起到控制或缓慢释放媒介物的作用。
经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以任何状态被使用，即，液体或固体、冷冻冻干或干燥成粉末、作为用于局部创伤治疗和抗粘附应用的膜、作为血管注射剂，参见通过引用以其整体并入本文的PCT WO96/39101。
可选择地，本公开内容的经调节的细胞培养基可以与可聚合的或交联水凝胶一起配制，如在美国专利第5,709,854号；第5,516,532号；第5,654,381号；和WO98/52543中所描述的，以上专利中的每一个通过引用以其整体并入本文。可以用于形成水凝胶的材料的实例包括改性的藻酸盐。藻酸盐是从海藻分离的碳水化合物聚合物，其可以通过暴露于二价阳离子例如钙而交联形成水凝胶，如例如在WO94/25080中所描述的，其公开内容通过引用并入本文。藻酸盐在二价阳离子的存在下在水中在室温下离子交联，以形成水凝胶基质。如本文使用的，术语“改性的藻酸盐”是指具有改性的水凝胶性质的化学改性的藻酸盐。
另外，通过暴露于单价阳离子而胶凝的多糖，包括细菌多糖例如结冷胶、和植物多糖例如角叉菜胶，可以使用类似于可用于上述藻酸盐的交联的那些的方法来交联以形成水凝胶。
改性的透明质酸衍生物是特别有用的。如本文使用的，术语“透明质酸”是指天然的透明质酸和化学改性的透明质酸。改性的透明质酸可以被设计和合成具有预选的化学修改以调节交联和生物降解的速率和程度。
共价可交联的水凝胶前体也是有用的。例如，水溶性多胺(例如壳聚糖)可以与水溶性二异硫氰酸酯(例如聚乙二醇二异硫氰酸酯)交联。
可选择地，可以利用包括在与自由基引发剂接触之后通过自由基反应交联的取代基的聚合物。例如，可以利用包括可以光化学交联的烯属不饱和基团的聚合物，如在WO93/17669中所公开的，其公开内容通过引用并入本文。在该实施方案中，提供了包括至少一种水溶区、可生物降解区和至少两个自由基可聚合区的水溶性大单体。这些大单体的实例是PEG-低聚乳酰基-丙烯酸酯，其中丙烯酸酯基团使用自由基引发系统例如曙红染料，或通过简单暴露于紫外线或可见光来聚合。另外，可以利用包括可以光化学交联的肉桂酰基团的水溶性聚合物，如在Matsuda等人，ASAID Trans.，38：154-157(1992)中所公开的。
优选的可聚合基团是丙烯酸酯、二丙烯酸酯、低聚丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、低聚甲基丙烯酸酯和其他生物学上可接受的光可聚合基团。丙烯酸酯是最优选的活性物质可聚合基团。
天然存在的和合成的聚合物可以使用本领域中可利用的且描述在例如March，“Advanced Organic Chemistry”，第4版，1992，Wiley-Interscience Publication，New York中的化学反应来改性。
优选地使用光引发剂引发聚合。有用的光引发剂是可以用于在没有细胞毒性的情况下和在短时帧，至多几分钟且最优选地几秒内引发大单体的聚合的那些。
许多染料可以用于光聚合。合适的染料是本领域技术人员熟知的。优选的染料包括赤藓红、根皮红、玫瑰红、苏氨酸(thonine)、樟脑醌、乙基曙红、曙红、亚甲蓝、核黄素、2，2-二甲基-2-苯基苯乙酮、2-甲氧基-2-苯基苯乙酮、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、其他苯乙酮衍生物、和樟脑醌。合适的助催化剂包括胺例如N-甲基二乙醇胺、N，N-二甲基苄胺、三乙醇胺、三乙胺、二苄胺、N-苄基乙醇胺、异丙基苄胺。三乙醇胺是优选的助催化剂。
在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物，或可选择地，加工到培养基中的特定的经代谢的胞外基质蛋白，用于提供极好的物质来包覆缝线。经代谢的、天然分泌的胞外基质提供具有I型和III型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白、葡糖氨基葡聚糖、酸性和碱性FGF、TGF-α和TGF-β、KGF、蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和各种其他分泌的人真皮基质蛋白的活性的经调节的培养基。同样地，本公开内容的经调节的细胞培养基或源自经调节的培养基的胞外基质蛋白可以用于包覆手术方法中矫正身体中的缺陷的包括血管假体的常规植入装置-产生优良的植入装置。植入物应由替换或代替有缺陷的功能的生物相容的惰性材料制成且由不可生物降解材料或可生物降解材料制成。通过用包含这些胞外蛋白的培养基包覆植入装置，植入物引起适当到的细胞附接，在植入部位导致优良的组织。因此，用经调节的细胞培养基或源自培养基的蛋白包覆的缝线、绷带和植入物，增强细胞例如白细胞和成纤维细胞补充到受损区域中并诱导细胞增殖和分化，导致改善的创伤愈合。
在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以与作为内部施用的媒介物的药学上可接受的载体一起被配制。并且，培养基可以被进一步加工以浓缩或减少包含在培养基内的一种或多种因子或组分，例如，使用免疫亲和色谱法富集生长因子或其他蛋白，或相反地，除去较不希望的组分，用于如本文描述的任何给定的应用。
IV.用于治疗或防止病状的方法
在一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物：可接受的载体和经代谢的经调节的生长培养基。
在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物：可接受的载体和经代谢的细胞提取物。
待治疗的病状包括(但不限于)皮肤病状，皮肤病状包括外观缺陷、先天性缺陷、脱发和后天缺陷。在一些实施方案中，待治疗的病状包括(但不限于)细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
A.皮肤病状
在一些实施方案中，治疗或防止的病状是皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。皮肤病状还包括(但不限于)细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
在一个非限制性实例中，把如本文描述的局部组合物应用到皮肤。本文所公开的组合物的应用使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。
在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括(但不限于)3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约50％。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约100％、约125％、约150％或一种或多种症状或病状改善更多。
上述经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物影响人皮肤的效果可以本领域技术人员已知的许多方法来测量。特定地，上述经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以针对它们对皮肤的效果通过采用分析技术例如(诸如)在具体的皮肤细胞(例如角质形成细胞)或成纤维细胞上的人基因组微阵列，或通过在单个皮肤细胞、组织模型或体外或体内皮肤模型上的蛋白表达分析而被筛选。在这些测试模型中，具体的基因和/或蛋白可以由于提取处理而上调或下调。在筛选中能够调节皮肤病状的基因和蛋白是特别关心的。为了本公开内容的目的，特别关心的是与炎症、胞外基质表达、黑色素调节、皮肤增湿、脱落等相关的基因和蛋白。特别关心的是与环加氧酶表达尤其是环加氧酶-1和2，和同样胞外基质蛋白表达尤其是I型、IV型和VI型胶原表达，以及弹性蛋白和纤连蛋白表达相关的蛋白。此外，提取对皮肤黑色素表达的影响也是相当关心的。
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物对这些和其他重要的皮肤蛋白的表达的影响可以通过人基因组微阵列分析和蛋白表达以及通过本领域技术人员熟知的非侵入性测试方法来监测，非侵入性测试方法包括(但不限于)增湿改善、皱纹减少、色素沉着减少、肤色改善等。本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的应用本身可以由测量的皮肤皱纹减少来表明，例如，如由技术例如SiIFIo硅氧烷建模、PRIMOS和VISIO照相系统等测量的。此外，增湿可以使用经皮水分损失(TEWL)或皮肤弹性测量仪或角质仪测量来测量。同样地，皮肤色素沉着可以使用比色计来测量。这样的测试技术是本领域技术人员熟知的且可以见于“Handbook of Non-Invasive Methods and the Skin”，第2版，Serup J，Jemec GBE，Grove GL(编辑)，Taylor and Francis BocaRaton FL2006。
对人表皮角质形成细胞的人基因微阵列分析表明，经代谢的经调节的生长培养基使在各种皮肤功能中涉及的若干基因上调。参见实施例18。因此应明白，根据本公开内容的酵母代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物可以用在个人护理组合物中，用于治疗皮肤病状。
B.创伤愈合应用
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以被处理成促进创伤和烧伤愈合。当组织受伤时，展示生物活性阵列的多肽生长因子被释放到创伤中以促进愈合。创伤愈合是包括若干阶段的复杂过程且能够以控制的方式将破口密封至体被以形成功能上有能力的组织。该过程从止血开始，随后是包括中性白细胞和巨噬细胞的炎性相。该过程继续肉芽组织和表皮再植的发展以闭合创伤。随后，疤痕组织被形成且在接连数月被重新塑造成接近原始解剖结构。理论上，疤痕组织是最小的，使得可以形成在组织学上和生理学上类似于原始正常组织的健康组织、功能上有能力的组织。
愈合过程的每一个阶段受通过调节蛋白例如细胞因子、生长因子和炎性媒介物的细胞相互作用、以及细胞接触机制控制。例如，炎性媒介物例如IL-6、IL-8和G-CSF诱导淋巴细胞分化和急性期蛋白以及中性白细胞渗入、成熟和活化，它们是创伤愈合的炎性阶段中重要的过程。创伤愈合过程中涉及的调节蛋白的其他实例是在炎症和肉芽组织形成期间诱导血管生成的VEGF、诱导骨形成的BMP、激活角质形成细胞的KGF、和诱导胞外基质的沉积的TGF-β1。
在慢性创伤中，愈合过程在止血之后和在表皮再植之前的点被中断，且明显不能重新开始。在创伤床中看到的大部分炎症与感染相关，但炎症产生富含蛋白酶的环境，蛋白酶使调节蛋白降解且因此干扰创伤愈合过程。
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含认为在创伤愈合中是重要的且已经表明在创伤愈合的体内模型中耗尽的活性。例如，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以包含支持愈合过程的许多生长因子(例如VEGF、G-CSF、IL-8、KGF和TGF-β)中的一种或多种的活性。此外，在一些医疗病状例如糖尿病中，创伤愈合所需要的调节蛋白中的一些是处于供应不足。例如，已经发现，在非胰岛素依赖性糖尿病的小鼠模型(例如，db/db小鼠)中，相比于正常小鼠的创伤中的水平，创伤中的VEGF和PDGF的分泌以及PDGF受体的表达全部被抑制。
并且，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可用于治疗其他类型的组织损伤，例如，外伤的或先天的，其中组织缺陷或损伤的修复和/或再生是期望的，因为在申请人的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物中发现这些生长因子中的许多的活性，包括(例如)成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、骨形态生成蛋白(BMP)和转化生长因子(TGF)；以及调节血管形成的那些，例如血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)和碱性FGF；血管生成因子、和抗血管生成因子。应激蛋白例如GR78和MSP90诱导生长因子例如TGF-β。TGF-β(包括TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、TGFβ-4和TGFβ-5)调节生长和分化且加速创伤愈合(Noda等人，1989，Endocrin.124：2991-2995；Goey等人，1989，J.Immunol.143：877-880；Mutoe等人，1987，Science237：1333-1335)。促细胞分裂剂(例如PDGF)增加细胞结构和肉芽组织在组织形成中的速率(Kohler等人，1974，Exp.Cell.Res.87：297-301)。如前所述的，细胞优选地是人以最小化免疫原性问题。
因为本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含一系列创伤愈合因子的活性，所以经调节的培养基有利地用于治疗创伤和烧伤愈合，包括皮肤创伤、断骨、胃溃疡、胰腺、肝、肾、脾、血管损伤和其他内部创伤。此外，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以与其他药物成分例如抗生素和镇痛药组合。实施方案包括本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物和用于局部应用的药膏或软膏剂的制剂。
可选择地，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以与绷带(粘性的或无粘性的)组合以促进和/或加速创伤愈合。
特殊组织处的创伤可能需要由该特殊组织调节的培养基。例如，神经组织的损伤可能需要包含在由神经细胞培养物调节的培养基中的蛋白。具体的产物可以是衍生的，或可选择地，经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以通过免疫亲和色谱法或来自具体培养基的所需的蛋白例如诸如NGF的增强的表达来富集。NGF控制的特征包括(但不限于)胆碱能神经递质功能(乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱-合成酶(ChAT))、神经细胞尺寸、和II型NGF受体的表达；NGF分泌到由在三维基质组织上培养的神经胶质和其他神经细胞调节的经调节的培养基中，该经调节的培养基然后可以用在用于神经愈合的组合物中。
内源性NGF的不足加重某些人神经变性病症，且受损的成人CNS神经元明显不能再生。特别地，神经损伤之后是在该损伤远端的神经纤维的退化，这是从细胞主体分离轴突的结果。在中枢神经系统中，在损伤部位处没有显著的生长，通常导致受损神经元的死亡。NGF在成人CNS胆碱能神经元在细胞主体水平(例如，隔膜)、插入组织空间(例如，神经桥)和脉状区域(例如，海马结构)中的再生能力中起到关键的作用。另外，NGF在改善认知缺陷中可以是有益的。用神经胶质细胞调节的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物(例如)可以供应外源性NGF和其他神经生长因子的活性，使得新的轴突可以从受损神经的切割端长出(例如，产生生长锥)，延长至连接的原始部位。
此外，对大脑和脊髓的损伤常常伴有对伴随的轴索变性的神经胶质响应，导致疤痕组织。该疤痕组织最初被认为是神经生长的物理障碍，然而，在额外神经环境中存在或不存在亲神经元因子是更重要的。星形细胞似乎能够响应于损伤而合成昆布氨酸(昆布氨酸还可以见于经代谢的经调节的生长培养基中)。已经发现胶原和纤连蛋白且尤其是昆布氨酸促进从培养的神经元或神经外植体在体外生长神经。这些胞外基质蛋白似乎提供粘性底质(adhesive substratum)，该粘性底质促进生长锥向前运动和轴突伸长。因此，亲神经元因子的存在和支持的底质是成功的神经再生所需要的，因为再生似乎需要：神经细胞主体能够安装适当的生物合成响应；和围绕损伤部位的环境能够支持轴突的伸长和最后的功能重新连接。由神经细胞例如星形细胞和神经胶质细胞调节的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含大脑和脊髓损伤中神经再生所需的亲神经元生长因子和胞外基质蛋白的活性。因此，在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物被配制用于治疗这样的损伤。
在其他实施方案中，皮肤、骨、肝、胰腺、软骨和其他特殊组织的治疗可以用由它们的相应的特殊细胞类型调节的培养基治疗，培养基优选地以三维培养，导致包含可用于治疗该相应的组织类型的创伤的该组织类型的一种或多种特有的胞外蛋白和其他代谢物的活性的经调节的培养基。
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物还可以加入到用于牙周手术的装置中，以促进均一的组织修复，以提供可生物降解的隐形眼镜、角膜盾或骨移植物，以提供手术空间填充物，以促进软组织增大尤其是为了减少皮肤皱纹的目的在皮肤中的软组织增大，和同样地泌尿括约肌增大，为了控制失禁的目的。
在另一个实施方案中，组合物可以被冻干/冷冻干燥的且作为创伤填充物加入(例如，从用于植入的毛发塞留下的填充孔)或加入到现有的创伤填充组合物中以加速创伤愈合。在另一个实施方案中，培养基用基因工程细胞来调节以增加创伤愈合蛋白在培养基中的浓度。例如，细胞可以被工程化为表达基因产物例如上面列出的生长因子中的任一种。
C.出生异常、后天缺陷和外观缺陷的修复和修正
如上所公开的，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物还可以用于修复和修正各种异常(先天的和后天的两者)以及外观缺陷(表面的和侵入性的两者)。在一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于治疗或防止细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；和/或改善肤色、纹理和/或紧致度。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于使皮肤饱满和/或使皮肤变亮和/或发亮。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；和/或改善皮肤紧致度、弹性和/或回弹性。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于使皮肤上的细纹光滑、紧致和/或填充。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于减淡眼睛下方黑眼圈的外观。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于改善嘴唇纹理和/或病状，增强自然唇色，和/或增加唇量。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于促进手术后皮肤的上皮形成和/或恢复皮肤的屏障和/或湿度平衡。在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用于改善老年斑的外观和/或色素沉着。
例如，包含本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的组合物可以任何形式被加入，且可以用在水凝胶、血管注射剂、霜剂、软膏剂中，且甚至可以加入到眼影膏、饼状化妆品(pancake makeup)、粉饼或局部地加强皮肤的其他化妆品。
在另一个实施方案中，进行经代谢的经调节的生长培养基的通过任何已知的方法例如注射、口服等的局部应用以逆转和/或防止皱纹和由例如UV光、暴露于各种污染物和正常老化引起的许多有害作用。
另外，在另一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物用于减少细胞老化和抑制造成皮肤癌的因子的活性。在实施例中示出经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物具有抗氧化活性。再次，应用到哺乳动物可以是通过任何已知的方法例如注射、口服等的局部应用。申请人已经发现，注意到在暴露于申请人的经代谢的经调节的生长培养基的人角质形成细胞中约50百分数的胞内氧化的统计学上显著的(p＜0.003)下降。
因此，除了在体外诱导表皮和真皮细胞增殖和胶原分泌之外，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物具有抗氧化活性。参见实施例18。
该无菌的富集营养液表示容易地大量可得到且可以用作各种皮肤、化妆品和皮肤病产品的添加剂以补充人皮肤、毛发和指甲中的生长因子和基质分子的水平的生物工程药妆。产品被设想为与α羟基酸去角质一起使用以潜在地优化生长因子和其他生物分子渗透入皮肤中和与化学换肤一起使用以潜在地加速愈合和减少炎症。
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以被配制用于消除皱纹、皱眉线、瘢疤形成和其他皮肤病状，代替使用硅氧烷或其他产品来这样做。经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含生长因子和炎性媒介物的活性，例如诸如VEGF、HGF、IL-6、IL-8、G-CSF和TFGβ，以及胞外基质蛋白例如I型和III型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白、葡糖氨基葡聚糖、酸性和碱性FGF、TGF-α和TGF-β、KGF、蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、β聚糖、多配体蛋白聚糖和可用于修复身体异常和外观缺陷的各种其他分泌的人真皮基质蛋白。
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以被配制成可注射制剂。可选择地，源自经调节的培养基的产物可以被配制。例如，生物活性物质(例如蛋白和药物)可以合并到本公开内容的组合物中，用于在注射组合物之后释放或控制释放这些活性物质。示例性的生物活性物质可以包括组织生长因子，例如TGF-β和促进在注射部位处愈合和组织修复的类似物。产物纯化的方法包括(但不限于)经调节的培养基的使用基质例如
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的凝胶色谱法、离子交换、使用不溶性基质例如交联琼脂糖的金属螯合物亲和色谱法、HPLC纯化、疏水相互作用色谱法。这样的技术被更详细地描述在上文的Cell & Tissue Culture；Laboratory Procedures，supra；Sanbrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Lab Press，Cold Spring Harbor，NY。
在可注射的实施方案中，使用水性悬浮液，且水性悬浮液的制剂可以具有生理pH(即，约pH6.8至7.5)。另外，局部麻醉剂例如利多卡因(通常以按重量计约0.3％的浓度)通常被加入以减少注射之后的局部疼痛。最终制剂还可以包含流体润滑剂例如麦芽糖，其必须是身体耐受的。示例性的润滑剂组分包括甘油、糖原、麦芽糖等。有机聚合物基础材料例如聚乙二醇和透明质酸以及非纤维状胶原(优选地琥珀酰化的胶原)还可以作为润滑剂。这样的润滑剂通常用于改善注射的生物材料在注射部位处的注射能力、入侵能力和分散，且用于通过修改组合物的粘度来减少掺加的量。根据定义，最终制剂是药学上可接受的载体中的经加工的经代谢的经调节的生长细胞培养基。
随后，将本公开内容的经加工的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物放在注射器或其他注射设备中，用于将本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物精确放置在组织缺陷的部位处。在用于真皮增大的制剂的情况下，术语“可注射的”意指制剂可以在正常条件下在正常压力下在没有实质掺加下从具有低至25的量规的注射器被分配。掺加可以造成组合物从注射器流出而不是被注射入组织中。对于该精确放置，细至27量规(200μI.D.)或甚至30量规(150μI.D.)的针是期望的。可以通过这样的针挤出的最大粒度将是至少以下的复合函数：颗粒最大尺寸、颗粒长宽比(长度：宽度)、颗粒刚性、颗粒表面粗糙度和影响颗粒：颗粒粘附的相关因素、悬浮流体的粘弹性质、和流过针的速率。悬浮在牛顿流体中的硬的球形珠表示最简单的情况，而在粘弹性流体中的纤维状或枝状颗粒可能是更复杂的。
在用于制备公开内容的可注射的分泌的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的工艺中的上述步骤优选地在无菌条件下使用无菌材料进行。药学上可接受的载体中的本公开内容的经加工的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以被皮内或皮下注射以增加软组织，以修复或修正出生缺陷、后天缺陷或外观缺陷。这样的病状的实例是出生缺陷，例如半侧面部肢体发育不良、颧骨和颧发育不全、单侧乳房发育不全、凹陷胸、胸大肌发育不全(波兰氏异常)和腭咽闭合不全、继发腭裂修复或粘膜下腭裂(由于咽后植入)；后天缺陷(外伤后、手术后、感染后)，例如凹陷瘢痕、皮下萎缩(例如，继发盘状红斑狼疮)、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷眼球内陷(并且上沟综合征)、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病和单侧声带麻痹；和外观缺陷，例如眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷和乳房发育不全。本公开内容的组合物还可以被注射到内部组织，例如界定身体括约肌的组织，以增大这样的组织。
用于调节培养基的其他组织类型包括但不限于骨髓、皮肤、上皮细胞和软骨，然而，应清楚地理解，三维培养系统可以与其他类型的细胞和组织一起使用。
可选择地，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以与如在关于创伤治疗的先前部分中所描述的可聚合的或交联水凝胶一起被配制。
D.药物应用
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含各种有用的药物因子和组分例如生长因子、调节因子、肽激素类、抗体等，如在整个说明书中所描述的，且因此可用于各种药物应用。并且，可以被加入的产品包括(但不限于)抗生素、抗病毒素、抗真菌剂、类固醇、镇痛药、抗肿瘤药、将与经调节的培养基中的因子导致互补或协同作用的试验药或任何化合物。如先前所讨论，在无菌条件下培养细胞，和回收培养基。另外，培养基可以针对病原体被测试。如果进行灭菌，则灭菌必须以最低限度地影响如上所描述的所需的生物活性的方式进行。培养基可以被进一步加工以浓缩或减少包含在培养基内的一种或多种因子或组分，例如，使用免疫亲和色谱法富集生长因子，或相反地，除去较不希望的组分，用于如其中描述的任何给定的应用。在优选的实施方案中，制剂从通过三维细胞构建体调节的培养基制备。三维培养物产生以最佳的生理比率和浓度分泌到培养基中的大量生长因子和蛋白。参见(例如)表2。因此，培养基提供接近地表示体内发现的那些的因子和指定比率的独特组合。在该应用中，牛血清通常不是优选的。可以优选的是除去细胞碎屑或其他特定的物质以及蛋白酶、乳酸和可能对细胞生长有害的其他组分。
通常由本领域技术人员采用的测定可以用于测试一种或多种特定因子的活性，由此确保可接受的生物活性水平(例如，治疗上有效的活性)由附接分子或封装分子保留。
因此，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物和源自培养基的产物可以用于(例如)提供用于治疗糖尿病的胰岛素、用于治疗阿尔茨海默病的神经生长因子、用于治疗血友病的因子VIII和其他凝血因子、用于治疗帕金森病的多巴胺、经由肾上腺嗜铬细胞用于治疗慢性疼痛的脑啡肽、用于治疗肌肉萎缩的抗肌萎缩蛋白、和用于治疗异常生长的人生长激素。
这样的治疗蛋白剂的剂量是本领域技术人员熟知的且可以见于药物书籍，例如the PHYSICIANS DESK REFERENCE，MedicalEconomics Data Publishers；REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，Mack Publishing Co.；GOODMAN & GILMAN，THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，McGraw HillPubl.，THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK，Williams and WilkensPublishers。
上述药物或剂中的任何的治疗上有效的剂量可以常规上使用本领域技术人员熟知的技术来确定。“治疗上有效的”剂量是指足以导致正被治疗的过程和/或疾病的至少一种症状的改善的化合物的量。
药物的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过(例如)用于确定LD50(50％种群致死的剂量)和ED50(在50％种群中治疗上有效的剂量)的标准药物程序来确定。在有毒作用和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数且其可以被表示为比率LD50/ED50。展示大的治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用展示有毒副作用的化合物，但应谨慎设计将这样的化合物靶向受影响的组织部位的递送系统，以便最小化对未被感染的细胞的潜在损伤且由此减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于阐明用于人的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以在该范围内变化，取决于采用的剂量形式和利用的施用途径。对于用于本公开内容的方法中的任何化合物，治疗上有效的剂量可以最初从细胞培养测定估计。包括IC50(即，实现症状的最大抑制的一半的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围如在细胞培养中确定的。这样的信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。血浆中的水平可以(例如)通过高效液相色谱法来测量。
另外，细胞和组织可以被基因工程为增强所需的产物(例如)诸如胰岛素的表达、和/或表达核苷酸序列和/或目标为上面列出的基因产物的部分，例如核酶、反义分子和三螺旋，其可以对目标基因表达和/或活性具有抑制作用。当培养组织时这可以是有利的，其中培养基中的特殊的基质细胞可以起到特定的结构/功能作用，例如，神经组织的神经胶质细胞、肝的库柏法细胞等。
E.毛发生长的刺激
培养基可以使用(例如)人毛乳头细胞来调节。优选地，由这样的细胞调节的培养基以三维生长。毛乳头细胞是在毛发形成、生长和恢复中起到关键作用的间充质干细胞的类型(Matsuzaki等人，WoundRepair Regen，6：524-530(1998))。随后代谢的经调节的生长培养基优选地被浓缩和作为局部制剂而被应用。经代谢的经调节的培养基组合物可以使用促进化合物渗透到皮肤中的剂(例如DMSO)来配制用于局部应用且作为用于刺激毛发生长的局部应用而被应用。
本公开内容的组合物当被局部应用时通过提供增加上皮细胞迁移到毛囊的因子而促进或恢复毛发生长。除了经代谢的经调节的培养基中发现的因子之外，可以使用其他化合物(例如米诺地尔和抗生素)。在毛发生长期间，在毛发生长中期(在生长阶段和静止阶段之间的毛囊的过渡阶段)和毛发生长终期(静止阶段)期间血液供给减少。源自经代谢的经调节的细胞培养基的生物活性分子可以在毛发生长的这些阶段期间使用本领域已知的测定来确定和优化用于使用，所述则定包括男性型脱发的残尾猕猴模型，参见例如，Brigham，P.a.，A.Cappas和H.Uno，The Stumptailed Macaque as a Model forAndrogenetic Alopecia：Effects of Topical Minoxidil Analyzed by Use ofthe Folliculogram，Clin Dermatol，1988，6(4)：第177-87页；Diani，A.R.和C.J.Mills，Immunocytochemical Localization of Androgen Receptorsin the Scalp of the Stumptail Macaque Monkey，a Model of AndrogeneticAlopecia，J Invest Dermatol，1994，102(4)：第511-4页；Holland，J.M.，Animal Models of Alopecia，Clin Dermatol，1988，6(4)：第159-162页；Pan，H.J.等人，Evaluation of RU58841as an Anti-Androgen in ProstatePC3Cells and a Topical Anti-Alopecia Agent in the Bald Scalp ofStumptailed Macaques，Endocrine，1998，9(1)：第39-43页；Rittmaster，R.S.等人，The Effects of N，N-diethyl-4-methyl-3-oxo-4-aza-5alpha-androstane-17beta-carboxamide，a5alpha-reductase Inhibitor andAntiandrogen，on the Development of Baldness in the StumptailMacaque，J.Clin Endocrinol Metab，1987，65(1)：第188-93页(它们中的每一个通过引用以其整体并入)。另外的模型包括测量从光秃的和多毛的区域培养的囊的毛囊增殖的差异、新生大鼠模型以及斑秃的大鼠模型，参见，Neste，D.V.，The Growth of Human hair in Nude Mice，Dermatol Clin.，1996，14(4)：第609-17页；McElwee，K.J.，E.M.Spiers，和R.F.Oliver，In Vivo Depletion of CD8+T Cells Restores Hair Growthin the DEBR Model for Alopecia Areata，Br J Dermatol，1996，135(2)：第211-7页；Hussein，A.M.，Protection Against CytosineArabinowide-Induced Alopecia by Minoxidil in a Rat Animal Model，IntJ Dermatol，1995，34(7)：第470-3页；Oliver，R.F.等人，The DEBR RatModel for Alopecia Areata，J Invest Dermatol，1991，96(5)：第978页；Michie，H.J.等人，Immunobiological Studies on the Alopecic(DEBER)Rat，Br J Dermatol，1990，123(5)：第557-67页(它们中的每一个通过引用以其整体并入)。
V.其他用途
A.食物添加剂和饮食补充物
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用作食物添加剂且被配制入饮食补充物中。本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以包含许多有用的营养素，包括单种食品或商品组中没有发现的丰富和多样的必需氨基酸、矿物和维生素。本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用作平衡营养补充物的廉价来源，平衡营养补充物用于重量减轻或可选择地用于增强食物的营养含量，特别地用于第三世界国家。本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物是无菌的且不含人病原体污染物(即，无菌的)。本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以被浓缩和/或冻干且优选地以胶囊剂或片剂被施用摄取。可选择地，组合物可以被直接加入到成人或婴儿食品中以增强营养含量。营养素的该丰富源可以被相对便宜地加工，且对于营养不良的老年人且尤其是对于发展中国家的儿童可以是无价的，发展中国家中由于对感染的差的响应而增加的死亡率已经与营养不良相关联。
另外，许多微量成分(例如铁和镁)对于哺乳动物生存和繁殖是关键的，且所关心的是，边际微量元素缺乏可以是公共健康问题。已经建议摄取各种必需微量营养素来通过修改致癌作用的具体阶段而减少感染以及发癌率。微量营养素还增强免疫系统的功能活性和其T细胞和B细胞、
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和NK细胞的相互作用机理，特别地通过增强各种细胞因子的生产以促进它们对入侵病原体的吞噬细胞的和细胞毒素的作用和/或破坏各个重要器官中的出现的癌变前细胞。参见，Chandra，R.K.编辑(1988)，Nutrition and Immunology.ContemporaryIssues in Clinical Nutrition，Alan R.Liss，New York。因此，对平衡营养素的相对廉价的源存在需求。用于富集有经调节的培养基的理想食品是面包、谷物和其他谷类产品例如食用面糊、饼干等。此外，经代谢的培养基可以被进一步加工以浓缩或减少包含在培养基内的一种或多种因子或组分，例如，使用免疫亲和色谱法富集生长因子，或相反地，除去较不希望的组分，用于如该部分中所描述的任何给定的应用。
B.动物饲料补充物
本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物可以用作动物饲料的补充物。在一个实施方案中，本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物包含牛血清，牛血清提供蛋白和其他因子的源，所述蛋白和其他因子对于哺乳动物例如牛和其他反刍动物例如母牛、鹿等是有益的。培养基被针对病原体进行筛选且不含牛病原体和支原体。本公开内容的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物优选地从在美国饲养的母牛获得，使得病原体的可能性被显著减少。
在一个实施方案中，提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中经代谢的经调节的生长培养基是由酵母细胞代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，经调节的生长培养基通过在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基来制备。在一些实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在一些实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在其他实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在一些实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后、感染后发生的医疗病状或医疗程序后缺陷。
在其他实施方案中，提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在其他实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在一些实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在其他实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后、感染后发生的医疗病状或医疗程序后缺陷。
在其他实施方案中，提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。
在其他实施方案中，提供用于制备权利要求15至18中任一项所述的经代谢的经调节的生长培养基的工艺，该工艺包括：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
在一些实施方案中，将经代谢的经调节的生长培养基与可接受的载体组合。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％，组合物的按重量计约0.01％至约50％或组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在一些实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。
本文还提供了通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。
在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在一些实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。
在一个实施方案中，提供包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在一些实施方案中，组合物还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％，组合物的按重量计约0.01％至约50％，或组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一些实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在其他实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。
本文还提供了包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。
在一个实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一些实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％，组合物的按重量计约0.01％至约50％，或组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在。在一些实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在其他实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。
本文还提供了用于防止或治疗受试者中的病状的方法，该方去包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
在一个实施方案中，病状是外观缺陷、脱发、先天性缺陷或后天缺陷。在其他实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后、感染后发生的医疗病状或医疗程序后缺陷。在其他实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％，组合物的按重量计约0.01％至约50％，或组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在组合物中。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在其他实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，至少一种胞外基质蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％至约100％、约10％至约50％、或约60％至约100％。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白被COL4A1基因或PLOD1基因编码。在一个实施方案中，至少一种修复蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在另一个实施方案中，修复蛋白被上调约10％至约70％、约35％至约50％、或约25％至约50％。在另一个实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在另一个实施方案中，修复蛋白被FN1基因编码。在另一个实施方案中，至少一种细胞连接蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％至约200％、约10％至约80％、或约30％至约50％。在一些实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在其他实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。在一个实施方案中，至少一种抗氧化蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％至约300％、约10％至约50％、或约200％至约250％。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在其他实施方案中，抗氧化蛋白被SOD2基因编码。
本文还提供了用于防止或治疗受试者中的病状的方法，该力法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物：可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
(e)收集经代谢的细胞提取物。
在一些实施方案中，病状是外观缺陷、脱发、先天性缺陷或后天缺陷。在一些实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后、感染后发生的医疗病状，或医疗程序后缺陷。在其他实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在一个实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在另一个实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在另一个实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001％至约95％，组合物的按重量计约0.01％至约50％，或组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在组合物中。在一个非限制性实例中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在组合物中。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一个实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在另一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，至少一种胞外基质蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％至约100％、约10％至约50％、或约60％至约100％。在又一个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被COL4A1基因或PLOD1基因编码。在一些实施方案中，至少一种修复蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，修复蛋白被上调约10％至约70％、或约25％至约50％。在另一个实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在另一个实施方案中，修复蛋白被FN1基因编码。在一个实施方案中，至少一种细胞连接蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在另一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％至约200％、约10％至约80％、或约30％至约50％。在另一个实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在另一个实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。在一个实施方案中，至少一种抗氧化蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％至约300％、约10％至约50％、或约200％至约250％。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在又一个实施方案中，抗氧化蛋白被SOD2基因编码。
实施例
实施例1：成纤维细胞单层细胞培养物
从人包皮分离的正常人真皮成纤维细胞在150cm2组织培养瓶(Corning，Corning，N.Y.)中以单层培养使用补充有10％小牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，Utah)、非必需氨基酸(GibcoBRL)和100U/ml青霉素-链霉素-250ng/ml两性霉素B(GibcoBRL)的预调节的细胞培养基(在该实施例中，高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；GibcoBRL，Grand Island，N.Y.)(“DMEM1”)在37℃、5％CO2培养箱中培养。单层培养每周被供给新鲜的预调节的培养基两次且每周使用1至10倍分裂传代，如所描述的。通常，参见Pinney等人，J.Cell.Physio.，183：7482(2000)。真皮成纤维细胞还可以在具有DMEM1的滚瓶中扩展。将来自这些单层培养的经调节的培养基收集并保存用于将来使用。
尽管成纤维细胞已经为了说明性的目的而被用于该实施例，但技术人员将理解，许多其他类型的细胞(例如但不限于)其他上皮细胞类型、内皮细胞、平滑肌细胞、肌细胞、角质形成细胞、软骨细胞等，可以以单层培养和以三维培养生长。
实施例2：调节培养基
将人真皮成纤维细胞在‘766专利中描述和以上详细描述的设备的基材上接种。基材在设计为利于在其表面上三维组织生长的套管内，且在封闭系统中在高葡萄糖DMEM(补充有2mM L-谷氨酸盐和50mg/ml抗坏血酸的10％BCS)中在37℃下在湿润的5％CO2气氛下培养细胞。在10天之后，除去细胞培养物，加入新鲜培养基。将细胞培养另外的4天，如上所述。然后，将已经暴露于细胞和组织培养物持续四天(第10-14天)的所得到的经调节的培养基从单个室除去并集中。将经调节的培养基(约5至10升/池)分配成200ml等分试样且使用带有具有10,000截留分子量的过滤器的正压浓缩装置(Amicon，Beverly，MA)进一步浓缩10至20倍。将所得到的10至20ml浓缩的经调节的培养基分配成1ml等分试样并在-20℃下冷冻，用于分析。1X浓度的经调节的培养基由作为10％(vol/vol)溶液加入到基础培养基的10X经调节的培养基产生。同样地，1X浓度的“培养基”或“无血清培养基”由作为10％(vol/vol)溶液加入到基础培养基的10X培养基(即，基础培养基)或10X无血清培养基(不含血清的基础培养基)产生，然后用作对照。
实施例3：经代谢的经调节的生长培养基的制备
a.有机体和培养基
巴斯德毕赤酵母(野生型菌株)用作用于发酵工作的酵母细胞培养物。将储用培养物维持在酵母-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂平板上。使母体储用培养物在YPD肉汤中生长并维持在-20℃。发酵在酵母氮源(YNB)生长培养基中进行并补充有包含2.7％H3PO4、0.09％CaSO4、1.8％K2SO4、1.5％MgSO4、0.41％KOH、4％甘油的甘油(SigmaSt.Louis，MO)。调节生长培养基由SkinMedica(California)供应。
b.发酵罐
使用酵母的标准生长条件将发酵工艺放大至2L和15L发酵阶段(2L New Brunswick Scientific，Edison NJ和15L ApplikonBiotechnology Foster City CA)。
c.经调节的生长培养基代谢条件
补料分批培养物在29℃下在酵母氮源(YNB)生长培养基中生长并补充有甘油(2.7％H3PO4、0.09％CaSO4、1.8％K2SO4、1.5％MgSO4、0.41％KOH、4％甘油)。通过用2M NH4OH滴定将pH保持恒定在5.0±0.5。溶解氧水平通过消毒的DO探针来测量，且通过调节搅拌速度在100和600rpm之间使氧饱和度保持在30％。通过在酵母的活跃生长期期间把液体培养基注入发酵罐中来将经调节的生长培养基作为营养补充物引入发酵工艺。补料分批工艺在巴斯德毕赤酵母的对数生长期期间开始。生长通过在发酵期间监测巴斯德毕赤酵母的光密度来测量。进行发酵，直到达到经调节的生长培养基被巴斯德毕赤酵母代谢的时间，如通过巴斯德毕赤酵母的生长期从对数期变化至稳定期测量的。发酵可以进行至完成，其中经调节的生长培养基被完全代谢，或可以被部分发酵，即，被部分代谢。
在组合经代谢的经调节的生长培养基与合适的媒介物之前，可以浓缩、过滤和/或纯化经调节的生长培养基。
实施例4：经代谢的细胞提取物的制备
a.细胞提取物
全细胞提取物从动物细胞或植物细胞(例如)通过技术人员已知的任何方法来获得。
b.有机体和培养基
巴斯德毕赤酵母(野生型菌株)用作用于发酵工作的酵母细胞培养物。将储用培养物维持在酵母-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂平板上。使母体储用培养物在YPD肉汤中生长并维持在-20℃。发酵在酵母氮源(YNB)生长培养基中进行并补充有包含2.7％H3PO4、0.09％CaSO4、1.8％K2SO4、1.5％MgSO4、0.41％KOH、4％甘油的甘油(SigmaSt.Louis，MO)。
b.发酵罐
使用酵母的标准生长条件将发酵工艺放大至2L和15L发酵阶段(2L New Brunswick Scientific，Edison NJ和15L ApplikonBiotechnology Foster City CA)。
c.细胞提取物代谢条件
补料分批培养物在29℃下在酵母氮源(YNB)生长培养基中生长并补充有甘油(2.7％H3PO4、0.09％CaSO4、1.8％K2SO4、1.5％MgSO4、0.41％KOH、4％甘油)。通过用2M NH4OH滴定将pH保持恒定在5.0±0.5。溶解氧水平通过消毒的DO探针来测量，且通过调节搅拌速度在100和600rpm之间使氧饱和度保持在30％。通过在酵母的活跃生长期期间把液体培养基注入发酵罐中来将细胞提取物作为营养补充物引入发酵工艺。补料分批工艺在巴斯德毕赤酵母的对数生长期期间开始。生长通过在发酵期间监测巴斯德毕赤酵母的光密度来测量。进行发酵，直到达到细胞提取物被巴斯德毕赤酵母代谢的时间，如通过巴斯德毕赤酵母的生长期从对数期变化至稳定期测量的。在组合经代谢的细胞提取物与合适的媒介物之前，可以浓缩、过滤和/或纯化细胞提取物。
d.三维经调节的培养基的增殖活性
可以任选地检查实施例2-4的经调节的培养基和经代谢的经调节的生长培养基以及经代谢的细胞提取物的促进人成纤维细胞和角质形成细胞的增殖的能力。将人成纤维细胞或人基底角质形成细胞接种到96孔板中(～5,000细胞/孔)并在补充有1X最终浓度的无血清培养基、培养基、或上面在实施例2-4中描述的三维经调节的培养基、经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物的高葡萄糖DMEM(补充有2mM L-谷氨酸盐和1X抗生素/抗霉菌素的10％BCS)中培养。将培养物维持在37℃下在湿润的5％CO2气氛中3天。
细胞增殖使用商购的、基于荧光的染料测定(CyQuant CellProliferation Assay Kit，Molecular Probes，Eugene，Or)来测量，基于荧光的染料测定测量总核酸含量作为细胞增殖的估值。所有测定根据制造者的使用说明来进行。通过印迹法除去培养基，且使用包含绿荧光染料、CyQuant GR染料的裂解缓冲液来使细胞溶解。染料当结合至细胞核酸时展示强的荧光增强且荧光量与存在样品中的核酸的量成比例。在不存在光下将样品温育5分钟，且使用具有适合于～480nm激发和～520nm发射最大值的滤波器的微量滴定板读数器来确定样品荧光。每一种样品中的核酸的量通过将每一个孔中的观察到的荧光的量与使用已知浓度的作为标准品的小牛胸腺DNA得到的标准曲线进行比较来计算。
图3中示出示例性的结果，其中当相比于两个对照时，在包含经调节的培养基的培养基中培养的细胞导致成纤维细胞和角质形成细胞两者的细胞增殖增加。
实施例5：通过经代谢的经调节的生长培养基将胶原沉积调节到 组织中
a.创伤愈合应用
经代谢的经调节的生长培养基对三维组织的制备和组成的影响通过测量分泌到在无血清培养基、培养基或三维经调节的培养基的存在下培养的组织的胞外基质中的胶原的量来检查。
将尼龙支架激光切割成11mmx11mm正方形，在0.5M乙酸中洗涤，在FBS中大面积冲洗，且用12F临床成纤维细胞以传代8(～38，000/cm2)接种。培养物在补充有1X最终浓度的如上所述的无血清培养基、培养基、或经代谢的经调节的生长培养基外加每一次进料时的50mg/ml抗坏血酸盐的1ml DMEM(补充有2mM L-谷氨酸盐和1x抗生素/抗霉菌素的10％BCS)中生长。硫酸铜被加到2.5ng/ml的最终浓度，且通过标准培养箱的经调节的充气维持高氧(40％、约两倍大气的)。将培养物(n＝3或更大)维持在37℃下在湿润的5％CO2气氛中10天。还不包括抗坏血酸盐对照。
b.胶原分离
从在补充有1X最终浓度的上面所述的无血清培养基、培养基或经代谢的经调节的生长培养基的基础培养基的存在下生长的三维组织培养物将胶原分离和纯化至接近均匀性。最终样品制剂的纯度通过以下来评估：使纯化的胶原样品在梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上经历电泳，使用考马斯蓝肉眼观察分离的蛋白带，和评估胶原特有的α带、β带和γ带相比于总蛋白的量(下面)。纯化方法应在所有样品中产生相似的图案。
将样品在PBS中冲洗，然后在无菌水中冲洗，随后在0.5M乙酸中冲洗2-6小时。然后将样品在0.012N HCl中的1mg/ml胃蛋白酶(Worthington，Inc.)中在4℃下消化过夜。通过在4℃下以13000rpm离心使样品澄清。在将5M NaCl加入成0.7M的最终浓度之后，使胶原在4℃下沉淀30-60分钟。沉淀的胶原通过在4℃下以13000rpm离心30至60分钟而分离，并被再悬浮在0.012N HCl中。
c.分析
总蛋白使用商购的比色测定试剂盒(Pierce，Inc.BCA测定试剂盒)来确定，且根据制造者的使用说明进行测定。牛皮肤胶原用作标准品(InVitrogen，Carlsbad，CA；Cohesion Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)，用于定量总蛋白。
然后，使样品(10mg)经历在3-8％梯度凝胶上电泳的SDS-PAGE分析。然后，将分离的胶原的样品在减少样品缓冲液中加热至95℃。凝胶用考马斯蓝染色，脱色，和计算机扫描用于显像。
胶原在体内的增强的沉积具有许多应用，包括创伤愈合、随年龄增加而出现的皱纹和轮廓线的治疗、以及能够促进基质沉积在对瘫痪的或卧床不起的患者中的压力性溃疡敏感的骨性突起上。
实施例6：评估经代谢的经调节的生长培养基的体内影响的闭塞 贴片试验
a.实验设计：
六名健康的知情成年女性(30-60岁)参加。排除标准包括对蛋白的敏感性、皮肤病、测试部位中或附近的受损皮肤、糖尿病、肾病、心脏病或免疫病，使用抗炎药、免疫抑制药、抗组胺剂或局部用药品或化妆品，以及妊娠。根据轮流方案将测试制品分配至每一个受试者的右或左前臂上的测试部位(2个部位，3.8cm2)以最小化位置或顺序偏差。部位1被指定用于媒介物对照，且部位2用于治疗(即，经代谢的经调节的生长培养基)。闭塞贴片是具有0.2ml媒介物或治疗的Webril非织造棉花垫。贴片被3M闭塞的、塑料的、低变应原带覆盖和保持。闭塞贴片每日被定位在3个受试者的前臂，持续5个连续的24小时时间。剩下的3受试者每日被贴上12个连续的24小时时间。在最后的贴剂应用之后的那天，从每一个部位取出2-mm活组织切片。该方案由IRB批准用于研究组织，加利福尼亚皮肤研究所(San Diego，Ca.)，且根据CFR的标题21，第50和56部分。
b.评估：
大体观察被分级为发亮、剥落、成疤、裂开、色素沉着过多和色素减退。刺激在视觉上使用5点等级来计分且在数字上分级为红斑、水肿、丘疹和小泡(＞25％贴剂部位)以及可识别的反应(＜25％贴剂部位)，即，具有或不具有渗出、扩展和硬结的大疱反应。由委员会认证的病理学家进行的H&E组织学评估包括以下参数：有活力的表皮厚度，表皮增生(棘层肥厚)、颗粒细胞层厚度、炎性渗透物、有丝分裂象、胶原和弹性纤维的外观、以及脉管系统。
实施例7：人内皮细胞行为的调节
确定经代谢的经调节的生长培养基对血管生成和内皮细胞运动性的影响。经代谢的经调节的生长培养基被浓缩(10X)或冻干。
a.内皮细胞小管形成测定
使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的内皮细胞小管形成测定用于评估血管生成。
b.伤害测定
内皮细胞的汇合层被擦伤且所产生的“创伤”的闭合速度被测量用于评估细胞运动性。“伤害”测定被测量为以mm/h(毫米/小时)计的闭合速度。
实施例8：酵母提取物的制备
a.有机体和培养基
酵母细胞培养物从ATCC获得(巴斯德毕赤酵母#60372)。将储用培养物维持在酵母-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂平板上。使母体储用培养物在YPD肉汤中生长并维持在-20℃。发酵在酵母氮源(YNB)生长培养基中进行并补充有包含2.7％H3PO4、0.09％CaSO4、1.8％K2SO4、1.5％MgSO4、0.41％KOH、4％甘油的甘油(Sigma St.Louis，MO)。在整个工艺中使用防沫剂sigma-乳液B(Sigma，St.Louis，MO)。
b.发酵罐
在经由摇瓶试验优化处理之后，将工艺放大至2L和15L发酵阶段(2L New Brunswick Scientific，Edison NJ和15L ApplikonBiotechnology Foster City CA)。
c.应激状态
补料分批培养物在29℃下在酵母氮源(YNB)生长培养基中生长并补充有甘油(2.7％H3PO4、0.09％CaSO4、1.8％K2SO4、1.5％MgSO4、0.41％KOH、4％甘油)。通过用2M NH4OH滴定将pH保持恒定在5.0±0.5。溶解氧水平通过消毒的DO探针来测量，且通过调节搅拌速度在100和600rpm之间使氧饱和度保持在30％。充气速率以IVVM设置。
实施例9：全厚度评估
在MatTek全厚度皮肤组织模型上测试上面所公开的经代谢的细胞提取物。该皮肤模型由以下组成：1)源自正常人的表皮角质形成细胞，其已经被培养形成人表皮的多层、高度分化的模型；和2)人成纤维细胞，其已经被接种到胶原基质中以形成真皮。在到达之后，组织在被使用之前被储存在4℃下。对于使用，将组织从琼脂糖航运托盘除去并放置入包含4ml测定培养基的6孔板中，且允许在37±2℃和5±1％CO2下平衡过夜。在过夜平衡之后，培养基用4ml新鲜的培养基替换，且50μl测试材料(即，经代谢的细胞提取物)然后被局部地应用到组织。然后将组织在37+2℃和5+1％CO2下温育24小时且随时间测量治疗的生理效应。
实施例10：脂质体封装的经代谢的经调节的生长培养基的制备
经代谢的经调节的生长培养基的样品合并到包括从大豆获得的磷脂和卵磷脂层的脂质体中。使用从Hydraulic EngineeringCorporation(Brea，California)获得的高压匀浆器将溶解产物与脂质体浆化在一起。乳白色混合物包含被脂质体组分封装的经代谢的经调节的生长培养基。
实施例11：麦芽糊精封装的经代谢的细胞提取物的制备
使用WO2003/068161中的方法学，将经代谢的细胞提取物的样品封装到麦芽糊精中并喷雾干燥以基本上提供麦芽糊精封装的经代谢的细胞提取物的无水粉末。
实施例12：油包水乳液
实施例阐明合并如上所公开的经代谢的经调节的生长培养基的高内相油包水乳液。
Figure BDA00003462061900951
实施例13：油包水霜剂
实施例阐明合并如上所公开制备的经代谢的经调节的生长培养基的油包水霜剂。
实施例14：含醇洗剂
实施例阐明合并如上所公开制备的经代谢的细胞提取物的含醇洗剂。
Figure BDA00003462061900962
实施例15：亚微米乳液浓缩物
实施例阐明包含如上所公开制备的经代谢的经调节的生长培养基的亚微米乳液浓缩物。
Figure BDA00003462061900963
Figure BDA00003462061900971
实施例16：经代谢的细胞提取物的稀释物
实施例阐明包含如上所公开制备的经代谢的细胞提取物的稀释物。
Figure BDA00003462061900972
实施例17：对正常人真皮成纤维细胞的人DNA微阵列研究
正常人真皮成纤维细胞被处理用于如下24小时暴露：(i)对照1：Nouricel(10X)，即，经调节的生长培养基(参见，例如实施例2)；(ii)对照2：毕赤酵母发酵滤液(20X)，即，酵母发酵提取物(参见实施例8)；(iii)部分发酵的Nouricel(20X)，即，部分代谢的经调节的生长培养基(参见实施例3)；和(iv)完全发酵的Nouricel(20X)，即，完全代谢的经调节的生长培养基(参见实施例3)。
结果在下面的表中呈现且被表示为在经处理的样品和未处理样品之间的中值的比率。中值＞1.3的比率表明强的上调且＜1.3表明基因的强的下调。
Figure BDA00003462061900981
来自第二测定的结果在下面的表中呈现且被表示为在经处理的样品和未处理样品之间的中值的比率。中值＞1.3的比率表明强的上调且＜1.3表明基因的强的下调。
Figure BDA00003462061900982
Figure BDA00003462061900991
在一个实施方案中，将经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物施用至受试者导致至少一种胞外基质蛋白的上调。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约25％至约50％。在其他实施方案中，胞外基质蛋白被上调约10％至约50％、或约60％至约100％。在又一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施方案中，被上调的胞外基质蛋白是胶原或赖氨酰基羟化酶蛋白。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被COL4A1或PLOD1编码。
在一个实施方案中，将经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物施用至受试者导致至少一种修复蛋白的上调。在一些实施方案中，修复蛋白被上调约5％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约25％至约50％。在其他实施方案中，修复蛋白被上调约10％至约70％。在一些实施方案中，修复蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在一些实施方案中，修复蛋白被FN1编码。
在一个实施方案中，将经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物施用至受试者导致至少一种细胞连接蛋白的上调。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％至约200％。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约10％至约80％。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被上调约30％至约50％。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％或约200％。在其他实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。
在一个实施方案中，将经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物施用至受试者导致至少一种抗氧化蛋白的上调。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％至约300％、约5％至约200％、约5％至约150％、约5％至约100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约25％至约50％。在其他实施方案中，抗氧化蛋白被上调约10％至约50％、或约200％至约250％。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约250％或约300％。在一些实施方案中，被上调的抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶。在一些实施方案中，被上调的抗氧化蛋白被SOD2编码。
实施例18：体外和临床研究
患者和方法
方法：体外研究
基因阵列分析
将人真皮成纤维细胞接种到96孔板(细胞毒性测定)或接种到T-25烧瓶(细胞因子阵列)并在37±2℃和5±1％CO2下使用成纤维细胞生长培养基(FGM)生长。使用MTT测定来确定每一种测试材料的安全工作浓度。在达到融合之后，用测试材料处理细胞24小时。在24小时处理之后，使用
Figure BDA00003462061901011
试剂盒(Ambion)按照制造者的使用说明来分离总RNA。在纯化之后，总RNA通过以下来制备用于阵列使用：首先使用MessageAmpTM aRNA试剂盒(Ambion)扩增RNA，然后以Cy3或Cy5使用ASAP标记试剂盒(Perkin Elmer)来荧光标记aRNA，两者均按照制造者的使用说明。将荧光标记的aRNA应用到DNA微阵列芯片(Agilent Technologies)，且按照制造者的推荐方案使芯片杂交过夜并洗涤。在洗涤之后，微阵列用Axon GenePix4100A扫描仪来扫描并用GenePix Pro软件分析。微阵列的荧光强度受到整体归一化。两种染料的总荧光信号用将使两种染料的总强度的比率等于一的校正因子归一化。对于该研究，大于1.3或小于0.7(这涉及至少30％的基因表达的变化)的Cy3/Cy5(未处理的/经处理的)荧光强度比率分别用作上调和下调基因的截止值。此外，基因标记物的荧光强度必须大于背景强度。
蛋白阵列分析
将人真皮成纤维细胞接种到96孔板(细胞毒性测定)或接种到T-25烧瓶(细胞因子阵列)并在37±2℃和5±1％CO2下使用成纤维细胞生长培养基(FGM)生长。使用MTT测定来确定每一种测试材料的安全工作浓度。在达到融合之后，用测试材料处理细胞24小时，之后，使用细胞因子阵列(Ray Biotechnology)评估释放到培养基中的细胞因子。微阵列用Axon GenePix4100A扫描仪来扫描并用GenePix Pro软件分析。
方法：12星期临床使用研究(组合产品)
12星期开放标记临床研究检查组合治疗血清在具有轻微到严重面部光损伤的受试者中的功效和耐受性。研究参与的标准包括在眼周区域具有临床上确定的轻微到严重的、细皱纹和粗皱纹的年龄为30至60岁的女性受试者(具有I-IV的Fitzpatrick Skin Phototype)。如果受试者在研究开始的3个月内已经使用局部用类维生素A，已经接受真皮填充物或肉毒杆菌毒素的注射或在6月内具有面部脱皮或具有面部重修程序或在研究开始的30天内在面部上使用其他形式的抗老化产品，则将她们从研究排除。还排除对面部产品方案具有已知的过敏反应的受试者。
指示受试者在她们的整个面部皮肤上应用治疗血清，每天两次(早晨和晚上)，持续十二个星期。除了治疗血清之外，受试者同意使用基础护肤方案，包括清洁剂、光保湿剂和防晒剂。受试者还同意不开始使用除了提供的材料之外的任何新的面部产品，达到研究的持续时间。
从IntegReview of Austin，Texas获得该开放标记、单中心研究的IRB许可。根据来自协调和良好临床实践的国际会议的伦理和管理原则进行研究。
在基线(第1次访问)、第4个星期(第2次访问)、第8个星期(第3次访问)和第12个星期(第4次访问)进行临床评估。在每一次访问进行以下程序。
功效评估：临床上使用十点等级对每一个受试者的右和左眼周区域上的细皱纹和粗皱纹分级(其中0＝无，0.5-3.5＝轻微，4-6.5＝适中，且7-9＝严重)。十点等级还用于评估皮肤触觉粗糙度(其中0＝光滑的，9＝粗造的)、肤色(0＝斑点的/不均匀的，9＝光亮的/均匀的)、皮肤紧致度(其中0＝皮肤呈现松弛和下垂，9＝皮肤呈现紧致)和皮肤发光度(0＝暗淡的/无光泽不光滑的，9＝明亮的/发光的/容光焕发的)。所有分级评估由相同的研究员在每一个访问时进行以确保分级一致性。
安全评估：在所有访问时通过报告不利事件和通过客观的和主观的评估来评估治疗产品的耐受性。客观刺激(红斑、水肿和脱皮)由研究员评估，而主观刺激(烧伤/刺痛、瘙痒和发麻)由受试者评估，全部使用4点等级(其中0＝无，1＝轻微，2＝适中，且3＝严重)。
标准化摄影术：使用侧光(标准色)取得受试者的左面部、右面部和前额面部视图的标准化数字图像。
自我评估问卷：受试者在第12星期完成自我评估问卷，当时她们以四点等级评定她们的面部皮肤状态和治疗血清的功效(强烈同意、同意、不同意、强烈不同意)。受试者以四点等级评定她们使用治疗血清的总满意度，其中1＝极好，2＝良好，3＝一般，且4＝差的。
统计学分析：使用学生配对t检验将第4、8和12星期的平均临床分级分数与平均基线分数相比。在p＜0.05水平，从基线的变化被认为是显著的。对于受试者自我评估问卷，积极回答者的发病率百分数被报告为治疗血清的功效和审美属性部分。
结果
结果：体外研究
在用Biometa复合物(酵母代谢的经调节的生长培养基)治疗人真皮成纤维细胞之后，分析基因表达谱，特别着重于抗老化级联中牵连的基因。以下表列出由Biometa复合物调节的一些关键基因：Biometa复合物刺激在胞外基质再生中涉及的许多基因。
另外，我们看到MMP(负责分解胶原和弹性蛋白的酶)的下调。该MMP下调使孔与TIMPS(MMP的天然抑制剂)的上调相关联。Biometa复合物还已经使维持皮肤的总体健康所必需的其他基因上调，包括应激蛋白(HSP)、抗氧化蛋白(SOD1)、和对于维持皮肤屏障(TJ1)来说重要的蛋白。
基于在治疗之后对释放到培养基中的蛋白的分析，Biometa复合物还刺激成纤维细胞以表达和合成已知在皮肤修复和重建模中涉及的关键蛋白(细胞因子、生长因子等)，包括bFGF(成纤维细胞生长因子)、TIMP-1(金属蛋白酶的组织抑制剂)、和VEGF(血管内皮生长因子)。该数据示出在基因表达和蛋白合成之间的良好相关性。这些结果表明Biometa复合物具有刺激成纤维细胞，由此减少老化迹象的能力。
结果：12星期临床使用研究
三十三个具有轻微到严重的、细的和粗的眼周皱纹的年龄为35-56岁的女性受试者加入并完成十二个星期研究。
在每日局部使用组合治疗血清两次之后，在第4、8和12星期，实现所有光老化参数的平均分数的统计学上显著的改善。研究员评估证明在第4星期细的和粗的眼周皱纹的平均分数的显著下降，且继续显著下降直到第12星期(全部P＜0.0001)，如图4所示。最值得注意的是，在第12星期，粗的眼周皱纹的平均分数减小30％。此外，皮肤紧致度、肤色、发光度和触觉粗糙度的平均分数反映从基线和全部随后继续的访问的相似的显著的和进展的改善(全部P≤0.02)，如图5和图6所描绘。尤其突出的是在早至第4星期实现的皮肤纹理的改善，由平均触觉粗糙度分数的显著下降(79.5％)示出(P＜0.0001)。
在第12星期的自我评估问卷中受试者回答强烈支持在研究员评估中观察到的改善，且超过85％的受试者顺利地回答所有的问题。图7中呈现在第12星期回答问卷中选择强烈同意或同意的受试者的百分数。
标准化数字照片(数据未示出)表示在每日使用组合治疗血清两次之后的临床响应的实例。简洁地，眼周的细皱纹和粗皱纹和肤色的改善在仅四星期的产品使用之后的49岁的老年白种人女性受试者中证明。此外，46岁的老年西班牙女性受试者在第4星期显示细的眼周皱纹、肤色、触觉粗糙度和发光度的可见的改善。46岁的老年朝鲜人/白种人女性受试者在四星期的产品使用之后呈现细的和粗的眼周皱纹和不均匀的肤色的看得见地改善。
组合治疗血清是充分耐受的，且没有在研究的过程期间报告的治疗相关的不利事件。在整个研究中水肿、脱皮、烧伤/刺痛、瘙痒和发麻的平均分数保持小于轻微(以0-4等级，所有分数＜0.09)。值得注意的是，红斑的平均分数在所有继续的访问中从基线减少，且在第8星期观察到统计学上显著的减少(P＜0.03)。
结论
该治疗血清为医师和患者提供了改善皮肤老化的迹象的独特的和有效的局部组合产品。
本公开内容在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，从前述描述和附图，对于本领域技术人员来说除了所描述的那些之外的各种修改将变得明显。这样的修改意图落在所附的权利要求的范围内。
本文引用各种出版物，其公开内容通过引用以其整体并入。

Claims (42)

1.一种局部组合物，包含：
a.经代谢的经调节的生长培养基；和
b.合适的媒介物，
其中所述局部组合物用于治疗或防止皮肤病状。
2.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述经代谢的经调节的生长培养基是由酵母细胞代谢的经调节的生长培养基。
3.根据权利要求1所述的局部组合物，其中所述经调节的生长培养基通过在足以满足使酵母细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养所述酵母细胞以形成经调节的生长培养基来制备。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的局部组合物，其中所述经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的局部组合物，其中所述经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10％、约15％或约20％的量存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的局部组合物，使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的局部组合物，还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的局部组合物，其中所述局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。
9.一种局部组合物，包含：
a.经代谢的细胞提取物；和
b.合适的媒介物，
其中所述局部组合物用于治疗或防止皮肤病状。
10.根据权利要求9所述的局部组合物，其中所述经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。
11.根据权利要求9或10所述的局部组合物，其中所述细胞提取物源自成纤维细胞。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的局部组合物，其中所述经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01％至约50％的量存在。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的局部组合物，其中所述经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10％、约15％、或约20％的量存在。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的局部组合物，还包括以下中的至少一种：水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的局部组合物，其中所述局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的局部组合物，其中所述组合物使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。
17.一种用于制备权利要求1至8中任一项所述的局部组合物的工艺，包括：
(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养所述细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去所述经调节的生长培养基；
(b)培养酵母细胞；
(c)将所述酵母细胞暴露于所述经调节的生长培养基；
(d)培养所述酵母细胞以使所述经调节的生长培养基的至少一部分代谢；
(e)收集经代谢的经调节的生长培养基；和
(f)组合所述经代谢的经调节的生长培养基与合适的媒介物。
18.根据权利要求17所述的工艺，其中在组合所述经代谢的经调节的生长培养基与合适的媒介物之前，将步骤(e)的所述收集的经代谢的经调节的生长培养基浓缩、过滤和/或纯化。
19.根据权利要求17或18所述的工艺，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
20.一种用于制备权利要求9至16中任一项所述的经代谢的细胞提取物的工艺，包括：
(a)提供细胞提取物；
(b)培养酵母细胞；
(c)将所述酵母细胞暴露于所述细胞提取物；
(d)培养所述酵母细胞以使所述细胞提取物的至少一部分代谢；
(e)收集所述经代谢的细胞提取物；和
(f)组合所述经代谢的细胞提取物与合适的媒介物。
21.根据权利要求20所述的工艺，其中在组合所述经代谢的细胞提取物与合适的媒介物之前，将步骤(e)的所述收集的经代谢的细胞提取物浓缩、过滤和/或纯化。
22.根据权利要求20或21所述的工艺，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母。
23.一种用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的包含权利要求1至16中任一项的局部组合物的组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
26.根据权利要求23至25所述的方法，其中至少一种胞外基质蛋白通过向受试者施用所述局部组合物而上调。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述胞外基质蛋白被上调约5％至约100％、约10％至约50％、或约60％至约100％。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述胞外基质蛋白被COL4A1基因或PLOD1基因编码。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中至少一种修复蛋白通过向受试者施用所述组合物而上调。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述修复蛋白被上调约10％至约70％、约35％至约50％、或约25％至约50％。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述修复蛋白是纤连蛋白。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述修复蛋白被FNl基因编码。
34.根据权利要求23至33中任一项所述的方法，其中至少一种细胞连接蛋白通过向受试者施用所述组合物而上调。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述细胞连接蛋白被上调约5％至约200％、约10％至约80％、或约30％至约50％。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述细胞连接蛋白是内披蛋白。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述细胞连接蛋白被IVL基因编码。
38.根据权利要求23至37中任一项所述的方法，其中至少一种抗氧化蛋白通过向受试者施用所述组合物而上调。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗氧化蛋白被上调约5％至约300％、约10％至约50％、或约200％至约250％。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述抗氧化蛋白被SOD2基因编码。
42.根据权利要求23-41中任一项所述的方法，其中所述方法使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。
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