KR20140012072A - 겔-캡슐화된 마이크로콜로니의 스크리닝 - Google Patents

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KR20140012072A
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Abstract

본 발명은 세포에서, 예컨대 하나 이상의 산업적으로 유용한 화합물 (예, 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산)을 생산하도록 유전자 변형된 미생물 세포에서, 상기 화합물의 생산을 검출하는데 유용한 방법과 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 세포를 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는 단계와 상기 하이드로겔 입자에서 상기 화합물을 검출하는 단계를 포함한다.

Description

겔-캡슐화된 마이크로콜로니의 스크리닝 {GEL-ENCAPSULATED MICROCOLONY SCREENING}
본 출원은 2011년 1월 28일자 미국 가출원번호 61/437,214의 "겔-캡슐화된 마이크로콜로니의 스크리닝" 및 2011년 5월 13일자 미국 가출원번호 61/486,211의 "미생물에서의 수-비혼화성 화합물의 생산을 검출하기 위한 방법 및 조성물"에 대한 우선권을 주장하며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 제공되는 조성물 및 방법은 통상적으로 산업적인 미생물의 이용에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 세포에서, 예를 들어 1종 이상의 화합물을 생산하도록 유전자 변형된 미생물 세포에서, 산업적으로 유용한 화합물 (예, 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산)의 생산을 검출하는데 유용한 방법과 조성물을 제공한다.
합성 생물학의 진보는, 재생가능한 소스로부터 바이오연료, 화합물 및 바이오물질 (biomaterial)을, 미생물을 통해 생산 스케일과 품질로서 생산할 수 있다는 기대를 가지게 하였다. 그러나, 공업적인 합성 생물학의 상업적인 성공은, 재생가능한 생산물의 생산 단가가 이의 대응되는 재생불가능한 카운터파트의 생산 단가와 맞먹거나 그 보다 효율적인지의 여부에 크게 좌우될 것이다. 이를 위해, 균주 조작 및 스크리닝 시도들은, 이상적으로는, 가능한 생산 공정 초기에 바람직한 균주 (예, 고수율 (기질 g 당 화합물 수 g), 고생산성 (수 g/L) 및/또는 생산율 (수 g/L/hr))를 동정하는 것을 목표로 한다.
숙주 세포 미생물은 생합성 유전자 또는 경로를 포함하도록 조작될 수 있으며, 이러한 경로를 통한 대사적 흐름이 고 생산 역가를 달성하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 항말라리아 약물인 아르테미시닌에 대한 전구체를 공업적으로 제조하기 위해 메발로네이트 (MEV) 대사 경로의 일부분 또는 전체를 과발현하도록 조작된 바 있다. 예컨대, Martin et al., Nat. Biotechnol. 21:796-802 (2003); Ro et al., Nature 440:940943 (2006); 및 미국 특허 7,172,886와 미국 특허 7,192,751을 참조하며, 이들 문헌의 내용들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
균주에서의 원하는 표현형의 조작은 대개 여러번의 대사 흐름의 조작, 분석 및 모델링을 포함하는 반복적인 프로세스로서 수행된다. 이러한 프로세스를 수행하는 동안에, 대사 흐름을 조절하기 위한 몇가지 방안들이 평가 및 최적화될 수 있으며, 그러한 것으로는 개별 경로 구성 인자들의 발현을 미세 조절하기 위한 이종의 프로모터의 병합, 최적화된 네트워크 및 경로에 대한 합리적인 설계, 및 랜덤 돌연변이 유발을 포함하는 방향성 진화적 전략 (directed evolutionary strategies)이 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
성능이 개선된 균주를 스크리닝하는 방법은, 이상적으로는, (1) 변형된 한 집단과 다른 집단에서 증대된 성능 개선을 식별할만큼 충분히 민감하고; (2) 세포에 내재되거나 또는 주변 배지로 배출되던지 간에, 재조합을 통해 생산된 이종 산물을 내인성 분자와 구별할 수 있을 만큼 특이적이며; (3) 한번에 다수의 변형된 균주 라이브러리를 스크리닝할 수 있을 만큼 견고하고; (4) 숙주에 그 생산이 대사적 충격을 주는 지에 대한 정보를 제공해준다. 후자는, 숙주에 이종 유전자들을 도입하여 발현시키면 대사적 불균형 및/또는 독성 대사산물의 축적이 이루어지는 경우일 수 있다. 이 시나리오에서는, 생산이 숙주의 생존성 감소를 댓가로 이루어지는 것인지를 아는 것이 유리하다. 아울러, 한가지 생산 집단과 다른 집단이 생물량(biomass)이 매우 다를 가능성을 고려하면, 세포 생물량에 따른 영향 또는 충격 없이도 재조합 산물을 특이적으로 검출하는 능력이 해당 균주의 수율, 생산 및/또는 생산율에 대한 더 정확한 정보를 제공해 줄 수 있다. 아울러, 공업적인 화합물이 숙주 세포에서 방출되는 경우, 스크리닝 방법에 추가적인 요건, 즉, 세포에서 생산되는 화합물의 양을 표현형을 발현시키는 근원 유전자형과 물리적으로 연결지어 유지하는 능력이 요구된다.
유세포 측정과 조합하여 세포 캡슐화 기법을 활용하는 당해 기술 분야의 다양한 방법들은 일반적으로 세포 라이브러리에서 세포에서 생산되는 마크로분자의 존재 또는 부재를 동정하는 것을 목표로 한다. 유세포 측정은 강력한 분석 기능을 갖추고 있어, 매우 빠른 속도로, 초 당 최대 40,000건의 속도로 세포 또는 입자를 분석할 수 있으므로, 이 기법은 세포 집단에 대한 신뢰성 있고 정확한 정량적 평가와 특정 세포를 선별하는데 이상적이다.
그럼에도 불구하고, 다른 균주에 비해 어떤 균주에서의 대사적 흐름의 미세한 개선을 식별하는 합성 생물학의 목표를 감안하면, 현행 기법들에 비해 더욱 민감하고, 믿을 수 있고, 견고하고, 효율적인 스크리닝 시스템과 방법들이 여전히 요구되고 있다. 특히, 동정 후, 숙주 세포의 생존성과 관계없이, 표현형과 유전자형 간의 연결을 유지하는 방식으로 재조합 단백질의 생산을 검출 및 정량화하는 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해소시키며, 또한 관련된 효과를 제공한다.
본 발명은 세포, 예컨대 1종 이상의 수-비혼화성 화합물을 더 높은 수율로 생산하도록 유전자 변형되고, 유전자 변형되지 않은 미생물 모 세포에 비해 지속성이 증가된 미생물 세포에서, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는데 유용한 방법과 조성물을 제공한다. 특히, 본원에 제공되는 방법은, "피코스크리닝(picoscreening)"으로도 지칭되는 방법으로서, 예컨대, 비제한적인 예로서, 이소프레노이드, 폴리케타이드, 지방산 및 이의 유도체 등의 공업적으로 유용한 수-비혼화성 화합물을 생산하도록 조작된 미생물을 스크리닝하기 위한 고성능의, 민감한, 정량적인 수단을 제공한다. 또한, 본원에 제공되는 방법은, 상기한 재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물을 증가된 수준으로 생산 및/또는 포함하는, 세포, 예컨대 재조합 세포 및 이의 클론 세포 집단의 동정, 선별 및 농화를 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 방법은 하이드로겔 입자에 세포를 캡슐화하는 단계, 및 상기 하이드로겔 입자 안에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다.
일부 구현예들에서, 검출 방법은 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료를 하이드로겔 입자와 접촉시키는 단계, 및 상기 하이드로겔 입자에서 상기 형광 염료를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 형광 염료는 Nile Red이다. 일부 구현예들에서, 상기 검출은 상기 하이드로겔 입자내 수-비혼화성 화합물의 양을, 상기 하이드로겔 입자내 세포 생물량의 양에 대해 정규화(normalization)하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 수-비혼화성 화합물, 예컨대 세포에서 생산되는 수-비혼화성 화합물을 보유할 수 있다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔은 아가로스 (agarose)를 포함한다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 1 mm 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 500 ㎛ 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 100 ㎛ 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 50 ㎛ 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 50, 45, 40, 35, 30 또는 25 ㎛이다.
본원에 제공되는 검출 방법에 대한 일부 구현예들에서, 캡슐화는 세포를 포함하는 하이드로겔 입자가 형성되는데 충분한 조건 하에 수계 하이드로겔 현탁물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 조건은 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 플루오로카본 오일과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 플루오로카본 오일은 불소계면활성제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 플루오로카본 오일과의 접촉은 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 플루오로카본 오일을 포함하는 미세유체 디바이스 (microfluidic device)에 로딩(loading)하는 것을 포함하며, 하이드로겔 현탁물은 상기 미세유체 디바이스의 T-정션에서 플루오로카본 오일과 접촉하며, 플루오로카본 오일과의 접촉으로 세포를 포함하는 비-수계 하이드로겔 입자가 만들어진다. 일부 구현예들에서, 검출 방법은 플루오로카본 오일로부터 하이드로겔 입자를 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 검출 방법은 검출 단계 전에 하이드로겔 입자 안에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 배양은 12 내지 24시간 동안 이루어진다.
일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물은 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드이다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물은 파르네신 (farnesene)이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 하나 이상의 메발로네이트 (MEV) 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물은 파르네신이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 1-데옥시-D-자일룰로스 5-다이포스페이트 (DXP) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 효모 세포는 이소펜티넬 피로포스페이트 (IPP)를 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 효모 세포는 IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 만들 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴크렐오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 세포는 폴리케타이드 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 효모 세포는 폴리케타이드 신타제 시스템 (PKS)을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, PKS는 모듈러 (modular) PKS이다. 일부 구현예들에서, PKS는 아로마틱(aromatic) PKS이다.
일부 구현예들에서, 세포는 지방산 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 효모 세포는 아세틸-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 재조합 효모 세포는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 세포에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 방법은, (a) 세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시키는 단계; (b) 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 플루오로카본 오일을 포함하는 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계로서, 상기 하이드로겔 현탁물이 미세유체 디바이스의 T-정션에서 상기 플루오로카본 오일과 접촉하며, 상기 플루오로카본 오일과의 접촉으로 세포를 포함하는 비-수계 하이드로겔 입자가 만들어지는 것인 단계; (c) 플루오로카본 오일을 하이드로겔 입자로부터 분리, 예컨대 세척하는 단계; (d) 하이드로겔 입자 안에서 세포를 배양하는 단계; (e) 상기 하이드로겔 입자를, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물과 직접 결합하는 형광 염료와 접촉시키는 단계; 및 (f) 상기 하이드로겐 입자에서 상기 형광 염료를 검출하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 하이드로겔 입자 안에 각 라이브러리 세포를 캡슐화하는 단계; 각 하이드로겔 입자 안에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 단계; 및 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 세포 라이브러리에서 재조합에 의해 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 수-비혼화성 화합물을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 클론 집단 또는 세포를 캡슐로 둘러싸고 있는 하이드로겔 입자 집단을 제공하는 단계; (b) 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 포함하는 하이드로겔 입자를 검출하는 단계; (c) 단계 (b)의 하이드로겔 입자로부터 세포 또는 세포의 클론 집단을 회수하는 단계; (d) 단계 (c)의 세포 또는 세포의 클론 집단을 재-캡슐화하는 단계; 및 (e) 단계 (a) - (c)를 반복하는 단계를 포함하는, 세포 집단에서 재조합에 의해 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포를 농화 (enriching)하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 플루오로카본 오일을 포함하는 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계로서, 상기 하이드로겔 현탁물은 미세유체 디바이스의 T-정션에서 상기 플루오로카본 오일과 접촉되며, 상기 플루오로카본 오일과의 접촉으로 세포를 포함하는 비-수계 하이드로겔 입자가 형성되는 것인 단계를 포함하는, 하이드로겔 입자 안에 세포를 캡슐화하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물을 포함하는 하이드로겔에 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 세포 또는 클론 세포 집단을 포함하며, 추가적으로 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 포함하는, 하이드로겔 입자를 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔은 아가로스를 포함한다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 1 mm 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 500 ㎛ 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 100 ㎛ 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 50 ㎛ 미만이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 50, 45, 40, 35, 30 또는 25 ㎛이다.
도 1A는 이소펜테닐 디포스페이트 ("IPP")를 생산하기 위한 메발로네이트 ("MEV") 경로를 개략적으로 도시한 것이다.
도 1B는 이소펜테닐 피로포스페이트 ("IPP")와 디메틸알릴 피로포스페이트 ("DMAPP")를 생산하기 위한 1-데옥시-D-자일룰로스 5-디포스페이트 ("DXP") 경로를 개략적으로 도시한 것이다. Dxs는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제이고; Dxr은 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 레덕토이소머라제 (reductoisomerase) (또한, IspC로 알려져 있음)이고; IspD는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 신타제이고; IspE는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 신타제이고; IspF는 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 신타제이고; IspG는 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 신타제 (IspG)이고; ispH는 이소펜테닐/디메틸알릴 디포스페이트 신타제이다.
도 2는 IPP와 디메틸알릴 피로포스페이트 ("DMAPP")에서 게라닐 피로포스페이트 ("GPP"), 파르네실 피로포스페이트 ("FPP") 및 게라닐게라닐 피로포스페이트 ("GGPP")로의 변환을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본원에 기술된 하이드로겔 입자를 만드는데 유용한 마세유체 디바이스의 예를 제공한다. 이 디바이스는 평면 기판으로 제작되며, 세포 용액 흐름 채널 (cell solution flow channel)에 유동적으로 연결된 세포 유입부를 포함하며, 상기 세포 용액 흐름 채널은 입자 흐름 채널 (particle flow channel)과 그 다음으로 이의 단부에 위치한 입자 수집 유출부와 유동적으로 연결된다. 이 디바이스는 오일 흐름 채널과 유동적으로 연결된 오일 유입부를 추가로 포함하며, 상기 오일 흐름 채널은 상기 세포 용액 흐름 채널에 대해 횡으로 위치되며, T-정션에서 상기 세포 용액 흐름 채널과 교차한다.
도 4는 세포를 캡슐로 둘러싸고 있는 하이드로겔 입자를 제조하는 공정의 예를 제공한다. 세포들은 수계 스트림에서 좌측에서 유입되며, 2개의 오일 스트림에 의한 노즐을 통해 포커싱되어, 입자들로 분리된다. 디바이스의 출구 (즉, 입자 수집 유출부)에서, 입자는 일정 길이의 도관으로 도입되어, 용기로 흘러들어간다.
도 5는 피코스크린 프로세스의 예시적인 구현예를 제공한다. (A) 아가로스 용해물 중의 효소 세포 현탁물을 미세유체 디바이스에 로딩한다. 아가로스 현탁물은 T-정션에서 오일/계면활성제 혼합물과 만나게 된다. 흐르는 오일이 오일에 현탁된 단일한 크기의 아가로스 액적(drop)으로 전단(shears off)한다. (B) 액적을 수집한 후, 입자에서 오일을 세척 제거하고, 입자를 배양 배지에 재-현탁한다. (c) 24시간 배양한 후, 40 - 80개의 세포로 구성된 마이크로콜로니들이 형성된다. 그 후, 입자를 형광-기반의 분석으로 스크리닝할 수 있는 형광 염료로 염색한다.
도 6은 Nile Red의 방출 스펙트럼을 제공한다. (A) Nile Red의 방출 스펙트럼은, 비-생산 효모로 구성된 주로 인지질 환경에서 max ~590 nm (우측 피크)에서, 순수한 파르네신에서의 max ~ 550 nm (좌측 피크)로 이동한다. (B) 파장 함수로서의 파르네신 중의 Nile Red / 비-생산 세포 중의 Nile Red의 비율. 녹색 (좌) 및 적색 (우) 수직 바들은 피코스크린 FACS 분석의 일 구현예에 사용된 방출 필터이며, 방사측정 분석에서 녹색/적색 형광 비를 최대화하도록 선정된 스펙트럼이 표시됨.
도 7은 하이드로겔 입자 안에 캡슐화되고 Nile Red로 염색된 파르네신 생산 균주에 대한 FACS 분석의 예를 제공한다.
도 8은 다른 분석을 통해 측정한 파르네신 생산 (y-축, 좌에서 우측: 2L 발효기 수율, 나일 레드 교반 플레이트 분석, 및 파르네실 플럭스 분석)에 대해 그래프 작성한 피코스크린 (x-축, "FACS")으로 측정한 파르네신 생산의 상관성을 제공한다. 파르네신을 가변적인 양으로 생산하도록 조작된 균주 7종에서 파르네신 생산을 분석하였다.
도 9는 PCR 농화 분석 (PCR enrichment assay)을 나타낸 것이다. (A) 균주 FS2 (파르네신 신타제 (FS)를 2 카피로 포함함)를 균주 FS5 (FS를 5 카피로 포함함)와 구분하기 위해, 2개의 밴드를 증폭시키는 프라이머 3종을 설계하였다. 균주 FS2 및 균주 FS5 둘다에서 2번째 FS 병합부로부터 89 bp 단편이 만들어지지만, 균주 FS5에만 존재하는 5번째 FS 병합부로부터 304 bp 단편이 만들어진다. (B) 304 bp 밴드의 존재는 콜로니가 균주 FS5로부터 유래됨을 표시하는 명확한 마커로서 사용된다.
도 10은 모델 라이브러리에서 파르네신 고생산 효모 균주 (FS5)의 농화를 나타낸 것이다. 균주 FS2 (파르네신 저생산 균주)와 FS5를 10:1, 100:1 및 1000:1의 비율로 혼합하고, 고생산 균주 (FS5)를 농화하기 위해 피코스크리닝을 수행하였다. (A) 순수 균주의 FACS 히스토그램 데이타는 1열과 2열에 나타낸다. 캡슐화 및 분류를 1, 2 및 3회 수행한 후, 혼합 집단의 히스토그람 (3열 - 5열)에 따르면, 균주 FS5의 상당한 농화가 3회차에서 달성됨을 보여준다. (B) 각각의 혼합 비에서의 분류 회차 별 농화 정량화. 출발 비율이 각각 10:1 및 100:1인 라이브러리의 경우, FS5는 3회로 농화되어, 수득되는 집단의 거의 100%가 FS5 유래 콜로니로 이루어진다.
도 11은 캡슐화된 효모 세포에서 재조합에 의해 생산되는 리모넨을 검출하기 위한 피코스크린 결과를 나타낸다. (A) 피코스크린 프로세스를 처리한 다양한 리모넨-생산 균주들의 G/R 형광 피크들. 균주 Y0는 비-생산 균주이고, 균주 L1, L2 및 L3는 다양한 리모넨 생산 수준을 포함한다. 좌측 패널은 여러가지 집단들의 형광 중앙값의 증가를 나타낸다. 우측 패널은, FACS 중앙값을 96웰 교반 플레이트 타이터의 함수로서 그래프 작성한 것으로, 피코스크린 값이 교반 플레이트 값에 비례함을 나타낸다. (B) 공-배양 (색칠된 피크) 또는 각각 배양한 (색칠 안된 피크) 캡슐화된 생산 세포 (L1) 및 비-생산 세포 (YO)의 형광 피크들. Y0 및 L1에 대한 각각의 형광 피크들은 공-배양 조건에서 유지되었는데, 이는 생산 균주가 함유된 입자 안에 캡슐화된 상태에서 생산이 유지되며, 누출되거나 또는 비-생산 균주를 함유한 입자로 누출되지 않는다는 것을 의미한다. 중앙값 차이는 개별 튜브 차이(tube-to-tube variation)로 인한 것일 수 있다.
도 12는 캡슐화된 효모 세포로부터 재조합에 의해 생산되는 패출리(patchouli)를 검출하기 위한 피코스크린 결과를 제공한다. (A) 캡슐화되고 피코스크린 프로세스를 처리한, 비-생산 균주 (Y0) 및 2종의 패출리 생산 균주들 (P1 및 P2)의 G/R 형광 피크들. (B) 기체 크로마토그래피 (GC)로 측정한 표면 교반 플레이트 타이터 (y-축)에 대한 피코스크린 (x-축, "FACS")으로 측정한 패출리 생산의 상관성 그래프.
6.1 정의
본원에서, 용어 "메발로네이트 경로" 또는 "MEV 경로"는 본원에서 아세틸-CoA를 IPP로 변환하는 생합성 경로를 지칭한다. MEV 경로는 도 1A에 개략적으로 도시된다.
본원에서, 용어 "데옥시자일룰로스 5-포스페이트 경로" 또는 "DXP 경로"는 본원에서 글리세르알데하이드-3-포스페이트와 피루베이트를 IPP와 DMAPP로 변환하는 경로를 지칭한다. DXP 경로는 도 1B에 개략적으로 도시된다.
본원에서, 용어 "캡슐화된 (encapsulated)"은 하이드로겔 입자의 표면에 주로 존재하거나 표면에 부착된 것과는 상반되는 의미로, 본질적으로 하나 이상의 세포, 예컨대 클론 세포 집단이 하이드로겔 입자 안에 존재하는 것을 의미한다. 일부 구현예들에서, 세포의 농도는 적게는 하이드로겔 입자 안에 존재하는 세포 1개일 수 있다. 이 구현예에서, 하이드로겔 입자 안에 존재하는 단일 세포가 세포 분열하여, 캡슐화된 클론 세포 집단이 만들어진다.
본원에서, 용어 "하이드로겔"은 물 또는 수용액에 용해되지 않고 팽창할 수 있는 능력과, 구조에 물 또는 수용액을 현저한 비율로 보유하는 능력을 나타내는, 가교된 폴리머 물질을 지칭한다. 일부 구현예들에서, "하이드로겔 입자"는 본원에서 수-비혼화성 화합물, 예컨대 하이드로겔 입자 안에 캡슐화된 세포에 의해 재조합으로 생산되는 수-비혼화성 화합물을 보유하는 능력을 가진다.
본원에서, "이종의 뉴클레오티드 서열"이라는 표현은, (a) 숙주 세포에 외래적이거나 (즉, 세포에 "외인성"임); (b) 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지만 (즉, "내인성"임), 세포에 비정상적인 함량으로 존재하거나 (즉, 숙주에서 본래 발견되는 양 보다 많거나 적음); 또는 (c) 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지만 본래의 유전자 좌가 아닌 다른 곳에서 위치될 수 있는, 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에서, 유전자 변형된 미생물 세포에 의한 이소프레노이드 생산에 있어서, 용어 "지속성"은, 유전자 변형되지 않은 미생물 모 세포와 비교하여, 유전자 변형된 미생물 세포의 이소프레노이드 화합물 생산 능력이 산업적인 발효시 장기간 이루어지는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "모 (parent)"는 본원에 기술된 유전자 변형된 미생물 세포, 예를 들어, 수-비혼화성 화합물, 예컨대, 이소프레노이드, 폴리케타이드 또는 지방산을 세포에서 증가된 수준으로 생산하도록 및/또는 증가된 수준을 달성하도록 유전자 변형된 세포의 생성을 유도하는 유전자 변형을 도입하기 위한 출발 포인트로서 제공되지만, 유전자 변형된 세포의 유전적 변형을 모두 포함하지 않는 세포를 지칭한다.
본원에서, "재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물" 및 "이종의 수-비혼화성 화합물"이라는 표현은 유전자 변형된 세포 또는 미생물로부터 생산되며, 물과 섞이지 않는, 탄소 원자 4개 이상을 가진 화합물을 지칭한다. 탄소 원자 4개 이상을 가지는 화합물은 분지형, 선형 또는 환형일 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 이종 원자 (예, 질소, 산소 및 황) 뿐만 아니라 하나 이상의 치환기나 관능기 모이어티 (예, -OH, -NH2, -COOH, -C(H)=O, -NO3, -NH-, -C(=O)- 등)를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 화합물은 오일이다. 다른 구현예에서, 화합물은 소수성이다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물의 재조합에 의해 생산된, 즉, 이종의 수-비혼화성 화합물의 예로는, 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는, 즉, 이종의 수-비혼화성 화합물은 탄소 원자 4 내지 40개의 길이 범위의 탄소 쇄를 포함한다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는, 즉, 이종의 수-비혼화성 화합물은 탄소 원자 5 - 30개, 10 - 25개 또는 15 - 20개의 탄소 원자로 구성된 탄소 쇄를 포함한다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는, 즉, 이종의 수-비혼화성 화합물은 5, 10, 15 또는 20개 이상의 탄소로 이루어진 탄소 쇄를 포함한다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는, 즉, 이종의 수-비혼화성 화합물은 탄소 원자 40개 이하로 구성된 탄소 쇄를 포함한다.
본원에서, "직접 결합한다"라는 표현은 항체에서와 같이 제2 결합 반응 제제가 없이 제1 분자 (예, 형광 염료)와 제2 분자 (예, 수-비혼화성 화합물) 간의 물리적인 상호작용의 형성을 지칭한다.
6.2 세포에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 검출 방법
6.2.1 세포를 캡슐화하는 방법
특정 구현예에서, 세포에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물 (WIC)을 검출하는 방법은, 세포를 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는 단계 및 하이드로겔 입자 안에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 하이드로겔 입자는, 이종의 수-비혼화성 화합물을 생산하기 위해 세포를 스크리닝 및/또는 분리하기 전에, 세포에서 방출될 수 있는 재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물을 포집하는, 반응 용기로서 또는 미니어처 발효기로서 작용한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은, 적정 세포 배양 조건에서 입자 안에서 증식 및 분열하여 세포의 클론 마이크로콜로니를 만드는 단일 세포를, 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는 단계를 포함한다. 하이드로겔의 케이징 효과로 인해, 하이드로겔 입자를 예컨대 수-비혼화성 화합물-특이 형광 염료로 염색할 수 있으며, 예컨대 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 이종의 수-비혼화성 화합물 생산을 정량할 수 있다.
본원에 제공된 방법에 대한 일부 구현예들에서, 세포를 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는 단계는 세포를 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는데 충분한 조건에서 세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시키는 것을 포함한다. 세포의 캡슐화에 사용가능한 하이드로겔의 예는 섹션 5.2.1.1에 기술되어 있으며, 아가로스 입자 안에 세포를 캡슐화하기 위한 프로토콜의 예는 아래 실시예 2에 제공된다.
일부 구현예들에서, 스크리닝할 세포는 배양물에서 수집하여 생리 완충액, 예컨대 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)로 1회 이상 세척한 다음, 수계 하이드로겔 현탁물과의 접촉 전에, 예컨대 PBS나 배양 배지에 재현탁한다.
일부 구현예들에서, 재현탁한 세포는 특정한 부피:부피 (v/v) 비율로 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포 현탁물의 농도는 원하는 입자 크기, 캡슐화에 사용되는 하이드로겔, 및 입자 안에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 방법 (예, FACS)에 따라 결정될 것이다. 일부 구현예들에서, 세포의 농도는 다음과 같이 바람직한 입자 크기에 대한 함수로서 계산할 수 있다:
농도 (세포/L) = 원하는 입자 당 세포 수 / (4/3 x Pi x r 3 ), r = 바람직한 입자의 반경. 입자 당 원하는 세포 수는 마이크로콜로니의 집락형성성(clonogenicity)을 유지하기 위해, 즉 입자 당 세포의 수가 1 이하로 캡슐화되도록 하기 위해, 바람직하게는 1 이하일 것이다.
일부 구현예들에서, 세포 현탁물은 바람직한 입자 크기 및/또는 타입의 하이드로겔에 적합한 최종 농도에 대한 2X 농도로 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 수계 하이드로겔 현탁물은 최종 농도의 2X로 유사하게 제형화될 수 있으며, 상기 접촉은 1:1 비율 (v/v)로 용액들을 조합하는 단계를 포함한다. 상기 용액들은 세포 생존성을 현저하게 손상시키지 않도록 약하게 혼합한다. 일부 구현예들에서, 바람직한 입자 크기는 직경이 약 25 ㎛이며, 세포는 약 7.3 x 107 cells/ml의 2X 농도로 재현탁한다. 다른 구현예에서, 바람직한 입자 크기는 직경이 약 32 ㎛이며, 세포는 약 3.5 x 107 cells/ml의 2X 농도로 재현탁한다. 다른 구현예에서, 바람직한 입자 크기는 직경이 약 50 ㎛이며, 세포는 약 9 x 106 cells/ml의 2X 농도로 재현탁한다. 다른 구현예에서, 바람직한 입자 크기는 직경이 약 100 ㎛이며, 세포는 약 1 x 106 cells/ml의 2X 농도로 재현탁한다. 일부 구현예들에서, 세포는 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107 또는 1x107 이상의 2X 농도로 재현탁한다.
특정 구현예에서, 약 3.7x107로 포함되는 세포의 2X 농도를, 1.5% 아가로스를 포함하는 2X 아가로스 수용액과 접촉시킨다. 다른 특정 구현예에서, 약 9x106로 포함하는 세포의 2X 농도를 2% 아가로스를 포함하는 2X 아가로스 수용액과 접촉시킨다. 다른 특정 구현예에서, 약 1x106로 포함하는 세포의 2X 농도를 3% 아가로스를 포함하는 2X 아가로스 수용액과 접촉시킨다.
세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시킨 다음, 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법을 이용하여 하이드로겔 입자를 제조할 수 있다. 일부 구현예들에서, 구형의 하이드로겔 입자는 수-비혼화성 오일, 예컨대 플루오로카본 오일 중에 하이드로겔 액체 매트릭스 (세포 포함)를 분산시킴으로써, 제조된다. 일부 구현예들에서, 원하는 크기의 균일한 크기의 입자가 형성되도록 보장하기 위해, 정션, 예컨대, 수계 흐름 채널에 대해 횡으로 위치된 오일 흐름 채널이 교차하여 형성되는, T-정션을 포함하는 미세유체 디바이스를 사용하여, 유중수 에멀젼을 만든다. (세포를 포함하는) 하이드로겔 액체 매트릭스는 하나의 채널에 로딩되어, 즉 채널로 흘러들어가며, 상기 비혼화성 오일은 상기 하이드로겔 수용액을 포함하는 채널에 대해 횡으로 위치된 채널 쪽으로 흐르며, 접촉은 T-정션에서 이루어져, 세포를 포함하는 하이드로겔 입자가 만들어진다. 새롭게 형성된 입자는 그 후 수집 채널을 통해 흘러가, 예컨대 수집관에 수집된다. 그 후, 겔은, 예컨대 용액의 온도를 낮추거나 또는 가교제를 첨가함으로써, 경화시키고, 입자를 오일에서 수용액, 예컨대 영양 증식 배지로 이동시킨다.
일부 구현예들에서, 본원에 제공되는 방법에 사용가능한 하이드로겔 입자는 미세유체 디바이스를 사용하지 않고도 만들 수 있다. 예를 들어, 막 에멀젼화로 상대적으로 작은 크기 분포를 갖는 에멀젼을 제조할 수 있다. 작은 크기 다분산성이 그리 중요하지 않을 경우, 교반, 균질화 (homogenization) 또는 교반(shaking) 등의 다른 에멀젼 형성 방법들도 사용할 수 있다. 그외 사용가능한 방법으로는 공기 중에서의 액체 제트 형성 (jet of liquid in air) 후, 스피닝 와이어로 상기 제트를 기계적으로 절단하거나, 제트를 고주파수 변환기로 셰이킹하거나 또는 가압 공기를 사용하여 구멍을 통과하도록 강제함으로서, 에어로졸 입자로 제트를 쪼개는 방법을 포함한다.
6.2.1.1 하이드로겔
하이드로겔은 고형 매트릭스로 경화된 폴리머로서, 물에 의해 팽창되지만, 물에 용해되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔의 메쉬 크기는 세포 및 미크론-크기의 수-비혼화성 화합물 액적 등과 같이 물체를 캡슐화할 만큼 작지만, 예를 들어 세포 생장과 증식을 지원하거나 또는 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는데 필요한 소형 분자나 이온이 매트릭스를 통해 자유롭게 확산할 수 있을 정도로 큰 크기이다.
일부 구현예들에서, 하이드로겔의 메쉬 크기는 약 1 nm - 100 nm이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔의 메쉬 크기는 약 10 nm - 90 nm이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔의 메쉬 크기는 약 20 nm - 80 nm이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 캡슐의 메쉬 크기는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 nm이다.
일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자의 크기는 예를 들어 통상의 세포 분류기의 유체 소자(fluidic component)를 통과할만큼 작지만 세포 수십개로 이루어진 콜로니를 포집할만큼의 큰 크기를 가진다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 20-50 ㎛이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 30-40 ㎛이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 ㎛이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 50 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예들에서, 하이드로겔 입자는 직경이 약 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100 ㎛ 이상이다.
일부 구현예들에서, 단일 원조 세포 (single founder cell)의 완전한 캡슐화는 클론 집단을 포함하는 소형 콜로니가 상기 원조 세포에 바로 인접하여 포집되어 유지되게 할 수 있다. 따라서, 한가지 유전자형에 대한 표현형은 수십개의 세포에서 평균하여, 분석 노이즈를 크게 줄일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하이드로겔 매트릭스는 하이드로겔 안에 삽입된 물체를 전단력 및 대류(convention)로부터 차폐함으로써, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 위치되게 한다. 따라서, 탄화수소 분자 등의 소형 분자는 단지 확산에 의해서만 생산 세포로부터 멀리 천천히 이동할 수 있다. 이렇듯 생산 오리진으로부터 멀리 느리게 이동하는 현상은 고 농도를 야기하여, 핵형성과 미크론 크기의 수-비혼화성 화합물 액적의 성장을 개시한다. 수-비혼화성 화합물 액적들은 겔의 메쉬 크기에 근접 및 초과함에 따라, 영구적으로 매트릭스에 갖히게 되고, 이를 생산한 세포와 조합된 상태로 유지된다. 액적은 겔 매트릭스의 외부에 존재하는 전단력으로부터 차폐되기 때문에, 액적은 입자들로 외부로 확산될 수도 있는 더 작은 액적으로 쪼개질 수 없다.
일부 구현예들에서, 세포는 세포 증식을 지원하는 임의의 바이오-폴리머로 형성된 하이드로겔 안에 캡슐화된다. 바이오-폴리머는 단백질 및 탄화수소와 같은 천연 폴리머이다. 바람직한 구현예에서, 바이오-폴리머는 캡슐화된 세포에 생물친화적이며 세포 무독성이다. 본 발명의 방법에 사용가능한 적합한 바이오-폴리머의 예로는 콜라겐 (I, II, III, IV 및 V형 포함), 변성된 콜라겐 (또는 젤라틴), 재조합 콜라겐, 피브린-피브리노겐, 엘라스틴, 당단백질, 알기네이트, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트 및 글리코스아미노글리칸 (또는 프로테오글리칸)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예들에서, 바이오-폴리머는 이의 천연 형태이다. 다른 구현예에서, 바이오-폴리머는 합성 폴리머와의 가교를 용이하게 하도록 유도체화된다.
특정 구현예에서, 바이오-폴리머는 아가로스 등의 열에 의해 겔화되는 다당류 (thermally gelling polysaccharide) 또는 젤라틴 등의 열에 의해 겔화되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아가로스는 해초류로부터 추출된 천연 폴리머이며, 이의 특성 (예, 분자량, 실제 화학 조성, 측쇄 등)은 다양하다. 아가로스는 임의의 다른 성분을 첨가하지 않고도 용액의 온도를 낮춤으로써 고체화할 수 있다. 이러한 특성은, 특히 본원에 기술된 하이드로겔 입자를 만들기 위해 미세유체 장치 또는 기타 에멀젼-기반의 방법을 이용하는 경우에, 입자를 제조하는데 특히 유용하다. 바람직한 구현예에서, 아가로스는, 세포 생존성을 현저하게 손상시키지 않는 온도에서, 살아있는 세포를 아가로스 용액에 혼합할 수 있는, 겔화 온도 (gelling temperature)를 가진다. 바람직한 구현예에서, 아가로스는 세포 생존성과 양립가능한 온도 보다 높은 온도에서는 겔이 되지 않는다. 따라서, 아가로스의 겔화 온도가 세포 생존 온도 보다 높다면, 이 아가로스 또는 겔은 겔화 온도 보다 낮은 온도에서는 세포를 아가로스 용액 (겔-전 상태)과 혼합하는데 요구되는 시간 보다 더 빨리 겔화되지 않아야 한다. 일부 구현예들에서, 아가로스는 약 18℃ - 60℃, 24℃ - 50℃, 30℃ - 40℃ 또는 32℃ - 37℃의 온도 범위에서 (예, 조심스러운 기계적 교반 또는 파이펫팅을 통해) 혼합이 가능하다.
일부 구현예들에서, 아가로스 용액은 세포를 이 용액에 혼합하는 충분한 시간이 허용될 수 있도록, 겔이 되는데 1분 이상 걸린다. 일부 구현예들에서, 아가로스 용액은 약 4시간 이하의 시간 안에, 더 바람직하게는 1시간 이하의 시간 안에, 더 바람직하게는 분 단위의 시간 안에 (예, 약 1 - 20분, 또는 약 2- 5분) 겔이 된다. 당해 기술 분야의 당업자는, 겔화가 충분히 느리게 진행되고 겔이 세포 생존성을 보장하는 온도 범위에서 안정적인 한, 실제 겔 포인트 온도 ( gel point temperature)가 결정적이지 않다는 것을 알 것이다.
본원에 제공되는 방법에 사용가능한 그외 열에 의해 겔화되는 단백질로는, 엘라스틴-모방 단백질 폴리머 및 실크-엘라스틴 블럭 공중합체가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 예로, Hurt and Gehrke, J. Phar. Sci. Vol. 96 No. 3 (March 2007); McMillan et al., (1999) Macromolecules 32: 3643-3648; Huang et al., (2000) Macromolecules 33: 2989-2997; 및 McMillan et al., (2000) Macromolecules 33: 4809-4821을 참조하며, 이들 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 잠재적으로 유용한 열에 의해 겔화되는 다당류로는 κ-카라기난과 ι-카라기난을 포함한다.
일부 구현예들에서, 세포는 세포 증식을 지원하는 임의의 생합성 매트릭스 안에 캡슐화된다. 일부 구현예들에서, 상기 생합성 매트릭스는 폴리아크릴아미드를 포함하는 폴리머 또는 1종 이상의 아크릴아미드 유도체이다. 본원에서, "아크릴아미드 유도체"는 N-알킬 또는 N,N-디알킬 치환된 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드를 지칭한다. 세포의 캡슐화에 사용하기 적합한 아크릴아미드 유도체의 예로는, N-메틸아크릴아미드, N-에틸아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드 (NiPAAm), N-옥틸아크릴아미드, N-사이클로헥실아크릴아미드, N-메틸-N-에틸아크릴아미드, N-메틸메타크릴아미드, N-에틸메타크릴아미드, N-이소프로필메타크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N,N-디메틸메타크릴아미드, N,N-디에틸메타크릴아미드, N,N-디사이클로헥실아크릴아미드, N-메틸-N-사이클로헥실아크릴아미드, N-아크릴오일피롤리딘, N-비닐-2-피롤리디논, N-메타크릴오일피롤리딘 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 세포는, 세포 증식을 지원하는, 물리적으로 가교된 폴리머, 화학적으로 가교된 폴리머, 정전기적으로 가교되거나 또는 얽힌 폴리머 안에 캡슐화된다. 일부 구현예들에서, 세포는 물리적으로 가교된 폴리머, 화학적으로 가교된 폴리머, 정전기적으로 가교되거나 또는 얽힌 폴리머 중 하나 이상을 포함하는 하이드로겔 네트워크 안에 캡슐화된다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 공중합체는 하이드로겔 형성을 용이하게 하도록 수용액에 충분히 용해되어야 한다.
특정 구현예에서, 상기 얽힌 폴리머는 아가로스 등의 열에 의해 겔화되는 다당류 또는 젤라틴 등의 열에 의해 겔화되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 물리적으로 가교되거나, 화학적으로 가교되거나 또는 정전기적으로 가교된 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 ("PEG-DA") 및 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 ("HEMA")와 같은 수용성 비닐 단량체로부터 동형폴리머로서 또는 공중합체로서 합성된다.
일부 구현예들에서, 하이드로겔 네트워크는 합성 폴리머에서 펜던트 가교 모이어티를 이용하여 합성 폴리머와 가교된 바이오폴리머 또는 이의 유도체화된 버전을 포함한다. 이에, 이러한 구현예에서, 바이오폴리머는 합성 폴리머의 가교 모이어티와 반응할 수 있는 하나 이상의 기 (예, 일차 아민 또는 티올)를 포함하거나, 이러한 기를 포함하도록 유도체화될 수 있다. 세포는, 바이오폴리머와 혼합하여 가교된 하이드로겔을 형성하기 전에, 세포를 합성 폴리머의 용액에 첨가함으로써, 최종 매트릭스 안에 쉽게 포획될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 가교 단계 전에 합성 폴리머와 바이오폴리머 둘다를 포함하는 용액에 첨가될 수 있다. 매트릭스 안에 세포를 캡슐화하기 위해, 세포 배양 배지 또는 이의 희석된 또는 변형된 버전 등의 수계 매질에 다양한 성분들 (세포, 합성 폴리머 및 바이오폴리머)을 분산시킨다. 세포 현탁물을 세포가 용액에서 실질적으로 균일하게 분산될 때까지 폴리머 용액에서 서서히 혼합하며, 하이드로겔이 전술한 바와 같이 형성된다.
일부 구현예들에서, 세포가 1종 이상의 가교된 폴리머, 예컨대 물리적으로 가교된, 화학적으로 가교된 또는 정전기적으로 가교된 폴리머로 구성된 하이드로겔 안에 캡슐화하는 경우, 폴리머는 바람직하게는 살아있는 세포의 상당 비율이 살아있는 상태로 유지되는 기간 동안 중합 및/또는 가교된다. 일부 구현예들에서, 세포는 1시간 이하, 약 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1분 이하의 기간 동안에 가교된다.
6.2.1.2 미세유체 디바이스
전술한 하이드로겔 입자를 만드는데 사용가능한 미세유체 디바이스의 예는 복수 개의 흐름 채널들이 표면에 조합된 하나 이상의 표면을 가진 기판을 포함한다. "채널"은 본원에서 적어도 부분적으로 유체의 흐름을 향하게 하는 기판 상 또는 기판내의 형상 (feature)를 지칭한다. 일부 경우들에서, 채널은 적어도 부분적으로는 단일 구성 요소, 예컨대 에칭된 기판 또는 몰딩된 유닛에 의해 형성될 수 있다. 채널은 임의의 횡단면 형태, 예를 들어, 원형, 난형, 삼각형, 부정형, 정사각형 또는 (임의의 면 각도를 가진) 직사각형 등을 가질 수 있으며, 밀폐되거나 또는 밀폐되지 않을 수 (즉, 채널을 둘러싼 외부 환경으로 열려 있음) 있다. 채널이 완전히 밀폐된 경우, 채널의 한 곳 이상이 완전히 봉인된 횡단면을 가질 수 있으며, 및/또는 전체 채널이 유입부 및 유출부를 제외하고는 전장이 완전히 봉인될 수 있다.
일부 구현예들에서, 디바이스는 표면으로 조립된 2 상의 흐름 채널을 포함하데, 하나 이상의 채널이 각 채널의 제1 포인트에서, 즉 T-정션에서 횡으로 위치된 하나 이상의 채널과 유동적으로 연결된다. 일부 구현예들에서, 디바이스는 2 이상의 유입부, 즉 예를 들어 수용액 중의 세포 또는 플루오로카본 오일을 각각 수용하는 디바이스의 영역을 포함한다. 각 유입부는 하나 이상의 유입 채널, 웰 또는 저장소, 개구부 및 그외 예컨대 수용액 중의 세포 또는 플루오로카본 오일의 기판으로의 도입을 용이하게 하는 형상부를 포함할 수 있다. 유입부는 통상적으로 샘플 유입 채널 (예, 세포 유입 채널 또는 오일 유입 채널)과 주 채널 (예, 세포 용액 흐름 채널 또는 오일 흐름 채널 각각) 사이에, 샘플 용액 (예, 수용액 중의 세포 또는 플루오로카본 오일)이 상기 주 채널에 도입되는, 정션을 포함한다. 일부 구현예들에서, 디바이스는 하나 이상의 유입부, 예컨대 하나 이상의 세포 유입부 또는 하나 이상의 오일 유입부를 필요에 따라 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 여러가지 샘플 유입 채널들은 소통할 수 있으며, 즉, 여러가지 유입부에서 주 채널과 유체 소통할 수 있다. 예를 들어, 복수 세포 유입 채널은 세포 용액 흐름 채널과 소통할 수 있으며, 복수의 오일 유입 채널은 오일 흐름 채널과 소통할 수 있다. 다른 구현예에서, 여러가지 샘플 유입 채널들은 동일한 유입부에서 주 채널과 소통할 수 있다.
일부 구현예들에서, 디바이스는, 유입 채널과 유체 소통하는 유입부, 예컨대 세포 유입부 또는 오일 유입부에서 샘플을 디바이스로 도입하기 위한, 샘플 용액 저장소 또는 웰, 또는 기타 장치를 포함한다. 1종 이상의 샘플을 미세유체 디바이스 상에 로딩하는데 사용되는 저장소 및 웰로는 시린지, 카트리지, 바이얼, 에펜도르프 관 및 세포 배양 재료들이 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
하이드로겔 입자 형성을 용이하게 하기 위해 사용가능한 미세유체 디바이스의 일 예는 도 3에 나타낸다. 디바이스 전체는 평면 기판으로 제작되며, 세포 용액 흐름 채널과 유체 소통가능하게 연결된 세포 유입부를 포함하며, 상기 세포 용액 흐름 채널은 입자 흐름 채널과 그 다음으로 단부에 위치한 입자 수집 유출부와 유체 소통가능하게 연결된다. 디바이스는, 세포 용액 흐름 채널에 대해 횡으로 위치되어 있으며 T-정션에서 세포 용액 흐름 채널과 교차하는, 오일 흐름 채널과 유체 소통가능하게 연결된, 오일 유입부를 더 포함한다. 오일 흐름 채널은, 세포 용액 흐름 채널을 통해 통과하는 유체 스트림에 대해 직각의 각도로 오일이 세포 용액 흐름 채널에 도입되도록, 세포 용액 채널과 교차할 수 있다. 일부 구현예들에서, 오일 흐름 채널과 세포 용액 흐름 채널은 T-정션에서 인터셉터되며, 즉, 오일 흐름 채널은 세포 용액 흐름 채널과 직각 (90°)이다. 다른 구현예에서, 오일 흐름 채널은 임의 각도에서 세포 용액 흐름 채널에 인터셉터될 수 있으며, 오일은 흐름 채널과 직각인 각도에서는 세포 용액 흐름 채널로 도입되지 않을 수 있다. 일부 구현예들에서, 인터셉팅되는 채널들 사이의 각도는 약 60 내지 약 120° 범위이다. 일부 구현예들에서, 인터셉팅되는 채널들 사이의 각도는 약 45, 60, 90 또는 120°이다.
일부 구현예들에서, 용액, 예컨대 세포 수용액 또는 플루오로카본 오일의 미세유체 디바이스를 통한 이동은 압력 구동 흐름 제어(pressure drive flow control)에 의해 구동되며, 펌프와 밸브를 사용하여 한가지 이상의 방향으로 및/또는 미세유체 디바이스의 하나 이상의 채널쪽으로 용액의 흐름을 조작할 수 있다. 일부 구현예들에서, 흐름 채널의 내압은, 각각의 유입 채널에 대한 압력을 조정함으로써, 예컨대, 유입 채널로의 가압화된 시린지 공급(pressurized syringes feeding)을 이용하여, 조절할 수 있다. 각 유입부에서 오일 소스와 세포 용액 소스 간의 압력 차를 조절함으로써, 제조되는 하이드로겔 입자의 크기와 주기성(periodicity)을 조절할 수 있다. 또한, 하이드로겔 입자의 크기와 주기성은 채널의 직경, 유체의 점성 및 전단 압력에 좌우될 수 있다.
도 4는 하이드로겔로 캡슐화된 세포를 만드는 공정의 예를 도시한 것이다. 세포는 연속적인 수계 스트림으로 세포 용액 흐름 채널을 통해 세포 유입부로부터 좌측에서 들어간다. T-정션에서 오일 흐름 채널을 통해 흐르는 플루오로카본 오일과 만나게 되면, 세포 용액이 분산 또는 연속되지 않게 되며, 호일로 둘러싸이고, 입자 흐름 채널을 통해 이동되는 입자로 만들어진다. 디바이스의 출구 (즉, 입자 수집 유출부)에서, 입자는 일정 길이의 도관(tubing)으로 유입되어 마이크로원심분리 관 등의 용기으로 흘러들어간다. 겔 입자는 경화된 다음 플루오로카본 오일로부터, 즉, 세척 제거하여, 수계 완충액으로 분리된다.
일부 구현예들에서, 미세유체 디바이스의 입자 흐름 채널의 횡단면 직경은, 형성된, 즉 하이드로겔 현탁물이 T-정션에서 플루오로카본 오일과 접촉한 후, 형성되는 하이드로 겔 입자의 크기에 기여할 것이다. 일부 구현예들에서, 입자 흐름 채널은 예컨대 약 0.1 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 50 ㎛ 미만의 범위의 횡단 직경을 가질 것이다. 마찬가지로, 일부 구현예들에서, 오일 흐름 채널의 횡단 치수 (cross sectional dimension)는 하이드로겔 현탁물이 T-정션에서 플루오로카본 오일과 접촉한 후 형성되는 하이드로겔 입자의 크기에 기여할 것이다. 일부 구현예들에서, 오일 흐름 채널은 예를 들어 약 0.1 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 50 ㎛ 미만 범위의 횡단 치수를 가질 것이다.
용이하게 하이드로겔 입자를 형성하는데 사용가능한 미세유체 디바이스를 제작하기 위한 적합한 기판 물질은 일반적으로 만들고자 하는 입자의 특성과의 적절성을 기초로 선택된다. 이러한 조건으로는 양극단 pH, 온도, 여기에 적용되는 플루오로카본 오일/플루오로계면활성제, 여기에 적용되는 폴리머 등을 포함할 수 있다. 유용한 기판 물질의 예로는, 예를 들어, 유리, 석영 및 실리콘 뿐만 아니라 폴리머 물질, 예컨대 플라스틱을 포함한다. 일부 구현예들에서, 기판 물질은 딱딱하거나, 반강성(semi-rigid) 또는 비강성(non-rigid)이거나, 불투명, 반-불투명 또는 투명하다. 예를 들어, 입자 형성을 모니터링 할 수 있도록 광학 또는 시각적 요소를 포함하는 디바이스는, 일반적으로, 적어도 부분적으로, 모니터링할 수 있거나 또는 적어도 모니터링을 쉽게할 수 있도록 투명한 물질로 제작될 것이다. 다른 구현예에서, 예를 들어 유리 또는 석영의 투명 창이 이러한 타입의 모니터링 요소로 디바이스에 혼용된다. 부가적으로, 폴리머 물질은 선형 또는 분지형 벡본을 가질 수 있으며, 선택적으로 가교되거나 비-가교된다. 특히 적합할 폴리머 물질의 예로는, 폴리대메틸실록산 (PDMS), 폴리우레탄, 폴리비닐클로라이드 (PVC) 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리카보네이트 등을 포함한다.
미세규모의 요소, 예컨대 흐름 채널을 기판의 표면에 형성하는 것은 일반적으로 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다수의 미세조립 기법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 리소그라피 기법들은, 선택적으로, 포토리소그라피 에칭, 플라스마 에칭 또는 습식 화학적 에칭 등의 반도체 제조 산업에서 잘 알려져 있는 방법들을 이용하여, 예컨대 유리, 석영 또는 실리콘 기판을 제작하는데 채택된다. 다른 구현예에서, 레이저 드릴링(laser drilling), 마이크로밀링(micromilling) 등과 같은 미세가공 방법들이 선택적으로 채택된다. 마찬가지로, 폴리머 물질의 경우, 또한 잘 알려져 있는 제작 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기법으로는 다수의 기판들을 예컨대 미세규모 기판으로 구성된 큰 시트를 제조하기 위해 롤링 스템프(rolling stamp)를 이용하여 다수의 기판들을 선택적으로 제조하는, 인젝션 몰딩 또는 스탬프 몰링 방법과, 미세가공한 몰드에서 기판을 중합하는 폴리머 마이크로주조 기법을 포함한다.
디바이스는, 전형적으로, 다양한 흐름 채널을 둘러싸 유체 이동을 차단(substrate enclosing)하여 도관(conduit)을 형성하는 채널 기판(channeled substrate)에 적층된 추가적인 평면 소자(planar element)를 포함할 것이다. 평면 커버 소자 (planar cover element)의 부착은 예컨대 열 결합, 접착제 또는 특정 기판, 예컨대 유리 또는 반-강성 및 비-강성의 폴리머 기판의 경우에는, 2가지 성분간의 자연적인 점착 (natural adhesion)을 비롯한, 다양한 수단에 의해 달성된다. 평면 커버 소자는 부가적으로 하이드로겔 입자 형성에 필요한 다양한 유체 요소들을 도입하기 위한 액세스 포트(access port) 및/또는 저장소를 구비할 수 있다.
폴리머 물질의 표면 변형은 다양한 여러가지 형태로 취해질 수 있다. 예를 들어, 물질 (예, 세포 및/또는 하이드로겔 입자)이 채널의 면에 부착되지 않도록 하기 위해, 채널 (및 사용되는 경우, 커버슬립)은 부착을 최소화하는 코팅을 구비할 수 있다. 미세유체 디바이스의 채널들의 표면은 분산상(dispersed phase)에 대해 임의의 항-습윤제 또는 차단제로 코팅될 수 있다. 또한, 채널은 생물/화학 샘플의 부착을 방지하기 위해 임의 단백질로 코팅될 수 있다. 채널은 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단으로 코팅할 수 있다. 예를 들어, 채널은 PPG Industries, Inc. 사에서 상표 Aquapel로 판매하며 미국 특허 5,523,162에 기술된 타입의 소수성 코팅제로 코팅할 수 있다 (예, 플라스틱 및 실리카 프라이머 층이 사용된 코팅된 플라스틱 기판 표면에 퍼플루오로알킬알킬실란의 표면 처리). 채널 표면에 불소 처리함으로써, 연속상 (continuous phase)이 우선적으로 채널을 적셔, 디바이스를 통한 액적의 안정적인 생성과 이동을 가능하게 한다. 그로 인해 채널 벽의 낮은 표면 장력은 채널 응집 미립자 (channel clogging particulate)의 축적을 최소화한다. 채널 표면에 불소 처리함으로써, 지속상이 우선적으로 채널을 적셔, 디바이스를 통한 물질 (예, 세포 및/또는 하이드로겔 입자)의 안정적인 생성과 이동을 가능하게 한다. 이로써 채널 벽의 낮은 표면 장력은 채널 응집 미립자의 축적을 최소화한다.
일 구현예에서, 기판에 하전된 표면을 형성하는 것은, 변형시킬 표면, 예컨대 흐름 채널을, 폴리머 물질의 표면을 일정 부분 용해 또는 연화하는 적정 용매에 노출시키는 것을 포함한다. 적정 용매의 선택은 일반적으로 기판에 사용되는 폴리머 물질에 따라 결정될 것이다. 예컨대, 염화된 하이드로카본 용매, 즉, 트리클로로에탄 (TCE), 디클로로에탄 등이 특히 PMMA 및 폴리카보네이트 폴리머와 함께 사용하기 위한 용매로서 유용하다. 그 후, 디터전트를 부분적으로 용해된 표면에 접촉시킨다. 디터전트 분자의 소수성 영역은 부분적으로 용해된 폴리머와 결합할 것이다. 매우 다양한 디터전트들, 예컨대 SDS (소듐 도데실 설페이트), DTAB (도데실트리메틸암모늄 브로마이드), 또는 CTAB (세틸트리메틸암모늄브로마이드)가 사용될 수 있다. 그 후, 용매를 예컨대 물을 사용하여 표면에서 세척 제거하며, 이때 폴리머 표면은 표면에 함침된 디터전트에 의해 경화되어, 유체 인터페이스에 하전된 헤드 그룹(charged head group)을 제시하게 된다.
다른 측면에서, 폴리디메틸실록산 등의 폴리머 물질을 플라즈마 조사에 의해 변형시킬 수 있다. 특히, PDMS의 플라즈마 조사로 메틸기는 산화되어, 탄소는 방출되고 그 위치에 하이드록시기만 남게 되므로, 폴리머 물질 상에 유리와 유사한 표면이 하이드록시 관능기가 조합된 형태로 효과적으로 형성된다.
폴리머 물질은 강성, 반-강성, 비-강성 또는 강성 및 비-강성 인자의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 기판은 하나 이상의 보다 연질의 유연한 기판 소자와 하나 이상의 보다 경질의 더욱 강성인 기판 소자로 이루어지면, 이들 중 한가지는 그 표면에 조립된 채널 및 챔버를 포함한다. 2개의 기판을 조합하는 경우, 연질 소자의 포함은 채널과 챔버에 대한 효과적인 유체 실링이 이루어질 수 있게 하며, 이로써 보다 강성인 플라스틱 성분들이 함께 붙거나 용융하는 것과 관련된 요건 및 문제들을 해소한다.
6.2.1.3 플루오로카본 오일
플루오로카본 오일 연속상은 본원에 제시된 하이드로겔 입자를 만드는데 사용하기 위한 연속상으로써 매우 적합하다. 플루오르계 오일(fluorous oil)은 소수성 및 소유성(lipophobic)이며, 따라서 수상에 대한 성분 용해성이 낮다. 아울러, 하이드로카본 또는 실리콘 오일과는 반대로, 플루오르계 오일은 미세유체 채널을 구축하는데 일반적으로 사용되는 물질인 PDMS 물질을 팽창시키지 않는다.
일부 구현예들에서, 플루오로카본 오일은 하이드로겔 입자가 형성되고 이후 경화/중합될 때 하이드로겔 입자를 안정시킨다. 일부 구현예들에서, 플루오로카본 오일은 하이드로겔 입자와의 화학적 및 생물학적 불활성을 유지하여, 입자 안에 존재하는 세포 생존성에 부정적으로 작용하지 않는다. 일부 구현예들에서, 오일 용액은 미세유체 디바이스를 구축하는데 사용되는 물질을 팽창(swell), 용해 또는 분해시키지 않는다. 바람직하게는, 오일의 물성 (예, 점성)은 캡슐화 공정의 흐름 및 작동 조건에 적합하여야 한다.
본원에 제공되는 방법에서 사용하기 위한 플루오로카본 오일의 예로는, 에테르 결합을 통해 탄화수소 화합물과 커플링된 불소화된 알킬 쇄인, 하이드로플루오로에테르를 포함한다 (즉, Novec Engineered Fluids 또는 HFE-시리즈 오일). 사용가능한 HFE-시리즈 오일로는 HFE-7500, HFE-7100, HFE -7200 및 HFE -7600이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 플루오로카본 오일은 1 중량%의 3M Novec HFE-7500이다. HFE-시리즈 오일은 독립형 오일 (stand-alone oil)로서 또는 에멀젼 특성과 성능을 최적화하기 위한 오일 혼합물들의 성분으로서 사용될 수 있다. 그외 사용가능한 플루오로카본 오일로는 퍼플루오로알킬아민 구조를 기재로 퍼플루오로화된 오일인 퍼플루오로알킬아민 (예, Fluorinert Electronic Liquids (FC-oils))을 포함한다. 사용가능한 FC-오일로는 Fluorinert FC-3283와 Fluorinert FC-40을 포함한다. 또한, FC-오일은 독립형 오일로서 또는 에멀젼 특성과 성능을 최적화하기 위한 오일 혼합물들의 성분으로서 사용될 수 있다.
일부 구현예들에서, 플루오로카본 오일은 플루오로계면활성제를 포함한다. 연속상에 첨가될 수 있는 계면활성제로는, 소르비탄 모노라우레이트 (Span 20), 소르비탄 모노팔미테이트 (Span 40), 소르비탄 모노스테아레이트 (Span 60) 및 소르비탄 모노올리에이트 (Span 80)를 비롯한, 소르비탄-기재의 카르복실산에스테르 (예, "Span" 계면활성제, Fluka Chemika), 및 과불소화된 폴리에테르 (예, DuPont Krytox 157 FSL, FSM, 및/또는 ESH) 등의 계면활성제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 비-이온성 계면활성제에 대한 기타 비제한적인 예로는 폴리옥시에틸렌화된 알킬페놀 (예컨대, 노닐-, p-도데실- 및 다이노닐페놀), 폴리옥시에틸렌화된 직쇄 알코올, 폴리옥시에틸렌화된 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 머캅탄, 장쇄 카르복실산에스테르 (예컨대, 천연 지방산의 글리세릴 및 폴리글리세릴 에스테르, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 폴리옥시에틸렌화된 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 에스테르 등) 및 알카놀아민 (예, 디에탄올아민-지방산 축합체 및 이소프로판올아민-지방산 축합체)을 포함한다. 특정 구현예에서, 플루오로계면활성제는 Krytox 157 FSH의 암모늄 카르복실레이트 염이다.
연속상 유체, 예를 들어 플루오로카본 오일에 첨가될 수 있는, 부가적인 플루오로계면활성제의 예들은 다음과 같이 합성할 수 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
6.2.2 검출 방법
6.2.2.1 세포 배양
하이드로겔 입자의 생성 후, 겔 입자 현탁물을 플루오로카본 오일로부터 분리하여, 배양 배지로 옮겨 적정 조건 하에, 예컨대 이종의 수-비혼화성 화합물 생산에 적합한 조건 하에 탄소원을 포함하는 배지에서 배양한다. 일부 구현예들에서, 상기 조건은 세포가 분열하여 이종의 수-비혼화성 화합물을 생산할 수 있도록 30℃ 교반 배양기에서 시험관에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 생성물은 아가로스 입자 안에 유지되며, 따라서 이를 생산한 세포와 조합되어 유지된다.
미생물 세포를 배양하기 위한 적절한 조건과 적정 배지들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 구현예들에서, 탄소원은 단당류 (단순 당), 이당류, 다당류, 비-발효성 탄소원 또는 이들의 한가지 이상의 조합이다. 적합한 단당류에 대한 비제한적인 예로는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 리보스 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 이당류에 대한 비제한적인 예로는 슈크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로바이오스 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 다당류에 대한 비제한적인 예로는 스타치, 글리코겐, 셀룰로스, 키틴 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 비-발효성 탄소원에 대한 비제한적인 예로는 아세테이트와 글리세롤을 포함한다. 일부 구현예들에서, 적정 배지에는 예를 들어 유도제 (예, 유전자 산물을 코딩하는 1종 이상의 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터의 통제 하에 있는 경우), 억제제 (예, 유전자 산물을 코딩하는 1종 이상의 뉴클레오티드 서열이 억제가능한 프로모터의 통제 하에 있는 경우), 또는 선별 제제 (예, 유전자 변형을 포함하는 미생물 세포를 선별하기 위한 항생제) 등의 1종 이상의 부가적인 제제가 보충된다.
일부 구현예들에서, 세포를 포함하는 하이드로겔 입자는 적어도 12시간의 기간 동안 이종의 수-비혼화성 화합물을 생산하는데 적합한 조건 하에 배양한다. 일부 구현예들에서, 세포를 포함하는 하이드로겔 입자는 12 내지 24시간의 기간 동안 이종의 수-비혼화성 화합물을 생산하는데 적합한 조건 하에 배양한다. 일부 구현예들에서, 세포를 포함하는 하이드로겔 입자는 적어도 24시간의 기간 동안 이종의 수-비혼화성 화합물을 생산하는데 적합한 조건 하에 배양한다. 일부 구현예들에서, 세포를 포함하는 하이드로겔 입자는 약 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 72시간 이상의 기간 동안 이종의 수-비혼화성 화합물을 생산하는데 적합한 조건 하에 배양한다.
6.2.2.2 검출
하이드로겔 입자 안에 캡슐화된, 즉, 캡슐화된 내부의 세포 또는 세포 클론 집단으로부터 생산된, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물은, 유세포 측정, 세포 분류, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 자기 활성화된 세포 분류 (MACS), 광 현미경 또는 공초점 현미경을 이용한 내부에 캡슐화된 세포 및/또는 입자의 검경, 및/또는 캡슐화된 세포의 분리 등의, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 표준 세포 검출 기법을 이용하여, 검출할 수 있다.
특정 구현예에서, 수 비-혼화성 화합물을 생산하는 세포를 포함하는 입자는 형광 활성화된 세포 분류기 (FACS)를 이용하여 분류할 수 있다. 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 특성을 기반으로 세포 등의 입자를 분리하기 위한 잘 알려져 있는 방법이다 (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). 개별 입자에서 형광 모이어티들을 레이저로 여기시키면, 혼합물로부터 양성 입자와 음성 입자가 전자기적으로 분리된다. 일 구현예에서, 입자는 입자 안에 캡슐화된 세포에 의해 생산되는 이종의 수 비-혼화성 화합물에 결합하는, 예컨대 직접 결합하는 친지성의 형광 염료로 염색한다. 입자는 세포 분류기를 통해 처리되어, 사용되는 형광 표지물에 대한 결합력을 기초로 입자가 분리가능해진다. 일부 구현예들에서, 정방향 또는 측방 산란기 (side scatter)를 사용하여 세포로 점유된 (cell-occupied) 하이드로겔 입자를 비어있는(unoccupied) 하이드로겔 입자와 구분할 수 있다. 그런 후, 상기 점유된 입자는 바람직한 형광 프로파일을 가진 세포 아집단을 검출하기 위해 추가로 게이팅(gate)할 수 있다. FACS로 분류한 입자들은 96웰 또는 384웰 플레이트의 각각의 웰에 직접 증착하여, 안에 캡슐화된 세포의 분리 (separation), 격리 (isolation) 및 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
본원에 제공된 검출, 스크리닝 및/또는 농화 방법에 대한 일부 구현예들에서, 본 방법은 하이드로겔 입자를 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료와 접촉시키는 단계, 및 상기 형광 염료를 상기 하이드로겔 입자 안에서 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 형광 염료는 용매변색 염료 (solvatochromic dye)이다. 형광 용매변색 염료는 분자를 둘러싼 용매의 극성에 따라 색이 변하고, 예를 들어 생물학적 분자, 특히 지질 분자의 동역학을 고감도의 실시간 관찰에서의 프로브와 같이 사용되는, 염료이다. 이의 색 변화 기전은 직접 결합을 통해 달성되며, 특정 화합물 종들과의 접촉이 필요한 것은 아니다. 이러한 형광 용매변색 염료로는 NBD, Dansyl, DASPMI, Prodan, Dapoxyl, 4-DMAP, 4-아미노-1,8-나프탈이미드 유도체, 라이하르트 염료 (Reichardt's dye) 및 Nile Red를 포함한다.
일부 구현예들에서, 형광 용매변색 염료는 Nile Red이다. Nile Red는 형광 현미경 및 유세포 특정에 의해 세포내 지질 액적을 검출하기 위해, 예컨대 포유류 세포, 박테리아, 효모 및 미세조류 등의 동물 세포 및 미생물의 지질 함량을 평가하기 위해, 흔히 사용되고 있는 지용성 형광 염료이다. Nile Red는 본원에 기술된 재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물의 고성능 검출에 이상적이게 만드는 몇가지 고유한 특징들을 가진다. 예를 들어, Nile Red는 소수성 환경에서 형광성이 강하며, 친수성 환경에서는 소광 (quenching)되며, 그외 유사한 용매변색 염료, 이의 여기 및 방출 스펙트럼은 이의 천연 환경에서 스펙트럽 위치, 형태 및 강도 측면에서 다양하다. Nile Red의 용매변색 특성은 포스포- 및 극성 지질에 결합된 Nile Red의 편미분(partial differentiation)을 허용한다. 인지질 세포 막 등의 극성 지질에서, Nile Red는 ~ 590 nm에서 최대 형광 방출을 나타낸다. 반면에, 중성 지질, 예컨대 탄화수소 산물 (예, 파르네신)이 존재하는 경우, 그 스펙트럼은 550 nm의 최대 방출에서 블루-쉬프트된다. 따라서, 본원에 기술된 방법에 대한 특정 구현예에서, 스펙트럼의 녹색 (525 +/- 20 nm) 및 적색 (670 +/- 20 nm) 영역에서의 광학 필터는, 이상적인 생산 세포 (예, 순수 파르네신)와 완전한 비-생산 세포 간의 녹색 대 적색 형광 비를 최대화하기 위해, 검출하는 동안에 사용된다. 형광 데이타는 녹색 및 적색 스펙트럼 둘다에서 포착할 수 있으며, 녹색 대 적색 형광 비를 사용하여 마이크로콜로니에서 세포 생물량의 양에 대해 정규화(normalize)한 마이크로콜로니 내부의 수 비-혼화성 화합물의 양을 측정하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 방법은, (a) 캡슐화된 마이크로콜로니에 의해 생산되는 수 비-혼화성 화합물의 양과, (b) 캡슐화된 마이크로콜로니의 세포 생물량을 동시에 측정하는데, Nile Red 등의 용매변색 염료를 유용하게 활용한다. 예를 들어, 세포벽을 구비한 마이크로콜로니의 대조염색 또는 핵 특이 염색에 의한 세포 생물량의 개별 측정에 대한 요건을 불필요하게 하거나, 또는 마이크로콜로니의 광학 세기를 측정함으로써, 다른 스크리닝 방법에 비해 고성능과 효율을 달성할 수 있다.
마이크로콜로니의 녹색 대 적색 형광 (G/R) 비는 캡슐화된 세포 콜로니에서 상대적인 생산 : 생물량 비율을 특정하는데 유익하게 사용될 수 있으며, 그에 따라 집단을 분류할 수 있다. 예를 들어, 피코스크리닝한 콜로니는 다음과 같은 것으로 분류할 수 있다: (a) 상대적으로 높은 G/R 비율, 이는 상대적으로 천천히 증식하는/고생산 집단을 나타낼 수 있음; 또는 (b) 상대적으로 낮은 G/R 비율, 이는 상대적으로 빠르게 증식하는/저생산 집단, 상대적으로 빠르게 증식하는/고생산 집단, 또는 상대적으로 느리게 증식하는/저생산 집단을 나타낼 수 있음. 마이크로콜로니의 G/R 비율은, 집단을 추가로 특정화하기 위해, 집단에서 생산되는 화합물의 양을 나타내는, 이의 녹색 형광 단독 수치 (G)와 조합하여 추가로 사용될 수 있다. 예를 들어, G/R 비는 낮지만 G 값은 높은 피코스크리닝한 콜로니는 상대적으로 빠르게 증식하는/고생산 집단을 의미할 수 있으며, G/R 비는 낮지만 G 값은 높은 피코스크리닝한 콜로니는 상대적으로 느리게 증식하는/저생산 집단 또는 빠르게 증식하는/저생산 집단을 의미할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 검출, 스크리닝 및/또는 농화 방법에 대한 일부 구현예들에서, 본 방법은 하이드로겔 입자내 수-비혼화성 화합물의 양을 하이드로겔 입자내 세포 생물량의 양에 대해 정규화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 정규화는, (a) 하이드로겔 입자내 수-비혼화성 화합물의 형광 수준, 및 (b) 하이드로겔 입자내 세포 생물량의 형광 수준을 측정하는 단계, 및 (b)에서 측정된 형광에 대해 (a)에서 측정된 형광의 비율을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 형광 염료는 Nile Red이며, 상기 정규화는 하이드로겔 입자내 수-비혼화성 화합물 수준에 해당되는 녹색 스펙트럼 (예, 525 +/- 20 nm)에서의 형광 수준을 측정하는 단계, 하이드로겔 입자내 세포 생물량 수준에 해당되는 적색 스펙트럼 (670 +/- 20 nm)에서의 형광 수준을 측정하는 단계, 및 적색 형광에 대한 녹색 형광 비 (G/R)를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 본 방법은 G/R 비가 높은 하이드로겔 입자를 선별하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 녹색 형광 수준이 높은 하이드로겔 입자를 선별하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 G/R 입자가 높고 녹색 형광 수준이 높은 하이드로겔 입자를 선별하는 단계를 더 포함한다.
6.2.2.3 검출을 위한 스펙트럼 조건 선정
복수의 캡슐화된 세포로부터 생산되는 WIC에 결합된 형광 염료를 선별적으로 검출하는데 적합한 스펙트럼 조건의 결정은 몇가지 구현예들로 수행할 수 있다. 일 구현예에서, (1) 복수의 세포에 의해 재조합으로 생산되는 WIC; (2) WIC에 직접 결합하는 형광 염료; 및 (3) 숙주 세포의 임의 조합의 경우, 스펙트럼 조건은 WIC에 결합한 염료의 특이적인 검출을 수행할 수 있는 여기 파장을 동정하는 단계를 포함하는 방법으로 측정할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 WIC에 결합한 염료를 특이적으로 검출할 수 있는 방출 파장을 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 WIC에 결합한 염료를 특이적으로 검출할 수 있는 여기 파장과 방출 파장의 쌍을 동정하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은, 숙주 세포 생물량 유래 형광은 검출되지 않고, WIC에 결합된 형광 염료를 충분히 선별하는, 여기 파장과 방출 파장의 쌍을 동정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, WIC에 결합된 형광 염료를 검출하기 위한 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 양립성 야기 파장 (compatible excitation wavelength)을 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 양립성 야기 파장은 하기 단계에 의해 결정된다:
(a) 형광 염료를 복수의 제1 세포 집단 및 복수의 제2 세포 집단과 접촉시키는 단계로서, 상기 복수의 제1 집단과 복수의 제2 집단의 세포는 스크리닝할 WIC-생산 세포로서 동일한 세포 타입이며, 각각의 복수의 집단이 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단을 포함하며, 복수의 제1 세포 집단은 각각 WIC를 포함하며, 복수의 제2 세포 집단은 WIC를 포함하지 않는 것인, 단계;
(b) 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 각각에 대해 여기 스펙트럼을 구하는 단계; 및
(c) 하기로 특정되는 여기 파장을 선택하는 단계:
(i) 동일한 세포 밀도를 가진, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이가, 80% 이상이고
(ii) 상기 복수의 제2 세포 집단에서 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단 간의 형광 차이가 250% 이하임.
일부 구현예들에서, WIC에 결합된 형광 염료를 선택적으로 검출하는데 충분한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 양립성 방출 파장을 결정하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 양립성 방출 파장은 하기 단계에 의해 결정된다:
(a) 형광 염료를 복수의 제1 세포 집단 및 복수의 제2 세포 집단과 접촉시키는 단계로서, 상기 복수의 제1 집단과 복수의 제2 집단의 세포는 스크리닝할 WIC-생산 세포로서 동일한 세포 타입이며, 각각의 복수의 집단이 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단을 포함하며, 복수의 제1 세포 집단은 각각 WIC를 포함하며, 복수의 제2 세포 집단은 WIC를 포함하지 않는 것인, 단계;
(b) 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 각각에 대해 방출 스펙트럼을 구하는 단계; 및
(c) 하기로 특정되는 방출 파장을 선택하는 단계:
(i) 동일한 세포 밀도를 가진, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이가, 80% 이상이고
(ii) 상기 복수의 제2 세포 집단에서 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단 간의 형광 차이가 250% 이하임.
특정 구현예에서, WIC에 결합된 형광 염료를 선택적으로 검출하는데 충분한 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은, (i) 동일한 광학 밀도를 가진, 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이가, 80% 이상이고; 및 (ii) 상기 복수의 제2 세포 집단에서 OD5인 세포 집단과 OD25인 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이하인, 여기 및 방출 파장, 즉, 양립가능한 여기 및 방출 파장 쌍을 선택하는 단계를 포함한다.
본 방법이 제1 및 제2 복수 세포들에 대해 여기 스펙트럼을 구하는 단계를 포함하는 경우, 방출 파장은 일정하게 유지하고, 여기 스펙트럼은 예컨대 250 nm - 500 nm에서 또는 이의 서브세트 파장에서 수득한다. 일부 구현예들에서, 방출 파장은 방출 파장이 수득하는 여기 스펙트럼의 여기 파장 범위를 벗어난 인접한 파장에서 일정하게 유지된다. 특정 구현예에서, 방출 파장은 550 nm에서 유지된다. 마찬가지로, 본 방법이 제1 및 제2 복수 세포들에 대해 방출 스펙트럼을 구하는 단계를 포함하는 경우, 여기 파장은 일정하게 유지하고, 방출 스펙트럼은 예컨대 260 nm - 720 nm에서 또는 이의 서브세트 파장에서 수득한다. 특정 구현예에서, 여기 파장은 290 nm에서 유지된다. 형광 스펙트럼을 수득할 수 있는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 형광측정기가 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다.
전술한 방법에 사용가능한 복수의 제1 세포 집단 및 복수의 제2 세포 집단은 바람직하게는 상당한 수준의 백그라운드 형광이 분석에 기여하지 않는 액체 배지에 포함된다. 예를 들어, 세포는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 세포 배양 또는 세포-기반의 분석에 통상적으로 사용되는 수용액, 예컨대 생물학적 완충액, 예를 들어 포스페이트 완충화된 염수, 또는 세포의 증식을 지지할 수 있는 임의 배지내로 첨가될 수 있다.
일부 구현예들에서, 세포 집단의 세포 밀도 x는 600 nm (OD600)에서의 세포 집단의 광학 밀도이다. 예를 들어, 세포 밀도가 x인 제1 세포 집단의 OD600이 1인 경우, 세포 밀도가 5x인 세포 집단의 OD600은 5이다. 일부 구현예들에서, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단은 각각 세포 밀도가 증가된 2 이상의 세포 집단, 예컨대 x 및 5x (예, OD600 1 및 5)인 세포 집단들, x 및 10x (예, OD600 1 및 10)인 세포 집단들, 또는 x 및 20x (예, OD600 1 및 20)인 세포 집단들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 복수의 제1 세포 집단들과 복수의 제2 세포 집단들은 보다 높거나 낮은 광학 밀도의 집단을 포함한다. 예를 들어, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단은 OD가 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상인 세포 집단들을 더 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단은, 형광 스펙트럼을 수득하는, 세포 밀도가 증가된 세포 집단을 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상의 수로 포함하며, 상기 복수의 집단들은 OD600이 5인 집단과 OD600이 25인 집단들을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 복수의 제1 집단과 복수의 제2 집단은 OD600이 5, 10, 15, 20 및 25인 세포 집단들을 포함한다. 다른 구현예들에서, 상기 복수의 제1 세포들과 복수의 제2 세포들은 OD600이 1 및 10, 1 및 15, 5 및 20, 10 및 20, 또는 10 및 25인 집단들을 포함한다. 바람직하게는, 세포 밀도 x와 세포 밀도 5x는 해당 세포 타입에 대해 600 nm에서 분광광도계로 검출하기 위한 동역학적 범위내이다.
선택적인 스펙트럼 조건이 구해지는 수-비혼화성 화합물 (WIC)과 관련하여, 스펙트럼 조건을 결정하기 위해, WIC는 예컨대 정제된 화합물로서 상기 복수의 제1 세포 집단들을 구성하는 세포를 포함하는 수계 배지에 첨가될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 복수의 제1 세포 집단의 세포들은 WIC를 생산하도록 변형된 재조합 세포일 수 있다. WIC를 생산하는 재조합 세포를 이용하는 일부 구현예들에서, 세포에 의해 생산되는 WIC의 양은, 예컨대 수율 (기질 g 당 화합물 g, 예, 슈크로스), 생산 수준 (g/L) 및/또는 생산율 수준 (g/L/시간)으로서 미리 확립된다. 상기 복수의 제1 세포 집단이 WIC를 생산하는 재조합 세포를 포함하는 일부 구현예들에서, 세포는 WIC에 특이적인 스펙트럼 조건을 결정하기 전에 WIC를 생산하는데 충분한 기간 동안 배양된다.
일부 구현예들에서, 상기 복수의 제1 세포 집단들은 각각 동량으로 WIC를 포함한다. 다른 구현예에서, 복수의 제1 세포 집단들은 WIC를 다양한 양으로 포함한다. 바람직하게는, WIC의 양은 접촉하는 동안에 WIC에 결합하기 위해 이용가능한 형광 염료의 양을 초과하지 않는다. 일구들서, 복수의 제1 세포 집단들 각각은 WIC를 적어도 0.1 g/L의 함량으로 포함한다. 다른 구현예에서, 복수의 제1 세포 집단들 각각은 WIC를 0.1 g/L 내지 10 g/l의 함량으로 포함한다. 일부 구현예들에서, 복수의 제1 세포 집단들 각각은 WIC를 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0 또는 15.0 g/L 이상의 함량으로 포함한다. 특정 구현예에서, WIC는 정제된 WIC로서 예컨대 상당한 함량의 백그라운드 형광이 분석에 기여하지 않는 용매 중에서 복수의 제1 세포 집단들 각각에 첨가된다. 특정 구현예에서, WIC는 적어도 2　g/L의 농도로 상기 복수의 제1 세포 집단들 각각에 외인적으로 첨가된다.
바람직하게는, 복수의 제1 세포 집단 및 복수의 제2 세포 집단의 세포들은, 형광 염료에 의해 결합될 수 있는 내인성 세포 타겟의 어떠한 양적 또는 질적 차이를 최소화하기 위해, 동일한 세포 타입이다. 바람직하게는, 복수의 제2 세포 집단의 세포들은 WIC를, 예컨대 외인적으로 첨가되거나 또는 재조합에 의해 생산되는 WIC를 포함하지 않는다. 그러나, WIC가 내인성 분자로서 복수의 제2 세포 집단의 세포들에 존재할 수 있는 경우, WIC는 또한 내인성 분자로서 상기 복수의 제1 세포 집단의 세포들에도 존재할 것이다.
일부 구현예들에서, WIC를 특이적으로 검출하기 위해 선택된 여기 파장 및/또는 방출 파장에서, 세포 밀도가 동일한, (WIC를 포함하는) 복수의 제1 세포 집단과 (WIC를 포함하지 않는) 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이는 80% 이상이다. 일부 구현예들에서, 이들 세포 집단들 간의 형광 차이는 적어도 약 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 500% 이상일 것이다.
일부 구현예들에서, WIC를 특이적으로 검출하기 위해 선택된 여기 파장 및/또는 방출 파장에서, 상기 복수의 제2 세포 집단으로부터 유래된, 세포 밀도가 x인 세포 집단과 세포 밀도가 5x인 세포 집단 간의 형광 차이는 250% 이하이다. 일부 구현예들에서, 이러한 차이는 약 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 20 또는 10% 이하이다.
본 발명은, Nile-Red 형광, 예를 들어 WIC에 결합된 Nile-Red의 형광으로부터의 영향없이, 세포로부터 오토형광 (autofluorescence)을 검출하기 위한 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법을, 추가로 제공한다. 오토형광은 세포 생물량에 대한 대체제로서 사용될 수 있으며, 따라서, 오토형광을 위해 선택적인 스펙트럼 조건이 결정되면, 해당 WIC-생산 세포 집단에서의 WIC : 세포 생물량 비는 2개의 선택적인 여기/방출 파장 쌍을 이용하여 수득할 수 있다.
일부 구현예들에서, 세포 오토형광에 대해 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 형광 염료를 복수의 제1 세포 집단 및 복수의 제2 세포 집단과 접촉시키는 단계로서, 상기 복수의 제1 집단과 복수의 제2 집단의 세포는 동일한 세포 타입이며, 각각의 복수의 집단이 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단을 포함하며, 복수의 제1 세포 집단은 각각 WIC를 포함하며, 복수의 제2 세포 집단은 WIC를 포함하지 않는 것인, 단계;
(b) 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 각각에 대해 여기 스펙트럼을 구하는 단계; 및
(c) 하기로 특정되는 여기 파장을 선택하는 단계:
(i) 동일한 세포 밀도를 가진, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이가, 80% 이하이고,
(ii) 상기 복수의 제2 세포 집단에서 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단 간의 형광 차이가 250% 이상임.
일부 구현예들에서, 세포 오토형광에 대해 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 형광 염료를 복수의 제1 세포 집단 및 복수의 제2 세포 집단과 접촉시키는 단계로서, 상기 복수의 제1 집단과 복수의 제2 집단의 세포는 동일한 세포 타입이며, 각각의 복수의 집단이 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단을 포함하며, 복수의 제1 세포 집단은 각각 WIC를 포함하며, 복수의 제2 세포 집단은 WIC를 포함하지 않는 것인, 단계;
(b) 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 각각에 대해 방출 스펙트럼을 구하는 단계; 및
(c) 하기로 특정되는 방출 파장을 선택하는 단계:
(i) 동일한 세포 밀도를 가진, 상기 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이가, 80% 이하이고,
(ii) 상기 복수의 제2 세포 집단에서 세포 밀도 x인 세포 집단과 세포 밀도 5x인 세포 집단 간의 형광 차이가 250% 이상임.
특정 구현예에서, 세포 오토형광에 대해 선택적인 스펙트럼 조건을 결정하는 방법은, (i) 동일한 세포 밀도를 가진, 복수의 제1 세포 집단과 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이가, 80% 이하이고; 및 (ii) 상기 복수의 제2 세포 집단에서 세포 밀도가 x인 세포 집단과 세포 밀도가 5x인 세포 집단들 간의 형광 차이가 250% 이상인, 여기 및 방출 파장, 즉, 양립가능한 여기 및 방출 파장 쌍을 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 세포 오토형광을 특이적으로 검출하기 위해 선택된 여기 파장 및/또는 방출 파장에서, 세포 밀도가 동일한, (WIC를 포함하는) 복수의 제1 세포 집단과 (WIC를 포함하지 않는) 복수의 제2 세포 집단 간의 형광 차이는 80% 이하이다. 일부 구현예들에서, 이들 세포 집단들 간의 형광 차이는 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10% 이하일 것이다.
일부 구현예들에서, 세포 오토형광을 특이적으로 검출하기 위해 선택된 여기 파장 및/또는 방출 파장에서, 상기 복수의 제2 세포 집단으로부터 유래된, 세포 밀도가 x인 세포 집단과 세포 밀도가 5x인 세포 집단 간의 형광 차이는 80% 이상이다. 일부 구현예들에서, 이러한 차이는 적어도 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 500% 이상이다.
6.2.3 스크리닝 및 농화 방법
다른 측면에서, 본 발명은, 하이드로겔 입자 안에 라이브러리를 구성하는 각 세포를 캡슐화하는 단계; 각 하이드로겔 입자 안에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 단계, 및 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 세포 라이브러리에서 재조합에 의해 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 방법은 상기 선별한 하이드로겔 입자로부터 세포를 분리하는 단계, 및 상기 캡슐화, 검출 및 선별을 반복하는 단계를 더 포함하며, 그래서 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포 또는 상기 세포의 클론 집단이 연속적인 선별 라운드를 통해 농화된다.
일부 구현예들에서, 본원에 제공되는 방법 및 조성물은, 하나 이상의 상기한 화합물을, 높은 수율, 생산, 생산율 및/또는 유전자 변형되지 않은 미생물 모 세포, 예를 들어 천연적으로 수-비혼화성 화합물을 일정량 생산하지 않는 천연 모 세포, 또는 수-비혼화성 화합물을 이종적인 양이 아닌 천연적인 양으로 생산하는 천연 모 세포와 비교하여, 증가된 지속성으로 생산하도록 유전학적으로 변형된 미생물 세포에서, 산업적으로 유용한 화합물의 생산을 검출하는데 유용하다. 다른 구현예에서, 본 방법은 높은 수율, 생산, 생산율 및/또는 유전자 변형되지 않은 미생물 모 세포에 비해 증가된 지속성으로 상기한 1종 이상의 화합물을 생산하도록 유전자 변형된 미생물 세포를 동정하는데 유용하다. 예를 들어, 본 방법은 수-비혼화성 화합물을 생산하도록 모두 유전자 변형된 세포의 집단으로부터 보다 고도로 생산하는 세포를 동정하는데 사용할 수 있다. 일부 구현예들에서, 집단의 모든 세포는 동일한 방식으로 유전자 변형된다. 다른 구현예에서, 세포 집단은 수-비혼화성 화합물의 생산을 높이기 위한 여러가지 전략들을 통해 유전자 변형시킨 세포를 포함한다. 예를 들어, 스크리닝할 세포 집단은 화합물의 대사 경로를 구성하는 하나 이상의 성분들의 카피 수 또는 조절 방식 (예, 프로모터 사용법에 변화를 줌)의 변형을 포함하도록 변형된 세포를 포함할 수 있다. 본원에 제공되는 방법은 특히 수-비혼화성 화합물을 생산하기 위해 동일한 방식으로 유전자 변형된 다음 돌연변이를 거친 세포들로 구성된 집단에서 고 생산 균주를 동정하는데 유용하다. 일부 이러한 구현예들에서, 스크린 방법을 사용하여 하나 이상의 돌연변이를 가지고 있지 않은 세포에 비해 수-비혼화성 화합물의 수율, 생산 또는 생산율을 증가시키는 한가지 이상의 돌연변이를 가지고 있는 세포를 동정한다. 돌연변이화된 세포 집단들을 제조하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 모든 방법들, 예컨대, 비제한적인 예로서, UV 조사, γ선 조사, X선, 제한효소-유도성 돌연변이 유발, 돌연변이성 또는 유전자변형 유도(teratogenic) 화학제, DNA 복구 돌연변이원(DNA repair mutagen), DNA 복구 저해제, 오류 발생형 DNA 복제 단백질, N-에틸-N-니트로소우레아 (ENU), 에틸메탄설포네이트 (EMS) 및 ICR191을 비롯한 생리화학적 돌연변이 유도물(mutagen)의 사용; 또는 비제한적인 예로서 하나 이상의 다중 클로닝 사이트, 하나 이상의 전사 종결부, 하나 이상의 전사 조절 서열, 하나 이상의 번역 신호 서열, 하나 이상의 오픈 리딩 프래임 (ORF), 하나 이상의 서열 변이성 ORF, 하나 이상의 정지 서열, 하나 이상의 서열 변이성 또는 소거성 정지 코돈, 하나 이상의 mRNA 탈안정화 요소, 하나 이상의 헤어핀 서열, 하나 이상의 리포터 유전자, 하나 이상의 스플라이스 어셉터 서열, 하나 이상의 스플라이스 도너 서열, 하나 이상의 내부 리보좀 도입부 (IRES), 하나 이상의 프랜스포존 서열, 하나 이상의 부위-특이적인 재조합 사이트 서열, 하나 이상의 제한효소 서열, 하나 이상의 융합 파트너 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 하나 이상의 선별 마터 또는 선별 모듈, 숙주 세포에서 벡터의 증식에 유용한 하나 이상의 박테리아 서열, 하나 이상의 3' 유전자 트랩, 하나 이상의 5' 유전자 트랩, 위치화 신호를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 하나 이상의 복제 오리진, 하나 이상의 프로테아제 절단 사이트, 유전자 또는 유전자의 일부에 의해 코딩되는 하나 이상의 바람직한 단백질 또는 펩타이드, 및 하나 이상의 5' 또는 3' 폴리뉴클레오티드 테일을 코딩하는 하나 이상의 서열을 비롯한, 삽입형 돌연변이 유발물의 사용 등이 이용될 수 있다.
일부 구현예들에서, 본 방법은, 예컨대 캡슐화, 검출 및 선별 각 라운드 마다, 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포들의, 집단에서 다른 세포에 비해 높은 수준으로 생산하는 세포들의, 집단에서의 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상으로의 농화를 제공한다. 일부 구현예들에서, 본 방법은 제1 집단에서 1:10, 1:100 또는 1:1000 비율인 세포 또는 세포의 집단의 농화된 집단에서 1:2 이상 또는 1:2 내지 1:1로의 농화를 제공한다. 일부 구현예들에서, 농화는 캡슐화, 검출 및 선별의 1회, 2회 또는 3회를 통해 이루어진다. 일부 구현예들에서, 농화는 캡슐화, 검출 및 선별의 3회, 4회 또는 5회 라운드내에 이루어진다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은 WIC 대 세포 생물량의 비로서 표시되는 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 세포 생물량은 WIC에 결합된 형광 염료의 형광이 검출되지 않는 스펙트럼 조건에서 상기 복수의 세포들에서 오토형광을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 측정된다. 일부 구현예들에서, 상기 WIC : 생물량의 비는, 활용 WIC 및 생물량의 각각의 개별 특정 측정치의 상대적인 형광 단위 (RFU)를 기초로 계산될 수 있으며, 본원에 기술된 스펙트럼 조건을 선별하는데 이용된다. 일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 약 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 또는 1:100의 WIC : 생물량 비율로 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 약 100:1 이상 또는 1:100 미만의 WIC : 생물량 비율로 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 발효 배지 1 L 당 약 10 g 이상의 함량으로 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물은 세포 배양물 1 L 당 약 10 내지 약 50 g, 약 15 g 이상, 약 20 g 이상, 약 25 g 이상, 또는 약 30 g 이상의 양으로 생산된다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 세포 건조 중량 1 g 당 약 50 mg 이상의 함량으로 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물은 세포 건조 중량 1 g 당 약 50 내지 약 1500 mg, 약 100 mg 이상, 약 150 mg 이상, 약 200 mg 이상, 약 250 mg 이상, 약 500 mg 이상, 약 750 mg 이상, 또는 약 1000 mg 이상의 함량으로 생산된다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 세포 배양물 기준의 단위 부피 당, 본원에 기술된 바와 같이, 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 세포 배양물 기준의 단위 부피 당, 본원에 기술된 바와 같이 유전자 변형된 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 단위 건조 세포 중량 당, 본원에 제공된 방법에 따라 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 단위 건조 세포 중량 당, 본원에 제공된 방법에 따라 유전자 변형된 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 세포 배양물의 단위 부피/시간 당, 본원에 제공된 방법에 따라 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 세포 배양물 단위 부피/시간 단위 당, 본원에 제공된 방법에 따라 유전자 변형된 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다.
일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 단위 건조 세포 중량/단위 시간 당, 본원에 제공된 방법에 따라 유전자 변형되지 않은 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다. 일부 구현예들에서, 스크리닝 방법은, 단위 건조 세포 중량/단위 시간 당, 본원에 제공된 방법에 따라 유전자 변형된 미생물 세포에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물의 양에 비해, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배, 또는 그 이상, 더 많은 양으로, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포 또는 세포의 클론 집단을 동정하는데 충분하다.
6.2.4 하이드로겔에 캡슐화된 세포 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물 하나 이상을 포함하는 하이드로겔에 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 세포 또는 클론 세포 집단을 포함하며 추가적으로 재조합에 의해 생산된 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 포함하는, 하이드로겔 입자를 제공한다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물에 이용가능한 세포로는 수-비혼화성 화합물, 예를 들어 이소프레노이드, 폴리케타이드, 지방산 등을 천연적으로 또는 재조합에 의해 생산할 수 있는 모든 세포를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 원핵생물 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 박테리아 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS-7 세포, 마우스 섬유모세포, 마우스 배아 암종 세포 또는 마우스 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 곤충 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 S2 세포, 슈나이더 세포(Schneider cell), S12 세포, 5B1-4 세포, Tn5 세포 또는 Sf9 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 단세포성 진핵생물 세포이다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 균사체 박테리아 세포 (mycelial bacterial cell)이다. 일부 구현예들에서, 균사체 박테리아 세포는 액티노마이세테스 강 세포이다. 특정 구현예에서, 균사체 박테리아 세포는 속명 스트렙토마이세스에 속하며, 예컨대 스트렙토마이세스 암보팩시엔스(Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 아베미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 아주레우스(Streptomyces azureus), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 쿠라코이(Streptomyces curacoi), 스트렙토마이세스 에리트레우스(Streptomyces erythraeus), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 갈릴래우스(Streptomyces galilaeus), 스트렙토마이세스 글라우세센스(Streptomyces glaucescens), 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 파르불루스(Streptomyces parvulus), 스트렙토마이세스 페우세티우스(Streptomyces peucetius), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 로세오풀부스(Streptomyces roseofulvus), 스트렙토마이세스 써모톨레란스(Streptomyces thermotolerans), 스트렙토마이세스 비올라세오루버(Streptomyces violaceoruber)이다.
다른 구현예에서, 상기 세포는 진균 세포 (fungal cell)이다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 세포는 효모 세포이다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물에 사용사능한 효모는 미생물 기탁기관 (예, IFO, ATCC 등)에 기탁된 효모를 포함하며, 특히 속명 아시쿨로코니디움(Aciculoconidium), 암브로시오지마(Ambrosiozyma), 아르트로아스쿠스(Arthroascus), 아르시오지마(Arxiozyma), 아쉬비아(Ashbya), 바브제비아(Babjevia), 벤싱토니아(Bensingtonia), 보트리오아스쿠스(Botryoascus), 보트리오지마(Botryozyma), 브레타노마이세스(Brettanomyces), 불레라(Bullera), 불레로마이세스(Bulleromyces), 칸디다(Candida), 시테로마이세스(Citeromyces), 클라비스포라(Clavispora), 크립토코커스(Cryptococcus), 시스토필로바시디움(Cystofilobasidium), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 데카라(Dekkara), 디포다스콥시스(Dipodascopsis), 디포다스쿠스(Dipodascus), 에니엘라(Eeniella), 엔도마이콥셀라(Endomycopsella), 에레마스쿠스(Eremascus), 에레모테시움(Eremothecium), 에리트로바시디움(Erythrobasidium), 펠로마이세스(Fellomyces), 필로바시디움(Filobasidium), 갈락토마이세스(Galactomyces), 지오트리쿰(Geotrichum), 귈리에르몬델라(Guilliermondella), 한세니아스포라(Hanseniaspora), 한세뉼라(Hansenula), 하세가와이에(Hasegawaea), 홀터만니아(Holtermannia), 호르모아스쿠스(Hormoascus), 히포피키아(Hyphopichia), 이사첸키아(Issatchenkia), 클로에케라(Kloeckera), 클로에케라스포라(Kloeckeraspora), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 콘도아(Kondoa), 쿠라이쉬아(Kuraishia), 쿠르츠마노마이세스(Kurtzmanomyces), 루코스포리디움(Leucosporidium), 리포마이세스(Lipomyces), 로데로마이세스(Lodderomyces), 말라세지아(Malassezia), 메츠슈니코위아(Metschnikowia), 므라키아(Mrakia), 믹소지마(Myxozyma), 나드소니아(Nadsonia), 나카자와에아(Nakazawaea), 네마토스포라(Nematospora), 오가타에아(Ogataea), 오스포리디움(Oosporidium), 파키솔렌(Pachysolen), 파키티코스포라(Phachytichospora), 파피아(Phaffia), 피키아(Pichia), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 로도토룰라(Rhodotorula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 사카로마이코데스(Saccharomycodes), 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis), 세이토엘라(Saitoella), 사카구키아(Sakaguchia), 사투르노스포라(Saturnospora), 시조블라스토스포리온(Schizoblastosporion), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 스포로파키더미아(Sporopachydermia), 스테파노아스쿠스(stphanoascus), 스테리그마토마이세스(Sterigmatomyces), 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium), 심비오타프리나(Symbiotaphrina), 심포디오마이세스(Sympodiomyces), 심포디오마이콥시스(Sympodiomycopsis), 투룰라스포라(Torulaspora), 트리코스포리엘라(Trichosporiella), 트리코스포론(Trichosporon), 트리고놉시스(Trigonopsis), 츠키야에아(Tsuchiyaea), 우데니오마이세스(Udeniomyces), 왈토마이세스(Waltomyces), 위커하미아(Wickerhamia), 위커하미엘라(Wickerhamiella), 윌리옵시스(Williopsis), 야마다지마,(Yamadazyma), 야로이아(Yarrowia), 지고아스투스(Zygoascus), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 지고윌리옵시스(Zygowilliopsis) 및 지고지마(Zygozyma)에 속한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 방법 및 조성물에 사용되는 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 파키아 파스토리스(Pichia pastoris), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 데케라 브룩셀렌시스(Dekkera bruxellensis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) (예전엔 사카로마이세스 락티스(Saccharomyces lactis)로 지칭되었음), 클루베로마이세스 마르시아누스(Kluveromyces marxianus), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 또는 한세눌라 폴리모르파 (지금은 피키아 앙구스타(Hansenula polymorpha)로 지칭됨)를 포함한다. 일부 구현예들에서, 미생물은 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica), 칸디다 귈리에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis) 또는 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 등의 칸디다 속의 균주이다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 사카로마이세스 세레비지애 세포이다. 일부 구현예들에서, 사카로마이세스 세레비지애 세포는 빵 효모, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, 및 AL-1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 사카로마이세스 세레비지애의 균주는 PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1 및 SA-1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 사카로마이세스 세레비지애의 균주는 PE-2이다. 다른 구체적인 구현예에서, 사카로마이세스 세레비지애 균주는 CAT-1이다. 다른 특정 구현예에서, 사카로마이세스 세레비지애 균주는 BG-1이다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 반수체 미생물 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 이배체 미생물 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 이형접합체 (heterozygous)이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 교배형 대립유전자(즉, 세포가 포자를 형성하여야 한다면, 제조되는 반수체 미생물 세포 4개는 이의 교배형 대립유전자를 제외하고는 유전적으로 동일하며, 반수체 세포들 중 2개는 교배형 a일 것이며, 다른 반수체 세포 2개는 교배형 α일 것임)를 제외한 다른 것에 대해서는 동형접합형이다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 산업 발효, 예컨대 바이오에탄올 발효에 적합한 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 세포는, 산업 발효 환경에서 인지된 스트레스 환경인, 높은 용매 농도, 고온, 확장된 기질 이용성, 영양 한계, 삼투 스트레스 원인, 산도, 설파이트 및 박테리아 오염 또는 이들의 조합 하에 존속하도록 개조된다.
수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포, 예컨대 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산을 재조합에 의해 생산하는 세포와 상기 세포의 제조 방법에 대한 예가 아래에 제시된다.
6.2.4.1 이소프레노이드를 생산하는 재조합 세포
일 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 한가지 이상의 이소프레노이드 화합물을 재조합에 의해 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포의 클론 집단에서 이소프레노이드 생산을 검출하는 방법을 제공한다. 이소프레노이드는 메발로네이트-의존형 ("MEV") 경로 또는 1-데옥시-D-자일룰로스 5-디포스페이트 ("DXP") 경로의 효소들에 의해 생합성할 수 있는, 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)로부터 유래된다. MEV 경로는 도 1A에 개략적으로 도시되며, DXP 경로는 도 1B에 개략적으로 도시된다.
6.2.4.1.1 MEV 경로
본원에 제공되는 이소프레노이드 생산 세포를 검출하는 방법에 대한 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는, 유전적으로 비-변형된 모 세포와 비교하여, 한가지 이상의 이소프레노이드 화합물의 생산을 증가시키는, MEV 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 아세틸-코엔자임 A 2 분자를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 만들 수 있는 효소, 예컨대 아세틸-CoA 티올라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)), (D49362; 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)), 및 (L20428; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae))이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 아세토아세틸-CoA를 다른 아세틸-CoA 분자와 축합하여 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)를 만들 수 있는 효소, 예컨대 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (NC_001145. complement 19061.20536; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), (X96617; 사카로마이세스 세레비지애), (X83882; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라(Kitasatospora griseola)), (BT007302; 호모 사피엔스(Homo sapiens)), 및 (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus))가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (NM_206548; 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), (NM_204485; 갈루스 갈루스(Gallus gallus)), (AB015627; 스트렙토마이세스(Streptomyces) sp. KO 3988), (AF542543; 니코티아나 아테누아타(Nicotiana attenuata)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라, (AX128213, 절단형 HMGR을 코딩하는 서열 제공; 사카로마이세스 세레비지애), 및 (NC_001145: complement (115734.118898; 사카로마이세스 세레비지애)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 메발로네이트 키나제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (L77688; 아라비돕시스 탈리아나), 및 (X55875; 사카로마이세스 세레비지애)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF429385; 헤베아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis)), (NM_006556; 호모 사피엔스), 및 (NC_001145. complement 712315.713670; 사카로마이세스 세레비지애)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 메발로네이트 5-피로포스페이트를 IPP로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (X97557; 사카로마이세스 세레비지애), (AF290095; 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)) 및 (U49260; 호모 사피엔스)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로의 효소 1종 이상을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로의 효소 2종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소와 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로의 효소 3종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로의 효소 4종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로의 효소 5종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로의 효소 6종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로를 통해 제조되는 IPP를 이의 이성질체, 디메틸알릴 피로포스페이트 ("DMAPP")로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. DMAPP는 다양한 부가적인 효소들의 작용을 통해 축합 및 변형되어, 단순한 이소프레노이드 보다는 복잡한 이소프레노이드가 만들어질 수 있다 (도 2).
6.2.4.1.2 DXP 경로
본원에 제공되는 이소프레노이드 생산 세포를 검출하는 방법에 대한 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 유전적으로 비-변형된 모 세포와 비교하여 한가지 이상의 이소프레노이드 화합물의 생산을 증가시키는데 작용하는, DXP 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 아세틸-코엔자임 A 2분자를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 만들 수 있는 효소, 예컨대 아세틸-CoA 티올라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; 에셰리키아 콜라이), (D49362; 파라코커스 데니트리피칸스), 및 (L20428; 사카로마이세스 세레비지애)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 피루베이트를 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트와 축합하여 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 만들 수 있는 효소, 예컨대 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF035440; 에셰리키아 콜라이), (NC_002947, locus tag PP0527; 슈도모나스 푸티다 KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; 살모넬라 엔테리카 파라티피, ATCC 9150), (NC_007493, locus tag RSP_0254; 로도박터 스페어로이데스 2.4.1), (NC_005296, locus tag RPA0952; 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) CGA009), (NC_004556, locus tag PD1293; 자일렐라 파스티디오사 테메쿨라(Xylella fastidiosa Temecula1)) 및 (NC_003076, locus tag AT5G11380; 아라비돕시스 탈리아나)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 레덕토이소머라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AB013300; 에셰리키아 콜라이), (AF148852; 아라비돕시스 탈리아나), (NC_002947, locus tag PP1597; 슈도모나스 푸티다 KT2440), (AL939124, locus tag SCO5694; 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) A3(2)), (NC_007493, locus tag RSP_2709; 로도박터 스페어로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 2.4.1) 및 (NC_007492, locus tag Pfl_1107; 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) PfO-1)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 2C-메틸-D-에리트리톨-4-포스페이트를 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF230736; 에셰리키아 콜라이), (NC_007493, locus tag RSP_2835; 로도박터 스페어로이데스 2.4.1), (NC_003071, locus tag AT2G02500; 아라비돕시스 탈리아나), 및 (NC_002947, locus tag PP1614; 슈도모나스 푸티다 KT2440)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨을 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 키나제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF216300; 에셰리키아 콜라이) 및 (NC_007493, locus tag RSP_1779; 로도박터 스페어로이데스 2.4.1)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨-2-포스페이트를 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF230738; 에셰리키아 콜라이), (NC_007493, locus tag RSP_6071; 로도박터 스페어로이데스 2.4.1), 및 (NC_002947, locus tag PP1618; 슈도모나스 푸티다 KT2440)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트를 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AY033515; 에셰리키아 콜라이), (NC_002947, locus tag PP0853; 슈도모나스 푸티다 KT2440), 및 (NC_007493, locus tag RSP_2982; 로도박터 스페어로이데스 2.4.1)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐-4-디포스페이트를 IPP 또는 이의 이성질체, DMAPP로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 이소펜틸/디메틸알릴 디포스페이트 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AY062212; 에셰리키아 콜라이) 및 (NC_002947, locus tag PP0606; 슈도모나스 푸티다 KT2440)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 1종 이상을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 2종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 3종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 4종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 5종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 6종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 5종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DXP 경로의 효소 7종을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포의 자체 대사 공정과 IPP 생산에 관여하는 상기한 공정들 간에 "혼선" (또는 간섭)은 최소화되거나 전체적으로 소거된다. 예를 들어, 혼선은 숙주 미생물이 IPP 합성을 위해 DXP 경로에만 의존하고 MEV 경로가 부가적인 IPP를 제공하기 위해 도입되는 경우에 최소화되거나 완전히 없어진다. 이러한 숙주 유기체는 MEV 경로 효소들의 발현을 변형시키거나 또는 MEV 경로와 조합된 중간 산물을 가공하도록 갖추어져 있지 않을 것이다. 거의 또는 주로 DXP 경로에만 의존하는 유기체로는 예를 들어 에셰리키아 콜라이를 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로를 통해서만 또는 DXP 경로와 조합하여 IPP를 생산한다. 다른 구현예에서, 숙주의 DXP 경로는 기능적으로 불능이어서, 숙주 세포는 이종으로 도입된 MEV 경로를 통해서만 IPP를 생산한다. DXP 경로는 DXP 경로 효소들 중 하나 이상의 기능을 불활화하거나 유전자 발현을 불능화함으로써 기능적으로 불능이 될 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 세포에 의해 생산되는 이소프레노이드는 C5 이소프레노이드이다. 이들 화합물은 이소프렌 유닛 하나로부터 유래되며, 또한 헤미테르펜(hemiterpene)으로도 지칭된다. 다른 구현예에서, 이소프레노이드는 C10 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 유닛 2개로부터 유래된 것으로, 모노테르펜으로도 지칭된다. 모노테르펜에 대한 예로는 리모넨, 시트라넬롤, 게라니올, 멘톨, 페릴릴 알코올, 리나롤(linalool), 투존(thujone) 및 미르센(myrcene)이 있다. 다른 구현예에서, 이소프레노이드는 C15 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 유닛 3개로부터 유래된 것으로, 세스퀴테르펜(sesquiterpene)으로도 지칭된다. 세스퀴테르펜에 대한 예시적인 예로는 페리플라논 B(periplanone B), 깅코라이드(gingkolide) B, 아모르파디엔(amorphadiene), 아르테미시닌(artemisinin), 아르테미신산(artemisinic acid), 발렌센(valencene), 누트카톤(nootkatone), 에피-세드롤(epi-cedrol), 에피-아리스톨로첸(epi-aristolochene), 파르네솔(farnesol), 고시폴(gossypol), 사노닌(sanonin), 페리플라논(periplanone), 포르스콜린(forskolin) 및 패출롤(patchoulol)(또한, 패출리 알코올로 알려져 있음)이 있다. 다른 구현예에서, 이소프레노이드는 C20 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 유닛 4개로부터 유래되며, 디테르펜(diterpene)으로도 지칭된다. 디테르펜에 대한 예시적인 예로는 카스벤(casbene), 엘레우테로빈(eleutherobin), 파클리탁셀(paclitaxel), 프로스트라틴(prostratin), 슈돕테로신(pseudopterosin) 및 탁사디엔(taxadiene)이 있다. 또 다른 예로, 이소프레노이드는 C20+ 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 유닛 4개 이상으로부터 유래되며, 트리테르펜(triterpene) (이소프렌 유닛 6개로부터 유래된 C30 이소프레노이드 화합물), 예컨대 아르브루시드 E(arbrusideE), 브루세안틴(bruceantin), 테스토스테론(testosterone), 프로게스테론, 코르티손(cortisone), 디지톡신(digitoxin) 및 스쿠알렌; 테트라테르펜 (이소프레노이드 8개로부터 유래된 C40 이소프레노이드 화합물), 예컨대 β-카로틴; 및 폴리테르펜 (이소프렌 유닛 8개 이상으로부터 유래된 C40+ 이소프레노이드 화합물), 예컨대 폴리이소프렌을 포함한다. 일부 구현예들에서, 이소프레노이드는 아비에타디엔(abietadiene), 아모르파디엔(amorphadiene), 카렌(carene), α-파르네신, β-파르네신, 파르네솔(farnesol), 게라니올(geraniol), 게라닐게라니올, 이소프렌, 리나룰, 리모넨, 미르센, 네롤리돌(nerolidol), 오시멘(ocimene), 패출롤(patchoulol), β-피넨(β-피넨), 사비넨(sabinene), γ-테르피넨(γ-terpinene), 테르피놀렌(terpinolene) 및 발렌센(valencene)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이소프레노이드 화합물은 또한 카로테노이드 (예, 라이코펜, α-카로틴, β-카로틴, α-크립토잔틴, β-크립토잔틴, 빅신(bixin), 지아잔틴(zeaxanthin), 아스타잔틴(astaxanthin) 및 루테인(lutein)), 스테로이드계 화합물, 및 혼성 테르펜-알카로이드 및 코엔자임 Q-10과 같은 다른 화합물 기에 의해 변형된 이소프레노이드로 구성된 화합물을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 MEV 경로를 통해 생산되는 IPP를 DMAPP로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 IPP 이소머라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (NC_000913, 3031087.3031635; 에셰리키아 콜라이), 및 (AF082326; 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis))를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 IPP 및/또는 DMAPP 분자들을 축합하여 탄소 6개 이상을 함유한 폴리프레닐 화합물을 만들 수 있는 폴리프레닐 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 DMAPP 분자 1개와 IPP 분자 1개를 축합하여 게라닐 피로포스페이트 ("GPP") 분자 1개를 만들 수 있는 효소, 예컨대 GPP 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF513111; 아비에스 그란디스(Abies grandis)), (AF513112; 아비에스 그란디스), (AF513113; 아비에스 그란디스), (AY534686; 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus)), (AY534687; 안티리눔 마주스), (Y17376; 아라비돕시스 탈리아나), (AE016877, Locus AP11092; 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); ATCC 14579), (AJ243739; 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis)), (AY534745; 클라르키아 브레웨리(Clarkia breweri)), (AY953508; 입스 피니(Ips pini)), (DQ286930; 라이코페리시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)), (AF182828; 멘타 x 피페리타(Mentha x piperita)), (AF182827; 멘타 x 피페리타), (MPI249453; 멘타 x 피페리타), (PZE431697, Locus CAD24425; 파라코커스 지아잔티니팩시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)), (AY866498; 피크로리자 쿠로아(Picrorhiza kurrooa)), (AY351862; 비티스 비니페라(Vitis vinifera)), 및 (AF203881, Locus AAF12843; 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis))를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 IPP 분자 2개와 DMAPP 분자 1개를 축합하거나 또는 IPP 분자를 GPP 분자에 부가하여 파르네실 피로포스페이트 ("FPP")를 만들 수 있는 효소, 예컨대 FPP 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (ATU80605; 아라비돕시스 탈리아나), (ATHFPS2R; 아라비돕시스 탈리아나), (AAU36376; 아르테미시아 아누아(Artemisia annua)), (AF461050; 보스 타우루스(Bos taurus)), (D00694; 에셰리키아 콜라이 K-12), (AE009951, Locus AAL95523; 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; 지베렐라 푸지쿠로이(Gibberella fujikuroi)), (CP000009, Locus AAW60034; 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) 621H), (AF019892; 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)), (HUMFAPS; 호모 사피엔스), (KLPFPSQCR; 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)), (LAU15777; 루피누스 알부스(Lupinus albus)), (LAU20771; 루피누스 알부스), (AF309508; 무스 무스쿨루스(Mus musculus)), (NCFPPSGEN; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), (PAFPS1; 파르테니움 아르겐타툼(Parthenium argentatum)), (PAFPS2; 파르테니움 아르겐타툼), (RATFAPS; 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)), (YSCFPP; 사카로마이세스 세레비지애), (D89104; 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), (CP000003, Locus AAT87386; 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), (CP000017, Locus AAZ51849; 스트렙토코커스 피오게네스), (NC_008022, Locus YP_598856; 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS10750), (MZEFPS; 지아 메이스(Zea mays)), (AE000657, Locus AAC06913; 에쿠이펙스 에어올리쿠스(Aquifex aeolicus) VF5), (NM_202836; 아라비돕시스 탈리아나), (D84432, Locus BAA12575; 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)), (U12678, Locus AAC28894; 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) USDA 110), (BACFDPS; 지오바실러스 스테아로테르모필러스(Geobacillus stearothermophilus)), (NC_002940, Locus NP_873754; 헤모필러스 두크레이(Haemophilus ducreyi) 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd KW20), (J05262; 호모 사피엔스), (YP_395294; 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) subsp. sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; 렙토스피라 인테로간스 세로바르 코펜하게니(Leptospira interrogans serovar Copenhageni) str. Fiocruz L1-130), (AB003187; 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)(, (NC_002946, Locus YP_208768; 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae) FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; 리조비움 sp. NGR234), (J05091; 사카로마이세스 세레비지애), (CP000031, Locus AAV93568; 실리키박터 포메로이(Silicibacter pomeroyi) DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae( R6), 및 (NC_004556, Locus NP 779706; 자이렐라 파스티디오자(Xylella fastidiosa) Temecula1)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 IPP를 DMAPP 또는 IPP 및 FPP와 조합하여 게라닐게라닐 피로포스페이트 ("GGPP")를 만들 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, (ATHGERPYRS; 아라비돕시스 탈리아나), (BT005328; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_119845; 아라비돕시스 탈리아나), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; 바실러스 투리기엔시스 세로바르 이스라엘렌시스( Bacillus thuringiensis serovar israelensis), ATCC 35646 sq1563), (CRGGPPS; 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus)), (NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; 푸조박테리움 뉴클레아툼 subsp. 빈센티이(Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii), ATCC 49256), (GFGGPPSGN; 지벨렐라 푸지쿠로이), (AY371321; 징코 빌로바(Ginkgo biloba)), (AB055496; 헤베아 브라실리엔시스), (AB017971; 호모 사피엔스), (MCI276129; 무코르 서시넬로이데스 f. 루시타니쿠스(Mucor circinelloides f. lusitanicus)), (AB016044; 무스 무스쿨루스), (AABX01000298, Locus NCU01427; 뉴로스포라 크라사), (NCU20940; 뉴로스포라 크라사), (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; 랄스토니아 솔라나세아룸( Ralstonia solanacearum) UW551), (AB118238; 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus)), (SCU31632; 사카로마이세스 세레비지애), (AB016095; 시네코코커스 일론가테스(Synechococcus elongates)), (SAGGPS; 시나피스 알바(Sinapis alba)), (SSOGDS; 설폴로부스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)), (NC_007759, Locus YP_461832; 신트로푸스 액시디트로피쿠스(Syntrophus aciditrophicus) SB), (NC_006840, Locus YP_204095; 비브리오 피셰리(Vibrio fischeri) ES114), (NM_112315; 아라비돕시스 탈리아나), (ERWCRTE; 판토에아 어글로메란스(Pantoea agglomerans)), (D90087, Locus BAA14124; 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)), (X52291, Locus CAA36538; 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus)), (AF195122, Locus AAF24294; 로도박터 스페어로이데스), 및 (NC_004350, Locus NP_721015; 스트렙토코커스 무탄스 UA159)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소프레노이드 생산 세포는 폴리프레닐을 변형시켜 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 테트라테르펜, 폴리테르펜, 스테로이드 화합물, 카로테노이드 또는 변형된 이소프레노이드 화합물을 만들 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 카렌(carene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF461460, REGION 43.1926; 피세아 아비에스(Picea abies)) 및 (AF527416, REGION: 78.1871; 살비아 스테노필라(Salvia stenophylla))가 있으나, 이들로 한정되지 않는다 .
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 게라니올 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AJ457070; 신나모뭄 테누이필룸(Cinnamomum tenuipilum)), (AY362553; 옥시뭄 바실리쿰(Ocimum basilicum)), (DQ234300; 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens) 균주 1864), (DQ234299; 페릴라 시트리오도라(Perilla citriodora) 균주 1861), (DQ234298; 페릴라 시트리오도라 균주 4935) 및 (DQ088667; 페릴라 시트리오도라)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 리날롤 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF497485; 아라비돕시스 탈리아나), (AC002294, Locus AAB71482; 아라비돕시스 탈리아나), (AY059757; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_104793; 아라비돕시스 탈리아나), (AF154124; 아르테미시아 아누아), (AF067603; 클라르키아 브레웨리), (AF067602; 클라르키아 콘시나(Clarkia concinna)), (AF067601; 클라르키아 브레웨리), (U58314; 클라르키아 브레웨리), (AY840091; 라이코페르시콘 에스쿨렌툼), (DQ263741; 라반둘라 앵구스티폴리아(Lavandula angustifolia)), (AY083653; 멘타 사이트레이트), (AY693647; 오키뮴 바실리쿰), (XM_463918; 오리자 사티바), (AP004078, Locus BAD07605; 오리자 사티바), (XM_463918, Locus XP_463918; 오리자 사티바), (AY917193; 페릴라 시트리오도라), (AF271259; 페릴라 프루테센스), (AY473623; 피세아 아비에스), (DQ195274; 피세아 시첸시스(Picea sitchensis)), 및 (AF444798; 페릴라 프루테센스 var. 크리스파 컬티바 No. 79)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 리모넨 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (+)-리모넨 신타제 (AF514287, REGION: 47.1867; 시크러스 리몬(Citrus limon)) 및 (AY055214, REGION: 48.1889; 아가스타체 루고사(Agastache rugosa)) 및 (-)-리모넨 신타제 (DQ195275, REGION: 1.1905; 피세아 시첸시스), (AF006193, REGION: 73.1986; 아비에스 그란디스), 및 (MHC4SLSP, REGION: 29.1828; 멘타 스피카타(Mentha spicata))가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 미르센 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (U87908; 아비에스 그란디스), (AY195609; 안티리눔 마주스), (AY195608; 안티리눔 마주스), (NM_127982; 아라비돕시스 탈리아나 TPS10), (NM_113485; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (AF271259; 페릴라 프루테센스), (AY473626; 피세아 아비에스), (AF369919; 피세아 아비에스) 및 (AJ304839; 퀘르쿠스 일렉스(Quercus ilex))가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 오시멘(ocimene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AY195607; 안티리눔 마주스), (AY195609; 안티리눔 마주스), (AY195608; 안티리눔 마주스), (AK221024; 아라비돕시스 탈리아나), (NM_113485; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS-CIN), (NM_117775; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS03), (NM_001036574; 아라비돕시스 탈리아나 ATTPS03), (NM_127982; 아라비돕시스 탈리아나 TPS10), (AB110642; 시트러스 운시우(Citrus unshiu) CitMTSL4), 및 (AY575970; 로투스 코르니쿨라투스(Lotus corniculatus) var. 자포니쿠스)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 α-피넨 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (+) α-피넨 신타제 (AF543530, REGION: 1.1887; 피누스 타에다), (-)α-피넨 신타제 (AF543527, REGION: 32.1921; 피누스 타에다) 및 (+)/(-)α-피넨 신타제 (AGU87909, REGION: 6111892; 아비에스 그란디스)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 β-피넨 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (-) β-피넨 신타제 (AF276072, REGION: 1.1749; 아르테미시아 아누아) 및 (AF514288, REGION: 26.1834; 시트러스 리몬)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 사비넨(sabinene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 AF051901, REGION: 26.1798 (살비아 오피시날리스(Salvia officinalis)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 γ-테르피넨(terpinene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AF514286, REGION: 30.1832, 시트러스 리몬) 및 (AB110640, REGION 1.1803, 시트러스 운시우)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 테르피놀렌(terpinolene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (AY693650, 오스키뮴 바실리쿰) 및 (AY906866, REGION: 10.1887, 슈도츠가 멘지에시이(suga menziesii))가 있으나, 이들로 한정되지 않는다
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 아모르파디엔(amorphadiene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예는 미국 특허 공개번호 2004/0005678의 서열번호 37이다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 α-파르네신 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 피루스 코무니스 cultivar d'Anjou의 DQ309034 (배; 유전자 명 AFS1) 및 말루스 도메스티카(Malus domestica)의 AY182241 (사과; 유전자 AFS1)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. Pechouus et al., Planta 219(1):84-94 (2004).
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 β-파르네신 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 유전자은행 등재번호 AF024615 (멘타 x 피페리타) (페퍼민트; 유전자 Tspa11), 및 AY835398 (아르테미시아 아누아)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 파르네솔 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 유전자은행 등재번호 AF529266 (지아 메이스) 및 YDR481C (사카로마이세스 세레비지애) (유전자 Pho8)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006).
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 네롤리돌(nerolidol) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 지아 메이스의 AF529266 (옥수수; 유전자 tps1)이 있으나, 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 패출리올(patchouliol 신타제)를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 포고스테몬 칼블린(Pogostemon cablin)의 AY508730 REGION: 1.1659가 있으나, 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 누트카톤(nootkatone) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 시트러스 시넨시스의 AF441124 REGION: 1.1647과 페릴라 프루테센스의 AY917195 REGION: 1.1653가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 이종의 뉴클레오티드는 아비에타디엔(abietadiene) 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 (U50768; 아비에스 그란디스)와 (AY473621; 피세아 아비에스)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
6.2.4.2 폴리케타이드를 생산하는 재조합 세포
다른 측면에서, 본 발명은 세포 또는 세포의 클론 집단, 예컨대 하나 이상의 폴리케타이드 화합물을 재조합에 의해 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포의 클론 집단에서, 폴리케타이드의 생산을 검출하는 방법을 제공한다. 폴리케타이드 합성은 지방산 신타제 (FAS)와 관련된 다기능성 효소인 폴리케타이드 신타제 (PKS)에 의해 매개된다. PKS는 아실티오에스테르, 통상 아세틸, 프로피오닐, 말로닐 또는 메틸말로닐 간의 반복적인 클라이젠 축합 (Claisen condensation) (데카르복실성)을 통해 폴리케타이드의 생합성을 촉매한다. 각 축합 후, PKS는 자라나는 폴리케타이드 체인의 β-케토기에 대한 케토환원, 탈수 및 에노일환원을 포함하는 환원 사이클 전체 또는 일부를 촉매하거나 전혀 촉매하지 않으므로써 폴리케타이드 산물에 구조적 변이성을 도입한다.
본원에 제공된 폴리케타이드의 검출 방법에 대한 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는, 유전적으로 비-변형된 모 세포와 비교하여, 하나 이상의 폴리케타이드 화합물의 생산 증가를 달성하기 위해, PKS 시스템, 즉, 폴리케타이드의 합성을 촉매할 수 있는 하나 이상의 PKS을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
폴리케타이드 신타제 (PKS)는 주 클래스가 2종이다: 각각 아로마틱(aromatic) PKS 및 모듈러(modular) PKS로서, 이들은 촉매 사이트가 사용되는 방식에 차이가 있다. 아로마틱 PKS의 경우, 최소 시스템(minimal system), 즉, 폴리케타이드의 생산을 촉매화하는데 필요한 최소 구성 성분으로는, 케토신타제/아실 트랜스퍼라제 (KS/AT) 촉매 영역, 체인 길이 인자 (CLF: chain length factor) 촉매 영역 및 아실 캐리어 단백질 (ACP: acyl carrier protein) 활성을 포함한다. 모듈러 PKS 시스템의 경우, 최소 시스템은 KS 촉매 영역, AT 촉매 영역 및 ACP 활성을 포함하나, 단 합성에서의 중간산물들이 기질로서 제공된다. 신규 (de novo) 폴리케타이드 합성이 필요한 경우, 최소 모듈러 PKS 시스템은 부가적인 AT 및 ACP 영역들을 포함하는 로딩(loading) 아실 트랜스퍼라제를 추가로 포함한다.
이에, 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 KS 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 AT 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 AT 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 1 보다 더 많이 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 CLF 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 ACP 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 ACP 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 1 보다 더 많이 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리케타이드 생산 세포는 최소 아로마틱 PKS 시스템, 예컨대 KS 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열, AT 촉매 영역을 포함하는 효소, CLF 촉매 영역을 포함하는 효소, 및 ACP 활성을 포함하는 효소 각각을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리케타이드 생산 세포는 최소 모듈러 PKS 시스템, 예컨대 KS 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열, AT 촉매 영역을 포함하는 효소, 및 ACP 활성을 포함하는 효소를 각각 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 폴리케타이드 생산 세포는 신규 폴리케타이드 합성을 위한 모듈러 아로마틱 PKS 시스템, 예컨대 KS 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열, AT 촉매 영역을 포함하는 하나 이상의 효소, 및 ACP 활성을 포함하는 하나 이상의 효소를 각각 포함한다.
일부 구현예들에서, 전술한 바와 같이, 최소 PKS 시스템, 예컨대, 최소 아로마틱 PKS 시스템 또는 최소 모듈러 PKS 시스템을 포함하는 폴리케타이드 생산 세포는, 최종 산물인 폴리케타이드의 생산에 기여할 수 있는 부가적인 촉매 활성들을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 초기 폴리케타이드 벡본의 고리화(cyclization)를 촉매하는 사이클라제 (CYC) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 케토리덕타제 (KR) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 아로마타제 (ARO) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 에노일리덕타제 (ER) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 티오에스테라제 (TE) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는, ACP의 판테테이닐화(pantetheinylation)를 달성하는, 완전한(holo) ACP 신타제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 폴리케타이드의 합성 후 활성 변형(postsynthesis polyketide modifying activity)을 부여하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는, 예컨대 항생제 활성을 가진 폴리케타이드가 바람직한 경우, 폴리케타이드의 합성 후 변형을 달성하는, 글리코실라제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 하이드록실라제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 에폭시다제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는 메틸라제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예들에서, 폴리케타이드 생산 세포는, 비제한적인 예로서, 다음과 같은 폴리케타이드계 화합물로부터 선택되는 폴리케타이드를 생산할 수 있는, 이종의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 PKS 효소 및 폴리케타이드 변형 효소를 코딩하는 서열을 포함한다: 아베멕틴(Avermectin) (예, 미국 특허 제 5,252,474; 미국 특허 제 4,703,009; 유럽 특허 공개번호 제 118,367; MacNeil et al., 1993, "Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics"; Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256, "A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide synthase for Avermectin, Erythromycin, and Nemadectin"; MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125; and Ikeda and Omura, 1997, Chem. Res. 97: 2599-2609); 칸디시딘(Candicidin) (FR008) (예, Hu et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 163-172); 카보마이신(Carbomycin), 쿠라마이신(Curamycin) (예, Bergh et al., Biotechnol Appl Biochem. 1992 Feb;15(1):80-9); 다우노루비신(Daunorubicin) (예, J Bacteriol. 1994 Oct;176(20):6270-80); 에포틸론(Epothilone) (예, PCT 공개 번호 제 99/66028; 및 PCT 공개 번호 제 00/031247); 에리트로마이신(Erythromycin) (예, PCT 공개 번호 제 93/13663; 미국 특허 제 6,004,787; 미국 특허 제 5,824,513; Donadio et al., 1991, Science 252:675-9; 및 Cortes et al., Nov. 8, 1990, Nature 348:176-8); FK-506 (예, Motamedi et al., 1998; Eur. J Biochem. 256: 528-534; 및 Motamedi et al., 1997, Eur. J Biochem. 244: 74-80); FK-520 (예, PCT 공개 번호 제 00/020601; 및 Nielsen et al., 1991, Biochem. 30:5789-96); 그리세우신(Griseusin) (예, Yu et al., J Bacteriol. 1994 May;176(9):2627-34); 로바스타틴(Lovastatin) (예, 미국 특허 제 5,744,350); 프레놀리신(Frenolycin) (예, Khosla et al., Bacteriol. 1993 Apr;175(8):2197-204; 및 Bibb et al., Gene 1994 May 3;142(1):31-9); 그라나티신(Granaticin) (예, Sherman et al., EMBO J. 1989 Sep;8(9):2717-25; 및 Bechtold et al., Mol Gen Genet. 1995 Sep 20;248(5):610-20); 메데르마이신(Medermycin) (예, Ichinose et al., Microbiology 2003 Jul;149(Pt 7):1633-45); 모넨신(Monensin) (예, Arrowsmith et al., Mol Gen Genet. 1992 Aug;234(2):254-64); 노낙틴(Nonactin) (예, FEMS Microbiol Lett. 2000 Feb 1;183(1):171-5); 나나오마이신(Nanaomycin) (예, Kitao et al., J Antibiot (Tokyo). 1980 Jul;33(7):711-6); 네마덱틴(Nemadectin) (예, MacNeil et al., 1993, supra); 니다마이신(Niddamycin) (예, PCT 공개 번호 제 98/51695; 및 Kakavas et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 7515-7522); 옥레안도마이신(Oleandomycin) (예, Swan et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 242: 358-362; PCT 공개 번호 제 00/026349; Olano et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 259(3): 299-308; 및 PCT 공개 번호 제 WO 99/05283); 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline) (예, Kim et al., Gene. 1994 Apr 8;141(1):141-2); 피크로마이신(Picromycin) (예, PCT 공개 번호 제 99/61599; PCT 공개 번호 제 00/00620; Xue et al., 1998, Chemistry & Biology 5(11): 661-667; Xue et al., October 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12111 12116); 플라테놀라이드(Platenolide) (예, 유럽 특허 공개번호 제 791,656; 및 미국 특허 제 5,945,320); 라파마이신(Rapamycin) (예, Schwecke et al., August 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843; 및 Aparicio et al., 1996, Gene 169: 9-16); 리파마이신(Rifamycin) (예, PCT 공개 번호 제 WO 98/07868; 및 August et al., Feb. 13, 1998, Chemistry & Biology, 5(2): 69-79); 소란지움(Sorangium) (예, 미국 특허 제 6,090,601); 소라펜(Soraphen) (예, 미국 특허 제 5,716,849; Schupp et al., 1995, J. Bacteriology 177: 3673-3679); 스피노신(Spinocyn) (예, PCT 공개 번호 제 99/46387); 스피라마이신(Spiramycin) (예, 미국 특허 제 5,098,837); 테트라세노마이신(Tetracenomycin) (예, Summers et al., J Bacteriol. 1992 Mar;174(6):1810-20; 및 Shen et al., J Bacteriol. 1992 Jun;174(11):3818-21); 테트라사이클린(Tetracycline) (예, J Am Chem Soc. 2009 Dec 9;131(48):17677-89); 틸로신(Tylosin) (예, 미국 특허 제 5,876,991; 미국 특허 제 5,672,497; 미국 특허 제 5,149,638; 유럽 특허 공개번호 제 791,655; 유럽 특허 공개번호 제 238,323; Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231-6; 및 Merson-Davies and Cundliffe, 1994, Mol. Microbiol. 13: 349-355); 및 6-메틸살리사이클산 (예, Richardson et al., Metab Eng. 1999 Apr;1(2):180-7; 및 Shao et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 23;345(1):133-9).
6.2.4.3 지방산을 생산하는 재조합 세포
다른 측면에서, 본 발명은 세포 또는 세포의 클론 집단, 예컨대 하나 이상의 지방산을 재조합에 의해 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포의 클론 집단에서 지방산의 생산을 검출하는 방법을 제공한다. 지방산 합성은 아실 체인의 개시와 연장을 촉매하는 지방산 신타제 (FAS)에 의해 매개된다. 아실 캐리어 단백질 (ACP)은 FAS 경로에서 효소와 더불어 생산되는 지방산의 길이, 포화도와 분지 형성을 조절한다. 지방산 생합성 경로에는 전구체들, 즉 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA가 참여한다. 본 경로에서 공정들은 지방산 생합성 효소(fab) 및 아세틸-CoA 카르복실라제 (ace) 유전자에 의해 촉매된다.
본원에 제공되는 지방산 생산 세포의 검출 방법에 대한 일부 구현예들에서, 지방산 생산 세포는, 유전적으로 비-변형된 모 세포와 비교하여, 하나 이상의 지방산의 생산 증가를 달성하기 위해, 아세틸-CoA 신타제 및/또는 말로닐-CoA 신타제를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
예를 들어, 아세틸-CoA의 생산을 높이기 위해, 하기 유전자들 중 하나 이상을 세포에서 발현시킬 수 있다: pdh, panK, aceEF (피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제 복합체의 EIp 데하이드로게나제 성분과 E2p 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라제 성분을 코딩함), fabH, fabD,fabG, acpP, 및 fabF.
이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 비제한적인 예로는 pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (coaA라고도 함, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF (AAC74179)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 지방산 수준 증가는 지방산 분해에 참여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 약화 또는 낫-아웃시킴으로써 세포에서 달성할 수 있다. 예컨대, fadE, gpsA, idhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, 및/또는 ackB의 발현 수준은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 조작된 숙주 세포에서 약화 또는 낫-아웃시킬 수 있다. 이러한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 비제한적인 예로는 fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356), 및 ackB (BAB81430)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 제조되는 숙주 세포는 적정 환경에서 배양되었을 때 아세틸-CoA 생산 수준이 증가될 것이다.
일부 구현예들에서, 지방산 생산 세포는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 멀티서브유닛 AccABCD 단백질을 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. AccABCD를 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재 번호 AAC73296, EC 6.4.1.2가 있으나, 이로 한정되진 않는다.
일부 구현예들에서, 지방산 생산 세포는 리파제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 리파제를 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재 번호 CAA89087 및 CAA98876가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 지방산 수준 증가는 지방산 생합성 경로에서 초기 공정들을 저해하는 장쇄 아실-ACP의 수준을 증가시킬 수 있는 PlsB를 저해함으로써 세포에서 달성될 수 있다 (예, accABCD, fabH 및 fabl). PlsB의 발현 수준은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 조작된 숙주 세포에서 약화 또는 낫-아웃시킬 수 있다. PlsB를 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재 번호 AAC77011이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, plsB D31 IE 돌연변이를 사용하여 세포에서 이용가능한 아실-CoA의 양을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예들에서, 모노불포화된 지방산의 생산 증가는 fabA를 억제시키는 sfa 유전자를 과다발현시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. sfa를 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 AAN79592가 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, 지방산 수준 증가는 지방산 기질의 체인 길이를 조절하는 효소, 예컨대 티오에스테라제의 발현을 조절함으로써 세포에서 달성할 수 있다. 일부 구현예들에서, 지방산 생산 세포는 tes 또는 fat 유전자를 과다발현하도록 변형된다. 적정 tes 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 (tesA: AAC73596, C18:1 지방산을 생산할 수 있는 E. Coli) 및 (tesB: AAC73555, E. Coli)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 적정 fat 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 (fatB: Q41635 및 AAA34215, C12:0 지방산을 생산할 수 있는 움벨루라리아 캘리포르니아(Umbellularia california)), (fatB2: Q39513 및 AAC49269, C8:0 - C10:0 지방산을 생산할 수 있는 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana)), (fatB3: AAC49269 및 AAC72881, C14:0 - C16:0 지방산을 생산할 수 있는 쿠페아 후케리아나), (fatB: Q39473 및 AAC49151, C14:0 지방산을 생산할 수 있는 신나모넘 캄포룸(Cinnamonum camphorum)), (fatB [M141T]: CAA85388, C16:1 지방산을 생산할 수 있는 아라비돕시스 탈리아나), (fatA: NP 189147 및 NP 193041, C18:1 지방산을 생산할 수 있는 아라비돕시스 탈리아나), (fatA: CAC39106, C18:1 지방산을 우선적으로 생산할 수 있는 브라드브리이조비움 자포니쿰(Bradvrhiizobium japonicum)), (fatA: AAC72883, C18:1 지방산을 생산할 수 있눈 쿠페아 후케리아나), 및 (fatA1, AAL79361, 헬리안투스 아누스(Helianthus annus))가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, C10 지방산의 수준 증가는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 티오에스테라제 C18의 발현 또는 활성을 약화시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. 티오에스테라제 C18을 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 AAC73596 및 P0ADA1이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, C10 지방산의 수준 증가는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 티오에스테라제 C10의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. 티오에스테라제 C10을 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 Q39513가 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, C14 지방산의 수준 증가는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 비(non)-C14 지방산을 생산하는 내인성 티오에스테라제의 발현 또는 활성을 약화시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, C14 지방산의 수준 증가는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 기질 C14-ACP를 이용하는 티오에스테라제의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. 이러한 티오에스테라제를 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 Q39473가 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.
일부 구현예들에서, C12 지방산의 수준 증가는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 비(non)-C12 지방산을 생산하는 내인성 티오에스테라제의 발현 또는 활성을 약화시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, C12 지방산의 수준 증가는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 기질 C12-ACP를 이용하는 티오에스테라제의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 세포에서 달성될 수 있다. 이러한 티오에스테라제를 코딩하는 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는 등재번호 Q41635가 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.
6.2.4.4 부가적인 유전자 변형
본원에 제공되는 방법 및 조성물에 대한 일부 구현예들에서, 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 생산하도록 조작된 유전자 변형된 세포는 산업 발효 측면에서 유용한 특성을 세포에 부여하는 한가지 이상의 유전자 변형을 더 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 응집(flocculation)을 증가시키는 한가지 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 상기 응집은 액체 배양 기질의 바닥에 빠르게 침전하는 다수의 세포를 함유한 플록(floc)을 형성하는 미생물 세포의 무성 생식의, 가역적인, 칼슘-의존형 집합화(aggregation)이다. 응집은, 산업 발효에서 이로부터 생산되는 발효 산물들로부터 현탁된 효모 세포를 분리하기 위한 공정을 매우 단순화하기 때문에, 예를 들어 바이오에탄올, 와인, 맥주 및 기타 제품을 생산하는데 있어, 효소의 산업적인 발효에 중요하다. 분리는 원심분리나 여과를 통해 달성될 수 있지만, 이러한 방법에 의한 분리는 시간이 소요되고 비용이 많이 든다. 청징(clarification)은 다른 예로는 미생물 세포의 자연적인 침강에 의해 달성될 수 있다. 단일한 미생물 세포들은 시간 경과에 따라 침강되는 경향이 있음에도 불구하고, 자연적인 침강은 공업적인 공정에서는 세포가 모일 (즉, 응집) 때에만 가능한 옵션이 된다. 최근 연구에서, 세포의 응집 행태가 특정한 공업적인 요건을 만족시키도록 견고하게 조절되고 미세 조정될 수 있는 것으로 확인되었다 (예, Governder et al., Appl Environ Microbiol. 74(19):6041-52 (2008), 이 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 효모 세포의 응집 행태는 비제한적인 예로서 FLO1, FLO5, FLO8, FLO9, FLO10 및 FLO11 유전자의 산물 등의 특정 응집 단백질의 기능에 의존 한다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본원에 기술된 하나 이상의 수-비혼화성 화합물을 생산하도록 유전자 변형된 세포는 Flo1p, Flo5p, Flo8p, Flo9p, Flo10p 및 Flo11p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 응집 단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 포자 형성에 결함이 있거나 및/또는 내인성 교배에 결함을 가진다. 포자 형성 및/또는 내인성 교배에 결함이 있는 유전자 변형된 미생물 세포는, (1) 기질(nature)의 전파; 및 (2) 유전자 변형된 미생물 세포와 기질 전파력에 결함이 없는 야생형 미생물 간의 유전적 물질의 교환 위험성이 낮다. 효모에서, 이배수체 미생물 세포의 포자 형성력과 반수체 미생물 세포의 교배력은 특정 유전자 산물의 기능에 좌우된다. 효모에서 이러한 것으로는 특히 Ime1, Ime2, Ndt80, Spo11, Spo20, Ama1, Hop2 및 Spo21 유전자의 산물 등의 포자 형성 유전자의 산물과, Ste5, Ste4, Ste18, Ste12, Ste7 및 Ste11 유전자의 산물 등의 페로몬 반응 유전자의 산물이 있다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 Ste5, Ste4, Ste18, Ste12, Ste7, 및 Ste11 중 하나 이상의 페로몬 반응 유전자가 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 Ime1, Ime2, Ndt80, Spo11, Spo20, Ama1, Hop2 및 Spo21 중 하나 이상의 포자 형성 유전자가 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 Ste5, Ste4, Ste18, Ste12, Ste7 및 Ste11 중 하나 이상의 페로몬 반응 유전자와 Ime1, Ime2, Ndt80, Spo11, Spo20, Ama1, Hop2 및 Spo21 중 하나 이상의 포자 형성 유전자가 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 IME1 유전자와 STE5 유전자가 기능적으로 파괴된 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 IME1 유전자와 STE5 유전자가 기능적으로 파괴되고, HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 반수체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 IME1 유전자와 STE5 유전자가 기능적으로 파괴되고, 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 반수체 효모 세포이다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는 Ste5, Ste4, Ste18, Ste12, Ste7, 및 Ste11 중 하나 이상의 페로몬 반응 유전자의 2 카피 모두가 기능적으로 파괴된 이배체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 Ime1, Ime2, Ndt80, Spo11, Spo20, Ama1, Hop2 및 Spo21 중 하나 이상의 포자 형성 유전자의 2카피가 모두 기능적으로 파괴된 이배체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 Ste5, Ste4, Ste18, Ste12, Ste7 및 Ste11 중 하나 이상의 페로몬 반응 유전자의 2 카피 모두와 Ime1, Ime2, Ndt80, Spo11, Spo20, Ama1, Hop2 및 Spo21 중 하나 이상의 포자 형성 유전자의 2 카피 모두가 기능적으로 파괴된 이배체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 IME1 유전자의 2 카피 모두와 STE5 유전자의 2 카피 모두가 기능적으로 파괴된 이배체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 IME1 유전자의 2 카피 모두와 STE5 유전자의 2 카피 모두가 기능적으로 파괴되고, HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이배체 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포는 IME1 유전자의 2 카피 모두와 STE5 유전자의 2 카피 모두가 기능적으로 파괴되고, 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이배체 효모 세포이다.
응집 단백질을 코딩하는 이종의 서열을 도입하는데, 그리고 하나 이상의 포자 형성 유전자 및/또는 페로몬 반응 유전자를 기능적으로 파괴하는데, 유용한 방법 및 조성물은, 미국 특허 출원 공개번호 2010/0304490 및 2010/0311065에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예들에서, 상기 세포는, 파괴의 결과로서 상기 세포가 영양 요구성(auxotrophic)이 되게 되는, 하나 이상의 생합성 유전자의 기능적인 파괴를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 항생제 화합물에 대한 내성을 부여하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 선별 마커 유전자를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 선별 마커는 항생제 내성 마커이다. 항생제 내성 마커에 대한 예시적인 예로는 BLA, NAT1, PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, mouse dhfr, HPH, DSDA, KAN R , 및 SH BLE 유전자 산물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. E. coli의 BLA 유전자 산물은 β-락탐 항생제 (예, 작용 범위가 좁은 세팔로스포린, 세파마이신 및 카르바페넴 (에르타페넴), 세파만돌 및 세포페라존)과 테모실린을 제외한 모든 항-그램 음성 박테리아 페니실린에 대해 내성을 부여하며; 스트렙토마이세스 누르세이(S. noursei)의 NAT1 유전자 산물은 누르세오트리신(nourseothricin)에 대한 내성을 부여하며; 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(S. viridochromogenes) Tu94의 PAT 유전자 산물은 비알로포스(bialophos)에 대한 내성을 부여하며; 사카로마이세스 세레비지애의 AUR1-C 유전자 산물은 아우에로바시딘 A(AbA: Auerobasidin A)에 대해 내성을 부여하며; PDR4 유전자 산물은 세룰레닌(cerulenin)에 대한 내성을 부여하며; SMR1 유전자 산물은 설포메투론 메틸(sulfometuron methyl)에 대한 내성을 부여하며; Tn9 트랜스포존의 CAT 유전자 산물은 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하며; 마우스의 dhfr 유전자 산물은 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 내성을 부여하며; 클렙시엘라 뉴모니아의 HPH 유전자 산물은 히그로마이신 B에 대한 내성을 부여하며; E. coli의 DSDA 유전자 산물은 단독 질소원으로서 D-세린이 첨가된 플레이트에서 세포가 증식하게 하며; Tn903 트랜스포존의 KAN R 유전자는 G418에 대한 내성을 부여하며; 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus)의 SH BLE 유전자 산물은 제옥신 (블레오마이신)에 대한 내성을 부여한다. 일부 구현예들에서, 항생제 내성 마커는 예컨대 수-비혼화성 화합물의 생산 증가를 달성하기 위해 세포를 유전자 변형시킨 후 숙주 세포 게놈으로부터 적출된다. 뉴클레오티드 서열, 예컨대 유전자 변형된 숙주 세포의 게놈으로부터 상기한 항생제 내성 마커를 코딩하는 서열을 정확하게 적출하는데 유용한 방법과 조성물은 2010년 12원 23일자 미국 특허 출원번호 12/978,061에 기술되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예들에서, 상기 선별 마커는 유전자 변형된 미생물 세포에서 영양요구성(auxotroph, nutritional auxotroph)을 회복시킨다. 이러한 구현예에서, 미생물 모 세포는, 예컨대, 효모에서 HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET15, TRP1, ADE2 및 URA3 유전자 산물 등의, 아미노산 또는 뉴클레오티드 생합성 경로에서 기능하는 하나 이상의 유전자 산물에서의 기능적 파괴를 포함하며, 상기한 파괴는 상기 미생물 모 세포가 하나 이상의 영양원 (영양요구성 표현형)이 보충되지 않은 배지에서 증식할 수 없게 한다. 영양요구성 표현형은, 그 후, 상기 미생물 모 세포에 상기 파괴된 유전자 산물의 기능적 카피를 코딩하는 발현 벡터를 형질전환시키거나 또는 염색체 병합함으로써, 복원될 수 있으며, 제조되는 유전자 변형된 미생물 세포는 상기 미생물 모 세포의 영양요구성 표현형의 소멸을 기반으로 선별할 수 있다. 선별 마커로서 URA3, TRP1 및 LYS2 유전자들을 이용하는 것은, 양성 선별 및 음성 선별이 둘다 가능하므로, 매우 유익하다. 양성 선별은 URA3, TRP1 및 LYS2 돌연변이에 대한 영양요구성 보완(auxotrophic complementation)에 의해 수행되고, 음성 선별은 특정 저해제,즉, 각각 URA3, TRP1 및 LYS2 돌연변이주의 증식은 허용하지만 프로토트로픽 균주(prototrophic strain)의 증식을 방지하는, 즉, 5-플루오로-오르트산 (FOA), 5-플루오로안트라닐산 및 α-아미노아디프산 (αAA)을 기반으로 이루어진다.
다른 구현예에서, 상기 선별 마커는 공지된 선별 방법에 의해 동정할 수 있는 기타 비-치사성 결함 또는 표현형을 복원시킨다.
예를 들어, 숙주 세포에서 한가지 이상의 수-비혼화성 화합물의 생산 증가를 달성하거나 또는 전술한 바와 같이 그러한 세포에 유용한 특성을 부여하기 위해, 발현 벡터 또는 염색체 병합 구조체를 이용하여 미생물을 유전자 변형시키는 방법은, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예로, Sherman, F., et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1978); Guthrie, C., et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 및 Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.를 참조하며, 이들 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 아울러, 예를 들어 세포에서 한가지 이상의 수-비혼화성 화합물의 생산을 증가시키는, 유전자 발현의 저해는, 결손, 돌연변이화 및/또는 유전자 재정렬에 의해 달성할 수도 있다. 또한, 이는 안티센스 RNA, siRNA, miRNA, 리보자임, 3중 가닥 DNA 및 전사 및/또는 번역 저해제를 사용하여 달성할 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, 프로모터와 코딩 영역 사이나 또는 하나 또는 양측 유전자를 불활성화하기 위해 2개의 인접 유전자 사이에 크랜스포존을 삽입함으로써, 트랜스포존을 사용하여 유전자 발현을 파괴할 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 세포에 수-비혼화성 화합물의 생산 증가는, 특정 단백질, 예컨대 전술한 생합성 경로에 참여하는 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터를 사용함으로써 달성된다. 일반적으로, 발현 벡터는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된, 복제 신호 및 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터와 종결인자를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 유용한 발현 벡터로는 바이러스 벡터 (예, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-조합 바이러스(adeno-associated viruse)), 플라스미드 벡터 및 코스미드를 포함한다. 효모 세포에서 사용하기 적합한 발현 벡터의 예로는 CEN/ARS와 2μ 플라스미드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 효모 세포에서 이용하기 적합한 프로모터의 예로는 클루이베로마이세스 락티스의 TEF1 유전자의 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애의 PGK1 유전자의 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애의 TDH3 유전자의 프로모터, 억제성 프로모터, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애의 CTR3 유전자의 프로모터, 및 유도성 프로모터, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애의 갈락토스 유도성 프로모터 (예, GAL1, GAL7 및 GAL10 유전자들의 프로모터)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
발현 벡터와 염색체 병합 구조체는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의 방법에 의해 미생물 세포에 도입될 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 예컨대, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385 (1985); 미국 특허 제 5,272,065; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; 및 Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY를 참조한다. 예시적인 기법으로는 스페로플라스팅(spheroplasting), 전기천공(electroporation), PEG 1000 매개 형질전환 및 리튬 아세테이트 또는 리튬 클로라이드 매개 형질전환이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
7. 실시예
7.1 실시예 1: 수-비혼화성 화합물을 생산하는 유전자 변형된 세포의 제조
본 실시예는 이소프레노이드 파르네신을 생산하도록 조작된 유전자 변형된 반수체 사카로마이세스 세레비지애 세포의 제조 방법에 대한 일예를 기술한다.
I상 병합 구조체는, 병합 서열로서, 갈락토스-유도성 프로모터 (사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 및 GAL10 유전자의 프로모터)의 통제 하에 있는, 선별 마커 (히그로마이신 B에 대해 내성을 부여하는 hygA); 사카로마이세스 세레비지애의 MEV 경로에 참여하는 효소 2종 (절단된 HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 절단된 HMG1 코딩 서열과, HMG-CoA 신타제를 코딩하는 ERG13 코딩 서열), 및 기타 사카로마이세스 세레비지애 효소 (아세토아세틸-CoA 티올라제를 코딩하는 ERG10 코딩 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 측면에 위치된 사카로마이세스 세레비지애 GAL80 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드 서열로 이루어진 상동 서열을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포에 도입시, I상 병합 구조체는 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포 게놈의 GAL80 유전자 좌에 상동 재조합에 의해 병합될 수 있으며, GAL80 코딩 서열이 병합 서열로 치환됨으로써 GAL80 유전자 좌는 기능적으로 파괴될 수 있다. I상 병합 구조체는 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하여, 플라스미드 TOPO-Phase I 병합 구조체를 수득하였다. 이 구조체는 카나마이신 50 ㎍/ml을 포함하는 LB 아가에서 배양한 TOP10 세포에서 증폭시켰다.
II상 병합 구조체는, 병합 서열로서, 갈락토스-유도성 프로모터 (사카로마이세스 세레비지애의 GAL1 및 GAL10 유전자의 프로모터)의 통제 하에 위치한, 선별 마커 (노우르세오트리신에 대한 내성을 부여하는 natA)와 사카로마이세스 세레비지애 MEV 경로에 참여하는 몇가지 효소 (메발로네이트 키나제를 코딩하는 ERG12 코딩 서열과, 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 ERG8 코딩 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 뿐만 아니라, GAL4oc 프로모터 (MIG1 결합 부위가 제거된 돌연변이를 포함하고 있어, 글루코스에 의한 억제에 대한 민감성이 둔한 GAL4 프로모터)의 통제 하에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 GAL4 유전자의 코딩 서열; 측면에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 LEU2 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드 서열로 이루어진 상동 서열을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포로의 도입시, II상 병합 구조체는 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포 게놈의 LEU2 유전자 좌에 상동 재조합에 의해 병합될 수 있으며, LEU2 코딩 서열이 병합 서열로 치환됨으로써 LEU2 유전자 좌는 기능적으로 파괴될 수 있다. II상 병합 구조체는 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터에 클로닝하여, 플라스미드 TOPO-Phase II 병합 구조체를 수득하였다. 이 구조체는 카나마이신 50 ㎍/ml을 포함하는 LB 아가에서 배양한 TOP10 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 증폭시켰다.
III상 병합 구조체는, 병합 서열로서, 갈락토스-유도성 프로모터 (사카로마이세스 세레비지애의 GAL1, GAL10 및 GAL7 유전자의 프로모터); 뿐만 아니라, 사카로마이세스 세레비지애 CTR3 유전자의 프로모터의 통제 하에 위치한, 선별 마커 (G418에 대한 내성을 부여하는 kanA); 사카로마이세스 세레비지애 MEV 경로에 참여하는 효소 (디포스포메발로네이트 데카르복실라제를 코딩하는 ERG19 코딩 서열과, MEV 경로의 산물 IPP를 FPP로 변환하는데 참여하는 사카로마이세스 세레비지애 효소 2종 (파르네실 피로포스페이트 신타제를 코딩하는 ERG20 코딩 서열, 이소펜테닐 피로포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 IDI1 코딩 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 측면에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 ERG9 유전자 좌의 코딩 뉴클레오티드 서열과 상류 서열을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포에 도입시, III상 병합 구조체는 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포 게놈의 ERG9 유전자 좌 상류에 상동 재조합에 의해 병합되어, ERG9 (스쿠알렌 신타제)의 발현이 구리에 의해 조절될 수 있는 방식으로 본래의 ERG9 프로모터가 CTR3 프로모터로 치환될 수 있다. III상 병합 구조체는 TOPO Zero Blunt II 클로닝 벡터에 클로닝하여, 플라스미드 TOPO-Phase III 병합 구조체를 수득하였다. 이 구조체는 카나마이신 50 ㎍/ml을 포함하는 LB 아가에서 배양한 TOP10 세포에서 증폭시켰다.
I상 마커 리사이클링 구조체는, 사카로마이세스 세레비지애 GAL7 유전자의 프로모터에 의한 조절식 통제 하에 위치한, 선별 마커 (우라실 결핍 배지에서 증식할 수 있는 능력을 부여하는 URA3); 및 아르테미시아 아누아의 효소 (파르네신 신타제를 코딩하는 FS 코딩 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 측면에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 HMG1 유전자의 코딩 서열과 사카로마이세스 세레비지애 GAL80 유전자 좌의 상류 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포로의 도입시, I상 마커 리사이클링 구조체는 선별 마커 hphA가 URA3로 치환되도록 이미 병합되어 있는 I상 병합 서열로 상동 재조합에 의해 병합될 수 있다.
II상 마커 리사이클링 구조체는, 사카로마이세스 세레비지애 GAL7 유전자의 프로모터에 의한 조절식 통제 하에 위치한 선별 마커 (우라실 결핍 배지에서 증식할 수 있는 능력을 부여하는 URA3)과 아르테미시아 아누아의 효소 (파르네신 신타제를 코딩하는 FS 코딩 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과; 측면에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 ERG12 유전자의 코딩 서열과 사카로마이세스 세레비지애 LEU2 유전자 좌의 상류 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포로의 도입시, II상 마커 리사이클링 구조체는 선별 마커 natA가 URA3로 치환되도록 이미 병합되어 있는 II상 병합 서열로 상동 재조합에 의해 병합될 수 있다.
III상 마커 리사이클링 구조체는, 사카로마이세스 세레비지애 GAL7 유전자의 프로모터에 의한 조절식 통제 하에 위치한, 선별 마커 (우라실 결핍 배지에서 증식할 수 있는 능력을 부여하는 URA3)와 아르테미시아 아누아의 효소 (파르네신 신타제를 코딩하는 FS 코딩 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과; 측면에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 ERG19 유전자의 코딩 서열과 사카로마이세스 세레비지애 ERG9 유전자 좌의 상류 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 숙주 세포로의 도입시, III상 마커 리사이클링 구조체는 선별 마커 kanA가 URA3로 치환되도록 이미 병합되어 있는 III상 병합 서열로 상동 재조합에 의해 병합될 수 있다.
발현 플라스미드 pAM404는 β-파르네신 신타제를 코딩한다. 뉴클레오티드 서열 삽입체는, 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 아르테미시아 아누아의 β-파르네신 신타제 유전자의 코딩 서열을 주형으로 사용하여 합성을 통해 제조하였다.
출발 숙주 균주인 Y1198 (1994년에 분리됨; Santelisa Vale, Sertaozinho, Brazil)은 100 ㎍/mL 카바미실린 및 50 ㎍/mL 카나마이신이 함유된 YPD 배지 5 mL에서 활성형 PE-2 건조 효모를 현탁함으로써 준비하였다. 배양물을 회전식 교반기에서 30℃ 200 rpm에서 밤새 배양하였다. 배양물 분액 10 ㎕를 YPD 플레이트에 도말하여, 건조시켰다. 단일 콜로니를 위해 세포를 시리즈 스크리킹하여, 30℃에서 2일간 배양하였다. 단일 콜로니 20개를 취하여, 새로운 YPD 플레이트에 접종하여, 밤새 30℃에서 배양하였다. Bio-Rad CHEF 게놈 DNA 플러그 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 제조사의 설명서에 따라 이용하여 Bio-Rad CHEF DR II 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)에서 염색체 크기를 분석함으로써, 콜로니들의 균주 정체를 검증하였다. 콜로니 하나를 취하여 균주 Y1198로서 스톡 보관하였다.
균주 Y1661, Y1662, Y1663 및 Y1664는, 균주 반수체가 유전자 조작이 가능하게 함으로써 균주 Y1198로부터 준비하였다. 균주 Y1198을 롤러 드럼내 유리관에서 YPD 배지 5 mL에서 30℃에서 밤새 배양하였다. OD600을 측정하고, 세포를 2% 초산 칼륨이 포함된 YP 배지 5 mL에서 OD600 0.2로 희석하였다. 이 배양물을 롤러 드럼내 유리관에서 30℃에서 밤새 배양하였다. 다시 OD600을 측정하고, 5,000 x g에서 2분간 원심분리함으로써 세포 4 OD600*mL을 수집하였다. 세포 펠렛을 멸균수로 1회 세척한 다음, 0.02% 라피노스가 포함된 2% 초산 칼륨 3 mL에 재현탁하였다. 세포를 롤러 드럼 안 유리관에서 3일간 30℃에서 배양하였다. 현미경으로 포자 형성을 검증하였다. 배양물 분액 33 ㎕를 1.5 mL 미세원심분리관으로 옮겨, 2분간 14,000 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10 mg/mL Zymolyase 100T (MP Biomedicals, Solon, OH) 2 ㎕이 포함된 멸균수 50 ㎕에 재현탁하고, 세포를 30℃ 수조에서 10분간 인큐베이션하였다. 튜브를 얼음으로 옮기고, 빙랭 수 150 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물 분액 10 ㎕을 12 mL YPD 플레이트에 넣고, Singer MSM 300 해부 현미경 (Singer, Somerset, UK) 상에서 사분자(tetrad)를 분할하였다. YPD 플레이트를 3일간 30℃에서 배양한 후, 포자를 신선한 YPD 플레이트에 옮겨 30℃에서 밤새 배양하였다. 4-포자 사분자 8개 각각의 교배형(mating type)을 콜로니 PCR로 분석하였다. 2 MATα 및 2 MATα 포자를 가진 4 포자 사분자 하나를 취하여, Y1661 (MATa), Y1662 (MATa), Y1663 (MATα) 및 Y1664 (MATα) 균주로서 스톡 보관하였다.
효모 세포 형질전환을 위해, 효모 추출 펩톤 덱스트로스 (YPD) 배지 25 ml에 출발 숙주 균주 콜로니 하나를 접종하였다. 배양물을 회전식 교반기에서 200 rpm 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양물의 OD600을 측정한 다음, 배양물을 YPD 배지 50 ml에 OD600 = 0.15로 접종하였다. 새롭게 접종한 배양물을 회전식 교반기에서 200 rpm으로, 30℃에서 최대 OD600 = 0.7 내지 0.9로 배양하였으며, 이 시점에 세포에 DNA 1 ㎍을 형질전환하였다. 세포는 숙주 세포 형질전환체를 식별하기 위해 선별 제제가 함유된 아가에 접종하기 전 4시간 동안 YPD 배지에서 회복시켰다.
숙주 균주 Y1515는, 균주 Y1664에 PmeI 제한효소 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단 완료한 플라스미드 TOPO-I상 병합 구조체를 형질전환하여, 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체를 300 ㎍/mL 히그로마이신 B이 첨가된 YPD 배지에서 선별하였고, GAL80 유전자 좌에 병합된 I상 병합 서열을 포함하는 양성 형질전환체를 PCR 증폭으로 검증하였다.
숙주 균주 Y1762는, 균주 Y1515에 PmeI 제한효소 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단 완료한 플라스미드 TOPO-II상 병합 구조체를 형질전환하여, 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체를 100 ㎍/mL 누르세오트리신이 첨가된 YPD 배지에서 선별하였고, LEU 유전자 좌에 병합된 II상 병합 서열을 포함하는 양성 형질전환체를 PCR 증폭으로 검증하였다.
숙주 균주 Y1770은, 균주 Y1762에 PmeI 제한효소 엔도뉴클레아제를 이용하여 절단 완료한 플라스미드 TOPO-III상 병합 구조체와 발현 플라스미드 pAM404를 2단계로 형질전환하여, 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체를 메티오닌 및 루신이 결핍된 완전 합성 배지 (CSM: Complete Synthetic Medium)에서 선별하였다. pAM404 및 III상 병합 구조체를 가진 숙주 세포 형질전환체는 200 ㎍/mL G418 (Geneticin®)이 첨가되고 메티오닌 및 루신이 결핍된 CSM에서 선별하였고, ERG9 유전자 좌에 병합된 III상 병합 서열을 포함하는 양성 형질전환체를 PCR 증폭으로 검증하였다.
숙주 균주 Y1793는 균주 Y1770에 URA3 낫-아웃 구조체 (서열번호 154)를 형질전환하여 제조하였다. URA3 낫-아웃 구조체는 (사카로마이세스 세레비지애 균주 CEN.PK2 게놈 DNA로부터 준비된) URA3 유전자 좌의 상류 및 하류 서열을 포함한다. 숙주 세포 형질전환체를 5-FOA가 첨가된 YPD 배지에서 선별하였다.
숙주 균주 YAAA는 Y1793 균주에 I상 마커 리사이클링 구조체를 형질전환하여 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체는 메티오닌 및 우라실이 결핍된 CSM에서 선별하였다. URA3 마커는 세포를 YPD 배지에서 회전식 교반기에서 30℃ 및 200 rpm으로 밤새 배양한 다음, 세포를 5-FOA가 첨가된 아가에 접종하여, 적출하였다. 마커 적출은 콜로니 PCR로 검증하였다.
숙주 균주 YBBB는 균주 YAAA에 II상 마커 리사이클링 구조체를 형질전환하여 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체는 메티오닌 및 우라실이 결핍된 CSM에서 선별하였다. URA3 마커는 세포를 YPD 배지에서 회전식 교반기에서 30℃ 및 200 rpm으로 밤새 배양한 다음, 세포를 5-FOA가 첨가된 아가에 접종하여, 적출하였다. 마커 적출은 콜로니 PCR로 검증하였다.
숙주 균주 Y1912는 균주 YBBB에 III상 마커 리사이클링 구조체를 형질전환하여 제조하였다. 숙주 세포 형질전환체는 메티오닌 및 우라실이 결핍된 CSM에서 선별하였다. URA3 마커는 세포를 YPD 배지에서 회전식 교반기에서 30℃ 및 200 rpm으로 밤새 배양한 다음, 세포를 5-FOA가 첨가된 아가에 접종하여, 적출하였다. 마커 적출은 콜로니 PCR로 검증하였다.
7.2 실시예 2: 세포의 캡슐화
본 실시예는 세포를 하이드로겔 안에 캡슐화하고, 캡슐화된 세포를 1종 이상의 수-비혼화성 화합물의 재조합 생산에 대해 스크리닝하는 방법의 일예를 기술한다.
7.2.1 미세유체 시스템의 제조
엘라스토머 폴리머 폴리(디메티실록산)(PDMS)로 구성되며 T-정션에 상호연결된 2 이상의 채널을 포함하는 미세유체 디바이스를, 예컨대 포토리소그라피에 의해 몰드로서 제조한 에칭된 와이퍼 기판을 이용하여 제작한다.
간략하게는, 와이퍼 기판은 와이퍼를 아세톤과 이소프로필 알코올로 헹구어 준비한다. 와이퍼에 스핀-코딩에 의해 포토레지스트, 예컨대, SU8-3000 포토레지스트 (Microchem, Newton, MA)를 적용한다. 그런 후, 포토레지스트 코팅을, 선택된 패턴, 예컨대 T-정션에서 상호 연결된 2개의 채널을 포함하는 패턴으로 포토레지스트에 노출가능하도록 설계된 마스크를 통해 UV 광으로 선택적으로 조사한다. UV 노출 후, 와이퍼를 1분간 65℃에서 베이킹한 다음 4분간 95℃에서 베이킹하여 가공한다. 4-5분간 80 rpm으로 교반하면서 와이퍼를 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) 용액에 침지한 다음 이소프로필 알코올로 3회 세척함으로써, 포토레지스트를 발색시킨다. 그 후, 와이퍼를 5-30분간 200℃에서 베이킹한 다음 실온으로 냉각시킨다.
에칭된 와이퍼를 PDMS (Sylgard®, Dow Corning, Midland, MI)와 접촉시켜, 미세유체 디바이스를 형성시킨다. 간략하게는, 70 g의 Sylgard® 엘라스토머 베이스를 용기에서 Sylgard® 가교제 7 g과 혼합하고, 혼합한다. 혼합한 조성물 34 g을 상기 에칭된 와이퍼에 붓고, 이를 약 5분간 (또는 와이퍼 표면에 기포가 발생되지 않을 때까지) 진공 데시케이터에 둔 다음 60-90분간 65℃에서 베이킹한다.
중합된 PDMS를 와이퍼에서 제거하고, 플라즈마 처리 (20초간 0.3 mbar)를 수행한다. 또한, 미세유체 디바이스를 밀봉하는데 사용되는 유리 슬라이드에도 플라즈마 처리 (20초간 0.3 mbar)를 수행한다. 플라즈마 처리 후, 유리 슬라이드를 플라즈마 노출시킨 면을 하방으로 PDMS 상에 두고, 약간 압력을 주어 기포를 제거한다. 그 후, 밀봉된 미세유체 디바이스를 10분간 65℃에서 베이킹한다. 이 디바이스의 채널은 장착하고, 발수 처리, 예컨대 Aquapel™ (Pittsburgh Glass Works LLC, Pittsburgh, PA) 등의 실란/실록산계 발수제를 처리한다. 본원에서 제조된, T-정션에서 상호 연결되는 2개의 채널을 포함하는 미세유체 디바이스의 일예에 대한 2차원도를 도4 및 도 5A에 제시한다.
7.2.2 캡슐화용 세포의 제조
이종의 수-비혼화성 화합물에 대해 스크리닝할 세포를 포함하는, 액체 세포 배양물 500 ㎕ 또는 플레이트로부터 수득한 수개의 콜로니를 PBS-MBF (1x PBS +: 10 mM 만노스, 0.5% BSA, 0.001% Pluronic F-127) 1 ml에 첨가하여 약 10초 볼텍싱한 다음, 5000 g로 30초간 원심분리한다. 상층액은 제거하고, 1 ml PBS-MBF를 첨가한 다음, 세포를 10초간 볼텍싱하고, 5000 g로 1분간 원심분리한다. 상층액은 제거하고, 세포는 1 ml의 PBS-F에 재현탁한다.
세포 현탁물을 블랙 10 μM Par-tec 필터 상에 로딩하고 간단하게 원심분리 (~500 rcf)하여, 여과한다. 샘플을 간단히 볼텍싱하여 재현탁한 다음 PBS에 1:9로 희석한다. OD600을 측정하고, 배양물 1 ml을 적정 OD600로, 즉 소정의 액적 크기를 위해 필요한 최종 세포 농도의 2x로 세포를 PBS-F (1x PBS +: 10 mM 만노스, 0.5% BSA, 0.001% Pluronic F-127)에 희석한다.
세포를 캡슐화하기 위한 아가로스 용액을 준비한다. 간략하게는, 0.5 g LMP 아가로스 (예, Omnipur®, EM Science, Gibbstown, NJ)를 100 mL 보틀에서 물 25 ml에 현탁하고, 완전히 녹아 용해될 때까지 10초 간력으로 마이크로웨이브를 처리한다. 아가로스를 ~30-35℃로 냉각시킨 다음, 30-35℃로 가온시킨 세포 현탁물과 1:1로 혼합한다.
7.2.3 하이드로겔 입자 안에 세포의 캡슐화
전술한 바와 같이 준비한 세포 현탁물을 26 게이지 바늘의 주사기에 넣고, 바늘 끝에 12인치의 PE/2 관을 장착한다. 세포는 예컨대 자동화된 방식으로 바늘 끝에서 관으로 배출된다. 관을 세포 용액 흐름 채널의 입구에 삽입한다. 12인치의 1/32" OD PEEK 관을 상기 흐름 채널의 반대쪽 단부에 삽입하여, 오일/하이드로겔 에멀젼의 배출 수단(outlet)으로 사용한다.
주사기와 관에 자동 오일 디펜서를 장착하고, 주사기는 유속 5,000 내지 10,000 ml/h로 오일이 주입된다. 관을 미세유체 디바이스 상의 오일 프름 채널의 입구에 삽입하고, 오일 유속을 850 내지 1,000 ml/h로 설정한다. 상기 관과 디바이스 사이의 정션부를 젖시도록 오일 흐름을 잠시 진행시킨다.
(아가로스 안에 세포를 포함하는) 수계 흐름은 세포 용액 흐름 채널을 통해 시작되며, 바로 곧 오일 흐름 채널을 통한 오일 흐름이 뒷따른다. 하이드로겔 입자를 포함하는 에멀젼은 얼음 위에 둔 2 ml 수집관내 PEEK 관으로부터 수집한다.
하이드로겔 입자가 5분간 얼음 위에서 고체화된 후, 하부 오일 층을 파이펫으로 제거한다. 20% PFO (20% V/V 퍼플루오로옥타놀/HFE-7500) 500 ㎕를 입자에 첨가하고, 이 현탁물을 볼텍싱한 다음 30초가 6000 g로 원심분리한다. 오일 잔류물을 제거하고, 적정 배양 배지 5 ml + 0.001% F127을 첨가하여 현탁물을 잘 볼텍싱한다. 배양 배지 5 ml을 더 첨가하고, 현탁물을 1분간 6000 g로 원심분리한다. 상층액은 부어 제거하고, 펠렛을 간단히 볼텍싱한 다음 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮긴다. 여기에 배양 배지 500 ㎕을 넣어 현탁물을 간단하게 볼텍싱한 다음 1분간 6000 g로 원심분리한다. 상층액을 제거하고, 하이드로겔 입자의 대략적인 중량을 확인하고, 입자 중량의 2배로 배양 배지를 첨가한다. 입자를 재현탁하여, 14 ml 팔콘 튜브로 옮긴다. 그 후, 세포 증식 및 이종의 수-비혼화성 화합물 생산이 가능한 적정 세포 배양 조건 하에 34℃에서 24시간 동안 용액을 교반한다.
7.3 실시예 3: 입자 분석 및 분류
본 실시예는 세포에서 생산하는 수-비혼화성 화합물을 포함하는 하이드로겔 입자를 분석 및 분류하기 위한 방법의 일 예를 설명한다.
50 ml 코니칼 튜브 위에 70 ㎛ BD 세포체류기(cellstrainer)를 장착한다. 캡슐화된 세포를 포함하는 배양물을 5 ml 파이펫으로 필터 막의 중앙에 둔다. 입자를 PBS 1 ml 분액 2개로 막 세척하고, 30초간 100 g로 원심분리한 다음 1 ml PBS에 재현탁하여 다시 100 g로 30초간 원심분리한다. 여과한 배양물을 분액하여 10 ㎛ Partec 필터에 넣고, 100 g로 90초간 원심분리한다. 각 필터의 필터 케이크에 PBS 1 ml을 가하고, 위아래로 파이펫팅하여 케이크를 재현탁한다. 이 현탁물에 PBS 1 ml을 다시 첨가하여, 100 g로 90초가 원심분리한다.
Nile Red 염색 용액 (2 ml / 샘플)은 필요에 따라 200 ㎕ Nile Red stock (EtOH 중의 100 ㎍/ml)을 각 PBS (2 ㎍/ml 최종) 10 ml에 첨가하여 준비한다.
염색 용액 1 ml을 각 필터의 필터 케이크에 가하여, 아래 위로 파이펫팅하여 재현탁한다. 염색 용액 1 ml을 더 첨가하여, 90초간 120 g로 원심분리한다. 플레인 PBS 1 ml을 가하여 위 아래로 파이펫팅하여 재현탁한 다음 입자를 FACS 관으로 옮겨, 입자를 필터에서 취한다. 막을 2번째 PBS 1 ml로 세척하여, 동일 관으로 옮긴다.
그 후, 입자를 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해, 입자 안에 함유된 세포의 생물량의 양에 대해 정규화한 이종의 수-비혼화성 화합물 생산 수준에 해당되는 형광 세기를 기반으로 분류한다. 이러한 분석은 Nile Red의 용매변색 특성의 이점이 있다. 인지질 세포 막 등의 극성 지질에서, Nile Red의 형광 방출 최대치는 ~590 nm이다. 반면에, 중성 지질이 존재하는 경우, 스펙트럼은 방출 최대치 550 nm로 블루-쉬프트한다. 따라서, 이상적인 생산체 (순수 파르네신)와 완전한 비-생산체 간의 녹색/적색 형광 비를 최대화하기 위해, 스펙트럼의 녹색 (515 +/- 20 nm) 및 적색 (670 +/- 20 nm) 영역에서 광학 필터를 사용한다 (도 6 참조).
캡슐화된 샘플을 FACSAria II (Becton Dickinson, San Jose, CA)에서 분석한다. 피크의 높이, 면적 및 폭을 4개의 파라미터에서 수집한다: 고상 488 nm 레이저로부터 정방향 및 측방 스캐터 (각각 FSC 및 SSC), 515 nm 밴드패스 필터로부터 녹색 형광, 및 670 nm 밴드패스 필터로부터 적색 형광. 캡슐화된 콜로니를 FSC 면적 파라미터의 함수로서 SSC 면적 플롯을 이용하여, 임의의 찌꺼기, 나머지 비-캡슐화된 세포 및 빈 입자로부터 먼저 게이트-어웨이(gate away)한다 (도 7A 참조).
입자 안에서 생산된 산물의 양을 측정하기 위해, 입자내 가변적인 세포 수로인해 야기되는 노이즈를 고려한 1차 분석을 수행한다. 탄화수소 산물 (예, 파르네신) 등의 중성 지질에서의 Nile Red 형광은 인지질 막과 같은 극성 지질에서의 형광에 비해 블루-쉬프트한다. 녹색 (산물) : 적색 (세포 생물량) 형광 비를 취함으로써, 세포 수 편차로 발생하는 대부분의 노이즈는 소거된다. 이러한 정규화는 변동 계수를 균주에 따라 80-100%에서 8-12%로 낮춘다 (예, 각각 도 7C 및 7D 참조). 따라서, 분류된 집단을 선별하기 위한 2차 플롯은 녹색 : 적색 형광 (G/R) 비이며; 녹색 (G) 신호와 G/R 신호가 모두 높은 집단을 선별한다 (예, 도 7B에서 박스 표시된 집단).
초 당 500 - 1000건으로 취합하여, 세팅 게이트에서 10,000건을 수집한다. G + G/R이 높은 콜로니의 "분류 게이트"는 돌연변이의 예상되는 표현형 변화, 스크리닝 회차 및 집단의 크기에 따라 총 콜로니의 0.5% - 20%를 차지한다. 분류된 집단을 영양 아가 페트리 디쉬에 직접 도말하고, 세포를 입자에서 증식되어 나와 아가에서 콜로니를 형성하게 되며, 이는 추가적인 프로세스, 예컨대 후속적인 캡슐화, 분류 및 배양 라운드에서 회수한다. 캡슐화, 분류 및 증식 사이클 2 - 6회차를 포함하는 스크리닝을 수행하여, 수-비혼화성 화합물을 다량 생산하는 세포 집단을 농화시킬 수 있다. 최종 분류 라운드를 수행한 후, 개개 콜로니들을 고수준 생산을 확증하기 위한 전통적인 벌크-배양 스크리닝으로 평가하기 위해 선별할 수 있다.
7.4 실시예 4: 파르네신 생산 세포의 동정 및 선별
본 실시예는 파르네신을 저수준 내지 고수준으로 생산하도록 조작된 재조합 효모 세포에서 이종의 수-비혼화성 화합물을 검출하는데 있어 민감성과 정확도(fidelity)를 입증한다. 광범위한 수준으로 파르네신을 생산하는 것으로 나타난, 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조한 효모 균주 래더(ladder)를, 실시예 2 및 3에 기술된 방법에 따라, 각각 캡슐화 및 분류하였다. Nile Red를 검출제로서 사용하였다. 피코스크리닝 방법으로 검출한 파르네신 수준을 2 L 발효기 수율, Nile Red 96웰 교반 플레이트 및 파라네신 플럭스 등의 표준 측정 방법으로 검출된 수준과 비교하였다.
Nile Red 96-웰 교반 플레이트 분석을 다음과 같이 수행하였다. 각 균주에 대해, 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 취하여 360 ㎕의 BSM (Bird Seed Medium) 2% 슈크로스 0.25N+ crb (예비-배양 배지)가 든 1.1 ml 96 웰 플레이트에 접종하였다. 예비-배양 플레이트를 통기성 막 실 (seal)로 밀봉하고, 배양물을 33.5℃, 80% 습도 하에 96시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 예비-배양 배지 14.4 ㎕를 1.1 ml 96웰 생산 플레이트에 든 360 ㎕의 BSM 4% 슈크로스 (1:25 희석)에 옮겼다. 생산 플레이트를 통기성 막 실로 밀봉하고, 배양물을 33.5℃, 80% 습도 하에 48시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 배양한 후, 생산 배양물 98 ㎕를 Nile Red 용액 (Nile Red 최종 농도 2 ㎍/ml) 2 ㎕와 96웰의 바닥이 평평한 블랙 폴리스티렌 분석 플레이트에서 혼합하였다. 플레이트를 스펙트로포토미터에 로딩하기 전 30초간 혼합하고, 여기 파장 290 nm 및 방출 파장 550 nm에서 파르네신-특이 판독값을 수득하였다. 또한, 세포 생물량-특이적인 판독값도 여기 파장 350 nm 및 방출 파장 450 nm에서 구하여, 파르네신 / 생물량의 비를 결정하였다.
파르네신 플럭스 분석은 다음과 같이 수행하였다. 각 균주에 대해, 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 취하여 360 ㎕의 BSM 2% 슈크로스 (예비-배양 배지)가 든 1.1 ml 96 웰 플레이트에 접종하였다. 예비-배양 플레이트를 통기성 막 실로 밀봉하고, 배양물을 33.5℃, 80% 습도 하에 65-72시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 예비-배양 배지 30 ㎕를 1.1 ml 96웰 생산 플레이트에 든 360 ㎕의 BSM 4% 슈크로스에 옮겼다. 생산 플레이트를 통기성 막 실로 밀봉하고, 배양물을 33.5℃, 80% 습도 하에 48시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 파르네신 역가(titer)를 구하기 전에 각 배양물에 대해 OD600 측정치를 구하였다. 각 배양물 200 ㎕를 2.2 mL 플레이트로 옮기고, 400 ㎕/웰로 메탄올을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여, 30-40분간 교반하였다. 실을 제거하고, 0.001% 트랜스-카리오필렌이 포함된 n-헵탄을 600 ㎕/웰로 첨가한 다음, 플레이트를 밀봉하여 90분간 교반하였다. 그 후, 플레이트를 5분간 2500 g로 원심분리하였다. 각 샘플에 대해, 2.2 mL 플레이트로부터 헵탄 상층을 200 ㎕/웰로 취하여 1.1 mL 플레이트의 웰에 넣고, 0.001% 트랜스-카리오필렌이 포함된 n-헵탄을 200 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여 2분간 교반한 다음 2분간 2500 g로 원심분리하였다. 헵탄 추출물을 불꽃 이온화 검출기 (FID)와 Agilent 7890 기체 크로마토그래피 시스템 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)을 이용하여 분석하였다. 파르네신 역가는, 생물학적으로 유래된 정제된 트랜스-β-파르네신 (Amyris Inc., Emeryville, CA)의 헵탄 중의 정량적인 캘리브레이션 곡선에 대해 수득한 피크 면적들을 비교하여 계산하였다.
2L 발효기 수율을 다음과 같이 구하였다. 멸균 BSM 2% 슈크로스 완충화된 w/숙시네이트 50 mL이 든 250-mL의 비-배플드형 교반 플라스크에 해동시킨 작업 시드 스톡 1 mL을 접종하였다. 접종 플라스크를 200 rpm으로 약 24시간 배양하였고, 2'' 트로우(throw)로 34℃에서 OD600 = 약 3.5로 배양하였다. 멸균 배지 800 mL이 든 페른바흐 교반 플라스크에 접종원 50 mL을 접종하였다. 시드 플라스크를 200 rpm으로 약 24시간 배양하였고, 2'' 트로우로 34℃에서 OD600 = 약 3.5 및 에탄올 > 2 g/L로 배양하였다. 접종 후 부피 전체를 2 L 발효에 사용하였다. 2X 배치 베이스를 DI 물과 조합하여 자동멸균화하여, 발효기배치 배지를 준비하였다. 멸균 미량 금속과 비타민을 멸균 후 첨가로서 첨가하고, 배지를 접종하기 전 타겟 프로세스 조건으로 평형화하였다. Tergitol L-81 소포제 (0.1 mL/L 최종 부피)를 또한 접종 후 발효기에 첨가하였다. 28% 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 pH를 조절하였다. 당 공급원은 750 g/L 슈크로스였다. 생산 단계 동안에는 6일간 33.5℃에서 pH 5, 임펠러 교반, OUR 80-150에서 발효를 진행하였다. 세포 밀도를 측정하고, 파르네신 역가를 전술한 바와 같이 기체 크로마토그래피로 측정하였다.
도 8은, 다양한 수준으로 파르네신을 생산하도록 조작된 7종의 균주 각각에서의, (y 축) 피코스크리닝을 통해 결정된 (임의 단위(arbitrary unit)로 표시되며 생물량의 양에 대해 정규화된) 파르네신 수율을, 2L 발효기 수율 (x-축, 좌측 플롯), Nile Red 교반 플레이트 분석 (x-축, 중간 플롯) 및 파르네신 플럭스 분석 (x-축, 우측 플롯)을 통해 행해진 수율 측정치에 대해 그래프 작성한 것이다. 상관성은 넓은 범위의 생산 수준에서 양호하다 (R2>90%). 이들 상관성은 피코스크린 분석을 파르네신을 다양한 수준으로 생산하는 균주 집단들에서 파르네신 생산을 구분할 수 있는 분석으로서 입증해준다.
7.5 실시예 5: 파르네신-고생산 집단의 농화
본 실시예는 본원에 제공된 캡슐화 및 검출 ("피코스크리닝") 방법을 반복 수행하는 경우 저생산체 백그라운드로부터 고생산 세포를 농화하는데 유효함을 입증해준다.
저 생산체 백그라운드에서 고 생산체를 농화하는 피코스크리닝 방법의 역량을 입증하기 위해, 분류 전과 후에 단일 집단으로 공배양한 여러가지 캡슐화된 균주들을 명확하게 구분하고, 다른 균주 대비 한가지 균주의 상대적인 농화를 확인하도록, 디지털 콜로니 PCR 분석을 개발하였다. 게놈에 병합된 파르네신 신타제 (FS) 유전자의 수에 차이가 있는 한쌍의 균주를 모델 시스템으로 활용하였다. 게놈에 FS 유전자를 고카피수로 포함하는 경우 균주에 의해 생산되는 파르네신의 양이 높아진다. 제1 균주로서 FS2는 FS가 2카피 병합된 것이고, 제2 균주인 FS5는 5카피가 병합된 것이다. FS5는 FS2에 비해 파르네신을 ~ 30% 이상의 수율로 생산하는 것으로 독립적으로 검증되었다.
단일 PCR 반응으로 FS2와 FS5 균주를 명확하게 구분하기 위해 이용할 수 있는 3개의 프라이머를 설계하였다. 제1 프라이머는 상기 양쪽 균주에서 공통적인 TCYC1 종결인자 서열을 타겟팅하며 정방향 프라이머로서 작동한다. 제2 프라이머는, 또한 양쪽 균주에 공통적인, FS의 2번째 카피를 포함하는 병합된 서열에서 확인되는 영역을 타겟팅하는 역방향 프라이머로서 작동하며; 이 유전자 좌에서 증폭되어 89 bp 앰플리콘이 만들어진다. 또한, 제3 프라이머는, 균주 FS5에 고유한 것이며 균주 FS2에는 존재하지 않는, FS의 5번째 카피를 포함하는 병합된 서열에서 확인되는 영역을 타겟팅하는 역방향 프라이머로서 작동하며; 이 유전자 좌에서 증폭되어 304 bp 앰플리콘이 생산된다. PCR을 이들 3가지 프라이머 혼합물로 각 균주에 대해 수행하였을 때, 균주 FS2는 밴드 1개 (89 bp)를 생산하였고, 균주 FS5는 2개의 밴드 (89 bp 및 304 bp)를 생산하였다 (도 9). 304 bp 밴드의 존재는 콜로니가 균주 FS5로부터 유래된 것임을 나타내는 명백한 마커로서 사용된다.
균주 FS2 및 FS5는 FS2:FS5 비율 10:1, 100:1 및 1000:1로 별개의 단일 라이브러리로 혼합하고, 이들 모델 라이브러리 각각에 대해 피코스크리닝을 수행하였다. 3회의 캡슐화 및 분류를 각 라이브러리에 대해 수행하였다. 라운드 사이에, 분류한 입자를 큰 페트리 트레이에 직접 접종하여 배양하고, 각 회차마다 콜로니 96개를 선별하여, 전술한 3종의 프라이머를 이용한 콜로니 PCR을 수행하여, 각 콜로니의 정체를 확인하였다. 이들 PCR 데이타로부터, 균주 FS5 유래 콜로니로 표시되는 접종된 집단의 비율을 각 캡슐화 및 분류 라운드를 수행한 후 측정하였다.
도 10에 나타낸 결과는 캡슐화 및 분류를 3회차 이상 수행하였을 때 균주 FS5가 성공적으로 농화됨을 보여준다. 도 10A는 1 및 2열에 나타낸 순수 균주들의 FACS 히스토그람을 나타낸다. 캡슐화 및 분류를 1, 2, 및 3회 (3-5열) 수행한 후, 100:1로 혼합된 집단의 히스토그람은, 3회차까지 균주 FS5의 상당한 농화가 달성되었음을 나타낸다. 도 10B는 각각의 10:1, 100:1 및 1000:1 라이브러리에 대한 분류 라운드 사이에, cPCR 데이타로부터 유래된, 농화에 대한 정량적인 결과를 나타낸 것이다. 이들 연구에서, 출발 FS2:FS5 비율이 각각 10:1 및 100:1인 라이브러리의 경우, FS5의 농화가 거의 완성되었는데, 3회차까지, 수득되는 집단의 거의 100%가 FS5 유래 콜로리로 이루어져 있었다. 심지어 FS5가 출발 집단에서 매우 적을 경우 (~10%)에도, 각 라운드 당 약 5배의 농화가 관찰되었다. 이들 결과는, 저 생산성 세포 집단에서 비율이 매우 낮은 고 생산 세포 집단의 거의 완전한 농화가 피코스크리닝에 의해 효율적으로 달성될 수 있음을 증명해준다.
7.6 실시예 6: 다른 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포의 동정 및 선별
본 실시예는 다른 수-비혼화성 화합물을 재조합에 의해 생산하는 세포를 검출, 분류 및 선별함에 있어 피코스크리닝의 효과를 보여준다.
7.6.1 리모넨 생산 세포
세스퀴테르펜 파르네신의 재조합 생산 뿐만 아니라, 모노테르펜 등의 다른 이소프레노이드계 화합물을 피코스크리닝을 통해 세포에서 검출할 수 있다. 모노테르펜은 일반적으로 이소프렌 유닛 2개로 구성되어 있으며, 분자식이 C10H16이다. 모노테르펜 리모넨은 천연적으로는 시트러스 열매 및 페퍼민트의 껍질에서 발견되며, 아래 구조로 표시된다:
Figure pct00003
리모넨은 리모넨 신타제에 의해 게라닐 피로포스페이트 (GPP)로부터 만들어진다. 리모넨을 다양한 양으로 생산하는 일련의 효모 균주들을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였으며, 단 균주는 파르네신 신타제가 아닌 리모넨 신타제를 코딩하는 유전자를 발현하도록 조작시켰다.
리모넨 생산 균주를 각각 실시예 2 및 3에 기술된 방법에 따라 캡슐화하고 분류하였다. Nile Red를 검출제로서 사용하였다. 피코스크리닝 방법을 통해 검출된 리모넨 수준을 다음과 같이 수행한 96웰 교반 플레이트 분석으로 검출한 수준과 비교하였다. 각 균주에서, 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 취하여 360 ㎕의 BSM (Bird Seed Medium) 2% 슈크로스 0.25N+ crb (예비-배양 배지)가 든 1.1 ml 96 웰 플레이트에 접종하였다. 예비-배양 플레이트를 통기성 막 실로 밀봉하고, 배양물을 30℃, 80% 습도 하에 72시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 예비-배양 배지 6 ㎕를 1.1 ml 96웰 생산 플레이트에 든 75 ㎕의 BSM 4% 갈락토스와 75 ㎕의 이소프로필 미리스테이트에 옮겼다. 생산 플레이트를 Velocity 11 플레이트 locTM (Agilent Technologies)로 비-투과성 알루미늄 호일 열 실로 밀봉하고, 배양물을 30℃, 80% 습도 하에 72시간 동안 1000 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 배양한 후, 플레이트를 2시간 동안 -20℃에서 급속 냉동시켜, 모노테르펜 생산으로 인한 증기 압력을 낮추었다. 이 단계에서, 플레이트 실을 빨리 제거하고, 헥사데칸 내부 표준물질이 포함된 에틸아세테이트 300 ㎕를 디펜스 길이가 15 mm인 Phoenix 액체 취급기 (Art Robbins Instruments)를 사용하여 펌핑 속도 3 mm/s로 직접 냉동시킨 배양물 브로스에 첨가하였다. 플레이트를 다시 비-투과성 알루미늄 실로 즉시 밀봉하여, 마이크로타이터 플레이트 교반기에서 90 rpm 회전 속도로 2시간 동안 RT에서 교반하였다. 2시간 교반한 후, 플레이트를 2분간 2000 rpm으로 원심분리하고, GC-FID (기체 크로마토그래피 + 불꽃 이온화 검출)를 이용하여 분석하였다. 모노테르펜 생산에 대한 GC-FID 분석은, 스플리트 비율 1:50인 에틸 아세테이트 2 ㎕를 메틸 실리콘 정지상 컬럼에 주입하여, 정량화하였다. 오븐 파라미터를 2.5분에 걸쳐 25℃에서 250℃로 높인 다음, 다음 샘플 주입을 위해 급속 냉각시켰다. 각각을 수행하기 전에 리모넨과 미르센 표준 물질을 주입하여, 샘플 피크 하 적분한 정확한 면적 ppm을 구하였다. 이들 값을 도 11에 나타낸 수치를 구하기 위한 절대 역가로서 변환하였다.
도 11A는, 리모넨을 다양한 수준으로 생산하도록 조작된 균주 3종 (L1, L2 및 L3)과 나이브 비-생산 균주 (Y0) 각각에 대한, (좌측 패널) 균주 당 생산되는 리모넨 생산 수준에 해당되는 G/R 형광 피크; 및 (우측 패널) 교반 플라스크 발효기 수율 (x-축)에 의해 결정된 수율 측정에 대해 그래프로 나타낸, 피코스크리닝 (y-축)을 통해 결정된 리모넨 수율을 제공한다. 상관성은 광범위한 리모넨 생산 수치들에서 관찰할 수 있다. 도 11B는 공-배양 (색칠된 피크) 또는 각각 배양한 (색칠 안된 피크) 캡슐화된 생산 세포 (L1) 및 비-생산 세포 (Y0)의 형광 피크를 나타낸다. Y0 및 L1에 대한 각각의 형광 피크들은 공-배양 조건에서 유지되었는데, 이는 생산이 생산 균주가 함유된 입자 안에 캡슐화되어 유지되며, 누출되지 않거나 또는 비-생산 균주를 함유한 입자로 누출되지 않는다는 것을 의미한다. 중앙값 차이는 개별 튜브 차이(tube-to-tube variation)로 인한 것일 수 있다.
이들 결과는 피코스크린 분석을 이용하여 리모넨을 다양한 수준으로 생산하는 숙주 균주를 동정 및 구분할 수 있음을 입증해준다.
7.6.2 패출롤 생산 세포
패출롤, 아래 구조의 세스퀴테르펜은,
Figure pct00004
또한 패출리 알코올로도 알려져 있으며, 포고스테몬 패출리(Pogostemon patchouli)의 에센셜 오일의 구성 성분이다. 패출롤은 패출롤 신타제에 의해 FPP로부터 만들어진다. 패출롤을 다양한 양으로 생산하는 일련의 효모 균주들을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였으며, 단, 균주는 파르네신 신타제가 아닌 패출롤 신타제를 발현하도록 조작하였다. 패출롤 생산 균주를 실시예 2 및 3에 각각 기술된 방법에 따라 캡슐화하고 분류하였다. Nile Red를 검출제로서 사용하였다. 피코스크리닝 방법으로 검출한 패출롤 수준을 다음과 같이 96웰 교반 플레이트 수율로 검출한 수준과 비교하였다. 각 균주에 대해, 단일 콜로니를 웰 당 360 ㎕의 BSM (Bird Seed Medium) + 2% 슈크로스 (예비-배양)가 든 96 웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 30℃에서 999 rpm으로 교반하면서 2일 배양한 후, 각 웰의 6.4 ㎕를 150 ㎕의 신선한 BSM + 4% 갈락토스 및 3.33% 미네랄 오일 및 Brij-56 에멀젼이 든 새로운 96웰 플레이트의 웰에 접종하였다 (생산 배양). 999 rpm으로 교반하면서 30℃에서 다시 4일간 배양한 후, 샘플을 취하여, 기체 크로마토그래피 (GC) 분석으로 패출롤 생산을 분석하였다. GC 분석을 위해, 샘플을 메탄올-부톡시 에탄올-헵탄 (100 ㎕:50 ㎕:400 ㎕ v/v)으로 추출하고, 세포 물질을 중력으로 침전시켰다. 헵탄 추출물의 분액을 다시 헵탄으로 추출한 다음, 펄스형 스플리트 주입을 이용하여 메틸 실리콘 정지상에 주입하였다.
도 12는 캡슐화된 효소 세포로부터 재조합에 의해 생산되는 패출롤을 검출하기 위한 피코스트린 결과를 나타낸다. 비-생산 균주 (Y0)와 2종의 상이한 패출롤 생산 균주 (P1 및 P2)를 캡슐화하여, 피코스크리닝을 수행하였다. 도 12A는 균주 당 생산되는 패출롤 수준에 해당되는 G/R 형광 피크들을 나타낸다. 도 12B는 96웰 교반 플레이트 수율 (x축)에 의해 결정된 수율 측정에 대해 작성된 피코스크리닝 (y축)을 통해 결정된 리모넨 수율 (생물량의 양에 대해 정규화되며, 임의 단위로 표시됨)을 나타낸다. 이들 결과는, FACS 값이 GC로 결정된 표준 교반 플레이트 역가와 비례함을 보여준다.
이들 결과는, 피코스크린 분석을 이용하여 다양한 양으로 패출롤을 생산하는 숙주 균주를 동정하고 구분할 수 있음을, 입증해준다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원들은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 병합되는 것으로 표시된 바와 같이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 발명이 명확한 이해를 위해 설명과 예를 들어 일부 상세하게 기술되지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 청구항의 사상 또는 범위로부터 이탈되지 않으면서 일부 변화와 수정을 행할 수 있음이 자명할 것이다.

Claims (123)

  1. 세포에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 방법으로서,
    (a) 세포를 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는 단계; 및
    (b) 상기 하이드로겔 입자 안에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 상기 하이드로겔 입자를 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료(fluorescent dye)와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형광 염료가 용매변색 염료(solvatochromic dye)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 형광 염료가 Nile Red인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 상기 하이드로겔 입자내 수-비혼화성 화합물의 양을 하이드로겔 입자내 세포 생물량(biomass) 양에 대해 정규화(normalizing)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 수-비혼화성 화합물을 보유(retaining) 할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔이 아가로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 1 mm 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 100 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 50 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 50, 45, 40, 35, 30 또는 25 ㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 캡슐화는 세포를 포함하는 하이드로겔 입자를 형성하는데 충분한 조건에서 세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조건이 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물과 플루오로계면활성제를 포함하는 플루오로카본 오일의 접촉을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 플루오로카본 오일과의 접촉이 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 상기 플루오로카본 오일을 포함하는 미세유체 디바이스(microfluidic device)에 로딩(loading)하는 단계를 포함하며,
    상기 하이드로겔 현탁물이 상기 미세유체 디바이스의 T-정션에서 상기 플루오로카본 오일과 접촉하며,
    상기 플루오로카본 오일과의 접촉으로 세포를 포함하는 비-수계 하이드로겔 입자가 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 플루오로카본 오일로부터 하이드로겔 입자를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 검출하기 전에 상기 하이드로겔 입자내 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 배양은 12 - 24시간의 기간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 파르네신인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포가 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 파르네신 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 하니 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열이 메발로네이트 경로의 효소 1종 이상을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, IPP 또는 폴리프레닐을 변형시켜 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 효소가 카렌(carene) 신타제, 게라니올(geraniol) 신타제, 리날롤(linalool) 신타제, 리모넨(limonene) 신타제, 미르센(myrcene) 신타제, 오시멘(ocimene) 신타제, α-피넨 신타제, β-피넨 신타제, γ-테르피넨(terpinene) 신타제, 테르피놀렌(terpinolene) 신타제, 아모르파디엔(amorphadiene) 신타제, α-파르네신 신타제, β-파르네신 신타제, 파르네솔(farnesol) 신타제, 네롤리돌(nerolidol) 신타제, 패출리올(patchouliol) 신타제, 누트카톤(nootkatone) 신타제 및 아비에타디엔(abietadiene) 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 C5-C20 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네신, β-파르네신, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날롤, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 오시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제22항에 있어서, 상기 세포가 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제22항에 있어서, 상기 세포가 폴리케타이드 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 폴리케타이드 신타제 시스템 (PKS)을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 PKS가 모듈러 PKS (modular PKS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 PKS가 아로마틱 PKS (aromatic PKS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 케토신타제/아실 트랜스퍼라제 (KS/AT) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 체인 길이 인자 (CLF) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아실 캐리어 단백질 (ACP) 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제35항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 사이클라제 (CYC) 촉매 영역, 케토리덕타제 (KR) 촉매 영역, 아로마타제 (ARO) 촉매 영역, 에노일리덕타제 (ER) 촉매 영역, 티오에스테라제 (TE) 촉매 영역 또는 완전(holo) ACP 신타제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제22항에 있어서, 상기 세포가 지방산 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아세틸-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 말로닐-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 이종의 pdh, panK, aceEF, fabH, fabD,fabG, acpP, 또는 fabF 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 방법으로서,
    (a) 세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시키는 단계;
    (b) 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 플루오로카본 오일을 포함하는 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계로서, 상기 하이드로겔 현탁물은 미세유체 디바이스의 T-정션에서 상기 플루오로카본 오일과 접촉되며, 상기 플루오로카본 오일과의 접촉으로 세포를 포함하는 비-수계 하이드로겔 입자가 형성되는 것인, 단계;
    (c) 상기 플루오로카본 오일로부터 상기 하이드로겔 입자를 분리하는 단계;
    (d) 상기 하이드로겔 입자내 상기 세포를 배양하는 단계;
    (e) 상기 하이드로겔 입자를, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물에 직접 결합하는 형광 염료와 접촉시키는 단계; 및
    (f) 상기 하이드로겔 입자에서 상기 형광 염료를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 재조합에 의해 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포에 대해 세포 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 상기 라이브러리의 각 세포를 하이드로겔 입자 안에 캡슐화하는 단계;
    (b) 각 하이드로겔 입자에서 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 재조합에 의해 수-비혼화성 화합물을 생산하는 세포에 대해 세포 집단을 농화하는 방법으로서,
    (a) 수-비혼화성 화합물을 생산하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포의 클론 집단을 캡슐화하는 하이드로겔 입자를 포함하는, 하이드로겔 입자 집단을 제공하는 단계;
    (b) 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 포함하는 하이드로겔 입자를 검출하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 하이드로겔 입자로부터 상기 세포 또는 상기 세포의 클론 집단을 회수하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 상기 세포 또는 상기 세포의 클론 집단을 재-캡슐화하는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (a) - (c)를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 하이드로겔 입자 안에 세포를 캡슐화하는 방법으로서,
    (a) 세포를 수계 하이드로겔 현탁물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 포함하는 수계 하이드로겔 현탁물을 플루오로카본 오일을 포함하는 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계로서, 상기 하이드로겔 현탁물은 미세유체 디바이스의 T-정션에서 상기 플루오로카본 오일과 접촉되며, 상기 플루오로카본 오일과의 접촉으로 세포를 포함하는 비-수계 하이드로겔 입자가 형성되는 것인 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 재조합에 의해 생산된 수-비혼화성 화합물을 포함하는, 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  52. 제51항에 있어서, 형광 용매변색 염료와 접촉된 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  53. 제51항에 있어서, Nile Red와 접촉된 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  54. 제51항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  55. 제51항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  56. 제51항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  57. 제56항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  58. 제56항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 파르네신인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  59. 제55항에 있어서, 상기 세포가 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  60. 제59항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 파르네신 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  61. 제59항에 있어서, 상기 재조합 효모가 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  62. 제59항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  63. 제59항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열이 메발로네이트 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  64. 제59항에 있어서, 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  65. 제59항에 있어서, IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  66. 제65항에 있어서, 상기 효소가 카렌 신타제, 게라니올 신타제, 리나롤 신타제, 리모넨 신타제, 미르센 신타제, 오시멘 신타제, α-피넨 신타제, β-피넨 신타제, γ-테르피넨 신타제, 테르피놀렌 신타제, 아모르파디엔 신타제, α-파르네신 신타제, β-파르네신 신타제, 파르네솔 신타제, 네롤리돌 신타제, 패출리올 신타제, 누트카톤 신타제 및 아비에타디엔 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  67. 제65항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 C5-C20 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  68. 제67항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네신, β-파르네신, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날롤 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 오시멘. 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  69. 제59항에 있어서, 상기 세포가 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  70. 제55항에 있어서, 상기 세포가 폴리케타이드 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔로 캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  71. 제70항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 폴리케타이드 신타제 시스템 (PKS)을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  72. 제71항에 있어서, 상기 PKS가 모듈러 PKS인 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  73. 제71항에 있어서, 상기 PKS가 아로마틱 PKS인 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  74. 제71항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 케토신타제/아실 트랜스퍼라제 (KS/AT) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  75. 제71항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 체인 길이 인자 (CLF) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  76. 제71항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아실 캐리어 단백질 (ACP) 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  77. 제71항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 사이클라제 (CYC) 촉매 영역, 케토리덕타제 (KR) 촉매 영역, 아로마타제 (ARO) 촉매 영역, 에노일리덕타제 (ER) 촉매 영역, 티오에스테라제 (TE) 촉매 영역, 또는 전체(holo) ACP 신타제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  78. 제55항에 있어서, 상기 세포가 지방산 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효소 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  79. 제78항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아세틸-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  80. 제78항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  81. 제78항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 말로닐-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  82. 제78항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 이종의 pdh, panK, aceEF, fabH, fabD,fabG, acpP 또는 fabF 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔-캡슐화된 세포 또는 클론 세포 집단.
  83. 세포 또는 클론 세포 집단을 포함하며, 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물을 추가로 포함하는, 하이드로겔 입자.
  84. 제83항에 있어서, 형광 용매변색 염료와 접촉된 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  85. 제83항에 있어서, Nile Red와 접촉된 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  86. 제83항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포, 박테리아 세포, 포유류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  87. 제84항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  88. 제83항에 있어서, 상기 재조합에 의해 생산되는 수-비혼화성 화합물이 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  89. 제88항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 테르펜, C5 이소프레노이드, C10 이소프레노이드 또는 C15 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  90. 제88항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 파르네센인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  91. 제83항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 파르네센 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  92. 제83항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 수-비혼화성 화합물을 보유할 수 있는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  93. 제92항에 있어서, 상기 수-비혼화성 화합물이 이소프레노이드, 폴리케타이드 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  94. 제92항에 있어서, 상기 수-비혼화성 화합물이 파르네센인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  95. 제83항에 있어서, 상기 하이드로겔이 아가로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  96. 제83항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 약 1 mm 미만인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  97. 제83항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 500 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  98. 제83항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 100 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  99. 제83항에 있어서, 상기 하이드로겔 입자가 직경이 약 50 ㎛ 미만인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  100. 제87항에 있어서, 상기 세포가 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  101. 제100항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 파르네센 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  102. 제100항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  103. 제100항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  104. 제100항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열이 메발로네이트 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  105. 제100항에 있어서, 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  106. 제100항에 있어서, IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  107. 제106항에 있어서, 상기 효소가 카렌 신타제, 게라니올 신타제, 리날롤 신타제, 리모넨 신타제, 미르센 신타제, 오시멘 신타제, α-피넨 신타제, β-피넨 신타제, γ-테르피넨 신타제, 테르피놀렌 신타제, 아모르파디엔 신타제, α-파르네센 신타제, β-파르네센 신타제, 파르네솔 신타제, 네롤리돌 신타제, 패출리올 신타제, 누트카톤 신타제 및 아비에타디엔 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  108. 제106항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 C5-C20 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  109. 제108항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네센, β-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날롤, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 오시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  110. 제100항에 있어서, 상기 세포가 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  111. 제87항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 폴리케타이드 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  112. 제111항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 폴리케타이드 신타제 시스템 (PKS)을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  113. 제112항에 있어서, 상기 PKS가 모듈러 PKS인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  114. 제112항에 있어서, 상기 PKS가 아로마틱 PKS인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  115. 제112항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 케토신타제/아실 트랜스퍼라제 (KS/AT) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  116. 제112항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 체인 길이 인자 (CLF) 촉매 영역을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  117. 제112항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아실 캐리어 단백질 (ACP) 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  118. 제112항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 사이클라제 (CYC) 촉매 영역, 케토리덕타제 (KR) 촉매 영역, 아로마타제 (ARO) 촉매 영역, 에노일리덕타제 (ER) 촉매 영역, 티오에스테라제 (TE) 촉매 영역, 또는 전체(holo) ACP 신타제 활성을 포함하는 효소를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  119. 제87항에 있어서, 상기 세포가 지방산 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 세포인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  120. 제119항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아세틸-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  121. 제119항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  122. 제119항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 말로닐-CoA 신타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
  123. 제119항에 있어서, 상기 재조합 효모 세포가 이종의 pdh, panK, aceEF, fabH, fabD,fabG, acpP, 또는 fabF 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 입자.
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